CN106032540B - CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途。本发明人通过缩小优化Cas9表达元件,制备了具有组织细胞广谱表达的Cas9蛋白的AAV表达载体,首次实现将整个表达元件和Cas9编码序列包装进AAV病毒。基于AAV病毒包装的特性,只需更换包装衣壳质粒,即可将此Cas9载体包装成不同血清型的AAV病毒。本发明获得的病毒可以有效地实现组织靶向表达及DNA编辑。
Description
技术领域
本发明属于基因技术领域,更具体地,本发明涉及CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途。
背景技术
II型原核CRISPR/Cas系统是细菌的一种获得性免疫系统,能够降解噬菌体DNA或外源质粒。经过改造的人工内切核酸酶CRISPR/Cas9,由Cas9蛋白,含有引导序列的crRNA和tracrRNA组成。通过20碱基的引导序列和目的DNA互补配对结合,Cas9在靶DNA进行切割产生双键断裂。DNA双链断裂通过高保真的同源重组或者容易引入插入/缺失突变的非同源末端连接途径进行修复。通过同源重组途径修复时,在同源模板存在情况下,将会按照模板进行定向修复。非同源末端连接途径则会导致移码突变,破坏读码框并扰乱蛋白的表达。目前这一技术被广泛应用于各种基因型细胞及小鼠模型的制备,并可同时高效地获取多位点突变,极大地缩短实验时间。此外,在细胞水平及小鼠水平的疾病模型中,此系统能够有效地修复致病的基因突变,从根本上治疗遗传病。但是目前这一系统局限于受精卵及肝脏中,其他器官的靶向递送尚待解决。
目前有慢病毒和腺病毒载体被用于递送CRISPR/Cas9系统。但是,慢病毒会插入基因组造成插入突变;而腺病毒为5型腺病毒,其嗜肝,在其他组织的表达非常少。
综上,本领域迫切需要进一步优化递送CRISPR/Cas9系统,以期能够在其它器官或组织中实现基因靶向操作。
发明内容
本发明的目的在于提供CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途。
在本发明的第一方面,提供一种表达Cas9的重组腺相关病毒载体,该载体包括如下操作性连接的序列元件(按照5’→3’的方向):5’末端反向重复序列(即L-ITR),CMV启动子序列,核定位信号1序列,Cas9编码核酸序列,核定位信号2序列,miniPolyA序列和3’末端反向重复序列。
在一个优选例中,所述的重组腺相关病毒载体中,所述的5’末端反向重复序列如SEQ ID NO:1中第1~141位所示;
所述的CMV启动子序列如SEQ ID NO:1中第165~828位所示;
所述的核定位信号1序列如SEQ ID NO:1中第913~963位所示;
所述的Cas9编码核酸序列如SEQ ID NO:1中第964~5064位所示;
所述的核定位信号2序列如SEQ ID NO:1中第5065~5112位所示;
所述的miniPolyA序列如SEQ ID NO:1中第5122~5169位所示;
所述的3’末端反向重复序列如SEQ ID NO:1中第5192~5332位所示。
在另一优选例中,所述的重组腺相关病毒载体中,在核定位信号1序列的5’端或核定位信号2序列的3’端,还包括标签序列。
在另一优选例中,所述的标签是Flag,较佳地为3×Flag标签。
在本发明的另一方面,提供所述的重组腺相关病毒载体的用途,用于制备病毒,所述的病毒能够在特定组织(如心脏)中表达Cas9蛋白。
在本发明的另一方面,提供一种重组腺相关病毒,所述病毒由所述的重组腺相关病毒载体包装获得。
在本发明的另一方面,提供一种试剂盒,所述的试剂盒中包括:所述的重组腺相关病毒;或所述的重组腺相关病毒载体。
在一个优选例中,所述的试剂盒中还包括:所述的表达Cas9的重组腺相关病毒载体。
在另一优选例中,其中还包括能在体内形成sgRNA(single-guided RNA)和TracrRNA(Trans-activating crRNA)的载体或由该载体包装成的腺相关病毒。
在另一优选例中,所述的在体内形成sgRNA和TracrRNA的载体包括如下操作性连接的序列元件(按照5’→3’的方向):缺失D序列的5’末端反向重复序列,sgRNA和TracrRNA的表达盒,和3’末端反向重复序列。
在另一优选例中,所述的sgRNA和TracrRNA序列的表达盒包括:U6启动子序列,sgRNA和TracrRNA序列,U6终止子序列。
在另一优选例中,所述的试剂盒中,所述的缺失D序列的5’末端反向重复序列如SEQ ID NO:2中第1~117位所示;
所述的U6启动子序列如SEQ ID NO:2中第141~389位所示;
所述的sgRNA和TracrRNA序列如SEQ ID NO:2中第408~483位所示;
所述的U6终止子序列如SEQ ID NO:2中第484~489位所示;或
所述的3’末端反向重复序列如SEQ ID NO:2中第2108~2248位所示。
在另一优选例中,所述的sgRNA和TracrRNA序列的表达盒与3’末端反向重复序列之间,还包括报告基因的表达盒。
在另一优选例中,所述的报告基因的表达盒包括:PGK启动子,EGFP编码核酸以及SV40polyA。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A、AAV-Cas9表达质粒的图谱,该质粒表达带有3xFlag标签的Cas9蛋白。Cas9的完整表达元件依次为CMV启动子,带有3×Flag标签及两端核定位信号NLS的Cas9读码框,人工微小加尾信号miniPolyA。总大小为5.0kb。
