KR101856345B1 - CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 이중-넉아웃 고양이를 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 유전자가 넉아웃된 형질전환 고양이를 간편하고 효율적으로 제조하는 방법 및 이에 따라 제조된 형질전환 고양이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 생산된 고양이 모델은 HIV-1 감염 및 벡신 연구에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 이중-넉아웃 고양이를 제조하는 방법{Method for generation of APOBEC3H and APOBEC3CH double-knocked out cat using CRISPR/Cas9 system}
본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 유전자가 넉아웃된 형질전환 고양이를 간편하고 효율적으로 제조하는 방법 및 이에 따라 제조된 형질전환 고양이의 용도에 관한 것이다.
고양이 (Felis catus)는 사람의 질병 연구에 있어서 중요한 동물모델 중 하나이다. 레트로바이러스 (Retrovirus) 감염을 포함하여 고양이에게서 발견된 250여종 이상의 유전병은 사람에게도 존재하는 것으로 알려져 있다 [Tamazian G, Simonov S, Dobrynin P et al . Annotated features of domestic cat - Felis catus genome. Gigascience 2014; 3:13]. 예를 들어, FIV (feline immunodeficiency virus)에 감염된 고양이의 AIDS-유사 증후군 (acquired immune deficiency syndrome-like syndrome)은 HIV-1 (human immunodeficiency virus-1)에 감염된 사람의 AIDS (acquired immunedeficiency syndrome)와 유사한 증상을 나타낸다 [Elder JH, Lin YC, Fink E, Grant CK. Feline immunodeficiency virus (FIV) as a model for study of lentivirus infections: parallels with HIV. Curr HIV Res 2010; 8:73-70]. 사람의 질병 모델로 가장 흔히 사용되는 마우스 (mouse) 및 랫 (rat)과 비교하여, 고양이는 더 긴 수명, 특정 사람 조직과의 높은 유사성 등을 포함하여 여러 독특한 장점을 갖는다 [NarfstroK, Holland Deckman K, Menotti-Raymond M. The domestic cat as a large animal model for characterization of disease and therapeutic intervention in hereditary retinal blindness. J Ophthalm 2011; 2011:906-943]. 따라서 여러 연구 그룹들은 형광 단백질을 발현하는 기증체 (donor) 세포의 체세포 핵치환 (somatic cell nuclear transfer, SCNT)을 이용하거나 [Yin ZJ, Lee HS, Yu XF et al. Generation of cloned transgenic cats expressing red fluorescence protein. Biol Reprod 2008; 78(3):425-431 및 GoMC, Pope CE, Kutner RH et al . Generation of domestic transgenic cloned kittens using lentivirus vectors. Cloning Stem Cells 2009; 11(1):167-176], 또는 수정 전 또는 후에 난모세포의 난황주위간극 (perivitelline space)으로 형광 단백질을 미세주입 (microinjection)하는 방법 [Wongsrikeao P, Saenz D, Rinkoski T, Otoi T, Poeschla E. et al. Antiviral restriction factor transgenesis in the domestic cat. Nat Met 2011; 8(10):853-859] 등을 이용하여 고양이를 유전적으로 변형시키기 위해 많은 노력을 기울여 왔다. 그러나 고양이에서는 체세포 핵치환뿐만 아니라 난모세포의 난황주위간극으로의 미세주입 방법도 효과적이지 않았다. 게다가 지금까지 고양이에 대한 유전자 적중을 위한 효율적인 유전체 편집기술은 개발되지 않았으며, 고양이 접합자의 높은 지방 함량은 미세주입을 매우 어렵게 하는 문제점이 있다.
한편, 1987년 일본학자인 Yoshizumi Ishino에 의해 대장균에서 CRISPR가 발견된 이래 DNA를 절단하는 핵산분해효소 (Nuclease)인 Cas9과 결합해서 만들어진 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 새로운 방식으로 다양한 형질전환동물을 생산하는 기술이 개발되었다. 박테리아와 고세균 (archaea)의 CRISPR (clustered, regular interspaced, short palindromic repeats)/Cas9 (CRISPR-associated 9) 시스템은 1987년에 외부 플라스미드와 바이러스의 분해와 관련된 ‘면역 시스템’으로 처음 발견되었다 [Ishno Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Kakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol 1987; 169(12):5429-5433]. 그 이후로 상기 시스템은 여러 응용이 가능하고 매우 효율적인 유전체 편집 기술로 널리 사용되어져 왔다. 이는 흔히 유전자 가위라 불리는 endonuclease splicing 기술로서 1세대인 Zinc-Finger Nucleases (ZFNs)와, 2세대인 Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)보다 효율적이고 손쉽게 유전자를 조작할 수 있는 이점이 있다. 이러한 CRISPR/Cas9 시스템은 특정 유전자 내에 target site와 동일한 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)의 유도에 의해 Cas9의 특정 유전자 내 target site를 공격하여 유전자 삽입과 손실을 일으켜 유전자의 기능을 무력화하는 원리로 작동한다. 이와 같이 만약 염색체 내 특정 부분에 위치한 유전자에 인위적으로 삽입, 손실, 변형 등을 유도할 수 있다면 유전학 및 분자 생물학 연구뿐만 아니라 특정 유전자와 관련된 질병 연구에도 널리 활용될 수 있다. 하지만 위 CRISPR/Cas9 시스템은 아직까지 단지 몇몇의 가축 및 설치류 동물의 배아에만 직접 미세주입하는 방식으로 사용되어져 왔다.
