CN107922918B

CN107922918B - 用于有效递送核酸和基于rna的抗微生物剂的方法和组合物

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Publication number: CN107922918B
Application number: CN201680031757.4A
Authority: CN
Inventors: C·L·拜赛尔; A·A·M·戈玛; M·罗
Original assignee: North Carolina State University
Current assignee: North Carolina State University
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2016-06-15
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2036-06-15
Also published as: AU2016280002B2; FI3307872T3; KR102468240B1; KR20180008917A; JP2018518163A; US20180155729A1; US20210403926A1; EP3307872A1; AU2016280002A1; JP2022104951A; JP2023109907A; AU2022204576A1; EP3307872B1; HK1254074A1; WO2016205276A1; CN107922918A; DK3307872T3; JP7051438B2; KR20220158846A; CA2983874C

Abstract

本发明涉及修饰噬菌体DNA或噬菌粒DNA的甲基化模式的方法以及涉及利用溶源性噬菌体选择性杀灭细菌的方法，所述溶源性噬菌体包含具有工程化CRISPR‑Cas系统的组分的噬菌体DNA或噬菌粒DNA。

Description

用于有效递送核酸和基于RNA的抗微生物剂的方法和组合物

优先权声明

本申请根据美国法典第35章第119条第(e)款(35U.S.C.§119(e))要求于2015年6月15日提交的美国临时专利申请No.62/175,749的权益，将该专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。

关于联邦资助的声明

本发明受到国家科学基金政府资助，资助号为No.MCB-1452902。政府在本发明中享有一定权利。

技术领域

本申请涉及用于改变噬菌体DNA和噬菌粒DNA的甲基化模式的方法和组合物。本发明还涉及利用噬菌体选择性杀灭细菌的方法和组合物，所述噬菌体包含具有工程化CRISPR-Cas系统的组分的噬菌体DNA或噬菌粒DNA。

背景技术

成簇的规律间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats,CRISPR)与CRISPR相关基因(cas)相结合构成了CRISPR-Cas系统，该系统在许多细菌和大多数古细菌中赋予获得性免疫。CRISPR介导的免疫通过整合来自侵入性遗传元件诸如质粒和噬菌体的DNA来形成，该免疫可用于避免未来受到含有相同序列的侵入者的感染。

CRISPR-Cas系统由CRISPR阵列和一组旁侧cas基因组成，该CRISPR阵列为由高变“间隔区”序列间隔的短DNA“重复”。该系统通过对外来核酸的序列特异性靶向和干扰，提供针对侵入性遗传元件诸如噬菌体和质粒的获得性免疫力(Barrangou等人，2007.Science.315:1709-1712；Brouns等人，2008.Science 321:960-4；Horvath和Barrangou.2010.Science.327:167-70；Marraffini和Sontheimer.2008.Science.322:1843-1845；Bhaya等人，2011.Annu.Rev.Genet.45:273-297；Terns和Terns.2011.Curr.Opin.Microbiol.14:321-327；Westra等人，2012.Annu.Rev.Genet.46:311-339；BarrangouR.2013.RNA.4:267-278)。通常，将侵入性DNA序列以新的“间隔区”形式获得(Barrangou等人，2007.Science.315:1709-1712)，每个这种新“间隔区”与CRISPR重复配对并作为新的重复-间隔区单元插入CRISPR基因座中。“间隔区”由所有CRISPR-Cas系统普遍具有的Cas1蛋白和Cas2蛋白获得(Makarova等人，2011.Nature Rev.Microbiol.9:467-477；Yosef等人，2012.Nucleic Acids Res.40:5569-5576)，在一些系统中有Cas4蛋白参与(Plagens等人，2012.J.Bact.194:2491-2500；Zhang等人，2012.PLoS One 7:e47232)。所得的重复-间隔区阵列转录为长的前CRISPR RNA(pre-crRNA)(Brouns等人，2008.Science 321:960-4)，该前CRISPR RNA被加工成CRISPR RNA(crRNA)，其驱动DNA或RNA的序列特异性识别。具体而言，crRNA将核酸酶引向互补的靶标以进行由Cas核酸内切酶介导的序列特异性核酸切割(Garneau等人，2010.Nature.468:67-71；Haurwitz等人，2010.Science.329:1355-1358；Sapranauskas等人，2011.Nucleic Acid Res.39:9275-9282；Jinek等人，2012.Science.337:816-821；Gasiunas等人，2012.Proc.Natl.Acad.Sci.109:E2579-E2586；Magadan等人，2012.PLoS One.7:e40913；Karvelis等人，2013.RNA Biol.10:841-851)。

这种普遍的系统在几乎一半的细菌(约46％)和绝大部分古细菌(约90％)中出现。基于驱动crRNA生物发生的生化过程中的cas基因含量、组织和变化以及介导靶标识别和切割的Cas蛋白复合物，将它们分成六个主要类型(Makarova等人，2011.NatureRev.Microbiol.9:467-477；Makarova等人，2013.Nucleic Acid Res.41:4360-4377；Makarova等人，2015.Nature Rev.Microbiol.13:722-736；Shmakov等人，2015.Mol.Cell.60:385-397)。在I型和III型中，专门的Cas内切核酸酶加工前crRNA，其然后组装成能够识别并切割与该crRNA互补的核酸的大的多Cas蛋白质复合物。在II型CRISPR-Cas系统中涉及不同的加工。这里，通过其中反式激活性crRNA(tracrRNA)与crRNA的重复区杂交的机制对前crRNA进行加工。RNA酶III切割该杂交的crRNA-tracrRNA，接下来的第二个事件是移除每个间隔区的5’端，产生保持与tracrRNA和Cas9二者相缔合的成熟crRNA。该成熟复合物定位与该复合物中的间隔区序列互补的靶标dsDNA序列(“原间隔区(protospacer)”序列)并切开这两条链。II型系统中的复合物进行的靶标识别和切割不仅需要crRNA-tracrRNA复合物上的间隔区序列与靶标“原间隔区”序列(本文定义为与间隔区序列互补的链)之间互补的序列，还需要位于原间隔区序列5’端的原间隔区相邻基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列。不同的II型系统之间所需要的确切PAM序列可以不同。

I型系统在细菌中以及古细菌中最普遍(Makarova等人，2011.NatureRev.Microbiol.9:467-477)并且靶向DNA(Brouns等人，2008.Science 321:960-4)。称为CRISPR相关抗病毒防御复合体(Cascade)的3至8种Cas蛋白的复合物可加工pre-crRNA(Brouns等人，2008.Science 321:960-4)，保留crRNA来识别与crRNA的间隔区部分互补的称为“原间隔区”的DNA序列。除了crRNA间隔区与原间隔区之间的互补性外，靶向还需要位于原间隔区3'端的原间隔区相邻基序(PAM)(Mojica等人，2009.Microbiology 155:733-740；Sorek等人，2013.Ann.Rev.Biochem.82:237-266)。对于I型系统，PAM直接由Cascade识别(Sashital等人，2012.Mol.Cell46:606-615；Westra等人，2012.Mol.Cell 46:595-605)。不同的I型系统之间所需的确切的PAM序列可以变化并且可通过确立的生物信息学和实验程序鉴定(Esvelt等人，2013.Nat.Methods10:1116-11121；Jiang等人，2013.Nat.Biotechnol.31:233-239；Mojica等人，2009.Microbiology 155:733-740)。一旦识别原间隔区，则Cascade通常募集核酸内切酶Cas3，后者切割并降解靶标DNA(Sinkunas等人，2011.EMBO J.30:1335-1342；Sinkunas等人，2013.EMBO J.32:385-394)。

噬菌体是依赖于宿主的细胞机制来复制的细菌病毒。一般而言，噬菌体通常分成三类：裂解性噬菌体、溶原性噬菌体和温和性噬菌体。裂解性噬菌体感染宿主细胞，经历数轮复制，并触发细胞溶解以释放新制备的噬菌体颗粒。溶原性噬菌体永久性地存在于宿主细胞中，处于细菌基因组内或作为染色体外质粒存在。温和性噬菌体能够成为裂解性的或溶原性的，并且根据细胞的生长条件和生理状态来二选一。

追溯到20世纪50年代，噬菌体就已用于包装和递送合成的DNA(Lennox,E.s.,Virology 1(2):190-206(1950))。在这时期，已经采用了三种通用方法。在第一种方法中，将合成的DNA随机重组进噬菌体基因组中，这通常涉及可选择标记。在现代分子生物学技术到来之前的早期噬菌体工作中通常使用这种方法。在第二种方法中，将噬菌体内的限制性位点用于体外引入合成的DNA。大肠杆菌λ噬菌体是最好的例子，其中具有掺入的限制性位点的λ噬菌体的一些商业来源可供利用(Chauthaiwale等人，Microbiol.Rev.56,577-591(1992))。在第三种方法中，将通常编码噬菌体包装位点和裂解性复制起点的质粒作为噬菌体颗粒装配的一部分进行包装(Westwater et al.Microbiol.Read.Engl.148,943-950(2002)；Sternberg,N.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,103-107(1990))。所得的质粒已被创造为‘噬菌粒’。噬菌粒已主要用于递送独立的基因或构建体，例如用以对内源途径进行重新编程或用以诱导细胞死亡(Sternberg,N.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,103-107(1990)；Lu&Collins.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104,11197-11202(2007)；Citorik等人，Nat.Biotechnol.(2014)32(11):1141-1145；Bikard等人，Nat.Biotechnol.(2014)32(11):1146-1150；Kittleson等人，ACS Synth.Biol.1,583-589(2012))。

大多数噬菌体因为进化的原因而局限于给定的菌株。将它们的遗传物质注入不相容的菌株将会达不到预期目标，所以噬菌体已进化成特异性地感染有限的菌株。然而，已发现一些噬菌体可将它们的遗传物质注入各种各样的细菌中。经典的例子为P1噬菌体，其已显示可将DNA注入一系列革兰氏阴性细菌(其中有一些大大超出其天然的大肠杆菌宿主)中(Westwater et al.Microbiol.Read.Engl.148,943-950(2002)；Kaiser&Dworkin.Science187,653-654(1975)；O’Connor et al.J.Bacteriol.155,317-329(1983)。

尽管诸如P1之类的噬菌体可提供用于递送合成DNA的一般性平台，但它们面临普遍存在的障碍：限制-修饰(R-M)系统。这些细菌防御系统由在特定序列中使DNA甲基化的甲基化酶(甲基转移酶)和/或限制性内切酶组成，该限制性内切酶切割未甲基化的DNA(I型、II型、III型)或切割甲基化的DNA(IV型)。当这些系统遇到具有外来的甲基化模式的DNA时，限制性酶在多个位置切割该DNA，从而限制修复的潜能。确实经历甲基化的任何外来DNA可避开限制性内切酶，但这种情况的可能性很低。因为大多数细菌编码产生独特甲基化模式的多种R-M系统，将合成DNA引入随机细菌可具有重大挑战。

本发明通过提供用于修饰噬菌体和噬菌粒DNA甲基化的方法以及将噬菌体颗粒用于递送靶向基因组的CRISPR-Cas系统的方法和组合物，克服了本领域以前的缺点。

发明内容

在一个方面，提供了一种修饰噬菌体DNA或噬菌粒DNA的甲基化模式的方法，包括：改变生产宿主细菌的甲基化活性，包括：(1)破坏生产宿主细菌的内源限制修饰系统(R-M系统)的至少一种酶的活性，由此产生内源R-M系统的至少一种酶的活性被破坏的经修饰的生产宿主细菌，以及/或者(2)将编码至少一种异源甲基转移酶的多核苷酸引入生产宿主细菌中，由此产生表达所述异源甲基转移酶的经修饰的生产宿主细菌；用包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒感染具有经改变的甲基化活性的所述经修饰的生产宿主细菌，由此使所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA甲基化；以及产生包含具有经修饰的甲基化模式的噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒。在一些方面，所述感染步骤可在改变所述生产宿主细菌的甲基化活性的步骤之前进行。

在另一个方面，提供了一种修饰噬菌体DNA或噬菌粒DNA的甲基化模式的方法，包括：用包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒感染生产宿主细菌，其中所述生产宿主细菌通过破坏内源R-M系统的至少一种酶和/或表达至少一种异源甲基转移酶而具有改变的甲基化活性，由此使所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA甲基化；以及产生包含具有经修饰的甲基化模式的噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒。

在另一方面，本发明提供一种增加通过噬菌体将所关注的异源核酸引入靶标宿主细菌的效率的方法，包括：用包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒感染生产宿主细菌，所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含至少一种所关注的异源核酸，其中所述生产宿主细菌具有通过破坏内源限制修饰系统(R-M系统)的至少一种酶和/或表达至少一种异源甲基转移酶而改变的甲基化活性，由此使所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA甲基化；产生噬菌体颗粒，其包含具有经修饰的甲基化模式并且包含/编码所述至少一种所关注的异源核酸的噬菌体DNA或噬菌粒DNA；以及用所述噬菌体颗粒感染靶标宿主细菌，其中所述靶标宿主细菌具有的甲基化模式(或R-M系统)与所述生产宿主细菌的甲基化模式(或R-M系统)实质上相似(即相容)，由此增加将所述所关注的异源核酸引入所述靶标宿主噬菌体的效率。

在一些方面，提供了通过本发明方法产生的噬菌体颗粒。本发明的另一方面提供了一种噬菌体颗粒，其包含具有经修饰的DNA甲基化模式的噬菌体DNA或噬菌粒DNA，所述经修饰的DNA甲基化模式与靶标宿主细菌的限制-修饰系统实质上相似。在一些方面，在用所述噬菌体感染所述生产宿主细菌之前，将至少一种所关注的异源核酸引入所述噬菌体DNA或所述噬菌粒DNA中，由此使所述至少一种所关注的异源核酸连同所述噬菌体DNA或所述噬菌粒DNA一起甲基化。在另外的方面，所述至少一种所关注的异源核酸编码CRISPR阵列(如I型或II型CRISPR阵列)。在另外的方面，所述至少一种所关注的异源核酸编码重组I型CRISPR-Cas系统或重组II型CRISPR-Cas系统。

本发明的另一个方面提供一种噬菌体颗粒，其包含具有编码II型CRISPR阵列的多核苷酸的噬菌体DNA。在另一个方面提供了一种噬菌体颗粒，其包含具有编码I型CRISPR阵列的多核苷酸的噬菌体DNA或噬菌粒DNA。

本发明的另一方面提供了一种包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒，其中所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含重组II型CRISPR-Cas系统，所述系统包含：(a)编码Cas9多肽的多核苷酸；(b)编码CRISPR阵列的多核苷酸；和c)tracr核酸，任选地其中所述编码CRISPR阵列的多核苷酸和所述tracr核酸彼此融合以形成单一向导核酸。

本发明的另一个方面提供了一种包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒，其中所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含重组I型CRISPR-Cas系统，所述系统包含：(a)编码CRISPR阵列的多核苷酸；和(b)编码一种或多种I型CRISPR多肽的至少一种多核苷酸。在一些方面，I型CRISPR多肽包含I型Cascade多肽，和编码Cas3多肽、Cas3'多肽和Cas3”多肽的多核苷酸。

在一个另外的方面，所述I型CRISPR阵列、所述II型CRISPR阵列、所述I型CRISPR-Cas系统或所述II型CRISPR-Cas系统、所述编码Cas9多肽的多核苷酸、所述tracr核酸和/或编码一种或多种I型CRISPR多肽的所述至少一种多核苷酸在非必需位点或在弥补位点整合进所述噬菌体DNA中。

本发明的另一个方面提供了选择性杀灭至少一种靶标细菌物种或菌株的方法，包括：使所述至少一种靶标细菌物种或菌株与本发明的噬菌体颗粒接触，其中包含在所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA中的所述CRISPR阵列包含至少一个间隔区，所述间隔区与所述至少一种靶标细菌物种或菌株中的靶标DNA实质上互补。在本发明的一些方面，在不同于靶标细菌物种或菌株的细菌物种或菌株中产生所述噬菌体颗粒。

本发明还提供了包含本发明的重组核酸分子、CRISPR阵列和/或异源多核苷酸的噬菌体颗粒、表达盒和细胞。

下面在本发明的具体实施方式中更详细地描述本发明的这些方面及其它方面。

附图说明

图1提供了生成作为递送CRISPR抗微生物剂的平台的噬菌体颗粒的通用方法概览。

图2A-2B显示来自不具有甲基转移酶的菌株的质粒DNA不被靶向甲基化DNA的限制性内切酶降解。来自大肠杆菌菌株MG1655的DNA在左边两个泳道中，来自大肠杆菌菌株MG1655ΔdamΔdcmΔhsdRMS(缺少甲基转移酶基因)的DNA在右边两个泳道(图2A)。所述DNA在有(+)或没有(-)Dpn1的情形下温育。图2B示出了从在甲基转移酶阳性大肠杆菌菌株中产生的P1噬菌体颗粒提取的dsDNA。泳道1：VWR 2-log DNA分子量标准。泳道2、4、6：来自dam+dcm+大肠杆菌中产生的噬菌体的DNA。泳道3、5、7：来自dcm-dam-大肠杆菌中产生的噬菌体的DNA。泳道2-3：用AleI、NheI和XhoI消化的DNA。泳道4-5：用AleI、NheI、XhoI和DpnII消化的DNA。泳道6-7：用AleI、NheI、XhoI和StyD41消化的DNA。DNA大小标记在左边示出。

图3A-3B示出了噬菌体基因组中的不同位点用于引入合成序列的用途。图3A提供了显示将合成DNA序列引入进P1噬菌体基因组中的示意图。IS1和simABC为噬菌体P1基因组内的非必需基因，coi/imcB为仅需要用于触发裂解周期的可弥补基因。coi/imcB功能可通过来自质粒载体的coi基因的诱导表达来补偿。图3B示出了P1基因组的有效递送，其中kan抗性基因被整合进该噬菌体基因组中的不同位点(着陆位点(landing site))。

图4A-4B显示破坏simAB可允许第二噬菌体的再感染和维持。图4A提供了测试超感染的实验程序。将带有P1-ΔimcB/coi::kan^R(LB001)或P1-ΔsimABC::kan^R(LB002)的细胞用噬菌体P1-ΔimcB/coi::cm^R感染并平板接种于kan、cm和kan+cm平板上。图4B示出了P1-ΔimcB/coi::cm^R在带有P1-ΔimcB/coi::kan^R或P1-ΔsimABC::kan^R的细胞中的递送效率。*意指未检测到集落。

