CN106906240A - 运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法 - Google Patents
运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及大麦转基因材料的构建,旨在提供一种运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法。该方法包括下述步骤:gRNA靶位点的选择、gRNA片段的克隆、GG(gRNA‑gRNA)片段的连接、连接产物的PCR扩增、纯化产物和目标载体的酶切、纯化产物和目标载体的连接反应、连接产物转化大肠杆菌感受态、农杆菌介导的大麦转基因、阳性转基因植株的筛选、突变体测序。本发明利用先进的基因编辑技术‑CRISPR‑Cas9系统对大麦VE合成通路中的关键基因(HPT)进行靶向基因编辑,获得有效的功能缺失突变体,为大麦中生物活性物质的研究创造条件。
Description
技术领域
本发明涉及大麦转基因材料的构建,特别涉及运用CRISPR-Cas9系统敲除HvHPT(MLOC_37476)基因的应用。
背景技术
维生素E(vitamin E,VE)是由光合生物合成的生育酚类化合物的总称。根据侧链是否饱和,VE可以分为生育酚(tocophero1)和生育三烯酚(tocotrieno1)两大类。根据芳香环上甲基位置和数目的不同,每类又可分为α,β,γ,δ四种形式,其中,α-生育酚活性最高。近些年来,由于生育三烯酚在某些方面更优越的生物学特性,备受人们关注。不仅表现在抗氧化活性,在降胆固醇、预防糖尿病、促进骨吸收、抗癌、神经保护等方面也有一定的作用。
大麦是世界上四大粮食作物之一,主要用于食品生产、动物饲养、啤酒制造等领域。另外,由于大麦含有丰富的生物活性物质如β-葡聚糖、酚类物质、维生素E等,也常被用作功能食品开发的原料。大麦谷粒,含有丰富的生育三烯酚,大概占VE总含量的70%,是研究生育三烯酚的好材料。因此利用基因工程手段调控大麦谷粒中的VE合成通路,可以提高大麦生育三烯酚的含量,从而起到增加大麦谷粒营养成分的作用。目前由于大麦突变体库的缺乏,限制了大麦VE合成通路中相关基因的功能研究。
近年来发展起来的以CRISPR-Cas9为代表的新一代基因组编辑技术,为植物基因工程带来了新的革命,已成为基因功能研究和作物品质改良的重要手段之一。运用基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术改造相关基因,并通过自交、分子鉴定和后代筛选,获得“非转基因”大麦新材料,可为今后将成果应用于生产实践提供依据和技术支持。但是因为大麦基因转化效率低,稳定转基因材料的获得周期长,目前运用CRISPR-Cas9系统研究大麦基因的报导很少见。因此,应用CRISPR-Cas9技术敲除大麦VE合成通路中的关键基因(HvHPT)而获得的大麦突变体,可为HvHPT基因的功能研究提供可靠材料。
发明内容
本发明要解决的问题是,克服现有技术中的不足,提供一种运用CRISPR-Cas9系统敲除大麦HPT基因的编辑方法,以获得HPT基因突变的理想突变体。
为解决技术问题,本发明的解决方案是:
提供一种运用CRISPR-Cas9系统敲除大麦HPT基因的编辑方法,包括以下步骤:
(1)gRNA靶位点的选择
由于HPT基因位于大麦基因组的七号染色体上,根据CRISPR-Cas9技术的靶位点设计原则,应尽量将gRNA靶位点设计在外显子区并且要设计在基因的5’端(因该基因编码的是蛋白质,5’端编码的正好是蛋白质的功能区域)。
(2)gRNA片段的克隆
以质粒pGTR为模板,用PCR方法克隆四个片段L1、L2、L3、L4部分重叠的片段,引物序列如下,其中F和R分别代表正、反向引物:
L1-F:CGGGTCTCAGGCAGGATG GGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG
L1-R:CGGGTCTCACCCCTACCCTATTGCACCAGCCGGG
L2-F:TAGGTCTCCGGGGGTAGGGGTGTTTTAGAGCTAGAA
L2-R:CGGGTCTCACATACTGTTCCTTGCACCAGCCGGG
L3-F:TAGGTCTCCTATGCCGAAACGGTTTTAGAGCTAGAA
L3-R:CGGGTCTCACAGTATCGTGTGTGCACCAGCCGGG
L4-F:TAGGTCTCCACTGCAAGCTTCGTTTTAGAGCTAGAA
L4-R:
TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG
PCR体系为:Phusion酶0.5μL;5×Phusion HF Buffer 10μL;上下游引物各2.5μL;dNTPs 4μL;pGTR plasmid 0.5μL;三蒸水30μL,共50μL体系。
PCR反应条件为:预变性95℃,5min;变性95℃,30s;退火60℃,30s;延伸72℃,30s;共33个循环;最后72℃延伸10min;
PCR反应后,取5-10μL产物,用2%的琼脂糖凝胶电泳检测后,纯化回收目的片段,测定四个PCR产物L1、L2、L3、L4的浓度;
