CN107828874B - 一种基于crispr的dna检测和分型方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用；该方法包括如下步骤：(1)用一对通用引物PCR扩增靶DNA；(2)用Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA；(3)用DNA连接酶连接被切割的靶DNA；(4)用PCR扩增连接后的靶DNA。本发明利用了CRISPR技术对DNA的特异性识别切割特性，可以简单、快速、灵敏地对目标DNA进行特异性检测和分型，是一种具有高特异性和灵敏度的DNA检测新方法，成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和特异性PCR引物设计等关键瓶颈问题。通过运用本发明的方法成功检测人宫颈癌细胞中HPV16和HPV18的L1和E6/E7基因。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用。
背景技术
对于基础研究、各种检测及诊断应用，DNA检测和基因分型一直很重要。因此，DNA检测和基因分型技术一直受到广泛关注，从而促进了该类技术发展。简而言之，主要有三类DNA检测和基因分型技术被广泛应用。第一种是基于聚合酶链反应(PCR)的各种技术。PCR是最常用的DNA检测和基因分型技术。基于PCR的DNA检测和基因分型主要依赖于特异性引物的设计和多重PCR扩增。PCR检测可以通过传统PCR(tPCR)，定量PCR(qPCR)和最近开发的数字PCR来实现。因为具有明显的优点，如实时检测和高灵敏度，Q-PCR在几乎所有的研究、检测和诊断实验室中得到高度普及。现在已经开发出更准确的数字PCR，作为临床检测工具，具有很大的潜力和优势。然而，PCR技术在用于区分高度相关的基因型时，要受到多重扩增和高度特异性引物的限制。除PCR技术外，DNA微阵列等多种DNA杂交技术也被广泛用于检测和分型DNA。然而，由于其昂贵的设备，复杂的检测流程和不可避免的非特异性杂交，DNA微阵列技术不能像PCR一样成为常规DNA检测和基因分型工具。DNA测序是另一种有效的DNA检测和基因分型技术。特别是随着下一代测序(NGS)技术的出现，诸如Illumina NovaSeq等NGS平台的DNA测序工具越来越多。然而，由于需要昂贵的设备和化学试剂，它们仍然不能像PCR一样用于常规研究，检测和诊断。因此，相比之下，如果克服了引物设计的限制，PCR仍然是最方便、经济高效的DNA检测和基因分型的平台。
Ishino等人于1987年首次在大肠杆菌(E.coli)的基因组中发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列，并由Jansen等人在2002年定义为CRISPR(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat)。CRISPR系统有三种不同类型(I，II和III型)。I型和III型系统需要多种Cas蛋白互相作用才能发挥正常功能，因此要比II型复杂很多。在II型系统中，只需要一种蛋白(Cas9)，Cas9与引导RNA(gRNA)结合后能够特异地识别和切割双链DNA(dsDNA)。Cas9是II型系统的标志蛋白，在反式激活crRNA(tracrRNA)和CRISPR RNA(crRNA)的引导下发挥作用。tracrRNA能够激活Cas9核酸酶，crRNA特异地与靶DNA的20个核苷酸序列互补。因此crRNA决定了CRISPR-Cas9系统的特异性。将tracrRNA和crRNA整合成一个RNA即单导向RNA(sgRNA)后，极大地简化了II型CRISPR系统的应用。Cas9介导的位点特异性切割依赖于sgRNA和PAM(protospacer adjacent motif)。如果目标DNA中有PAM，在sgRNA的引导下，Cas9在PAM上游三个碱基处切割靶DNA。目前，由于简便和高效，CRISPR-Cas9系统已被许多研究者广泛应用于基因组编辑领域。另外,dCas9(dead Cas9)是由Cas9改造而成，其失去了核酸酶活性，但保留基因转录激活结构域(AD)或抑制结构域(ID)，dCas9(deadCas9)作为一种新的人工转录因子已被广泛应用于内源性基因表达调控。