图1B、AAV-sgRNA表达质粒的图谱,该质粒表达融合了引导RNA和TracrRNA的融合RNA。该载体的5’端ITR删除了D序列(Δ-ITR),将包装成双链AAV病毒。该载体中构建了小鼠PGK启动子驱动的EGFP蛋白表达元件,用以方便检测病毒感染表达分布。
图2、AAV9-Cas9注射小鼠左心室1个月后,利用抗Flag标签的抗体通过WesternBlot检测Cas9蛋白在小鼠各组织的表达状况。
图3A、AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA共同注射小鼠1个月后,小鼠心肌靶点DNA测序图。
图3B、AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA共同注射小鼠1个月后,小鼠心肌靶DNA位点的测序结果,显示发生随机插入/缺失突变。
图3C、AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA共同注射小鼠1个月后,通过Surveyor酶检测小鼠心肌靶点DNA发生突变的比例。
图4、pAAV-MCS的质粒图谱。
图5、pX330的质粒图谱。
图6、AAV-Cas9的质粒图谱。
图7、pscAAV-U6-BB-chemeric_sgRNA的质粒图谱。
图8、scAAV-sgRNA的质粒图谱。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究,通过缩小优化Cas9表达元件,制备了具有组织细胞广谱表达的Cas9蛋白的AAV表达载体,首次实现将整个表达元件和Cas9编码序列包装进AAV病毒。基于AAV病毒包装的特性,只需更换包装衣壳质粒,即可将此Cas9载体包装成不同血清型的AAV病毒。本发明获得的病毒可以有效地实现特定组织(如心脏)的靶向表达及目的DNA编辑。
术语
如本文所用,所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如:启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置,使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导,从而,启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用,所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列,本发明中,所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些,也包括它们的变体,只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能,其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp;较佳地1-30bp,更佳地1-20bp,更佳地1-10bp),或进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用,所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因所需的所有必要元件的基因表达系统,通常其包括以下元件:启动子、目的基因序列,终止子;此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
质粒
腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)是一种不能自我复制的病毒,具有较低的免疫原性。目前有约10种血清型AAV,不同血清型的AAV能够选择性地靶向不同组织。但是AAV病毒载体装载容量有限,不超过5.0kb。
本发明人致力于研究利用AAV表达Cas9蛋白,但鉴于Cas9的编码区4.2kb,很难实现将Cas9表达盒全部装载入。因此,本发明人对于Cas9表达盒序列以及AAV载体中各元件进行了优化改造。
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。
本发明提供了一种表达Cas9的重组腺相关病毒载体,该载体包括如下操作性连接的序列元件:5’末端反向重复序列,CMV启动子序列,核定位信号1序列,Cas9编码核酸序列,核定位信号2序列,miniPolyA序列和3’末端反向重复序列。该腺相关病毒载体的主要元件的示意图如图1。
本发明还提供了一种能在体内形成sgRNA和TracrRNA的载体,该载体包括如下操作性连接的序列元件:缺失D序列的5’末端反向重复序列,sgRNA和TracrRNA的表达盒,和3’末端反向重复序列。
为了实现成功的病毒包装,本发明人选择了CMV启动子作为启动子,以及选择了精简的polyA加尾信号,以3个串联Flag作为标签,有效地简化了载体中的元件结构。对于所用的各元件的序列,也进行了优化设计改造,以最精简的序列构成表达Cas9的AAV载体,以利于成功包装及表达。