(3)GG(gRNA-gRNA)片段的连接
根据测定的PCR产物浓度,将四个片段等量混合,T7酶连接反应与BsaI酶切反应同时进行;取L1、L2、L3、L4各2μL,与10μL T7ligase buffer、1μLBsaI-HF、0.5μL T7ligase、0.5μL水混合;在PCR仪中进行如下反应:37℃,5min;20℃,10min;30-50个循环;
(4)连接产物的PCR扩增;
连接反应结束后,取连接产物1μL,加19μL水稀释,将稀释后的产物作为模板,进行PCR扩增;PCR结束后,取5μL产物进行电泳检测,并将产物纯化;产物大小为500bp;
引物序列如下,其中F和R分别代表正、反向引物:
S1-F:CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCA
S1-R:TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC
(5)纯化产物和目标载体的酶切
FokI酶切纯化产物暴露黏性末端,同时BsaI酶切空载体pRGEB32;
酶切体系为50μL,包括底物5μL、FokI或BsaI酶5μL、Buffer(cutsmart)10μL;底物包括GG纯化产物和空载体pRGEB32;
酶切时间3-4h,酶切温度37℃;用2%琼脂糖凝胶检测酶切产物,并回收目标产物,测定浓度;
(6)纯化产物和目标载体的连接反应
取酶切回收的GG纯化产物与pRGEB32载体等量混合(50ng),T4DNA ligase 1μL,10×T4DNA ligase Buffer 1μL,加三蒸水至20μL,4℃连接过夜;
(7)连接产物转化大肠杆菌感受态
将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞,涂板,37℃过夜;挑取单菌落,摇菌6-8h,提取质粒,PCR鉴定目标片段是否连入载体;鉴定正确的质粒送去测序,将测序结果正确的质粒,电转化农杆菌AGL1;
(8)农杆菌介导的大麦转基因
以Golden Promise野生型大麦的幼胚为外植体材料,以AGL1农杆菌进行感染转化,经潮霉素抗性筛选,抗性愈伤组织分化再生获得转基因植株;
(9)阳性转基因植株的筛选
提取转基因植株的基因组DNA,在三个gRNA序列的两侧设计引物,对目的片段进行PCR扩增,利用琼脂糖凝胶电泳和垂直聚丙烯凝胶电泳检测突变体;
(10)突变体测序
将以上突变株系PCR产物进行纯化回收,连接T载体测序,确认获得敲除了大麦HPT基因的突变材料。
发明原理描述:
VE的合成通路比较复杂,生育酚和生育三烯酚有共同的合成前体尿黑酸(homogentisate,HGA)。其中生育三烯酚合成的限速步骤是由尿黑酸牻牛儿基转移酶(homogentisate geranylgeranyl transferase,HGGT)催化HGA和牻牛儿焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate,GGDP)的合成反应;而生育酚合成的限速步骤是由尿黑酸植基转移酶(homogentisate phytyltransferase,HPT)催化HGA和植基二磷酸(phytyldiphosphate,PDP)的合成反应。HGGT、HPT分别是生育三烯酚、生育酚合成过程中的关键基因,因此可以通过敲除生育酚合成通路中的关键限速酶基因HPT来调节代谢流,从而起到提高或者分离生育三烯酚组分的作用。
CRISPR-Cas系统可定点修饰(删除、添加、激活、抑制)靶细胞中特定的基因序列,为靶向性编辑基因组序列提供行之有效的技术手段。但是,目前尚无运用该技术敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的报道。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明利用先进的基因编辑技术-CRISPR-Cas9系统对大麦VE合成通路中的关键基因(HPT)进行靶向基因编辑,获得有效的功能缺失突变体,为大麦中生物活性物质的研究创造条件。
附图说明
图1为靶向大麦HPT基因的3个gRNA位点示意图;
图2为琼脂糖凝胶电泳检测大片段缺失突变体;
图3为PAGE凝胶电泳检测突变体;
图4为突变株系目的片段测序结果的比较(点状虚线表示缺失碱基,单下划线表示插入碱基)。
具体实施方式
实施例1大麦VE合成通路中的关键限速酶基因敲除株系HPT的获得与鉴定。
本发明所用大麦品种为Hordeum vulgare L.,cv.Golden promise,申请人承诺:从本专利申请之日起20年内向公众发放该大麦品种,以用于实现、利用本发明所述技术方案。
1.gRNA靶位点的选择
由于HPT基因位于大麦基因组的七号染色体上,根据CRISPR-Cas9技术的靶位点设计原则,本发明将gRNA靶位点设计在外显子区并且要设计在HPT基因的5’端(因该基因编码的是蛋白质,5’端编码的正好是蛋白质的功能区域)。如图1所示。
2.gRNA片段的克隆及载体构建
2.1以质粒pGTR为模板,用PCR方法克隆四个片段L1、L2、L3、L4部分重叠的片段,引物序列如下:
L1-F:CGGGTCTCAGGCAGGATG GGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG(如SEQ ID NO:1所示)