尽管Cas9/sgRNA已广泛应用于基因编辑和调控，但很少应用于核酸检测。凭借高特异性的DNA切割能力(能够区分单碱基)，Cas9/sgRNA在DNA检测和分型上有具有很大的潜力。最近，CRISPR-Cas9系统已被用于检测Zika病毒并且能够对美国和非洲Zika病毒进行分型。基于CRISPR的高特异性，CRISPR-Cas9在区分病毒株时可以达到单碱基的分辨率，可以在单碱基水平上对直系同源的细菌和病毒进行分型检测。最近CRISPR系统(III型的cas13a/C2c2)已经应用于Zika病毒的检测并且具有超高灵敏度(病毒颗粒的量低至2aM)。这些研究表明，CRISPR系统用于开发核酸检测技术时具有很大的潜力和优势。然而，在报道的基于Cas9的DNA检测中，Cas9/sgRNA系统尚未直接用于检测和分型基因组DNA。
HPV是双链DNA病毒，与子宫颈癌，肛门癌和其他癌症的发病机制密切相关。大约有100种不同变异类型的HPV。根据致癌能力的不同，HPV分为高危型HPV(hrHPV)和低危型HPV(lrHPV)。世界上最常见的hrHPV是HPV16和HPV18，它们导致了大约70％的宫颈癌。其他hrHPV包括HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、82等。LrHPV包括HPV6、11、40、42、43、44、61、81等。因其丰富的DNA多态性，HPV是研究DNA检测及分型技术良好的实验材料。因此，本发明以HPV DNA为材料，进行本发明方法的论证。
聚合酶链反应(PCR)作为最常用的核酸检测方法之一，被几乎所有的生物学、检测和诊断相关的实验室作为基本的核酸检测工具。在传统PCR(tPCR)的基础上，衍生了定量PCR(qPCR)，并被广泛应用于DNA检测和诊断。另外，最近开发出的数字PCR(dPCR)已经显示出其作为临床检测工具的巨大潜力和优势。因此，CRISPR和PCR技术的结合为开发出新的核酸检测和分型技术提供了新的机会。这些技术同时具备了CRISPR技术的高特异性和PCR技术的高灵敏度，在DNA检测和基因分型上更有优势。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法，该方法被命名为CARP，即CRISPR辅助反向PCR(CRISPR-assistant reverse PCR)或者Cas9/sgRNA相关的反向PCR。该方法为一种快速，便宜和灵敏的基于CRISPR的PCR方法，可以有效地对目标DNA进行特异性检测和分型。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用一对通用引物PCR扩增靶DNA；
(2)用Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA；
(3)用DNA连接酶连接被切割的靶DNA；
(4)用PCR扩增连接后的靶DNA。
其中，步骤(1)所述通用引物为可将含有靶DNA序列的DNA片段从待检测DNA样品中PCR扩增出来的一对引物；该对引物是单一序列或简并序列。
步骤(2)所述Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA为利用Cas9核酸酶与靶向目的DNA的一对sgRNA混合，形成两个Cas9/sgRNA复合物；该复合物在sgRNA的引导靶向目的DNA，使Cas9/sgRNA复合物与目的DNA结合并在Cas9的作用下发生目的DNA的双链切割。
步骤(3)所述DNA连接酶连接被切割的靶DNA为利用DNA连接酶处理步骤(2)产生的DNA，产生分子内或分子间的平末端DNA连接。作为优选，其中所使用的的DNA连接酶为T4DNA连接酶及其他具有类似功能的酶。
步骤(4)所述用PCR扩增连接后的靶DNA为使用一对在靶DNA上呈反向的PCR引物；该对反向的PCR引物在靶DNA未发生Cas9/sgRNA切割时和之后步骤(3)的连接时，不能扩增靶DNA，而在靶DNA发生Cas9/sgRNA切割并经步骤(3)连接后，则可扩增靶DNA。
作为优选，步骤(1)和步骤(4)所述PCR包括普通PCR、定量PCR或数字PCR。
所述检测和分型方法，在检测高拷贝靶DNA或仅用于含量丰富的靶DNA分型检测时，通过Cas9/sgRNA直接切割高拷贝靶DNA或含量丰富的靶DNA进行检测，不需要用一对通用引物PCR扩增靶DNA。
其中，步骤(2)所述Cas9可以替换成与Cas9类似其他CRISPR相关核酸酶，如Cpf1；所述sgRNA可以替换成与其他CRISPR相关核酸酶匹配的引导RNA，如Cpf1匹配的引导RNA。当使用Cpf1等非平末端双链DNA断裂的CRISPR核酸酶时，可通过末端加工如延伸补齐等，使切割产物成为平末端，以便连接；或使用与CRISPR核酸酶产生的序列已知的粘性末端匹配的接头DNA将切割产物连接起来。
