KR20220158846A - 핵산 및 rna-기반 항미생물제를 효율적으로 전달하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

핵산 및 rna-기반 항미생물제를 효율적으로 전달하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 박테리오파지 DNA 및 파지미드 DNA의 메틸화 패턴을 변형시키는 방법 및 조작된 CRISPR-Cas 시스템의 구성요소를 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 용원성 박테리오파지를 사용하여 박테리아를 선별적으로 사멸시키는 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 및 RNA-기반 항미생물제를 효율적으로 전달하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR EFFICIENT DELIVERY OF NUCLEIC ACIDS AND RNA-BASED ANTIMICROBIALS}
우선권의 선언
본 출원은 35 U.S.C.§119 (e)에 의거하여, 2015년 6월 15일자로 출원된 미국 가출원 제62/175,749호의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고로서 통합된다.
연방 지원의 선언
본 발명은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 수여하는 수여 번호 MCB-1452902로 정부 지원에 의해 이루어졌다.
발명의 분야
본 발명은 박테리오파지 DNA 및 파지미드 (phagemid) DNA의 메틸화 패턴을 변형시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조작된 (engineered) CRISPR-Cas 시스템의 구성요소를 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지를 사용하여 박테리아를 선별적으로 사멸시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)는, CRISPR-연관된 유전자 (cas)와 조합으로, 많은 박테리아 및 대부분의 고세균 (archaea)에서 적응 면역을 부여하는 CRISPR-Cas 시스템을 구성한다. CRISPR-매개 면역은 플라스미드 및 파지와 같은 침입 유전 요소로부터의 DNA의 통합을 통해 발생하고, 이는 동일한 서열을 포함하는 침입인자에 의한 미래의 감염을 막는데 사용될 수 있다.
CRISPR-Cas 시스템은 초가변 (hypervariable) "스페이서 (spacer)" 서열 및 플랭킹하는 (flanking) cas 유전자 세트에 의해 중간에 위치하는 (interspaced) 짧은 DNA "반복"의 CRISPR 어레이 (arrays)로 구성된다. 상기 시스템은 외래 핵산의 서열-특이적 표적화 및 간섭을 통해 파지 및 플라스미드와 같은 침입 유전 요소에 대한 적응 면역을 제공하여 작동한다 (Barrangou et al. 2007. Science. 315:1709-1712; Brouns et al. 2008. Science 321:960-4; Horvath and Barrangou. 2010. Science. 327:167-70; Marraffini and Sontheimer. 2008. Science. 322:1843-1845; Bhaya et al. 2011. Annu. Rev. Genet. 45:273-297; Terns and Terns. 2011. Curr. Opin. Microbiol. 14:321-327; Westra et al. 2012. Annu. Rev. Genet. 46:311-339; Barrangou R. 2013. RNA. 4:267-278). 통상적으로, 침입 DNA 서열은 새로운 "스페이서"로서 획득되고 (Barrangou et al. 2007. Science. 315:1709-1712), 각각 CRISPR 반복과 쌍을 이루며, 상기 CRISPR 유전자좌 (locus)에 새로운 반복-스페이서 유닛으로서 삽입된다. 상기 "스페이서"는 모든 CRISPR-Cas 시스템에 공통적인 Cas1 및 Cas2 단백질에 의해 획득되고 (Makarova et al. 2011. Nature Rev. Microbiol. 9:467-477; Yosef et al. 2012. Nucleic Acids Res. 40:5569-5576), 일부 시스템에서는 Cas4 단백질에 관여한다 (Plagens et al. 2012. J. Bact. 194: 2491-2500; Zhang et al. 2012. PLoS One 7:e47232). 결과로 수득된 반복-스페이서 어레이가, DNA 또는 RNA의 서열-특이적 인식을 유도하는 CRISPR RNAs (crRNAs)로 프로세싱되는, 긴 프리-CRISPR RNA (pre-crRNA)로 전사된다 (Brouns et al. 2008. Science 321:960-4). 특히, crRNAs는 Cas 엔도뉴클레아제 (endonucleases)에 의해 매개되는 서열-특이적 핵산 절단을 위해 뉴클레아제 (nucleases)를 상보적인 표적 (complementary target)으로 유도한다 (Garneau et al. 2010. Nature. 468:67-71; Haurwitz et al. 2010. Science. 329:1355-1358; Sapranauskas et al. 2011. Nucleic Acid Res. 39:9275-9282; Jinek et al. 2012. Science. 337:816-821; Gasiunas et al. 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:E2579-E2586; Magadan et al. 2012. PLoS One. 7:e40913; Karvelis et al. 2013. RNA Biol. 10:841-851).
이러한 광범위한 시스템은 거의 절반의 박테리아 (약 46%)와 대다수의 고세균 (약 90%)에서 발생한다. 상기는, crRNA 생물속생 (biogenesis)을 유도하는 생화학적 과정에서 cas 유전자 내용, 조직 및 변이, 뿐만 아니라 표적 인식 및 절단을 매개하는 Cas 단백질 복합체에 기반하여 6개의 주요 타입으로 분류된다 (Makarova et al. 2011. Nature Rev. Microbiol. 9:467-477; Makarova et al. 2013. Nucleic Acid Res. 41:4360-4377; Makarova et al. 2015. Nature Rev. Microbiol. 13:722-736; Shmakov et al. 2015. Mol. Cell. 60:385-397). 타입 I 및 III에서, 상기 전문화된 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 프리-crRNAs를 처리한 다음 상기 crRNA와 상보적인 핵산을 인식하고 절단할 수 있는 대형 멀티-Cas 단백질 복합체로 조립한다. 타입 II CRISPR-Cas 시스템에 다른 프로세스가 관여된다. 여기에서, 상기 프리-crRNAs는 트란스-활성화 (trans-activating) crRNA (tracrRNA)가 상기 crRNA의 반복 영역에 혼성화되는 메카니즘에 의해 처리된다. 혼성화된 crRNA-tracrRNA는 RNase III에 의해 절단되고, 각 스페이서의 5' 말단을 제거하는 두 번째 사건 이후, tracrRNA 및 Cas9 둘 모두와 결합되어 남아있는 성숙한 (mature) crRNAs가 생산된다. 상기 성숙한 복합체는 그 다음에 상기 복합체에서 상기 스페이서 서열에 상보적인 표적 dsDNA 서열 ('프로토스페이서 (protospacer)' 서열)에 위치하고, 두 개의 가닥 모두를 절단한다. 상기 타입 II 시스템에서 복합체에 의한 표적 인식 및 절단은 crRNA-tracrRNA 복합체 상의 스페이서 서열과 표적 '프로토스페이서' 서열 사이에 상보적인 서열을 필요로 할 뿐만 아니라, 상기 프로토스페이서 서열의 5' 말단에 위치하는 프로토스페이서 인접 모티프 (protospacer adjacent motif: PAM) 서열도 필요로 한다. 상기 필요로 하는 정확한 PAM 서열은 상이한 타입 II 시스템들 사이에서 가변할 수 있다.
상기 타입 I 시스템은 박테리아 및 고세균에서 가장 우세하고 (Makarova et al. 2011. Nature Rev. Microbiol. 9:467-477), DNA를 표적으로 한다 (Brouns et al. 2008. Science 321:960-4). 항바이러스 방어를 위해 CRISPR 관련된 복합체로 불리우는 3 내지 8개의 Cas 단백질의 복합체 (Cascade)는 상기 프리-crRNAs를 처리하여 (Brouns et al. 2008. Science 321:960-4), 상기 crRNA의 스페이서 부분에 상보적인 "프로토스페이서"로 불리우는 DNA 서열을 인식하기 위해 상기 crRNA를 보유한다. 상기 crRNA 스페이서 및 상기 프로토스페이서 사이의 상보성 (complementarity)을 제외하고, 표적화 (targeting)는 상기 프로토스페이서의 3' 말단에 위치한 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)를 필요로 한다 (Mojica et al. 2009. Microbiology 155:733-740; Sorek et al. 2013. Ann. Rev. Biochem. 82:237-266). 타입 I 시스템에 있어서, 상기 PAM이 Cascade에 의해 직접 인식된다 (Sashital et al. 2012. Mol. Cell 46:606-615; Westra et al. 2012. Mol. Cell 46:595-605). 필요로 하는 정확한 PAM 서열은 상이한 타입 I 시스템들 사이에서 가변될 수 있고, 확립된 생물정보학 (bioinformatics) 및 실험적 절차를 통해 확인될 수 있다 (Esvelt et al. 2013. Nat. Methods 10:1116-11121; Jiang et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:233-239; Mojica et al. 2009. Microbiology 155:733-740). 일단 프로토스페이서가 인식되면, Cascade는 일반적으로 상기 엔도뉴클레아제 Cas3을 모집하고, 이는 상기 표적 DNA를 절단 및 분해한다 (Sinkunas et al. 2011. EMBO J. 30:1335-1342; Sinkunas et al. 2013. EMBO J. 32:385-394).
박테리오파지 (또는 파지)는 복제를 위해 숙주의 세포 기관에 의존하는 박테리아성 바이러스이다. 일반적으로, 파지는 대개 3개의 카테고리로 분류된다: 용균성 (lytic), 용원성 (lysogenic), 및 잠재성 (temperate). 용균성 박테리오파지는 숙주 세포를 감염시키고, 수회의 복제 라운드를 거쳐서, 세포 용균을 유도하여 새롭게 생산된 박테리오파지 입자를 방출한다. 용원성 박테리오파지는 상기 숙주 세포내, 상기 박테리아 게놈 또는 염색체외 (extrachromosomal) 플라스미드로 영구하게 존재한다. 잠재성 박테리오파지는 용균성 또는 용원성일 수 있고, 상기 세포의 성장 조건 및 생리학적 상태에 의존하여 하나를 다른 것에 대해 선택한다.
파지는 1950년대부터 합성 DNA를 패키징하고 전달하는데 사용되어 왔다 (Lennox, E.s., Virology 1(2):190-206(1950)). 이때, 3가지 일반적인 접근 방식이 채택되었다. 제1 접근 방식에서, 상기 합성 DNA가 상기 박테리오파지 게놈으로 무작위로 재조합되어서, 이는 보통 선별성 마커 (selectable marker)를 포함한다. 상기 접근 방식은 종종 현대 분자 생물학 기술의 출현 전에 파지 연구 초기에 사용되었다. 제2 접근 방식에서, 상기 파지 내에 제한 부위가 합성 DNA를 인 비트로에서 도입하는데 사용된다. 이. 콜리 (E. coli) 람다 (lambda) 파지가 주요 예이며, 여기서 도입된 제한 부위를 갖는 람다 박테리오파지의 수 개의 상업적 공급원이 이용가능하다 (Chauthaiwale et al. Microbiol. Rev. 56, 577-591 (1992)). 제3 접근 방식에서, 상기 파지 패키징 부위 및 용균성 복제 기원을 일반적으로 코딩하는 플라스미드가 상기 박테리오파지 입자의 조립체의 일부로 패키징된다 (Westwater et al. Microbiol. Read. Engl. 148, 943-950 (2002); Sternberg, N. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 103-107 (1990)). 상기 결과로 수득된 플라스미드가 '파지미드'로 만들어졌다. 파지미드는 개별의 유전자 또는 구조물을 전달하는데, 예를들면 내인성 경로를 재프로그램화하거나 또는 세포사를 유도하는데 주로 사용되었다 (Sternberg, N.,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 103-107 (1990); Lu & Collins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 11197-11202 (2007); Citorik et al. Nat. Biotechnol. (2014) 32(11):1141-1145; Bikard et al. Nat. Biotechnol. (2014) 32(11):1146-1150; Kittleson et al. ACS Synth. Biol. 1, 583-589 (2012)).
대부분의 파지는 진화학적 이유로 주어진 박테리아 균주에 한정된다. 이들의 유전 물질을 양립불가능한 (incompatible) 균주로 주입하면 비생산적 (counterproductive)일 수 있어서, 파지는 균주의 제한된 횡단을 특이적으로 감염시키도록 진화되었다. 그러나, 일부 파지는 그 유전 물질을 광범위한 박테리아로 주입할 수 있다는 것이 발견되었다. 고전적인 예로는 P1 파지이고, 이는 DNA를 그람 (gram)-음성 박테리아에 주입하는 것이 개시되었고 - 천연 이. 콜리 숙주의 범위를 넘어서는 것이다 (Westwater et al. Microbiol. Read. Engl. 148, 943-950 (2002); Kaiser & Dworkin. Science 187, 653-654 (1975); O'Connor et al. J. Bacteriol. 155, 317-329 (1983).
P1과 같은 파지는 합성 DNA를 전달하기 위한 편재된 플랫폼을 제공할 수 있지만, 이들은 편재하는 장벽 (barrier)인: 제한-변형 (restriction-modification: R-M) 시스템에 직면해 있다. 상기 박테리아 방어 시스템은 특정 서열에서 DNA를 메틸화하는 메틸라제 (methylases) (메틸트란스퍼라제 (methyltransferases)) 및/또는 비메틸화 (unmethylated) (타입 I, II, III) 또는 메틸화 (타입 IV)되는 DNA를 절단하는 제한 효소로 구성된다. 상기 시스템이 외래 메틸화 패턴을 갖는 DNA와 만날 때, 상기 제한 효소는 다수의 위치에서 상기 DNA를 절단하여, 복구 (repair) 가능성을 제한한다. 메틸화를 겪는 외래 DNA는 제한 효소를 탈출할 수 있지만, 그 발생 확률은 낮다. 대부분의 박테리아는 구별되는 메틸화 패턴을 생산하는 다수의 R-M 시스템을 코딩하기 때문에, 무작위 박테리아에 합성 DNA를 도입하는 것은 큰 어려움이 따를 수 있다.
본 발명은 박테리오파지 및 파지미드 DNA의 메틸화를 변형시키는 방법 및 CRISPR-Cas 시스템을 표적으로 하는 게놈의 전달에서 박테리오파지 입자를 사용하기 위한 방법 및 조성물을 제공함으로써 당분야에서 이전의 단점을 극복하였다.
일 양태에서, 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA의 메틸화 패턴을 변형시키는 방법은: 생산 숙주 박테리아의 메틸화 활성을 변경시키는 단계로서: (1) 생산 숙주 박테리아의 내인성 제한 변형 시스템 (R-M 시스템)의 적어도 하나의 효소의 활성을 파괴하여 (disrupting), 상기 내인성 R-M 시스템의 적어도 하나의 효소의 활성이 파괴된 변형된 생산 숙주 박테리아를 생산하는 단계, 및/또는 (2) 적어도 하나의 이종 메틸트란스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생산 숙주 박테리아에 도입하여, 상기 이종 메틸트란스퍼라제를 발현시키는 변형된 생산 숙주 박테리아를 생산하는 단계를 포함하는 것인 단계; 변경된 메틸화 활성을 갖는 상기 변형된 생산 숙주 박테리아를 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자로 감염시켜서, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 메틸화시키는 단계; 및 변형된 메틸화 패턴을 갖는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 생산하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 감염시키는 단계가 상기 생산 숙주 박테리아의 메틸화 활성을 변경하는 단계 전에 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA의 메틸화 패턴을 변형시키는 방법은: 생산 숙주 박테리아를 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자로 감염시키는 단계로서, 상기 생산 숙주 박테리아는 내인성 R-M 시스템의 적어도 하나의 효소의 파괴 및/또는 적어도 하나의 이종 메틸트란스퍼라제의 발현을 통해 메틸화 활성을 변경시켜서, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 메틸화시키는 것인 단계; 및 변형된 메틸화 패턴을 갖는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 생산하는 단계를 포함한다.
부가의 양태에서, 본 발명은 관심있는 이종 핵산을 표적 숙주 박테리아로 박테리오파지를 통해 도입시키는 효율을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은: 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산을 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자로 생산 숙주 박테리아를 감염시키는 단계로서, 상기 생산 숙주 박테리아는 내인성 제한 변형 시스템 (R-M 시스템)의 적어도 하나의 효소의 파괴 및/또는 적어도 하나의 이종 메틸트란스퍼라제의 발현을 통해 메틸화 활성을 변경시켜서, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 메틸화시키는 것인 단계; 변형된 메틸화 패턴을 가지며 및 상기 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산을 포함/코딩하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 생산하는 단계; 및 표적 숙주 박테리아를 상기 박테리오파지 입자로 감염시키는 단계로서, 상기 표적 숙주 박테리아는 상기 생산 숙주 박테리아의 메틸화 패턴과 실질적으로 유사한 (즉, 양립가능한) 메틸화 패턴 (또는 R-M 시스템(들))을 가지고 있어서, 상기 관심있는 이종 핵산을 상기 표적 숙주 박테리오파지로 도입시키는 효율을 증가시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 박테리오파지 입자가 제공된다. 본 발명의 부가의 양태는 표적 숙주 박테리아의 제한-변형 시스템(들)에 실질적으로 유사한 변형된 DNA 메틸화 패턴을 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공한다. 일부 양태에서, 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산이, 상기 박테리오파지에 의한 상기 생산 숙주 박테리아의 감염 전에, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA로 도입되어, 상기 박테리오파지 DNA 또는 상기 파지미드 DNA와 함께 상기 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산을 메틸화시킨다. 부가의 양태에서, 상기 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산은 CRISPR 어레이 (예컨대, 타입 I 또는 타입 II CRISPR 어레이)를 코딩한다. 추가의 양태에서, 상기 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산은 재조합 타입　I CRISPR-Cas 시스템 또는 재조합 타입 II CRISPR-Cas 시스템을 코딩한다.
본 발명의 부가의 양태는 타입 II CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리오파지 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공한다. 추가의 양태에서, 타입 I CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자가 제공된다.
본 발명의 또다른 양태는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공하고, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA는 하기를 포함하는 재조합 타입 II CRISPR-Cas 시스템을 포함하고: (a) Cas9 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (b) CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) tracr 핵산, 선택적으로 CRISPR 어레이를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 tracr 핵산이 서로 융합되어 단일 가이드 핵산을 형성한다.
본 발명의 부가의 양태는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공하고, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA는 하기를 포함하는 재조합 타입 I CRISPR-Cas 시스템을 포함한다: (a) CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 하나 이상의 타입 I CRISPR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드. 일부 양태에서, 타입 I CRISPR 폴리펩티드는 타입 I Cascade 폴리펩티드, 및 Cas3 폴리펩티드, 또는 Cas3' 폴리펩티드 및 Cas3" 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 타입 I CRISPR 어레이, 상기 타입 II CRISPR 어레이, 상기 타입 I CRISPR-Cas 시스템 또는 상기 타입 II CRISPR-Cas 시스템, Cas9 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 tracr 핵산, 및/또는 하나 이상의 타입 I CRISPR 폴리펩티드를 코딩하는 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 불필요한 부위 또는 보충 부위에서 박테리오파지 DNA로 통합된다.
본 발명의 부가의 양태는 적어도 하나의 표적 박테리아 종 또는 균주를 선별적으로 사멸시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은: 상기 적어도 하나의 표적 박테리아 종 또는 균주를 본 발명의 박테리오파지 입자와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA에 포함된 CRISPR 어레이는 상기 적어도 하나의 표적 박테리아 종 또는 균주에서 표적 DNA와 실질적인 상보성을 갖는 적어도 하나의 스페이서를 포함한다. 본 발명의 일부 양태에서, 상기 박테리오파지 입자가 상기 표적 박테리아 종 또는 균주와 상이한 박테리아 종 또는 균주에서 생산된다.
본 명세서에서 본 발명의 재조합 핵산 분자, CRISPR 어레이, 및/또는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리오파지 입자, 발현 카세트 및 세포가 더 제공된다.
본 발명의 상기 및 다른 양태가 하기 발명의 상세한 설명에서 더 상세하게 제공된다.
도 1은 CRISPR 항미생물제의 전달을 위한 플랫폼으로서 박테리오파지 입자를 생산하는 일반적인 과정의 개략도를 제공한다.
도 2a-2b는 메틸트란스퍼라제가 없는 박테리아 균주로부터 플라스미드 DNA가 메틸화된 DNA를 표적으로 하는 제한 효소에 의해 분해되지 않는다는 것을 보여주었다. 이. 콜리 균주 MG1655로부터의 DNA는 좌측 2개의 레인에 있고, 이. 콜리 균주 MG1655 Δdam Δdcm ΔhsdRMS로부터의 DNA (메틸트란스퍼라제 유전자가 결여됨)는 우측 2개의 레인에 있다 (도 2a). 상기 DNA가 (+) Dpn1과 함께 또는 (-) Dpn1 없이 인큐베이트되었다. 도 2b는 이. 콜리의 메틸트란스퍼라제-포지티브 균주에서 생산될 때 P1 박테리오파지 입자로부터 추출된 dsDNA를 보여주었다. 레인 1: VWR 2-log DNA 래더 (ladder). 레인 2, 4, 6: dam+dcm+ 이. 콜리에서 생산된 파지로부터의 DNA. 레인 3, 5, 7: dcm-dam- 이. 콜리에서 생산된 파지로부터의 DNA. 레인 2-3: AleI, NheI, 및 XhoI로 분해된 DNA. 레인 4-5: AleI, NheI, XhoI, 및 DpnII로 분해된 DNA. 레인 6-7: AleI, NheI, XhoI, 및 StyD41로 분해된 DNA. DNA 크기 마커가 좌측에 개시되었다.
도 3a-3b는 합성 서열을 도입하기 위한 파지 게놈에서 상이한 부위의 사용을 개시하였다. 도 3a는 합성 DNA 서열의 상기 P1 박테리오파지 게놈으로의 도입을 나타내는 도식도를 제공한다. IS1, 및 simABC는 상기 박테리오파지 P1 게놈 내에서 불필요한 유전자이고, coi/imcB는 용균 주기만을 유발하는데 필요한 보충가능한 (complementable) 유전자이다. 상기 coi/imcB 기능이 플라스미드 벡터로부터 상기 coi 유전자의 유도성 발현에 의해 보상될 수 있다. 도 3b는 kan 저항성 유전자가 상기 파지 게놈에서 다른 부위 (랜딩 부위)로 통합되는 P1 게놈의 효율적인 전달을 개시하였다.
도 4a-4b는 simAB를 파괴하여 제2 박테리오파지를 재감염 및 유지시키는 것을 보여주었다. 도 4a는 중복감염 (superinfection)을 테스트하기 위한 실험적 절차를 제공한다. P1-ΔimcB/coi::kan R (LB001) 또는 P1-ΔsimABC::kan R (LB002)를 갖는 (harboring) 세포가 파지 P1-ΔimcB/coi::cm R 로 감염되었고, kan, cm, 및 kan+cm 플레이트에 플레이팅되었다 (plated). 도 4b는 P1-ΔimcB/coi::kan R 또는 P1-ΔsimABC::kan R 을 갖는 세포에서 P1-ΔimcB/coi::cm R 의 전달 효율을 보여주었다. *는 검출된 콜로니가 없음을 의미한다.
도 5a-5b는 P1 게놈의 P1 입자 패키징 및 전달 대 P1 파지미드의 P1 입자 패키징 및 전달의 병렬 비교를 개시하였다. 도 5a는 상기 P1 게놈의 패키징 및 전달 또는 조작된 파지미드를 보여주는 도식도를 제공한다. 도 5b는 P1 입자가 이. 콜리 MG1655 및 BL21로 상기 P1 게놈을 P1 파지미드보다 더 효율적으로 패키징 및 전달하는 것을 보여주었다.
도 6은 상기 P1 게놈 (P1 coi-icmB::kanR)이 다른 환경 조건하에 전달될 수 있다는 것을 보여주었다. 약어: LB (Luria Broth); 최소 배지 (Minimal Media) (M9 글루코스), 혈청 (Serum) (우태아 혈청).
도 7a-7c는 박테리오파지를 통한 DNA 전달을 보여주었다. 도 7a는 +/- DNA 메틸화를 갖는 P1 박테리오파지 (즉, DNA 메틸화 (+) 또는 DNA 메틸화 (-)인 박테리아에서 생산된 P1)를 사용하여 이. 콜리로의 DNA 전달을 보여주었다. 카나마이신 (kanamycin) 선별하에 성장된 CFUs로 측정되는 감염된 이. 콜리 세포의 수가 균주들과 감염들 사이에서 비교되었다. 도 7b는 박테리오파지 LB002 +/- 메틸화에 의한 이. 콜리 및 클레브시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pneumoniae)로의 DNA 전달에서의 차이를 보여주었다. 카나마이신 선별하에 성장된 이. 콜리 또는 케이. 뉴모니에 (K. pneumoniae) CFUs로 측정되는, LB002 감염 유닛 (infectious units)이 그 후 감염들 사이에서 비교되었다. 도 7c는 +/- DNA 메틸화인 M13 변이체 박테리오파지를 사용하여 이. 콜리로의 DNA 전달을 보여주었다. 감염된 이. 콜리 세포의 수가 그 후 균주에 의해 비교되었다. TOP10F': dam 및 dcm을 코딩하지만, 제한 효소가 결여됨; EMG2: 제한-메틸화 시스템이 온전함 (비메틸화된 이중-가닥 DNA를 분해시킬 것임); JM110: dam 및 dcm을 코딩하지 않고, 제한 효소가 결여됨.
도 8a는 타입 I-E Cascade 및 Cas3이 게놈-표적화된 CRISPR RNA가 구비된 P1의 전달 후에 성장에 부정적인 영향을 주는 것을 보여주었다. 박테리아 성장이 600nm의 흡광도 (OD600)로 측정되었다. 도 8b는 타입 I-E Cascade 및 Cas3이 게놈-표적화된 CRISPR RNA를 구비한 P1의 전달 후에 생존에 부정적인 영향을 주는 것을 보여주었다. 각 박테리아 균주에 대해 상이한 감염 다중도 (multiplicities of infection: MOIs)에서 생존한 박테리아 세포의 수가 그 후에 비교되었다. 도 8c-8d는 상이한 위치에서 게놈-표적화된 CRISPR RNA를 코딩하는 P1 게놈을 전달하여 상기 타입 I-E Cascade 및 Cas3의 존재하에 이. 콜리를 사멸시키는 것을 보여 주었다. 도 8c는 CRISPR/파지 처리가 성장을 제거하는 것을 보여주었고, 도 8d는 배양 중에 CRISPR/파지 처리로 감소된 생존력을 초래하는 것을 보여주었다.
도 9는 상기 박테리오파지 P1 imcB-coi::kanR의 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri)의 2개의 균주로의 효율적인 전달을 보여주었다.
도 10a-10c. CRISPR 파지 (ftsA를 표적화함)가 도 10a에서 항생제-저항성 박테리아를 사멸시키는 것이 입증되었다. Cip=시프로플록사신 (Ciprofloxacin). 도 10b는 CRISPR 파지가 효과적인 항생제와 조합될 때 부가의 항미생물 효과를 발휘하는 것을 보여주었다. IM = 이미페넴 (imipenem). 도 10c는 CRISPR 파지가 상기 항생제 이미페넴의 존재 또는 부재하에 120분내에 이. 콜리를 사멸시키는 것을 보여주었다.
도 11a-11b는 이. 콜리를 표적으로 하는 CRISPR 파지가 대퇴부 근육 감염의 마우스 모델에서 살아있는 박테리아 수를 감소시키는 것을 보여주었고 (도 11a), 이. 콜리를 표적으로 하는 CRISPR 파지가 마우스 모델에서 동물 생존 시간을 증가시키는 것을 보여주었다 (도 11b).