이에 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 mRNA가 고양이 접합자의 세포질 (Cytoplasm) 내로 직접 미세주입되어 높은 효율로 인델 (indels)를 만들 수 있을 것으로 가정하고 연구한 끝에 apolipoprotein B editing complex 3H (APOBEC3H)와 3CH (APOBEC3CH)를 암호화하는 유전자들을 적중 (targeting)하는 sgRNA와 Cas9 mRNA의 세포질 내 미세주입에 의해 유전자 적중된 (gene-targeted) 고양이를 처음으로 제작하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 APOBEC3H 와 APOBEC3CH 유전자를 동시에 넉아웃시킨 형질전환 고양이를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 APOBEC3H 와 APOBEC3CH 유전자가 이중-넉아웃된 형질전환 고양이를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 sgRNA와 Cas9 발현 벡터를 포함하는 CRISPR (clustered, regular interspaced, short palindromic repeats)/Cas9 시스템을 이용하여 특정 유전자를 넉아웃(knockout)시킨 고양이를 제조하는 방법에 있어서, 상기 특정 유전자는 고양이의 APOBEC3H 와 APOBEC3CH 유전자이며, 상기 sgRNA는 APOBEC3H(NCBI Accession Number: NC_018729.2)유전자 내의 서열번호 33으로 표시되는 엑손 3과 APOBEC3CH(NCBI Accession Number: NC_018729.2) 유전자 내의 서열번호 34로 표시되는 엑손 6에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 sgRNA는 APOBEC3H 유전자 내의 엑손 3 및 APOBEC3CH 유전자 내의 엑손 6에 공통적으로 포함되어 있는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 적중 부위(target site)로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 sgRNA와 Cas9 mRNA를 고양이로부터 유래한 세포에 코트랜스펙션(co-transfection)시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 노출시간이 6시간인 체외수정(In vitro fertilization, IVF) 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조되는 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 이중-넉아웃 고양이를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이중-넉아웃 고양이는 HIV-1 감염에 의한 에이즈(AIDS) 발병 연구의 모델로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 생산된 고양이에 대한 유전자 적중 (gene targeting) 분석 결과 예상대로 HIV-1 감염을 억제하는 APOBEC3H와 APOBEC3CH 유전자가 넉아웃된 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 고양이 모델은 HIV-1 감염 및 백신 연구에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 CRISPR/Cas9 시스템의 세포질내 미세주입 (Cytoplasmic microinjection, CP)에 의한 Feline APOBEC3H (fA3H)/Feline APOBEC3CH (fA3CH) 이중-넉아웃 고양이의 제작을 나타낸 것이다.
(a) 엑손과 유전자 적중 부위를 나타낸 fA3H/fA3CH 유전자좌(genomic locus)의 개요도. 붉은색 문자는 sgRNA 표적 서열의 PAM (protospacer adjacent motif) 부위이며, 밑줄 부위는 PCR-RFLP 방법에 사용되는 제한효소 인식부위(HaeII)임. 초록색 화살표는 PCR-RFLP 방법에 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 나타냄.
(b) 대리모와 fA3H/fA3CH sgRNA 및 Cas9 mRNA를 세포질내 주입한 배아로부터 태어난 새끼 고양이.
(c) 세포질내 미세주입 배아로부터 태어난 새끼 고양이의 PCR-RFLP 어세이 결과. 새끼고양이 IDs: #1, #2, #3, #4, #5, 및 #6. #1 새끼 고양이는 homozygous하게 적중되었으며, #5는 heterozygous 또는 mosaical하게 적중되었다; 나머지 고양이들은 야생형임.
(d) fA3H/fA3CH 유전자좌에서 야생형 서열과 #1 새끼 고양이의 생거 시퀀싱의 비교. 붉은색 박스는 fA3H/fA3CH 유전자좌에서 한 개의 뉴클레오티드의 결실(deletion)을 나타냄.
(e) 체외수정된 배반포에서의 유전자 적중 결과
(f) 살아 있는 fA3H/fA3CH 적중된 새끼고양이의 제작 결과. F; Female.
도 2는 단세포(one-cell) 단계의 고양이 배아를 나타낸다.
a) 마이크로-조작(micro-manipulation) 기술을 이용한 고양이 접합자로의 세포질내 미세주입
b) 마이크로-조작 기술을 이용한 시리안 골든 햄스터로의 세포질내 미세주입
도 3은 fA3H/fA3CH 유전자좌에서 적중 부위를 포함하는 영역의 서열을 나타낸다. 붉은색 뉴클레오티드는 디자인된 sgRNA의 적중 부위를 나타낸다(볼드체는 PAM 서열임). 파란색 뉴클레오티드는 각각 fA3H/fA3CH 유전자좌에서 적중 부위를 포함하는 영역을 증폭하는데 사용되는 정방향 및 역방향 PCR 프라이머의 결합 부위를 나타낸다. 초록색 뉴클레오티드는 PCR-RFLP 방법에 사용되는 프라이머의 결합 부위를 나타낸다.
도 4는 PCR-RFLP 방법에 의해 측정된, 고양이 배아 섬유아세포의 fA3H/fA3CH 유전자좌에서의 유전자 적중 효율을 나타낸다. M. DNA ladder. 1. 트랜스펙션되지 않은 고양이 섬유아세포. 2. pX330-fA3H/fA3CH 플라스미드로 트랜스펙션된 고양이 섬유아세포(유전자-적중 효율: 23%). 3. fA3H/fA3CH sgRNA/Cas9 mRNA로 트랜스펙션된 고양이 섬유아세포(유전자-적중 효율: 41%).
도 5는 난모세포 채취로부터 배아 이식까지의 수술 과정을 나타낸다.
Donor: 1) Laparotomy. 2) Finding the ovary. 3) Checking the corpus luteum to determine whether hormone priming worked. 4) & 5) Recovery of the oocyte from ovary by aspiration. 6) Suture.
Recipient: 1) Laparotomy. 2) Finding the ovary. 3) Checking the corpus luteum to determine whether hormone priming worked. 4) Loading the embryos into a plastic tube for transfer. 5) Catheter injection. 6) Suture.
도 6은 핵형 분석 결과이다.
도 7은 대조군(WT) 및 새끼 고양이 #1, 및 #5의 유전체 DNA에 대해 PCR-RFLP 방법를 이용하여 수행한 DNA 오프-타겟팅 분석 결과이다. 좌측 패널: 잘리지 않은 PCR 산물; 우측 패널: 제한효소로 잘린 PCR 산물. 각각의 패널은 잘리거나 잘리지 않은 PCR 산물의 예상크기를 나타낸다. WT, 야생형 고양이; #1 및 #5, fA3H/fA3CH 유전자좌가 넉아웃된 새끼 고양이.
본 발명의 일 양태에 따른 본 발명의 목적은 고양이 내 인간 HIV-1에 대한 제한 인자(Restriction Factor)인 APOBEC3 패밀리의 구성원인 APOBEC3H (fA3H)와 APOBEC3CH (fA3CH)를 유전적으로 변형시킴으로 인하여 HIV-1 감염을 원활하게 하여 AIDS 연구에 유용한 고양이를 생산하고자 하는 것이다.