本发明基于CRISPR的DNA检测和分型方法在双链DNA相关生物检测中的应用；具体的基于CRISPR的DNA检测和分型方法应用在人乳头状瘤病毒双链DNA生物检测中；如人类乳头状瘤病毒(HPV)DNA的检测及分型。
其中，所述HPV病毒包括HPV16和HPV18两种高危型HPV病毒。尤其是，人类乳头状瘤病毒(HPV)的L1和E6-E7基因的各种基因型等。本发明只是用HPV作为一种实验材料来验证CARP方法的可行性。该方法也可用于检测其他DNA。本发明采用HPV DNA作为CARP检测的DNA靶标。结果表明CARP可以检测和分型HPV DNA。发现CARP可以在少至0.002ng宫颈癌细胞系gDNA中检测到HPV16和HPV18DNA。
在本发明的CARP检测中，Cas9分别和两种sgRNA结合后切割靶DNA。然后DNA连接酶连接切割产物，最后连接产物用于PCR扩增。所用的sgRNA对靶DNA具有特异性。另外，针对目标DNA设计一对反向引物，这一对引物方向相反不能直接用于扩增靶DNA。当靶DNA被Cas9/sgRNA切割，然后在分子间连接成线性或分子内连接成环状DNA后，反向引物就会变为正常引物，就可以通过PCR扩增靶DNA。
由于人类乳头状瘤病毒(HPV)的L1基因已广泛用于检测和鉴别HPV亚型。在本发明中，首先设计了两对sgRNA和两对反向PCR引物，用于检测HPV16和HPV18的L1基因。用这些sgRNA和引物通过基于tPCR和qPCR的CARP方法检测HPV16和HPV18的L1基因。结果表明，CARP可以在9种HPV亚型中特异性地检测HPV16和HPV18的L1基因，显示了CRISPR系统用于DNA分型时所具有的巨大潜力和可行性。然而，据报道，HPV基因在整合到宿主细胞基因组的过程中，L1 DNA会有缺失，这就会导致HPV检测遗漏。例如，在使用HPVL1区域通用引物(MY09/MY11)检测56例浸润性宫颈癌活检样本，发现与HPV E6-E7型引物检测相比，L1区域丢失了多达23个样本。使用MY09/MY11引物在15,774例患者样本中进行的另一个HPV检测中，有10.9％的样本(522个)丢失。在随访中，发现使用MY09/MY11PCR鉴定为阴性的409例患者中有104例(25.4％)发展为CIN2+。据报道，HPV18的L1/E1区域更容易丢失。几乎所有HPV18阳性宫颈癌基因组中只整合了HPV18的基因，HPV16阳性宫颈癌基因组中HPV16基因在所有整合基因中的比例≤60％。这些研究一起表明，在HPV检测中使用MY09/11引物进行L1区域的PCR扩增可能导致严重的错误检测。因此，HPV检测越来越依赖于致癌基因E6/E7，因为E6/E7在整合后不会缺失。这可以防止错误检测。因此，相对于L1基因，E6/E7基因可以用作更可靠的HPV检测目标。
本发明中，针对两种高危型HPV，即HPV16和HPV18，设计了两对靶向E6/E7基因的sgRNA；运用这些sgRNA，用本发明提出的方法检测了三种人宫颈癌细胞系HeLa、SiHa和C-33a中的HPV16和HPV18DNA。同时设计了两对sgRNA和反向引物，用于检测这些人宫颈癌细胞系中的HPV16和E6/E7基因。结果表明，分别在HeLa和SiHa细胞中成功检测到HPV18和16；然而，在C-33a细胞中没有检测到两种HPV。这与HeLa是HPV18阳性细胞，SiHa是HPV16阳性细胞和C-33a是HPV阴性细胞的事实相符合。
本发明中，在检测人宫颈癌细胞中的HPV16和18时，用了两轮PCR。第一轮qPCR用L1基因通用引物MY09/MY11和E6-E7基因通用引物E67-6F/7R进行扩增。用Cas9/sgRNA切割qPCR产物，并用T4 DNA连接酶连接切割产物。然后用反向引物进行第二轮qPCR。因此，通过第一轮PCR扩增HPV DNA，可以快速判断样品是否有HPV感染。“切割和连接”步骤用于HPV分型。第二轮qPCR用于显示分型结果。qPCR扩增的高灵敏度可以保证检测下限足够低。由第一轮qPCR扩增产生的靶DNA足够用于随后的分型检测。CARP检测使用Q-PCR有助于增加检测下限，缩短检测时间，使CARP适用于临床检测。