도 12는 상기 타입 I-E 시스템에서 연장된 CRISPR RNA 스페이서가 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여주었다. 32 nts (+0) 내지 44 nts (+12)의 길이를 갖는 스페이서를 갖는 반복-스페이서-반복 (어레이)이 테스트되었고, 여기서 천연 (야생형) 타입 I-E 시스템은 32-nt 길이를 갖는 스페이서에 의존한다. 사용된 스페이서 (p1, as1, p2 및 s1)는 도 12의 상단부에서 lacZ 유전자의 개략도에 개시된 바와 같이 lacZ을 표적으로 하였다. DNA 간섭 프로세스의 개략도가 도 12의 중간부에 제공되었고, 상기 스페이서 및 Cascade 복합체가 상기 게놈 DNA에 결합하고, 이어서 Cas3을 모집하는 것을 보여 주었다. 도 12의 하단부에 비-표적화된 플라스미드와 바교하여 테스트된 4개의 스페이서를 각각 코딩하는 플라스미드에 있어서 타입 I-E 단백질 (Cas3, Cascade)을 발현하는 이. 콜리 MG1655 세포로의 형질전환 효율을 보여주는 그래프가 제공되었다. 상기 형질전환 효율이 비-표적화된 스페이서를 코딩하는 플라스미드와 비교하여 보고되었다.
이하, 본 발명의 구현예가 개시된 첨부 도면 및 실시예를 참조로 하여, 본 발명이 개시될 것이다. 본 설명은 본 발명이 구현될 수 있는 모든 상이한 방식들 또는 본 발명에 추가될 수 있는 모든 특징들의 상세한 카탈로그가 되도록 의도되지는 않는다. 예를 들면, 일 구현예와 관련하여 개시된 특징들은 다른 구현예에 통합될 수 있고, 특정 구현예와 관련하여 개시된 특징들은 그 구현예로부터 삭제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 또한, 본 명세서에서 제안된 다양한 구현예에 대한 다수의 변형 및 부가로서, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 것은, 본 개시내용에 비추어 당업계의 숙련된 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 이하의 설명은 본 발명의 일부 특정 구현예를 예시하기 위한 것이며, 그의 모든 순열, 조합 및 변형을 철저히 명시하지는 않았다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 설명에 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 참고가 제시되는 문장 및/또는 단락과 관련된 지시에 대해 그의 전체로 참고로서 통합된다.
문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에 개시된 본 발명의 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있음을 구체적으로 의도한다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 예시를 위해, 조성물이 성분 A, B 및 C를 포함하는 것으로 명시된 경우, A, B 또는 C 중 어느 것 또는 그 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략 및 포기될 수 있음을 구체적으로 의도한다.
본 발명의 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에 명백하게 달리 명시되지 않는 한 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 또한 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "및/또는 (and/or)"은 하나 이상의 관련 열거된 항목의 어느 것 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라, 대안 ("또는 (or)")으로 해석될 때 조합의 결여임을 지칭하고 포함한다.
투여량 또는 시간 주기 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 명세서에서 사용되는 용어 "약 (about)"은 명시된 양의 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5% 또는 ±0.1% 조차의 편차를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "X와 Y 사이 (between X and Y)" 및 "약 X와 Y 사이 (between about X and Y)"와 같은 문구는 X 및 Y를 포함하는 것으로 해석되어야만 한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약 X와 Y 사이 (between about X and Y)"와 같은 문구는 "약 X와 약 Y 사이 (between about X and about Y)"를 의미하고, "약 X에서 Y까지 (from about X to Y)"와 같은 문구는 "약 X에서 약 Y까지 (from about X to about Y)"를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "포함한다 (comprise)", "포함되는 (comprises)" 및 "포함한 (comprising)"은, 명시된 특징, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 구성요소의 존재를 나타내지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 동작, 요소, 구성요소, 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "필수적으로 구성된 (consisting essentially of)"이라는 과도기적 문구는 청구범위가 하기 청구범위에 명시된 특정 재료 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적 및 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것을 포함하는 것으로 해석되어야 하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 청구범위에서 사용되는 경우 "필수적으로 구성된"이라는 용어는 "포함하는 (comprising)"과 동등한 것으로 해석되도록 의도된 것이 아니다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "키메라 (chimeric)"는 적어도 2개의 성분이 상이한 공급원 (예컨대, 상이한 생물체, 상이한 코딩 영역)으로부터 유래된 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "보체 (complement)"는 비교인자 (comparator) 뉴클레오티드 서열과 100% 상보성 또는 동일성을 의미할 수 있거나 또는 100% 미만의 상보성 (예컨대, 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 등의 상보성)을 의미할 수 있다. 보체 또는 보충가능한은 또한 돌연변이에 대한 "보체 (complement)" 또는 이를 "보충하는 (complementing)" 측면에서 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 파지 게놈에서 "보충가능한" 부위는 파지 기능 (예컨대, 용균 주기)의 일 양태에 필수적인 유전자를 포함하는 부위이지만, 상기 기능은 상기 게놈에서 또는 플라스미드 상의 다른 위치에서 유전자를 발현시킴으로써 회복될 수 있다.
용어 "상보적인 (complementary)" 또는 "상보성 (complementarity)"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 허용하는 염 및 온도 조건하에 염기-쌍에 의한 폴리뉴클레오티드의 천연 결합을 의미한다. 예를 들면, 서열 "A-G-T"는 상보적인 서열 "T-C-A"에 결합한다. 2개의 단일-가닥 분자들 사이의 상보성은 일부만의 뉴클레오티드가 결합하는 경우에 "부분적 (partial)"일 수 있거나, 또는 단일 가닥 분자들 간에 완전한 상보성이 존재할 때 완전 (complete)할 수 있다. 핵산 가닥들 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥들 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "접촉한다 (contact)", "접촉한 (contacting)", "접촉된 (contacted)" 및 그의 문법적 변형은, 목적하는 반응 (예컨대, 통합, 형질전환, 스크리닝, 선별, 사멸, 동정, 증폭 등)을 수행하기에 적합한 조건하에 원하는 반응의 성분들을 함께 위치시키는 것을 지칭한다. 이러한 반응을 수행하기 위한 방법 및 조건은 당업계에 공지되어 있다 (예컨대, Gasiunas et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. 109:E2579-E2586; M.R. Green and J. Sambrook (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조).
뉴클레오티드 서열의 "단편 (fragment)" 또는 "부분 (portion)"은 참조 핵산 또는 뉴클레오티드 서열과 비교하여 길이가 감소되고 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 뉴클레오티드 감소된), 참조 핵산 또는 뉴클레오티드와 동일하거나 또는 거의 동일한 (예컨대, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한) 인접한 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 및/또는 이로 구성된 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명에 따른 그러한 핵산 단편 또는 부분은, 적절한 경우, 보다 큰 폴리뉴클레오티드에 구성요소로 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 단편은 그 기능을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 기능적 단편일 수 있다 (예컨대, 야생형 폴리펩티드와 비교하여 길이가 감소되었지만, 타입-I Cascade 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능 (예컨대, CRISPR RNAs를 프로세스하고, DNA에 결합하고 및/또는 복합체를 형성하는)을 보유하는 타입-I Cascade 폴리펩티드의 단편). Cascade 폴리펩티드의 기능적 단편이 상기 Cascade 폴리펩티드의 단편에 의해 코딩될 수 있다. 대표적인 구현예에서, 본 발명은 Cas9 뉴클레아제의 기능적 단편을 포함할 수 있다. Cas9 기능적 단편은, 이에 한정되는 것은 아니지만, HNH 뉴클레아제 활성, RuvC 뉴클레아제 활성, DNA, RNA 및/또는 PAM 인식 및 결합 활성을 포함하는 천연 Cas9 뉴클레아제의 하나 이상의 활성을 보유한다. Cas9 뉴클레아제의 기능적인 단편이 Cas9 폴리뉴클레오티드의 단편에 의해 코딩될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "유전자 (gene)"는 mRNA, tRNA, rRNA, miRNA, 항-미크로RNA, 조절 RNA 등을 생산하는데 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 유전자는 기능성 단백질이나 유전자 산물을 생산하는데 사용될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 유전자는 코딩 및 비-코딩 영역 (예컨대, 인트론, 조절 요소, 프로모터, 인핸서, 종결 서열 및/또는 5' 및 3' 비번역된 영역)을 모두 포함할 수 있다. 유전자는 자연 상태의 핵산과 관련하여 통상적으로 발견되는 성분이 실질적으로 또는 필수적으로 없는 핵산을 의미하는 것에 의해 "단리될 (isolated)" 수 있다. 이러한 성분은 다른 세포 물질, 재조합 생산으로부터의 배양 배지 및/또는 상기 핵산을 화학적으로 합성하는데 사용되는 다양한 화학 물질을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "게놈 (genome)"은 미토콘드리아 및/또는 플라스미드 게놈뿐만 아니라 생물체의 염색체/핵 게놈을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "헤어핀 서열 (hairpin 서열)"은 헤어핀 (예컨대, 하나 이상의 헤어핀 구조를 형성하는)을 포함하는 뉴클레오티드 서열이다. 헤어핀 (예컨대, 줄기-루프, 폴드-백)은 단일 가닥-영역이 각 부분에서 이중 가닥 영역에 의해 플랭크되는 단일 가닥을 형성하는 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 2차 구조를 갖는 핵산 분자를 지칭한다. 이러한 구조는 당업계에 널리 알려져 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 상기 이중 가닥 영역은 염기 쌍에서 약간의 미스매치를 포함할 수 있거나 또는 완전히 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 상기 반복 뉴클레오티드 서열내에 위치하는 헤어핀 서열 (즉, 상기 반복 뉴클레오티드 서열내에 있는 상기 헤어핀의 한쪽 면에 존재하는 반복 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나 또는 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산 구조물의 헤어핀 서열이 tracr 핵산의 3' 말단에 위치될 수 있다.
"이종성 (heterologous)" 또는 "재조합 (recombinant)" 뉴클레오티드 서열은 자연적으로 발생한 뉴클레오티드 서열의 자연적으로 발생하지 않은 다중 카피를 포함하는, 그것이 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 결합하지 않은 뉴클레오티드 서열이다.
본 명세서에서 사용된, "이종 메틸트란스퍼라제 (heterologous methyltransferase)"는 상기가 도입되는 박테리아 숙주 세포 (예컨대, 생산 숙주 박테리아)에서 자연적으로는 발견되지 않는 메틸트란스퍼라제이다. 그러므로, 생산 숙주 박테리아로 도입되는 "이종 메틸트란스퍼라제"는 상기 생산 숙주 박테리아에서 발견되는 메틸트란스퍼라제(들)과는 다른, 고세균 종으로부터 또는 박테리아 균주 또는 종으로부터의 메틸트란스퍼라제일 수 있다.
이종 메틸트란스퍼라제가, 표적 균주의 메틸화 패턴과 유사한 메틸화 패턴을 생산 숙주 박테리아에 부여하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 DNA MTase의 비제한적인 예는 파지 Φ50으로부터의 LlaPI를 포함하고, 이는 락토코시 (lactococci)에서 타입 II R-M 시스템으로부터 보호하기 위해 도입될 수 있다 (Hill et al. J Bacteriol. 173(14):4363-70 (1991)). 생산 숙주 박테리아에서 발현될 수 있는 부가의 DNA 변형 효소는 아데닌 잔기를 아세트이미드화 (acetimidate)하는 폴리펩티드를 코딩하는 것을 포함한다. 일부 R-M 시스템은 아데닌 메틸화에 민감하다. 상기 박테리오파지 DNA에서 아데닌 잔기를 아세트이미드화하는 폴리펩티드는 상기 시스템으로부터 DNA를 보호할 것이다. 상기 생산 숙주 박테리아에서 아데닌 잔기를 아세트이미드화할 수 있는 폴리펩티드의 비제한적인 예는 파지 Mu 및 Mu-유사 프로파지 (prophage) 서열로부터의 mom 유전자를 포함하고 (헤모필루스 인플루엔제 (Haemophilus influenzae) Rd (FluMu), 네이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis) 타입 A 균주 Z2491 (Pnme1) 및 에이취. 인플루엔제 (H. influenzae) 바이오타입 에깁티우스 (aegyptius) ATCC 11116), 상기는 아데닌 잔기를 N(6)-메틸아데닌으로 전환시켜서, 아데닌 민감성 제한 효소를 보호한다. 개별의 메틸트란스퍼라제에 의해 부여되는 메틸화 패턴이 확립된 DNA 시퀀싱 기술, 가령 Pacbio SMRT 시퀀싱 (O'Loughlin et al. PLoS One. 2015:e0118533)을 사용하여 평가될 수 있다. 일단 생산되면, 상기 생산 균주는 표적 균주로 DNA 전달을 위한 박테리오파지 입자를 생산하는데 사용될 수 있다.
박테리아 "제한-변형 시스템 (restriction-modification systems)" (R-M 시스템)은 (1) 특정 서열에서 DNA를 메틸화하는 메틸트란스퍼라제 및/또는 (2) 비메틸화된 (타입 I, II, 및 III) 또는 메틸화된 (타입 IV) DNA를 절단하는 제한 효소를 포함한다. 상기 R-M 시스템은 외래 메틸화 패턴을 갖는 DNA가 상기 R-M 시스템의 제한 효소에 의해 다수의 위치에서 절단되는 박테리아 방어 시스템을 구성한다. 대부분의 박테리아는 하나 초과의 R-M 시스템을 포함한다. Roberts, R. J. et al. Nucleic Acids Res. 31, 1805-1812 (2003). 타입 I 메틸트란스퍼라제는 기능에 있어서 양립가능한 특이성 단백질의 존재를 필요로 한다. 타입 II 및 타입 III 메틸트란스퍼라제는 기능에 부가되는 단백질을 필요로하지 않는다. 그러므로, 본 발명에 유용한 메틸트란스퍼라제 및 제한 효소 (변형 또는 저해를 위한 표적으로서 또는 생산 숙주 박테리아에서 발현되는 이종 폴리펩티드로서, 이로써 상기 생산 숙주 박테리아의 R-M 시스템을 변형시킴)는 박테리아 제한-변형 시스템 (예컨대, 타입 I, II, III, 또는 IV)에 포함되는 임의의 메틸트란스퍼라제 또는 제한 효소를 포함할 수 있다.
상동성을 갖는 상이한 핵산 또는 단백질은 본 명세서에서 "동종체 (homologues)"로 지칭된다. 용어 동종체는 동일 및 다른 종으로부터의 동종 서열 및 동일 및 다른 종으로부터의 이종상동성 (orthologous) 서열을 포함한다. "상동성 (homology)"은 위치상의 동일성 (positional identity) (즉, 서열 유사성 또는 동일성)의 백분율의 측면에서 둘 이상의 핵산 및/또는 아미노산 서열들 간의 유사성 수준을 지칭한다. 상동성은 또한 상이한 핵산 또는 단백질 사이의 유사한 기능적 특성의 개념을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드 서열에 대한 동종체를 더 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, "이종상동성 (orthologous)"은 종 분화 동안 공통의 조상 유전자로부터 발생한 상이한 종에서 동종 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 동종체는 본 발명의 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 실질적 서열 동일성 (예컨대, 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및/또는 100%)을 갖는다. 따라서, 예를 들면, 본 발명에서 유용한 반복, tracr 핵산, Cas9 폴리펩티드, Cas3 폴리펩티드, Cas3' 폴리펩티드, Cas3" 폴리펩티드, 및/또는 Cascade 폴리펩티드의 동종체는 임의의 알려져 있는 반복, tracr 핵산, Cas9 폴리펩티드, Cas3 폴리펩티드, Cas3' 폴리펩티드, Cas3" 폴리펩티드, 및/또는 Cascade 폴리펩티드에 대해 약 70% 이상 상동일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 혼성화 (hybridization), 혼성화한다 (hybridize), 혼성화한 (hybridizing), 및 이들의 문법적 변형은 두 개의 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 일부 미스매치된 염기 쌍이 존재할 수 있는 실질적으로 상보적인 서열의 결합을 지칭할 수 있다. 혼성화를 위한 조건은 당업계에 공지되어 있고 뉴클레오티드 서열의 길이와 상기 뉴클레오티드 서열들 사이의 상보성의 정도에 기초하여 가변한다. 일부 구현예에서, 혼성화의 조건은 매우 엄격할 수 있거나, 또는 그들은 상보성의 양 및 혼성화될 서열의 길이에 의존하여 중간 엄격성 또는 낮은 엄격성일 수 있다. 뉴클레오티드 서열들 사이의 혼성화의 목적에 대한 낮은, 중간 및 높은 엄격성을 구성하는 조건은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예컨대, Gasiunas et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. 109:E2579-E2586; M.R. Green and J. Sambrook (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "증가하다", "증가한", "증가된", "향상하다", "향상된", "향상시키는" 및 "향상" (및 이들의 문법적 변형)은 대조군과 비교하여 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상의 향상을 설명한다. 그러므로, 예를 들면, 표적 DNA의 증가된 전사는 상기 표적 유전자의 전사에서 대조군과 비교하여 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상의 증가를 의미할 수 있다.
"천연" 또는 "야생형" 핵산, 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 자연적으로 발생한 또는 내인성 핵산, 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 예를 들면, "야생형 mRNA"는 생물체에서 자연적으로 발생하거나 생물체에 대해 내인성인 mRNA이다. "상동" 핵산은 상기가 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 연관된 뉴클레오티드 서열이다. 그러므로, 예를 들면, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "내인성 제한 효소"는 상기 생산 숙주 박테리아에서 자연적으로 발생하는 (이에 천연인) 제한 효소를 의미한다.
또한 본 명세서에서 사용되는, 용어 "핵산", "핵산 분자", "핵산 구조물", "뉴클레오티드 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 그들의 혼성체인 RNA 또는 DNA를 지칭한다. 상기 용어는 또한 RNA/DNA 혼성체 (hybrids)를 포함한다. dsRNA가 합성으로 생산되는 경우, 덜 흔한 염기, 가령 이노신 (inosine), 5-메틸시토신, 6-메틸아데닌, 히폭산틴 (hypoxanthine) 및 다른 것들이 또한 안티센스, dsRNA, 및 리보자임 쌍에 사용될 수 있다. 예를 들면, 유리딘 및 시티딘의 C-5 프로핀 (propyne) 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 RNA에 높은 친화도로 결합하는 것으로 나타났고 유전자 발현의 강한 안티센스 저해인자인 것으로 나타났다. 다른 변형, 가령 포스포디에스테르 백본, 또는 RNA의 리보오스 당 작용기에서 2'-히드록시에 대한 변형 또한 제조될 수 있다. 본 개시내용의 핵산 구조물은 DNA 또는 RNA일 수 있지만, 바람직하게는 DNA일 수 있다. 따라서, 비록 본 발명의 핵산 구조물이 DNA의 형태로 개시되고 사용될 수 있지만, 의도된 사용에 따라서, 상기는 또한 RNA의 형태로 개시되고 사용될 수 있다.
"합성 (synthetic)" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 자연에서는 발견되지 않지만, 인간의 손으로 생산되므로, 자연의 산물이 아닌 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 헤테로폴리머 또는 핵산 분자의 5'에서 3' 말단의 이러한 뉴클레오티드의 서열을 지칭하고, cDNA를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자, DNA 단편 또는 부분, 게놈 DNA, 합성 (예컨대, 화학적으로 합성된) DNA, 플라스미드 DNA, mRNA, 및 안티-센스 RNA를 포함하고, 이들 중 어느 것은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산", "핵산 분자", 및 "올리고뉴클레오티드"는 또한 본 명세서에서 뉴클레오티드의 헤테로폴리머를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 달리 지시된 것을 제외하고, 본 명세서에 제공된 핵산 분자 및/또는 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 5'에서 3' 방향, 왼쪽에서 오른쪽으로 제시되었고, U.S. 서열 규칙, 37 CFR §§1.821 - 1.825에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 성격을 나타내는 표준 코드 및 WIPO (World Intellectual Property Organization) 표준 ST.25를 사용하여 나타내었다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "퍼센트 (percent) 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은 두 서열이 최적으로 정렬될 경우 시험 ("피험체 (subject)") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 이의 상보적 가닥)과 비교하여 기준 ("쿼리 (query)") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 이의 상보적 가닥)의 선형 폴리뉴클레오티드에서 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 지칭한다. 일부 구현예에서, "퍼센트 동일성"은 아미노산 서열에서 동일한 아미노산들의 백분율을 지칭할 수 있다.
"프로토스페이서 (protospacer) 서열"은 표적 이중 가닥 DNA 및 특이적으로 CRISPR 반복-스페이서 서열, CRISPR 반복-스페이서-반복 서열, 및/또는 CRISPR 어레이의 스페이서 서열에 대해 완전히 또는 실질적으로 상보적인 (및 혼성화하는) 표적 DNA의 부분 (예컨대, 또는 게놈에서 표적 영역)을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "감소하다", "감소된", "감소한", "감소", "약화하다", "억제하다" 및 "줄이다" (및 이들의 문법적 변형)은, 대조군과 비교하여 예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 감소를 개시한다. 특정 구현예에서, 감소는 검출가능한 활성 또는 양이 없거나 본질적으로 없는 것 (즉, 유의하지 않은 양, 예컨대, 약 10% 미만 또는 심지어 약 5% 미만)을 야기할 수 있다. 따라서, 예를 들면, Cas3 뉴클레아제 또는 Cas9 뉴클레아제에서 돌연변이화는 상기 Cas3 뉴클레아제 또는 상기 Cas9 뉴클레아제의 뉴클레아제 활성을 대조군 (예컨대, 야생형 Cas3)과 비교하여 적어도 약 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지 감소할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "반복 서열"은, 예를 들면, 야생형 CRISPR 유전자좌의 임의의 반복 서열 또는 "스페이서 서열"에 의해 분리된 합성 CRISPR 어레이의 반복 서열 (예컨대, 반복-스페이서-반복 서열)을 지칭한다. 본 발명에서 유용한 반복 서열은 임의의 공지된 또는 이후에 확인되는 CRISPR 유전자좌의 반복 서열일 수 있거나 또는 이는 CRISPR 타입 I 시스템 또는 CRISPR 타입 II 시스템에서 기능하도록 디자인된 합성 반복일 수 있다. 그러므로, 일부 구현예에서, 반복 서열은 야생형 CRISPR 타입 I 유전자좌 또는 야생형 CRISPR 타입 II 유전자좌로부터의 반복 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 반복 서열은 야생형 반복 서열의 일부 (예컨대, 야생형 반복 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 반복 서열은 적어도 하나의 뉴클레오티드 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 또는 그 중 임의의 범위)를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 반복 서열은 적어도 약 1 내지 약 150 뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 또다른 구현예에서, 반복 서열은 적어도 약 1 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 그 중 임의의 범위 또는 값을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 부가의 구현예에서, 반복 서열은 약 3 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 약 10 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 약 15 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 40 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 30 뉴클레오티드, 약 30 내지 약 40 뉴클레오티드, 약 25 내지 약 40 뉴클레오티드, 약 25 내지 약 45 뉴클레오티드, 및/또는 약 25 내지 약 50 뉴클레오티드, 또는 그 중 임의의 범위 또는 값을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성될 수 있다. 대표적인 구현예에서, 반복 서열은 약 25 뉴클레오티드 내지 약 38 뉴클레오티드, 또는 그 중 임의의 범위 또는 값을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성될 수 있다. 더 부가의 구현예에서, 반복 서열은 약 29 뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성될 수 있다. 또다른 구현예에서, 상기 반복 서열은 길이가 적어도 약 20 내지 30 뉴클레오티드 만을 갖는 헤어핀을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성될 수 있다. 또다른 구현예에서, 반복 서열은 적어도 약 적어도 3 뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 하나 초과의 스페이서 뉴클레오티드 서열이 CRISPR 어레이에 존재할 때, 각 스페이서 뉴클레오티드 서열이 "반복 뉴클레오티드 서열"에 의해 다른 것으로부터 분리된다. 그러므로, 일부 대표적인 구현예에서, 스페이서 서열의 5' 말단에 연결되는 반복 서열은 길이가 약 3 뉴클레오티드 (예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 뉴클레오티드 또는 그 이상)일 수 있고, 야생형 반복 뉴클레오티드 서열의 동일한 영영역 (예컨대, 5' 말단)에 대해 적어도 90% 동일성 (예컨대, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상)을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 스페이서 서열의 3' 말단에 연결된 반복 서열의 일부는 야생형 반복 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 50% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 10 이상의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 또다른 구현예에서, 반복 서열은 길이가 적어도 약 20 내지 30 뉴클레오티드만을 갖는 헤어핀을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "CRISPR 어레이"는 적어도 2개의 반복 서열, 또는 상기 각 반복 서열의 일부, 및 적어도 하나의 스페이서 서열을 포함하는 핵산 분자를 의미하고, 상기 두개의 반복 서열 중 하나, 또는 그 일부가 상기 스페이서 서열의 5' 말단에 연결되고, 상기 2개의 반복 서열의 다른 것 또는 그 일부가 상기 스페이서 서열의 3' 말단에 연결된다. 재조합 CRISPR 어레이에서, 반복 서열 및 스페이서 서열의 조합은 인간에 의해서 만들어지고 자연에서는 발견되지 않는 합성의 것이다. 일부 구현예에서, "CRISPR 어레이"는 5'에서 3'로 적어도 하나의 반복-스페이서 서열 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 이상의 반복-스페이서 서열, 및 그 중 임의의 범위 또는 값)을 포함하는 핵산 구조물을 지칭하고, 상기 어레이의 3' 대부분의 반복-스페이서 서열의 3' 말단이 반복 서열에 연결되어, 상기 어레이 중 모든 스페이서가 5' 말단과 3' 말단 둘 다에서 반복 서열에 의해 플랭킹된다.
본 발명의 CRISPR 어레이는 임의의 길이를 가질 수 있고, 상기에 개시된 바와 같이 반복 서열을 교대로 갖는 스페이서 서열의 임의의 수를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 어레이는 1 내지 약 100 스페이서 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성될 수 있고, 각각은 그 5' 말단 및 그 3' 말단에서 반복 서열에 연결된다 (예컨대, 반복-스페이서-반복-스페이서-반복-스페이서-반복-스페이서-반복 등, 그 결과 각 CRISPR 어레이는 반복으로 시작하고 반복으로 끝난다). 그러므로, 일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 CRISPR 어레이는 그 5' 말단 및 그 3' 말단에서 반복 서열에 각각 연결되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 또는 그 이상의, 스페이서 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "CRISPR 파지"는 CRISPR-Cas 시스템의 적어도 하나의 구성요소를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리오파지 DNA를 포함하는 파지 입자를 의미한다 (예컨대, CRISPR 어레이, crRNA; 예컨대, ftsA를 표적으로 하는 crRNA의 삽입을 포함하는 P1 박테리오파지).
본 명세서에서 사용되는 "서열 동일성"은 2개의 최적으로 정렬된 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드 서열이 구성요소들, 예컨대 뉴클레오티드 또는 아미노산의 정렬 윈도우를 통해 변하지 않는 정도를 지칭한다. "동일성"은 다음에 개시된 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 알려진 방법에 의해 용이하게 산출될 수 있다: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991).