APOBEC3 단백질은 DNA와 RNA에서 사이티딘(cytidine)을 우리딘(uridine)으로 전환함으로써 레트로바이러스를 제한하는데 중요한 역할을 하는 탈아미노효소(deaminases)이다. APOBEC3 는 포유동물에서만 나타나며, 각각의 종들은 구별되는 개수의 유전자 패밀리 멤버들을 갖고 있다[Willems L. & Gillet NA. APOBEC3 Interference during Replication of Viral Genomes. Viruses 2015; 7(6):2999-3018]: 사람은 7개의 유전자들을, 고양이는 4개를, 마우스 및 랫은 각각 1개씩만을 갖고 있으며, 이에 따라 APOBEC3 기능에 관한 연구에서 설치류 모델의 유용성은 제한적일 수 밖에 없다. 이와는 대조적으로, 고양이의 APOBEC3H (fA3H) 및 APOBEC3CH (fA3CH) 는 고양이 세포에서 HIV-1 복제를 억제한다는 사실이 확인되었으며[MuC, Zielonka J, Constabel H et al . Multiple restrictions of human immunodeficiency virus type 1 in feline cells. J Virol 2007; 81(13):7048-7060], 구체적으로 fA3H와 fA3CH는 고양이 체내에서 HIV-1의 감염을 감소시키고, HIV-1 아미노산 서열 내 Glycine (G)의 Alanine (A)로의 hyper mutation을 유도한다고 알려져 있다. 따라서, 고양이에서 이들 유전자들의 유전적 불활성화는 HIV-1 복제를 증진시키고 HIV-1 감염의 고양이 모델을 개발하는데 이용될 수 있다.
한편 CRISPR/CAS9 시스템은 특정한 유전체의 좌위에서 돌연변이를 유도할 수 있는 간편하고 쉬운 방법으로, 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 RNA (sgRNA)와 특정한 염기서열을 자르는 역할을 하는 Cas9 nuclease로 구성되어 있으며, 세포나 동물에 plasmid DNA를 도입하여 특정 유전자의 기능을 완전히 억제할 수 있는 넉아웃(knock-out)이 가능하다.
본 발명자들은 CRISPR/CAS9 시스템을 이용하여 fA3H/fA3CH 이중-넉아웃 고양이를 제작하기 위하여, 우선 fA3H/fA3CH의 유전자 서열을 PCR 증폭하고 유전자 분석 결과를 확보하였다. 이 fA3H/fA3CH 유전자 서열을 바탕으로 특정 target site에 대한 sgRNA 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotides)를 디자인하였고 이를 CRISPR/Cas9 플라스미드인 pX330에 삽입하여 CRISPR/Cas9 플라스미드인 pX330-fA3H/fA3CH를 완성하였다. 이를 바탕으로 fA3H/fA3CH에 대한 sgRNA와 Cas9 mRNA를 합성하였다.
이를 이용한 CRISPR/Cas9 mRNA의 유전자 적중 효율을 세포 내에서 확인하기 위해서, 고양이 귀 섬유아세포에 트랜스펙션(transfection)한 결과 pX330-fA3H/fA3CH 플라스미드(DNA)는 23%, fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA(RNA)는 41%의 유전자 손실 및 삽입 효율을 보였다. 이렇게 구축된 fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA를 이용하여 형질전환 고양이 생산을 위해서 고양이 난자 회수, 체외 성숙, 정자 채취, 그리고 이를 이용한 체외 수정 및 배아 이식 등의 방법 등을 최적화하였다. 특히, 전핵 단계 고양이 초기 배아 세포질 내에 fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA를 미세주입하여 배반포 단계까지 발달을 조사하여 최적의 미세조작(micro-manipulation) 방법을 구축하였다.
이러한 배반포에서 genomic DNA를 추출하여 PCR-RFLP 방법으로 배아 내에서 CRISPR/Cas9 시스템의 효율을 조사하였다. 그 결과 24개의 배반포에서 15개 배반포가 유전자 적중됨을 보였으며(15/24=62.5%), 이중 12개 배반포는 bi-allelic knocked out homozygote이며, 나머지 3개 배반포는 mon-allelic knocked out heterozygote이었다. 이를 바탕으로 fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA를 미세주입 배아를 가임신 된 대리모 고양이 수란관내에 이식하였다. 이후 30일 후에 임신여부를 확인하고 65일째 2마리의 대리모 고양이로부터 6마리의 산자를 얻었으며 이중 2마리가 유전자 서열 분석을 통하여 최종적으로 유전자 적중됨을 확인하였다(2/6=33.3%). 이중 한 마리는 fA3H/fA3CH exon 3내 target site에 하나의 뉴클레오타이드가 손실된 bi-allelic knocked out된 고양이이고, 다른 하나는 두개의 뉴클레오타이드가 손실된 mono-allelic knocked out 고양이로 밝혀졌다.
이는 CRISPR/Cas9 시스템으로 유전자 적중(gene targeting)된, 특히, HIV-1 감염에 의한 AIDS 발병 연구에 중요한 모델 고양이로 사용될 수 있는 최초의 유전자 적중 고양이다. 이는 CRISPR/Cas9 시스템으로 다양한 종류의 유전자에 대한 유전자 적중 및 유전자 삽입 (Knock In)을 가능케 하는 계기가 될 수 있다. 특히, 향후 이 fA3H/fA3CH 유전자 적중 고양이를 이용하여 HIV-1 감염에 대한 백신 개발을 가능케 하고 AIDS치료를 위한 항체 생산에 활용도가 높을 것으로 예측된다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실험방법
1. 시약
본 실시예에서 사용된 모든 시약은 달리 언급되지 않는 한 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
2. 실험동물
본 발명에서 사용한 고양이는 domestic cat (일반고양이)로서 본 연구실의 고양이 사육장에 사육 중인 것을 사용하였다.
대리모(recipients) 및 기증체(donors)로 사용된 암컷 고양이들은 1.86 m × 0.73 m × 0.65 m (W × D × H)의 스테인리스 스틸 우리에서 개별적으로 사육하였으며, 건식사료(dry food)와 물을 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다. 사육실의 온도는 21-25℃로, 빛 주기는 14D:10L로 조절하였다. 모든 고양이들에 대해 고양이 백혈병 바이러스(feline leukemia virus, FeLV), 면역부전 바이러스(feline immunodeficiency virus, FIV), 및 전염성복막염(feline infectious peritonitis, FIP)에 감염되지 않은 것을 확인하였다.