由于Cas9核酸内切酶具有大量的脱靶结合位点，能够在一些错配的位置进行切割。脱靶是CRISPR-Cas9系统应用于全基因组范围内的一个瓶颈，特别是用于基因治疗和临床应用。虽然Cas9在全基因组范围内有许多脱靶点，但在小DNA片段上应该具有非常少或没有脱靶位点。本发明为了确保CARP方法的特异性，用PCR从大的DNA片段或gDNA扩增出小的DNA片段，然后使用一对sgRNA来切割靶DNA。结果表明，通过CARP从9个HPV亚型和2种含有HPV gene的宫颈癌细胞株中鉴定了HPV16和HPV18。此外，Cas9具有足够高的切割效率，以避免检测信号强度的过度损失，并且PCR的扩增效率很高。因此CARP在检测DNA时具有足够的特异性和灵敏性。
有益效果：与现有技术相比，本发名具有如下优点：
本发明开发了一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法，该方法被命名为CARP，代表基于Cas9/sgRNA的反向PCR。该方法为一种快速，便宜和灵敏的基于CRISPR的PCR方法，可以有效地对目标DNA进行特异性检测和分型。本发明通过在9个HPV亚型中检测两种高危HPV(HPV16和HPV18)的L1基因验证了该方法。在两个HPV阳性宫颈癌细胞系(HeLa和SiHa)中检测两种高风险HPV(HPV16和HPV18)的E6/E7基因，再次验证了该方法。通过检测7个非靶向HPV亚型(45、40、35、26、11和6)中两种高危HPV的L1基因和一个HPV阴性子宫颈中两种高危HPV的E6/E7基因癌细胞系(C-33a)，显示CARP检测的高特异性。另外，在检测中由于对DNA进行了第一轮PCR扩增，所以该方法具有高灵敏度。总之，本发明开发了一种具有高特异性和灵敏度的DNA检测新方法CARP。CARP的全部检测过程可以通过常用而普遍的核酸检测设备定量PCR仪在3小时内完成。
本发明利用了CRISPR技术对DNA的特异性识别切割特性，可以简单、快速、灵敏地对目标DNA进行特异性检测和分型，成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和特异性PCR引物设计等关键瓶颈问题。
附图说明
图1为CARP检测及分型DNA分子的原理及流程示意图；其中CARP检测由三个步骤组成：(1)Cas9核酸内切酶切割靶DNA，一对sgRNA(sgRNA a和b)与Cas9核酸酶结合后切割靶DNA；(2)切割后的DNA由T4 DNA连接酶连接(分子间和分子内连接)；(3)连接后的DNA用PCR扩增；在本发明中，运用CARP检测HPV16和HPV18的L1和E6/E7基因来进行CARP检测技术可行性的论证，在PCR扩增步骤，分别使用了传统PCR(tPCR)和定量PCR(qPCR)；
图2为本发明中检测的目标DNA HPV16和HPV18的L1和E6/E7基因，以及针对这些基因设计的反向PCR引物、sgRNA的位置；
图3为用Cas9/sgRNA切割和CARP检测HPV16和HPV18 L1基因；其中(A)Cas9/sgRNA切割HPV16和HPV18 L1基因，HPV16或18 L1基因的特异性sgRNA与Cas9结合后切割HPV16或HPV18 L1基因；(B)用tPCR进行HPV16和18 L1基因的CARP检测；(C)用tPCR检测HPV16和18L1基因CARP的特异性；在图A、B和C中列出了各泳道中的反应产物；
图4为CARP检测HPV L1基因的灵敏度；其中(A)使用tPCR检测各种量的HPV16 L1基因；(B和C)使用qPCR检测各种量的HPV16 L1基因；最终的qPCR产物也进行了琼脂糖凝胶电泳检测(C)；(D)使用qPCR检测各种量的HPV18 L1基因；
图5为使用基于tPCR的CARP在9种HPV亚型中检测HPV16或18 L1基因；其中(A)通过CARP在9种HPV亚型中检测HPV16 L1基因；(B)通过CARP在9种HPV亚型中检测HPV18 L1基因；
图6为使用基于qPCR的CARP在9个HPV亚型中检测HPV16或18 L1基因；其中(A)在9个HPV亚型中检测HPV16 L1基因；(B)在9个HPV亚型中检测HPV18 L1基因；最终的qPCR产物也用琼脂糖凝胶电泳检测；
图7为用CARP检测细胞中的HPV18和16E6-E7和L1基因；其中(A)用qPCR1扩增三个宫颈癌细胞中的HPV E6-E7和L1基因；(B和C)用CARP检测三种宫颈癌细胞中的HPV16和HPV18E6-E7(B)和L1(C)基因；(D)用CARP检测各种量的HeLa gDNA中的HPV18E6-E7和L1基因。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