본 명세서에서 사용되는 "스페이서 서열"은 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열이다 (즉, 게놈에서 표적 영역 또는 "프로토스페이서 서열", 이는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열에 인접함). 상기 스페이서 서열은 표적 DNA에 대해 완전히 상보적이거나 또는 실질적으로 상보적 (예컨대, 적어도 약 70% 상보적 (예컨대, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상))일 수 있다. 그러므로, 일부 구현예에서, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 DNA와 비교하여 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 미스매치를 가질 수 있고, 상기 미스매치는 인접하거나 또는 인접하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스페이서 서열은 표적 DNA에 70% 상보성을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 스페이서 뉴클레오티드 서열은 표적 DNA에 80% 상보성을 가질 수 있다. 또다른 구현예에서, 상기 스페이서 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자의 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 등의 상보성을 가질 수 있다. 대표적인 구현예에서, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 DNA에 100% 상보성을 갖는다. 특정 구현예에서, 스페이서 서열은 길이가 적어도 약 8 뉴클레오티드 내지 약 150 뉴클레오티드인 표적 뉴클레오티드 서열의 영역에 대해 완전한 상보성 또는 실질적인 상보성을 갖는다. 대표적인 구현예에서, 스페이서 서열은 길이가 적어도 약 20 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드인 표적 뉴클레오티드 서열의 영역에 대해 완전한 상보성 또는 실질적인 상보성을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열의 5' 영역은 표적 DNA에 대해 100% 상보성일 수 있지만 상기 스페이서의 3' 영역은 상기 표적 DNA에 실질적으로 상보적일 수 있지만, 그러므로 상기 표적 DNA에 대한 상기 스페이서 서열의 전체 상보성은 100% 미만이다. 그러므로, 예를 들면, 20 뉴클레오티드 스페이서 서열 (시드 영역 (seed region))의 3' 영역에서 처음 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 등의 뉴클레오티드는 상기 표적 DNA에 대해 100% 상보성일 수 있지만, 상기 스페이서 서열의 5' 영역에 남아있는 뉴클레오티드는 상기 표적 DNA에 대해 실질적으로 상보성 (예컨대, 적어도 약 70% 상보성)이다. 일부 구현예에서, 상기 스페이서 서열의 3' 말단의 처음 7 내지 12 뉴클레오티드는 상기 표적 DNA에 대해 100% 상보성일 수 있지만, 상기 스페이서 서열의 5' 영역에 남아있는 뉴클레오티드는 상기 표적 DNA에 대해 실질적으로 상보성 (예컨대, 적어도 약 50% 상보성 (예컨대, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상))이다. 일부 구현예에서, 상기 스페이서 서열의 3' 말단에서 처음 7 내지 10 뉴클레오티드는 상기 표적 DNA에 75%-99% 상보성일 수 있지만, 상기 스페이서 서열의 5' 영역에 남아있는 뉴클레오티드는 상기 표적 DNA에 대해 적어도 약 50% 내지 약 99% 상보성이다. 다른 구현예에서, 상기 스페이서 서열의 3' 말단에서 처음 7 내지 10 뉴클레오티드는 상기 표적 DNA에 대해 100% 상보성일 수 있지만, 상기 스페이서 서열의 5' 영역에 남아있는 뉴클레오티드는 상기 표적 DNA에 대해 실질적으로 상보성 (예컨대, 적어도 약 70% 상보성)일 수 있다. 대표적인 구현예에서, 상기 스페이서 서열의 (시드 영역내에) 처음 10 뉴클레오티드는 상기 표적 DNA에 대해 100% 상보성일 수 있지만, 상기 스페이서 서열의 5' 영역에 남아있는 뉴클레오티드는 상기 표적 DNA에 대해 실질적으로 상보성 (예컨대, 적어도 약 70% 상보성)이다. 예시되는 구현예에서, 스페이서 서열의 5' 영역 (예컨대, 5' 말단에서 처음 8 뉴클레오티드, 5' 말단에서 처음 10 뉴클레오티드, 5' 말단에서 처음 15 뉴클레오티드, 5' 말단에서 처음 20 뉴클레오티드)은 표적 DNA에 대해 약 75% 이상의 상보성 (75% 내지 약 100%의 상보성)을 가질 수 있지만, 상기 스페이서 서열의 나머지는 상기 표적 DNA에 대해 약 50% 또는 그 이상의 상보성을 가질 수 있다. 그러므로, 예를 들면, 스페이서 서열의 5' 말단에서 처음 8 뉴클레오티드는 상기 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 100% 상보성을 가질 수 있거나 또는 이는 하나 또는 둘의 돌연변이화를 가질 수 있으므로, 표적 DNA에 대해 각각 약 88% 상보성 또는 약 75% 상보성일 수 있고, 상기 스페이서 뉴클레오티드 서열의 나머지는 상기 표적 DNA에 대해 적어도 약 50% 또는 그 이상의 상보성일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 스페이서 서열은 길이가 약 15 뉴클레오티드 내지 약 150 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 스페이서 뉴클레오티드 서열은 길이가 약 15 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드 (예컨대, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 뉴클레오티드 또는 그 이상)일 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 스페이서 뉴클레오티드 서열은 약 8 내지 약 150 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 100 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 50 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 40 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 30 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 25 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 20 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 150 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 100 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 80 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 50 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 30, 약 10 내지 약 25, 약 10 내지 약 20, 약 15 내지 약 150, 약 15 내지 약 100, 약 15 내지 약 50, 약 15 내지 약 40, 약 15 내지 약 30, 약 20 내지 약 150 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 100 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 80 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 40, 약 20 내지 약 30, 약 20 내지 약 25, 적어도 약 8, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 32, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 44, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150 뉴클레오티드의 길이 또는 그 이상, 및 그 중 임의의 값 또는 범위일 수 있다.
일부 구현예에서, 스페이서가 이. 콜리에서 야생형 스페이서 타입 I-E CRISPR Cas 시스템의 통상적인 길이에 대해 변형될 수 있다 (예컨대, 약 32 뉴클레오티드의 길이) (즉, 더 길어지거나 (연장되거나) 또는 더 짧아질 수 있다). 일부 구현예에서, 상기 스페이서를 상기 표적 DNA에 상보적인 부가의 뉴클레오티드를 포함하도록 상기 스페이서의 3' 말단을 연장시킴으로써 더 길게 만들었다. 그러므로, 전술한 바와 같이, 일부 양태에서, 스페이서 서열은 길이가 적어도 약 15 뉴클레오티드 내지 약 150 뉴클레오티드, 약 15 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 약 20 뉴클레오티드 내지 약 150 뉴클레오티드, 약 20 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드 등 (예컨대, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 뉴클레오티드, 또는 그 중 임의의 범위 또는 값)인 표적 뉴클레오티드 서열의 영역에 대해 완전히 상보성이거나 또는 실질적으로 상보성을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 그 3' 말단에서 스페이서는 상기 표적 DNA의 연속하는 뉴클레오티드의 일부에 대해 완전히 상보성이거나 또는 실질적으로 상보성 (예컨대, 적어도 약 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 이상)일 수 있다.
대표적인 구현예에서, 본 발명의 타입 II CRISPR 반복-스페이서 핵산의 스페이서 서열은 적어도 약 16 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 스페이서의 3' 말단에서 상기 적어도 약 16 뉴클레오티드의 적어도 약 10의 연속하는 뉴클레오티드는 표적 핵산의 10의 연속하는 뉴클레오티드에 대해 적어도 약 90% 상보성을 가지며, 상기 표적 핵산은 관심있는 생물체의 게놈에서 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열에 인접한다.
대표적인 구현예에서, 본 발명의 타입 I CRISPR 반복-스페이서 핵산의 스페이서 서열은 적어도 약 15 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 스페이서의 5' 말단에서 상기 적어도 약 15 뉴클레오티드의 적어도 약 7의 연속하는 뉴클레오티드는 표적 핵산의 7의 연속하는 뉴클레오티드에 대해 적어도 약 90% 상보성을 가지며, 상기 표적 핵산은 관심있는 생물체의 게놈에서 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열에 인접한다.
본 명세서에서 사용되는, 문구 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적인 동일성"은 두 개의 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 서열의 문맥에서, 하기의 서열 비교 알고리즘 중 하나의 사용 또는 육안 검사에 의해서 측정되는 최대 일치에 대한 비교 및 정렬의 경우에 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및/또는 100%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 특정 구현예에서, 실질적인 동일성은 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95, 96, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 문구 "실질적으로 상보적인" 또는 "실질적인 상보성"은 두 개의 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열의 문맥에서, 하기의 서열 비교 알고리즘 중 하나의 사용 또는 육안 검사에 의해서 측정되는 최대 일치에 대한 비교 및 정렬의 경우에 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및/또는 100%의 뉴클레오티드 상보성을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 특정 구현예에서, 실질적인 상보성은 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95, 96, 96, 97, 98, 또는 99%의 상보성을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭할 수 있다.
서열 비교에서, 통상적으로 하나의 서열은 비교되는 시험 서열에 대한 기준 (reference) 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 기준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 하위서열 좌표가 필요한 경우에 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이후 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여 기준 서열과 비교하여 시험 서열(들)에 대하여 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교 윈도우를 정렬하기 위한 서열의 최적의 정렬은 당업자에게 공지되어 있고, Smith 및 Waterman의 로컬 상동성 알고리즘 (local homology algorithm), Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘 (homology alignment algorithm), Pearson 및 Lipman의 유사성 방법의 검색, 및 선택적으로 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 구현 가령 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., San Diego, CA)의 부분으로서 사용가능한 TFASTA와 같은 도구에 의해서 수행될 수 있다. 시험 서열 및 기준 서열의 정렬된 세그먼트에 대한 "동일성 분획 (fraction)"은 두 개의 정렬된 서열에 의해 공유되는 동일한 구성요소들의 수를 기준 서열 세그먼트의 구성요소의 총 수, 즉 전체 기준 서열 또는 기준 서열의 더 작게 정의된 부분으로 나눈 값이다. 퍼센트 서열 동일성은 동일성 분획에 100을 곱한 값으로 나타내어진다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 비교는 전체 길이 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 부분, 또는 더 긴 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 것일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서 "퍼센트 동일성"은 또한 번역된 뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTX 버전 2.0을 그리고 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정될 수 있다.
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information을 통해 공개적으로 입수할 수 있다. 상기 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양의 값 임계 점수 T와 매치되거나 또는 만족하는 쿼리 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 식별하여 높은 득점 서열 쌍 (high scoring sequence pairs: HSPs)을 먼저 식별하는 것을 포함한다. T는 인접 단어 점수 임계라고 지칭된다 (Altschul et al., 1990). 이러한 초기 인접 단어는 검색을 시작하는 시드로 사용되어 상기를 포함하는 더 긴 HSP를 찾는다. 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (매칭되는 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상> 0) 및 N (미스매칭되는 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 있어서, 누적 점수를 계산하기 위해 득점 매트릭스가 사용된다. 누적 정렬 점수가 최대 달성 값에서 양 X만큼 떨어지면 각 방향으로 단어 히트의 확장이 중단되고, 누적 점수는 하나 이상의 음의 득점 잔기 정렬의 누적 때문에 0 또는 그 이하가 되거나, 또는 서열의 말단에 도달된다. BLAST 알고리즘 파라미터인 W, T 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대함)은 11의 단어 길이 (W), 10의 기대값 (E), 100의 컷오프, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 기본값 (defaults)으로 사용한다. 아미노산 서열에 있어서, BLASTP 프로그램은 3의 단어 길이 (W), 10의 기대값 (E) 및 BLOSUM62 득점 매트릭스를 기본값으로 사용한다 (Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989) 참조).
퍼센트 서열 동일성을 계산하는 것 이외에, BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다 (예컨대, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 측정은 최소 합 확률 (P(N))이고, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이의 매치가 우연히 일어날 수 있는 가능성의 지시를 제공한다. 예를 들면, 시험 핵산 서열은 시험 뉴클레오티드 서열 대 기준 뉴클레오티드 서열의 비교에서 최소 합 확률이 약 0.1 미만 내지 약 0.001 미만인 경우 기준 서열에 대해 유사한 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 시험 뉴클레오티드 서열 대 기준 뉴클레오티드 서열의 비교에서 최소 합 확률은 약 0.001 미만이다.
본 명세서에서 사용되는 "표적 DNA", "표적 뉴클레오티드 서열", "표적 영역" 또는 "게놈에서 표적 영역"은 CRISPR 어레이에서 스페이서 서열에 대해 완전히 상보적이거나 또는 실질적으로 상보적인 (예컨대, 적어도 70% 상보성 (예컨대, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상)) 생물체의 게놈의 영역을 지칭한다. 일부 구현예에서, 표적 영역은 생물체의 게놈에서 PAM 서열 (상기 표적 영역의 3'에 완전히 인접하게 위치한 PAM 서열)에 완전히 인접하여 위치하는 길이가 약 10 내지 약 40 연속되는 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 양태에서, 표적 뉴클레오티드 서열이 PAM (프로토스페이서 인접 모티프)에 인접하게 위치하거나 또는 이에 의해 플랭킹되었다. PAMs은 종종 특정 CRISPR-Cas 시스템에 대해 특이적이지만, PAM 서열이 확립된 실험 및 계산적 접근방식을 통해서 당분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정될 수 있다. 그러므로, 예를 들면 실험적 접근방식은 모든 가능한 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 서열을 표적화하고, 및 표적화를 수행하지 않은 서열 멤버를, 가령 표적 DNA의 인 비트로 절단 (Patanayak et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:839-843) 또는 표적 플라스미드 DNA의 형질전환 (Esvelt et al. 2013. Nat. Methods 10:1116-1121; Jiang et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:233-239)을 통해서 동정하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 계산적 접근방식은 천연 스페이서의 BLAST 조사를 수행하여 박테리오파지 또는 플라스미드에서 원래의 표적 DNA 서열을 확인하고, 상기 서열들을 정렬하여 상기 표적 서열에 인접하는 보존된 서열을 결정하는 단계를 포함한다 (Briner and Barrangou. 2014. Appl. Environ. Microbiol. 80:994-1001; Mojica et al. 2009. Microbiology 155:733-740).
본 명세서에서 사용되는 "트란스-활성화 CRISPR (trans-activating CRISPR: tracr) 핵산" 또는 "tracr 핵산"은 임의의 tracr RNA (또는 그것의 코딩 DNA)를 지칭한다. tracr 핵산은 5'에서 3'로 벌지 (bulge), 넥서스 헤어핀 (nexus hairpin) 및 말단 헤어핀 (terminal haripin), 및 선택적으로 5' 말단에서 상부 스템 (upper stem)을 포함한다 (Briner et al. (2014) Molecular Cell. 56(2):333-339 참조). tracr 핵산은 성숙 또는 미성숙 crRNAs의 반복 부분에 대한 혼성화에서 기능하고, Cas9 단백질을 표적 부위에 모집하고, 구조적 재배열을 유도함으로써 Cas9의 촉매 활성을 촉진할 수 있다. tracrRNAs에 대한 서열은 상기 CRISPR-Cas 시스템에 대하여 특이적이고 다양할 수 있다. 공지되거나 또는 이후에 확인된 임의의 tracr 핵산이 본 발명에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, tracr 핵산이 CRISPR 어레이에 융합될 수 있어서 단일 가이드 핵산을 형성하고, 그러므로 상기 tracr 핵산 및 CRISPR 어레이가 단일 가이드로 도입될 수 있다.
본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드 서열 및/또는 재조합 핵산 분자 (예컨대, CRISPR 어레이를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 이종 메틸트란스퍼라제, Cascade 폴리펩티드, Cas9 폴리펩티드, Cas3 폴리펩티드, Cas3' 폴리펩티드, Cas3" 폴리펩티드, 재조합 타입 I 및 타입 II CRISPR-Cas 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 등)는 관심있는 임의의 종에서 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 코돈 최적화가 당 분야에 잘 알려져 있고, 종-특이적 코돈 사용 테이블을 사용하여 코돈 사용 바이어스 (codon usage bias)를 위한 뉴클레오티드 서열의 변형을 포함한다. 상기 코돈 사용 테이블이 관심있는 종에 대한 가장 고도하게 발현되는 유전자의 서열 분석에 기반하여 생산된다. 상기 뉴클레오티드 서열이 상기 핵에서 발현되도록 할 때, 상기 코돈 사용 테이블이 관심있는 종에 대해 고도로 발현되는 핵 유전자의 서열 분석에 기반하여 생산된다. 상기 뉴클레오티드 서열의 변형은, 상기 종-특이적 코돈 사용 테이블을 상기 천연 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 코돈과 비교하여 결정된다. 당분야에서 이해되는 바와 같이, 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 상기 천연 뉴클레오티드 서열에 대해 100% 미만의 동일성 (예컨대, 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 등)을 갖는 뉴클레오티드 서열을 유도하지만, 원래의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것과 동일한 기능을 갖는 폴리펩티드를 여전히 코딩한다. 그러므로 본 발명의 대표적인 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및/또는 재조합 핵산 분자는 관심있는 특정 생물체/종에서 발현하기에 최적화된 코돈일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 상기 재조합 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드가 "단리"된다. "단리된" 핵산 분자, "단리된" 뉴클레오티드 서열 또는 "단리된" 폴리펩티드는 인간에 의해서 천연 환경으로부터 벗어나서 존재하여, 천연의 산물은 아닌 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드이다. 단리된 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드가, 자연에서 발생하는 생물체 또는 바이러스, 예를 들면 폴리뉴클레오티드와 결합하여 일반적으로 발견되는 세포 또는 바이러스 구조적 구성요소 또는 다른 폴리펩티드 또는 핵산의 다른 구성요소들의 적어도 일부로부터 적어도 일부 분리된 정제된 형태로 존재할 수 있다. 대표적인 구현예에서, 상기 단리된 핵산 분자, 상기 단리된 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 단리된 폴리펩티드는 적어도 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상 순수하다.
다른 구현예에서, 단리된 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 비-천연 환경, 가령 예를 들면 재조합 숙주 세포에서 존재할 수 있다. 그러므로, 예를 들면, 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 "단리된 (isolated)"은 이를 천연에서 발생시키는 크로모좀 및/또는 세포로부터 분리되는 것을 의미한다. 천연에서 발생되는 크로모좀 및/또는 세포로부터 분리되고, 그 후 이를 천연에서 발생시키지 않은 유전적 내용, 크로모좀 및/또는 세포 (예컨대, 천연에서 발견되는 것보다 상이한 숙주 세포, 상이한 조절 서열, 및/또는 게놈에서 상이한 위치)로 삽입시킨다면 폴리뉴클레오티드가 또한 단리된다. 따라서, 인간에 의해서 그 천연 환경으로부터 분리되어 존재하지만, 천연의 산물은 아닌 상기 폴리뉴클레오티드 및 그 코딩된 폴리펩티드가 "단리"되고, 그러나 일부 구현예에서, 이들이 재조합 숙주 세포로 도입 및 이에 존재할 수 있다.
본 발명의 부가의 구현예에서, tracr 핵산 및/또는 CRISPR 어레이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는, 및 이종 메틸트란스퍼라제, Cas9 폴리펩티드, Cas3 폴리펩티드, Cas3' 폴리펩티드, Cas3" 폴리펩티드, Cascade 폴리펩티드 및/또는 타입 I 및 II CRISPR-Cas 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 다양한 생물체 또는 세포에서 발현을 위해 다양한 프로모터, 종결인자 및 다른 조절 요소과 작동적으로 결합될 수 있다. 그러므로, 대표적인 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터 및/또는 종결인자가 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명에서 유용한 임의의 프로모터가 사용될 수 있고, 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 본원에 개시된 바와 같이 구성성, 유도성, 발전적으로 조절되는 것을 포함하는 관심있는 생물체에서 기능하는 프로모터를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 조절 요소는 내인성 및 이종성일 수 있다. 일부 구현예에서, 표제의 생물체로부터 유래된 내인성 조절 요소가 천연에서 발생하지 않는 유전적 내용으로 삽입되고 (예컨대, 천연에서 발견되는 것보다 게놈에서 상이한 위치), 이로써 재조합 또는 비-천연 핵산을 생산한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"또는 "작동가능하게 결합된 (operably associated)"은, 지시된 요소가 서로 기능적으로 관련되며 일반적으로 물리적으로 관련되어 있음을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 "작동가능하게 연결된 (operably linked)" 또는 "작동가능하게 결합된 (operably associated)"이란 용어는 기능적으로 결합된 단일 핵산 분자 상의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, 제2 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열이란, 상기 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열과 기능적 관계에 놓여있는 때의 상황을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 상기 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현에 영향을 주는 경우, 프로모터가 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 결합된다. 당업자는, 상기 조절 (control) 서열이 그의 발현을 지시하는 기능을 하는 한, 작동가능하게 결합된 뉴클레오티드 서열과 조절 서열 (예컨대, 프로모터)이 연속적일 필요는 없다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 예를 들면, 번역되지 않았지만, 전사된 개재 (intervening) 서열이 프로모터와 뉴클레오티드 서열 사이에 존재할 수 있으며, 상기 프로모터는 여전히 상기 뉴클레오티드 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
"프로모터 (promoter)"는 상기 프로모터와 작동가능하게 결합된 뉴클레오티드 서열 (즉, 코딩 서열)의 전사를 제어 또는 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 상기 코딩 서열은 폴리펩티드 및/또는 기능성 RNA를 코딩할 수 있다. 통상적으로, "프로모터"는 RNA 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 전사 개시를 지시하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 프로모터는 상응하는 코딩 서열의 코딩 영역의 시작에 대하여 5', 또는 상류 (upstream)에서 발견된다. 상기 프로모터 영역은 유전자 발현의 조절인자로서 작용하는 다른 요소를 포함할 수 있다. 상기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, -35 요소 컨센서스 서열 및 -10 컨센서스 서열을 포함한다 (Simpson. 1979. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:3233-3237).
프로모터는, 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 재조합 핵산 구조물을 포함하는 재조합 핵산 구조물, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 및 벡터의 생산에 사용하기 위한, 예를 들어, 구성성, 유도성, 일시적으로 조절된, 발전적으로 조절된, 화학적으로 조절된 프로모터를 포함할 수 있다. 이러한 다양한 유형의 프로모터는 당업계에 널리 공지되어 있다.
그러므로, 일부 구현예에서, 본 발명의 구조물의 발현은 관심있는 생물체에서 기능하는 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 재조합 핵산 구조물을 사용하여 구성성, 유도성, 일시적으로 조절된, 발전적으로 조절된, 화학적으로 조절된 프로모터로 이뤄질 수 있다. 대표적인 구현예에서, 예를 들면 관심있는 생물체에서 기능하는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 재조합 핵산 구조물을 사용하여 억제가 이뤄질 수 있다.
프로모터의 선택은 발현을 위한 정량적, 시간적 및 공간적 요건에 따라, 또한 형질전환될 숙주 세포에 따라 다양할 것이다. 많은 다른 생물체에 대한 프로모터가 당업계에 널리 공지되어 있다. 당업계에 존재하는 광범위한 지식에 기초하여, 적절한 프로모터가 특정한 관심 숙주 생물체에 대해 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모델 생물체에서 고도로 구성적으로 발현된 유전자의 상류에 있는 프로모터에 관해서는 널리 공지되어 있고 그러한 지식은 적절하게 다른 시스템에 쉽게 접근 및 구현될 수 있다.
본 발명에서 유용한 예시되는 프로모터는 박테리아에서 기능하는 프로모터를 포함한다. 박테리아에 유용한 프로모터는, 이에 한정되는 것은 아니지만, L-아라비노스 유도성 (araBAD, P BAD ) 프로모터, 임의의 lac 프로모터, L-람노스 (rhamnose) 유도성 (rhaP BAD ) 프로모터, T7 RNA 폴리머라제 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 (lambda) 파지 프로모터 (p L, p L -9G-50), 안히드로테트라시클린 (anhydrotetracycline)-유도성 (tetA) 프로모터, trp, lpp, phoA, recA, proU, cst-1, cadA, nar, lpp-lac, cspA, T7-lac 작동인자 (operator), T3-lac 작동인자, T4 유전자 32, T5-lac 작동인자, nprM-lac 작동인자, Vhb, 단백질 A, 코리네박테리아 (corynebacterial)-이. 콜리 유사 프로모터, thr, hom, 디프테리아 (diphtheria) 독소 프로모터, sig A, sig B, nusG, SoxS, katb, α-아밀라제 (amylase) (Pamy), Ptms, P43 (2개의 중첩된 RNA 폴리머라제 σ 인자 인식 부위인, σA, σB로 이루어짐), Ptms, P43, rplK-rplA, 페레독신 (ferredoxin) 프로모터, 및/또는 크실로스 (xylose) 프로모터를 포함할 수 있다. (K. Terpe Appl. Microbiol, Biotechnol. 72:211-222 (2006); Hannig et al. Trends in Biotechnology 16:54-60 (1998); and Srivastava Protein Expr Purif 40:221-229 (2005) 참조).
본 발명의 일부 구현예에서, 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 그러므로, 예를 들면, 화학적으로-조절된 프로모터가 외인성 화학적 조절제의 적용을 통해서 생물체에서 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 화학적으로 조절되는 프로모터를 통한 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현의 조절은 본 발명의 RNAs 및/또는 폴리펩티드가 예를 들면 생물체가 상기 유도성 화학제로 처리되는 경우에만 합성될 수 있다. 상기 목적에 따라서, 상기 프로모터는, 화학제의 적용으로 유전자 발현을 유도하는 경우 화학제-유도성 프로모터, 또는 화학제의 적용으로 유전자 발현을 억제하는 경우 화학제-억제성 프로모터일 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터는 또한 특정 파장의 광의 적용으로 유전자 발현을 유도하는 경우 광-유도성 프로모터를 포함할 수 있다 (Levskaya et al. 2005. Nature 438:441-442).
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 구조물은 "발현 카세트 (expression cassette)"일 수 있거나 또는 발현 카세트 내에 포함될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "발현 카세트 (expression cassette)"는 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 구조물을 의미하고, 상기 재조합 핵산 구조물이 적어도 하나의 조절 서열 (예컨대, 프로모터)과 작동가능하게 결합된다. 그러므로, 본 발명의 일부 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 디자인된 발현 카세트를 제공한다.
관심있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있으며, 이는 그의 구성요소 중 적어도 하나가 그 다른 구성요소 중 적어도 하나에 대해 이종성임을 의미한다. 발현 카세트는 또한 자연적으로 발생하는 것이지만 이종성 발현에 유용한 재조합 형태로 수득된 것일 수 있다.
발현 카세트는 또한 선택된 숙주 세포에서 기능하는 전사 및/또는 번역 종결 영역 (즉, 종결 영역)을 선택적으로 포함할 수 있다. 발현 카세트에서 다양한 전사 종결인자를 사용할 수 있으며, 관심있는 이종성 뉴클레오티드 서열 이후에 전사의 종료 및 올바른 mRNA 폴리아데닐화를 담당한다. 상기 종결 영역은 전사 개시 영역에 고유할 수 있거나 (native), 작동가능하게 연결된 관심있는 뉴클레오티드 서열에 고유할 수 있거나, 숙주 세포에 고유할 수 있거나, 또는 다른 공급원(즉, 프로모터에 대해, 관심있는 뉴클레오티드 서열에 대해, 숙주에 대해, 또는 그 임의의 조합에 대해 외래 또는 이종성)으로부터 유래한 것일 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 종결인자가 본 발명의 재조합 핵산 분자 및 CRISPR 어레이에 작동가능하게 연결될 수 있다.