3. fA3H / fA3CH 유전자 적중 벡터의 제작
고양이 유전체 서열 정보(NC_018729.2)에 기초하여 fA3H/fA3CH 유전자좌(locus)의 서열을 증폭 및 확인하기 위한 PCR 프라이머 (Primer)를 디자인하였다(표 1 및 도 3).
fA3H/fA3CH 유전자좌 (locus)의 증폭 및 시퀀싱을 위한 프라이머 (Primer)
프라이머 서열 (5′ → 3′) PCR 산물의 크기
(bp)		 Annealing 온도
(℃)
A3 F1 TTGAGACCGTGTTGTAGGGGTG (서열번호 1) 623 57
A3 R1 CCTGCTTCGGTCCAGCCTC (서열번호 2)
A3 F2 CACTGACGCGGGACACATC (서열번호 3) 223 57
A3 R2 GGGAGGCTCATGACAGCCAC (서열번호 4)
(A3 F1 및 A3 R1 프라이머는 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 적중(targeted)된 fA3H/fA3CH 의 일부 서열을 증폭하기 위한 것이다. A3 F2 및 A3 R2 는 PCR-RFLP 어세이에 사용된 것이다.)
그 후 오프-타겟 이벤트(off-target events)를 피하고 유전자 적중 효율을 높이기 위해 CRISPR 디자인(Website; http://crispr.mit.edu/)을 이용하여 fA3H 의 엑손 3 (fA3CH의 엑손 6)를 적중하는 sgRNA를 디자인하였다(도 1A,3).
fA3H/fA3CH sgRNA/Cas9 유전자 적중(targeting) 벡터의 제작을 위해, pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 플라스미드(pX330, Addgene, Cambridge, MA, USA)를 BbsI (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)로 선형화하고, 그 크기를 1% 아가로오스겔 (agarose gel) 전기영동으로 확인하였다[Cong L, Ran FA, Cox D et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas9 systems. Science 2013; 339:819823]. 선형화된(linearized) 벡터 pX330을 정제하고, fA3H/fA3CH를 적중하는 sgRNA 올리고뉴클레오티드(표 2)를 어닐링하여 BbsI 부위에 접합시킴으로써 유전자 적중에 사용할 pX330-fA3H/fA3CH 벡터를 제작하였다.
Figure 112016082523696-pat00001
* 표적부위(Target site) 서열 중 붉은색 볼드체로 표시한 서열(TGG)은 PAM 서열을 나타낸다; 밑줄표시한 뉴클레오티드들은 pX330 벡터와의 접합을 위한 overhang 서열들이다.
4. sgRNA 및 Cas9 mRNA의 시험관 내( in vitro ) 전사
MEGAshortscript T7 transcription kit (Ambion, Foster City, CA, USA) 및 mMESSAGE mMACHINE mRNA transcription synthesis kit (Ambion)를 각각 이용하여 fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA를 시험관 내(in vitro)에서 전사시켰다. pX330-fA3H/fA3CH 플라스미드를 주형으로 하고, T7 프로모터 영역을 포함하는 아래 표 3의 프라이머를 사용하였다. MEGAclear kit (Ambion)를 이용하여 합성된 RNA들을 정제하였다.
fA3H/fA3CH sgRNA 및 Cas9 mRNA의 시험관 내 전사를 위한 올리고뉴클레오티드
Oligos Sequence (5′ → 3′)
A3CRISPR IF TTAATACGACTCACTATAGGGCCTGTACGTCCACTGGCGC (서열번호 8)
A3CRISPR IR AAAAGCACCGACTCGGTGCC (서열번호 9)
Cas9 F TAATACGACTCACTATAGGGAGATCGCCACCATGGACTATAAGGACCACGAC (서열번호 10)
Cas9 R GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC (서열번호 11)
* 밑줄친 뉴클레오티드는 T7 프로모터 영역을 나타낸다.
5. 고양이 귀 섬유아세포 구축
고양이 귀 조직으로부터 고양이 귀 섬유아세포(Cat ear fibroblasts, CEFs)를 확립하였다. 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)(Gibco), 비필수 아미노산(Gibco) 및 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)을 첨가한 DMEM (11995-065, Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 CEFs를 배양하였다(95% air/5% CO2의 가습 공기에서 38.5℃로 배양). 4D-Nucleofector 시스템과 P3 primary cell 4D-nucleofector X kit L (Lonza, Walkersville, MD, USA)을 이용하여 1 마이크로그램의 환형(circular) pX330-fA3H/fA3CH 플라스미드를 2×105 CEFs에 트랜스펙션(transfection)시켰다. mRNA 트랜스펙션을 위해, 200 ng의 fA3H/fA3CH sgRNA 및 800 ng의 Cas9 mRNA를 CEFs에 코트랜스펙션(co-transfection)시켰다. 48시간 후에 세포들로부터 유전체(genomic) DNA를 분리하여 유전자형(genotyping) 분석을 수행하였다.
6. 세포, 배반포(blastocysts) 및 고양이들의 유전자형 분석
Puregene Core Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 트랜스펙션시킨 CEFs로부터 유전체 DNA를 분리하였다. PureLink Genomic DNA Mini Kit (Thermo Scientific)를 이용하여 주사된 접합자(zygotes)에서 유래한 배반포로부터 유전체 DNA를 분리하였다. 상기 Puregene Core Kit를 이용하여 새끼 고양이의 귀 생검(biopsies)으로부터 유전체 DNA를 분리하였다. fA3H/fA3CH 유전자좌에 대해 디자인한 프라이머(표 1)를 이용하여 fA3H/fA3CH 의 엑손 3를 포함한 영역을 유전체 DNA로부터 PCR-증폭하였다. PCR 산물을 PCR-RFLP 어세이로 분석하고, 절단된 PCR 산물의 상대적 농도를 ImageJ 소프트웨어(NIH, Rockville, MD, USA)로 정량하여 유전자-적중 효율(gene-targeting efficiencies)을 계산하였다(도 4). #1 및 #5 새끼 고양이의 유전체 PCR 산물을 pcDNA2.1 벡터(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)에 서브클론하고, 인델(indels) 부위를 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)으로 검출하였다.