CARP检测及分型DNA分子的原理及流程示意图如图1所示。CARP检测由三个步骤组成：(1)Cas9核酸内切酶切割靶DNA。一对sgRNA(sgRNA a和b)与Cas9核酸酶结合后切割靶DNA；(2)切割后的DNA由T4 DNA连接酶连接(分子间和分子内连接)；(3)连接后的DNA用PCR扩增。在本发明中，运用CARP检测HPV16和HPV18的L1和E6/E7基因来进行CARP检测技术可行性的论证。在PCR扩增步骤，分别使用了传统PCR(tPCR)和定量PCR(qPCR)。
本发明中各实施例检测的目标DNA HPV16和HPV18的L1和E6/E7基因，以及针对这些基因设计的反向PCR引物、sgRNA的位置如图2所示。该示意图2有有助于理解本发明实例2～5中的实验。
实施例2用Cas9/sgRNA切割HPV 16和HPV 18 L1基因
实验方法：
制备sgRNA：根据T7聚合酶(New England Biolabs)的使用说明，用T7聚合酶通过体外转录合成sgRNA。使用表1(SEQ IDNO.1-27)中列出的寡核苷酸经过三次PCR扩增出sgRNA的DNA模板。用F1和R(7个循环)进行第一次PCR。用第一次PCR的产物作为模板，以F2和sgR作为引物进行第二次PCR(30个循环)；用第二PCR的产物作为模板，以F3和sgR作为引物进行第三次PCR(30个循环)。第三次PCR的产物纯化后作为体外转录的模板。然后将纯化后的sgRNA模板用T7RNA聚合酶(New England Biolabs)在37℃孵育过夜进行体外转录。将体外转录的RNA与Trizol溶液混合，然后用氯仿和异丙醇依次萃取，用乙醇沉淀。将纯化的RNA溶解在无RNase的ddH2O中，并通过光谱法进行定量。实施例2制备的sgRNA还用于本发明中的实施例3-5的实验。
用PCR制备HPV L1基因片段：通过PCR扩增制备HPV16、18、26、33、35、40、45、6和11的L1基因片段。用HPV16、18、26、33、35、40、45、6和11的质粒DNA作为模板PCR扩增出全长的L1基因片段。PCR引物M13F和M13R为通用引物(表2；SEQ IDNO.28-29)。M13F和M13R在质粒L1基因两边的序列上。PCR反应(20μL)：10μL 2×预混Taq(Takara)，500nM M13F，500nM M13R和10ng质粒DNA。PCR程序如下：95℃5分钟；30个循环：95℃20秒，60℃30秒和72℃90秒；72℃5分钟。用1.5％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen)回收L1片段。纯化的L1片段用NanoDrop(Thermo)定量。然后将纯化的L1片段作为验证CARP检测的底物DNA。实例1制备的HPV L1基因片段还用于本发明中的实施例2和实施例3实验。
Cas9/sgRNA切割HPV 16and 18 L1基因：重组Cas9蛋白购自New England Biolabs(NEB)。Cas9切割反应(30μL)：1×Cas9核酸酶反应缓冲液，1μM Cas9核酸酶(NEB)，300nMsgRNA a(16L1a1或18L1a1；表1)和300nM sgRNA b(16L1b1或18L1b1；表1)。首先将Cas9反应液在25℃温育10分钟。然后向Cas9反应液中加入200ng底物DNA(纯化的L1片段)，并在37℃下孵育20分钟。最后，Cas9在65℃灭活10分钟。用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
实验结果：
Cas9与一对sgRNA(sgRNA a和b)结合后切割HPV16和18 L1基因。未切割的HPV16和18 L1基因用作对照。将含有两个切割位点的DNA(M13F/M13R PCR扩增产物)切成几个较短的DNA片段(图3A)。切割20分钟后，在琼脂糖凝胶中几乎看不到完整的DNA底物(L1基因片段)(图3A)(即未被切的L1基因片段)，这表明Cas9的切割效率很高，这有利于提高检测灵敏度。
表1用于制备sgRNA的体外转录模板的寡核苷酸
表2.用于PCR扩增的寡核苷酸
实施例3用CARP检测HPV16和18 L1基因
实验方法：
sgRNA及HPV L1基因片段的制备同实施例1。