L1-R:CGGGTCTCACCCCTACCCTATTGCACCAGCCGGG(如SEQ ID NO:2所示)
L2-F:TAGGTCTCCGGGGGTAGGGGTGTTTTAGAGCTAGAA(如SEQ ID NO:3所示)
L2-R:CGGGTCTCACATACTGTTCCTTGCACCAGCCGGG(如SEQ ID NO:4所示)
L3-F:TAGGTCTCCTATGCCGAAACGGTTTTAGAGCTAGAA(如SEQ ID NO:5所示)
L3-R:CGGGTCTCACAGTATCGTGTGTGCACCAGCCGGG(如SEQ ID NO:6所示)
L4-F:TAGGTCTCCACTGCAAGCTTCGTTTTAGAGCTAGAA(如SEQ ID NO:7所示)
L4-R:
TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG(如SEQ ID NO:8所示)
PCR扩增L1片段体系如下:
Phusion酶 | 0.5μL |
5×Buffer | 10μL |
L1-F | 2.5μL |
L1-R | 2.5μL |
三蒸水 | 30μL |
dNTPs | 4μL |
模板(pGTR plasmid) | 0.5μL |
总计 | 50μL |
PCR扩增L2片段体系如下:
Phusion酶 | 0.5μL |
5×Buffer | 10μL |
L2-F | 2.5μL |
L2-R | 2.5μL |
三蒸水 | 30μL |
dNTPs | 4μL |
模板(pGTR plasmid) | 0.5μL |
总计 | 50μL |
PCR扩增L3片段体系如下:
PCR扩增L4片段体系如下:
Phusion酶 | 0.5μL |
5×Buffer | 10μL |
L4-F | 2.5μL |
L4-R | 2.5μL |
三蒸水 | 30μL |
dNTPs | 4μL |
模板(pGTR plasmid) | 0.5μL |
总计 | 50μL |
PCR反应程序为:
PCR反应后,取5-10μL产物,用2%的琼脂糖凝胶电泳检测后纯化回收目的片段,测定产物浓度。L1,L2,L3,L4产物大小约为130bp,200bp,200bp,150bp。
2.2 GG(gRNA-gRNA)片段的连接。
按照上步测定的产物浓度,将4个片段等量混合,T7酶连接。反应体系如下:
试剂 | 体积(μL) |
L1 | 2 |
L2 | 2 |
L3 | 2 |
L4 | 2 |
2×T7ligase buffer | 10 |
BsaI-HF | 1 |
T7ligase | 0.5 |
三蒸水 | 0.5 |
总体积 | 20 |
以上连接反应在PCR仪中进行:37℃,5min;20℃,10min;30-50个循环。
2.3连接产物的PCR扩增
连接反应结束后,取连接产物1μL,加19μL水稀释,将稀释后的产物作为模板,
以S1-F、S1-R为引物进行PCR扩增。
S1-F:CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCA(如SEQ ID NO:9所示)
S1-R:TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC(如SEQ ID NO:10所示)
PCR体系如下:
试剂 | 体积(μL) |
稀释后的GG产物 | 2.5 |
S1-F | 2.5 |
S1-R | 2.5 |
2×TaqMix | 25 |
三蒸水 | 17.5 |
总体积 | 50 |
PCR反应程序为:
取5-10μL PCR产物电泳检测,产物大小约为500bp,并将产物纯化。
2.4将上一步纯化的产物,FokI酶切暴露黏性末端,同时BsaI酶切空载体pRGEB32。
酶切体系为50μL,包括底物5μL、FokI或BsaI酶5μL、Buffer(cutsmart)10μL;底物包括GG纯化产物和空载体pRGEB32;
酶切时间3-4h,作用温度37℃;用2%琼脂糖凝胶检测酶切产物,并回收目标产物,测定浓度;
2.5酶切后的GG连接产物与目标载体pRGEB32的连接。
试剂 | 体积(μL) |
酶切后的GG连接产物 | 50ng |
酶切后的载体pRGEB32 | 50ng |
T4DNA ligase | 1 |
10×T4ligase buffer | 1 |
三蒸水 | 补至10 |
总体积 | 10 |
3.将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞,涂板,37℃过夜;挑取单菌落,摇菌6-8h,提取质粒,PCR鉴定目标片段是否连入载体;鉴定正确的质粒送去测序。
PCR鉴定及测序引物为U3-F,UGW-gRNA-R。序列如下:
U3-F:AGTACCACCTCGGCTATCCACA(如SEQ ID NO:11所示)
UGW-gRNA-R:CGCGCTAAAAACGGACTAGC(如SEQ ID NO:12所示)
4.将测序正确的质粒,电转化农杆菌AGL1。
5.农杆菌介导的大麦的遗传转化