根据上述所提供的元件的信息,进行了适当的变化且仍然保留其原有功能的上述元件的变异体也包括在本发明中。例如,在严格条件下与本发明限定的序列杂交且具有相同功能的序列变异体。如本文所用,术语“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在70%以上、更佳地75%以上、80%以上、85%以上或90%以上,更优选是95%以上时才发生杂交。例如,所述序列也可为这些所限定序列的互补序列。
本发明的各元件所指向的基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。
所述的载体中上述元件的上游以及下游的位置,还可包括限制性的酶切位点,这样有利于各元件的有机连接。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于进行病毒的包装。
本发明构建的上述载体可以与其他不同AAV衣壳质粒组合包装出不同血清型的AAV病毒,并能靶向不同组织细胞。
病毒
本发明构建的表达载体可以包装成AAV的任何一种病毒血清型,进行不同组织的靶向表达。
重组腺相关病毒载体(rAAV)的包装方法有很多种,例如双质粒共转染加辅助病毒(多为腺病毒)感染法,无辅助病毒包装系统,如Strategene公司的AAV Helper-FreeSystem,辅助病毒被辅助病毒质粒(如Strategene公司的pHelper质粒)取代,从而产生了不需要辅助病毒参与的三质粒共转染法。作为本发明的优选方式,采用无辅助病毒包装系统进行包装。
在本发明的具体实施例中,将包装好的表达Cas9、sgRNA和TracrRNA的AAV9病毒注射小鼠,成功地在小鼠心肌靶基因DNA中引入突变。
试剂盒
本发明还提供了包含有所述表达Cas9的重组腺相关病毒载体或由该载体包装而成的病毒的试剂盒。
作为本发明的优选方式,所述的试剂盒中还包括所述的在体内形成sgRNA和TracrRNA的载体或有该载体包装而成的病毒。
其它常用于进行病毒包装、转染、注射等的试剂也可被包含在所述的试剂盒中,以方便本领域技术人员使用。此外,所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1.培养基
细胞培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)购自Life Technologies公司;琼脂糖购自Promega公司;限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司;Taq酶和dNTPs购自TaKaRa公司;寡聚核苷酸由南京金斯瑞公司合成。
2、抗体
鼠单抗CHC抗体购自BD Transduction LaboritoriesTM;鼠单抗和兔多抗Flag抗体购自Sigma。辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗鼠和抗兔IgG购自Jackson免疫研究实验室。
3、菌株与质粒
(1)大肠杆菌DH12S获自Invitrogen(Cat.No.18312-017)。
(2)AAV-Cas9的构建
通过引物:MluI-XbaI-CMV-F:atcACGCGTGTGTCTAGAACGCGTG GAGCTAGTTATTAAT(SEQ ID NO:3);和CMV-EcoRI-R:atcGAATTCCGGTACCGGAGGCTG GATCGGTCCC(SEQ ID NO:4)扩增pAAV-MCS载体(图4,GenBank:AF396260.1)中的CMV启动子,通过MluI和EcoRI酶切并接入pAAV-MCS,筛选引入XbaI的载体pAAV-CMV-hGHpolyA。
通过3’末端互补配对的引物miniPolyA-F:AGCTGGTACCGGTCCGCGAATTCaataaaatatctttattttcattacatctgtgt(SEQ ID NO:5)和miniPolyA-R:ATCGCACGTGacacaaaaaaccaacacacagatgtaatgaaaa(SEQ ID NO:6)互为模板扩增miniPolyA,通过KpnI和PmlI酶切接入pAAV-CMV-hGHpolyA,获得pAAV-CMV-minipolyA。
通过AgeI/EcoRI从pX330(图5,获自Addgene,http://www.addgene.org/42230/)切下3×Flag-NLS-Cas9-NLS,接入pAAV-CMV-minipolyA,从而获得AAV-Cas9,如图6。该质粒的全序列如SEQ ID NO:1所示,其中,各元件在序列中的位置如下:
NLS1:第913~963位;
Cas9:第964~5064位;
NLS2:第5065~5112位;
L-ITR:第1~141位;
R-ITR:第5192~5332位(Complementary,其表示与LITR反向互补);
3×FLAG:第844~912位;
miniPolyA:第5122~5169位;
CMV Promoter:第165~828位。
(3)AAV9-sgRNA构建
以pX330为模板,通过引物U6-XbaI-F:ATCTCTAGAgagggcctatttcccatgattc(SEQID NO:7)和U6-gRNA-SalI-BglII-R:GTGAGATCTTCGAGTCGACgccatttgtctgcagaattg(SEQ IDNO:8)扩增U6-chemiric RNA,通过XbaI和PmlI接入载体pAAV-CMV-hGHpolyA,替换掉ITR中间序列。获得pAAV-U6-BB-chemeric_sgRNA。