발현 카세트는 또한 선별가능한 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 이는 형질전환된 숙주 세포를 선택하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "선별가능한 마커 (selectable marker)"는 발현될 때 마커를 발현하는 숙주 세포에 별개의 표현형을 부여하여, 따라서 상기 형질전환된 세포가 마커를 갖지 않은 세포와 구별되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 그러한 뉴클레오티드 서열은 상기 마커가 예를 들면 선별제 (selective agent) (예컨대, 항생제 등)를 사용하는 것과 같이, 화학적 수단에 의해 선별될 수 있는 형질을 부여하는지 여부에 따라, 또는 상기 마커가 단순히 스크리닝 (예를 들어, 형광)과 같은 관찰이나 테스트를 통해 식별할 수 있는 특성인지 여부에 따라 선별가능한 또는 스크리닝가능한 마커를 코딩할 수 있다. 물론, 적합한 선별가능한 마커의 많은 예가 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 기재된 발현 카세트에서 사용될 수 있다.
발현 카세트 외에도, 본 명세서에 개시된 재조합 폴리뉴클레오티드 (예컨대, CRISPR 어레이 및/또는 tracr 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 이종 메틸트란스퍼라제, Cascade 폴리펩티드, Cas9 폴리펩티드, Cas3 폴리펩티드, Cas3' 폴리펩티드, Cas3" 폴리펩티드, 재조합 타입 I 및 타입 II CRISPR-Cas 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 등)가 벡터와 관련하여 사용될 수 있다. 용어 "벡터 (vector)"는 세포 내로 핵산 (또는 핵산들)을 전송 (transferring), 전달 (delivering) 또는 도입하기 위한 조성물을 지칭한다. 벡터는 전송, 전달 또는 도입될 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 숙주 생물체의 형질전환에 사용하기 위한 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적인 벡터 부류의 비-제한적인 예는 벡터가 자기 전달 또는 이동가능할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 이중 또는 단일 가닥의 선형 또는 원형 형태로, 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 파지미드 벡터, 코스미드 벡터 (cosmid vector), 포스미드 벡터 (fosmid vector), 박테리오파지, 인공 염색체 또는 아그로박테리움 바이너리 벡터 (Agrobacterium binary vector)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 명세서에서 정의된 바와 같은 벡터는 세포 게놈으로의 통합에 의해 원핵생물 숙주를 형질전환시킬 수 있거나 또는 염색체 외에서 존재할 수 있다 (예컨대, 복제 기원을 갖는 자율 복제 플라스미드). 또한 셔틀 벡터가 포함되고, 이는 두 개의 다른 숙주 생물체에서 복제가 자연적으로 또는 디자인에 의해 가능한 DNA 비히클 (vehicle), 가령 다수의 복제-기원을 갖는 광범위한-숙주 플라스미드 또는 셔틀 벡터를 의미한다. 일부 대표적인 구현예에서, 상기 벡터 내의 핵산은 숙주 세포에서 전사를 위한 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 제어하에 있고, 작동 가능하게 연결되어 있다. 상기 벡터는 복수의 숙주에서 기능하는 이중-기능성 발현 벡터일 수 있다. 게놈 DNA의 경우, 이것은 그 자체의 프로모터 또는 다른 조절 요소를 포함할 수 있으며, cDNA의 경우, 이는 숙주 세포에서의 발현을 위한 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 제어하에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트가 본 명세서에 개시되고 당업계에 공지된 바와 같은 벡터에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "접촉하는", "도입하는", "전달하는" 및 "투여하는"은 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드가 세포로 전달되어, 예를 들면, 상기 숙주 세포의 메틸화 활성을 변경하거나 또는 도입된 (이종/외래) CRISPR 어레이의 적어도 하나의 스페이서에 대해 실질적인 상보성을 갖는 표적 DNA를 포함하는 세포를 사멸시키는 프로세스를 지칭할 수 있다. 그러므로, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 문맥에서, 용어 "접촉하는", "도입하는", "전달하는" 및 "투여하는" (및 그 문법적 변형)은 관심있는 폴리뉴클레오티드의 문맥에서 관심있는 폴리뉴클레오티드를 숙주 생물체 또는 상기 생물체의 세포 (예컨대, 숙주 세포, 가령 박테리아 세포)에, 상기 폴리뉴클레오티드가 세포의 내부에 접근권을 얻도록 하는 방식으로 제시하는 것을 의미하고, 이러한 용어를 형질전환, "형질감염" 및/또는 "형질도입"으로 포함한다. 하나 초과의 폴리뉴클레오티드가 도입되는 경우, 이들 폴리뉴클레오티드는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구조물의 일부로서, 또는 개별의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구조물로서 조립될 수 있고, 동일 또는 상이한 발현 구조물 또는 형질전환 벡터상에 위치할 수 있다. 따라서, 이들 폴리뉴클레오티드는 단일 형질전환 이벤트 및/또는 개별의 형질전환 이벤트들에서 세포 내로 도입될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 숙주 박테리아의 세포로 도입될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환 (transformation)", "형질감염 (transfection)", 또는 "형질도입 (transduction)"은 이종성 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다. 세포로의 이러한 도입은 안정적이거나 또는 일시적일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 숙주 세포 또는 숙주 생물체가 본 발명의 핵산 분자에 의해 안정하게 형질전환된다. 다른 구현예에서, 숙주 세포 또는 숙주 생물체가 본 발명의 재조합 핵산 분자로 일시적으로 형질전환된다.
폴리뉴클레오티드의 문맥에서 "일시적인 형질전환 (transient transformation)"은 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되고 세포의 게놈에 통합되지 않는다는 것을 의미한다.
폴리뉴클레오티드의 문맥에서 "안정적으로 도입하는 (stably introducing)" 또는 "안정적으로 도입된 (stably introduced)"은 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈에 안정하게 혼입됨으로써, 상기 세포가 폴리뉴클레오티드에 의해 안정적으로 형질전환된다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "안정한 형질전환 (stable transformation)" 또는 "안정적으로 형질전환된 (stably transformed)"은 핵산 분자가 세포 내로 도입되어 상기 세포의 게놈에 통합되는 것을 의미한다. 이와 같이, 상기 통합된 핵산 분자는 그 자손에 의해, 보다 구체적으로는 다수의 연속적인 세대의 자손에 의해, 유전될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "게놈 (genome)"은 핵 및 플라스미드 게놈을 포함하며, 따라서 예를 들어, 플라스미드 게놈 내로의 핵산 구조물의 통합을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 안정한 형질전환은 또한 염색체 외에서, 예를 들어, 미니크로모좀 (minichromosome) 또는 플라스미드로서 유지되는 이식유전자 (transgene)를 지칭할 수도 있다.
일시적인 형질전환은 예를 들어, 생물체에 도입된 하나 이상의 이식유전자에 의해 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 존재를 검출할 수 있는 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA) 또는 웨스턴 블롯 (Western blot)에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은, 예를 들어, 생물체 (예를 들어, 박테리아)에 도입된 이식유전자의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열과 상기 세포의 게놈 DNA의 서던 블롯 혼성화 분석 (Southern blot hybridization assay)에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은, 예를 들어, 상기 세포로 도입되는 이식유전자의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열과 상기 세포의 RNA의 노던 블롯 혼성화 분석 (Northern blot hybridization assay)에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환이 또한, 예컨대 이식유전자의 표적 서열(들)과 혼성화하는 특정 프라이머 서열을 사용하여, 상기 이식유전자 서열의 증폭을 야기하고, 이는 표준 방법에 따라 검출될 수 있는, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 당분야에 알려져 있는 다른 증폭 반응에 의해 검출될 수 있다. 형질전환은 또한 당업계에 공지된 직접 시퀀싱 (direct sequencing) 및/또는 혼성화 프로토콜에 의해 검출될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열, 핵산 구조물, 발현 카세트, 및/또는 벡터가 일시적으로 발현될 수 있고 및/또는 이들이 숙주 생물체의 게놈에 안정하게 혼입될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드가 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 형질전환의 예시되는 방법은 수용성 세포 (competent cells)의 전기천공, 수용성 세포에 의한 수동 흡수 (passive uptake), 수용성 세포의 화학적 형질전환뿐만 아니라, 핵산의 세포로의 도입을 유도하는 임의의 다른 전기적, 화학적, 물리적 (기계적) 및/또는 생물학적 기전, 및 그 임의의 조합을 통한 형질전환을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 세포의 형질전환은 핵 형질전환을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 세포의 형질전환은 플라스미드 형질전환 및 콘쥬게이션을 포함한다.
원핵 생물체를 형질전환하기 위한 절차는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있고 일반적이며, 문헌을 통해 개시되었다 (예를 들면, Jiang et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:233-239; Ran et al. Nature Protocols 8:2281-2308 (2013) 참조).
그러므로, 뉴클레오티드 서열이 당업계에 공지된 임의의 수의 방식으로 숙주 생물체 또는 그의 세포에 도입될 수 있다. 본 발명의 방법은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 생물체에 도입하는 특정 방법에 의존하지 않으며, 단지 상기 세포의 내부에 접근권을 얻는다. 하나 초과의 뉴클레오티드 서열이 도입되어야 하는 경우, 이들은 단일 핵산 구조물의 일부로서, 또는 별개의 핵산 구조물로서, 조립될 수 있고, 동일하거나 또는 상이한 핵산 구조물에 위치할 수 있다. 따라서, 상기 뉴클레오티드 서열은 단일 형질전환 이벤트 또는 별개의 형질전환 이벤트들에서 관심있는 세포에 도입될 수 있다.
본 발명자들은 simABC, imcB/coi, res-mod, darA, phd-doc, kilA, tRNA 1,2, cixL, cixR 및 Is1을 포함하는 박테리오파지 게놈으로 이종 DNA를 혼입하기 위한 신규한 통합 부위를 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도 도입된 이종 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 것을 포괄하는 파지 DNA가, 상기 표적 숙주 박테리아에 실질적으로 유사한 메틸화 패턴 (R-M 시스템)을 갖는 생산 숙주 박테리아에서 상기 파지를 성장시킴으로써 표적 숙주 박테리아에 실질적으로 유사하게 메틸화될 수 있다는 것을 발견하였다. 상기 파지의 효율적인 메틸화는 패키징 이전 (예컨대, P1의 경우) 또는 단일-가닥 DNA의 패키징 동안 (예컨대, M13) 상기 파지 DNA의 빠른 복제에 의해 예상치 못했고, 이는 그렇지 않으면 DNA 패키징 전에 메틸화를 방지할 것으로 기대될 수 있다.
그러므로, 일부 양태에서, 본 발명은 박테리오파지 DNA 및 파지미드 DNA의 메틸화 패턴을 변형하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA의 메틸화 패턴을 변형하는 인 비보 방법을 제공하고, 상기 방법은: 생산 숙주 박테리아의 메틸화 활성을 변경하는 단계로서, (1) 생산 숙주 박테리아의 내인성 제한 변형 시스템 (R-M 시스템)의 적어도 하나의 효소의 활성을 파괴하여, 상기 내인성 R-M 시스템의 적어도 하나의 효소의 활성을 파괴시킨 변형된 생산 숙주 박테리아를 생산하는 단계, 및/또는 (2) 적어도 하나의 이종 메틸트란스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생산 숙주 박테리아에 도입하여, 상기 이종 메틸트란스퍼라제를 발현시키는 변형된 생산 숙주 박테리아를 생산하는 단계를 포함하는 것인 단계; 변경된 메틸화 활성을 갖는 상기 변형된 생산 숙주 박테리아를 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자로 감염시켜서, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 메틸화시키는 단계; 및 대조군 생산 숙주 박테리아에서 성장한 박테리오파지와 비교하여 변형된 메틸화 패턴을 갖는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 생산하는 단계 (상기 대조군 생산 숙주 박테리아는 본 명세서에 개시된 바와 같은 그 변경된 메틸화 활성을 갖지 않음)를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 감염시키는 단계가 상기 생산 숙주 박테리아의 메틸화 활성을 변경하는 단계 전에 수행될 수 있다. 그러므로, 일부 양태에서 본 발명은 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA의 메틸화 패턴을 변형시키는 인 비보 방법을 제공하고, 상기 방법은: 변경된 메틸화 활성을 갖는 상기 변형된 생산 숙주 박테리아를 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자로 감염시켜서, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 메틸화시키는 단계; 생산 숙주 박테리아의 메틸화 활성을 변경하는 단계로서, (1) 생산 숙주 박테리아의 내인성 제한 변형 시스템 (R-M 시스템)의 적어도 하나의 효소의 활성을 파괴하여, 상기 내인성 R-M 시스템의 적어도 하나의 효소의 활성을 파괴시킨 변형된 생산 숙주 박테리아를 생산하는 단계, 및/또는 (2) 적어도 하나의 이종 메틸트란스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생산 숙주 박테리아에 도입하여, 상기 이종 메틸트란스퍼라제를 발현시키는 변형된 생산 숙주 박테리아를 생산하는 단계를 포함하는 것인 단계; 및 대조군 생산 숙주 박테리아에서 성장한 박테리오파지와 비교하여 변형된 메틸화 패턴을 갖는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 생산하는 단계 (상기 대조군 생산 숙주 박테리아는 본 명세서에 개시된 바와 같은 그 변경된 메틸화 활성을 갖지 않음)를 포함한다.
또한 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA의 메틸화 패턴을 변형하는 인 비보 방법이 제공되고, 상기 방법은: 생산 숙주 박테리아를 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자로 감염시키는 단계로서, 상기 생산 숙주 박테리아는 내인성 R-M 시스템의 적어도 하나의 효소의 파괴 및/또는 적어도 하나의 이종 메틸트란스퍼라제의 발현을 통해 메틸화 활성을 변경시켜서, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 메틸화시키는 것인 단계; 및 대조군 생산 숙주 박테리아에서 성장한 박테리오파지와 비교하여 변형된 메틸화 패턴을 갖는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 생산하는 단계 (상기 대조군 생산 숙주 박테리아는 본 명세서에 개시된 바와 같은 그 변경된 메틸화 활성을 갖지 않음)를 포함한다.
일부 구현예에서, 생산 숙주 박테리아의 내인성 제한 변형 시스템의 2 이상 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 등)의 효소의 활성이 파괴 또는 변경될 수 있다.
생산 숙주 박테리아는 임의의 그람 (gram) 양성 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 그러므로, 일부 구현예에서, 생산 숙주 박테리아는 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 락토바실루스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 살모넬라 엔테리아 (Salmonella enteria), 스트렙토코쿠스 서모필루스 (Streptococcus thermophilus), 리스테리아 (Listeria), 캄필로박터 (Campylobacter) 또는 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 대표적인 구현예에서, 상기 생산 숙주 박테리아는 이. 콜리일 수 있다. 부가의 구현예에서, 상기 생산 숙주 박테리아는 이. 콜리 균주 MG1655, BW25113, BL21, TOP10, 또는 MG1655 Δdam Δdcm ΔhsdRMS일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 생산 숙주 박테리아의 메틸화 활성이 변형되지 않았다. 따라서, 일부 구현예에서, 그 메틸화 활성을 변경하도록 변형되지 않은 생산 숙주 박테리아가 재조합 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자로 감염될 수 있다.
임의의 알려져 있거나 또는 이후에 확인된 박테리오파지 DNA가 본 발명에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 박테리오파지 DNA가 용원성 또는 잠재성 박테리오파지로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 박테리오파지 DNA가 파지미드와 결합될 때 용균성 박테리오파지로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 박테리오파지 DNA가 잠재성 박테리오파지로부터 유래될 수 있다. 그러나, UV 노출, 기아 (starvation), 온도 변경, 유도성 화학제의 존재, 및/또는 용균성 전사 인자의 발현 유도와 같은 이벤트는 새로운 파지의 증식을 유발하는 용균 주기를 유도할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 박테리오파지 DNA는 P1 파지, M13 파지, λ 파지, T4 파지, PhiC2 파지, PhiCD27 파지, PhiNM1 파지, Bc431v3 파지, 파지, Phi10 파지, Phi25 파지, Phi151 파지, A511-유사 파지, B054, 01761-유사 파지, 또는 캄필로박터 파지 (가령 NCTC12676 및 NCTC12677)의 DNA를 포함할 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 생산 숙주 박테리아는 그람-음성 박테리아일 수 있고, 상기 박테리오파지 DNA는 예를 들면 P1 파지, M13 파지, λ 파지, Phi10, Phi25, Phi151, 캄필로박터 파지 (가령 NCTC12676 및 NCTC12677), 또는 T4 파지일 수 있다. 다른 구현예에서, 생산 숙주 박테리아는 그람-양성 박테리아일 수 있고, 상기 박테리오파지 DNA는 예를 들면 PhiC2 파지, PhiCD27 파지, PhiNM1 파지, B054, 01761-유사 파지, 또는 Bc431v3 파지일 수 있다.
임의의 알려져 있거나 또는 이후에 확인된 파지미드 DNA가 본 발명에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 유용한 파지미드 DNA는 P1 파지미드, M13 파지미드, λ 파지미드, T4 파지미드, PhiC2 파지미드, PhiCD27 파지미드, PhiNM1 파지미드, Bc431v3 파지미드, Phi10 파지미드, Phi25 파지미드, Phi151 파지미드, A511-유사 파지미드, B054, 01761-유사 파지미드, 캄필로박터 파지미드 (가령 NCTC12676 및 NCTC12677)의 DNA를 포함할 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.
내인성 R-M 시스템의 효소의 활성이, 폴리펩티드의 기능 및 활성을 파괴하기 위한 당분야에 잘 알려져 있는 방법 또는 이후에 개발된 방법을 사용하여 파괴될 수 있다. 이러한 방법은 점 돌연변이화 (point mutations) (예컨대, 미스센스 (missense), 또는 논센스 (nonsense), 또는 프레임 전이를 유도하는 단일 염기쌍의 삽입 또는 결실), 삽입, 결실, 및/또는 절단 (truncations)을 포함할 수 있고, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 저해인자가 박테리아 제한 변형 시스템 (R-M 시스템)의 효소의 활성을 파괴 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드 저해인자가 당분야에 알려져 있다. 폴리펩티드 저해인자가, 예를 들면 박테리오파지 DNA, 파지미드 DNA내에 코딩될 수 있고, 및/또는 상기 박테리오파지 입자에서 단백질로 패키징될 수 있다. 예를 들면, P1 파지는 이. 콜리에서 발견된 타입 I 제한 효소를 저해하는 2개의 폴리펩티드 저해인자를 코딩한다 (Lobocka et al. J. Bacteriol. 186, 7032-7068 (2004)). 일부 구현예에서, 내인성 R-M 시스템이 폴리펩티드 저해인자인, 숙주 메틸화 효소의 활성을 자극하는 폴리펩티드의 도입에 의해 저해 또는 파괴되어 상기 전달된 DNA의 메틸화 및 보호를 촉진할 수 있다.
R-M 시스템 효소의 저해인자는 REase (제한 엔도뉴클레아제)를 분해함으로써, 상기 숙주 R-M 효소 시스템이 상기 파지 DNA를 절단하는 것을 방지하는 단백질을 포함하고, 이에 한정되지 않는다. 내인성 박테리아 R-M 시스템 효소의 활성을 파괴 또는 변형하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 R-M 효소 저해인자의 비제한적인 예는 (a) 타입 I R-M 시스템의 모든 주요 부류를 저해하는 단백질 ArdA를 생산하는, 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis)로부터의 orf18; 및 (b) 상기 타입 I R-M 효소 EcoKI를 격리시키는 단백질 Ocr을 생산하는 박테리오파지 T7로부터의 gp0.3을 포함한다. R-M 시스템의 효소의 활성을 차단하는데 사용될 수 있는 단백질의 부가의 비제한적인 예로는 마스킹 (masking) 단백질을 포함한다. 마스킹 단백질이 파지 헤드로 패키지되고, DNA를 주입하자마자, 상기 파지 DNA에 결합하여, R-M 인식 부위를 마스킹한다. 본 발명에서 유용한 마스킹 단백질의 비제한적인 예로는 DarA 및 DarB 단백질을 포함한다 (Iida et al. Virology. 157(1):156-66 (1987)). 상기 단백질이 용균 주기 동안 P1 박테리오파지에 의해 발현되고, 상기 헤드로 패키지된다. 숙주 박테리아로 DNA를 주입하자마자, 이들은 상기 타입 I R-M 인식 부위에 결합하고 마스킹시킨다.
부가 또는 대안으로서, 생산 숙주 박테리아의 내인성 R-M 시스템이 적어도 하나의 이종 메틸트란스퍼라제의 발현을 통해 변경/변형될 수 있다. 생산 숙주 박테리아의 내인성 메틸화 패턴을 변경하여 상기 생산 숙주 박테리아의 메틸화 패턴이 상기 표적 박테리아의 메틸화 패턴과 실질적으로 유사하게 되는 임의의 메틸트란스퍼라제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 상기 이종 메틸트란스퍼라제는 상기 표적 박테리아 균주와 같은 상기 생산 숙주 박테리아와 실질적으로 유사한 메틸화 패턴을 부여하는 한, 상기 이종 메틸트란스퍼라제는 동일 또는 상이한 생물체로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 유용한 DNA MTase의 비제한적인 예로는 파지 Φ50으로부터의 LlaPI를 포함하고, 이는 락토코시에서 타입 II R-M 시스템을 보호하기 위해서 도입될 수 있다 (McGrath et al. Applied Environmental Microbiology. 65:1891-1899 (1999)). 개별의 메틸트란스퍼라제에 의해 부여되는 메틸화 패턴이 그 후 확립된 DNA 시퀀싱 기술, 가령 Pacbio SMRT 시퀀싱을 사용하여 평가된다 (O'Loughlin et al. PLoS One. 2015:e0118533.). 일단 생산되면, 상기 생산 균주가 상기 표적 균주로 DNA 전달을 위해 박테리오파지 입자를 생산하는데 사용된다.
부가의 이종 DNA 변형 효소가 생산 숙주 박테리아에서 발현될 수 있어서, 상기 생산 숙주 박테리아의 R-M 시스템이 상기 표적 박테리아의 R-M 시스템과 실질적으로 유사하게 만들어질 수 있다. 상기 목적에 유용한 이러한 DNA 변형 효소의 예로는 상기 DNA에서 아데닌 잔기를 아세트아미도아데닌으로 전환시키는 폴리펩티드를 코딩하는 것을 포함한다. 박테리오파지 DNA에서 아데닌 잔기를 아세트아미도아데닌으로 전환시키는 폴리펩티드는 아데닌 메틸화에 민감한 제한 효소로부터 상기 DNA를 보호할 것이다. 상기 DNA에서 아데닌 잔기를 상기 생산 숙주 박테리아에서 아세트아미도아데닌으로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 파지 Mu 및 Mu-유사 프로파지 서열로부터의 mom 유전자를 포함하고 (헤모필루스 인플루엔제 Rd (FluMu), 네이세리아 메닌기티디스 타입 A 균주 Z2491 (Pnme1) 및 에이취. 인플루엔제 바이오타입 에깁티우스 ATCC 11116; (Drozdz et al. Nucleic Acids Res. 40(5):2119-30 (2012) 참조), 이는 아데닌 잔기를 N(6)-메틸아데닌으로 전환하여, 아데닌-민감성 제한 효소를 보호한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 저해인자 및 다른 DNA 변형 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 상기 표적 숙주 박테리아의 R-M 시스템으로부터 전달된 DNA를 보호하는데 사용하기 위해 상기 파지 게놈으로 직접 도입될 수 있다.
박테리오파지 입자로 박테리아를 감염시키는 방법이 잘 알려져 있고, 예를 들면 상기 박테리아 숙주 세포를 상기 박테리오파지 입자와 특정 조건하에 인큐베이트하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 박테리아 숙주 세포에서 복제 후에, UV 노출, 기아, 온도 변경, 또는 용균성 전사 인자의 발현 유도를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아닌 다른 확립된 방법을 통해 용균 주기가 유발되어서 상기 박테리오파지 DNA 또는 상기 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 수득할 수 있다.
본 발명은 또한 박테리오파지 및 파지미드를 통해 이종 DNA를 도입시키는 효율을 증가시키기 위한 본 발명의 박테리오파지 입자의 사용을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 그러므로, 일부 구현예에서, 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산이 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA로 도입될 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA로 도입시키는 방법이 당분야에 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산이 박테리오파지 DNA로, 예를 들면 동종 재조합을 통해 도입될 수 있고, 상기 박테리오파지 DNA가 숙주 박테리아 (예컨대, 생산 숙주 박테리아)에 있거나, 또는 표준 클로닝 기술을 통해 파지미드 DNA로 도입된다.
일부 구현예에서, 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산은 리포터 (reporter) 유전자 (예컨대 gfp, lacZ), 항생제 저항성 마커 (예컨대 cat, bla), 대사 경로에서 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예컨대 카로테노이드 생합성), 유전자 조절인자 (예컨대 dCas9, tetR), 및/또는 임의의 내인성 유전자의 부가의 카피 (예컨대 과발현을 위해)일 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 관심있는 이종 핵산을 표적 숙주 박테리아로 박테리오파지를 통해 도입시키는 효율을 증가시키는 방법을 제공하고, 생산 숙주 박테리아의 감염 전에 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산을 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA로 도입시키는 단계로서, 상기 생산 숙주 박테리아가 내인성 R-M 시스템의 적어도 하나의 효소를 파괴 및/또는 적어도 하나의 이종 메틸트란스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 변형시켜서, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 메틸화하고, (상기 변경된 메틸화 활성이 없는 생산 숙주 박테리아에서 생산되는 박테리오파지 또는 파지미드 DNA와 비교하여) 변형된 메틸화 패턴을 갖는 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 생산하는 것인 단계; 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산을 포함하는 상기 재조합 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 생산하는 단계; 및 표적 숙주 박테리아를 상기 박테리오파지 입자로 감염시키는 단계로서, 상기 표적 숙주 박테리아는 상기 생산 숙주 박테리아의 메틸화 패턴과 실질적으로 유사한 메틸화 패턴 (또는 R-M 시스템(들))을 가져서, 대조군 생산 숙주 박테리아에서 성장된 박테리오파지를 사용하여 관심있는 상기 이종 핵산을 도입하는 것과 비교하여 관심있는 상기 이종 핵산을 상기 표적 숙주 박테리아로 도입시키는 효율을 증가시키는 단계 (상기 대조군 생산 숙주 박테리아는 상기 표적 숙주 박테리아의 메틸화 활성과 실질적으로 유사하게 변경된 그 메틸화 활성을 갖지 않음)를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 생산 숙주 박테리아가 상기 박테리오파지에 의한 감염 후에 그 R-M 시스템을 변경하도록 (예컨대, 내인성 R-M 시스템의 적어도 하나의 효소를 파괴 및/또는 적어도 하나의 이종 메틸트란스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록) 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 관심있는 이종 핵산을 표적 숙주 박테리아로 박테리오파지를 통해 도입시키는 효율을 증가시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은: 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산을 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자로 생산 숙주 박테리아를 감염시키는 단계로서, 상기 생산 숙주 박테리아는 내인성 R-M 시스템의 적어도 하나의 효소의 파괴 및/또는 적어도 하나의 이종 메틸트란스퍼라제의 발현을 통해 메틸화 활성을 변경시켜서, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 메틸화시키는 것인 단계; 변형된 메틸화 패턴을 가지며 및 상기 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산을 포함/코딩하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 생산하는 단계; 및 표적 숙주 박테리아를 상기 박테리오파지 입자로 감염시키는 단계로서, 상기 표적 숙주 박테리아는 상기 생산 숙주 박테리아의 메틸화 패턴과 실질적으로 유사한 메틸화 패턴 (또는 R-M 시스템(들))을 가지고 있어서, 대조군 생산 숙주 박테리아에서 성장된 박테리오파지를 사용하여 관심있는 상기 이종 핵산을 도입하는 것과 비교하여 관심있는 상기 이종 핵산을 상기 표적 숙주 박테리아로 도입시키는 효율을 증가시키는 단계 (상기 대조군 생산 숙주 박테리아는 본 명세서에 개시된 바와 같이 상기 표적 숙주 박테리아의 메틸화 활성과 실질적으로 유사하게 변경된 그 메틸화 활성을 갖지 않음)를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 생산 숙주 박테리아가 박테리오파지에 의한 감염 후에 그 R-M 시스템을 변경하도록 (예컨대, 내인성 R-M 시스템의 적어도 하나의 효소를 파괴 및/또는 적어도 하나의 이종 메틸트란스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록) 변형될 수 있다.