以野生型大麦(Hordeum vulgare L.,cv.Golden Promise)的幼胚为材料诱导愈伤组织,以AGL1农杆菌进行感染转化,经潮霉素抗性筛选,抗性愈伤组织分化再生获得转基因植株;
6.阳性转基因植株的筛选
6.1琼脂糖凝胶电泳检测大片段缺失突变体
以叶片为材料,提取转基因植株的基因组DNA,在3个gRNA位点的两侧设计引物进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳检测。(结果见图2)引物序列如下所示:
H1-F:ACCTTTCAGTCAGTGGCTTTGAACT(如SEQ ID NO:13所示)
H2-R:ACCTCCAGCAATCCAGTAAG(如SEQ ID NO:14所示)
6.2 PAGE胶检测小片段变化的突变体
以叶片为材料,提取转基因植株的基因组DNA,在每个gRNA位点两侧设计引物进行PCR。在常规PCR反应结束后,再对PCR产物进行高温变性、复性反应,PCR程序和变性复性步骤如下表:
引物如下所示:
H1-F:ACCTTTCAGTCAGTGGCTTTGAACT(如SEQ ID NO:13所示)
H1-R:TTACAAGAGGCGTTGCTGGTTCATT(如SEQ ID NO:15所示)
H2-F:CCACAACAAATCTACCGTCTC(如SEQ ID NO:16所示)
H2-R:ACCTCCAGCAATCCAGTAAG(如SEQ ID NO:14所示)
结果见图3。
7.突变株系的基因测序
将以上突变株系PCR产物进行纯化回收。大片段缺失的突变体可直接割胶回收测序,小片段变化的突变体则需连接T载体进行测序。测序公司为杭州擎科梓熙生物技术有限公司。测序结果见图4。
测序结果分析,发现了15#株系存在746bp的大片段缺失,获得了敲除大麦HPT基因的理想突变材料。
<110>浙江大学
<120>运用CRISPR-Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法
<160>16
SEQ ID NO:1
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PCR克隆片段L1的正向引物L1-F
<400> 1
CGGGTCTCAGGCAGGATG GGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG 46
SEQ ID NO:2
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PCR克隆片段L1的反向引物L1-R
<400> 2
CGGGTCTCACCCCTACCCTATTGCACCAGCCGGG 34
SEQ ID NO:3
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PCR克隆片段L2的正向引物L2-F
<400> 3
TAGGTCTCCGGGGGTAGGGGTGTTTTAGAGCTAGAA 36
SEQ ID NO:4
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PCR克隆片段L2的反向引物L2-R
<400> 4
CGGGTCTCACATACTGTTCCTTGCACCAGCCGGG 34
SEQ ID NO:5
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PCR克隆片段L3的正向引物L3-F
<400> 5
TAGGTCTCCTATGCCGAAACGGTTTTAGAGCTAGAA 36
SEQ ID NO:6
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PCR克隆片段L3的反向引物L3-R
<400> 6
CGGGTCTCACAGTATCGTGTGTGCACCAGCCGGG 34
SEQ ID NO:7
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PCR克隆片段L4的正向引物L4-F
<400> 7
TAGGTCTCCACTGCAAGCTTCGTTTTAGAGCTAGAA 36
SEQ ID NO:8
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PCR克隆片段L4的反向引物L4-R
<400> 8
TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG 52
SEQ ID NO:9
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于连接产物PCR扩增正向引物S1-F
<400> 9
CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCA 31
SEQ ID NO:10
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于连接产物PCR扩增反向引物S1-R
<400> 10
TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC 31