图5A-5B示出了P1基因组的P1颗粒包装和递送与P1噬菌粒的包装和递送的并排比较。图5A提供了示意图，示出了P1基因组或工程噬菌粒的包装和递送。图5B显示相比于P1噬菌粒，P1颗粒更有效地包装并将P1基因组递送进大肠杆菌MG1655和BL21中。

图6显示P1基因组(P1coi-icmB::kanR)可在不同的环境条件下递送。缩写：LB(Luria Broth)；基本培养基(M9葡萄糖)，血清(胎牛血清)。

图7A-7C示出了经由噬菌体的DNA递送。图7A示出了使用具有+/-DNA甲基化的P1噬菌体(即在DNA甲基化(+)或DNA甲基化(-)的细菌中产生的P1)将DNA递送至大肠杆菌。比较菌株和感染之间受感染大肠杆菌细胞的数目(通过在卡那霉素选择下生长的CFU测量)。图7B示出了由噬菌体LB002+/-甲基化递送DNA至大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌的差异。然后比较感染之间的LB002感染单位(通过在卡那霉素选择下生长的大肠杆菌或肺炎克雷伯杆菌CFU测量)。图7C示出了使用+/-DNA甲基化的M13变体噬菌体将DNA递送至大肠杆菌。然后按照菌株比较受感染的大肠杆菌细胞的数目。TOP10F’：编码dam和dcm但缺少限制性内切酶；EMG2：限制-甲基化系统是完整的(将降解未甲基化的双链DNA)；JM110：不编码dam和dcm并且缺少限制性酶。

图8A显示在递送配有靶向基因组的CRISPR RNA的P1后，I-E型Cascade和Cas3负面影响生长。通过在600nm下的吸光度(OD600)测量细菌生长。图8B显示在递送配有靶向基因组的CRISPR RNA的P1后，I-E型Cascade和Cas3负面影响存活。然后比较每种菌株在不同感染复数(MOI)下的存活细菌细胞的数目。图8C-8D显示递送P1基因组在存在I-E型Cascade和Cas3的情况下杀灭大肠杆菌，该P1基因组在不同位置编码靶向基因组的CRISPR RNA。图8C显示CRISPR/噬菌体处理可消除生长，而图8D显示在培养期间CRISPR/噬菌体处理导致了活力降低。

图9示出了噬菌体P1imcB-coi::kanR有效递送至弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)的两个菌株。

图10A-10C.图10A中证明了CRISPR噬菌体(靶向ftsA)能杀灭抗生素抗性细菌。Cip＝环丙沙星。图10B显示当与有效抗生素组合时CRISPR噬菌体发挥累加的抗微生物效果。IM＝亚胺培南。图10C显示在存在或不存在抗生素亚胺培南的情况下CRISPR噬菌体在120分钟内杀灭大肠杆菌。

图11A-11B显示在大腿肌感染的小鼠模型中靶向大肠杆菌的CRISPR噬菌体可降低活菌计数(图11A)，并且显示在小鼠模型中靶向大肠杆菌的CRISPR噬菌体可增加动物存活时间(图11B)。

图12显示I-E型系统中延长的CRISPR RNA间隔区可引发细胞杀灭。测试了间隔区长度为32nt(+0)和44nt(+12)的重复-间隔区-重复(阵列)，其中天然(野生型)I-E型系统依赖于长度为32nt的间隔区。所用的间隔区(p1、as1、p2和s1)靶向lacZ，如图12顶部的lacZ基因的示意图中所示。在图12中部提供了DNA干扰过程的示意图，示出了间隔区和Cascade复合物结合至基因组DNA并随后募集Cas3。图12底部提供了曲线图，其示出了编码所测四种间隔区每一者的质粒相对于非靶向质粒而言转化进表达I-E型蛋白(Cas3、Cascade)的大肠杆菌MG1655细胞的转化效率。相对于编码非靶向间隔区的质粒报告转化效率。

发明详述

现在将在下文参照附图和实施例描述本发明，其中示出了本发明的实施方案。这些描述并非意图成为可实施本发明的所有不同方式或可给本发明增加的所有特征的详细目录。例如，针对一个实施方案所示例的特征可并入其它实施方案中，并且针一个对具体实施方案示例的特征可从该实施方案删除。因而，本发明设想，在本发明的一些实施方案中，可排除或忽略本文所述的任何特征或特征组合。此外，根据本公开，针对本文所提出的各种实施方案的许多变型和添加对于本领域技术人员将是显而易见的，其不脱离本发明。从而，下面的描述旨在示例本发明的一些具体的实施方案，而不是穷举性地说明所有排列、组合或其变型形式。

除非另外定义，否则本文使用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一致。在本文的描述中所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案而无意于限制本发明。

本文所引用的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以引用的方式全文并入，用于与所述参考文献所存在的句子和/或段落相关的教导。

除非上下文中另外指明，否则特别意图本文所述的本发明的各种特征可以以任何组合使用。此外，本发明还设想，在本发明的一些实施方案中，可排除或忽略本文所述的任何特征或特征组合。为了说明，如果本说明书声称组合物包含组分A、B和C，则特别意图是A、B或C任一者或它们的组合可以单独地或以任何组合忽略或放弃。

如在本发明的具体实施方式和随附的权利要求书中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”旨在还包括复数形式，除非上下文明确地指出并非如此。另外，如本文所用的，“和/或”是指并且涵盖相关的所列各项中的一者或多者的任何和全部可能的组合，并且在理解为备选(“或”)时缺少组合。

如本文所用，当提及可测量值诸如剂量或时期等时，术语“约”是指规定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的波动。

如本文所用，短语诸如“介于X与Y之间”以及“介于约X与Y之间”应该理解为包括X和Y。如本文所用，短语诸如“介于约X与Y之间”意指“介于约X与约Y之间”，并且短语诸如“约X至Y”意指“约X至约Y”。

本文所用的术语“包括”、“包含”指明存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组分，但并不排除存在或增加一种或多种其它特征、整数、步骤、操作、元件、组分和/或它们的组合。

如本文所用的，连接词“基本上由...组成”意指权利要求的范围应理解为涵盖权利要求中所述的指定材料或步骤以及不实质影响要求保护的发明的基本特征和新颖特征的那些材料或步骤。因而，术语“基本上由...组成”在用于本发明的权利要求中时并非意图应理解为等价于“包含”。

如本文所用，“嵌合”是指其中至少两种组分源于不同来源(如不同生物体、不同编码区)的核酸分子或多肽。

本文所用的“互补”可以意指与比较性核苷酸序列具有100％互补性或同一性，或者其可以意指少于100％的互补性(如，约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等的互补性)。互补或可互补的也可以用于指与突变“互补”或“弥补”突变。因而，例如，噬菌体基因组中的“可弥补的”位点是包含对噬菌体功能(如裂解周期)的一个方面是必需的基因，但该功能可通过在基因组中或质粒上的不同位置表达该基因来恢复。

本文所用的术语“互补的”或“互补性”是指在碱基配对容许的盐和温度条件下多核苷酸的自然结合。例如，序列“A-G-T”结合至互补序列“T-C-A”。两个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，其中仅某些核苷酸结合，或者当所述单链分子之间存在总体互补性时该互补性可以完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有重大的影响。

如本文所用，“接触”、“使...接触”、“接触的”以及它们的语法上的变型形式，是指将所需反应的各组分在适于进行所述所需反应(如，整合、转化、筛选、选择、杀灭、鉴定、扩增等等)的条件下放在一起。适于进行这类反应的方法和条件是本领域所熟知的(参见例如，Gasiunas等人，(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.109:E2579-E2586；M.R.Green和J.Sambrook(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第4版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。

核苷酸序列的“片段”或“部分”应该理解为意指相对于参照核酸或核苷酸序列而言长度减少(如，减少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20个或更多个核苷酸)并且包含与参照核酸或核苷酸序列相同或大部分相同(如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)的邻接核苷酸的核苷酸序列、基本上由该邻接核苷酸的核苷酸序列组成和/或由该邻接核苷酸的核苷酸序列组成的核苷酸序列。根据本发明的这种核酸片段或部分可(在适当的情况下)包括在其作为构成组分的较大核苷酸中。在一些实施方案中，多核苷酸的片段可以是功能片段，该功能片段编码的多肽保留其功能(如，与野生型多肽相比长度减少但保留I型Cascade多肽的至少一种功能(如加工CRISPR RNA、结合DNA和/或形成复合体))的I型Cascade多肽片段)。Cascade多肽的功能片段可由所述Cascade多肽的片段编码。在代表性的实施方案中，本发明可包含Cas9核酸酶的功能片段。Cas9的功能片段保留了天然Cas9核酸酶的一种或多种活性，包括但不限于HNH核酸酶活性、RuvC核酸酶活性、DNA、RNA和/或PAM识别和结合活性。Cas9核酸酶的功能片段可由Cas9多核苷酸的片段编码。

如本文所用，术语“基因”是指能够用于产生mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、抗微小RNA、调节性RNA等的核酸分子。基因可以能够或不能够用于产生功能蛋白质或基因产物。基因可包括编码区和非编码区(如内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'和3'非翻译区)二者。基因可以是“分离的”，所谓“分离的”意指这样的核酸，该核酸实质上或基本上不含通常与处于天然状态的该核酸相关联存在的组分。这类组分包括其它细胞材料、来自重组制备的培养基和/或化学合成该核酸时所用的多种化学品。

本文所用的术语“基因组”包括生物体的染色体/核基因组以及任何线粒体和/或质粒基因组。

本文所用“发夹序列”是包含发夹(如形成一个或多个发夹结构)的核苷酸序列。发夹(如，茎-环结构、折回结构)是指具有二级结构的核酸分子，该二级结构包括形成单链的核苷酸区域，这些核苷酸在任一侧侧接双链区。这类结构是本领域所熟知的。如本领域已知的，双链区可在碱基配对中包含一些错配或者可以是完美互补的。在一些实施方案中，重复核苷酸序列包含发夹序列、基本上由发夹序列组成或由发夹序列组成，该发夹序列位于所述重复核苷酸序列内(即，所述重复核苷酸序列的至少一个核苷酸如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)存在于处于所述重复核苷酸序列内的发夹结构的任一侧)。在一些实施方案中，核酸构建体的发夹序列可位于tracr核酸的3'端。

“异源”或“重组”核苷酸序列是与其被引入的宿主细胞不天然相关的核苷酸序列，包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多拷贝。

如本文所用，“异源甲基转移酶”是不天然存在于其被引入的细菌宿主细胞(如生产宿主细菌)中的甲基转移酶。因而，引入生产宿主细菌中的“异源甲基转移酶”可以是来自古细菌物种或来自细菌菌株或物种的甲基转移酶，其与生产宿主细菌中存在的甲基转移酶不同。

可将异源甲基转移酶用于给生产宿主细菌赋予与靶标菌株的甲基化模式相似的甲基化模式。可用于本发明的DNA甲基化酶的非限制性实例包括来自噬菌体Φ50的LlaPI，可将其引入以防御乳球菌属(lactococci)中的II型R-M系统(Hill等人，J Bacteriol.173(14):4363-70(1991))。可在生产宿主细菌中表达的另外的DNA修饰酶包括编码使腺嘌呤残基乙酰亚胺化的多肽的那些。一些R-M系统对腺嘌呤甲基化敏感。使噬菌体DNA中的腺嘌呤残基乙酰亚胺化的多肽将使该DNA免受这种系统影响。可使生产宿主细菌中的腺嘌呤残基乙酰亚胺化的多肽的非限制性实例包括来自噬菌体Mu的mom基因和Mu样原噬菌体序列(见，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)Rd(FluMu)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)A型菌株Z2491(Pnme1)和流感嗜血杆菌埃及生物型(H.influenzae biotypeaegyptius)ATCC 11116)，其将腺嘌呤残基转化为N(6)-甲基腺嘌呤，从而免受腺嘌呤敏感的限制性内切酶影响。由各甲基转移酶赋予的甲基化模式可用已确立的DNA测序技术诸如Pacbio SMRT测序(O'Loughlin等人，PLoS One.2015:e0118533)来评估。一旦生成，就可将生产菌株用于产生噬菌体颗粒，该噬菌体颗粒用于将DNA递送进靶标菌株中。

细菌的“限制-修饰系统”(R-M系统)包含(1)在特定序列使DNA甲基化的甲基转移酶和/或(2)切割未甲基化的DNA(I型、II型、III型)或切割甲基化的DNA(IV型)的限制性内切酶。R-M系统构成细菌防御系统，其中具有外来甲基化模式的DNA被R-M系统的限制性内切酶在多个位置切割。大多数细菌包含不止一个R-M系统。Roberts,R.J.等人，Nucleic AcidsRes.31,1805-1812(2003)。I型甲基转移酶需要存在相容的特异性蛋白质来实现功能。II型和III型甲基转移酶不需要任何额外的蛋白质来发挥功能。因而，可用于本发明的甲基转移酶和限制性内切酶(作为修饰或抑制的靶标，或者作为要在生产宿主细菌中表达的异源多蛋，从而修饰生产宿主细菌的R-M系统)可包括细菌限制-修饰系统(如I、II、III或IV型)中包含的任何甲基转移酶或限制性内切酶。

具有同源性的不同核酸或蛋白质在本文中被称为“同源物”。术语同源物包括来自相同或其它物种的同源序列和来自相同和其它物种的直系同源序列。“同源性”是指两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间就位置同一性(即，序列相似性或同一性)的百分比而言的相似性水平。同源性还指不同核酸或蛋白质之间类似功能特性的概念。因而，本发明的组合物和方法还包含本发明的核苷酸序列和多肽序列的同源物。本文所用的“直系同源物”是指在物种形成期间从共同祖先基因产生的不同物种中的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明的核苷酸序列的同源物与所述本发明核苷酸序列具有实质性的序列同一性(如至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和/或100％)。因而，例如，可用于本发明的重复、tracr核酸、Cas9多肽、Cas3多肽、Cas3'多肽、Cas3”多肽和/或Cascade多肽的同源物可与任何已知的重复、tracr核酸、Cas9多肽、Cas3多肽、Cas3'多肽、Cas3”多肽和/或Cascade多肽具有约70％的同源性或更高同源性。

如本文所用的，杂交、与...杂交以及其语法变型形式是指两条互补核苷酸序列或其中存在一些错配碱基对的实质上互补的序列的结合。杂交条件是本领域众所周知的，并且基于核苷酸序列的长度和核苷酸序列之间的互补程度而变化。在一些实施方案中，杂交条件可以是高严格性，或者它们可以是中严格性或低严格性，这取决于互补性的量和待杂交的序列的长度。为了核苷酸序列之间的杂交而构成低、中和高严格性的条件是本领域众所周知的(参见例如，Gasiunas等人，(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.109:E2579-E2586；M.R.Green和J.Sambrook(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第4版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。

如本文所用，术语“增加”、“升高”、“增强”(以及它们的语法变型形式描述了与对照相比提高至少约25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。因而，例如，靶标DNA的转录增加可意指与对照相比，靶标基因的转录增加至少约25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。

“天然”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然存在的或内源的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因而，例如，“野生型mRNA”是该生物体中天然存在的或其内源的mRNA。“同源”核酸是与其被引入的宿主细胞天然相关的核苷酸序列。因而，例如，如本文所用，术语“内源限制性内切酶”意指天然存在于生产宿主细菌中的(原产的)限制性内切酶。

另外如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸构建体”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”是指RNA或DNA，该RNA或DNA是线性或分支的、单链或双链的、或它们的杂合体。该术语还涵盖RNA/DNA杂合体。当以合成方式制备dsRNA时，不太常见的碱基，诸如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等等也可用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已显示以高亲和力结合RNA，并且是基因表达的有效反义抑制剂。也可以进行其它修饰，诸如对磷酸二酯骨架或RNA的核糖糖基中的2'-羟基的修饰。本公开的核酸构建体可以是DNA或RNA，但优选是DNA。因此，尽管本发明的核酸构建体可以根据预期用途以DNA的形式描述和使用，但它们也可以以RNA的形式描述和使用。

如本文所用，“合成的”核酸或多核苷酸是指自然界中不存在而是通过人工构建、因而不是自然产物的核酸或多核苷酸。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸从核酸分子的5'至3'端的序列，并且包括DNA或RNA分子(包括cDNA、DNA片段或部分、基因组DNA、合成的(例如，化学合成的)DNA、质粒DNA、mRNA和反义RNA，它们任一者都可以是单链或双链的)。术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”“核酸”、“核酸分子”和“寡核苷酸”在本文中也可互换使用，指核苷酸的杂聚物。除非另有说明，否则本文提供的核酸分子和/或多核苷酸在本文中以5'至3'方向从左至右给出，并且使用如美国序列法规37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIP0)标准ST.25中说明的用于代表核苷酸身份的标准代码来代表。

如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指当最佳比对两个序列时，参照(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸中与测试(“主题”)多核苷酸分子(或其互补链)相比相同核苷酸的百分比。在一些实施方案中，“同一性百分比”可以指氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。

“原间隔区序列”是指靶标双链DNA，并且尤其是指靶标DNA(如，或者基因组中的靶标区)中与CRISPR重复-间隔区序列、CRISPR重复-间隔区-重复序列和/或CRISPR阵列的间隔区序列完全互补或实质上互补(并杂交)的部分。

如本文所用，术语“减少”、“减小”、“抑制”和“降低”(以及它们的语法变型形式)描述例如与对照相比降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在特定的实施方案中，所述减少导致没有或基本没有(即，不显著的量，如低于约10％或甚至低于约5％的)可检测的活性或量。因而，例如，Cas3核酸酶或Cas9核酸酶的突变可使Cas3核酸酶或Cas9核酸酶的核酸酶活性与对照(如野生型Cas3)相比减少至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％。

本文所用的“重复序列”是指例如，野生型CRISPR基因座的任何重复序列或合成CRISPR阵列的重复序列，其被“间隔区序列”分隔(如，重复-间隔区-重复序列)。可用于本发明的重复序列可以是CRISPR基因座的任何已知的或后来鉴定的重复序列，或者其可以是设计用于在CRISPR I型系统或CRISPR II型系统中发挥功能的合成的重复。因而，在一些实施方案中，重复序列可与来自野生型CRISPR I型基因座或野生型CRISPR II型基因座的重复序列相同或与之实质上相同。在一些实施方案中，重复序列可包含野生型重复序列的一部分(如野生型重复序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续核苷酸)。

