CN105274144A - 通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明主要涉及利用CRISPR/Cas9技术，设计独特的一段PAM区，使得斑马鱼中的铁调素基因被敲除，又不“误伤”其他基因，形成调素敲除的斑马鱼。作为首例铁调素敲除转基因的模式动物斑马鱼的意义重大，铁调素是调控铁的主要因素，一旦被敲除，即成功动物模成铁过载的模式动物，可以排除人为因素干预，对于研究铁的表达研究意义重大，同时与传统敲除基因的技术相比，CRISPR/Cas9技术具有毒性小，准确性高，效率高，成功周期短等特点；使得铁调素基因更快得被敲除。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼中的铁调素基因技术。
背景技术
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应CRISPRRNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifyingfactor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而RNA可连接到sgRNA的末端，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
相比于传统的Talens等敲基因技术，CRISPR/Cas9具有更高效率，更方便操作，其具有如下优点：
1.只需要合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具有特异性，
2.编码sgRNA的序列不超过100bp,因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便，
3.较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法，设计了新的gRNA序列，设计在铁调素第一个外显子和内含子之间，gRNA序列为CCAAGCGCCAAGTCACCTTTCC，从而对铁调素基因进行了敲除。
为了解决上述的技术问题，本发明提供的技术方案通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法，包括如下步骤：
(1)在铁调素基因第一个外显子和内含子之间设计gRNA序列，gRNA序列为CCAAGCGCCAAGTCACCTTTCC；
(2)设计并合成gRNA引物，引物序列为P3:Forwardsequence(5’to3’):TAACGTGTTTCTGGCTGCTG,
P4:Reversesequence(5’to3’):AAAAGCACCGACTCGGTGCC；
(3)以上述的引物、gRNA-plasmid为模板进行PCR反应，
PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环(95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共30个循环)，然后72℃-10min，最后保温在16℃；电泳检测PCR产物后，进行纯化；
(4)RNA-Free条件下，将上述的PCR产物进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7聚合酶和NTP，37℃，1hour反应完毕，然后进行纯化；
(5)将前述纯化后的gRNA和Cas9蛋白显微注射到单细胞的斑马鱼胚胎中，24小时后提取DNA进行测序检测；
(6)3-4个月后斑马鱼性成熟后，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到一定概率的杂合子，将胚胎进行RNA提取并逆转录成DNA送测序查看是否有突变，这时候的DNA还是双链的；
(7)将测序后发现突变的斑马鱼的cDNA和19T载体相连接后，将其在培养基中滚珠图板，经过12-14小时后，已经连接的质粒会以斑点形式成长，将其挑斑后，这时候得到的是单链的DNA，再次送测序，最终得到单链的突变，这时候为真正杂合的突变体，然后将其培养长大；
(8)经过3-4个月后性成熟后，第二代的突变成年的雄鱼与雌鱼再次切除尾巴，进行鉴定，突变的斑马鱼再次交配，从而得到纯合的铁调素敲除的斑马鱼。
作为本发明一优选技术方案，所述步骤(3)中PCR的酶为KOD酶。
本发明一优选技术方案，gRNA-plasmid的制备方法如下：
(1)设计并合成gRNA引物，引物序列为P3:Forwardsequence(5’to3’):TAACGTGTTTCTGGCTGCTG,
P4:Reversesequence(5’to3’):AAAAGCACCGACTCGGTGCC；
(2)以上述引物及斑马鱼cDNA为模板进行PCR反应，
PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环(95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共30个循环)，然后72℃-10min，最后保温在16℃；
(3)RNA-Free条件下，将上述的PCR产物进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7载体和NTP，37℃，1hour反应完毕，然后纯化，得到gRNA-plasmid。
作为本发明一优选技术方案，所述步骤(5)中注射体系为：gRNA12.5(ng/ul)，Cas9为300(ng/ul)，Tris-Hcl0.2ul，Phenol-red0.2ul，DEPCWater补充到2ul。
作为本发明一优选技术方案，步骤(3)和步骤(4)中的纯化方法包括如下步骤：
(A)加入体积为1：2-3的水和苯酚/氯仿/异丙醇,混匀后10,000-15,000rpm离心5min.上层移入新的管子，重复该步骤一次，
(B)上层移入新的管子，加入150ul氯仿,离心5min，
(C)加入1/10体积2.5M醋酸钠以及2.5体积乙醇,-70℃冷冻30min.
