CN107446932B - 一个控制水稻雄性生殖发育基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个控制水稻雄性生殖发育的基因及应用，具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白质具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对LOC_Os08g20730基因设计靶点打靶，受体为中花11，打靶T0代表型如说明书附图1、图2、图3、图4，测序分析表明，纯合突变或双等位突变的植株出现花药发育异常，无花粉。对杂合突变的T1代分析表明，可育株与不育株呈现3：1的分离比例，综合表明，该基因是调控水稻生殖发育，水稻中该基因被破坏即可导致水稻花药发育异常，出现无花粉型不育。通过本发明得到的细胞核基因控制水稻生殖发育的基因可利用分子手段创制智能不育系，将生产上的优良亲本改良成优良不育系，扩大杂种优势利用。

Description

一个控制水稻雄性生殖发育基因及其应用

技术领域

本发明涉及农业和植物生物技术等领域，特别是在分子水平上进行植物遗传育种以及植物生理、基因功能等基础研究,具体为涉及一个控制水稻雄性生殖发育基因及其应用。

背景技术

水稻雄性生殖发育是生殖生长的重要过程，也是繁衍后代和形成产量的关键过程。雄性不育系的发现，使得杂种优势在水稻中得以应用。随着“三系法”和“两系法”制种技术的诞生，杂交水稻在中国开始大规模种植，并逐步扩展至全球，对于粮食生产和粮食安全具有举足轻重的作用。雄性不育(Male Sterility,MS)是指雄性器官发育异常或者退化，不能形成有活力的花粉而雌蕊发育正常的现象。在植物界中，雄性不育现象普遍存在水稻雄性不育可分为细胞质雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility,CMS)和细胞核雄性不育(Genic Male Sterility,GMS)。细胞核雄性不育一般由小孢子在发育过程中出现异常，不能形成有活力的花粉粒甚至无花粉而引起的。花粉发育涉及孢原细胞分化和分裂、小孢子母细胞减数分裂、绒毡层细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)和降解、小孢子有丝分裂和花粉壁的形成以及花药开裂等过程，有大量基因参与这一复杂过程，这些关键基因发生突变或异常表达都将会导致雄性不育。由于细胞核不育系难以高效繁殖,因此在作物杂交种生产中难以利用。利用分子手段，在纯合的雄性不育植株中转入连锁的育性恢复基因、花粉失活(败育)基因以及用于筛选的标记基因,可以获得该雄性不育植株的保持系,保持系通过自交就可以实现不育系和保持系的繁殖.解决隐性核雄性不育基因及不育材料的应用问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一个控制水稻雄性生殖发育的基因、该基因编码的蛋白质及应用。水稻中该控制水稻花药发育的基因若被破坏，即可导致水稻雄性不育，出现无花粉败育。

本发明采用的技术方案如下：一个控制水稻雄性生殖发育的基因，其特征在于，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的水稻细胞核不育基因序列所编码的蛋白质为SEQ ID No.2所示的367个氨基酸序列；氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的在该基因(LOC_Os08g20730)第一外显子和第二外显子处设计CRISPR/Cas9载体靶点；

靶点1：TCCTGCCTCAATGGTAGCACCGG；

靶点2：GTTTTTTGCTAGGGCTGTGATGG。

本发明的在靶点前后各200bp左右设计引物扩增片段测序，分析打靶T0代植株突变情况，或用于靶点突变情况的扩增片段引物序列，

序列为：上游：5′-ACTGCAACTGGAGTAGATAG-3′；

下游：5′-GTTGCTCACGTTGTGGTTG-3′。突变分析情况如表1。

通过本发明得到的控制水稻雄性生殖发育的基因可应用于创制人工智能不育系，扩大杂种优势利用，提高水稻产量。

本发明的优点是：本基因是调控水稻生殖发育，水稻中该基因被破坏即可导致水稻花药发育异常，出现无花粉型不育。通过本发明得到的细胞核基因控制水稻生殖发育的基因可利用分子手段创制智能不育系，将生产上的优良亲本改良成优良不育系，扩大杂种优势利用。