본 발명은 또한 CRISPR-Cas 시스템을 표적으로 하는 게놈의 전달을 위해 본 발명의 박테리오파지 입자의 사용을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 조작된 (engineered) CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 잠재성 박테리오파지를 사용하여 박테리아를 선별적 사멸시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
그러므로, 일부 구현예에서, 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA가 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산으로 형질전환될 수 있고, 상기 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산은 CRISPR 어레이를 포함한다. 부가의 구현예에서, 상기 CRISPR 어레이는 타입 II CRISPR 어레이 또는 타입 I CRISPR 어레이일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 타입 II CRISPR 어레이가 박테리오파지 DNA로 도입되지만 파지미드 DNA로 도입되지 않았다. 일부 구현예에서, 상기 타입 I CRISPR 어레이가 박테리오파지 DNA로 도입되지만, 파지미드 DNA로 도입되지 않았다. 그러므로, 일부 구현예에서, 본 발명은 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공하고, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA는 CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 CRISPR 어레이는 반복-스페이서-반복 서열 또는 적어도 둘 이상의 반복-스페이서 서열을 포함하고, 상기 적어도 둘 이상의 반복-스페이서 서열은 적어도 제1 반복-스페이서 서열 및 최종 반복-스페이서 서열을 포함하고, 상기 제1 반복-스페이서 서열의 스페이서의 3' 말단이 다음 반복-스페이서 서열의 반복의 5' 말단에 연결되고, 상기 최종 반복-스페이서 서열이 상기 3' 말단에서 반복에 연결된다.
일부 구현예에서, 상기 CRISPR 어레이가 타입 II CRISPR 어레이인 경우, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA가 또한 (a) tracr 핵산 및 Cas9를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 형질전환될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 박테리오파지 DNA가 재조합 타입 II CRISPR-Cas 시스템 (예컨대, CRISPR 어레이, tracr 핵산 및 Cas9 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)을 포함하도록 조작될 수 있다. 다른 구현예에서, 파지미드 DNA가 재조합 타입 II CRISPR-Cas 시스템을 포함하도록 조작될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공하고, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA는 하기를 포함하는 재조합 타입 II CRISPR-Cas 시스템을 포함하고: (a) Cas9 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (b) CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 c) tracr 핵산, 선택적으로 CRISPR 어레이를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 tracr 핵산이 서로 융합된다 (단일 가이드 핵산,(sgRNA, sgDNA)을 형성함). 일부 구현예에서, 본 발명은 타입 II CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리오파지 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공한다. 부가의 구현예에서, 본 발명은 타입 II CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 단일 가이드 핵산 (융합된 CRISPR 어레이 및 tracr 핵산)을 포함하는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공한다.
일부 구현예에서, 타입 II CRISPR-Cas 시스템 또는 그 구성요소가 상기 CRISPR 어레이를 포함하는 박테리오파지 또는 다른 것으로부터 동일하거나 또는 상이한 박테리오파지로 도입될 수 있다. 그러므로, 예를 들면, 재조합 파지가 표적 박테리아로 도입될 수 있고, 상기 재조합 파지는 그 DNA에 어레이 만을 포함한다. 상기 경우에, 상기 표적 박테리아는 도입되는 CRISPR 어레이와 양립가능한 타입 II CRISPR-Cas 시스템을 포함할 수 있거나, 또는 타입 II CRISPR-Cas 시스템 또는 그 구성요소가 하나 이상의 부가의 재조합 박테리오파지에 도입될 수 있다. 따라서, 박테리오파지가 타입 II CRISPR 어레이; 단일 가이드; Cas9; tracr; 타입 II CRISPR 어레이 및 Cas9; 타입 II CRISPR 어레이 및 tracr; 타입 II CRISPR 어레이, Cas9 및 tracr; 타입 II CRISPR 어레이 및 단일 가이드; 등만을 포함 및 도입하도록 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 CRISPR 어레이가 타입 I CRISPR 어레이인 경우, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA가 또한 Cas3 폴리펩티드, 또는 Cas3' 및 Cas3" 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 타입 I Cascade 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 형질전환될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 박테리오파지 DNA가 타입 I CRISPR-Cas 시스템 (예컨대, CRISPR 어레이, 및 타입 I 폴리펩티드 (예컨대, Cas3 폴리펩티드, 또는 Cas3' 및 Cas3" 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 타입 I Cascade 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드)을 포함하도록 조작될 수 있다. 다른 구현예에서, 파지미드 DNA가 타입 I CRISPR-Cas 시스템을 포함하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공하고, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA는 (a) CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 하나 이상의 타입 I CRISPR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 타입 I CRISPR-Cas 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 타입 I CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리오파지 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공한다. 부가의 구현예에서, 본 발명은 타입 I CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공한다.
일부 구현예에서, 타입 I CRISPR-Cas 시스템 또는 그 구성요소가 상기 CRISPR 어레이를 포함하는 박테리오파지 또는 다른 것으로부터 동일하거나 또는 다른 박테리오파지에 도입될 수 있다. 그러므로, 예를 들면, 재조합 파지가 표적 박테리아로 도입될 수 있고, 상기 재조합 파지는 그 DNA에 CRISPR 어레이만을 포함한다. 상기 경우에, 상기 표적 박테리아는 도입되는 상기 CRISPR 어레이와 양립가능한 타입 I CRISPR-Cas 시스템을 포함할 수 있거나 또는 타입 I CRISPR-Cas 시스템 또는 그 구성요소가 하나 이상의 부가의 재조합 박테리오파지에 도입될 수 있다. 따라서, 박테리오파지가 타입 I CRISPR 어레이; Cas3; 하나 이상의 Cascade 폴리뉴클레오티드; CRISPR 어레이 및 Cas3, CRISPR 어레이 및 하나 이상의 Cascade 폴리펩티드; Cas3 및 하나 이상의 Cascade 폴리펩티드; CRISPR 어레이, Cas3, 및 하나 이상의 Cascade 폴리펩티드; 등 만을 포함 및 도입하도록 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 타입 II CRISPR-Cas 시스템 또는 재조합 타입 I CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 상기 박테리오파지 DNA 및 상기 파지미드 DNA가, 변형되지 않은 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA와 비교하여, 본 명세서에 개시된 바와 같이 변형된 DNA 메틸화 패턴을 포함하도록 변형될 수 있고, 선택적으로 상기 변형된 DNA 메틸화 패턴은 표적 숙주 박테리아의 제한-변형 시스템(들)과 실질적으로 유사한 변형된 DNA 메틸화 패턴을 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 유도한다. 그러므로, 일부 구현예에서, 상기 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산이, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 메틸화 활성을 변형시킨 생산 숙주 박테리아로 감염시키기 전에 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA로 도입될 수 있다. 이러한 방식으로, 관심있는 핵산으로 형질전환된 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA가 상기 숙주 박테리아 메틸화 기전에 의해 메틸화되고, 상기 생산 숙주 박테리아에서 복제된다. 상기 숙주 세포의 재패키징 및 용균은 그 후 상기 생산 숙주 박테리아에 존재하는 것에 해당하는 메틸화 패턴을 갖는 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산을 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 생산한다. 상기 생산 숙주 박테리아에 의해 생산된 박테리오파지 입자가 그 후 표적 숙주 박테리아를 감염시키기 위해 사용되어, 관심있는 핵산을 상기 표적 숙주 박테리아로 도입시킬 수 있다. 통상적으로, 상기 표적 숙주 박테리아가 생산 숙주 박테리아의 제한-변형 시스템(들) (R-M 시스템)과 실질적으로 유사한 DNA 메틸화 패턴을 갖는 것에 기반하여 선택된다. 대안으로서, 상기 생산 숙주 박테리아의 메틸화 활성이 표적 숙주 박테리아의 R-M 시스템과 실질적으로 유사하게 변형되어, 표적 숙주 박테리아의 R-M 시스템(들)과 실질적으로 유사한 메틸화 패턴을 갖는 박테리오파지 DNA 및/또는 파지미드 DNA를 생산하는데 사용될 수 있는 생산 숙주 박테리아를 제공한다. 그러므로, 일부 구현예에서, 상기 생산 숙주 박테리아의 DNA 메틸화 활성이 본 명세서에 개시된 바와 같이 박테리오파지 입자로 감염시키기 전에 변경되어서, 대조군 생산 숙주 박테리아에서 성장한 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA와 비교하여 변경된 메틸화 패턴을 갖는 형질전환된 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 생산한다 (예컨대, 상기 대조군 생산 숙주 박테리아는 본 명세서에 개시된 바와 같이 그 변경된 메틸화 활성을 갖지 않음). 일부 구현예에서, 상기 형질전환된 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA의 변경된 메틸화 패턴은 표적 숙주 박테리아의 메틸화 활성 (상기 R-M 시스템)에 해당할 수 있어서, 상기 표적 숙주 박테리아의 메틸화 패턴에 일치하지 않는 메틸화 패턴을 갖는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA와 비교하여 상기 표적 숙주 박테리아로 상기 형질전환된 DNA의 전달을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 생산 숙주 박테리아는 본래 표적 박테리아의 메틸화 패턴과 실질적으로 유사한 메틸화 패턴을 포함할 수 있다. 그러므로, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA가 상기 생산 숙주 박테리아에서 생산될 때, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA는 상기 생산 숙주 박테리아 뿐만 아니라 상기표적 숙주 박테리아의 메틸화 패턴을 가져서, 상기 표적 숙주 박테리아의 메틸화 패턴과 실질적으로 동일하지 않은 메틸화 패턴을 가진 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA와 비교하여 상기 형질전환된 DNA의 상기 표적 숙주 박테리아로의 전달을 증가시킨다.
메틸화 패턴이 박테리아 뿐만 아니라 메틸화된 특정 서열 (예컨대 GmATC)에 존재하는 메틸화 형태 (예컨대 m4C)에 의해 결정된다. 그러므로, 메틸화 패턴들 사이의 유사성의 수준 (천연 또는 변형의 결과인지)은 표적 부위가 적합한 메틸화 타입을 갖는 빈도를 의미한다. 그러므로, 실질적으로 유사한 메틸화 패턴은 본 명세서에 개시된 바와 같이 적합한 메틸화 타입을 갖는 표적 부위들 사이에 적어도 약 20% 이상의 유사성 (예컨대, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 그 이상, 또는 그 중 임의의 범위 또는 값)을 갖는 것을 의미한다. 그러므로, 일부 구현예에서, 메틸화 패턴은, 숙주와 표적 박테리아 사이에, 약 20% 내지 99% 이상 유사, 약 30% 내지 99% 이상 유사, 약 40% 내지 99% 이상 유사, 약 50% 내지 99% 이상 유사, 약 60% 내지 99% 이상 유사, 약 70% 내지 99% 이상 유사, 약 80% 내지 99% 이상 유사, 약 85% 내지 99% 이상 유사, 약 90% 내지 99% 이상 유사, 또는 약 95% 내지 99% 이상 유사할 수 있다. 표적 숙주 박테리아와 상기 도입된 DNA (변형되어진 박테리오파지 DNA)의 메틸화 패턴들 사이의 실질적인 유사성은 상기 도입된 DNA가 상기 표적 숙주 박테리아와 실질적으로 유사한 메틸화 패턴을 공유하지 않는 도입된 DNA의 것보다 덜 분해되는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 숙주 박테리아와 표적 박테리아의 메틸화 패턴이 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공하고, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA는 표적 숙주 박테리아의 R-M 시스템(들)과 실질적으로 유사한 변형된 DNA 메틸화 패턴 및 상기 박테리오파지 DNA (게놈)로 통합되는 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산을 포함한다. 그러므로, 예를 들면, 변형된 메틸화 패턴 (즉 표적 숙주 박테리아의 R-M 시스템(들)과 실질적으로 유사함)을 갖는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA는 (1) CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 (2) 타입 II CRISPR-Cas 시스템으로서, (a) Cas9 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (b) CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및/또는 c) tracr 핵산을 포함하는 타입 II CRISPR-Cas 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 어레이를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 및 상기 tracr 핵산 (c)은 서로 융합될 수 있다. 부가의 구현예에서, 변형된 메틸화 패턴 (즉 표적 숙주 박테리아의 R-M 시스템(들)과 실질적으로 유사함)을 갖는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA는 (1) CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 (2) 재조합 타입 I CRISPR-Cas 시스템으로서, (a) CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및/또는 (b) 하나 이상의 타입 I CRISPR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 타입 I CRISPR-Cas 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 관심있는 적어도 하나의 이종 핵산이 통합의 불필요한 부위 또는 통합의 보충 부위에서 상기 박테리오파지 DNA (예컨대, 게놈)로 통합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "불필요한 부위 (dispensable site)"는 상기 박테리오파지 게놈의 유지, 파지 입자의 생산, 및 패키지된 DNA의 전달에 필요하지 않은 박테리아파지 DNA 또는 게놈에서 부위를 의미한다. 그러므로, 이러한 기능을 수행하는데 필요로 하지 않는 박테리오파지 게놈에서 임의의 부위가 관심있는 핵산을 박테리오파지 게놈으로의 통합을 위한 "랜딩 (landing)" 부위로 사용될 수 있다. 박테리오파지 게놈에서 일부 예시되는 불필요한 부위는 (a) 파지-코딩된 제한-변형 시스템 (예컨대, P1 파지에서 res/mod), (b) 중복감염을 차단하는 유전자 (예컨대, simABC), (c) 제한-변형 시스템의 저해인자 (예컨대, P1 파지에서 darA), (d) 삽입 서열 요소 (예컨대, P1 파지에서 IS1), (e) 중독 시스템 (예컨대, P1 파지에서 phd/doc) 또는 (f) 그 임의의 조합을 포함할 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 "보충 부위 (complemented site)" 또는 "보충가능한 부위 (complementable site)"는 상기 박테리오파지 게놈의 유지, 파지 입자의 생산 및 패키지된 DNA의 전달에 필요하지만, 그러나 이는 관심있는 핵산의 통합 (통합의 보충 부위)에 의해 파괴되는 핵산을 코딩하는 보충하는 폴리뉴클레오티드에 의해 보충될 수 있는 박테리오파지 DNA 또는 게놈에서 필수적인 부위를 의미한다. 상기 보충하는 폴리뉴클레오티드가 상기 생산 숙주 박테리아의 게놈으로 통합될 수 있거나 또는 이는 상기 생산 숙주 박테리아에서 플라스미드에 포함될 수 있다. 따라서, 상기 관심있는 핵산이 박테리오파지 DNA의 보충 부위로 통합될 때, 상기 숙주 박테리아는 플라스미드 상에 또는 그 게놈에 상기 박테리오파지에서 보충 부위에 대해 보체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예시되는 보충 부위는 (a) 용균 주기의 활성인자 (예컨대, P1 파지에서 coi), (b) 용균성 유전자 (예컨대, P1 파지에서 kilA), (c) tRNA (예컨대, P1 파지에서 tRNA1,2), (d) 입자 구성요소 (예컨대, P1 파지에서 cixL, cixR 테일 파이버 (tail fiber) 유전자), 또는 (e) 그 임의의 조합을 포함할 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.
그러므로, 일부 구현예에서, 재조합 타입 I CRISPR-Cas 시스템, 재조합 타입 II CRISPR-Cas 시스템, CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (타입 I 또는 타입 II) 및/또는 tracr 핵산, 하나 이상의 타입 I CRISPR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 Cas9 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 박테리오파지 DNA에서 불필요한 부위로 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 타입 I CRISPR-Cas 시스템, 재조합 타입 II CRISPR-Cas 시스템, CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (타입 I 또는 타입 I) 및/또는 tracr 핵산, 하나 이상의 타입 I CRISPR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 Cas9 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 박테리오파지 DNA에서 보충 부위로 통합될 수 있고, 상기 박테리오파지에 대한 숙주 박테리아는 플라스미드 상에 또는 그 게놈에 상기 박테리오파지에서 보충 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 상기 CRISPR 폴리뉴클레오티드가 통합되는 상기 파지 게놈에서 상기 부위를 보충하는 유전자)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, "타입 I 폴리펩티드"는 Cas3 폴리펩티드, Cas3' 폴리펩티드, Cas3" 폴리펩티드 및 항바이러스 방어 ("Cascade") 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 타입 I 클러스터된 주기적 간격의 짧은 회문구조의 반복 (CRISPR)-관련된 복합체를 지칭한다. 그러므로, 용어 "타입 I 폴리펩티드"는 타입 I-A CRISPR-Cas 시스템, 타입 I-B CRISPR-Cas 시스템, 타입 I-C CRISPR-Cas 시스템, 타입 I-D CRISPR-Cas 시스템, 타입 I-E CRISPR-Cas 시스템, 및/또는 타입 I-F CRISPR-Cas 시스템을 구성하는 폴리펩티드를 지칭한다. 각 타입-I CRISPR-Cas 시스템은 적어도 하나의 Cas3 폴리펩티드를 포함한다. Cas3 폴리펩티드는 일반적으로 헬리카제 (helicase) 도메인 및 HD 도메인을 포함한다. 그러나, 일부 타입 I CRISPR-Cas 시스템에서, 상기 헬리카제 및 HD 도메인이 개별의 폴리펩티드인, Cas3' 및 Cas3"에서 발견된다. 구체적으로, Cas3'은 상기 헬리카제 도메인을 코딩하고, 반면에 Cas3"은 상기 HD 도메인을 코딩한다. 결과적으로, 상기 두 도메인들은 Cas3 기능을 필요로 하기 때문에, 타입 I 서브타입들은 Cas3 (I-C, I-D, I-E, I-F) 또는 Cas3' 및 Cas3" (I-A, I-B)을 코딩한다.
본 명세서에서 사용되는, "타입 I Cascade 폴리펩티드"는 프리-crRNAs의 프로세싱에 관여하고, 후속하여 타입 I CRISPR-Cas 시스템에서 상기 표적 DNA에 결합하는 폴리펩티드의 복합체를 지칭한다. 상기 폴리펩티드는 타입 I 서브타입들 I-A, I-B, I-C, I-D, I-E 및 I-F의 Cascade 폴리펩티드들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 타입 I-A 폴리펩티드들의 비-제한되는 예는 Cas7 (Csa2), Cas8a1 (Csx13), Cas8a2 (Csx9), Cas5, Csa5, Cas6a, Cas3' 및/또는 Cas3"을 포함한다. 타입 I-B 폴리펩티드들의 비-제한되는 예는 Cas6b, Cas8b (Csh1), Cas7 (Csh2) 및/또는 Cas5를 포함한다. 타입-IC 폴리펩티드들의 비-제한되는 예는 Cas5d, Cas8c (Csd1), 및/또는 Cas7 (Csd2)을 포함한다. 타입-ID 폴리펩티드들의 비-제한되는 예는 Cas10d (Csc3), Csc2, Csc1, 및/또는 Cas6d를 포함한다. 타입 I-E 폴리펩티드들의 비-제한되는 예는 Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cas7 (CasC), Cas5 (CasD) 및/또는 Cas6e (CasE)를 포함한다. 타입 I-F 폴리펩티드들의 비-제한되는 예는 Cys1, Cys2, Cas7 (Cys3) 및/또는 Cas6f (Csy4)를 포함한다. 그러므로, 본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명에서 유용한 타입-I Cascade 폴리펩티드는 CRISPR 어레이를 처리하여, 처리된 RNA를 생산하고, 이후 상기 처리된 RNA에서 스페이서에 상보적인 DNA에 상기 복합체를 결합시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 획득 (acquisition)에 관여하는 타입 I Cascade 폴리펩티드가 본 발명의 핵산 분자 (예컨대, Cas1, Cas2, Cas4)에 포함되지 않는다. 당분야에 알려져 있는 타입 I CRISPR-Cas 시스템으로부터의 Cascade 폴리펩티드의 임의의 이러한 서브세트 또는 이후에 발견된 것이 본 발명의 핵산 구조물에 포함될 수 있다. 이러한 폴리펩티드가 예를 들면 BLAST 조사 (searching)를 통해 확인될 수 있다.
그러므로, 일부 구현예에서, 박테리오파지 입자는 타입 I CRISPR 어레이 및/또는 (i) Cas7 (Csa2) 폴리펩티드, Cas8a1 (Csx13) 폴리펩티드 또는 Cas8a2 (Csx9) 폴리펩티드, Cas5 폴리펩티드, Csa5 폴리펩티드, Cas6a 폴리펩티드, Cas3' 폴리펩티드, 및 Cas3" 폴리펩티드 (타입 I-A); (ii) Cas6b 폴리펩티드, Cas8b (Csh1) 폴리펩티드, Cas7 (Csh2) 폴리펩티드, Cas5 폴리펩티드, Cas3' 폴리펩티드, 및 Cas3" 폴리펩티드 (타입 I-B); (iii) Cas5d 폴리펩티드, Cas8c (Csd1) 폴리펩티드, Cas7 (Csd2) 폴리펩티드, 및 Cas3 폴리펩티드 (타입 I-C); (iv) Cas10d (Csc3) 폴리펩티드, Csc2 폴리펩티드, Csc1 폴리펩티드, 및 Cas6d 폴리펩티드, 및 Cas3 폴리펩티드 (타입 I-D); (v) Cse1 (CasA) 폴리펩티드, Cse2 (CasB) 폴리펩티드, Cas7 (CasC) 폴리펩티드, Cas5 (CasD) 폴리펩티드, Cas6e (CasE) 폴리펩티드, 및 Cas3 폴리펩티드 (타입 I-E); 또는 (iv) Cys1 폴리펩티드, Cys2 폴리펩티드, Cas7 (Cys3) 폴리펩티드, Cas6f 폴리펩티드 및/또는 Cas3 폴리펩티드 (타입 I-F)를 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함할 수 있다. 대표적인 구현예에서, 박테리오파지 입자는 타입 I CRISPR 어레이 및 하나 이상의 타입 I-E Cascade 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 (즉, Cse1 (CasA) 폴리펩티드, Cse2 (CasB) 폴리펩티드, Cas7 (CasC) 폴리펩티드, Cas5 (CasD) 폴리펩티드, Cas6e (CasE) 폴리펩티드, Cas3 폴리펩티드)를 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함할 수 있다.
"Cas9 뉴클레아제"는 상기 CRISPR-Cas 타입 II 시스템에서 이중가닥 DNA 절단을 촉매화하는 엔도뉴클레아제의 큰 그룹을 지칭한다. 상기 폴리펩티드가 당 분야에 잘 알려져 있고, 그 구조 (서열)의 많은 것이 특성화되었다 (예컨대, WO2013/176772; WO/2013/188638 참조). 상기 이중가닥 DNA의 절단을 촉매화하는 도메인은 RuvC 도메인 및 HNH 도메인이다. 상기 RuvC 도메인은 (-) 가닥을 니킹하는 (nicking) 것을 담당하고, 상기 HNH 도메인은 (+) 가닥을 니킹하는 것을 담당한다 (예컨대, Gasiunas et al. PNAS 109(36):E2579-E2586 (September 4, 2012) 참조).
일부 구현예에서, CRISPR 어레이, tracr 핵산, Cas9 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Cas3 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Cas3' 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Cas3" 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 하나 이상의 타입 I CRISPR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 타입 I CRISPR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함할 때, 상기 적어도 2개의 폴리뉴클레오티드가 단일 프로모터 또는 개별의 프로모터들에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 어레이 및 tracr 핵산이 단일 프로모터 또는 다른 프로모터들에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 CRISPR 어레이 및 상기 tracr 핵산이 서로 융합될 때, 상기 융합된 상기 CRISPR 어레이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 tracr 핵산이 단일 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 타입 I CRISPR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 적어도 두 개가 융합되어 단일 폴리뉴클레오티드를 형성하고, 이는 프로모터에 선택적으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 타입 1 Cascade 폴리펩티드가, 프로모터에 선택적으로 작동가능하게 연결된, 단일 오페론 (operon)에 포함될 수 있다. 부가의 구현예에서, Cas3 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Cas3' 폴리펩티드 및/또는 Cas3" 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 타입 I Cascade 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 융합될 수 있고, 상기 융합된 폴리뉴클레오티드들이 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 이는 발현 시에 융합된 폴리펩티드를 생산한다. 대표적인 구현예에서, Cas3 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 Cse1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 융합될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법들 중 어느 것에 의해 생산된 박테리오파지 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 박테리오파지 입자는 박테리오파지 DNA를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 박테리오파지 입자는 파지미드 DNA를 포함한다. 부가의 구현예에서, 상기 박테리오파지 입자는 파지미드 DNA를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명은 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자를 제공하고, 이는 표적 숙주 박테리아의 제한-변형 시스템(들)과 실질적으로 유사한 변형된 DNA 메틸화 패턴을 포함한다.
CRISPR-Cas 시스템의 적어도 CRISPR 어레이를 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하도록 조작된 본 발명의 박테리오파지 입자를 사용하여 박테리아 (즉, 표적 박테리아)를 선별적으로 사멸시키는 방법이 또한 본 명세서에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 박테리오파지 DNA 및/또는 파지미드 DNA는 CRISPR 어레이만을 포함할 때, 상기 표적 박테리아 숙주는 활성 CRISPR-Cas 시스템 (예컨대, 적어도 tracr 핵산 및 Cas9 폴리펩티드 (타입 II CRISPR-Cas 시스템), 또는 적어도 Cas3 폴리펩티드, Cas3' 폴리펩티드 및/또는 Cas3" 폴리펩티드 및 상기 Cascade 폴리펩티드들의 적어도 서브세트 (타입 I CRISPR-Cas 시스템))을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 박테리오파지 입자의 박테리오파지 DNA 및/또는 파지미드 DNA는 CRISPR 어레이, tracr 핵산 및/또는 Cas9 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 CRISPR 어레이, 적어도 적어도 Cas3 폴리펩티드, Cas3' 폴리펩티드 및/또는 Cas3" 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 Cascade 폴리펩티드들의 적어도 서브세트를 코딩하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리아를 선별적으로 사멸시키는데 사용되는 상기 박테리오파지 DNA 또는 상기 파지미드 DNA는 본 명세서에 개시된 바와 같이 천연 또는 변형된 표적 박테리아의 메틸화 패턴과 실질적으로 유사한 메틸화 패턴을 포함한다.