7. 난모세포 채취 및 체외성숙( in vitro maturation, IVM)
2-4세 연령의 몸무게 약 5kg의 성숙한 암컷 고양이 5마리를 배아 기증체(embryo donors)로 사용하였다. Yin et al. (2008)에 기술된 방법과 같이 4일 간격으로 400 IU equine chorionic gonadotropin (eCG; 대성, 대한민국 서울) 및 100 IU human chorionic gonadotropin (hCG; 대성, 대한민국 서울)을 주입하여 기증체 고양이에서 난소 여포성 발육(ovarian follicular development)을 확인하였다[Yin XJ, Lee HS, Yu XF et al. Generation of cloned transgenic cats expressing red fluorescence protein. Biol Reprod 2008; 78:425431]. 난소의 개복수술은 국립경상대학교 동물의료센터에서 수행하였다. 일반적인 마취하에 미성숙한 난모세포들을 1 ml 시린지(syringe)에 부착된 18G 바늘로 흡출하였다(도 5). 10% (vol/vol) FBS, 1 μg/ml estradiol-17β, 10 μg/ml FSH, 0.6 mM cysteine, 0.2 mM sodium pyruvate 및 1% penicillin G/streptomycin (P4333)를 첨가한 체외성숙(in vitro maturation, IVM) 배지(M199, M7528)에서 채취한 난모세포들을 4시간 동안 배양하였다(95% air/5% CO2의 가습공기에서 38.5℃로 배양).
8. 정액 채취 및 냉동보존
인공질법(artificial virginal method)을 이용하여 고양이의 정액을 채취하였다[Sojka NJ, Jennings LL, Hamner CE. Artificial insemination in the cat (Felis catus L.). Lab Anim Care 1970; 20:198204 및 Tanaka A, Kuwabara S, Takagi Y et al. Effect of ejaculation intervals on semen quality in cats. J Vet Med Sci 2000; 62:11571161]. 100 IU eCG를 주사하여 수컷을 유인하기 위한 암컷 고양이의 발정을 유도하였다. 채취된 정액을 Dulbecco’s phosphate-buffered saline (D-PBS, 1689670, Gibco)에서 세척하고, 1800 × rpm 으로 5분간 원심분리한 후 냉동보존 프로토콜에 따라 냉동시켰다[Ha AN, Yoon JH, Kim YG, Jo AR, Lee KR, Kong IK. Effect of Semen Collection Methods on the Post-thaw Viability of Cat Semen. Reprod Dev Biol 2011; 35:5560]. 고양이 정액을 동결할 버퍼(semen-extender Tris buffer)는 Tris buffer에 20% egg yolk와 1% penicillin G/streptomycin을 첨가한 Extender I (Ext I)과, Ext I에 8% glycerol과 1.0% Equex STM paste를 첨가한 Extender II (Ext II)를 제조하였다. Ext I으로 희석한 정액을 10 ml 튜브(SPL Life Sciences Co. Ltd., 대한민국 포천시)에 넣고, 200 ml 비커에서 150 ml의 온수(35℃)에 잠기게 하고, 적어도 2시간 동안 냉장고에서 5℃까지 서서히 냉각시킨 뒤 순차적으로 Ext II로 적어도 1시간 동안 희석시킨다. 마지막으로, 5℃의 냉장실에서 냉각된 정액을 0.25 ml 스트로우(straw)에 담아 밀봉하고 냉동박스 내 액체질소 증기의 표면 위 5 cm 위치에 위 튜브를 유지시켜 동결한 후 바로 LN2 에 입수시켜 냉동보존한다.
9. 체외수정( In vitro fertilization , IVF ) 및 배아 배양
체외수정(IVF)을 위해, 해동된 정자를 D-PBS에 희석시키고 1800 × rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 뭉친(pelleted) 정자를 500 μl의 20 μg/ml 헤파린으로 15분간 희석시켜 수정능획득(capacitation)을 유도하였다. 성숙한 난모세포들을 수정능을 획득한 정자(1-2×106/ml)로 시험관 내(in vitro)에서 2, 3, 4, 5 또는 6시간 동안 수정시켜 다정자수정(polyspermy)을 감소시키는 최적의 노출시간을 확인하였다. 접합자(zygotes)로 추정되는 것을 in vitro culture-1 (IVC-1) 배지에서 44 μg/ml sodium pyruvate, 14.6 μg/ml glutamine, 10 μl/ml penicillin/streptomycin, 3 mg/ml bovine serum albumin (BSA; A6003, St. Louis, MO, USA) 및 310 μg/ml glutathione을 첨가한 CR1-aa 배지 50 μl 액적(drop)으로 옮겼다. 시험관 내에서 수정된 난모세포의 최적 배양조건을 결정하기 위해, 4, 5, 6 또는 10시간의 IVF 노출시간에 이어, 접합자를 4, 3, 6 또는 10시간 동안 IVC-1에서 배양한 후, 7일간 IVC-1을 10% (vol/vol) FBS를 첨가한 in vitro culture-2 (IVC-2) 배지로 교체하였다. IVM, IVF, IVC-1 및 2에서 모든 난모세포들과 배아들은 95% air/5% CO2의 가습공기에서 38.5℃로 배양하였다.
10. 접합자에서 mRNA의 미세주입(microinjection)
0.3% μg/ml BSA를 첨가한 manipulation medium, TCM199 (M7528)에서 접합자를 세척한 후 따뜻하게 데운 현미경 스테이지 위에서 manipulating medium 미세액적(microdrop) 안에 위치시킨다. 접합자의 배치 전에 현미경 아래에 세포조작용 피펫(manipulation pipets)을 준비하고, 배아에 mRNA를 주입하기 위한 준비를 한다; 홀딩 피펫(holding pipet)으로 극세포(polar body)를 0 또는 180°(즉, 6 또는 12 시)에 유지시킨다. 공지의 방법[Ittner LM, GoJ. Pronuclear injection for the production of transgenic mice. Nat Prot 2007; 2(5):1206-1215]에 따라 Femtojet injector system (Eppendorf, Hauppauge, USA)을 사용하여 fA3H/fA3CH sgRNA 및 Cas9 mRNA 혼합물 10 pl을 접합자의 세포질에 주입하였다. 주입된 접합자들을 IVC-1 배지로 3회 세척한 뒤, 유전자형 분석을 위해 IVC-1 배지에서 배반포(blastocyst) 단계로 배양하거나 유전자-적중 고양이를 만들기 위해 대리모 고양이의 수란관(oviducts)에 직접 이식하였다.