附图说明

图1为本发明的打靶T0代植株表型图。

图2为本发明的花药图。

图3为本发明的花药碘染图。

图4为本发明的花粉图。

附表说明：打靶T0代突变情况检测。

具体实施方式

实施例1

靶点的设计；对未知功能基因设计2个靶点。在ORF 5’区和功能结构域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。靶点序列GC％偏高可提高打靶效率，因此靶点最好含有11-14个C/G(包括U6转录起始点G)。将候选靶序列+NGG(上下游加几十碱基)对目标基因组做Blast(选Somewhat similar sequences(blastn)，避免在靶序列3’端+NGG与其它功能基因和基因组序列有相似性。

实施例2

突变位点检测；获得转基因T0植株的打靶效果检测：打靶成功的转化体往往在靶点产生单碱基插入或者缺失若干碱基。以靶点为中心，在两侧各离开约200-300bp处合成引物PCR扩增。关键点：在靶点上游约150-250bp处设计内部引物为测序引物(这个距离的测序质量最好，但不要少于100bp和不要大于400bp)，对PCR产物直接测序(不要用PCR扩增使用过的引物再次用作测序，会产生高水平杂信号)。如果从某个碱基以后全部是重叠峰峰，表明是杂合突变或双等位突变。

表1

序列表

<110> 江西省农业科学院

<120> 一个控制水稻雄性生殖发育的基因及应用

<130> SEQIDNo.1AATCATACCATCACAAACACCAACTGCAACTGGAGTAGATAGCGCTACCTCTCTCCGGGCTGAAAGCTACTGGCCATTATCATTGTTCTTCCAGCCATGGATCAGCTGCTGGCCCTGGCGGTGGCAGTCCCGCTGTTTGCTCTTGCCAGTGCACTTGCTGCTGCCTCTGCTACGCCGGTCAACAAGTCCTGCCTCAATGGTAGCACCGGCGCCGCCGTCAGCATAGGGTACGGTGGTGCCAGCGCTAGCGCTGGCGCCGGCGCCGGCGTGTCTCTTGGCACCGACGCGTACTGGTTGGCCTGCCCACTTGCCGAGGAGATCGTCCGCGACGTCGTGGAGAGGGCTGTCGCCGCCGACCCCCGCATGGCGGCGTCCCTCCTCCGTCTCCACTTCCACGACTGCTTTGTCAATGTGATTATCTTTCTGTTTGCCGCGCTACATGTGTGAAGTGGTCGTCACTCGTCAGGGCCATTGATGTGAGCATGTCGATGTGTGTTTTTTGCTAGGGCTGTGATGGCTCCGTGCTCTTGGACGACAAGCCGTTATTCATCGGCGAGAAGACGGCCGGGCCGAACGCAAACTCGCTCCGGGGATTCGAGGTTATCGACGCCATCAAAGCCGAGCTCGAGAACGCGTGCCCGGAGACCGTCTCCTGCGCTGACGTCCTCGCCATCGCCGCGCGCGACTCTGTCGTGGCAGTAAGCCATATCTAGCTAATAGCCAAGCAGATATATACCACGCATGTGTGTAAACCATCCAAACTGTAATTGTTGCTCACGTTGTGGTTGTGTCTTTTTCGAATGATCAGTCAGGCGGGCCGAGCTGGCAGGTGGAAGTCGGCCGGAAGGACAGCCGCACGGCGAGCCTGCAGGGCGCCAACACCAACCTCCCGGCGCCCACGTCCGGCGTCGCCACCCTCGTGCAGAAGTTCCGGAACGTTGGCCTCTCGGCCAAAGACATGGTCGCTCTCTCCGGTAACCAAGGCTCCTCCATCTTCGAATTCGAATACGTTACAGATAGCTCGCATATGTTCATGGATTGCGTCCATGCATGACGCAGGCGCGCACACCATTGGTAAGGCGCGGTGCACGACGTTCAGCGCACGCCTCGCTGGCGTCGGCGCCTCGGCCGGCGGCGGTGCCACTCCAGGTGACCTTTCGTTCCTCGAGTCACTGCACCAGCTGTGCGCAGTGTCCGCCGGCTCGGCGCTGGCGCACCTGGACCTTGTCACGCCGGCCACTTTCGACAACCAGTACTACGTCAACCTGCTCTCCGGCGAGGGCTTGCTGCCGTCCGACCAGGCGCTGGCCTCGGCCGGAGCAGCTGCTGCCGGGGCGGAGGACGTGGCCGGCCTCATCGCAGCCTACGCTTTCGATGCGTTGCTCTTCTTCGACGACTTCGCATCATCTATGCTACGGATGGGGAGGCTGGCGCCGGGAGCGGGCACCGCCTCCGGCGAGGTCCGCCGCAACTGCCGGGTGGTGAACTAGCTAGCTAGGTTGCTGCATGAAACAAGAAGGAAGCTGATTATGCTCCCAAAATTAATTAGGAGTATCTGTGCATCAGATAATTGCGCCAGCTATATATGTATGTGTCTGCTAGTTTCTCAATCTAGTCATGTATCGTTAATTAGCTAAAAAGATGATAGCTGGATTATCCATTATCTTAAAAAAAATTAACTAATGGTGTCTGATATTTGATTTGTTTAGTTAATCAGCTTATCTGATATATATATGACTATCCTGCATGTAATCGAATAACTATACTAATAAAATCGGGCAAGTCATTTTCAGTCATATATATTACAGGATGTGATACAAATAATCACATTAAAAAAATAAAAATGTTTATTGCACAAGCTATATTCTAAACAAAATTTATAGCGCACGTACTGAAACCTTTAGAGCATCCCAGCAGCTCCTCTATCCGATTCTCCATCCCTAAATTGGCGCATAGGAGCGAAAAAACCAGCTCCAGCAGATGCGCCATCCAGTCATTCAAAACTAGCGCATGCGCCAAAACCGGAGAGAGAAAGGGGAAATATAGCATGTCTCTCTCCTCACGCCATATCACAACGACCGCGCTCCCGCCCCCATCCGGAGTTCGGCGACCTCTCCTCCAAAGCGACCTCCCCTCCATCGTTGTCGTCGCC