在一些实施方案中，重复序列包含至少一个核苷酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸，或其中的任何范围)，基本上由其组成，或由其组成。在其它实施方案中，重复序列包含至少约1至约150个核苷酸，基本上由其组成，或由其组成。在其它实施方案中，重复序列包含至少约1个核苷酸至约100个核苷酸或其中的任何范围或值，基本上由其组成，或由其组成。在另外的实施方案中，重复序列可包含约3个核苷酸至约100个核苷酸、约10个核苷酸至约100个核苷酸、约15个核苷酸至约100个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约20至约40个核苷酸、约20至约30个核苷酸、约30至约40个核苷酸、约25至约40个核苷酸、约25至约45个核苷酸和/或约25至约50个核苷酸、或其中的任何范围或值，基本上由其组成，或由其组成。在代表性的实施方案中，重复序列可包含约25个核苷酸至约38个核苷酸、或其中的任何范围或值，基本上由其组成，或由其组成。在另外的实施方案中，重复序列可包含约29个核苷酸，基本上由其组成，或由其组成。在另外的实施方案中，重复序列可包含长度仅具有至少约20至30个核苷酸的发夹，基本上由其组成，或由其组成。在其它实施方案中，重复序列包含至少约3个核苷酸，基本上由其组成，或由其组成。当不止一个间隔区核苷酸序列存在于CRISPR阵列中时，每个间隔区核苷酸序列彼此通过“重复核苷酸序列”隔开。因而，在一些代表性实施方案中，连接至间隔区序列的5'端的重复序列可以长约3个核苷酸(如3,4,5,6,7,8,9,10个核苷酸更多个核苷酸)并且与野生型重复核苷酸序列的相同区域(如5'端)具有至少90％的同一性(如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。在其它实施方案中，连接至间隔区序列的3'端的重复序列部分可具有与野生型重复核苷酸序列具有至少约50％或更高同一性的10个或更多个核苷酸。在另外的实施方案中，重复序列可包含长度仅具有至少约20至30个核苷酸的发夹，基本上由其组成，或由其组成。

本文所用的“CRISPR阵列”意指核酸分子，该核酸分子包含至少两个重复序列或所述重复序列每一者的一部分，和至少一个间隔区序列，其中所述两个重复序列中的一者或其部分连接至所述间隔区序列的5'端，而所述两个重复序列的另一者或其部分连接至所述间隔区序列的3'端。在重组CRISPR阵列中，重复序列与间隔区序列的组合是合成的、由人工制备并且自然界中不存在。在一些实施方案中，“CRISPR阵列”是指一种核酸构建体，该核酸构建体从5’至3’包含至少一个重复-间隔区序列(如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个重复-间隔区序列，或其中的任何范围或值)，其中该阵列的最3'的重复-间隔区序列的3'端连接至重复序列，从而所述阵列中的所有间隔区在5'端和3'端都侧接重复序列。

本发明的CRISPR阵列可以具有任何长度，并且包含任何数目的与重复序列交替的间隔区序列，如上所述。在一些实施方案中，CRISPR阵列可包含1至约100个间隔区序列，基本上由其组成或由其组成，每一间隔区序列在其5'端和3'端连接至重复序列(如重复-间隔区-重复-间隔区-重复-间隔区-重复-间隔区-重复，等等，以便每个CRISPR阵列以重复开始并以重复结束)。因而，在一些实施方案中，本发明的重组CRISPR阵列可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个间隔区序列，基本上由其组成或由其组成，每一间隔区序列在其5'端和其3'端连接至重复序列。

本文所用的“CRISP噬菌体”意指噬菌体颗粒，该颗粒包含噬菌体DNA，所述噬菌体DNA包含编码CRISPR-Cas系统的至少一种组分(如CRISPR阵列、crRNA；如包含靶向ftsA的crRNA插入物的P1噬菌体)的至少一种异源多核苷酸。

如本文所用，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分(例如，核苷酸或氨基酸)的整个比对窗口内不变的程度。“同一性”可容易地通过已知的方法计算，所述方法包括但不限于以下中描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics andGenome Projects(Smith,D.W.编辑)Academic Press,New York(1993)；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.编辑)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press,New York(1991)。

本文所用的“间隔区序列”是与靶标DNA(即基因组或“原间隔区序列”中的靶标区，其邻近原间隔区相邻基序(PAM)序列)互补的核苷酸序列。间隔区序列可与靶标DNA完全互补或实质上互补(如至少约70％互补(如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高))。因而，在一些实施方案中，间隔区序列与靶标DNA相比可具有一个、两个、三个、四个或五个错配，该错配可以是邻接的或不邻接的。在一些实施方案中，间隔区序列可与靶标DNA具有70％互补性。在其它实施方案中，间隔区核苷酸序列可与靶标DNA具有80％互补性。在其它实施方案中，间隔区核苷酸序列可与靶标基因的靶标核苷酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％等的互补性。在代表性的实施方案中，间隔区序列与靶标DNA具有100％互补性。在特定的实施方案中，间隔区序列在靶标核苷酸序列长为至少约8个核苷酸至约150个核苷酸的区域上具有完全的互补性或实质的互补性。在代表性的实施方案中，间隔区序列在靶标核苷酸序列长为至少约20个核苷酸至约100个核苷酸的区域上具有完全的互补性或实质的互补性。在一些实施方案中，间隔区序列的5'区可与靶标DNA 100％互补，而所述间隔区的3'区与所述靶标DNA实质上互补，因此间隔区序列与靶标DNA的总体互补性低于100％。因而，例如，20个核苷酸的间隔区序列(种子区)的3'区中前7、8、9、10、11、12、13、14、15、16等个核苷酸可与靶标DNA 100％互补，而该间隔区序列5'区中的其余核苷酸与靶标DNA实质上互补(如至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔区序列的3'端的前7至12个核苷酸可与靶标DNA 100％互补，而间隔区序列的5'区中的其余核苷酸与靶标DNA实质上互补(如至少约50％互补(如50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高))。在一些实施方案中，间隔区序列的3'端中的前7至10个核苷酸可与靶标DNA75％-99％互补，而该间隔区序列的5'区中的其余核苷酸与靶标DNA至少约50％至约99％互补。在其它实施方案中，间隔区序列的3'端中的前7至10个核苷酸可与靶标DNA100％互补，而该间隔区序列的5'区中的其余核苷酸与靶标DNA实质上互补(如至少约70％互补)。在代表性的实施方案中，间隔区序列的前10个核苷酸(该种子区内)可与靶标DNA100％互补，而该间隔区序列的5'区中的其余核苷酸与靶标DNA实质上互补(如至少约70％互补)。在一个示例性的实施方案中，间隔区序列的5'区(如5'端的前8个核苷酸、5'端的前10个核苷酸、5'端的前15个核苷酸、5'端的前20个核苷酸)可与靶标DNA具有约75％的互补性或更高的互补性(75％至约100％的互补性)，而间隔区序列的其余部分可与靶标DNA具有约50％或更高的互补性。因而，例如，间隔区序列5'端的前8个核苷酸可与靶标核苷酸序列具有100％互补性，或者其可以具有一个或两个突变并因而可分别与靶标DNA具有约88％的互补性或约75％的互补性，而间隔区核苷酸序列的其余部分可与靶标DNA具有至少约50％或更高的互补性。

在一些实施方案中，本发明的间隔区序列可以长约15个核苷酸至约150个核苷酸。在其它实施方案中，本发明的间隔区核苷酸序列可以长约15个核苷酸至约100个核苷酸(如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个核苷酸或更多个核苷酸)。在一些特定的实施方案中，间隔区核苷酸序列可以长约8至约150个核苷酸、约8至约100个核苷酸、约8至约50个核苷酸、约8至约40个核苷酸、约8至约30个核苷酸、约8至约25个核苷酸、约8至约20个核苷酸、约10至约150个核苷酸、约10至约100个核苷酸、约10至约80个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约10至约40、约10至约30、约10至约25、约10至约20、约15至约150、约15至约100、约15至约50、约15至约40、约15至约30、约20至约150个核苷酸、约20至约100个核苷酸、约20至约80个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约20至约40、约20至约30、约20至约25、至少约8、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约32、至少约35、至少约40、至少约44、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150个核苷酸，或更多个核苷酸，以及其中的任何值或范围。

在一些实施方案中，可相对于大肠杆菌中的I-E型CRISPR Cas系统的野生型间隔区的典型长度(如约32个核苷酸长)修饰间隔区(即使之更长(延长的)或更短)。在一些实施方案中，通过延长间隔区的3'端以包括与靶标DNA互补的额外核苷酸来使之更长。因而，如上文所论述的，在一些方面，间隔区序列在靶标核苷酸序列长至少约15个核苷酸至约150个核苷酸、长约15个核苷酸至约100个核苷酸、长约20个核苷酸至约150个核苷酸、长约20个核苷酸至约100个核苷酸等等(如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150个核苷酸，或其中的任何范围或值)的区域上具有完全的互补性或实质的互补性。在一些方面，间隔区在其3'端可以与靶标DNA的一部分连续核苷酸完全互补或实质上互补(如至少约20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％或更高)。

在代表性的实施方案中，本发明的II型CRISPR重复-间隔区核酸的间隔区序列包含至少约16个核苷酸，其中在所述间隔区的3'端，所述至少约16个核苷酸的至少约10个连续核苷酸与靶标核酸的10个连续核苷酸具有至少约90％的互补性，其中所述靶标核酸邻近所关注生物体的基因组中的原间隔区相邻基序(PAM)序列。

在代表性的实施方案中，本发明的I型CRISPR重复-间隔区核酸的间隔区序列包含至少约15个核苷酸，其中在所述间隔区的5'端，所述至少约15个核苷酸的至少约7个连续核苷酸与靶标核酸的7个连续核苷酸具有至少约90％的互补性，其中所述靶标核酸邻近所关注生物体的基因组中的原间隔区相邻基序(PAM)序列。

如本文所用，在两个核酸分子、核苷酸序列或蛋白质序列的语境中，短语“实质上相同”或“实质同一性”是指这样的两个或更多个序列或子序列，当使用以下序列比较算法之一或通过目视检查测量而针对最大对应性比较和比对时，具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和/或100％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在特定的实施方案中，实质的同一性可以指具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95、96、96、97、98或99％同一性的两条或更多条序列或子序列。

如本文所用，在两个核酸分子或核苷酸序列的语境中，短语“实质上互补”或“实质的互补性”是指这样的两条或更多条序列或子序列，当使用以下序列比较算法之一或通过目视检查测量而针对最大对应性比较和比对时，具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和/或100％的核苷酸互补性。在特定的实施方案中，实质的互补性可以指具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95、96、96、97、98或99％互补性的两条或更多条序列或子序列。

对于序列比较，通常一条序列充当参照序列而与测试序列比较。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，如果必要的话，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。

用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员众所周知的，并且可以通过以下进行：工具诸如Smith和Waterman的局部同源性算法，Needleman和Wunsch的同源性比对算法，Pearson和Lipman的相似性搜索方法，以及任选这些算法的计算机化执行，诸如作为

Wisconsin

(Accelrys Inc.,San Diego,CA)的一部分可得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。测试序列和参照序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对序列共享的相同组分的数目除以参照序列区段中组分(即整个参照序列或参照序列的较小限定部分)的总数。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一条或多条多核苷酸序列的比较可以与全长多核苷酸序列或其部分或更长多核苷酸序列进行。对于本发明而言，还可以使用用于翻译的核苷酸序列的BLASTX版本2.0和用于多核苷酸序列的BLASTN版本2.0来确定“同一性百分比”。

用于进行BLAST分析的软件可以通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公开获得。该算法涉及首先通过在询问序列中鉴定长度为W的字段而鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字段比对时，其或匹配或满足一些正数阈值得分。T称为邻近字段得分阈值(Altschul等人，1990)。这些初始邻近字段命中充当种子用于起始寻找含有它们的更长HSP的搜索。然后沿每条序列在两个方向延伸字段命中，直至可以增加累积比对分数。对于核苷酸序列，使用参数M(对匹配残基对的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算累积评分。对于氨基酸序列，用打分矩阵计算累积评分。当累积比对评分从其最大实现值下降量X、累积评分由于累积一个或多个负得分残基比对而达到0或低于0、或达到任一条序列的末端时，字段命中在每一方向的延伸即停止。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的敏感度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用以下作为默认值：字长(W)为11，期望值(E)为10，截止值为100，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为默认值：字长(W)为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。

除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还进行两条序列之间相似性的统计分析(参见例如Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率的指示。例如，如果测试核苷酸序列与参照核苷酸序列的比较中的最小总和概率小于约0.1至小于约0.001，则认为测试核酸序列与参照序列相似。因此，在本发明的一些实施方案中，测试核苷酸序列与参照核苷酸序列比较中的最小总和概率小于约0.001。

如本文所用，“靶标DNA”、“靶标核苷酸序列”、“靶标区”或“基因组中的靶标区”是指生物体的基因组中与CRISPR阵列中的间隔区序列完全互补或实质上互补的区域(如至少70％互补(如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高))。在一些实施方案中，靶标区可以长度约为10至约40个连续核苷酸，位置紧邻生物体基因组中的PAM序列(位置紧邻靶标区3'的PAM序列)。

在一些方面，靶标核苷酸序列位置邻近或侧接PAM(原间隔区相邻基序)。虽然PAM通常对特定CRISPR-Cas系统是特异性的，但可由本领域技术人员通过确立的实验和计算方法测定PAM序列。因而，例如，实验方法包括靶向侧接所有可能的核苷酸序列的序列并鉴定未经受靶向的序列成员，诸如通过靶标DNA的体外切割(Patanayak等人，2013.Nat.Biotechnol.31:839-843)或靶标质粒DNA的转化(Esvelt等人，2013.Nat.Methods 10:1116-1121；Jiang等人，2013.Nat.Biotechnol.31:233-239)。在一些方面，计算方法可包括进行天然间隔区的BLAST搜索以鉴定噬菌体或质粒中的原始靶标DNA序列并且比对这些序列以确定邻近靶标序列的保守序列(Briner和Barrangou.2014.Appl.Environ.Microbiol.80:994-1001；Mojica等人，2009.Microbiology 155:733-740)。

本文所用的“反式激活CRISPR(tracr)核酸”或“tracr核酸”是指任何tracr RNA(或其编码DNA)。tracr核酸从5'至3'包含凸出部、连接发夹和末端发夹，并且任选地，在5'端包含上部茎干(参见,Briner等人，(2014)Molecular Cell.56(2):333-339)。tracr核酸的作用在于与成熟或不成熟crRNA的重复部分杂交、将Cas9蛋白募集至靶标位点，并且可通过诱导结构重排而帮助Cas9的催化活性。tracrRNA的序列对CRISPR-Cas系统是特异性的并且可以变化。任何tracr核酸(已知的或后来鉴定的)可用于本发明。在一些实施方案中，tracr核酸可以与CRISPR阵列融合而形成单一向导核酸，因而tracr核酸和CRISPR阵列可作为单一向导核酸引入。

可对本发明的任何多核苷酸、核苷酸序列和/或重组核酸分子(如本发明的包含CRISPR阵列的多核苷酸、编码异源甲基转移酶、Cascade多肽、Cas9多肽、Cas3多肽、Cas3'多肽、Cas3”多肽、重组I型和II型CRISPR-Cas系统的多核苷酸等)进行密码子优化以在任何所关注的物种中表达。密码子优化是本领域众所周知的，并且涉及使用物种特异性密码子使用表针对密码子使用偏好修饰核苷酸序列。基于对所关注物种的最高表达基因进行的序列分析产生密码子使用表。当在核中表达核苷酸序列时，基于对所关注物种的高度表达的核基因的序列分析产生密码子使用表。通过将物种特异性密码子使用表与天然多核苷酸序列中存在的密码子相比较来确定对核苷酸序列的修饰。如本领域中所理解的，核苷酸序列的密码子优化导致核苷酸序列与天然核苷酸序列具有小于100％的同一性(如，50％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等等)，但仍编码与初始核苷酸序列编码的多肽具有相同功能的多肽。因此，在本发明的代表性实施方案中，可对本发明的核苷酸序列和/或重组核酸分子进行密码子优化用于在任何所关注的特定生物体/物种中表达。

在一些实施方案中，本发明的重组核酸分子、核苷酸序列和多肽是“分离的”。“分离的”核酸分子、“分离的”核苷酸序列或“分离的”多肽是这样的核酸分子、核苷酸序列或多肽，其通过人工而脱离其天然环境存在，因此不是自然的产物。分离的核酸分子、核苷酸序列或多肽可以以纯化形式存在，其至少部分地与天然存在的生物体或病毒的至少一些其它组分(例如通常发现与所述多核苷酸相关联的细胞或病毒结构组分或其它多肽或核酸)分离。在代表性实施方案中，分离的核酸分子、分离的核苷酸序列和/或分离的多肽的纯度为至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。

在其它实施方案中，分离的核酸分子、多核苷酸或多肽可存在于非天然环境中，诸如例如重组宿主细胞中。因此，例如，关于核苷酸序列，术语“分离的”意指其与其天然存在于其中的染色体和/或细胞分离。如果多核苷酸与其天然存在于其中的染色体和/或细胞分离、然后插入其不天然存在于其中的遗传背景、染色体和/或细胞(例如，不同的宿主细胞，不同的调节序列和/或基因组中与在自然界中发现的不同位置)分离，则其也是分离的。因此，多核苷酸及其编码的多肽是“分离的”，原因在于通过人工，它们脱离其天然环境存在，因此不是自然产物，然而，在一些实施方案中，可将它们引入并存在于重组宿主细胞中。

在本发明的另外的实施方案中，包含tracr核酸和/或CRISPR阵列的多核苷酸，以及编码异源甲基转移酶、Cas9多肽、Cas3多肽、Cas3'多肽、Cas3”多肽、Cascade多肽和/或I型和II型CRISPR-Cas系统的多核苷酸可与多种启动子、终止子和用于在各种生物体或细胞中表达的其它调节元件有效关联。因而，在代表性的实施方案中，至少一个启动子和/或终止子可与本发明的多核苷酸有效连接。可用于本发明的任何启动子均可使用，并且包括例如在所关注的生物体中有功能的启动子，包括但不限于组成型启动子、诱导型启动子、发育调节型启动子等等，如本文所述。本文所用的调节元件可以是内源性的或异源性的。在一些实施方案中，可将源于主题生物体的内源调节元件插入进其天然不存在的遗传背景中(如，基因组中与天然存在的位置不同的位置)，从而产生重组的或非天然的核酸。