以pAAV-MCS载体为模板,通过引物AAV-L-ITR-PciI-F:GCTGGCCTTTTGCTCACATGTCCTGCAG(SEQ ID NO:9)和AAV-L-ITR-XbaI-R:CGTTCTAGACACACGCGTGCGGCCGCCCACTCCCTC TCTGCGCGCTC(SEQ ID NO:10)扩增ΔITR(删除了L-ITR的3’端含有D序列的24bp),通过PciI和XbaI替换原有的L-ITR。从而获得载体pscAAV-U6-BB-chemeric_sgRNA(图7)。
pEGFP-C1载体(Clontech)通过BglII和BamHI酶切并自连,去除BglII到BamHI之间的酶切位点,然后以改造后载体为模板,通过引物PGK-EGFP-F:GGCCTTTCGACCGCTAGCGCTACCGGTCGC(SEQ ID NO:11)和SV40_polyA-BglII-R:ACGAGATCTTAAGATACATTGATGAGTTTGGAC(SEQ ID NO:12)扩增EGFP-sv40_polyA序列。然后使用引物PGK-SalI-F:AGTCGTCGACTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGC(SEQ ID NO:13)和PGK-EGFP-R:GGTAGCGCTAGCGGTCGAAAGGCCCGGAGATG(SEQ ID NO:14)从小鼠基因组DNA扩增PGK启动子。并以上述两个PCR产物为模板,使用引物PGK-SalI-F:AGTCGTCGACTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGC(SEQ IDNO:15)和SV40polyA-R:ACGAGATCTTAAGATACATTGATGA GTTTGGAC(SEQ ID NO:16),使用重叠延伸方法扩增融合的PGK-EGFP-SV40_polyA序列。再通过SalI和BglII酶切接入载体pscAAV-U6-BB-chemeic-sgRNA,从而获得载体scAAV-sgRNA(图8)。该质粒的全序列如SEQID NO:2所示,其中,各元件在序列中的位置如下:
EGFP:第1096~1815位;
L-ΔITR:第1~117位;
R-ITR:第2108~2248(Complementary)位;
SV40polyA:第1840~2072位;
U6promoter:第141~389位;
PGK promoter:第574~1073位;
U6terminator:第484~489位;
chimeric guide RNA scaffold:第408~483位。
4、病毒包装
腺相关病毒包装采用无辅助病毒的三质粒包装系统。辅助质粒1(pAdDeltaF6,购自Penn Vector Core)含有所必需的腺病毒辅助基因,辅助质粒2(pAAV2/9(p0008)Q,购自Penn Vector Core)含有腺相关病毒复制及包装必需基因。本实验中辅助质粒2的衣壳蛋白为血清型9,能够辅助包装成AAV9。将AAV-Cas9和AAV-sgRNA分别与上述两个辅助质粒共转染293T细胞,72小时后收集细胞并破碎,经过纯化柱纯化浓缩,测定滴度(vg/ml),分装并冻存于-80℃。
5、AAV病毒介导的感染表达
2.5E+11vg总量的AAV9-Cas9病毒(病毒滴度1E+11vg/ml)通过左心室注射进新生小鼠(一周内)的心腔内,一个月后,取小鼠各组织匀浆检测Cas9蛋白的表达。
或者,AAV9-Cas9病毒和AAV9-sgRNA病毒各2.5E+11vg,1:1混匀经过左心室内注射,1个月后取心肌组织检测目的位点DNA编辑状况。
6、蛋白的收集和检测
小鼠组织用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0),150mM NaCl,2mM MgCl2,0.1%SDS,1.5%NP-40,0.5%去氧胆酸钠)匀浆裂解(含蛋白酶抑制剂:5μg/ml Pepstatin A,10μg/ml Leupeptin,5μM MG-132,1mM PMSF),高速16,000g离心后取上清,然后加入相应体积的4×上样缓冲液(12%SDS,6%β-巯基乙醇,30%甘油,以及适量的溴酚蓝),混匀后95℃温浴10分钟。Western blot检测蛋白的方法参见《分子克隆实验指南》(科学出版社,第二版)。
7、Cas9功能性检测
小鼠心肌组织抽提基因组DNA,PCR扩增目的位点DNA并测序。PCR产物经过Surveyor酶(Transgenomic公司)检测突变效率。
实施例1、Cas9的AAV表达质粒的构建
保留AAV表达载体(pAAV-MCS)关键元件ITR,使用CMV启动子和minipolyA位点替换ITR中间序列。从pX330载体获得3×Flag-NLS-Cas9-NLS序列,插入到CMV和minipolyA位点中间,从而获得AAV-Cas9,其中ITR中间序列总共为5.0kb,其主要元件的示意图如图1A,如此设计使得能够满足AAV包装大小限制。
构建对应的sgRNA表达载体将pX330中嵌合RNA表达元件插入到AAV表达载体(pAAV-MCS)并替换ITR中间序列,得到AAV9-sgRNA,主要元件示意图如图1B。
实施例2、Cas9成功包装进AAV9腺相关病毒并在小鼠成功表达
将构建好的Cas9的AAV表达载体(AAV-Cas9)包装进AAV9腺相关病毒,并通过心腔内注射新生小鼠(一周内)。一个月后,收取小鼠各个不同组织,匀浆后通过western blot检测Cas9蛋白的表达。