(D)离心10,000-15,000rpm在4C15min，
(E)弃掉溶液留沉淀，加入200ul80％乙醇,离心5min.弃掉溶液，干燥后用10-20μlDEPCH2O溶解。
本发明主要涉及利用CRISPR/Cas9技术，设计独特的一段gRNA序列，使得斑马鱼中的铁调素基因被敲除，又不“误伤”其他基因，得到首例铁调素敲除的斑马鱼(国内外均无报道)。作为首例铁调素敲除转基因的模式动物斑马鱼的意义重大，铁调素是调控铁的主要因素，一旦被敲除，即成功动物模成铁过载的模式动物，可以排除人为因素干预，对于研究铁的表达研究意义重大，同时与传统敲除基因的技术相比，CRISPR/Cas9技术具有毒性小，准确性高，效率高，成功周期短等特点；使得铁调素基因更快得被敲除。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为本发明方法的培育杂交图系。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体应用条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
此次实施例中所用的引物均为苏州金唯智公司合成。T7载体/聚合酶购自Trizol(Ambion公司),Cas9购TransGen公司。KOD购自PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)(大连宝生物公司)，19T载体购自PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)(大连宝生物公司)，oligo(dT)(生工公司)定量PCR试剂；酚、氯仿、异戊醇等各类有机试剂和NaCl等无机试剂(国药集团化学试剂有限公司),本发明中使用的野生型斑马鱼为野生型斑马鱼AB品系购自苏州大学生物钟研究中心。
本发明总体的思路是：设计gRNA位点-PCR-纯化-体外转录-纯化-显微注射-鉴定活性-饲养至成年-与野生型交配-检测下一代胚胎是否携带突变位点-饲养-成年后剪尾鉴定出杂合突变体-两杂合体交配得到纯合突变体。
具体实施例1
为了解决上述的技术问题，本发明提供的技术方案包括如下步骤：
(1)在铁调素基因第一个外显子和内含子之间设计gRNA序列，gRNA序列为CCAAGCGCCAAGTCACCTTTCC,如SeqNo.1所示；
(2)设计并合成gRNA引物，引物序列为P3:Forwardsequence(5’to3’):TAACGTGTTTCTGGCTGCTG,如SeqNo.2所示,
P4:Reversesequence(5’to3’):AAAAGCACCGACTCGGTGCC,如SeqNo.3所示；
(3)以上述设计的引物、gRNA-plasmid为模板进行PCR反应，PCR反应体系如下：
PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环(95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共30个循环)，然后72℃-10min，最后保温在16℃；电泳检测PCR产物后，进行纯化；
(4)RNA-Free条件下，将前述PCR产物进行体外转录得到gRNA，转录体系为：
以上体系37℃，1hour反应完毕，然后进行纯化；
(5)将前述纯化后的gRNA和Cas9蛋白显微注射到单细胞的斑马鱼胚胎中，24小时后提取DNA进行测序检测；注射体系如下：
(6)三个月后性成熟后，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，这时候我们得到一定概率的杂合子，将胚胎后进行RNA提取并转录成DNA送测序查看是否有突变，这时候的DNA还是双链的；
(7)然后将测序后发现突变的斑马鱼的cDNA和19T载体相连接后，将其在培养基中滚珠图板，经过12-14小时后，已经连接的质粒会以斑点形式成长，将其挑斑后，这时候得到的是单链的DNA，再次送测序，最终得到单链的突变，这时候才算找到真正杂合的突变体，然后将其培养长大；
(8)经过三个月后性成熟后，第二代的突变成年的雄鱼与雌鱼再次切除尾巴，进行鉴定，详见步骤4，得到相同突变(缺失几个碱基)的斑马鱼再次交配，从而得到纯合铁调素敲除的斑马鱼。
gRNA-plasmid的制备方法如下：
(1)设计并合成gRNA引物，引物序列为P3:Forwardsequence(5’to3’):TAACGTGTTTCTGGCTGCTG,
P4:Reversesequence(5’to3’):AAAAGCACCGACTCGGTGCC；
(2)以上述的引物及斑马鱼cDNA为模板进行PCR反应，
PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环(95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共30个循环)，然后72℃-10min，最后保温在16℃；电泳检测PCR产物后，进行纯化；