Cas9/sgRNA切割HPV16and 18 L1基因：重组Cas9蛋白购自New England Biolabs(NEB)。Cas9切割反应(30μL)：1×Cas9核酸酶反应缓冲液，1μM Cas9核酸酶(NEB)，300nMsgRNA a(16L1a1或18L1a1；表1)和300nM sgRNA b(16L1b1或18L1b1；表1)。首先将Cas9反应液在25℃温育10分钟。然后向Cas9反应液中加入200ng HPV L1基因片段(底物DNA)，并在37℃下孵育20分钟。最后，Cas9在65℃灭活10分钟。用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
连接反应体系(15μL)：1×T4连接酶缓冲液，5U T4 DNA连接酶(Thermo)和5μLHPV16和HPV18 L1基因的Cas9酶切产物(如上所述)。在22℃下温育20分钟。
tPCR检测：传统的PCR(tPCR)反应(20μL)由10μL 2×预混合Taq(Takara)，500nM16L1P11(或18L1P11)、500nM 16L1P21(或18L1P21)和1μL连接产物组成。PCR程序：95℃5分钟；30个循环：95℃20秒，60℃20s和72℃30s；72℃5分钟。反应产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
qPCR检测：用qPCR检测HPV16和18L1基因，将各种量的纯化的HPV16和18L1片段(200、20、2、0.2、0.02、0.002、0ng)进行切割和连接。qPCR反应(20μL)由10μL 2×SYBRGreen Master Mix(Yeasen)，500nM 16L1P11(或18L1P11)，500nM 16L1P21(或18L1P21)和1μL连接产物组成。PCR程序：95℃10分钟，45个循环：95℃15秒和60℃1分钟。反应在实时PCR装置StepOne plus(ABI)上进行。
实验结果：
HPV16和18 L1基因被Cas9切割后，用T4 DNA连接酶连接切割产物。然后用tPCR检测连接产物。结果表明，CARP可以用于检测HPV16和18 L1基因(图3B)。然而，如果基因未切割或切割产物未连接，则PCR会失败(图3B)。如果基因没有被切割和连接，两个引物会向相反的方向延伸，靶DNA不能被扩增(图3B)。一旦DNA被切割并连接后，反向引物就会转变成普通的引物，从而进行靶DNA的PCR扩增(图3B)。这些结果表明CARP方法是可行的。为了初步验证CARP检测的特异性，用HPV16和18的sgRNA交叉作用于HPV16和18 L1基因。结果表明，HPV16和18 L1基因仅能被自身的sgRNA识别并被Cas9切割(图3C)，验证了所设计的sgRNA以及CARP检测的特异性。除了sgRNA之外，反向PCR引物也有助于CARP检测特异性。值得注意的是，PCR产物主要集中在两个sgRNA目标位点之间预期大小的扩增条带上，表明连接步骤的主要产物是环状DNA。
实施例4 CARP检测HPV16和18 L1基因的灵敏度
实验方法：
sgRNA及HPV L1基因片段的制备同实施例1。
Cas9消化反应(30μL)由1×Cas9核酸酶反应缓冲液，1μM Cas9核酸酶(NEB)和300nM sgRNA a(16L1a1)和sgRNA b(16L1b1)组成。首先在25℃下将反应液温育10分钟。然后向反应液加入不同用量HPV16L1基因片段(200、20、2、0.2、0.02、0ng)，并在37℃下孵育20分钟。然后Cas9在65℃灭活10分钟。连接反应(15μL)由1×T4连接酶缓冲液，5U T4 DNA连接酶(Thermo)和5μL Cas9酶切产物组成。将连接反应液在22℃下孵育20分钟。tPCR反应(20μL)由10μL 2×Premix Taq(Takara)，500nM 16L1P11、500nM 16L1P21和1μL连接产物组成。PCR程序：95℃5分钟；30秒循环：95℃20秒，60℃20秒和72℃30秒；72℃5分钟。用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
实验结果：