如本文所用，所谓“有效连接”或“有效关联”意指所示元件在功能上彼此相关，并且通常在物理上也是相关的。因此，本文所用的术语“有效连接”或“有效关联”是指单一核酸分子上功能上相关联的核苷酸序列。因此，有效连接至第二核苷酸序列的第一核苷酸序列意指第一核苷酸序列与第二核苷酸序列处于功能关系时的情况。例如，如果启动子实现核苷酸序列的转录或表达，则启动子与该核苷酸序列有效关联。本领域技术人员将理解，控制序列(例如启动子)不需要与和其有效关联的核苷酸序列相邻，只要控制序列发挥功能以引导其表达即可。因此，例如，间插的非翻译、但转录的序列可以存在于启动子与核苷酸序列之间，并且该启动子仍然可视为与该核苷酸序列“有效连接”。

“启动子”是控制或调节与该启动子有效关联的核苷酸序列(即，编码序列)的转录的核苷酸序列。编码序列可以编码多肽和/或功能性RNA。通常，“启动子”是指含有RNA聚合酶的结合位点并引导转录起始的核苷酸序列。一般而言，相对于相应编码序列的编码区的起点启动子存在于5'端或上游。启动子区域可以包含充当基因表达的调节子的其它元件。这些包括但不限于-35元件共有序列和-10共有序列(Simpson.1979.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:3233-3237)。

启动子可包括例如，组成型启动子、诱导型启动子、时序调节启动子、发育调节启动子、化学调节启动子，供用于制备重组核酸构建体、多核苷酸、包含本发明的多核苷酸和重组核酸构建体的表达盒和载体。这些各种类型的启动子是本领域已知的。

因而，在一些实施方案中，可使用与在所关注生物体中有功能的适当启动子有效连接的本发明重组核酸构建体，使本发明构建体的表达成为组成型的、诱导型的、时序调节型的、发育调节型的、化学调节型的。在代表性的实施方案中，可使用与例如在所关注生物体中有功能的诱导型启动子有效连接的本发明重组核酸构建体，使阻遏成为可逆的。

启动子的选择将根据表达的数量、时间和空间需求以及还根据待转化的宿主细胞而变化。用于许多不同生物体的启动子是本领域众所周知的。基于本领域存在的广泛知识，可以针对所关注的特定宿主生物体选择适当的启动子。因此，例如，关于模型生物体中高度组成型表达的基因上游的启动子了解很多，并且这样的知识可以容易获得并视情况而定在其它系统中实施。

可用于本发明的示例性启动子包括在细菌中有功能的启动子。可用于细菌的启动子可包括但不限于，L-阿拉伯糖诱导型(araBAD、P_BAD)启动子、任何lac启动子、L-鼠李糖诱导型(rhaP_BAD)启动子、T7RNA聚合酶启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体启动子(p_L、p_L-9G-50)、无水四环素诱导型(tetA)启动子、trp、lpp、phoA、recA、proU、cst-1、cadA、nar、lpp-lac、cspA、T7-lac操纵子、T3-lac操纵子、T4基因32、T5-lac操纵子、nprM-lac操纵子、Vhb、蛋白A、棒状杆菌-大肠杆菌样启动子、thr、hom、白喉毒素启动子、sig A、sig B、nusG、SoxS、katb、α-淀粉酶(Pamy)、Ptms、P43(由两个重叠的RNA聚合酶σ因子识别位点σA、σB构成)、Ptms、P43、rplK-rplA、铁氧还蛋白启动子和/或木糖启动子。(参见，K.TerpeAppl.Microbiol,Biotechnol.72:211-222(2006)；Hannig等人，Trends in Biotechnology16:54-60(1998)；以及Srivastava Protein Expr Purif 40:221-229(2005))。

在本发明的一些实施方案中，可使用诱导型启动子。因而，例如可将化学调节型启动子用于通过施加外源化学调节剂来调控基因在生物体中的表达。通过化学调节型启动子来调节本发明的核苷酸序列的表达使得本发明的RNA和/或多肽仅能在例如用该诱导化学剂处理生物体时合成。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学阻抑型启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。在一些方面，启动子还可以包括光诱导型启动子，其中施加特定波长的光可诱导基因表达(Levskaya等人，2005.Nature 438:441-442)。

在一些实施方案中，本发明的核酸构建体可以是“表达盒”或可以包含于表达盒内。如本文所用，“表达盒”意指包含一种或多种本发明的多核苷酸的重组核酸构建体，其中所述重组核酸构建体与至少一种控制序列(如启动子)有效关联。因此，本发明的一些方面提供了设计用于表达本发明的多核苷酸的表达盒。

包含所关注的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指其组分中的至少一种相对于其至少一种其它组分是异源性的。表达盒也可以是天然存在、但已经以可用于异源表达的重组形式获得的表达盒。

表达盒还可以任选包含在所选的宿主细胞中有功能的转录和/或翻译终止区(即，终止区)。有多种转录终止子可供用于表达盒中，并且负责终止超出所关注的异源核苷酸序列的转录以及正确mRNA多聚腺苷酸化。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于有效连接的所关注核苷酸序列可以是天然的，对于宿主细胞可以是天然的，或者可以源自另一来源(即，对于启动子、所关注的核苷酸序列、宿主或它们的任何组合是外来的或异源的)。在本发明的一些实施方案中，可使终止子有效连接至本发明的重组核酸分子和CRISPR阵列。

表达盒还可以包含编码可选择标记的核苷酸序列，所述可选择标记可以用于选择转化的宿主细胞。如本文所用，“可选择标记”意指一种核苷酸序列，其在表达时赋予表达该标记的宿主细胞以不同的表型，因此允许将这样的转化细胞与不具有该标记的细胞区分开。这样的核苷酸序列可以编码可选择标记或可筛选标记，这取决于该标记是否赋予可以通过化学手段，诸如通过使用选择剂(如抗生素等)选择的性状，或者该标记是否仅仅是可以通过观察或测试(诸如通过筛选(例如，荧光))鉴别的性状。当然，合适的可选择标记的许多实例是本领域已知的，并且可以用于本文所述的表达盒。

除了表达盒以外，本文所述的重组多核苷酸(如包含CRISPR阵列和/或tracr核酸的多核苷酸，以及编码本发明的异源甲基转移酶、Cascade多肽、Cas9多肽、Cas3多肽、Cas3'多肽、Cas3”多肽、重组I型和II型CRISPR-Cas系统的多核苷酸等等)可与载体结合使用。术语“载体”是指用于将核酸(或多个核酸)转移、递送或引入细胞中的组合物。载体包含具有待转移、递送或引入的核苷酸序列的核酸分子。用于转化宿主生物体的载体是本领域众所周知的。一般类别的载体的非限制性实例包括但不限于病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、福斯质粒载体、噬菌体、人工染色体或农杆菌二元载体，其为双链或单链线性或环状形式，可以是或不是可自我转移的或可移动的。本文所定义的载体可以通过整合进细胞基因组或染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)来转化原核宿主。另外包括的是穿梭载体，所谓穿梭载体意指(天然或通过设计)能够在两种不同的宿主生物体中复制的DNA载体，诸如具有多个复制起点的广谱宿主质粒或穿梭载体。在一些代表性实施方案中，载体中的核酸处于适当的启动子或用于在宿主细胞中转录的其它调节元件的控制下并与之有效连接。载体可以是在多种宿主中发挥功能的双功能表达载体。在基因组DNA的情况下，其可以含有其自身启动子或其它调节元件，并且在cDNA的情况下，其可以在适当的启动子或用于在宿主细胞中表达的其它调节元件的控制下。因此，本发明的重组多核苷酸和/或包含本发明的重组多核苷酸的表达盒可以包含于本文所述和本领域已知的载体中。

如本文所用，术语“接触”、“引入”、“递送”和“施用”可以指这样一种过程，通过该过程，本发明的重组多肽被递送至细胞，例如用以改变宿主细胞的甲基化活性或用以杀灭包含与所引入的(异源/外源)CRISPR阵列的至少一个间隔区实质上互补的靶标DNA的细胞。因而，在所关注的多核苷酸的语境中，术语“接触”、“引入”、“递送”和“施用”(以及它们的语法变型形式)意指将所关注的多核苷酸呈递给宿主生物体或所述生物体的细胞(如，宿主细胞诸如细菌细胞)，呈递的方式使得所述多核苷酸能进入细胞的内部并且包括诸如“转化”、“转染”和/或“转导”之类的术语。若要引入不止一种多核苷酸，则可将这些多核苷酸组装为单一多核苷酸或核酸构建体的部分，或组装为独立的多核苷酸或核酸构建体，并且可位于相同或不同的表达构建体或转化载体上。因此，可在单个转化事件和/或分开的转化事件中将这些多核苷酸引入细胞中。因而，在本发明的一些方面，可将本发明的一种或多种多核苷酸引入宿主细菌的细胞中。

本文所用的术语“转化”、“转染”和“转导”是指将异源多核苷酸引入细胞中。这种引入进细胞中可以是稳定的或瞬时的。因此，在一些实施方案中，用本发明的核酸分子稳定转化宿主细胞或宿主生物体。在其它实施方案中，用本发明的重组核酸分子瞬时转化宿主细胞或宿主生物体。

在多核苷酸的语境中，“瞬时转化”意指多核苷酸被引入细胞中并且不整合至细胞的基因组中。

在引入进细胞中的多核苷酸的语境中，所谓“稳定引入”意指所引入的多核苷酸稳定地整合入细胞的基因组中，因此该细胞稳定地转化有该多核苷酸。

如本文所用，“稳定转化”或“稳定转化的”意指核酸分子被引入细胞并整合至细胞的基因组中。因此，整合的核酸分子能够被其子代，更具体地，被多个连续世代的子代遗传。本文所用的“基因组”还包括核和质粒基因组，因此包括将核酸构建体整合进例如质粒基因组中。本文所用的稳定转化也可以指保持在染色体外、例如作为微型染色体或质粒的转基因。

瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白质印迹(其可以检测由引入生物体中的一种或多种转基因编码的肽或多肽的存在)检测。细胞的稳定转化可以通过例如，用与引入生物体(如细菌)的转基因的核苷酸序列特异性杂交的核酸序列对所述细胞的基因组DNA进行DNA印迹杂交测定法来检测。细胞的稳定转化可以通过例如用与引入所述细胞的转基因的核苷酸序列特异性杂交的核酸序列对所述细胞的RNA进行RNA印迹杂交测定法来检测。细胞的稳定转化还可以通过例如以下方式检测：采用与转基因的靶标序列杂交的特异性引物序列进行聚合酶链式反应(PCR)或本领域众所周知的其它扩增反应，从而导致转基因序列的扩增，其可以根据标准方法检测。转化也可以通过本领域众所周知的直接测序和/或通过杂交方案来检测。

因此，在一些实施方案中，本发明的多核苷酸序列、核酸构建体、表达盒和/或载体可以瞬时表达和/或它们可以稳定地掺入宿主生物体的基因组中。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法将本发明的多核苷酸引入细胞中。示例性的转化方法包括经由感受态细胞的电穿孔的转化、通过感受态细胞的被动摄入的转化、感受态细胞的化学转化以及导致将核酸引入细胞中的任何其它电、化学、物理(机械)和/或生物机制的转化，包括它们的任何组合。

在本发明的一些实施方案中，细胞的转化包括核转化。在本发明的一些实施方案中，细胞的转化包括质粒转化和接合。

用于转化原核生物的程序是本领域众所周知和常规的，并且在整个文献中有描述(参见例如，Jiang等人，2013.Nat.Biotechnol.31:233-239；Ran等人，Nature Protocols8:2281-2308(2013))。

因此，可以以本领域众所周知的多种方式将核苷酸序列引入宿主生物体或其细胞中。本发明的方法不依赖于将一种或多种核苷酸序列引入生物体的具体方法，只要它们能进入细胞的内部即可。若要引入不止一种核苷酸序列，则可将它们组装为单一核酸构建体的部分，或组装为分开的核酸构建体，并且可位于相同或不同的核酸构建体上。因此，可在单个转化事件中或在分开的转化事件中将这些核苷酸序列引入所关注的细胞中。

本发明人已经鉴定了用于将异源DNA整合进噬菌体基因组中的新整合位点，包括simABC、imcB/coi、res-mod、darA、phd-doc、kilA、tRNA 1,2、cixL、cixR和Is1。另外，本发明已出人意料地发现，通过使噬菌体在具有与靶标宿主细菌实质上类似的甲基化模式(R-M系统)的生产宿主细菌中生长，包含引入的异源多核苷酸的噬菌体DNA可被甲基化成与所述靶标宿主细菌实质上相似。噬菌体的有效甲基化是出乎意料的，因为在包装之前(如，对于P1)或者对于单链DNA的包装(如M13)而言，噬菌体DNA快速复制，这原本预料会防止DNA包装之前的甲基化。

因而，在一些方面，本发明涉及用于修饰噬菌体DNA和噬菌粒DNA的甲基化模式的方法和组合物。

因此，在一些实施方案中，本发明提供一种修饰噬菌体DNA或噬菌粒DNA的甲基化模式的体内方法，包括：改变生产宿主细菌的甲基化活性，包括(1)破坏生产宿主细菌的内源限制修饰系统(R-M系统)的至少一种酶的活性，由此产生内源R-M系统的至少一种酶的活性被破坏的经修饰的生产宿主细菌，以及/或者(2)将编码至少一种异源甲基转移酶的多核苷酸引入生产宿主细菌中，由此产生表达所述异源甲基转移酶的经修饰的生产宿主细菌；用包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒感染具有经改变的甲基化活性的所述经修饰的生产宿主细菌，由此使所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA甲基化；以及产生噬菌体颗粒，所述噬菌体与在对照生产宿主细菌(其中所述对照生产宿主细菌未如本文所述使其甲基化活性改变)中生长的噬菌体相比，包含具有经修饰的甲基化模式的噬菌体DNA或噬菌粒DNA。

在一些方面，所述感染步骤可在所述改变生产宿主细菌的甲基化活性的步骤之前进行。因而，在本发明的一些方面，提供了一种修饰噬菌体DNA或噬菌粒DNA的甲基化模式的体内方法，包括：用包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒感染具有经改变的甲基化活性的所述经修饰的生产宿主细菌，由此使所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA甲基化；改变生产宿主细菌的甲基化活性，包括(1)破坏生产宿主细菌的内源限制修饰系统(R-M系统)的至少一种酶的活性，由此产生内源R-M系统的至少一种酶的活性被破坏的经修饰的生产宿主细菌，以及/或者(2)将编码至少一种异源甲基转移酶的多核苷酸引入生产宿主细菌中，由此产生表达所述异源甲基转移酶的经修饰的生产宿主细菌；以及产生噬菌体颗粒，所述噬菌体与在对照生产宿主细菌(其中所述对照生产宿主细菌未如本文所述使其甲基化活性改变)中生长的噬菌体相比，包含具有经修饰的甲基化模式的噬菌体DNA或噬菌粒DNA。

还提供了一种修饰噬菌体DNA或噬菌粒DNA的甲基化模式的体内方法，包括：用包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒感染生产宿主细菌，其中所述生产宿主细菌具有通过破坏内源R-M系统的至少一种酶和/或表达至少一种异源甲基转移酶而改变的甲基化活性，由此使所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA甲基化；以及产生噬菌体颗粒，所述噬菌体与在对照生产宿主细菌(其中所述对照生产宿主细菌未如本文所述使其甲基化活性改变)中生长的噬菌体相比，包含具有经修饰的甲基化模式的噬菌体DNA或噬菌粒DNA。

在一些实施方案中，生产宿主细菌的内源限制修饰系统的两种或更多种(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种等)酶的活性可被破坏或改变。

生产宿主细菌可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。因而，在一些实施方案中，生产宿主细菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、肠道沙门氏菌(Salmonella enteria)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、李斯特氏菌属(Listeria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在代表性的实施方案中，生产宿主细菌可以是大肠杆菌。在另外的实施方案中，生产宿主细菌可以是大肠杆菌菌株MG1655、BW25113、BL21、TOP10或MG1655△dam△dcm△hsdRMS。

在本发明的一些实施方案中，生产宿主细菌的甲基化活性未经修饰。因此，在一些实施方案中，可用包含重组噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒感染未经修饰而改变其甲基化活性的生产宿主细菌。

任何已知的或后来鉴定的噬菌体DNA均可用于本发明。在一些实施方案中，噬菌体DNA可来自溶原性噬菌体或温和性噬菌体。在一些实施方案中，当与噬菌粒联用时噬菌体DNA可来自裂解性噬菌体。

在一些实施方案中，噬菌体DNA可来自温和性噬菌体。然而，诸如紫外线曝露、饥饿、改变温度、存在诱导化学剂和/或诱导裂解转录因子的表达之类的事件可诱导裂解周期，从而引起新噬菌体的增殖。在本发明的一些实施方案中，噬菌体DNA可包括但不限于P1噬菌体、M13噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体、PhiC2噬菌体、PhiCD27噬菌体、PhiNM1噬菌体、Bc431v3噬菌体、噬菌体、Phi10噬菌体、Phi25噬菌体、Phi151噬菌体、A511样噬菌体、B054、01761样噬菌体、或弯曲杆菌噬菌体(诸如NCTC12676和NCTC12677)的DNA。在一些实施方案中，生产宿主细菌可以是革兰氏阴性细菌并且噬菌体DNA可以是例如，P1噬菌体、M13噬菌体、λ噬菌体、Phi10、Phi25、Phi151、弯曲杆菌噬菌体(诸如NCTC12676和NCTC12677)或T4噬菌体。在其它实施方案中，生产宿主细菌可以是革兰氏阳性细菌并且噬菌体DNA可以是例如，PhiC2噬菌体、PhiCD27噬菌体、PhiNM1噬菌体、B054、01761样噬菌体或Bc431v3噬菌体。