SEQ ID NO:11
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PCR鉴定及测序的引物U3-F
<400> 11
AGTACCACCTCGGCTATCCACA 22
SEQ ID NO:12
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PCR鉴定及测序的引物UGW-gRNA-R
<400> 12
CGCGCTAAAAACGGACTAGC 20
SEQ ID NO:13
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于电泳检测的PCR扩增引物H1-F
<400> 13
ACCTTTCAGTCAGTGGCTTTGAACT 25
SEQ ID NO:14
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于电泳检测的PCR扩增引物H2-R
<400> 14
ACCTCCAGCAATCCAGTAAG 20
SEQ ID NO:15
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PAGE胶检测的PCR扩增引物H1-R
<400> 15
TTACAAGAGGCGTTGCTGGTTCATT 25
SEQ ID NO:16
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PAGE胶检测的PCR扩增引物H2-F
<400> 16
CCACAACAAATCTACCGTCTC 21
Claims (1)
1.运用CRISPR-Cas9系统敲除大麦HPT基因的编辑方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)gRNA靶位点的选择
由于HPT基因位于大麦基因组的七号染色体上,根据CRISPR-Cas9技术的靶位点设计原则,选择gRNA靶位点在基因5’端的外显子区;
(2)gRNA片段的克隆
以质粒pGTR为模板,用PCR方法克隆四个部分重叠的片段L1、L2、L3、L4;其中,
PCR体系为:Phusion酶0.5μL;5×Phusion HF Buffer 10μL;上下游引物各2.5μL;dNTPs 4μL;pGTR plasmid 0.5μL;三蒸水30μL,共50μL体系;上下游引物的序列如SEQ IDNO:1~8所示:
PCR反应条件为:预变性95℃,5min;变性95℃,30s;退火60℃,30s;延伸72℃,30s;共33个循环;最后72℃延伸10min;
PCR反应后,取5~10μL产物,用2%的琼脂糖凝胶电泳检测后,纯化回收目的片段,测定四个PCR产物L1、L2、L3、L4的浓度;
(3)gRNA-gRNA片段的连接
根据测定的PCR产物浓度,将L1、L2、L3、L4四个片段等量混合,T7酶连接反应与BsaI酶切反应同时进行;取L1、L2、L3、L4各2μL,与10μL T7ligase buffer、1μLBsaI-HF、0.5μLT7ligase、0.5μL水混合;在PCR仪中进行如下反应:37℃,5min;20℃,10min;30-50个循环;
(4)连接产物的PCR扩增;
连接反应结束后,取连接产物1μL,加19μL水稀释,将稀释后的产物作为模板,进行PCR扩增;PCR结束后,取5μL产物进行电泳检测,并将产物纯化;产物大小为500bp;
PCR所用引物的序列如SEQ ID NO:9~10所示;
(5)纯化产物和目标载体的酶切
FokI酶切纯化产物暴露黏性末端,同时BsaI酶切空载体pRGEB32;
酶切体系为50μL,包括底物5μL、FokI或BsaI酶5μL、Buffer(cutsmart)10μL;底物包括GG纯化产物和空载体pRGEB32;
酶切时间3-4h,酶切温度37℃;用2%琼脂糖凝胶检测酶切产物,并回收目标产物,测定浓度;
(6)纯化产物和目标载体的连接反应
取酶切回收的GG纯化产物与pRGEB32载体等量混合(50ng),T4DNA ligase 1μL,10×T4DNA ligase Buffer 1μL,加三蒸水至20μL,4℃连接过夜;
(7)连接产物转化大肠杆菌感受态
将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞,涂板,37℃过夜;挑取单菌落,摇菌6-8h,提取质粒,PCR鉴定目标片段是否连入载体;鉴定正确的质粒送去测序,将测序结果正确的质粒,电转化农杆菌AGL1;
(8)农杆菌介导的大麦转基因
以Golden Promise野生型大麦的幼胚为外植体材料,以AGL1农杆菌进行感染转化,经潮霉素抗性筛选,抗性愈伤组织分化再生获得转基因植株;
(9)阳性转基因植株的筛选
提取转基因植株的基因组DNA,在三个gRNA序列的两侧设计引物,对目的片段进行PCR扩增,利用琼脂糖凝胶电泳和垂直聚丙烯凝胶电泳检测突变体;
(10)突变体测序
将以上突变株系PCR产物进行纯化回收,连接T载体测序,确认获得敲除了大麦HPT基因的突变材料。
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