따라서, 본 발명은 적어도 하나의 표적 박테리아 종 또는 균주를 선별적으로 사멸시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은: CRISPR 어레이를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드 또는 CRISPR 어레이를 포함하는 재조합 CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하는 본 발명의 박테리오파지 입자와 상기 적어도 하나의 표적 박테리아 종 또는 균주를 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 CRISPR 어레이는 상기 적어도 하나의 표적 박테리아 종 또는 균주에서 표적 DNA에 대해 실질적인 상보성 (예컨대, 적어도 약 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 상보성, 또는 그 중 임의의 범위 또는 값)을 갖는 적어도 하나의 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA는 상기 적어도 하나의 표적 박테리아 종 또는 균주에서 표적 DNA에 대해 100% 상보성을 갖는 적어도 하나의 스페이서를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 박테리오파지 입자는 타입 I CRISPR 어레이 또는 타입 II CRISPR 어레이 만을 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하고, 상기 표적 박테리아 숙주는 활성인 내인성 CRISPR-Cas 타입 I 또는 타입 II 시스템을 갖는 임의의 박테리아 종 또는 균주일 수 있다. 활성인 CRISPR-Cas 타입 I 또는 타입 II 시스템을 갖는 예시되는 박테리아 종 또는 균주는 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) (타입 II-A), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) (타입 I, III), 노비시다 메닌기티디스 (Novicida meningitidis) (타입 II-C), 슈도모나스 에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) (타입 I-F), 스타필로코쿠스 아우레우스 (타입 II-A), 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (타입 II-A), 펙토박테리움 아트로셉티쿰 (Pectobacterium atrosepticum) (타입 I-F), 및/또는 스트렙토코쿠스 서모필루스 (타입 II-A)를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 박테리오파지 입자는 재조합 타입 I CRISPR-Cas 시스템 또는 재조합 타입 II CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 박테리오파지 DNA 또는 파지미드 DNA를 포함하고, 상기 숙주 박테리아는 내인성 CRISPR-Cas 타입 I 또는 타입 II 시스템을 가질 수 있거나 또는 갖지 않을 수 있으므로, 상기 숙주 박테리아는 상기 표적 DNA를 포함하는 임의의 박테리아 숙주일 수 있다.
예시되는 구현예에서, 상기 표적 DNA는 표적 균주, 종 또는 속에 독특할 수 있고; 상이한 균주들, 종들 또는 속들 사이에서 공유될 수 있고; 대부분의 박테리아에 존재할 수 있고; 및/또는 항생제 저항성 유전자, 독성 유전자, 및/또는 병원성 유전자 섬 (pathogenicity island) 내에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 박테리오파지 입자가 상기 표적 박테리아 종 또는 균주보다 다른 박테리아 종 또는 균주에서 생산 또는 발생될 수 있다.
일부 구현예에서, 박테리아가 인간, 동물, 식물 및 농업, 의료 및/또는 산업 환경 (예컨대, 발효)에서 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리오파지 입자가 박테리아 균주를 완전히 제거하거나 또는 그 존재를 적정하는 방법에 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 서술될 것이다. 이들 실시예는 청구의 범위를 본 발명에 한정하려는 것이 아니라, 오히려 특정 구현예를 예시하도록 의도된 것이다. 당업자에 의해 발생되는 예시된 방법의 임의의 변형은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1. 숙주 박테리아의 메틸화 활성 및 파지 DNA의 메틸화 패턴의 변형
숙주 생산 균주인, 가령 에스케리치아 콜리 MG1655 또는 바실루스 서브틸리스 168의 메틸화 패턴이 그 내인성 제한-변형 시스템을 제거하고, 이종의 메틸트란스퍼라제 유전자를 도입시킴으로써 변경된다. 상기 제한-변형 유전자가 당분야에 알려져 있는 수단, 가령 온라인 REBASE 데이터베이스 (Roberts et al. Nucleic Acids Res 43:D298-D299. http://dx.doi.org/10.1093/nar/gku1046)를 통해 확인된다. 상기 제한-변형 시스템이 당분야에 알려져 있는 표준 리콤비니어링 (recombineering)전략을 사용하여 결실될 수 있다. 일단 결실되면, 외래 메틸트란스퍼라제 유전자가 복제 플라스미드로 삽입되거나 또는 구성성 또는 유도성 프로모터의 조절하에 숙주 게놈으로 리콤비니어링된다. 상기 유전자가 천연 서열 또는 생산 숙주에 대해 코돈-최적화된 서열을 사용하여 표적 균주로부터 직접 수득된다. 대안으로서, 이종 메틸트란스퍼라제 유전자가 표적 균주와 유사한 메틸화 패턴을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 개별의 메틸트란스퍼라제에 의해 부여된 메틸화 패턴이 그 후 확립된 DNA 시퀀싱 기술, 가령 PacBio SMRT 시퀀싱 (O'Loughlin et al. PLoS One. 2015:e0118533.)을 사용하여 평가된다. 일단 생산되면, 상기 생산 균주가 상기 표적 균주로 DNA 전달을 위해 박테리오파지 입자를 생산하는데 사용된다.
M13 파지 및 P1 파지가 파지미드 (M13) 및 파지 게놈 (P1)의 전달에 있어서 메틸화의 영향을 입증하는데 사용된다. 상기 M13 파지는 파지 디스플레이에 있어서 그 광범위한 용도에 기반한 확립된 파지미드 시스템을 갖는다 (Pande et al. Biotechnol. Adv. 28, 849-858 (2010)). 상기 시스템은 플라스미드 컨테이너 f1 기원을 효율적으로 패키지하는데 헬퍼 플라스미드를 사용하는데 기반한다. 상기 세포가 그 후 파지 입자를 구성적으로 생산하고, 이를 수집하여, 표적 균주로 투여할 수 있다. 상기 입자는 F1 섬모 (pilus)를 인식하고, 이는 상기 F 플라스미드를 운반하기 위한 균주를 필요로 한다. 상기 P1 파지는 M13보다 훨씬 더 복잡한 잘-특징화된 파지이다 (Lobocka et al. J. Bacteriol. 186, 7032-7068 (2004)). 상기 P1 파지의 용균 주기를 유도하기 위해서, 본 발명자들은 개별의 플라스미드로부터 coi 유전자를 발현시켰다.
M13 파지미드에 대한 개선된 전달을 입증함: R-M 시스템의 전체 (MG1655), 일부 (TOP10), 또는 부재 (MG1655 Δdam Δdcm ΔhsdRMS)를 갖는 이. 콜리에서 생산된 M13 파지의 역가가 테스트되었다. 상기 파지가 MG1655 Δdam Δdcm ΔhsdRMS에서 테스트되어서, 역가에서의 가능한 변동성을 평가하고, 그 후 MG1655에서 테스트되어서, DNA 메틸화의 영향을 평가하였다. 상기 파지미드에서 항생제 저항성 마커는 항생제 저항성 콜로니의 수에 기반하여 전달의 판독 (readout)으로서 제공된다. 전달 효율은 MG1655 Δdam Δdcm ΔhsdRMS로 유사하게 가지만, MG1655로 갈 때 MG1655의 경우 크게 높아질 것으로 기대된다.
M13 파지미드의 장출혈성 이. 콜리로의 전달: M13 파지미드가 EHEC (enterohaemorrhagic E. coli)의 균주로 전달된다. EHEC는 MG1655보다 더 많은 R-M 시스템을 포함하고, M13 파지미드의 감소된 흡수율을 보여주었다. EHEC로부터의 타입 II 메틸트란스퍼라제가 MG1655 Δdam Δdcm ΔhsdRMS 균주에서 발현되었고, 파지미드를 포함하는 M13 입자가 생산되었다. 상기 입자가 그 후 MG1655 Δdam Δdcm ΔhsdRMS 및 F 플라스미드를 갖는 (harboring) EHEC 균주로 투여되었고, 항생제 저항성이 있는 콜로니의 수가 계수되었다. 도입된 메틸트란스퍼라제는 MG1655 Δdam Δdcm ΔhsdRMS 콜로니의 수에 영향을 주지 않을 것으로 기대되지만 (유사한 입자 역가를 나타냄), EHEC 콜로니의 수가 크게 증가할 것으로 기대된다 (메틸트란스퍼라제에 의한 개선된 효율을 나타냄).
P1 파지에 대한 개선된 전달을 입증함: 전술한 바와 유사한 접근방식이 P1CM 파지를 사용하여 수행되었다. 주요 차이점은 P1 게놈에서 dmt 메틸라제 유전자가 더 파괴될 것이라는 것이다. 본 발명자들은 이미 EC135에서 P1 리소겐 (lysogens) 생산을 시도하였고, 이는 액체 배양물에서 세포 용균을 유도하였다. 어느 정도의 메틸화를 필요로 할 것이지만; 그러나 상기 자체의 메틸화와 함께, 부가의 메틸화 타입이 도입되어 상기 P1 게놈의 전달 효율을 향상시킬 것으로 기대된다.
실시예 2. 박테리아를 선별적으로 사멸시키기 위한 CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 박테리오파지 및 파지미드 DNA
P1 파지 및 M13 파지미드가 박테리아의 선별적 사멸을 위한 CRISPR-Cas 시스템의 운반체로서 박테리오파지 및 파지미드 DNA의 사용을 테스트하기 위해 사용되었다. 상기 P1 파지는 파지 생물학의 전형적인 모델이고 (Lobocka et al. J. Bacteriol. 186, 7032-7068 (2004)), 게놈성 DNA의 조각을 형질도입하는데 통상적으로 사용된다 (Ikeda & Tomizawa. J. Mol. Biol. 14, 85-109 (1965)). 파지미드가 P1에 대해 개발되었고 (Westwater, Microbiol. Read. Engl. 148, 943-950 (2002), DNA를 다양한 그람-음성 박테리아로 전달하고, 큰 DNA 라이브러리를 형질도입하기 위한 수단으로 사용되었다 (Kittleson et al. ACS Synth. Biol. 1, 583-589 (2012); Kaiser & Dworkin, Science 187, 653-654 (1975). 본 발명자들은 현재 야생형 P1 파지를 갖는 균주 및 coi 유전자를 유도적으로 발현시키는 개별의 플라스미드를 가졌다. 상기 P1 파지는 정상 성장 조건하에 용원성이다. 상기 coi 유전자의 발현은 상기 파지를 용균 주기로 유도하여, 파지 입자를 형성한다.
상기 M13 파지미드는 F1 복제 기원을 포함하는 파지미드 및 파지 기관의 나머지 부분을 코딩하는 헬퍼 플라스미드에 의존한다. M13에 의한 감염은 F-섬모를 필요로 하고, 이는 일부 이. 콜리 균주에서 발견되는 F 플라스미드로부터 정상적으로 발현된다. M13은 파지 디스플레이를 위한 표준 플랫폼 (standard platform)이었다 (Pande et al. Biotechnol. Adv. 28, 849-858 (2010)).
타입 I CRISPR-Cas 시스템에 의한 표적 사멸: 이. 콜리로부터의 전체 타입 I-E CRISPR-Cas 시스템 또는 바실루스 할로두란스 (Bacillus halodurans)로부터의 타입 I-C CRISPR-Cas 시스템이 M13 파지미드로 코딩되었고, 이. 콜리의 표적화된 사멸을 입증하기 위해 사용되었다. 상기 표적 균주에 존재하는 항생제 저항성 유전자가 상기 시스템을 사용한 선별적 사멸을 입증하는데 사용되었다. 효율적으로 감염시키기 위해서, 상기 표적 균주는 상기 F 플라스미드를 코딩한다. 상기 파지 입자가 상기 표적 세포로 투여되고, 상기 세포가 플레이트되어서 살아있는 콜로니를 계수한다. 상기 시스템의 전달로, 파지가 없거나 또는 비-표적화 파지와 비교하여, 콜로니 수에서 대량의 감소가 유도될 것으로 기대된다.
P1 게놈에서 통합 부위의 확인: 동종 재조합을 사용하여, 항생제 저항성 마커가 상기 P1 게놈에서 상이한 위치로 혼입된다. 상기 위치는 불필요한 부위 및/또는 보충 부위, 가령, 예를 들면 (a) 파지-코딩된 제한-변형 시스템 (예컨대, P1 파지에서 res/mod), (b) 중복감염을 차단하는 유전자 (예컨대, simABC), (c) 제한-변형 시스템의 저해인자 (예컨대, P1 파지에서 darA), (d) 삽입 서열 요소 (예컨대, P1 파지에서 IS1), (e) 중독 시스템 (예컨대, P1 파지에서 phd/doc), (f) 용균 주기의 활성인자 (예컨대, P1 파지에서 coi), (g) 용균성 유전자 (예컨대, P1 파지에서 kilA), (h) tRNA (예컨대, P1 파지에서 tRNA1,2), (i) 입자 구성요소 (예컨대, P1 파지에서 cixL, cixR 테일 파이버 유전자), 또는 (j) 그 임의의 조합을 포함한다.
보충 부위에 있어서, 상기 결실된 유전자(들)가 상기 pBAD18 유도성 발현 시스템으로 클로닝되었다. 각 경우에, 세포 용균이 유도 후에 평가되었고 (용균 주기가 여전히 활성인 것으로 표시), 그 후 형질도입된 입자의 수가 형질도입 후에 항생제 저항성 콜로니에 기반하여 측정되었다. 모든 연구는 이. 콜리에서 수행되었다.
P1 파지에 CRISPR-Cas 시스템의 구성요소를 구비: 3가지 접근방식이 취해짐:
1. 타입 I 또는 타입 II CRISPR-Cas 시스템을 발현하는 균주로의 전달을 위해 P1에 반복-스페이서-반복을 구비.
2. P1에 CRISPR-Cas9를 구비 (예를 들면, Sth1 Cas9 및 sgRNA (tracr 핵산에 융합된 CRISPR 어레이)).
3. P1에 이. 콜리 타입 I-E 시스템 또는 비. 할로두란스 (B. halodurans) 타입 I-C 시스템을 구비.
각 접근방식에 대해, 상기 구조물이 항생제 저항성 마커와의 동종 재조합을 사용하여 통합된다. 상기 CRISPR 어레이가 표적 균주에 존재하는 개별의 항생제 저항성 마커를 표적화하지만, 상기 생산 균주를 표적으로 하지 않도록 디자인된다. 상기 파지 입자가 그후 상기 표적 균주로 투여되었고, 살아있는 콜로니의 수가 계수되었다. 상기 디자인된 파지는 파지 없음 또는 비-표적화된 파지와 비교하여 살아있는 콜로니의 수가 크게 감소할 것으로 기대된다.
효율적인 교차-균주 및 교차-종 전달 및 사멸: 상기 디자인된 파지들 중 하나 (예컨대 P1)가 변형된 메틸화 패턴을 갖는 이. 콜리 (예컨대 MG1655 Δdam Δdcm ΔhsdRMS)의 생산 균주에서 생산되었다. 상기는 표적 균주 (예컨대 클레브시엘라 뉴모니에, 슈도모나스 에루기노사 (Psuedomonas aeruginosa), 이. 콜리 O157:H7)로부터의 이종 메틸트란스퍼라제 유전자 또는 유사한 메틸화 패턴을 생산하는 것으로 알려져 있는 다른 균주로부터의 메틸트란스퍼라제 (예컨대 온라인 REBASE 데이터베이스에 열거된 메틸트란스퍼라제)를 도입함으로써 달성되었다. 상기 박테리오파지가 내인성 CRISPR-Cas 시스템 (예컨대 슈도모나스 에루기노사에서 타입 I-F 시스템)과 양립가능하고, 상기 게놈에서 적어도 하나의 PAM-플랭크된 부위를 표적화하는 CRISPR 어레이를 코딩하도록 디자인되었다. 대안으로서, 상기 박테리오파지가 완전한 CRISPR-Cas 시스템 (예컨대 타입 I-E Cascade 유전자 및 cas3 및 타입 I-E CRISPR 어레이)을 코딩하도록 디자인되었다. 상기 파지 입자가 그 후 생산되었고 (예컨대, P1에 있어서 유도성 발현에 의해서 또는 M13에 있어서 필라멘트성 파지의 구성적 생산을 통해), 상기 숙주와 구별되는 다른 표적 균주를 감염시키는데 사용되었다. 예를 들면 상기 파지가 상기 DNA를 클레브시엘라 뉴모니에 또는 시겔라 플렉스네리로 전달하는데 사용된다. 전달은 상기 파지에 대한 선별가능한 마커 및 상이한 감염 다중도를 도입하여 수행된다. 사멸 정도가 액체 배양물의 혼탁의 정지된 증가 또는 콜로니-형성 유닛의 수의 감소에 기반하여 측정된다. 상기 표적 균주가 상기 파지를 사용하여 선별적으로 사멸되고, 비-표적 균주가 사멸로부터 보호된다. 또한, 상기 사멸 효율은 (그 R-M 시스템에 대한 임의의 변형 또는 임의의 첨가된 메틸트란스퍼라제가 없는 생산 균주에 대해서) 상기 표적 균주와 실질적으로 유사하게 조작된 그 메틸화 패턴을 갖는 생산 균주에서 생산된 박테리오파지에 대해 향상되었다.
P1 파지에 대한 방법
A. 파지미드를 통한 전달
1. P1 파지미드는 P1 박테리오파지 게놈으로부터의 하기의 구성요소들을 코딩하는 플라스미드이다 (coi, cin, repL, pacA 유전자).
2. 상기 파지미드가 Gibson 클로닝을 통해 상기 CRISPR-Cas 시스템 구성요소 (CRISPR 어레이 단독, 또는 상기 cas 유전자와 함께)를 도입하도록 조작된다.
3. 일단 상기 P1 파지미드-CRISPR-Cas가 제작되면, 프로토콜 파지미드-CRISPR-Cas 패키징을 사용하여 상기 P1 박테리오파지로 패키징된다.
4. 파지미드-CRISPR-Cas가 표적화 프로토콜을 사용하여 박테리아 균주를 표적화 및 제거하는데 사용된다.
B. 조작된 P1 박테리오파지를 통한 전달
1. P1 박테리오파지가, 상기 박테리오파지 기능을 파괴하지 않도록 선택된 특정 위치에서 상기 CRISPR-Cas 시스템 구성요소를 그 게놈으로 클로닝함으로써 조작되고, 상기 위치는, 예를 들면 하기와 같다:
a. coi 유전자 대신에 (상기 용균 주기를 유발하는 역할을 함).
b. coi 유전자 및 imcB 유전자 둘다의 대신에 (coi-icmB; 둘은 상기 용균 주기를 유발하는데 도와줌).
c. 함유 부위 (inclusion site)를 가짐.
2. coi 유전자가 P1 박테리오파지 게놈으로부터 증폭되고, pBad18 플라스미드로 클로닝된다.
3. 상기 P1-CRISPR-Cas 파지 및 상기 pBad18-coi가 균주에 공존할 때, coi의 발현이 유도되어 프로토콜 P1-CRISPR-Cas 패키징에 따라 파지 입자를 생산한다.
4. 상기 생산된 용균물은 100% P1-CRISPR-Cas 파지를 포함할 것으로 기대되고, 프로토콜 표적화 후에 상기 표적화된 균주를 사멸시키는데 사용된다.
C. CRISPR-Cas 구성요소 클로닝
1. 일반적으로 CRISPR-Cas 구성요소가 상기 P1 박테리오파지 게놈 또는 상기 파지미드로 클로닝될 필요가 있다. 클로닝될 상기 구성요소는 상기 표적 균주에 의존한다.
2. 상기 표적 균주가 활성 CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 경우, 클로닝을 위한 구성요소는 게놈-표적화 CRISPR RNAs를 발현하는 DNA이다 (예컨대, CRISPR 어레이, 반복 스페이서-반복). 도 1 도식도 참조.
3. 상기 표적 균주가 활성 CRISPR-Cas 시스템을 포함하지 않는 경우, 클로닝을 위한 구성요소는 상기 cas 유전자들 (예컨대, Cas9, Cas3, Cas3', Cas3", 및/또는 Cascade 폴리펩티드)에 대한 DNA 및 상기 게놈-표적화하는 CRISPR RNAs (예컨대, CRISPR 어레이, tracr 핵산)를 포함한다. 도 1 도식도 참조.
4. 상기 파지미드로의 클로닝이 Gibson 클로닝 도식을 사용하여 수행된다. P1 박테리오파지로의 클로닝이 동종 재조합을 사용하여 수행된다.
일반적 프로토콜
A. 파지미드-CRISPR-Cas 패키징:
1. 파지미드-CRISPR-Cas가 잠재성 P1 박테리오파지를 갖는 균주 Kl739 (이. 콜리 균주)로 형질전환된다.
2. 상기 균주가 그후 37℃에서 밤새 진탕하면서 액체 배양물에서 성장된다.
3. 다음 날, 상기 배양물이 다시 1:100으로 희석되고, 37℃에서 1-2시간 동안 진탕된다.
4. 아라비노스 (arabinose)가 상기 배양물에 첨가되어, 상기 파지미드 상에서 coi 유전자의 발현을 유도하고, 박테리오파지 P1의 용균 주기를 유도하였다. 진탕을 추가 5시간 동안 용균이 상기 배양물을 육안으로 검사하여 확인될 때까지 계속하였다.
5. 클로로포름이 상기 용균된 배양물로 첨가되고, 아래 위로 뒤집어서 혼합되었다. 상기는 임의의 용균되지 않은 세포를 사멸시켰다.
6. 세포 파편 (debris)이 10분 동안 원심분리에 의해 수집되고, 그 후 상층액이 용균물로서 수집되었다. 상기 용균물은 원래의 P1 박테리오파지 DNA 및 파지미드-CRISPR-Cas의 혼합을 포함하는 파지 입자를 포함한다.
B. P1-CRISPR-Cas 패키징:
1. coi 유전자를 코딩하는 pBad18 플라스미드가 조작된 잠재성 P1-CRISPR 박테리오파지를 갖는 균주 Kl739 (이. 콜리 균주)로 형질전환된다.
2. 상기 균주가 그후에 37℃에서 밤새 진탕하면서 액체 배양물에서 성장된다.
3. 다음 날, 상기 배양물이 다시 1:100으로 희석되고, 37℃에서 1-2시간 동안 진탕된다.
4. 아라비노스가 상기 배양물에 첨가되어, 상기 파지미드 상에서 coi 유전자의 발현을 유도하고, 박테리오파지 P1의 용균 주기를 유도하였다. 진탕을 추가 5시간 동안 용균이 상기 배양물을 육안으로 검사하여 확인될 때까지 계속하였다.
5. 클로로포름이 상기 용균된 배양물로 첨가되고, 아래 위로 뒤집어서 혼합되었다. 상기는 임의의 용균되지 않은 세포를 사멸시켰다.
6. 세포 파편이 10분 동안 원심분리에 의해 수집되고, 그 후 상층액이 용균물로서 수집되었다. 상기 용균물은 CRISPR-Cas 구성요소를 전달할 수 있는 P1-CRISPR 박테리오파지만을 포함한다.
C. 표적화
1. 표적화될 균주가 37℃에서 밤새 진탕하면서 액체 배양물에서 성장된다.
2. 다음 날, 세포가 원심분리에 의해 상기 배양물로부터 수집되고, CaCl2 및 MgSO4가 보충된 LB 배지에 재현탁되었다.
3. 상기 배양물이 OD 2로 조정되고, 그 후 용균물에 의해서, 적어도 하나의 파지 입자에 의해 감염되는 모든 세포의 확률을 최대화하는 미리-산출된 감염 다중도 (즉, 감염 표적에 대한 작용제 (예컨대 파지, 바이러스 등)의 비율; MOI)로 감염되었다.
4. 감염은 상기 튜브를 뒤집어서 상기 용균물과 상기 배양물을 혼합시킴으로써 수행된다.
5. 감염된 세포가 상기 용균물과 37℃에서 30분 동안 인큐베이트되었고, 그후 37℃에서 1시간 동안 진탕되었다.
6. 세포가 그후에 다른 희석으로 플레이트되었고, 밤새 37℃에서 인큐베이트되었다.
7. 콜로니 형성 유닛이 다음 날 계수되었다.
실시예 3. 다수-종 DNA 전달을 위한 광범위 숙주 박테리오파지 및 CRISPR 항미생물제 조작
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 및 그 Cas (관련된 CRISPR) 단백질이 항미생물제에 대한 강력한 작용제이고, 광범위한-스펙트럼의 항생제에 대한 잠재적 대체물인 것으로 입증되었다 (Gomaa, A. A. et al. MBio 5, e00928-913 (2014); Bikard, D. et al. Nature Biotechnology 32, 1146-1150 (2014); Citorik et al. Nat. Biotechnol. 32, 1141-1145 (2014)). 상기 시스템은 박테리아 및 고세균에서 RNA-유도된 면역계로 자연스럽게 기능하여 상보적인 유전 물질을 인식하고 절단한다 (Brouns et al. Science 321, 960-964 (2008); Marraffini et al. Science (New York, N.Y.) 322, 1843-1845 (2008); Garneau. et al. Nature 468, 67-71 (2010); Edgar et al. J. Bacteriol. 192, 6291-6294 (2010); Manica et al. Mol. Microbiol. 80, 481-491 (2011)). 상기 박테리아 게놈을 표적으로 하는 가이드 RNAs를 디자인하는 것은 상기 표적 부위에서 비가역적 DNA 손상을 일으킬 수 있어서, 서열-특이적 세포 사멸을 유도한다 (Gomaa, A. A. et al. MBio 5, e00928-913 (2014); Bikard, D. et al. Nature Biotechnology 32, 1146-1150 (2014); Citorik et al. Nat. Biotechnol. 32, 1141-1145 (2014)). 또한, 다약제 저항성 (multidrug resistance)을 갖는 플라스미드를 표적으로 하는 가이드 RNAs를 디자인하는 것은 항생제에 대해 상기 박테리아를 민감하게 할 수 있다 (Bikard, D. et al. Nature Biotechnology 32, 1146-1150 (2014)).
그 항미생물 활성을 발휘하기 위해서, CRISPR-Cas 시스템이 상기 박테리아 세포질로 전달되어야 한다. 지금까지의 전달 전략은, 박테리오파지 게놈내에서 또는 상기 박테리오파지 입자에 대한 패키징 신호를 포함하는 파지미드로 불리우는 플라스미드내에서, 잠재성 또는 필라멘트성 박테리오파지에 의해 패키징된 DNA내에서 상기 시스템을 코딩하는 것에 압도적으로 의존했다 (Bikard et al. Nature Biotechnology 32, 1146-1150 (2014); Citorik et al. Nat. Biotechnol. 32, 1141-1145 (2014); Yosef et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 112, 7267-7272 (2015)). 본 실시예에서, 상기 CRISPR-Cas 시스템의 전달은 강력한 사멸 또는 플라스미드 제거를 유도하거나, 또는 항생제 저항성의 전달에 대해 감염된 세포를 면역화시켰다. 상기는 유망한 입증이었지만, 상기 박테리오파지는 개별의 종 또는 균주로 한정되는 좁은 숙주 범위와 관련되었다. 결과적으로, 각 전달 플랫폼은 CRISPR가 표적으로 할 수 있는 박테리아의 범위를 제한하였다. CRISPR 항미생물제의 가능성을 완전히 실현시키기 위해서, 훨씬 더 넓은 숙주 범위에 도달할 수 있는 일반화된 전달 비히클을 필요로 한다.