结果如图2所示,心脏中Cas9表达最高,其次是脑和肌肉。其他组织表达量很低或检测不到。
实施例3、通过AAV9介导表达的Cas9蛋白在sgRNA及tracrRNA共同作用下能够对心肌细胞DNA进行编辑
向新生小鼠左心室注射表达Cas9和sgRNA嵌合RNA的AAV9腺相关病毒,一个月后提取小鼠心肌基因组DNA。通过扩增sgRNA靶向的DNA区段进行测序,检测该DNA区段的序列。同时利用Surveyor核酸错配酶检测DNA中突变的比例。
结果如图3A-B所示,注射了表达Cas9和sgRNA的AAV9病毒的小鼠,其心肌基因组靶点DNA发生突变,并且是插入或缺失突变。随后使用Surveyor错配核酸内切酶检测突变效率。使用PCR扩增基因组靶点DNA片段,并使其经历变性和重新缓慢均匀退火,这时野生型和产生了突变的DNA分子解链并能够形成含有错配的杂交双链DNA分子。这种带有错配的DNA分子能够被错配酶切断,定量切割后变小的DNA分子(cleaved)和未切割的DNA分子(uncleaved),并按照以下公式计算突变比例:%gene modification=100×[1-(1-fraction cleaved)1/2](D.Y.Guschin,et al.,"A rapid and general assay formonitoring endogenous gene modification,"Methods Mol.Biol.649,247(2010))。根据上述方法计算,本实验中突变DNA大约为30-40%(图3C)。
上述结果表明,构建的Cas9的AAV表达载体能够成功包装出AAV病毒,并且能够正常表达Cas9蛋白,而且具有基因组DNA编辑活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种表达Cas9的重组腺相关病毒载体,其特征在于,该载体包括如下操作性连接的序列元件:5’末端反向重复序列,CMV启动子序列,核定位信号1序列,Cas9编码核酸序列,核定位信号2序列,miniPolyA序列和3’末端反向重复序列;其中所述的Cas9编码核酸序列如SEQ ID NO:1中第964~5064位所示;所述的核定位信号1序列如SEQ ID NO:1中第913~963位所示;所述的核定位信号2序列如SEQ ID NO:1中第5065~5112位所示。
2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体,其特征在于,
所述的5’末端反向重复序列如SEQ ID NO:1中第1~141位所示;
所述的CMV启动子序列如SEQ ID NO:1中第165~828位所示;
所述的miniPolyA序列如SEQ ID NO:1中第5122~5169位所示;
所述的3’末端反向重复序列如SEQ ID NO:1中第5192~5332位所示。
3.如权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体,其特征在于,在核定位信号1序列的5’端或核定位信号2序列的3’端,还包括标签序列。
4.权利要求1所述的重组腺相关病毒载体的用途,用于制备病毒,所述的病毒能够在特定组织中表达Cas9蛋白。
5.一种重组腺相关病毒,其特征在于,所述病毒由权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体包装获得。
6.一种试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中包括:权利要求5所述的重组腺相关病毒;或权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体。
7.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,其中还包括:权利要求1所述的表达Cas9的重组腺相关病毒载体。
8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,其中还包括能在体内形成sgRNA和TracrRNA的载体或由该载体包装成的腺相关病毒。
9.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述的在体内形成sgRNA和TracrRNA的载体包括如下操作性连接的序列元件:缺失D序列的5’末端反向重复序列,sgRNA和TracrRNA的表达盒,和3’末端反向重复序列。
10.如权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,
所述的缺失D序列的5’末端反向重复序列如SEQ ID NO:2中第1~117位所示;
所述的U6启动子序列如SEQ ID NO:2中第141~389位所示;
所述的sgRNA和TracrRNA序列如SEQ ID NO:2中第408~483位所示;
所述的U6终止子序列如SEQ ID NO:2中第484~489位所示;或
所述的3’末端反向重复序列如SEQ ID NO:2中第2108~2248位所示。
11.如权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述的sgRNA和TracrRNA序列的表达盒与3’末端反向重复序列之间,还包括报告基因的表达盒。
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