(3)RNA-Free条件下，将上述的PCR产物进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7载体和NTP，37℃，1hour反应完毕，然后进行纯化，进而得到gRNA-plasmid。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)在铁调素基因第一个外显子和内含子之间设计gRNA序列，gRNA序列为CCAAGCGCCAAGTCACCTTTCC；
(2)设计并合成gRNA引物，引物序列为P3:Forwardsequence(5’to3’):TAACGTGTTTCTGGCTGCTG,
P4:Reversesequence(5’to3’):AAAAGCACCGACTCGGTGCC；
(3)以上述的引物、gRNA-plasmid为模板进行PCR反应，
PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环：95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共30个循环，然后72℃-10min，最后保温在16℃；电泳检测PCR产物后，进行纯化；
(4)RNA-Free条件下，将上述的PCR产物进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7聚合酶和NTP，37℃，1hour反应完毕，然后进行纯化；
(5)将前述纯化后的gRNA和Cas9蛋白显微注射到单细胞的斑马鱼胚胎中，24小时后提取DNA进行测序检测；
(6)3-4个月后斑马鱼性成熟后，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到一定概率的杂合子，将胚胎进行RNA提取并逆转录成DNA送测序查看是否有突变，这时候的DNA还是双链的；
(7)将测序后发现突变的斑马鱼的cDNA和19T载体相连接后，将其在培养基中滚珠图板，经过12-14小时后，已经连接的质粒会以斑点形式成长，将其挑斑后，这时候得到的是单链的DNA，再次送测序，最终得到单链的突变，这时候为真正杂合的突变体，然后将其培养长大；
(8)经过3-4个月后性成熟后，第二代的突变成年的雄鱼与雌鱼再次切除尾巴，进行鉴定，突变的斑马鱼再次交配，从而得到纯合的铁调素敲除的斑马鱼。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于，所述步骤(3)中PCR的酶为KOD酶。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于，所述步骤(3)中gRNA-plasmid的制备方法如下：
(1)设计并合成gRNA引物，引物序列为P3:Forwardsequence(5’to3’):TAACGTGTTTCTGGCTGCTG,
P4:Reversesequence(5’to3’):AAAAGCACCGACTCGGTGCC；
(2)以上述引物及斑马鱼cDNA为模板进行PCR反应，
PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环(95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共30个循环)，然后72℃-10min，最后保温在16℃；
(3)RNA-Free条件下，将上述的PCR产物进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7载体和NTP，37℃，1hour反应完毕，然后纯化，得到gRNA-plasmid。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中的纯化方法包括如下步骤：
(A)加入体积为1：2-3的水和苯酚/氯仿/异丙醇,混匀后10,000-15,000rpm离心5min.上层移入新的管子，重复该步骤一次，
(B)上层移入新的管子，加入150ul氯仿,离心5min，
(C)加入1/10体积2.5M醋酸钠以及2.5体积乙醇,-70℃冷冻30min.
(D)离心10,000-15,000rpm在4C15min，
(E)弃掉溶液留沉淀，加入200ul80％乙醇,离心5min.弃掉溶液，干燥后用10-20μlDEPCH2O溶解。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于，所述步骤(5)中注射体系为：gRNA12.5(ng/ul)，Cas9为300(ng/ul)，Tris-Hcl0.2ul，Phenol-red0.2ul，DEPCWater补充到2ul。
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