11. 체외 생산된 배반포의 염색체 핵형 분석(karyotyping)
핵형분석(karyotyping)을 위해, IVC 후 7일째 배반포(blastocysts)를 10 mg/ml colcemid (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel)를 함유한 IVC-2 배지에 68시간 동안 두고, 0.9% (w/v) sodium citrate의 저장액(hypotonic solution)에서 20분간 처리한 뒤, Dey et al.의 프로토콜[Dey S, Deb GK, Ha AN et al . Coculturing denuded oocytes during the in vitro maturation of bovine cumulus oocytes complexes exerts a synergistic effect on embryo development. Theriogenology 2012; 77(6):1064-1077]을 변형시켜 몇 방울의 고정액(1:3 아세트산:메탄올)을 첨가하여 고정시켰다. 배반포를 개별적으로 깨끗한 유리 슬라이드 위로 옮기고, 한 방울의 아세트산을 그 위에 놓아 할구(blastomeres)를 분리시켰다. 마지막으로 배아의 염색체를 펼치고 여러 방울의 고정액으로 고정시켰다. 염색체 샘플을 공기 중에서 말리고 4% Giemsa 용액으로 5분간 염색하였다. 위상차현미경(Zeiss, Axioskop, Germany) 하에서 중기판(metaphase plates)을 관찰하였으며, PSI:Capture (version 5.4) 이미징 소프트웨어를 이용하여 염색체의 쌍을 맞추어 핵형분석(karyotyping)을 수행하였다. 줄무늬의 염색체 모양이 Ford et al. [Ford, C.E, Pollock DL, Gustavsson I. Proceedings of the First International Conference for the standardisation of Banded Karyotypes of Domestic Animals University of Reading. England 2nd-6th August.Heriditas 1980; 92(1):145-162] 및 Merson et al.[Merson MH, O’Malley J, Serwadda D, Apisuk C. The history and challenge of HIV prevention. The Lancet 2008; 372(9637):475-488]의 고양이 핵형을 따랐다.
12. 배아 이식, 임신 테스트, 분만 및 사진촬영
수술실에서 37℃ 온수 보온병을 이용하여 미세주입한 배아(embryos)를 대리모 고양이의 수란관에 이식하였다(도 5). 수술 전에 각각의 고양이에게 medetomidine (10 μsubcutaneous injection; Domitor, Orion Pharma, Espoo, Finland), atropine (0.04 mg/kg; subcutaneous injection; Jeil Pharmaceutical Co., Daegu, Republic of Korea), acepromazine (0.1 mg/kg; subcutaneous injection; Samu Med., Seoul, Republic of Korea), 및 cefazolin (25 mg/kg, intravenous (i.v.) injection; Chong Kun Dang Pharm Co., Seodaemun-Gu, Republic of Korea)을 투여하였다. 2 mg/kg etomidate (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany)을 정맥주사(i.v. administration)하여 고양이들을 마취시켰다. 기관내삽관(endotracheal tube)을 통해 산소와 함께 2.5% isoflurane을 흡입시켜 마취를 유지하였다. 수술 과정 동안 생리식염수를 10 ml·kg-1·h-1으로 정맥내주사(i.v.) 하였다. 미세주입한 배아를 카테터에 올려 약 0.5 ml의 배지에서 컬럼을 만들고, 4마리의 동기화된(synchronized) 대리모 고양이들 각각에 415 배아를 외과적으로 이식하였다.
임신은 약 30일째 ultrasonography (Xario® SSA-660A, TOSHIBA, Hamamatsucho, Japan)를 통해 확인하였고, 임신한 고양이들은 자연분만시까지 분리된 방에서 사육하였다.
13. 오프-타겟팅(Off-targeting) 분석
새끼 고양이의 유전체에 어떠한 오프-타겟팅 이벤트의 가능성이 있는지 조사하기 위해, 고양이의 참조 유전체(assembly Felis_catus_8.0; www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/78) 상에서 sgRNA 서열을 쿼리(query)로 사용하여 BLAST 검색(www.rgenome.net/cas-offinder/)을 수행하여 씨드(seed) 서열에 대해 ≤3 미스매치인 서열을 찾았다(표 4).
Figure 112016082523696-pat00002
* PAM 서열은 붉은색으로 표시하였다. 표적 서열과 잠재적인 오프-타겟팅 후보 서열 사이의 뉴클레오티드 미스매치는 소문자로 나타내었다. 시드(seed) 영역의 미스매치는 녹색으로 표시하였고 다른 미스매치들은 파란색으로 표시하였다.
하기 표 5에 기재된 프라이머들을 이용하여 타겟 서열에 대해 가장 높은 유사성을 가진 7개의 잠재적인 오프-타겟 부위를 PCR 증폭하고, PCR-RFLP 어세이로 분석하였다.