任何已知的或后来鉴定的噬菌粒DNA均可用于本发明。在一些实施方案中，可用于本发明的噬菌粒DNA可包括但不限于P1噬菌粒、M13噬菌粒、λ噬菌粒、T4噬菌粒、PhiC2噬菌粒、PhiCD27噬菌粒、PhiNM1噬菌粒、Bc431v3噬菌粒、Phi10噬菌粒、Phi25噬菌粒、Phi151噬菌粒、A511样噬菌粒、B054、01761样噬菌粒、弯曲杆菌噬菌粒(诸如NCTC12676和NCTC12677)的DNA。

可使用本领域众所周知的方法或后来开发用于破坏多肽的功能和活性的方法来破坏内源R-M系统的酶的活性。这类方法可包括但不限于生成点突变(如错义突变、或无义突变、或导致读框移位的单碱基对的插入或缺失)、插入、缺失和/或截短。在一些实施方案中，可将多肽抑制剂用于破坏或抑制细菌限制修饰系统(R-M系统)的酶的活性。这类多肽抑制剂是本领域已知的。多肽抑制剂可例如在噬菌体DNA、噬菌粒DNA内编码和/或包装为噬菌体颗粒中的蛋白质。例如，P1噬菌体编码可抑制大肠杆菌中存在的I型限制性内切酶的两种多肽抑制剂(Lobocka等人，J.Bacteriol.186,7032-7068(2004))。在一些实施方案中，可通过引入多肽抑制剂(即刺激宿主甲基化酶的活性以加速对所递送的DNA的甲基化和保护的多肽)来抑制或破坏内源R-M系统。

R-M系统酶的抑制剂包括但不限于降解RE酶(限制性核酸内切酶)的蛋白质，从而防止宿主R-M酶系统切割噬菌体DNA。可用于本发明来破坏或修饰内源性细菌R-M系统酶的R-M酶抑制剂的非限制性实例包括(a)来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的orf18，其产生抑制所有主要类别的I型R-M系统的蛋白质ArdA；和(b)来自噬菌体T7的gp0.3，其产生隐蔽I型R-M酶EcoKI的蛋白质Ocr。可用于阻断R-M系统的酶的活性的蛋白质的另外非限制性实例包括掩蔽蛋白。掩蔽蛋白可被包装进噬菌体头部中并在DNA注入之后结合噬菌体DNA，从而掩蔽R-M识别位点。可用于本发明的掩蔽蛋白的非限制性实例包括DarA和DarB蛋白(Iida等人，Virology.157(1):156-66(1987))。这些蛋白质由P1噬菌体在裂解周期表达并且包装进头部中。一旦DNA注入宿主细菌，它们即结合并掩蔽I型R-M识别位点。

除此之外或备选的，可通过至少一种异源甲基转移酶的表达来改变/修饰生产宿主细菌的内源R-M系统。可改变生产宿主细菌的内源甲基化模式以使得生产宿主细菌的甲基化模式与靶标细菌的甲基化模式实质上类似的任何甲基转移酶均可用于本发明。该异源甲基转移酶可来源于相同生物体或不同生物体，只要其给生产宿主细菌赋予与靶标菌株实质上相似的甲基化模式即可。可用于本发明的DNA甲基转移酶的非限制性实例包括来自噬菌体Φ50的LlaPI，可引入其来防御乳球菌属中的II型R-M系统(McGrath等人，AppliedEnvironmental Microbiology.65:1891-1899(1999))。然后用确立的DNA测序技术诸如Pacbio SMRT测序(O'Loughlin等人，PLoS One.2015:e0118533)来评估由各甲基转移酶赋予的甲基化模式。一旦生成，则将生产菌株用于产生噬菌体颗粒，该噬菌体颗粒用于将DNA递送进靶标菌株中。

可在生产宿主细菌中表达另外的异源DNA修饰酶，从而使生产宿主细菌的R-M系统与靶标细菌的R-M系统实质上相似。可用于该目的的这类DNA修饰酶的实例包括编码可将噬菌体DNA中的腺嘌呤残基转化为乙酰氨基腺嘌呤(acetamidoadenine)的多肽的那些。将噬菌体DNA中的腺嘌呤残基转化为乙酰氨基腺嘌呤的多肽将保护DNA免受对腺嘌呤甲基化敏感的限制性内切酶影响。可在生产宿主细菌中使DNA中的腺嘌呤残基转化为乙酰氨基腺嘌呤的多肽的非限制性实例包括来自噬菌体Mu的mom基因和Mu样原噬菌体序列(见，流感嗜血杆菌Rd(FluMu)、脑膜炎奈瑟氏菌A型菌株Z2491(Pnme1)和流感嗜血杆菌埃及生物型ATCC11116；Drozdz等人，Nucleic Acids Res.40(5):2119-30(2012))，其将腺嘌呤残基转化为N(6)-甲基腺嘌呤，从而防御腺嘌呤敏感的限制性内切酶。

在一些实施方案中，可将编码如本文所述的多肽抑制剂和其它DNA修饰酶的多核苷酸引入噬菌体基因组中直接用于使所递送的DNA免受靶标宿主细菌的R-M系统的影响。

用噬菌体颗粒感染细菌的过程是众所周知的，并且可包括例如使细菌宿主细胞与所述噬菌体颗粒在规定的条件下温育。于细菌宿主细胞中复制之后，可通过不同的已确立方法触发裂解周期以获得包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒，所述方法包括但不限于紫外线曝露、饥饿、改变温度或诱导裂解转录因子的表达。

本发明还涉及将本发明的噬菌体颗粒用于增加经由噬菌体和噬菌粒引入异源DNA的效率的方法和组合物。因而，在一些实施方案中，可将至少一种所关注的异源核酸引入噬菌体DNA中或引入噬菌粒DNA中。将异源多核苷酸引入噬菌体DNA或噬菌粒DNA中的方法是本领域众所周知的。在一些实施方案中，可将至少一种所关注的异源核酸引入噬菌体DNA(例如，在所述噬菌体DNA位于宿主细菌(如生产宿主细菌)中时经由同源重组引入)，或者经由标准的克隆技术引入噬菌粒DNA中。

在一些实施方案中，所述所关注的至少一种异源核酸可以是报告基因(如gfp、lacZ)、抗生素抗性标记(如cat、bla)、编码代谢途径(如类胡萝卜素生物合成)中的一种或多种多肽的多核苷酸、基因调控因子(如dCas9、tetR)和/或任何内源基因的另外的拷贝(如用于过表达)。

因此，在一些实施方案中，本发明提供一种增加经由噬菌体将所关注的异源核酸引入靶标宿主细菌的效率的方法，包括在感染生产宿主细菌之前将至少一种所关注的异源核酸引入噬菌体DNA或噬菌粒DNA中，其中所述生产宿主细菌已经经修饰而破坏内源R-M系统的至少一种酶和/或已经经修饰而包含编码至少一种异源甲基转移酶的多核苷酸，由此使所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA甲基化并产生包含具有经修饰的甲基化模式的所述至少一种所关注的异源核酸的重组噬菌体DNA或噬菌粒DNA(与不具有所述改变的甲基化活性的生产宿主细菌中产生的噬菌体或噬菌粒DNA比较)；产生噬菌体颗粒，所述噬菌体颗粒包含具有所述至少一种所关注的异源核酸的所述重组噬菌体DNA或噬菌粒DNA；以及用所述噬菌体颗粒感染靶标宿主细菌，其中所述靶标宿主细菌具有与所述生产宿主细菌实质上相似的甲基化模式(或R-M系统)，由此与使用在对照生产宿主细菌(其中所述对照生产宿主细菌尚未使其甲基化活性改变成与靶标宿主细菌的甲基化活性实质上相似)中生长的噬菌体引入所述所关注的异源核酸相比，增加将所述所关注的异源核酸引入所述靶标宿主细菌的效率。在一些方面，在被所述噬菌体感染后，所述生产宿主细菌可被修饰而改变其R-M系统(如破坏内源R-M系统的至少一种酶和/或包含编码至少一种异源甲基转移酶的多核苷酸)。

在一些实施方案中，提供了一种增加经由噬菌体将所关注的异源核酸引入靶标宿主细菌的效率的方法，包括：用包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒感染生产宿主细菌，所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含至少一种所关注的异源核酸，其中所述生产宿主细菌具有通过破坏内源R-M系统的至少一种酶和/或表达至少一种异源甲基转移酶而改变的甲基化活性，由此使所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA甲基化；产生噬菌体颗粒，其包含具有经修饰的甲基化模式并且包含/编码所述至少一种所关注的异源核酸的噬菌体DNA或噬菌粒DNA；以及用所述噬菌体颗粒感染靶标宿主细菌，其中所述靶标宿主细菌具有与所述生产宿主细菌实质上相似的甲基化模式(或R-M系统)，由此与使用在对照生产宿主细菌(其中所述对照生产宿主细菌尚未使其甲基化活性改变成与本文所述的靶标宿主细菌的甲基化活性实质上相似)中生长的噬菌体引入所述所关注的异源核酸相比，增加将所述所关注的异源核酸引入所述靶标宿主细菌的效率。在一些方面，在被所述噬菌体感染后，所述生产宿主细菌可被修饰而改变其R-M系统(如破坏内源R-M系统的至少一种酶和/或包含编码至少一种异源甲基转移酶的多核苷酸)。

本发明还涉及将本发明的噬菌体颗粒用于递送靶向基因组的CRISPR-Cas系统的方法和组合物。在特定的实施方案中，提供了使用温和性噬菌体选择性杀灭细菌的方法和组合物，所述温和性噬菌体包含具有如本文所述的工程化CRISPR-Cas系统的噬菌体DNA或噬菌粒DNA。

因而，在一些实施方案中，可用至少一种所关注的异源核酸转化噬菌体DNA或噬菌粒DNA，其中所述至少一种所关注的异源核酸包含CRISPR阵列。在另外的实施方案中，CRISPR阵列可以是II型CRISPR阵列或I型CRISPR阵列。在一些实施方案中，将II型CRISPR阵列引入噬菌体DNA而不是噬菌粒DNA中。在一些实施方案中，将I型CRISPR阵列引入噬菌体DNA而不是噬菌粒DNA中。因而，在一些实施方案中，本发明提供了包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒，其中所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含编码CRISPR阵列的多核苷酸，所述CRISPR阵列包含重复-间隔区-重复序列，或至少两个或更多个重复-间隔区序列，所述至少两个或更多个重复-间隔区序列至少包含第一重复-间隔区序列和最后一个重复-间隔区序列，并且所述第一重复-间隔区序列的间隔区的3'端与下一个重复-间隔区序列的重复的5'端连接，并且所述最后一个重复-间隔区序列在3'端与重复连接。

在一些实施方案中，当CRISPR阵列是II型CRISPR阵列时，可另外转化所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA以包含(a)tracr核酸和编码Cas9的多核苷酸。因此，在一些实施方案中，可工程化改造噬菌体DNA以包含重组II型CRISPR-Cas系统(如CRISPR阵列、tracr核酸和编码Cas9多肽的多核苷酸)。在其它实施方案中，可工程化改造噬菌粒DNA以包含重组II型CRISPR-Cas系统。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒，其中所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含重组II型CRISPR-Cas系统，所述系统包含：(a)编码Cas9多肽的多核苷酸；(b)编码CRISPR阵列的多核苷酸；和c)tracr核酸，任选地其中所述编码CRISPR阵列的多核苷酸和所述tracr核酸彼此融合以形成单一向导核酸(sgRNA、sgDNA)。在一些实施方案中，本发明提供一种噬菌体颗粒，其包含具有编码II型CRISPR阵列的多核苷酸的噬菌体DNA。在另外的实施方案中，本发明提供一种噬菌体颗粒，其包含具有编码II型CRISPR阵列和/或单一向导核酸(融合的CRISPR阵列和tracr核酸)的多核苷酸的噬菌粒DNA。

在一些实施方案中，可将II型CRISPR-Cas系统或其组分引入与包含所述CRISPR阵列的噬菌体相同或不同或彼此不同的噬菌体中。因而，例如，可将重组噬菌体引入靶标细菌中，其中所述重组噬菌体在其DNA中仅包含阵列。在这种情形中，靶标细菌可包含与引入的CRISPR阵列相容的II型CRISPR-Cas系统，或者可将II型CRISPR-Cas系统或其组分在一种或多种另外的重组噬菌体中引入。因此，可对噬菌体进行工程改造以包含和引入仅II型CRISPR阵列；单一向导序列；Cas9；tracr；II型CRISPR阵列和Cas9；II型CRISPR阵列和tracr；II型CRISPR阵列、Cas9和tracr；II型CRISPR阵列和单一向导序列；等等。

在一些实施方案中，当CRISPR阵列为I型CRISPR阵列时，可另外转化噬菌体DNA或噬菌粒DNA以包含编码Cas3多肽、或Cas3'和Cas3”多肽的至少一种多核苷酸和/或编码I型Cascade多肽的一种或多种多核苷酸。因此，在一些实施方案中，可工程化改造噬菌体DNA以包含I型CRISPR-Cas系统(如CRISPR阵列，以及I型多肽(如编码Cas3多肽、或Cas3'和Cas3”多肽的多核苷酸，以及编码I型Cascade多肽的一种或多种多核苷酸)。在其它实施方案中，可工程化改造噬菌粒DNA以包含I型CRISPR-Cas系统。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒，其中所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含重组I型CRISPR-Cas系统，所述系统包含：(a)编码CRISPR阵列的多核苷酸；和(b)编码一种或多种I型CRISPR多肽的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供一种噬菌体颗粒，其包含具有编码I型CRISPR阵列的多核苷酸的噬菌体DNA。在另外的实施方案中，本发明提供一种噬菌体颗粒，其包含具有编码I型CRISPR阵列的多核苷酸的噬菌粒DNA。

在一些实施方案中，可将I型CRISPR-Cas系统或其组分引入与包含所述CRISPR阵列的噬菌体相同或不同或彼此不同的噬菌体中。因而，例如，可将重组噬菌体引入靶标细菌中，其中所述重组噬菌体在其DNA中仅包含CRISPR阵列。在这种情形中，靶标细菌可包含与引入的CRISPR阵列相容的I型CRISPR-Cas系统或者可将I型CRISPR-Cas系统或其组分引入一种或多种另外的重组噬菌体中。因此，可工程改造噬菌体以包含和引入仅I型CRISPR阵列；Cas3；一种或多种Cascade多核苷酸；CRISPR阵列和Cas3、CRISPR阵列以及一种或多种多肽；Cas3和一种或多种Cascade多肽；CRISPR阵列、Cas3和一种或多种Cascade多肽；等等。

在一些实施方案中，可如上所述对包含重组II型CRISPR-Cas系统或重组I型CRISPR-Cas系统的噬菌体DNA和噬菌粒DNA进行修饰以使其与未经这种修饰的噬菌体DNA或噬菌粒DNA相比具有经修饰的DNA甲基化模式，任选地其中所述经修饰的DNA甲基化模式导致所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA具有与靶标宿主细菌的限制-修饰系统实质上相似的经修饰的DNA甲基化模式。因而，在一些实施方案中，可在将噬菌体DNA或噬菌粒DNA感染进具有经修饰的甲基化活性的生产宿主细菌之前将所述至少一种所关注的异源核酸引入所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA中。以这种方式，用所述所关注的核酸转化的噬菌体DNA或噬菌粒DNA在生产宿主细菌中复制的同时被宿主细菌甲基化机制所甲基化。重新包装和裂解宿主细胞则产生包含具有所述至少一种所关注的异源核酸的噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒，所述至少一种所关注的异源核酸具有的甲基化模式对应于生产宿主细菌中存在的甲基化模式。然后可将由生产宿主细菌产生的噬菌体颗粒用于感染靶标宿主细菌，由此将所关注的核酸引入靶标宿主细菌中。通常，基于具有与生产宿主细菌的限制-修饰系统(R-M系统)实质上相似的DNA甲基化模式，选择靶标宿主细菌。备选地，生产宿主细菌的甲基化活性被修饰成与靶标宿主细菌的R-M系统实质上相似，由此提供可用于产生具有与靶标宿主细菌的R-M系统实质上相似的甲基化模式的噬菌体DNA和/或噬菌粒DNA的生产宿主细菌。因而，在一些实施方案中，在用如本文所述的噬菌体颗粒感染之前改变生产宿主细菌的DNA甲基化活性，从而产生包含转化的噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒，与在对照生产宿主细菌(例如，其中所述对照生产宿主细菌尚未如本文所述使其甲基化活性改变)中生长的噬菌体DNA或噬菌粒DNA相比，所述转化的噬菌体DNA或噬菌粒DNA具有改变的甲基化模式。在一些实施方案中，转化的噬菌体DNA或噬菌粒DNA的改变的甲基化模式可对应于靶标宿主细菌的甲基化活性(R-M系统)，由此与具有不对应于靶标宿主细菌的甲基化活性的甲基化模式的噬菌体DNA或噬菌粒DNA相比，增加递送转化的DNA至靶标宿主细菌的效率。

在一些实施方案中，生产宿主细菌可天然具有与靶标细菌的甲基化模式实质上相似的甲基化模式。因而，当在生产宿主细菌中产生噬菌体DNA或噬菌粒DNA时，噬菌体DNA或噬菌粒DNA将具有生产宿主细菌的甲基化模式以及靶标宿主细菌的甲基化模式，由此与具有的甲基化模式不与靶标宿主细菌的甲基化模式实质上相同的噬菌体DNA或噬菌粒DNA相比，增加转化的DNA向靶标宿主细菌的递送。

甲基化模式由细菌中存在的甲基化的类型(如m4C)以及被甲基化的具体序列(如GmATC)确定。因而，甲基化模式之间的相似性水平(不管其是天然的还是修饰的结果)是指靶标位点具有恰当甲基化类型的频率。因而，实质上相似的甲基化模式意指具有如本文所述的恰当甲基化类型的靶标位点之间具有至少约20％或更高的相似性(如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高，或其中的任何范围或值)。因而，在一些实施方案中，在宿主与靶标细菌之间，甲基化模式的相似性可以介于约20％至99％之间或更高相似性、约30％至99％之间或更高百分比的相似性、约40％至99％之间或更高相似性、约50％至99％之间或更高相似性、约60％至99％之间或更高相似性、约70％至99％之间或更高相似性、约80％至99％之间或更高相似性、约85％至99％之间或更高相似性、约90％至99％之间或更高相似性、或约95％至99％之间或更高相似性。靶标宿主细菌与所引入的DNA(已经经修饰的噬菌体DNA)的甲基化模式之间的实质相似性意指所述所引入的DNA的降解比与靶标宿主细菌不具有实质上相似的甲基化模式的引入DNA要低。在一些实施方案中，宿主细菌与靶标细菌的甲基化模式可以相同。