<140> SEQIDNo.2MDQLLALAVAVPLFALASALAAASATPVNKSCLNGSTGAAVSIGYGGASASAGAGAGVSLGTDAYWLACPLAEEIVRDVVERAVAADPRMAASLLRLHFHDCFVNGCDGSVLLDDKPLFIGEKTAGPNANSLRGFEVIDAIKAELENACPETVSCADVLAIAARDSVVASGGPSWQVEVGRKDSRTASLQGANTNLPAPTSGVATLVQKFRNVGLSAKDMVALSGAHTIGKARCTTFSARLAGVGASAGGGATPGDLSFLESLHQLCAVSAGSALAHLDLVTPATFDNQYYVNLLSGEGLLPSDQALASAGAAAAGAEDVAGLIAAYAFDALLFFDDFASSMLRMGRLAPGAGTASGEVRRNCRVVN*

<141> 2017-08-29

<160> 0

<170> SIPOSequenceListing 1.0

Claims (4)

1.一种基因在控制水稻雄性生殖发育中的用途，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的基因在控制水稻雄性生殖发育中的用途，其特征在于：所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求1所述的基因在控制水稻雄性生殖发育中的用途，其特征在于：在该基因第一外显子和第二外显子处设计CRISPR/Cas9载体靶点；

靶点1：TCCTGCCTCAATGGTAGCACCGG；

靶点2：GTTTTTTGCTAGGGCTGTGATGG。

4.如权利要求3所述的基因在控制水稻雄性生殖发育中的用途，其特征在于：在靶点前后各200bp左右设计引物扩增片段测序，分析打靶T0代植株突变情况，引物序列为：上游：5′-ACTGCAACTGGAGTAGATAG-3′；下游：5′-GTTGCTCACGTTGTGGTTG-3′。

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