오프-타겟팅 분석을 위한 프라이머들
Oligos Sequence (5′→3′) PCR product size (bp)
A3 OF 1 F: CCATGAAGAAATTTGTTTTTTGA (서열번호 19)
R: TCCCAGGGCTGAAAATTCCTG (서열번호 20)		 483
A3 OF 2 F: CAGCACACCTGCCTACGTC (서열번호 21)
R: GCGTGATGGGTATGTGAGCA (서열번호 22)		 552
A3 OF 3 F: CAGTAGTTTGTTTCTGTTTATTGTT (서열번호 23)
R: ACGAATGGAGGAGCGGATTG (서열번호 24)		 433
A3 OF 4 F: GCTTCCCTGGCCAACTTT (서열번호 25)
R: TCAAAAGAGTTAACAACAGTGGAC (서열번호 26)		 411
A3 OF 5 F: acaccaagtcgctgcttcta (서열번호 27)
R: ACAGCACTGAAAAATGAAGGACA (서열번호 28)		 506
A3 OF 6 F: AAGTGGGGGTGTCGCCGC (서열번호 29)
R: CAGCCGCTCGCGGAGGC (서열번호 30) 		482
A3 OF 7 F: TGCCCAGGATTGCCCATATT (서열번호 31)
R: CAGTGCCCTCTCTCCAGTTC (서열번호 32)		 443
APOBEC3H 유전자의 엑손 3과 APOBEC3CH 유전자의 엑손 6
Oligos Sequence (5′→3′)
exon 3 of fA3H CCAGAGATTCGAAATCATCTGCTATATCACATGGAGCCCCTGCCCCTTCTGTGCCGAGGAACTGGTTGCGTTTGTCAAAGACAACCCCCACCTCAGCCTGCGGATCTTTGCCTCCCTGGAAGTATCAGCAGGGGCTGAGACACCTGCACGCATCCGGGATCCCAA (서열번호 33)
exon 6 of fA3CH CCAGAGATTCGAAATCATCTGCTATATCACATGGAGCCCCTGCCCCTTCTGTGCCGAGGAACTGGTTGCGTTTGTCAAAGACAACCCCCACCTCAGCCTGCGGATCTTTGCCTCCCTGGAAGTATCAGCAGGGGCTGAGACACCTGCACGCATCCGGGATCCCAA (서열번호 34)
1. pX330 - fA3H / fA3CH 벡터, fA3H / fA3CH sgRNA 및 Cas9 mRNA를 이용한 트랜스펙션
fA3H 와 fA3CH 가 그들의 마지막 4개 엑손(fA3H 의 exons 25 및 fA3CH 의 exons 58[Munk C, Beck T, Zielonka J et al. Functions, structure, and read-through alternative splicing of feline APOBEC3 genes. Genome Biol 2008; 9(3):R48])을 공유한다는 사실에 기초하여, 본 발명자들은 상기 fA3H 와 fA3CH 의 공유 서열들을 PCR-증폭할 수 있는 프라이머를 설계하였고(표 1 참조), 그 후 증폭물(amplicons)의 서열을 분석하였다. 시퀀싱 결과에 기초하여, 본 발명자들은 위 두 개의 유전자들을 동시에 넉아웃(knockout) 시킬 수 있도록 fA3H의 exon 3 (fA3CH의 exon 6)를 적중하는 single sgRNA를 CRISPR 디자인(Website; http://crispr.mit.edu/)을 이용하여 디자인하였다(도 1A, 3 및 표 2 참조).
이중-넉아웃을 위한 가장 효과적인 전략을 결정하기 위해, 본 발명자들은 고양이 귀 섬유아세포(fibroblasts)에 대해 다음 두 가지 접근법을 비교하였다: (1) sgRNA/Cas9 발현 DNA 벡터(pX330-fA3H/fA3CH 벡터)의 트랜스펙션, 또는 (2) 시험관 내(in vitro) 전사(표 3 참조)에 의해 준비된 sgRNA 및 Cas9 mRNA의 코트랜스펙션(co-transfection).
시험관 내 유전자-적중 분석 결과 CRISPR/Cas9 시스템은 다음과 같이 높은 효율로 인델 부위를 유도하였다: 즉, Cas9 이 각각 DNA 및 mRNA 형태로 도입되었을 때 고양이 귀 섬유아세포의 23% 및 41%가 fA3H/fA3CH 유전자좌(locus)에 적중되었다(도 4 참조).
2. 체외수정( in vitro fertilization , IVF ) 및 미세주입 조건의 확립
CRISPR/Cas9 mRNA를 고양이 접합자(zygote)에 높은 효율로 세포질내 미세주입하기 위한 프로토콜을 수립하기 위해, 본 발명자들은 암컷 기증체(donor)로부터 생식세포(gamete)들을 채취하여 체외성숙(in vitro maturation, IVM)시키고 시험관 내에서 정자와 함께 수정시켰다(도 5).
일반적으로 다정자수정(polyspermy)은 접합자로부터 배반포로의 발달을 저해할 수 있기 때문에 다수의 고품질의 접합자를 얻기 위해, 체외수정(in vitro fertilization, IVF) 노출시간이 접합자의 다정자수정(polyspermy)에 미치는 영향을 조사하였다. 이에 따르면 다정자수정율은 노출시간에 따라 차이가 있었으며, 특히 6시간의 노출시간에서 다정자수정율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(표 7).
IVF 노출시간이 고양이 배아의 다정자수정에 미치는 영향
IVF time (h) Oocyte used Penetrated oocytes Polyspermy (%)
2 5 2 0
3 7 6 3 (50.0)
4 10 10 4 (40.0)
5 11 11 6 (54.5)
6 12 12 4 (33.3)
상기 체외수정(in vitro fertilization, IVF) 노출시간은 배아(embryo)의 질에도 영향을 미치므로 본 발명자들은 IVF 노출시간과 in vitro culture (IVC)-1 medium (IVC-1) 내 배양이 발달 능력에 미치는 영향을 측정하고, 이에 따라 각각의 단계들의 시간 간격을 최적화하였다(표 8).
IVF 노출시간이 고양이 배 발달능력에 미치는 영향
Replicate Oocytes used IVF (h) IVC-1 (h) Blastocysts (%)
1 9 4 4 0 (0)
2 8 5 3 1 (12.5)
3 11 6 6 3 (27.3)
4 16 18 10 4 (25.0)
위 결과에 따라 본 발명자들은 IVF 6시간 후에 50 ng/μl sgRNA 및 100 ng/μl Cas9 mRNA를 1:1의 부피비로 포함하는 주사 용액 10 pl을 세포질 내 미세주입(microinjection)하였다. 그 결과 주사되지 않은 IVF 고양이 배아의 배양에서 일반적으로 나타나는 것과 유사하게, 높은 비율의 배아 생존(95.5%) 및 배반포 형성(22.5%)이 나타났다(도 1E).
단일 배반포 상의 PCR-RFLP 어세이에 따르면, fA3H/fA3CH 유전자좌에서 높은 효율의 유전자 적중(62.5%, 15/24) 결과가 달성되었다(도 1E). 분석된 15개의 배반포 중에서 12개의 배반포가 biallelic하게 적중된 반면에, 3개의 배반포는 monoallelic하거나 mosaical하게 적중되었다(도 1E).
3. 핵형분석
fA3H/fA3CH sgRNA 및 Cas9 mRNA가 미세주입된 상기 배반포들의 유전질환을 조사하기 위해 핵형분석(karyotyping)을 수행한 결과 추가되거나 소실된 염색체는 발견할 수 없었다(도 6). 이러한 결과는 CRISPR/Cas9 mRNA의 세포질내 미세주입이 고양이의 배아에서 배 발달을 저해하거나 배반포에 손상을 일으키지 않고 유전자 적중을 유도할 수 있다는 것을 보여준다.