在一些实施方案中，本发明提供包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA的噬菌体颗粒，其中所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA具有与靶标宿主细菌的R-M系统实质上相似的经修饰的DNA甲基化模式，并且包含整合进噬菌体DNA(基因组)中的至少一种所关注的异源核酸。因而，例如，具有经修饰的甲基化模式(与靶标宿主细菌的R-M系统实质上相似)的噬菌体DNA或噬菌粒DNA可包含(1)编码CRISPR阵列的多核苷酸或(2)II型CRISPR-Cas系统，其包含：(a)编码Cas9多肽的多核苷酸；(b)编码CRISPR阵列的多核苷酸；和/或c)tracr核酸。在一些实施方案中，编码CRISPR阵列的多核苷酸(a)与tracr核酸(c)可以彼此融合。在另外的实施方案中，具有经修饰的甲基化模式(与靶标宿主细菌的R-M系统实质上相似)的噬菌体DNA或噬菌粒DNA可包含(1)编码CRISPR阵列的多核苷酸或(2)重组I型CRISPR-Cas系统，其包含：(a)编码CRISPR阵列的多核苷酸；和/或(b)编码一种或多种I型CRISPR多肽的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，可使所述至少一种所关注的异源核酸在非必需整合位点或在弥补的整合位点整合进噬菌体DNA(如基因组)中。

如本文所用，“非必需位点”意指噬菌体DNA或基因组中的位点，该位点对于噬菌体基因组的维持、噬菌体颗粒的生成以及包装DNA的递送不是必需的。因而，噬菌体基因组中对于执行这些功能并不需要的任何位点均可用作“着陆”位点以供所关注的核酸整合进噬菌体基因组中。噬菌体基因组中的一些示例性非必需位点可包括但不限于：(a)噬菌体编码的限制-修饰系统(如P1噬菌体中的res/mod)、(b)阻断超感染的基因(如simABC)、(c)限制-修饰系统的抑制剂(如P1噬菌体中的darA)、(d)插入序列元件(如P1噬菌体中的IS1)、(e)沉溺(addiction)系统(如P1噬菌体中的phd/doc)或(f)它们的任何组合。

本文所用的“弥补位点”或“可弥补位点”意指噬菌体DNA或基因组中必需的位点，其对于噬菌体基因组的维持、噬菌体颗粒的生成以及包装DNA的递送是必要的，但其可用弥补性多核苷酸来弥补，该弥补性多核苷酸编码被所述所关注核酸的整合(整合弥补位点)破坏的核酸。可使弥补性多核苷酸整合进生产宿主细菌的基因组中，或者可使其包含在所述生产宿主细菌的质粒上。因此，当所关注的核酸整合进噬菌体DNA的弥补位点中时，宿主细菌可在质粒上或在其基因组中包含编码噬菌体中的该弥补位点的弥补物的多核苷酸。示例性的弥补位点可包括但不限于：(a)裂解周期的激活因子(如P1噬菌体中的coi)、(b)裂解基因(如P1噬菌体中的kilA)、(c)tRNA(如P1噬菌体中的tRNA1、tRNA2)、(d)颗粒组分(如P1噬菌体中的cixL、cixR尾丝基因)、或者(e)它们的任何组合。

因而，在一些实施方案中，重组I型CRISPR-Cas系统、重组II型CRISPR-Cas系统、编码CRISPR阵列(I型或II型)的多核苷酸和/或tracr核酸、编码一种或多种I型CRISPR多肽的至少一种多核苷酸和/或编码Cas9多肽的多核苷酸可整合进噬菌体DNA中的非必需位点中。在一些实施方案中，重组I型CRISPR-Cas系统、重组II型CRISPR-Cas系统、编码CRISPR阵列(I型或II型)的多核苷酸和/或tracr核酸、编码一种或多种I型CRISPR多肽的至少一种多核苷酸和/或编码Cas9多肽的多核苷酸可整合进噬菌体DNA的弥补位点中，其中噬菌体的宿主细菌在质粒上或在其基因组中包含编码噬菌体中的该弥补位点的多核苷酸(如，弥补噬菌体基因组中已整合CRISPR多核苷酸的位点的基因)。

如本文所用，“I型多肽”是指Cas3多肽、Cas3'多肽、Cas3”多肽中的任一者和I型成簇的规律间隔短回文重复(CRISPR)相关抗病毒防御复合体(“Cascade”)多肽中的任一者或多者。因而，术语“I型多肽”是指构成I-A型CRISPR-Cas系统、I-B型CRISPR-Cas系统、I-C型CRISPR-Cas系统、I-D型CRISPR-Cas系统、I-E型CRISPR-Cas系统和/或I-F型CRISPR-Cas系统的多肽。每种I型CRISPR-Cas系统包含至少一种Cas3多肽。Cas3多肽通常包含解旋酶结构域和HD结构域二者。然而，在一些I型CRISPR-Cas系统中，解旋酶和HD结构域存在于分开的多肽Cas3’和Cas3”中。具体地讲，Cas3'编码解旋酶结构域，而Cas3”编码HD结构域。因此，因为两个结构域都是Cas3功能所需的，I型的亚型要么编码Cas3(I-C、I-D、I-E、I-F)要么编码Cas3’和Cas3”(I-A、I-B)。

如本文所用，“I型Cascade多肽”是指涉及前crRNA的加工并随后结合至I型CRISPR-Cas系统中的靶标DNA的多肽的复合体。这些多肽包括但不限于I型亚型I-A、I-B、I-C、I-D、I-E和I-F的Cascade多肽。I-A型多肽的非限制性实例包括Cas7(Csa2)、Cas8a1(Csx13)、Cas8a2(Csx9)、Cas5、Csa5、Cas6a、Cas3’和/或Cas3”。I-B型多肽的非限制性实例包括Cas6b、Cas8b(Csh1)、Cas7(Csh2)和/或Cas5。IC型多肽的非限制性实例包括Cas5d、Cas8c(Csd1)和/或Cas7(Csd2)。ID型多肽的非限制性实例包括Cas10d(Csc3)、Csc2、Csc1和/或Cas6d。I-E型多肽的非限制性实例包括Cse1(CasA)、Cse2(CasB)、Cas7(CasC)、Cas5(CasD)和/或Cas6e(CasE)。I-F型多肽的非限制性实例包括Cys1、Cys2、Cas7(Cys3)和/或Cas6f(Csy4)。因而，在本发明的一些实施方案中，可用于本发明的I型Cascade多肽加工CRISPR阵列以产生经加工的RNA，后者然后被用于使复合物结合至与该经加工的RNA中的间隔区互补的DNA上。在一些实施方案中，涉及获取的I型Cascade多肽不包含在本发明的核酸分子中(如Cas1、Cas2、Cas4)。来自I型CRISPR-Cas系统的Cascade多肽的任何这种亚组是本领域已知的，或者后来发现的那些可包含在本发明的核酸构建体中。可例如通过BLAST搜索鉴定这类多肽。

因而，在一些实施方案中，噬菌体颗粒可包括噬菌体DNA或噬菌粒DNA，所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含I型CRISPR阵列和/或(i)Cas7(Csa2)多肽、Cas8a1(Csx13)多肽或Cas8a2(Csx9)多肽、Cas5多肽、Csa5多肽、Cas6a多肽、Cas3'多肽和Cas3”多肽(I-A型)；(ii)Cas6b多肽、Cas8b(Csh1)多肽、Cas7(Csh2)多肽、Cas5多肽、Cas3'多肽和Cas3”多肽(I-B型)；(iii)Cas5d多肽、Cas8c(Csd1)多肽、Cas7(Csd2)多肽和Cas3多肽(I-C型)；(iv)Cas10d(Csc3)多肽、Csc2多肽、Csc1多肽、和Cas6d多肽、以及Cas3多肽(I-D型)；(v)Cse1(CasA)多肽、Cse2(CasB)多肽、Cas7(CasC)多肽、Cas5(CasD)多肽、Cas6e(CasE)多肽和Cas3多肽(I-E型)；或(iv)Cys1多肽、Cys2多肽、Cas7(Cys3)多肽、Cas6f多肽和/或Cas3多肽(I-F型)。在代表性的实施方案中，噬菌体颗粒可包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA，所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含I型CRISPR阵列和编码一种或多种I-E型Cascade多肽(即Cse1(CasA)多肽、Cse2(CasB)多肽、Cas7(CasC)多肽、Cas5(CasD)多肽、Cas6e(CasE)多肽、Cas3多肽)的至少一种多核苷酸。

“Cas9核酸酶”是指CRISPR-Cas II型系统中催化双链DNA切割的一大组内切核酸酶。这些多肽是本领域所熟知的并且许多它们的结构(序列)得以表征(参见例如WO2013/176772；WO/2013/188638)。催化双链DNA切割的结构域是RuvC结构域和HNH结构域。RuvC结构域负责使(-)链产生切口，而HNH结构域负责使(+)链产生切口(参见例如Gasiunas等人，PNAS 109(36):E2579-E2586(2012年9月4日))。

在一些实施方案中，可将CRISPR阵列、tracr核酸、编码Cas9多肽的多核苷酸、编码Cas3多肽的多核苷酸、编码Cas3'多肽的多核苷酸、编码Cas3”多肽的多核苷酸和/或编码一种或多种I型CRISPR多肽的至少一种多核苷酸与启动子有效连接。在一些实施方案中，当所述至少一种多核苷酸包含编码一种或多种I型CRISPR多肽的至少两种多核苷酸时，所述至少两种多核苷酸可与单个启动子或与分开的多个启动子有效连接。

在一些实施方案中，可将CRISPR阵列和tracr核酸与单个启动子或与不同的启动子有效连接。在一些实施方案中，当CRISPR阵列和tracr核酸彼此融合时，可将编码CRISPR阵列和tracr核酸的融合多核苷酸与单个启动子有效连接。在一些实施方案中，编码一种或多种I型CRISPR多肽的所述至少一种多核苷酸中的至少两种可融合而形成单一多核苷酸，任选地可将其与启动子有效连接。在一些实施方案中，1型Cascade多肽可包含在单个操纵子中，任选地与启动子有效连接。在另外的实施方案中，编码Cas3多肽、Cas3'多肽的多核苷酸和/或编码Cas3”多肽的多核苷酸可与编码I型Cascade多肽的多核苷酸融合，所述融合的多核苷酸可与启动子有效连接，在表达时其产生融合多肽。在一个代表性的实施方案中，编码Cas3多肽的多核苷酸可与编码Cse1多肽的多核苷酸融合。

另外，本发明提供通过本发明方法中的任一种产生的噬菌体颗粒。在一些实施方案中，所述噬菌体颗粒包含噬菌体DNA。在一些实施方案中，所述噬菌体颗粒包含噬菌粒DNA。在另外的实施方案中，所述噬菌体颗粒不包含噬菌粒DNA。在一些实施方案中，本发明提供了一种噬菌体颗粒，其包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA，所述DNA具有经修饰的DNA甲基化模式，所述模式与靶标宿主细菌的限制-修饰系统实质上相似。

本发明还提供了使用本发明的噬菌体颗粒来选择性杀灭细菌(即靶标细菌)的方法，所述噬菌体颗粒被工程改造成包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA，所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA至少包含CRISPR-Cas系统的CRISPR阵列。在一些实施方案中，当噬菌体DNA和/或噬菌粒DNA仅包含CRISPR阵列时，所述靶标细菌宿主可包含活性CRISPR-Cas系统(如，至少tracr核酸和Cas9多肽(II型CRISPR-Cas系统)，或至少Cas3多肽、Cas3'多肽和/或Cas3”多肽以及至少一亚组Cascade多肽(I型CRISPR-Cas系统))。在其它实施方案中，噬菌体颗粒的噬菌体DNA和/或噬菌粒DNA包含CRISPR阵列、tracr核酸和/或编码Cas9多肽的多核苷酸；或CRISPR阵列、编码至少Cas3多肽、Cas3'多肽和/或Cas3”多肽的多核苷酸以及编码至少一亚组Cascade多肽的多核苷酸。

在一些实施方案中，用于选择性杀灭细菌的噬菌体DNA或噬菌粒DNA天然地或如本文所述修饰后具有与靶标细菌的甲基化模式实质上相似的甲基化模式。

因此，本发明提供一种选择性杀灭至少一种靶标细菌物种或菌株的方法，包括：使所述至少一种靶标细菌物种或菌株与本发明的噬菌体颗粒接触，所述噬菌体颗粒包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA，所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含编码CRISPR阵列或包含CRISPR阵列的重组CRISPR-Cas系统的至少一种异源多核苷酸，其中所述CRISPR阵列包含至少一个间隔区，所述间隔区与所述至少一种靶标细菌物种或菌株中的靶标DNA具有实质的互补性(如至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％互补性，或其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含至少一个间隔区，所述间隔区与所述至少一种靶标细菌物种或菌株中的靶标DNA具有100％的互补性。

在一些实施方案中，其中所述噬菌体颗粒包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA，所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA仅包含I型CRISPR阵列或II型CRISPR阵列，所述靶标细菌宿主可以是具有活性内源CRISPR-Cas I型或II型系统的任何细菌物种或菌株。具有活性CRISPR-Cas I型或II型系统的示例性细菌物种或菌株包括土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)(II-A型)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(I型、III型)、Novicidameningitidis(II-C型)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(I-F型)、金黄色葡萄球菌(II-A型)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(II-A型)、黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)(I-F型)和/或嗜热链球菌(II-A型)。在其它实施方案中，其中所述噬菌体颗粒包含噬菌体DNA或噬菌粒DNA，所述噬菌体DNA或噬菌粒DNA包含重组I型CRISPR-Cas系统或重组II型CRISPR-Cas系统，所述宿主细菌可以具有或不具有内源CRISPR-Cas I型或II型系统，因而宿主细菌可以是包含靶标DNA的任何细菌宿主。

在示例性的实施方案中，靶标DNA可以是靶标菌株、菌种或属独特的；可以是不同菌株、菌种或属之间共有的；可以存在于大多数细菌中；和/或可以处于抗生素抗性基因、毒力基因和/或致病性岛内。在一些实施方案中，噬菌体颗粒可在与靶标细菌物种或菌株不同的细菌物种或菌株中产生或生成。

在一些实施方案中，可在例如，人、动物、植物中/上，以及在农业、医学和/或工业环境(如，发酵)中靶向细菌。在一些实施方案中，可将本发明的噬菌体颗粒用于完全消除菌株或滴定其存在的方法中。

现在将参照下面的实施例描述本发明。应当理解，这些实施例无意于限制本发明的权利要求书的范围，而是旨在示意某些实施方案。技术人员知晓的对示例方法的任何变型旨在落入本发明的范围内。

实施例

实施例1.宿主细菌的甲基化活性和噬菌体DNA的甲基化模式的修饰

宿主生产菌株诸如大肠杆菌MG1655或枯草芽孢杆菌168的甲基化模式通过改变其内源限制-修饰系统并引入异源甲基转移酶基因来改变。限制-修饰基因通过本领域已知的手段，诸如通过在线REBASE数据库来鉴定(Roberts等人，Nucleic Acids Res 43:D298-D299.http://dx.doi.org/10.1093/nar/gku1046)。这些限制-修饰系统可使用本领域已知的标准重组工程策略来缺失。一旦缺失，将外来甲基转移酶基因插入复制型质粒或重组工程进宿主基因组中处于组成型或诱导型启动子的控制下。使用天然序列或针对生产宿主进行了密码子优化的序列，直接从靶标菌株获得这些基因。备选地，可将异源甲基转移酶基因用于赋予与靶标菌株相似的甲基化模式。然后用已确立的DNA测序技术诸如PacBio SMRT测序法(O'Loughlin等人，PLoS One.2015:e0118533)来评估由各甲基转移酶赋予的甲基化模式。一旦生成，将生产菌株用于产生噬菌体颗粒，该噬菌体颗粒用于将DNA递送进靶标菌株中。

将M13噬菌体和P1噬菌体用于证实甲基化对噬菌粒(M13)和噬菌体基因组(P1)的递送的影响。M13噬菌体基于其用于噬菌体展示的广泛使用而具有确立的噬菌粒系统(Pande等人，Biotechnol.Adv.28,849-858(2010))。该系统是基于使用辅助质粒来有效包装含有f1复制起点的质粒。所述细胞则组成型产生噬菌体颗粒，可收集这些噬菌体并可以施用给靶标菌株。这些颗粒识别F1菌毛，其要求菌株携带F质粒。P1噬菌体是得到良好表征的噬菌体，其比M13复杂得多(

obocka等人，J.Bacteriol.186,7032-7068(2004))。为了驱动P1噬菌体的裂解周期，我们从分开的质粒表达了coi基因。

展示改善的M13噬菌粒递送：测试在其R-M系统全部完整的大肠杆菌(MG1655)、其R-M系统中的一些完整的大肠杆菌(TOP10)或其R-M系统均不完整的大肠杆菌(MG1655△dam△dcm△hsdRMS)中制备的M13噬菌体的滴度。在MG1655△dam△dcm△hsdRMS中测试噬菌体以评价滴度中的潜在变化性，然后在MG1655中测试噬菌体以评价DNA甲基化的影响。基于抗生素抗性菌落的数目，噬菌粒中的抗生素抗性标记充当递送的示值读数。在进入MG1655△dam△dcm△hsdRMS时递送效率预计相似，但当进入MG1655时对于MG1655预计递送效率有较大提升。

递送M13噬菌粒进入肠出血性大肠杆菌：将M13噬菌粒递送至EHEC(肠出血性大肠杆菌)的菌株。EHEC拥有比MG1655更多的R-M系统并且已显示出降低的M13噬菌粒摄入。在MG1655△dam△dcm△hsdRMS菌株中表达来自EHEC的II型甲基转移酶并生成含有该噬菌粒的M13颗粒。然后将该颗粒施用给MG1655△dam△dcm△hsdRMS和带有F质粒的EHEC菌株，并对抗生素抗性的菌落数目进行计数。所引入的甲基转移酶预计不会影响MG1655△dam△dcm△hsdRMS菌落的数目(指示相似的颗粒滴度)，但预计大大增加EHEC菌落的数目(指示由于该甲基转移酶而效率改善)。