为了探讨CARP的灵敏度，用Cas9/sgRNA分别切割200、20、2、0.2、0.02、0ng HPV16L1 DNA，然后用T4 DNA连接酶连接和tPCR扩增。结果表明，CARP可以检测到少至0.02ng的DNA(图4A)，表明CARP检测具有很高的灵敏度。因为qPCR检测在应用中优于tPCR检测，因此又探讨了基于qPCR的CARP检测的灵敏度。同样，用CARP检测HPV16 L1基因。结果，获得了低至0.002ng的灵敏度和200至0ng的检测范围(图4B)。为了进一步验证qPCR结果的可靠性，用琼脂糖凝胶电泳检测了HPV16 L1的最终qPCR产物(图4C)，表明qPCR产物的电泳结果与tPCR几乎一致(图4A)。比较tPCR，使用qPCR后CARP检测的灵敏度得到提高，检测时间进一步缩短。用qPCR检测HPV18 L1基因，得到了与tPCR类似的检测范围(图4C)。应该注意的是，tPCR产物只有一个在两个sgRNA的靶位点之间预期大小的带(图4A)，表明在各种CARP检测中连接反应的主要产物是的环状DNA。这也表明Cas9/sgRNA切割的高效率。与tPCR相比，qPCR产生了片段更大的DNA(图4C)，表明qPCR的高扩增效率和在CARP连接反应中存在的分子间连接。
实施例5用CARP检测9个HPV亚型中的HPV16或18 L1基因
实验方法：
sgRNA及HPV L1基因片段的制备同实施例1。
HPV16或18的sgRNAa(16L1a1或18L1a1)和sgRNA b(16L1b1或18L1b1)与Cas9核酸酶结合后切割9种HPVs亚型(高危型：16、18、26、33、35、40、45；低危型：6、11)的L1基因片段(200ng)。然后将Cas9灭活，并将切割产物用T4 DNA连接酶连接。Cas9消化反应及T4 DNA连接酶连接反应组分、反应条件同实施例3。连接产物通过tPCR和qPCR扩增分别检测连接产物。tPCR和qPCR的反应组分、反应条件同实施例3。
实验结果：
为了进一步验证CARP的特异性。用一对特异于HPV16或18的sgRNA结合Cas9核酸酶后切割9个亚型的HPVs(高危型：16、18、26、33、35、40、45；低危型：6、11)(200ng)L1基因，然后将切割产物连接并用于tPCR扩增。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，CARP在九种HPV亚型中成功区分出了HPV16或HPV18(图5)。另外，进一步用基于qPCR的CARP在9个HPV亚型中检测了HPV16和HPV18。也成功鉴定了HPV16和HPV18(图6)。这些结果再次证实了HPV16和HPV18 L1的sgRNA只对它们自身起作用。因此，CARP可用于特异地检测HPV16和HPV18。
实施例6用CARP检测宫颈癌细胞中的HPV L1和E6-E7基因
实验方法：
sgRNA制备同实施例1。
首先对L1和E6-E7基因进行qPCR扩增。PCR反应(20μL)：10μL 2×SYBR GreenMaster Mix(Yeasen)，500nM MY09或E67-6F，500nM MY11或E67-7R以及各种量(见附图)的宫颈癌细胞gDNA。PCR程序：95℃10分钟；35个循环：95℃15秒、58.5℃30秒和72℃45秒。我们将这一轮的qPCR命名为qPCR1。
Cas9切割反应(30μL)由1×Cas9核酸酶反应缓冲液，1μM Cas9核酸酶(NEB)，300nMsgRNA a(用于L1基因的16L1a2和18L1a2；用于E6-E7基因的16E6a和18E6a；表1)和sgRNA b(用于L1基因的16L1b2和18L1b2；用于E6-E7基因的16E7b和18E7b；表1)组成。首先在25℃下将反应液温育10分钟。然后向反应液中加入qPCR1产物(5μL)，并在37℃下孵育20分钟进行Cas9切割，然后在65℃下孵育10分失活Cas9。将切割产物(5μL)与1×T4连接酶缓冲液和5UT4 DNA连接酶混合，并在22℃下孵育20分钟。qPCR反应(20μL)由10μL 2×SYBR GreenMaster Mix(Yeasen)，500nM引物P1(用于L1基因的16L1P12和18L1P12；用于E6-E7基因的16E6P1和18E6P1；表2)，500nM引物P2(用于L1基因的16L1P22和18L1P22；用于E6-E7基因的16E6P2和18E6P2；表2)和1μL的连接产物组成。PCR程序：95℃10分钟，40个循环：95℃15秒和60℃1分钟。反应在实时PCR装置StepOne plus(ABI)上进行。此轮PCR命名为qPCR2。qPCR1和qPCR2中使用的引物列于表2。
实验结果：
为了检测宫颈癌细胞中的HPV E6-E7基因，首先设计并合成了一对通用引物E67-6F和E67-7R，用于扩增各种HPV的E6-E7基因。此外还设计了一对特异于HPV16和HPV18E6-E7基因的sgRNA，其中一个sgRNA针对E6基因，另一个针对E7基因。