4. 형질전환 고양이의 출산 및 유전자 적중 결과의 확인
fA3H 및 fA3CH 이중-넉아웃 고양이를 생산하기 위해, 본 발명자들은 fA3H/fA3CH sgRNA 및 Cas9 mRNA를 세포질에 미세주입 후 2시간의 이내에 45개의 배아들을 4마리의 가임신 대리모(pseudo-pregnant queens)의 난관 누두부(oviduct infundibula)에 이식하였다. 배아 이식 30일째 초음파 검사를 통해 대리모(recipients) 고양이들 중 2마리의 임신을 확인하였고, 그들은 65일째 6마리의 고양이를 출산하였다(도 1B, 1F).
유전자형 분석 결과 두 마리의 고양이들의 fA3H/fA3CH 유전자좌에 성공적으로 적중된 것을 확인하였다: 즉, #1 고양이는 biallelic하게 적중된 반면에, #5 고양이는 monoallelic 또는 mosaical하게 적중되었다(도 1C). TA 클로닝 벡터에 서브클론된 PCR 산물의 생거 시퀀싱 결과, #1 고양이는 양쪽 대립유전자 모두에 하나의 뉴클레오티드 결실(deletion)을 갖고 있고, #5 고양이는 monoallelic 또는 mosaical하게 위와 같은 하나의 뉴클레오티드 결실을 갖는 것을 확인하였다(도 1D).
유사한 7개의 서열들에 대한 오프-타겟팅(off-targeting) 분석 결과(표 4,5), 상기 7개 부위들에는 적중이 일어나지 않은 것을 확인하으며(도 7), 이는 본 발명의 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 고양이에서 fA3H/fA3CH 유전자좌가 특이적으로 적중되었다는 것을 보여준다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for generation of APOBEC3H and APOBEC3CH double-knocked out cat using CRISPR/Cas9 system <130> PN1606-206 <160> 34 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 F1_primer <400> 1 ttgagaccgt gttgtagggg tg 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 R1_primer <400> 2 cctgcttcgg tccagcctc 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 F2_primer <400> 3 cactgacgcg ggacacatc 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 R2_primer <400> 4 gggaggctca tgacagccac 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site <400> 5 gcctgtacgt ccactggcgc tgg 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3CRISPR F <400> 6 caccgcctgt acgtccactg gcgc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3CRISPR R <400> 7 aaacgcgcca gtggacgtac aggc 24 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3CRISPR IF <400> 8 ttaatacgac tcactatagg gcctgtacgt ccactggcgc 40 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3CRISPR IR <400> 9 aaaagcaccg actcggtgcc 20 <210> 10 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 F <400> 10 taatacgact cactataggg agatcgccac catggactat aaggaccacg ac 52 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 R <400> 11 gcgagctcta ggaattctta c 21 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 1 <400> 12 gcctgtactt ccacttgcgc tgg 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 2 <400> 13 gcctgtaggt cagctgccgc tgg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 3 <400> 14 ggctgtactt cccctggcgc cgg 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 4 <400> 15 gcctgtaggt ccacagactc cgg 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 5 <400> 16 gcctttaggt ccagtggctc agg 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 6 <400> 17 acctggccgt ccactggggc agg 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 7 <400> 18 gactgtactt gcactggggc tgg 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 1_F <400> 19 ccatgaagaa atttgttttt tga 23 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 1_R <400> 20 tcccagggct gaaaattcct g 21 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 2_F <400> 21 cagcacacct gcctacgtc 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 2_R <400> 22 gcgtgatggg tatgtgagca 20 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 3_F <400> 23 cagtagtttg tttctgttta ttgtt 25 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 3_R <400> 24 acgaatggag gagcggattg 20 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 4_F <400> 25 gcttccctgg ccaacttt 18 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 4_R <400> 26 tcaaaagagt taacaacagt ggac 24 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 5_F <400> 27 acaccaagtc gctgcttcta 20 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 5_R <400> 28 acagcactga aaaatgaagg aca 23 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 6_F <400> 29 aagtgggggt gtcgccgc 18 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 6_R <400> 30 cagccgctcg cggaggc 17 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 7_F <400> 31 tgcccaggat tgcccatatt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 OF 7_R <400> 32 cagtgccctc tctccagttc 20 <210> 33 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exon 3 of fA3CH <400> 33 ccagagattc gaaatcatct gctatatcac atggagcccc tgccccttct gtgccgagga 60 actggttgcg tttgtcaaag acaaccccca cctcagcctg cggatctttg cctccctgga 120 agtatcagca ggggctgaga cacctgcacg catccgggat cccaa 165 <210> 34 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exon 6 of fA3CH <400> 34 ccagagattc gaaatcatct gctatatcac atggagcccc tgccccttct gtgccgagga 60 actggttgcg tttgtcaaag acaaccccca cctcagcctg cggatctttg cctccctgga 120 agtatcagca ggggctgaga cacctgcacg catccgggat cccaa 165

Claims (6)

  1. (a) 암컷 고양이로부터 난모세포를 채취한 후, 체외 성숙시킨 난자 및 수컷 고양이로부터 채취한 정자를 시험관(in vitro)에서 6시간 동안 노출하는 체외 수정을 하여 배반포를 형성하는 단계; 및
    (b) APOBEC3H 유전자 내의 서열번호 33으로 표시되는 엑손 3과 APOBEC3CH 유전자 내의 서열번호 34로 표시되는 엑손 6에 특이적으로 결합하는 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA) 및 Cas9 mRNA를 상기 배반포에 코트랜스펙션(co-transfection) 시키는 단계를 포함하는 CRISPR (clustered, regular interspaced, short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated 9) 시스템을 이용하여 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 유전자를 넉아웃(knockout)시킨 고양이를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 sgRNA는 APOBEC3H 유전자 내의 엑손 3 및 APOBEC3CH 유전자 내의 엑손 6에 공통적으로 포함되어 있는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 적중 부위(target site)로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 이중-넉아웃 고양이.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 넉아웃 고양이가 HIV-1 감염에 의한 에이즈(AIDS) 발병 연구의 모델로서 사용되는 것을 특징으로 하는 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 이중-넉아웃 고양이.
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