展示改善的P1噬菌体递送：使用P1CM噬菌体进行与上述类似的方法。主要差别在于将额外破坏P1基因组中的dmt甲基化酶基因。我们已试图在EC135中生成P1溶源体，其会导致液体培养基中的细胞裂解。预计需要一定量的甲基化；然而，在存在这种甲基化时，可引入额外类型的甲基化来改善P1基因组的递送效率。

实施例2.用于选择性杀灭细菌的包含CRISPR-Cas系统的噬菌体和噬菌粒DNA

将P1噬菌体和M13噬菌粒用于测试噬菌体和噬菌粒DNA作为CRISPR-Cas系统的载体用于选择性杀灭细菌的用途。P1噬菌体是噬菌体生物学的经典模型(Lobocka等人，J.Bacteriol.186,7032-7068(2004))，并且通常用于转导基因组DNA片段(Ikeda&Tomizawa.J.Mol.Biol.14,85-109(1965))。已经开发了用于P1的噬菌粒(Westwater,Microbiol.Read.Engl.148,943-950(2002))，并已用于递送DNA至各种革兰氏阴性细菌且作为转导大的DNA文库的手段(Kittleson等人，ACS Synth.Biol.1,583-589(2012)；Kaiser&Dworkin,Science 187,653-654(1975))。我们目前具有含野生型P1噬菌体和可诱导表达coi基因的分开质粒的菌株。该P1噬菌体在正常生长条件下是溶原性的。coi基因的表达驱动该噬菌体进入裂解周期，从而产生噬菌体颗粒。

M13噬菌粒依赖于含有F1复制起点的噬菌粒和编码噬菌体机制的剩余部分的辅助质粒。被M13感染需要F菌毛，其正常从某些大肠杆菌菌株中存在的F质粒表达。M13已经成为噬菌体展示的标准平台(Pande等人，Biotechnol.Adv.28,849-858(2010))。

用I型CRISPR-Cas系统进行靶向杀灭：将来自大肠杆菌的整个I-E型CRISPR-Cas系统或来自Bacillus halodurans的I-C型CRISPR-Cas系统编码进M13噬菌粒中并用于证实大肠杆菌的靶向杀灭。将靶标菌株中存在的抗生素抗性基因用于展示使用该系统的选择性杀灭。为了确保有效感染，该靶标菌株还编码F质粒。将该噬菌体颗粒施用给靶标细胞并将细胞平板接种以对活菌落进行计数。预计与无噬菌体或无靶向噬菌体相比，该系统的递送将会导致菌落数目大大降低。

鉴定P1基因组中的整合位点：利用同源重组，将抗生素抗性标志掺入P1基因组中的不同位置。所述位置包括非必需位点和/或弥补位点，诸如(a)噬菌体编码的限制-修饰系统(如P1噬菌体中的res/mod)、(b)阻断超感染的基因(如simABC)、(c)限制-修饰系统的抑制剂(如P1噬菌体中的darA)、(d)插入序列元件(如P1噬菌体中的IS1)、(e)沉溺系统(如P1噬菌体中的phd/doc)、(f)裂解周期激活因子(如P1噬菌体中的coi)、(g)裂解基因(如P1噬菌体中的kilA)、(h)tRNA(如P1噬菌体中的tRNA1、tRNA2)、(i)颗粒组分(如P1噬菌体中的cixL、cixR尾丝基因)或(j)它们的任何组合。

对于弥补位点，可将缺失的基因克隆进pBAD18诱导型表达系统中。在每种情形中，在诱导后评估细胞裂解(裂解周期仍活跃的迹象)，然后基于转导后的抗生素抗性菌落测量转导颗粒的数目。该工作全部在大肠杆菌中进行。

用CRISPR-Cas系统的组分装备P1噬菌体：采取了三种方法：

1.用重复-间隔区-重复装备P1用于递送给表达I型或II型CRISPR-Cas系统的菌株。

2.用CRISPR-Cas9(例如，Sth1Cas9和sgRNA(与tracr核酸融合的CRISPR阵列))装备P1。

3.用大肠杆菌I-E型系统或B.halodurans I-C型系统装备P1。

对于每种方法，利用同源重组将构建体与抗生素抗性标记一起整合。CRISPR阵列被设计成靶向靶标菌株中存在而生产菌株中不存在的分开的抗生素抗性标记。然后将噬菌体颗粒施用给靶标菌株并对活性菌落的数目进行计数。预计相较于无噬菌体或非靶向噬菌体，所设计的噬菌体将大大降低活性菌落的数目。

有效的跨菌株和跨菌种递送和杀灭：在具有经修饰的甲基化模式的大肠杆菌生产菌株(如MG1655△dam△dcm△hsdRMS)中生成其中一种所设计的噬菌体(如P1)。这可通过引入来自靶标菌株(如肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌O157:H7)的异源甲基转移酶基因或来自已知产生类似甲基化模式的其它菌株的甲基转移酶(如，在线REBASE数据库中列出的甲基转移酶)来实现。将噬菌体设计成编码与内源CRISPR-Cas系统(如铜绿假单胞菌中的I-F型系统)相容并靶向基因组中的至少一个以PAM作为侧翼侧位点的CRISPR阵列。备选地，将噬菌体设计为编码整个CRISPR-Cas系统(如I-E型Cascade基因和cas3以及I-E型CRISPR阵列)。然后生成噬菌体颗粒(如，对于P1通过可诱导表达coi，或对于M13通过组成型产生丝状噬菌体)，并用于感染与宿主截然不同的不同靶标菌株。例如，将噬菌体用于递送DNA至肺炎克雷伯杆菌或弗氏志贺菌。通过引入可选择标记并以不同的噬菌体感染复数进行递送。基于液体培养物浊度的增加停止或菌落形成单位数目的降低来测量杀灭程度。靶标菌株被所述噬菌体选择性杀灭，而非靶标菌株免于杀灭。此外，对于在甲基化模式被工程改造成与靶标菌株实质上类似的生产菌株(相对于其R-M系统无任何修饰或没有任何增添的甲基转移酶的生产菌株)中生成的噬菌体，杀灭效率被增强。

用于P1噬菌体的方法

A.通过噬菌粒递送

1.P1噬菌粒是编码来自P1噬菌体基因组的以下组分(coi、cin、repL、pacA基因)的噬菌粒。

2.通过Gibson克隆对该噬菌粒进行工程改造以引入CRISPR-Cas系统组分(仅CRISPR阵列，或与cas基因一起)。

3.一旦构建了P1噬菌粒-CRISPR-Cas，则利用规程“噬菌粒-CRISPR-Cas包装”将其包装至P1噬菌体。

4.利用“靶向”规程将噬菌粒-CRISPR-Cas用于靶向和消除菌株。

B.通过工程化的P1噬菌体递送

1.通过将CRISPR-Cas系统组分在指定的位置克隆进P1噬菌体基因组中而对P1噬菌体进行工程改造，所述指定位置选择为不破坏该噬菌体功能，这些位置是例如：

a.替代coi基因(负责触发裂解周期)。

b.替代coi基因和imcB基因(coi-icmB；二者均帮助触发裂解周期)。

c.使用包含位点(inclusion site)。

2.从P1噬菌体基因组扩增coi基因并克隆进pBad18质粒中。

3.当P1-CRISPR-Cas噬菌体和pBad18-coi共存于菌株中时，按照规程“P1-CRISPR-Cas包装”诱导coi的表达以产生噬菌体颗粒。

4.所产生的裂解产物预计含有100％的P1-CRISPR-Cas噬菌体并按照规程“靶向”用于杀灭靶标菌株。

C.CRISPR-Cas组分克隆

1.一般而言，CRISPR-Cas组分需要被克隆至P1噬菌体基因组或噬菌粒。待克隆的组分取决于靶标菌株。

2.如果靶标菌株含有活性CRISPR-Cas系统，则要克隆的组分仅为表达靶向基因组的CRISPR RNA(如CRISPR阵列、重复-间隔区-重复)的DNA。参见图1的示意图。

3.如果靶标菌株不含活性CRISPR-Cas系统，则要克隆的组分包括cas基因(如Cas9、Cas3、Cas3'、Cas3”和/或Cascade多肽)的DNA和靶向基因组的CRISPR RNA(如CRISPR阵列、tracr核酸)二者。参见图1的示意图。

4.利用Gibson克隆方案进行向噬菌粒的克隆。利用同源重组进行向P1噬菌体的克隆。

通用规程

A.噬菌粒-CRISPR-Cas包装：

1.将噬菌粒-CRISPR-Cas转化至含有温和性P1噬菌体的菌株Kl739(大肠杆菌菌株)。

2.然后于37C使菌株在液体培养物中振摇培养过夜。

3.第二天，将培养物重新1:100稀释并于37C振摇1-2小时。

4.添加阿拉伯糖至该培养物以诱导噬菌粒上的coi基因表达并诱导噬菌体P1的裂解周期。再继续振摇5小时直至通过目视检查培养物确认裂解。

5.添加氯仿至裂解培养物并通过上下倒转混合。这确保任何未裂解的细胞死亡。

6.通过离心10分钟收集细胞碎片，然后收集上清液作为裂解产物。裂解产物含有噬菌体颗粒，该噬菌体颗粒含有初始P1噬菌体DNA和噬菌粒-CRISPR-Cas的混合物。

B.P1-CRISPR-Cas包装：

1.将编码coi基因的pBad18质粒转化至含有工程化的温和性P1-CRISPR噬菌体的菌株Kl739(大肠杆菌菌株)。

2.然后于37C使菌株在液体培养物中振摇培养过夜。

3.第二天，将培养物重新1:100稀释并于37C振摇1-2小时。

6.通过离心10分钟收集细胞碎片，然后收集上清液作为裂解产物。裂解产物仅含有能够递送CRISPR-Cas组分的P1-CRISPR噬菌体。

C.靶向

1.于37C使待靶向的菌株在液体培养物中振摇培养过夜。

2.第二天，通过离心从培养物收集细胞并重新悬浮于补充有CaCl2和MgSO4的LB培养基中。

3.将培养物调节至OD为2，然后用裂解产物以预先计算的感染复数(即，作用剂(如噬菌体、病毒等)与感染靶标的比率；MOI)感染该培养物，所述感染复数使所有细胞被至少一个噬菌体颗粒感染的概率最大。

4.通过倒转试管将培养物与裂解产物混合来进行感染。

5.将感染的细胞与裂解产物在37C下温育30分钟，然后在37C下振摇1小时。

6.然后以不同的稀释度将细胞平板接种并在37C下温育过夜。

7.第二天对菌落形成单位进行计数。

实施例3.工程改造广谱宿主噬菌体用于多物种DNA递送以及CRISPR抗微生物剂

CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复)及其Cas(CRISPR相关)蛋白已被证明是用于抗微生物的有力作用剂，并且是广谱抗生素的潜在替代物(Gomaa,A.A.等人，MBio 5,e00928-913(2014)；Bikard,D.等人，Nature Biotechnology 32,1146-1150(2014)；Citorik等人，Nat.Biotechnol.32,1141-1145(2014))。这些系统在细菌和古细菌中天然充当RNA引导的免疫系统，识别和切割互补的遗传物质(Brouns等人，Science 321,960-964(2008)；Marraffini等人，Science(New York,N.Y.)322,1843-1845(2008)；Garneau.等人，Nature 468,67-71(2010)；Edgar等人，J.Bacteriol.192,6291-6294(2010)；Manica等人，Mol.Microbiol.80,481-491(2011))。设计向导RNA来靶向细菌基因组可在靶标位点引起不可逆的DNA损害，从而导致序列特异性的细胞杀灭(Gomaa,A.A.等人，MBio 5,e00928-913(2014)；Bikard,D.等人，Nature Biotechnology 32,1146-1150(2014)；Citorik等人，Nat.Biotechnol.32,1141-1145(2014))。此外，设计向导RNA来靶向含有多药耐药性的质粒可使细菌对抗生素敏感(Bikard,D.等人，Nature Biotechnology32,1146-1150(2014))。

为了发挥它们的抗微生物活性，必须将CRISPR-Cas系统递送进细菌胞质中。递送策略迄今为止绝大部分依赖于在温和性噬菌体或丝状噬菌体包装的DNA内编码该系统，其或者在噬菌体基因组内或者在含有噬菌体颗粒包装信号的称为噬菌粒的质粒内(Bikard等人，Nature Biotechnology 32,1146-1150(2014)；Citorik等人，Nat.Biotechnol.32,1141-1145(2014)；Yosef等人，Proceedings of the National Academy of Sciences112,7267-7272(2015))。在这些实例中，递送CRISPR-Cas系统导致强力的杀灭或质粒移除，或者使受感染的细胞被免疫而对抗抗生素抗性的转移。虽然这些已经是很有前途的展示，但噬菌体全部存在宿主范围窄的问题，局限于个别物种或菌株。因此，每个递送平台限制了CRISPR可靶向的细菌范围。为了完全实现CRISPR抗微生物剂的潜能，需要可达到远远更宽宿主范围的一般化递送载体。

这里，针对DNA递送和CRISPR抗微生物剂对广谱宿主的温和性噬菌体P1进行工程改造。P1起着温和性噬菌体的作用，其中在其溶原性状态，约90-kb的基因组作为染色体外的单拷贝质粒存在(

obocka等人，J.Bacteriol.186,7032-7068(2004))。重要的是，P1已表明可将其基因组注入非常广谱范围的革兰氏阴性菌中，这些革兰氏阴性菌涵盖变形菌门(proteobacteria)内的多种细菌(Westwater等人，Microbiology 148,943-950(2002))。此外，P1已经成为通过对基因组DNA或噬菌粒的罕见包装进行DNA递送的标准平台(Westwater等人，Microbiol.148,943-950(2002)；Ikeda等人，J.Mol.Biol.14,85-109(1965)；Thomason等人，Curr Protoc Mol Biol，第1章，第1.17单元(2007)；Kittleson等人，ACSsynthetic biology 1,583-589(2012)；Ikeda等人，J.Mol.Biol.14,85-109(1965)；Thomason等人，Curr Protoc Mol Biol，第1章，第1.17单元(2007)；Kittleson等人，ACSsynthetic biology 1,583-589(2012))。我们发现，P1基因组的递送比P1噬菌粒更有效，并且可在其基因组中的至少三个不同着陆位点容纳合成的DNA。工程化的基因组已显示可被有效地递送至大肠杆菌和弗氏志贺菌，由此在递送设计的CRISPR-Cas系统时引发序列特异性的杀灭。因此工程化改造P1基因组代表了递送CRISPR抗微生物剂至各种细菌的有前途的策略。

菌株、质粒和噬菌体构建体.本工作中使用的所有菌株、质粒和噬菌体在表1和表2中报告。

表1.菌株

表2.质粒以及噬菌体

通过用SalI限制性内切酶消化pKD13质粒(Datsenko等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,6640-6645(2000))，用Pfu聚合酶形成平末端，并用T4DNA连接酶(NEB)连接而生成pKD13ΔSalI质粒。

为了生成pKD13ΔSalI-1E质粒，使用引物pKD13_1Earray.fwd/pKD13_1Earray.rev通过PCR扩增pKD13ΔSalI骨架。从IDT订购编码强组成型启动子(J23100)、用KpnI限制酶切位点和XhoI限制酶切位点修饰的单一I-E型CRISPR重复和双终止子的化学合成的线性双链DNA(如

)，并使用1Earray_pKD13.fwd/1Earray_pKD13.rev通过PCR扩增。然后将Gibson装配(Gibson,D.G.Meth.Enzymol 498,349-361(2011))用于将扩增的

连接至pKD13ΔSalI骨架中卡那霉素抗性盒上游。KpnI/XhoI限制性酶切位点包括在

中以允许连续插入工程化的重复-间隔区对1。按照该方法将靶向大肠杆菌中的必需ftsA基因的工程化间隔区插入进pKD13ΔSalI-1E中以便生成pKD13ΔSalI-1E-ftsA质粒。

为了生成pcoi质粒，通过NheI/SacI使pBAD18质粒(Guzman等人，J.Bacteriol.177,4121-4130(1995))线性化。然后使用引物coi.fwd/coi.rev从用ZymoPlasmid DNA纯化试剂盒分离的P1溶原体PCR扩增coi基因。这些引物在所扩增的coi基因的两端引入NheI和SacI位点。然后用NheI/SacI消化PCR产物并连接至线性化pBAD18质粒中pBAD启动子下游。

为了将卡那霉素抗性盒整合进P1噬菌体基因组中，使用在5'端具有P1基因组特异性同源区的引物从pKD13PCR扩增卡那霉素抗性盒。将所得的线性PCR产物通过λ-red介导的重组整合进含有pKD46质粒19的大肠杆菌KL739中存在的P1噬菌体溶原体中。选择大肠杆菌KL739菌株是因为其具有与靶标细菌(如Bw25113、BL21、MG1655或志贺菌)实质上相似的R-M系统。

进行相同的方法来将氯霉素抗性基因(cat)或I-E型CRISPR阵列/ftsA间隔区整合进P1噬菌体基因组中。在这些情形中，从pKD3质粒(Datsenko等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,6640-6645(2000))扩增氯霉素(cm)抗性盒，从pKD13ΔSalI-1E-ftsA质粒扩增I-E型CRISPR阵列ftsA间隔区以及卡那霉素抗性盒。所有的质粒均通过菌落PCR筛选并通过测序验证。

生长条件.所有菌株均在37℃或30℃下以250rpm在15mL Falcon^TM圆底试管中培养，该管中装有含适当抗生素的LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母浸膏、10g/L氯化钠)。将相同的菌株平板接种于弥补有适当抗生素的LB琼脂(含1.5％琼脂的Luria Broth培养基)上并在37℃下温育。以如下终浓度施用抗生素：50μg/ml卡那霉素，50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素。以0.2％施用L-阿拉伯糖来诱导pcoi的表达。

转导测定法.将大肠杆菌和志贺菌菌株的冷藏母液划线接种于LB琼脂上并分离独立的菌落。将独立的菌落接种进3ml的LB培养基中并在37℃下以250rpm振摇过夜。然后收集培养物的离心沉淀并重新悬浮于1mL的感染培养基中，在Nanodrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific)上测量ABS600。基于ABS600值以及假定ABS600为1等价于8×10⁸个细胞/mL，测定每mL的菌落形成单位数(CFU/mL)。然后通过吸移将培养物与噬菌体裂解产物以基于实验的特定MOI混合。在一些情况下，需要将培养物稀释于感染培养基中至适当的CFU/mL以达成目标MOI。然后将培养物/噬菌体混合物在37℃下以250rpm振摇60-90分钟。最后，将200-300μl培养物/噬菌体混合物的适当稀释液平板接种于弥补有适当抗生素的LB琼脂上并在37℃下温育过夜。将平板上生长的菌落数/mL噬菌体裂解产物视为递送效率的指示。

对于超感染实验，将含有P1-ΔimcB/coi::kan^R或P1-ΔsimABC::kan^R的大肠杆菌冷藏母液在弥补有适当抗生素的LB琼脂上划线接种进行分离。将独立的菌落接种进3mL弥补有适当抗生素的LB培养基中并在37℃下以250rpm振摇过夜。

按照上述相同的转导规程，用P1-ΔimcB/coi::cm^R感染培养物并平板接种于弥补有卡那霉素、氯霉素或这二者的LB平板上。

噬菌体颗粒产生.将含有P1溶原体以及pcoi质粒或P1噬菌粒的菌株冷藏母液在LB琼脂上划线接种进行分离。将独立的菌落接种进3ml的LB培养基中并在37℃下以250rpm振摇过夜。将过夜培养物重新在5mL的P1裂解培养基(PLM；含有100mM MgCl₂和5mM CaCl₂的LB培养基)(Westwater等人，Microbiology 148,943-950(2002))中1:100稀释并通过在37℃下以250rpm振摇让其生长至ABS600约为0.6-0.8。然后添加L-阿拉伯糖以诱导coi基因的表达并触发P1噬菌体裂解周期。通过在37℃下以250rpm振摇让培养物裂解4-6小时。然后将裂解的培养物转移至15mL Eppendorf锥形管，添加氯仿至2.5重量％的终浓度并通过使管倒转数次进行混合。然后通过在4℃下离心10分钟使裂解细胞碎片形成沉淀，将上清液置于新的15mL Eppendorf管中。所有的裂解产物均在4℃下保存。

A.与在不具有甲基转移酶基因的菌株中产生相比，当在具有甲基转移酶基因的菌株中产生时噬菌体包装的DNA的甲基化程度不同.