여기서, 상기 광범위한-숙주인, 잠재성 박테리오파지 P1이 DNA 전달 및 CRISPR 항미생물제를 위해 조작된다. P1은 잠재성 박테리오파지로 기능하고, 여기서 약 90-kb 게놈이 염색체외, 단일-카피 플라스미드로서, 그 용원성 상태로 존재한다 (Lobocka et al. J. Bacteriol. 186, 7032-7068 (2004)). 중요하게도, P1이 문 (phylum) 프로테오박테리아 (proteobacteria) 내에서 그람-음성 박테리아로부터 다양한 박테리아에 걸친 광범위한 범위로 그 게놈을 주입하는 것으로 나타났다 (Westwater et al. Microbiology 148, 943-950 (2002)). 또한, P1은 게놈성 DNA 또는 파지미드를 드물게 패키징하는 것을 통해서 DNA 전달을 위한 표준 플랫폼이었다 (Westwater et al. Microbiol. 148, 943-950 (2002); Ikeda et al. J. Mol. Biol. 14, 85-109 (1965); Thomason et al. Curr Protoc Mol Biol Ch. 1, Unit 1.17 (2007); Kittleson et al. ACS synthetic biology 1, 583-589 (2012); Ikeda et al. J. Mol. Biol. 14, 85-109 (1965); Thomason et al. Curr Protoc Mol Biol Ch. 1, Unit 1.17 (2007); Kittleson et al. ACS synthetic biology 1, 583-589 (2012)). 본 발명자들은 상기 P1 게놈이 P1 파지미드보다 더 효율적으로 전달되고, 그 게놈에서 적어도 3개의 구별되는 랜딩 부위에서 합성 DNA를 수용할 수 있다는 것을 발견하였다. 상기 조작된 게놈은 에스케리치아 콜리 및 시겔라 플렉스네리로 효율적으로 전달되어 디자인된 CRISPR-Cas 시스템의 전달 시에 서열-특이적 사멸을 유도하는 것으로 나타났다. 그러므로 상기 P1 게놈을 조작하는 것은 다양한 박테리아로 CRISPR 항미생물제를 전달하는 유망한 전략임을 나타내었다.
균주, 플라스미드, 및 박테리오파지 제작. 본 연구에 사용된 모든 균주, 플라스미드, 및 박테리오파지가 하기 표 1 및 표 2에 보고되었다.
균주
균주 유전자형
BW25113 에스케리치아 콜리 K12 F- DE(araD-araB)567 lacZ4787(del)(::rrnB-3) LAM- rph-1 DE(rhaD-rhaB)568 hsdR514
BW25113 Δcas3
 BW25113 [Δcas3 Pcse1]::[PJ23119]
BL21(D3) 에스케리치아 콜리 B F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 유전자 1 ind1 sam7 nin5])
KL739 에스케리치아 콜리 thr-1 leuB6(Am) fhuA21 lacY1 glnX44(AS) λ-rfbC1 thiE1 P1kc+ pro-89

P1 리소겐
MG1655 에스케리치아 콜리 K-12 F- λ-ilvG-rfb-50 rph-1
MG1655 ΔdamΔdcmΔhsdRMS 에스케리치아 콜리 MG1655 ΔdamΔdcmΔhsdRMS
시겔라 플렉스네리 ATCC #12022 및 ATCC #700930
플라스미드, 및 박테리오파지
플라스미드 상세 저항성 마커
pBAD18 araC 조절인자를 갖는 L-아라비노스-유도성 플라스미드 암피실린
pcoi coi 삽입물을 갖는 pBAD18 벡터 암피실린
pKD13 FRT 부위에 의해 플랭크된 카나마이신 저항성 유전자를 코딩하는 플라스미드 카나마이신
pKD13ΔSalI SalI 제한 부위가 결손된 pKD13 플라스미드 카나마이신
pKD13ΔSalI-1E 1 반복을 포함하고, 스페이서가 없는 CRSIPR 유전자좌 삽입물을 갖는 pKD13ΔSalI 카나마이신
pKD13ΔSalI-1E-ftsA ftsA 유전자를 표적으로 하는 스페이서를 코딩하는 pKD13ΔSalI-1E 카나마이신
pKD3 FRT 부위에 의해 플랭크된 cat 카세트를 코딩하는 플라스미드 클로람페니콜
pKD46 열-민감성 복제-기원을 갖는 플라스미드에서 λ-레드 유전자의 L-아라비노스-유도성 발현 암피실린
pcas3 구성성으로 발현된 cas3 유전자를 갖는 pBAD33 클로람페니콜
P1 파지미드 gfp, cin, repL, 및 pacA 유전자 이외에 아라비노스 유도성 coi 유전자를 갖는 P15a 벡터 클로람페니콜
P1-ΔimcB/coi::kanR imcB/coi 오페론 대신에 삽입된 카나마이신 저항성 유전자를 갖는 P1 박테리오파지 카나마이신
P1-ΔimcB/coi::cmR imcB/coi 오페론 대신에 삽입된 cat 카세트를 갖는 P1 박테리오파지 클로람페니콜
P1-ΔsimABC::kanR simABC 오페론 대신에 삽입된 카나마이신 저항성 유전자를 갖는 P1 박테리오파지 카나마이신
P1-ΔIS1::kanR IS1 부위 대신에 삽입된 카나마이신 저항성 유전자를 갖는 P1 박테리오파지 카나마이신
P1-ΔimcB/coi::kanR-ftsA imcB-coi 오페론 대신에 삽입된 ftsA 표적화 스페이서를 코딩하는 카나마이신 저항성 유전자 및 타입 I-E CRISPR 유전자좌를 갖는 P1 박테리오파지 카나마이신
P1-ΔsimABC::kanR-ftsA simABC 오페론 대신에 삽입된 ftsA 표적화 스페이서를 코딩하는 카나마이신 저항성 유전자 및 타입 I-E CRISPR 유전자좌를 갖는 P1 박테리오파지 카나마이신
P1-ΔIS1::kanR-ftsA IS1 부위 대신에 삽입된 ftsA 표적화 스페이서를 코딩하는 카나마이신 저항성 유전자 및 타입 I-E CRISPR 유전자좌를 갖는 P1 박테리오파지 카나마이신
M13KO7 NEB cat# N0315S 참조. 간단하게, 하기 돌연변이화에 따른 M13 박테리오파지: (1) gII에서 Met40Ile, (2) 상기 M13 복제 기원에 삽입된 트란스포슨 (transposon) Tn903으로부터 p15A 기원 및 카나마이신 저항성 유전자 둘다의 삽입 카나마이신
pKD13ΔSalI 플라스미드가 SalI 제한 효소에 의한 pKD13 플라스미드를 분해시키고 (Datsenko et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000)), Pfu 폴리머라제를 사용하여 블런트-엔드되었고 (blunt-ended), T4 DNA 리가제 (NEB)를 사용하여 결찰되었다.상기 pKD13ΔSalI-1E 플라스미드를 생산하기 위해서, 상기 pKD13ΔSalI 백본 (backbone)이 PCR에 의해서 프라이머 pKD13_1Earray.fwd/pKD13_1Earray.rev를 사용하여 증폭되었다. 강한 구성성 프로모터 (J23100), KpnI 제한 부위 및 XhoI 제한 부위에서 변형된 단일 타입 I-E CRISPR 반복, 및 이중 종결인자를 코딩하는 화학적으로-합성된 선형, 이중-가닥 DNA (예컨대 gBlocks®)를 IDT에서 주문하였고, PCR에 의해 1Earray_pKD13.fwd/1Earray_pKD13.rev를 사용하여 증폭되었다. Gibson 조립체 (Gibson, D. G. Meth. Enzymol 498, 349-361 (2011))가 그후 상기 증폭된 gBlocks®을 상기 카나마이신 저항성 카세트의 업스트림의 pKD13ΔSalI 백본에 결찰시키는데 사용되었다. 상기 KpnI/XhoI 제한 부위가 gBlocks®에 포함되어 조작된 반복-스페이서 pairs1이 순차적으로 삽입되도록 하였다. 상기 접근방식은 pKD13ΔSalI-1E-ftsA 플라스미드를 생산하기 위해서 이. 콜리에서 필수 ftsA 유전자를 표적으로 하는 조작된 스페이서를 pKD13ΔSalI-1E로 삽입하도록 수행되었다.
pcoi 플라스미드를 생산하기 위해서, pBAD18 플라스미드 (Guzman et al. J.Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995))가 NheI/SacI에 의해 선형화되었다. 상기 coi 유전자가 그후 Zymo 플라스미드 DNA 정제 키트를 사용하여 단리된 P1 리소겐으로부터 프라이머 coi.fwd/coi.rev를 사용하여 PCR 증폭되었다. 상기 프라이머는 NheI 및 SacI 부위를 상기 증폭된 coi 유전자의 양측 말단에 도입하였다. 상기 PCR 산물이 그후에 NheI/SacI에 의해 분해되었고, 상기 pBAD 프로모터의 다운스트림에 있는 선형화된 pBAD18 플라스미드에 결찰되었다.
상기 카나마이신 저항성 카세트를 상기 P1 박테리오파지 게놈에 통합하기 위해서, 상기 카나마이신 저항성 카세트가 5' 말단에 P1 게놈 특이적 상동 영역을 갖는 프라이머를 사용하여 pKD13으로부터 PCR-증폭되었다. 결과의 선형 PCR 산물이 λ-레드 매개된 재조합을 통해 pKD46 플라스미드19를 갖는 이. 콜리 KL739 균주에 존재하는 P1 박테리오파지 리소겐으로 통합되었다. 이. 콜리 KL739 균주가 상기 표적 박테리아의 R-M 시스템과 실질적으로 유사한 R-M 시스템을 갖기 때문에 선택되었다 (예컨대, Bw25113, BL21, MG1655, 또는 시겔라 (Shigella)).
동일한 접근방식이 상기 클로람페니콜 저항성 유전자 (cat) 또는 상기 타입 I-E CRISPR 어레이/ftsA 스페이서를 상기 P1 박테리오파지 게놈으로의 통합을 위해 수행되었다. 상기 경우에, 상기 클로람페니콜 (cm) 저항성 카세트가 pKD3 플라스미드로부터 증폭되었고 (Datsenko et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000)), 상기 타입 I-E CRISPR 어레이 ftsA 스페이서가 상기 pKD13ΔSalI-1E-ftsA 플라스미드로부터의 카나마이신 저항성 카세트와 함께 증폭되었다. 모든 플라스미드가 콜로니 PCR에 의해 스크리닝되었고, 시퀀싱에 의해 확인되었다.
성장 조건. 모든 균주가 37℃ 또는 30℃ 및 250 rpm에서 적절한 항생제를 갖는 LB 배지 (10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물, 10 g/L 염화나트륨)를 포함하는 15 mL FalconTM 둥근바닥 튜브에서 배양되었다. 상기 동일한 균주가 적절한 항생제가 보충된 LB 아가 (1.5%의 아가 (agar)를 갖는 Luria Broth 배지)에 플레이팅되었고, 37℃에서 인큐베이트되었다. 항생제가 하기 최종 농도로 투여되었다: 50 μg/ml 카나마이신, 50 μg/ml 암피실린, 및 34 μg/ml 클로람페니콜. L-아라비노스가 0.2%로 투여되어 pcoi의 발현을 유도하였다.
형질도입 분석. 이. 콜리 및 시겔라 균주의 냉동 원료 (Freezer stocks)가 LB 아가 상에 스트리킹시키고 (streaked), 개별의 콜로니가 단리되었다. 개별의 콜로니를 3 ml의 LB 배지에 접종하고, 밤새 37℃ 및 250 rpm에서 진탕시켰다. 상기 배양물이 그후 펠렛화되었고, 1 mL의 감염 배지에 재현탁시키고, ABS600이 Nanodrop 2000c 분광광도계 (Thermo Scientific)에서 측정되었다. ABS600 값 및 ABS600이 1이면 8×108 세포/mL과 동일하다는 가정에 기반하여, mL 당 콜로니 형성 유닛의 수 (CFU/mL)가 결정되었다. 상기 배양물이 그후 상기 실험에 기반한 특정 MOI로 박테리오파지 용균물을 피펫팅 (pipetting)하여 혼합시켰다. 일부 경우에, 상기 배양물이 상기 표적화된 MOI에 대한 적절한 CFU/mL로 상기 감염 배지에서 희석시킬 필요가 있다. 상기 배양물/박테리오파지 혼합물이 그후 60-90분동안 37℃ 및 250 rpm에서 진탕되었다. 마지막으로, 200-300μl의 상기 배양물/박테리오파지 혼합물의 적절한 희석물이 적절한 항생제가 보충된 LB 아가에 플레이팅되었고, 37℃에서 밤새 인큐베이트되었다. 첨가된 박테리오파지 용균물의 mL당 상기 플레이트상에서 성장한 콜로니의 수가 전달 효율의 표시로 간주되었다.
중복감염 실험을 위해서, P1-ΔimcB/coi::kan R , 또는 P1-ΔsimABC::kan R 을 갖는 이. 콜리의 동결된 원료가 적절한 항생제가 보충된 LB 아가 상에 분리를 위해 스트리킹되었다. 개별의 콜로니를 적절한 항생제가 보충된 3 mL의 LB 배지에 접종시키고, 37℃ 및 250 rpm에서 밤새 진탕되었다.
전술한 바와 동일한 형질도입 프로토콜에 따라, 상기 배양물이 P1-ΔimcB/coi::cm R 로 감염되었고, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 둘 다가 보충된 LB 플레이트 상에 플레이팅되었다.
파지 입자 생산. P1 리소겐 및 상기 pcoi 플라스미드 또는 상기 P1 파지미드를 갖는 균주의 동결된 원료가 LB 아가 상에서 분리를 위해 스트리킹되었다. 개별의 콜로니를 3 ml의 LB 배지에 접종시키고, 37℃ 및 250 rpm에서 밤새 진탕시켰다. 밤새 배양된 배양물이 다시 1:100으로 5 mL의 P1 용균 배지 (PLM; 100 mM MgCl2 및 5 mM CaCl2를 함유하는 LB 배지)에서 희석되었고 ((Westwater et al. Microbiology 148, 943-950 (2002)), 37℃ 및 250 rpm으로 진탕시킴으로써 ABS600이 약 0.6-0.8로 성장시켰다. L-아라비노스가 그후 coi 유전자의 발현을 유도하고, 상기 P1 박테리오파지 용균 주기를 유발하기 위해 첨가되었다. 상기 배양물을 37℃ 및 250 rpm에서 진탕시키면서 4-6시간 동안 용균시키기 위해 방치하였다. 용균된 배양물을 그후 15 mL의 Eppendorf 원뿔형 튜브로 옮기고, 클로로포름을 최종 농도 2.5 wt%로 첨가하였고, 상기 튜브를 아래 위로 몇 번 흔들어서 혼합하였다. 용균된 세포 파편이 그 후 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해서 펠렛화되었고, 상층액을 새로운 15 mL Eppendorf 튜브에 넣었다. 모든 용균물이 4℃에서 보관되었다.
A. 메틸트란스퍼라제 유전자를 갖지 않는 균주에 대해 메틸트란스퍼라제 유전자를 갖는 균주에서 생산될 때 박테리오파지-패키지된 DNA의 메틸화 정도가 다름.
pCas3에 대한 플라스미드 DNA가 MG1655 및 메틸트란스퍼라제 유전자가 결여된 MG1655로부터 추출되었다. 상기 DNA가 그 후 메틸화된 서열 GAmTC 만을 분해하는 제한 효소인 (+)와 함께 또는 (-) DpnI 없이 인큐베이트되었다. 상기 시료가 그 후 DNA 사이즈 마커와 함께 아가로스 겔 전기영동에 의해 분해되었다. 상기 데이터는 MG1655로부터 추출된 플라스미드 DNA가 DpnI에 의한 절단을 수행하고 (도 2a, 좌측 2개 레인), 반면에 메틸트란스퍼라제 유전자가 결여된 MG1655로부터의 DNA는 절단을 수행하지 않았다 (도 2a, 우측 2개 레인).
도 2b는 이. 콜리의 메틸트란스퍼라제-포지티브 및 메틸트란스퍼라제-네가티브 균주들에서 생산될 때 P1 박테리오파지 입자로부터 추출된 dsDNA를 나타내었다. P1 유도체 LB002가 dam 및 dcm 메틸트란스퍼라제 유전자를 갖거나 또는 갖지 않는 이. 콜리 K-12 균주에서 생산되었다. 파지 DNA가 Norgen Biotek Inc로부터 파지 DNA 분리 키트를 사용하여 추출되었다. 파지 DNA가 이후에 반응 당 120ng DNA를 사용하는 제한 효소 분석에 의해 분석되었다: 레인 1: VWR 2-log DNA 래더; 레인 2, 4, 6: dam+dcm+ 이. 콜리에서 생산된 파지로부터 DNA; 레인 3, 5, 7: dcm-dam-이. 콜리에서 생산된 파지로부터의 DNA; 레인 2-3: AleI, NheI, 및 XhoI로 분해된 DNA; 레인 4-5: AleI, NheI, XhoI, 및 DpnII로 분해된 DNA; 및 레인 6-7: AleI, NheI, XhoI, 및 StyD41로 분해된 DNA. DpnII가 Dam에 의해 메틸화된 DNA에 의해 차단되었다. StyD41이 Dcm에 의해 중첩을 메틸화하여 차단되었다. 상기 데이터는 메틸라제가 없는 박테리아에서 생산된 파지로부터의 DNA는 메틸라제를 갖는 박테리아에서 생산된 파지로부터의 DNA보다 덜 메틸화되고, 메틸라제를 갖는 박테리아에서 생산된 파지로부터의 DNA가 모든 가능한 부위에서 메틸화되지 않는 것을 보여주었다.
B. 합성 DNA 구조물의 상기 파지 게놈으로의 통합을 위해 이용가능한 다수의 부위.
P1 파지 게놈에서 외래 DNA에 대한 동정된 랜딩 부위를 보여주는 도식이 도 3a에 제공되었다. IS1, 및 sim은 상기 박테리오파지 P1 게놈 내에서 불필요한 유전자이고, coi-imcB는 보충가능하다. 상기 삽입 서열 1 (IS1) 요소는 P1 기능에서 알려져 있는 역할이 없고, simABC 오페론은 중복감염을 차단하는 것과 관련이 있다. 상기 부위들로 삽입되어진 카나마이신 저항성을 코딩하는 유전자 또는 이. 콜리에서 ftsA 유전자를 표적으로 하는 타입 I-E CRISPR RNA에 의해 플랭크된 상기 동일한 저항성 유전자에 대한 DNA 서열을 삽입하여 상기 3개의 부위들 중 하나가 파괴된 몇 개의 P1 박테리오파지 변이체가 제작되었다. 특히, P1 입자가 pcoi 및 P1-ΔimcB/coi::kan R , P1-ΔIS1::kan R , 또는 P1-ΔsimABC::kan R 을 갖는 이. 콜리 K-12 KL739에서 생산되었다. 상기 세포가 coi 유도 시에 용균되었고, 상기 입자가 이. 콜리 K-12 BW25113을 감염시키는데 사용되었다. 감염된 세포가 카나마이신을 갖는 LB 아가 상에 플레이팅되었다. 도 3b에 개시된 바와 같이, 결과의 입자는 상기 P1 게놈을 BW25113 세포로 효율적으로 전달하였다. 그러므로, 다수의 랜딩 부위 (통합 부위)는 P1 복제, 패키징 및 전달을 파괴하지 않는 합성 구조물에 이용가능하다.
C. 중복 감염에 있어서 simABC 오페론을 결실시킨 효과
상기 simABC 오페론은 원형질막공간 (periplasm)으로부터의 파지 DNA를 세포질 (cytoplasm)로의 전달을 차단함으로써 중복감염을 방지하는 것과 관련이 있다 (Kliem et al. Virology 171, 350-355 (1989)). CRISPR 항미생물제의 문맥에서, 중복감염은 세포가 비-기능성 파지를 수용한다면 중요할 수 있다. 중복감염에서 simABC의 효과를 테스트하기 위해서, 본 발명자들은 카나마이신 저항성 마커 (P1-ΔimcB/coi::kan R (LB001) 또는 P1-ΔsimABC::kan R (LB002))로 대체된 imcB/coi 또는 simABC를 갖는 P1 게놈으로 감염시킨 MG1655 세포를 생산하였다. P1-ΔimcB/coi::kan R (LB001) 또는 P1-ΔsimABC::kan R (LB002)를 갖는 세포가 그후 파지 P1-ΔimcB/coi::cm R 로 감염되었고, kan, cm, 및 kan+cm 플레이트 상에 플레이팅되었다 (도 4a 참조). 상기 세포가 그후 MOI 10으로 P1에 의해 감염되었고, 상기 imcB/coi 유전자좌가 클로람페니콜 저항성 마커로 대체되었다. 항생제들 중 하나 또는 둘 다에 플레이팅된 살아있는 콜로니의 수가 측정되었다.
놀랍게도, imcB/coi 또는 simABC가 결여된 P1을 세포가 초기에 갖는지의 여부와 관계없이 도입된 P1 게놈을 유지하는 세포의 유사한 수가 관찰되었다 (도 4b). 그러나, 두 항생제에 저항성인 세포를 평가할 때, simABC가 결여된 P1으로 초기에 감염된 세포만이 회수되었다. 상기 결과는 simABC는 중복감염을 차단하지 않지만, 용원 주기 동안 복제 또는 카피수 조절에서 역할을 하는 것을 나타내었다. 그러므로 합성 DNA를 simAB로 삽입하면 제2 P1 박테리오파지 게놈으로 재감염시켰다.
D. 상기 P1 게놈이 상기 P1 파지미드보다 더 효과적으로 패키지되고 전달됨.
합성 구조물을 패키징하고 전달하는 가장 효율적인 수단이 P1 박테리오파지 입자에서 탐색되었다. 파지미드는 합성 구조물을 코딩하는 표준 수단이 되었고, 여기서 상기 P1 파지미드는 용균성 복제-기원 및 P1 용균 주기를 유도하는 coi 유전자의 유도성 발현과 함께 pacA 패키징 부위를 포함한다 (Westwater et al. Microbiology 148, 943-950 (2002); Kittleson et al. ACS synthetic biology 1, 583-589 (2012))). 상기 P1 파지미드가 다양한 그람-음성 박테리아로의 DNA 전달 및 DNA 라이브러리를 전달하는데 사용되었지만 (Id.), 상기 파지미드는 패키징을 위해 P1 게놈과 경쟁해야 한다. 결과적으로 세포는 P1 게놈 또는 파지미드를 수용할 수 있어서, 잠재적으로 DNA 전달 및 프로그램가능한 사멸을 복잡하게 한다.
상기 파지미드 및 상기 P1 게놈의 전달을 직접 평가하기 위해서, 본 발명자들은 P1에서 imcB/coi 오페론의 게놈 카피를 카나마이신 저항성 마커로 대체하였다. 특히 P1 입자가 P1-ΔimcB/coi::kan R (카나마이신 저항성) 및 P1 파지미드 (클로람페니콜 저항성) 또는 pcoi (암피실린 저항성)를 갖는 이. 콜리 K-12 KL739 세포에서 생산되었다. 본 발명자들은 그 후 상기 게놈을 이. 콜리 K-12 하위균주 KL739에서 coi의 유도성 발현을 갖는 P1 파지미드 또는 플라스미드와 조합하여 박테리오파지 입자를 생산하였다. 상기 입자가 그후 이. 콜리 K-12 MG1655 또는 이. 콜리 B BL21을 감염시키는데 사용되고, 상기 감염된 세포가 지시된 항생제를 갖는 LB 아가 상에 플레이팅되었다. 상기 실험이 3중으로 수행되었다.
상기 결과가 도 5에 개시되었고, 이. 콜리의 2개의 다른 균주에 대해 P1 게놈이 P1 파지미드보다 더 효율적으로 패키지 및 전달되는 것이 입증되었다. 도 5는 상기 P1 게놈이 상기 파지미드보다 약 100-배 더 빈번하게 전달되었고, 상기 파지미드를 수용한 세포의 약 4%가 과량의 세포 (감염 다중도 (MOI) = 0.003)에도 불구하고 P1 게놈을 수용하는 것을 보였다. 상기 입자가 pcoi 플라스미드를 사용하여 생산될 때, 상기 P1 게놈은 약 300-배 더 많이 전달하는 것을 나타내었고, 이는 상기 파지미드가 P1 용균 주기 또는 입자 생산을 파괴할 수 있다는 것을 제시하였다. 상기 pcoi 플라스미드가 또한 상기 P1 게놈보다 약 33,000-배 더 적은 빈도로 전달되었다. 유사한 경향이 이. 콜리 B 하위균주 BL21로 감염될 때 관찰되었고, 상기 균주가 MG1655보다 더 적은 빈도로 감염되었다. 그러므로, 적어도 P1 시스템에 있어서, 상기 파지 자체를 조작하는 것은 조작된 산물의 훨씬 더 높은 역가를 갖는 용균물을 수득한다. 그러므로 상기 P1 게놈은 상기 P1 파지미드 보다 더 효율적인 전달 비히클을 제공한다.
E. P1 전달 효율은 환경 조건에 따라 가변함.
박테리오파지에 의한 DNA 전달이 일반적으로 P1 형질도입 및 파지미드 전달을 위한 특정 배지 조건, 가령 PLM 배지 (100 mM MgCl2 및 5 mM CaCl2를 함유하는 LM 배지) 하에 수행되었다 (Kittleson et al. ACS synthetic biology 1, 583-589 (2012)). 그러나, 실제 적용은 전달 효율에 영향을 줄 수 있는 다양한 환경을 포함할 것이다. P1에 의한 DNA 전달이 이러한 조건에 의해 어떻게 영향을 받는지를 조사하기 위해서, LB 배지에서 성장된 이. 콜리 K-12 BW25113 세포를 다른 배지로 옮기고, pcoi 플라스미드로 생산된 입자를 사용한 P1 게놈의 전달이 측정되었다. 감염도 (DNA 전달)는 PLM으로부터 MgCl2는 제거하였지만, CaCl2는 제거하지 않은 후에 동일하게 유지되었고 (도 6), 이는 세포 부착에 있어서 CaCl2의 중요성과 일치한다 (Watanabe et al. J. Gen. Virol. 17, 19-30 (1972)). 그러나, CaCl2가 DNA 전달에 있어서 충분하지 않았고, PLM과 유사한 CaCl2의 수준을 갖는 최소 배지에서는 전달이 크게 감소되는 것을 나타내었다. 흥미롭게도, 우태아 혈청 및 PLM 배지 (100 mM MgCl2 및 5 mM CaCl2를 함유하는 LB 배지)에서 세포는 유사한 전달 효율을 수득하였고, 이는 P1이 더 인 비보 설정에서 DNA를 더 효율적으로 전달할 수 있음을 제시하였다.
전반적으로 상기 데이터는 P1 게놈이 상이한 배지 조건하에 전달될 수 있음을 보여주었고, 상기 조건은 상기 전달 효율에 있어서 큰 영향을 주었다.