为了用CARP检测含有的HPV E6-E7基因的gDNA，首先使用一对通用引物E67-6F和E67-7R通过qPCR扩增来自三个宫颈癌细胞(HeLa，SiHa和C-33a)的200ng gDNA。结果表明，HeLa和SiHa细胞的gDNA中有E6-E7基因，这两种细胞均为HPV阳性细胞(图7A)。然而，没有从C-33a gDNA扩增出HPV E6-E7基因，表明该细胞是HPV阴性细胞(图7A)。这个第一轮qPCR被命名为qPCR1。然后将针对HPV16或18设计的sgRNA与Cas9核酸酶结合以切割qPCR1产物，将酶切产物用T4 DNA连接酶连接。最后，使用一对反向PCR引物，用qPCR扩增连接产物。结果表明，HPV16E6-E7基因存在于SiHa细胞中，HPV18E6-E7基因存在于HeLa细胞中(图7B)。然而，在C-33a gDNA中没有发现HPV16和HPV18E6-E7基因。这与HeLa是HPV18阳性细胞，SiHa是HPV16阳性细胞，C-33a是HPV阴性细胞的报道相符合。第二轮qPCR被命名为qPCR2。
使用相同的反应流程，也用三个相同的宫颈癌细胞检测了HPV L1基因。结果表明，使用通用引物MY09/MY11进行qPCR1，仅在HeLa和SiHa细胞的gDNA中发现了HPV L1基因(图7A)。qPCR2检测也表明HPV16 L1基因存在于SiHa细胞中，HPV18 L1基因存在于HeLa细胞中(图7C)。qPCR1和qPCR2都在C-33a细胞中没有发现HPV L1基因。这些结果与HPV E6-E7基因的CARP检测结果相符合，表明CARP检测的可靠性。
最后，探讨了CARP方法的检测灵敏度。为此，使用不同量的HeLa gDNA作为模板用qPCR1扩增了L1和E6-E7基因。将qPCR1产物用Cas9/sgRNA切割并用T4 DNA连接酶连接。使用反向引物通过qPCR2扩增qPCR1的连接产物(1μl)，用于检测HPV18(图7D)。基于qPCR的CARP可以检测到少至0.002ng的gDNA。这些数据表明，通过CARP可以敏感地，特异性地检测宫颈癌细胞gDNA中的HPV。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cgacgcagag aaacacaag 19
Claims (4)
1.一种非诊断的基于CRISPR的DNA检测和分型方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）用一对通用引物PCR扩增靶DNA；
（2）用Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA；
（3）用DNA连接酶连接被切割的靶DNA，产生分子内DNA成环或者分子间的平末端DNA连接；
（4）用PCR扩增连接后的靶DNA；
步骤（2）所述Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA为利用Cas9核酸酶与靶向目的DNA 的一对sgRNA混合，形成两个Cas9/sgRNA复合物；该复合物在sgRNA的引导下靶向目的DNA，使Cas9/sgRNA复合物与目的DNA结合并在Cas9的作用下发生目的DNA的双链切割，步骤（4）所述用PCR扩增连接后的靶DNA为使用一对在靶DNA上呈反向的PCR引物；该对反向的PCR引物在靶DNA未发生Cas9/sgRNA切割和之后步骤（3）的连接时，不能扩增靶DNA，而在靶DNA发生Cas9/sgRNA切割并经步骤（3）连接后，则可扩增靶DNA。
2.根据权利要求1所述的DNA检测和分型方法，其特征在于，步骤（1）所述通用引物为可将含有靶DNA序列的DNA片段从待检测DNA样品中PCR扩增出来的一对引物；该对引物是单一序列或简并序列。
3.根据权利要求1所述的DNA检测和分型方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（4）所述PCR包括普通PCR、定量PCR或数字PCR。
4.根据权利要求1所述的DNA检测和分型方法在，其特征在于，所述DNA检测和分型方法在检测高拷贝靶DNA或仅用于含量丰富的靶DNA分型检测时，为通过Cas9/sgRNA直接切割高拷贝靶DNA或含量丰富的靶DNA进行检测。
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