F. DNA 메틸화 및 전달
+/- DNA 메틸화를 갖는 P1 박테리오파지 (즉, DNA 메틸화 (+) 또는 DNA 메틸화 (-)인 박테리아에서 생산된 P1)를 사용한 이. 콜리로의 DNA 전달이 도 7a에 개시되었다. 카나마이신 저항성 카세트를 운반하는 박테리오파지 P1이 이. 콜리 MG1655 또는 MG1655 ΔdamΔdcmΔhdsRMS (메틸라제 및 비메틸화 DNA를 표적으로 하는 제한 효소의 결여)에서 생산되었다. MG1655가 MG1655 또는 MG1655 ΔdamΔdcmΔhdsRMS에서 생산된 파지 P1에 의해 감염되었다. 유사하게, MG1655 ΔdamΔdcmΔhdsRMS가 MG1655 또는 MG1655 ΔdamΔdcmΔhdsRMS에서 생산된 파지 P1에 의해 감염되었다. 카나마이신 선별 하에 성장된 CFUs로 측정되는 바와 같이 감염된 이. 콜리 세포의 수가 그 후 균주들과 감염들 사이에서 비교되었다. 도 7b는 박테리오파지 LB002 +/- 메틸화에 의한 이. 콜리 및 클레브시엘라 뉴모니에로의 DNA 전달에서 차이를 보여주었다. 카나마이신 저항성 카세트를 운반하는 박테리오파지 P1이 이. 콜리 MG1655 또는 MG1655 ΔdamΔdcmΔhdsRMS (메틸라제 및 비메틸화된 DNA를 표적으로 하는 제한 효소의 결여)에서 생산되었다. 이. 콜리 R4가 MG1655 또는 MG1655 ΔdamΔdcmΔhdsRMS에서 생산된 LB002에 의해 감염되었다. 유사하게, 케이. 뉴모니에 (K. pn) R196 및 K. pn R615가 MG1655 또는 MG1655 ΔdamΔdcmΔhdsRMS에서 생산된 LB002에 의해 감염되었다. 카나마이신 선별 하에 성장된 이. 콜리 또는 K. pn CFUs에 의해 측정되는 LB002 감염 유닛이 그 후 감염들 사이에서 비교되었다. 도 7c는 +/- DNA 메틸화인 M13KO7 (M13의 변이체) 박테리오파지를 사용한 이. 콜리로의 DNA 전달을 보여주었다. M13KO7이 메틸라제 포지티브 (+) 이. 콜리 (TOP10F') 또는 메틸화 네가티브 (-) 이. 콜리 (JM110)에서 생산되었다. TOP10F', EMG2, 및 JM110 박테리아 균주가 이 후에 메틸라제 (+) 이. 콜리 또는 메틸라제 (-) 이. 콜리에서 생산된 M13KO7에 의해 감염되었다. 감염된 이. 콜리 세포의 수가 그 후 균주에 의해 비교되었다. TOP10F': dam 및 dcm을 코딩하지만 제한 효소 결여됨; EMG2: 제한-메틸화 시스템이 온전함 (비메틸화된 이중-가닥 DNA를 분해시킬 것임); JM110: dam 및 dcm을 코딩하지 않고, 제한 효소가 결여됨. 상기 데이터는 메틸라제를 갖는 박테리아에서 생산된 파지가 메틸라제가 없는 박테리아에서 생산된 파지보다 더 많은 생산 감염 (DNA 전달)을 나타내는 것을 보여주었다.
G. 이. 콜리 에서 DNA 전달 및 CRISPR-매개된 사멸
이. 콜리에 천연인 타입 I-E CRISPR-Cas 시스템이, 상기 P1 게놈이 CRISPR-Cas 시스템의 하나 이상의 구성요소들을 수용하고, 후속하여 CRISPR-매개된 사멸을 유도할 수 있는지의 문제를 설명하기 위해 사용되었다. 이를 위해, 이. 콜리 K-12 BW25113 및 pcas3 플라스미드를 갖는 이. 콜리 K-12 BW25113Δcas3의 동결된 원료가 LB 아가에서 분리를 위해 스트리킹되었고, CASCADE 및 Cas3 (타입 I-E CRISPR-Cas 시스템의 구성요소, "+cas")을 발현하거나 또는 발현하지 않는 ("-cas") 이. 콜리가 배양되었다.
특히, 개별의 콜로니가 3 ml의 LB 배지에 접종되었고, 밤새 37℃ 및 250 rpm에서 진탕되었다. 상기 배양물이 그 후 펠렛화되었고, 1 mL의 PLM (100 mM MgCl2 및 5 mM CaCl2를 포함하는 LB 배지)에 재현탁되었고, ABS600이 Nanodrop 2000c 분광광도계 (Thermo Scientific)에서 측정되었다. 상기 배양물이 PLM에서 ABS600이 0.001로 희석되었고, 각 균주가 지시된 감염 다중도 (MOI)로 ftsA를 표적으로 하는 crRNA를 발현하도록 조작된 박테리오파지 P1 (CRISPR 파지)에 의해 감염되었고; 적절한 양의 박테리오파지 용균물이 첨가되어 0을 포함하는 상이한 MOI를 달성하였다. 상기 배양물/파지 혼합물이 피펫팅에 의해 혼합되었고, 37℃ 및 250 rpm에서 진탕되었다. 박테리아 성장이 그 후 최대 7시간 동안 매 30분 마다 수행되는 측정에 의해 600nm에서 흡광도 (OD600)에 의해 측정되는 바와 같은 조건들 사이에서 비교되었다. 각 박테리아 균주에 있어서 상이한 MOIs에서 살아있는 박테리아 세포의 수가 그후에 비교되었다.
도 8a는 Cascade 및 Cas3 (타입 I-E CRISPR-Cas 시스템의 구성요소, "+cas")을 발현하거나 또는 발현하지 않는 ("-cas") 이. 콜리는, 상기 타입 I-E Cascade 및 Cas3이 게놈-표적화하는 CRISPR RNA를 구비한 P1의 전달 후에 성장에 부정적인 영향을 주는 것을 보여주는 것을 나타내었다. 기대되는 바와 같이, CRISPR-파지는 상기 "+cas" 그룹에서 개선된 성장 억제와 함께, 두 세포 타입에서 명백한 성장 지체를 보였다. 이는 파지 단독에 비해서 CRISPR-Cas 시스템의 개선된 항미생물 효과를 입증하였다.
CRISPR-파지가 MOI>1에서 두 세포 타입에서 세포를 사멸하는지가 관찰되었고, 기대되는 바와 같이 "+cas" 그룹에서 사멸이 증가되었다. 도 8b에서 개시되는 바와 같이, 타입 I-E Cascade 및 Cas3은 게놈-표적으로 하는 CRISPR RNA를 구비한 P1의 전달 후에 생존에 부정적인 영향을 주었다. CASCADE 및 Cas3 (타입 I-E CRISPR-Cas 시스템의 구성요소, "+cas")을 발현하거나 또는 발현하지 않는 ("-cas") 이. 콜리가 지시된 MOI로 ftsA를 표적으로 하는 crRNA를 발현하도록 조작된 박테리오파지 P1 (CRISPR 파지)에 의해 감염되었다. 상기 데이터는 CRISPR가 파지 단독과 비교하여 사멸을 현저하게 증가시키는 것을 명확하게 입증하였다.
또한, 상이한 위치에서 게놈-표적으로 하는 CRISPR RNA를 코딩하는 P1 게놈을 전달하여 상기 타입 I-E Cascade 및 Cas3의 존재하에 이. 콜리를 사멸시켰다. 상기 타입 II/Cas9 CRIPSR-Cas 시스템과 달리, 상기 타입 I-E CRISPR-Cas 시스템은 모든 가능한 부위에서 강력한 세포 사멸을 유도할 수 있다 (Gomaa, A. A. et al. MBio 5, e00928-913 (2014); Cui et al. Nucleic Acids Res. (2016). doi:10.1093/nar/gkw223). 이. 콜리에서 필수 ftsA 유전자를 표적으로 하는 스페이서 (Gomaa, A. A. et al. MBio 5, e00928-913 (2014))가 상기 P1 게놈의 coi/imcB, IS1, 또는 simABC 랜딩 부위로 삽입되었다. ftsA를 표적으로 하는 crRNA의 상기 P1 coi-imcB 유전자, IS1 유전자, 또는 sim 유전자로의 삽입을 포함하는 결과의 P1 박테리오파지가 그 후 상기 타입 I-E Cas 단백질 (Cas3, Cse1, Cse2, Cas5e, Cas6e, Cas7)을 발현하거나 또는 발현하지 않는 이. 콜리 BW25113 세포를 감염시키는데 사용되었다. 상기 세포가 그후 다른 MOI로 상기 박테리오파지와 혼합되었고, 박테리아 세포 밀도에서 변화 (상기 배양물의 혼탁도)가 성장 7시간 후에 측정되었다. 본 발명자들은 Cas 단백질이 결여된 세포를 갖는 모든 배양물이 세포 밀도에서 실질적인 증가를 나타내는 것을 발견하였고, 최종 혼탁도는 더 큰 MOI에서 더 낮았다 (도 8c). 대조적으로, 상기 모든 타입 I-E Cas 단백질들 (Cas3, Cse1, Cse2, Cas5e, Cas6e, Cas7)을 발현하는 세포 배양물들은 거의 또는 전혀 검출가능한 성장을 나타내지 않았으므로 (*), CRISPR/파지 처리는 성장을 제거하는 것을 보여주었다 (도 8c). 상기 결과는 CRISPR-Cas 시스템의 구성요소가 구비된 P1 게놈이 CRISPR-매개된 사멸을 유도하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내었다.
배양 동안 CRISPR/파지 처리가 감소된 생존력을 유도한다는 부가의 증거가 도 8d에 제공되었다. 타입 I-E CRISPR Cas3을 발현하는 이. 콜리가 (1) coi 유전자 대신에 ftsA를 표적으로 하는 crRNA의 게놈 삽입을 포함하는 박테리오파지 P1 또는 (2) 박테리오파지 없음에 의해 감염되었고, 살아있는 박테리아 세포의 수가 비교되었다. 파지에 노출된 이. 콜리는 생존력에서 4-log (~10000x)의 손실을 보였다. 그러므로, CRISPR가 구비된 파지의 부재에서, Cas 단백질을 갖거나 또는 갖지 않는 세포들이 모두 7시간 후에 상당한 성장을 보였다. 그러나, 상기 파지가 초기 배양물에 포함될 때, Cas 단백질의 완전한 세트를 발현하는 세포에 대해 검출가능한 성장이 관찰되지 않았다.
H. 시겔라 플렉스네리 로의 효율적인 DNA 전달
상기 P1 게놈이 에스케리치아 (Escherichia) 이외의 다른 속을 감염시키는데 사용될 수 있는지를 조사하기 위해서, 시겔라 플렉스네리의 2개의 균주가 테스트되었다. 상기 종은 전세계적으로 설사 질환인 시겔라증 (Shigellosis)과 관련이 있다. 시겔라는 매년 미국에서만 약 500,000건의 설사를 일으키고, 27,000건의 약물-저항성 감염을 포함한다. 카나마이신 저항성 마커로 대체된 imcB/coi 오페론을 갖는 P1 게놈의 전달이 측정되었다. 결과의 P1 입자가, 이. 콜리 MG1655 및 이. 콜리 BL21에 대해 관찰된 것들 사이에서 수 콜로니 형성 유닛과 함께, 상기 게놈이 두 에스. 플렉스네리 (S. flexneri) 균주로 효율적으로 전달되는지가 결정되었다 (도 9). 상기 결과는 P1 게놈이 다수의 속에서 전달 및 안정하게 유지될 수 있어, CRISPR 항미생물제에 대한 다중-종 전달 비히클로서 P1을 활용할 수 있는 가능성을 열어주었다는 것을 확인하였다.
I. 항생제 저항성 박테리아를 표적화함
본 발명자들은, 시프로플록사신-저항성 균주인 이. 콜리 R182를 사멸시키기 위해서 P1 CRISPR 파지 단독 사용과 P1 CRISPR 파지 (ftsA를 표적으로 함) 및 시프로플록사신의 조합을 비교하였다 (도 10a). 시프로플록사신 (Cip) 용량은, 상기 R182 균주가 저항성인 것으로 알려져 있는 최대 치료 관련 농도 (밀리리터 당 4 마이크로그람)이었다. 이. 콜리가 감염 다중도 (MOI)의 범위에서 이. 콜리 ftsA 유전자를 표적으로 하는 CRISPR 파지로 감염되었다. 기대되는 바와 같이, 시프로플록사신 단독은 박테리아 생존력을 감소시키지 못한다 (도 10a). 대조적으로, CRISPR 파지 MOI를 증가시키면 살아있는 박테리아 세포의 감소에서 항생제-독립적 증가를 유도한다 (도 10a).
또한, P1 CRISPR 파지 (ftsA를 표적으로 함) 및 이. 콜리 감염에서 치료 항생제의 표준인 이미페넴의 조합이, 시프로플록사신-저항성 균주인 이. 콜리 R182를 사멸시키는데 있어서 P1 CRISPR 파지 단독과 비교되었다 (도 10b). 이미페넴이 일정 용량 (이. 콜리 R182에 있어서 LD50)으로 유지되었고, 기준 0.3-log CFU 감소를 유도하였다. 상기 이. 콜리 세포가 MOI의 범위에서 CRISPR 파지로 감염되었다. MOI 2에서, 파지 또는 항생제 단독에 대해 조합 치료의 상당한 효과 (P<0.05)가 관찰되었다. 더 높은 MOIs에서, 상기 CRISPR 파지는 지배적인 사멸 효과를 발휘하였고, 이는 파지 + 항생제 조합이 부가의 효과를 가질 수 있음을 시사하였다.
마지막으로, 본 발명자들은 이미피넴 (imipinem), ftsA를 표적으로 하는 P1 CRISPR 파지 또는 그 둘의 조합에 노출시킨 후에 살아있는 이. 콜리 R182 세포의 손실을 비교하였다 (도 10c). 관련 조건에 있어서 (각 조건에 대해 n = 3), 이미페넴이 일정 용량으로 유지되었고 (이. 콜리 R182에 대해 LD50), CRISPR 파지가 MOI 2로 유지되었다. 박테리아 사멸이 이미피넴이 있거나 또는 없는 CRISPR 파지 감염시키고 120분에 관찰되었다.
J. 마우스에서 이. 콜리 감염을 표적화함
이. 콜리를 표적으로 하는 CRISPR 파지는 대퇴부 근육 감염의 마우스 모델에서 살아있는 박테리아 수를 감소시켰다 (도 11a). 마우스에게 1.6x106 CFU의 이. 콜리를 근육내 대퇴부 주사로 투여한 후 ftsA를 표적으로 하는 CRISPR 파지의 1.9x1011 pfu 또는 50uL TBS (치료 조절 없음)를 근육내 대퇴부 주사로 파지 치료하였다. 대퇴부 조직으로부터 살아있는 박테리아 수가 파지 치료 후 30, 60, 120, 180, 및 240분에서 측정되었다. 파지 치료로 약 0.3-log 감소를 일정하게 유도하는 것이 관찰되었고, 박테리아 수에서 감소는 2개의 시점 (P<0.05) 및 (P<0.001)에서 통계적으로 유의했다.
도 11b는 이. 콜리를 표적으로 하는 CRISPR 파지가 마우스 모델에서 동물 생존 시간을 증가시키는 것을 보여주었다. 마우스가 5% 돼지 (hog) 뮤신 (mucin) 중 1.5x107 CFU의 용량으로 이. 콜리 균주 R260으로 IP (복강내) 주사에 의해 감염되었고, 그 후 이. 콜리 유전자 ftsA를 표적으로 하는 CRISPR 파지의 단일 용량 (용량 = 1.9x10^11 pfu, MOI 약 100)으로 IP 주사로 치료하거나 또는 치료하지 않고 두었다. 단일-용량 파지 치료로 마우스 생존을 상당히 연장시키는 것이 결정되었다 (Wilcoxon 검정, P<0.05).
K. 이. 콜리 또는 케이. 뉴모니아 ( K. pneumonia )의 다양한 균주를 사멸시키기 위한 CRISPR RNAs를 전달하는 파지의 능력
ftsA를 표적으로 하는 crRNA를 발현하는 타입 I CRISPR 파지 입자가 이. 콜리로 구성된 균주의 라이브러리를 감염시키는데 사용되었다. 표 3 및 표 5의 요약에 CRISPR 파지 감염 후에 각 균주에 있어서 치료되지 않은 성장 조절과 비교하여 박테리아 개체의 감소가 보고되었다. 상기 데이터는 파지가 이. 콜리 균주에 대해 CRISPR 구조물을 전달할 수 있다는 것을 입증하였다.
[표 3]
배경에 대해 검출된 KanR 콜로니로서 정의된 P1에 대한 민감도
Figure pat00001
Figure pat00002
* CFUs에서 감소는 치료되지 않은 (파지 없음) 대조군에서 성장한 CFUs의 수에 비례한다.
또한, ftsA를 표적으로 하는 crRNA를 발현하는 타입 I CRISPR 파지가 클레브시엘라 뉴모니에로 구성된 균주들의 라이브러리를 감염시키는데 사용되었다. 표 4 및 표 5의 요약에 CRISPR 파지 감염 후에 각 균주에 대한 치료되지 않은 성장 조절과 비교하여 박테리아 개체에서 감소가 보고되었다. 상기 데이터는 파지가 클레브시엘라 균주에 대해 CRISPR 구조물을 전달할 수 있다는 것을 입증하였다.
[표 4]
배경에 대해 검출된 KanR 클레브시엘라 (Kleb) 콜로니로서 정의된 P1에 대한 민감도
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
[표 5]
표 3 및 표 4로부터 취해진 ftsA를 표적으로 하는 CRISPR 파지에 의해 사멸된 이. 콜리 및 케이. 뉴모니에 (Kleb)의 임상적 분리물의 요약
Figure pat00006
Figure pat00007
L. 연장된 스페이서 길이는 사멸을 유도함
야생형 길이가 아닌 CRISPR RNA 스페이서를 갖는 타입 I-E 시스템은 세포 사멸을 유도할 수 있다. 32-nt 스페이서 (야생형 길이) (+0) 또는 44-nt 스페이서 (+12)를 갖는 CRISPR RNAs가 이. 콜리 MG1655 게놈에서 lacZ 유전자 주위에 4개의 위치 (p1, as1, p2 및 s1)를 표적으로 하도록 디자인되었다 (도 12). 상기 표적 서열과 실질적으로 동일하도록 44-nt 스페이서의 3' 말단에서 연장이 수행되었다. 반복-스페이서-반복으로서 각 CRISPR RNA를 발현하는 플라스미드가 타입 I-E Cas3 및 Cascade 단백질을 발현하는 이. 콜리 MG1655로 형질전환되었다. 형질전환 효율에서의 저하는 게놈 공격 및 세포 사멸을 반영하고, 소수의 세포만이 표적 서열, 스페이서 또는 Cas 단백질에 대한 돌연변이화를 통해 사멸을 피할 수 있다. 데이터에 개시된 바와 같이, 모든 디자인된 CRISPR RNAs는 스페이서가 없는 대조군과 비교하여 형질전환 효율에서 103 내지 105의 감소를 유도하였고, 이는 더 긴 스페이서를 갖는 CRISPR RNAs가 표적된 사멸을 유도할 수 있음을 입증하였다. 더 큰 복합체가 여전히 Cas3을 모집 및 활성화시킬 수 있다는 것은 놀랍다. 결정 구조는 전체 복합체에 대해 발생하는 더 큰 입체적 변화가 Cas3을 활성화하는데 필요하다는 것을 시사하고 (Mulepati et al. Science 345(6203):1479-84 (2014); Jackson et al. Science 345(6203):1473-9 (2014); Rutkauskas et al. Cell Rep pii: S2211-1247(15)00135-7 (2015); Gong et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 111(46):16359-64 (2014)), 부가의 단백질 서브유닛을 추가하는 것은 입체형태 변화를 파괴할 수 있을 것으로 예상되었다. 상기 데이터는 이러한 현상이 발생되지 않았고, 연장된 스페이서가 형질전환 효율에서 유사한 감소에 기반하여 일반적-길이의 스페이서와 유사한 수준의 사멸을 유도하는 것을 보여주었다.
M. 이. 콜리 로부터의 타입 I-E CRISPR-Cas 시스템 또는 바실루스 할로두란스 로부터의 타입 I-C CRISPR-Cas 시스템을 코딩하는 박테리오파지 입자
이. 콜리로부터의 전체 타입 I-E CRISPR-Cas 시스템 또는 바실루스 할로두란스로부터의 타입 I-C CRISPR-Cas 시스템이 상기 P1 박테리오파지 게놈으로 코딩되었고, 이. 콜리의 표적화된 사멸을 입증하는데 사용되었다. 각 경우에, 타입 I-C CRISPR-Cas 시스템 또는 타입 I-E CRISPR-Cas 시스템 (예컨대, 타입 I-E Cascade 또는 타입 I-C Cascade 폴리펩티드 및 Cas3 폴리펩티드) 뿐만 아니라 CRISPR 어레이를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 상기 파지 게놈의 선별된 부위 (예컨대, 통합의 불필요한 부위 또는 통합의 보충 부위)에서 상기 P1 게놈으로 도입되었다. 타입 I-C CRISPR-Cas 시스템 또는 타입 I-E CRISPR-Cas 시스템을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 PCR을 사용하여 소스 (source) 균주로부터 합성 또는 증폭되었고, 공여체 플라스미드 벡터 (예: pKD3, pKD13, 또는 기타)로 클로닝되었다. 상기 P1에서 선별된 랜딩 부위에 매칭되는 동종 영역 및 특정 항생제 저항성을 갖는 공여체 벡터가 디자인되었다. 동종 재조합을 사용하여, 타입 I-C CRISPR-Cas 시스템 또는 타입 I-E CRISPR-Cas 시스템을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 상기 생산 균주에 존재하는 P1 리소겐으로 클로닝되었다. 포지티브 클론이 항생제 저항성에 의해 선별되었다. 상기 항생제 저항성 마커가 리콤비나제 (recombinase) 부위 (예컨대 FRT 부위)에 의해 플랭크된다면, 상기 저항성 마커가 당 분야에 알려져 있는 바와 같이 리콤비나제의 발현에 의해 절제될 수 있다.
동일한 접근방식에 따라, 게놈-표적으로 하는 crRNAs를 코딩하는 CRISPR 어레이가 cas 유전자에 대해서보다 상이한 랜딩 부위 통합 부위에서 P1 게놈으로 코딩되었다. 표적 균주에 존재하지만, 상기 생산 균주에 존재하지 않는 특정 서열을 표적으로 하는 CRISPR 어레이가 디자인되었다.
상기 파지 입자가 그 후 생산되었고, 상기 표적 박테리아 균주로 투여되었고, 살아있는 콜로니 수가 계수되었다. 일부 양태에서, 상기 파지 입자가 상기 표적 숙주 박테리아의 메틸화 패턴과 실질적으로 유사한 메틸화 패턴을 갖는 생산 숙주 박테리아 균주를 사용하여 생산되었다. 상기 디자인된 파지는 파지 없음 또는 비-표적화된 파지와 비교하여 살아있는 콜로니의 수가 크게 감소되어야 한다.
토의
광범위한-숙주 P1 박테리오파지가 DNA를 다수의 박테리아 종으로 효율적으로 전달하는 것이 입증되었고, 그러므로 CRISPR 항미생물제의 전달을 위한 플랫폼으로 사용될 수 있다. 광범위한-숙주 박테리오파지의 한가지 장점은 단일 플랫폼이 단일, 산업 생산 균주로부터 생산될 수 있고, 박테리아 범위에 대해 적용될 수 있다는 것이다. 예를 들면, P1 입자가 공생형 (commensal) 이. 콜리의 산업 균주에서 형성될 수 있고, 그 후 장출혈성 이. 콜리, 시겔라, 또는 클레브시엘라와 같은 장 병원균에 의한 감염에 대처하는데 사용될 수 있다. 감염성 균주로부터 생산 균주를 분리하는 능력은 동일한 병원체에 대한 박테리오파지 입자를 생산하도록 박테리아 병원체의 대량 배치 (batch)를 배양하는 생물제조 과제를 해결한다. 또한 CRISPR 어레이를 단순히 변경하여 다른 종을 표적으로 하도록 상기 항미생물제를 용이하게 변형시킬 수 있는 가능성을 창출한다.
전술한 내용은 본 발명의 예시이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 본 발명은 하기 청구 범위와 그에 포함되는 상기 청구 범위의 등가물에 의해 정의된다.

Claims (14)

  1. 적어도 하나의 표적 박테리아 종을 선별적으로 사멸시키기 위한 박테로파지 DNA를 포함하는 박테리오파지 입자로서,
    상기 박테리오파지는 타입 I CRISPR 어레이를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 하나 이상의 타입 I Cascade 폴리펩티드; 및 Cas3 폴리펩티드, 또는 Cas3'폴리펩티드 및 Cas3" 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 타입 I CRISPR-Cas 시스템을 포함하고,
    상기 타입 I CRISPR 어레이는 상기 적어도 하나의 표적 박테리아 종에서의 표적 DNA에 대해 적어도 70%의 상보성을 갖는 적어도 하나의 스페이서를 포함하고,
    상기 타입 I CRISPR-Cas 시스템은 상기 박테리오파지 DNA에 통합되고, 상기 박테리오파지는 파지미드가 아닌 것인, 박테리오파지 입자.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 타입-I CRISPR 어레이는 불필요한 부위 (dispensable site) 또는 보충 부위 (complemented site)에서 상기 박테리오파지 DNA로 통합되는 것인 박테리오파지 입자.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 불필요한 부위는 (a) 파지-코딩된 제한-변형 시스템, (b) 중복감염 (superinfection)을 차단하는 유전자, (c) 제한-변형 시스템의 저해인자, (d) 삽입 서열 요소, (e) 중독 시스템 (addiction system) 또는 (f) 이들의 임의의 조합인 것인 박테리오파지 입자.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 보충 부위는 (a) 용균 주기 (lytic cycle)의 활성인자, (b) 용균 유전자, (c) tRNA, (d) 입자 구성요소, 또는 (e) 이들의 임의의 조합인 것인 박테리오파지 입자.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타입-I CRISPR 어레이는 적어도 둘 이상의 반복 서열을 포함하는 것인 박테리오파지 입자.
  6. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타입-I CRISPR 어레이는 반복-스페이서-반복 서열, 또는 적어도 둘 이상의 반복-스페이서 서열을 포함하고, 상기 적어도 둘 이상의 반복 스페이서 서열은 적어도 제1 반복 스페이서 서열 및 최종 반복 스페이서 서열을 포함하고, 상기 제1 반복 스페이서 서열의 스페이서의 3' 말단이 다음 반복 스페이서 서열의 반복의 5' 말단에 연결되고, 상기 최종 반복 스페이서 서열이 3' 말단에서 반복에 연결되는 것인 박테리오파지 입자.
  7. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 박테리아 종 또는 균주는 항생제-저항성인 것인 박테리오파지 입자.
  8. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리오파지는 광범위한 박테리아로 그 유전 물질을 주입할 수 있는 것인 박테리오파지 입자.
  9. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리오파지는 용원성 (lysogenic) 또는 용균성 (lytic) 특성을 갖는 잠재성 박테리오파지인 것인 박테리오파지 입자.
  10. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리오파지는 용균성 특성을 갖는 용균성 박테리오파지인 것인 박테리오파지 입자.
  11. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 스페이서는 상기 적어도 하나의 표적 박테리아 종에서의 표적 DNA에 대해 100%의 상보성을 갖는 것인 박테리오파지 입자.
  12. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타입 I CRISPR 어레이는 상기 적어도 하나의 표적 박테리아 종에 통합되지 않는 것인 박테리오파지 입자.
  13. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 박테리아 종은 슈도모나스 종 (Pseudomonas spp.), 에스케리치아 종 (Escherichia spp.), 및/또는 스타필로코쿠스 종 (Staphylococcus spp.) 으로부터 선택되는 것인 박테리오파지 입자.
  14. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 박테리아 종은 슈도모나스 에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli), 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로부터 선택되는 것인 박테리오 입자.
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