从MG1655和缺少甲基转移酶基因的MG1655提取pCas3的质粒DNA。然后将DNA与(+)或不与(-)DpnI一起温育，DpnI是仅切割甲基化序列GAmTC的限制性内切酶。然后通过琼脂糖凝胶电泳与DNA大小标准参照物一起分离样品。数据显示，从MG1655提取的质粒DNA经历DpnI的切割(图2A，左边两个泳道)，而从缺少甲基转移酶基因的MG1655提取的DNA不经历切割(图2A，右边两个泳道)。

图2B示出了当在甲基转移酶阳性大肠杆菌菌株和甲基转移酶阴性大肠杆菌菌株中产生时提取自P1噬菌体颗粒的dsDNA。在具有或不具有dam和dcm两种甲基转移酶基因的大肠杆菌K-12菌株中产生P1衍生物LB002。用来自Norgen Biotek公司的噬菌体DNA分离试剂盒提取噬菌体DNA。随后每个反应使用120ng DNA，通过限制酶分析法分析噬菌体DNA：泳道1：VWR 2-log DNA分子量标准；泳道2、4、6：来自dam+dcm+大肠杆菌中产生的噬菌体的DNA；泳道3、5、7：来自dcm-dam-大肠杆菌中产生的噬菌体的DNA；泳道2-3：用AleI、NheI和XhoI消化的DNA；泳道4-5：用AleI、NheI、XhoI和DpnII消化的DNA；泳道6-7：用AleI、NheI、XhoI和StyD41消化的DNA。DpnII被Dam甲基化的DNA阻断。StyD41被Dcm进行的重叠甲基化阻断。这些数据显示，来自在不具有甲基化酶的细菌中产生的噬菌体的DNA，其甲基化程度低于来自在具有甲基化酶的细菌中产生的噬菌体的DNA，并且来自在具有甲基化酶的细菌中产生的噬菌体的DNA在所有可能的位点未甲基化。

B.可用于将合成DNA构建体整合进噬菌体基因组中的多个位点.

图3A中提供了示意图，示出了鉴定的P1噬菌体基因组中用于外来DNA的着陆位点。IS1和sim是噬菌体P1基因组内的非必需基因，coi-imcB是可弥补的。插入序列1(IS1)元件在P1功能中不具有已知的作用，而simABC操纵子涉及阻断超感染。构建了若干P1噬菌体变体，在这些变体中，这三个位点之一通过插入这样的DNA序列而被破坏：已插入进这些位点中的编码卡那霉素抗性的基因的DNA序列，或者侧接靶向大肠杆菌中的ftsA基因的I-E型CRISPR RNA的这种相同抗性基因的DNA序列。具体而言，在含有pcoi以及P1-ΔimcB/coi::kan^R、P1-ΔIS1::kan^R或者P1-ΔsimABC::kan^R的大肠杆菌K-12KL739中生成P1颗粒。在coi诱导后细胞裂解，将颗粒用于感染大肠杆菌K-12BW25113。将感染的细胞平板接种于含有卡那霉素的LB琼脂上。如图3B中所示，所得的颗粒使得能有效递送P1基因组至BW25113细胞。因此，多个着陆位点(整合位点)可供用于合成的构建体，其不会破坏P1复制、包装和递送。

C.缺失simABC操纵子对超感染的影响

simABC操纵子涉及通过阻断噬菌体DNA从周质转移进胞质而防止超感染(Kliem等人，Virology 171,350-355(1989))。在CRISPR抗微生物剂的背景中，如果细胞接受非功能性噬菌体的话，则超感染可能是重要的。为了测试simABC在超感染中的影响，我们生成了用P1基因组感染的MG1655细胞，所述P1基因组的imcB/coi或simABC替换成卡那霉素抗性标记(P1-ΔimcB/coi::kan^R(LB001)或P1-ΔsimABC::kan^R(LB002))。然后将含有P1-ΔimcB/coi::kan^R(LB001)或P1-ΔsimABC::kan^R(LB002)的细胞用噬菌体P1-ΔimcB/coi::cm^R感染并平板接种于kan、cm和kan+cm平板上(见图4A)。然后用P1以MOI＝10感染细胞，在P1中imcB/coi基因座被替换成氯霉素抗性标记。测量平板接种于任一抗生素或两种抗生素上的存活菌落数目。

出人意料的是，观察到保持所引入的P1基因组的细胞的数目类似，而不管细胞是否最初含有缺少imcB/coi或simABC的P1(图4B)。然而，当评价细胞对两种抗生素的抗性时，仅回收到最初用缺少simABC的P1感染的细胞。这些结果表明，simABC不会阻断超感染，而是在溶原性周期期间在复制或拷贝数控制方面起作用。因而，将合成的DNA插入simAB可允许用第二P1噬菌体基因组再感染。

D.P1基因组比P1噬菌粒更有效地包装和递送

在P1噬菌体颗粒中探究了包装和递送合成构建体的最有效手段。噬菌粒已成为编码合成构建体的标准手段，其中P1噬菌粒含有裂解复制起点、和pacA包装位点以及驱动P1裂解周期的coi基因的诱导型表达(Westwater等人，Microbiology 148,943-950(2002)；Kittleson等人，ACS synthetic biology 1,583-589(2012)))。虽然P1噬菌粒已用于DNA递送至各种革兰氏阴性菌以及用于转移DNA文库(同上文献)，但噬菌粒必须与P1基因组竞争进行包装。因此，细胞可能接受P1基因组或噬菌粒，从而潜在地使DNA递送和可编程杀灭复杂化。

为了直接评价噬菌粒和P1基因组的递送，我们用卡那霉素抗性标记替换P1中的imcB/coi操纵子的基因组拷贝。具体而言，在大肠杆菌K-12KL739细胞中生成P1颗粒，该细胞含有P1-ΔimcB/coi::kan^R(卡那霉素抗性)以及P1噬菌粒(氯霉素抗性)或pcoi(氨苄青霉素抗性)。然后我们将该基因组与具有诱导型表达的coi的P1噬菌粒或质粒在大肠杆菌K-12亚株KL739中组合，以生成噬菌体颗粒。然后将该颗粒用于感染大肠杆菌K-12MG1655或大肠杆菌B BL21，接着将感染的细胞平板接种于含有指示的抗生素的LB琼脂上。该实验一式三份进行。

结果在图5中示出，证实了对于大肠杆菌的两种不同菌株而言，P1基因组比P1噬菌粒的包装和递送效率更高。图5显示，P1基因组递送频率比噬菌粒高约100倍，并且约4％接受噬菌粒的细胞也接受P1基因组，尽管细胞大大过剩(感染复数(MOI)＝0.003)。当用pcoi质粒生成颗粒时，P1基因组表现出高约300倍的递送，表明噬菌粒可能干扰P1裂解周期或颗粒生成。pcoi质粒也比P1基因组递送频率低约33,000倍。当感染大肠杆菌B亚株BL21时观察到类似趋势，尽管该菌株感染频率低于MG1655。因而，至少对于P1系统，工程化改造噬菌体本身产生的裂解产物具有比工程化产物高得多的滴度。P1基因组因而提供了比P1噬菌粒更有效的递送媒介。

E.P1递送效率随环境条件变化

用噬菌体进行的DNA递送通常在特定的培养基条件下进行，例如PLM培养基(含有100mM MgCl₂和5mM CaCl₂的LB培养基)用于P1转导和噬菌粒递送(Kittleson等人，ACSsynthetic biology 1,583-589(2012))。然而，实践应用将涉及各种环境，这些环境可影响递送效率。为了了解用P1进行的DNA递送如何受这些条件的影响，将在LB培养基中生长的大肠杆菌K-12BW25113细胞转移至不同的培养基并测量使用用pcoi质粒生成的颗粒进行的P1基因组递送。在从PLM中移除MgCl₂但不移除CaCl₂之后感染性(DNA递送)保持相同(图6)，这与CaCl2对于细胞粘附的重要性一致(Watanabe等人，J.Gen.Virol.17,19-30(1972))。然而，CaCl₂对于DNA递送不是充分的，因为CaCl₂水平类似于PLM的基本培养基表现出大大降低的递送。有意思的是，胎牛血清和PLM培养基(含有100mM MgCl₂和5mM CaCl₂的LB培养基)中的细胞产生相似的递送效率，表明P1可以在更多体内环境中有效地递送DNA。

总体而言，这些数据显示，P1基因组可以在不同的培养基条件下递送，其中这些条件对递送效率有大的影响。

F.DNA甲基化和递送

图7A中示出了使用具有+/-DNA甲基化的P1噬菌体(即在为DNA甲基化(+)或DNA甲基化(-)的细菌中产生的P1)将DNA递送至大肠杆菌。在大肠杆菌MG1655或在MG1655ΔdamΔdcmΔhdsRMS(缺少甲基化酶和靶向未甲基化的DNA的限制性内切酶)中产生携带卡那霉素抗性盒的噬菌体P1。用在MG1655中或在MG1655ΔdamΔdcmΔhdsRMS中产生的噬菌体P1感染MG1655。类似地，用在MG1655中或在MG1655ΔdamΔdcmΔhdsRMS中产生的噬菌体P1感染MG1655ΔdamΔdcmΔhdsRMS。然后比较菌株和感染之间受感染大肠杆菌细胞的数目(通过在卡那霉素选择下生长的CFU测量)。图7B示出了由噬菌体LB002+/-甲基化递送DNA至大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌的差异。在大肠杆菌MG1655或在MG1655ΔdamΔdcmΔhdsRMS(缺少甲基化酶和靶向未甲基化的DNA的限制性内切酶)中产生携带卡那霉素抗性盒的噬菌体P1。用在MG1655中或在MG1655ΔdamΔdcmΔhdsRMS中产生的LB002感染大肠杆菌R4。类似地，用在MG1655中或在MG1655ΔdamΔdcmΔhdsRMS中产生的LB002感染肺炎克雷伯杆菌(K.pn)R196和K.pn R615。然后比较感染之间的LB002感染单位(通过在卡那霉素选择下生长的大肠杆菌或K.pn菌CFU测量)。图7C示出了使用+/-DNA甲基化的M13KO7(M13的变体)噬菌体将DNA递送至大肠杆菌。在甲基化酶阳性(+)大肠杆菌(TOP10F’)或在甲基化酶阴性(-)大肠杆菌(JM110)中产生M13KO7。随后用在甲基化酶(+)大肠杆菌中或在甲基化酶(-)大肠杆菌中产生的M13KO7感染TOP10F’、EMG2和JM110细菌菌株。然后按照菌株比较受感染的大肠杆菌细胞的数目。TOP10F’：编码dam和dcm但缺少限制性内切酶；EMG2：限制-甲基化系统是完整的(将降解未甲基化的双链DNA)；JM110：不编码dam和dcm并且缺少限制性内切酶。这些数据显示，相比于在不具有甲基化酶的细菌中产生的噬菌体，在具有甲基化酶的细菌中产生的噬菌体表现出更高的生产性感染力(DNA递送)。

G.大肠杆菌中的DNA递送和CRISPR-介导的杀灭

将大肠杆菌天然的I-E型CRISPR-Cas系统用于解决P1基因组是否可以容纳CRISPR-Cas系统的一种或多种组分并随后引发CRISPR介导的杀灭的问题。为此，将大肠杆菌K-12BW25113和含有pcas3质粒的大肠杆菌K-12BW25113Δcas3的冷藏母液在LB琼脂上划线接种进行分离，培养表达CASCADE并且表达Cas3(I-E型CRISPR-Cas系统的组分，“+cas”)或不表达Cas3(“-cas”)的大肠杆菌。

具体而言，将独立的菌落接种进3ml的LB培养基中并在37℃下以250rpm振摇过夜。然后收集培养物的离心沉淀并重新悬浮于1mL的PLM(含有100mM MgCl₂和5mM CaCl₂的LB培养基)中，在Nanodrop2000c分光光度计(Thermo Scientific)上测量ABS600。然后将培养物在PLM中稀释至ABS600＝0.001，并将每种菌株用被工程化改造成表达靶向ftsA的crRNA的噬菌体P1(CRISPR噬菌体)以指定的感染复数(MOI)感染；添加适当量的噬菌体裂解产物以实现不同的MOI(包括O)。将培养物/噬菌体混合物通过吸移混合并在37℃下以250rpm振摇。然后比较不同条件之间的细菌生长，由600nm下的吸光度(OD600)测量，每30分钟测一次，进行长达7小时。然后比较每种菌株在不同MOI下的存活细菌细胞的数目。

图8A显示，表达Cascade和Cas3(I-E型CRISPR-Cas系统的组分，“+cas”)或不表达这些(“-cas”)的大肠杆菌显示在递送装备有靶向基因组的CRISPR RNA的P1后，I-E型Cascade和Cas3负面影响生长。正如预期的，CRISPR-噬菌体在两种细胞类型中均显示出明显的生长延迟，其中在“+cas”组中生长抑制提高。这证明了CRISPR-Cas系统与单独的噬菌体相比其抗微生物效果改善。

观察到在MOI>1时CRISPR-噬菌体在两种细胞类型中均杀灭细胞，正如预期的，在“+cas”组中杀灭提高。如图8B中所述，在递送装备有靶向基因组的CRISPR RNA的P1后，I-E型Cascade和Cas3负面影响存活率。用工程化改造成表达靶向ftsA的crRNA的噬菌体P1(CRISPR噬菌体)以指定的MOI感染表达Cascade和Cas3(I-E型CRISPR-Cas系统的组分，“+cas”)或不表达这些(“-cas”)的大肠杆菌。这些数据清楚地展示，与单独的噬菌体相比，CRISPR显著地增强了杀灭。

此外，递送在不同位置编码靶向基因组的CRISPR RNA的P1基因组在存在I-E型Cascade和Cas3的情况下杀灭大肠杆菌。不像II型/Cas9CRIPSR-Cas系统，I-E型CRISPR-Cas系统可在所有潜在位点引发强力的细胞死亡(Gomaa,A.A.等人，MBio 5,e00928-913(2014)；Cui等人，Nucleic Acids Res.(2016).doi:10.1093/nar/gkw223)。将靶向大肠杆菌中的必需ftsA基因的间隔区(Gomaa,A.A.等人，MBio5,e00928-913(2014))插入进P1基因组中的coi/imcB、IS1或simABC着陆位点中。然后将所得的P1噬菌体用于感染所有I-E型Cas蛋白(Cas3、Cse1、Cse2、Cas5e、Cas6e、Cas7)表达或不表达的大肠杆菌BW25113细胞，该噬菌体含有插入进P1coi-imcB基因、IS1基因或sim基因中的靶向ftsA的crRNA。然后将细胞与噬菌体以不同的MOI混合，并在生长七个小时后测量细菌细胞密度(培养物的浊度)的改变。我们发现，细胞缺少Cas蛋白的所有培养物表现出细胞密度的实质增加，尽管在较高MOI时最终浊度较低(图8C)。相比之下，表达所有I-E型Cas蛋白(Cas3、Cse1、Cse2、Cas5e、Cas6e、Cas7)的细胞的培养物表现出极小到不可检测的生长(*),从而显示了CRISPR/噬菌体处理可消除生长(图8C)。这些结果表明，装备有CRISPR-Cas系统的组分的P1基因组可用于引发CRISPR介导的杀灭。

培养期间的CRISPR/噬菌体处理可导致活力降低的另外证据在图8D中提供。用(1)含有靶向ftsA的crRNA的基因组插入替代coi基因的噬菌体P1或(2)不用噬菌体感染表达I-E型CRISPR Cas3的大肠杆菌，并比较存活细菌细胞的数目。暴露于噬菌体的大肠杆菌表现出4-log(～10000x)的活力丧失。因而，在不存在CRISPR装备的噬菌体时，具有或不具有Cas蛋白的两种细胞在7小时后均显示出实质的生长。然而，当将噬菌体包括在初始培养物中时，对于表达整套Cas蛋白的细胞，观察不到可检测的生长。

H.DNA有效递送至弗氏志贺菌

为了研究P1基因组是否可用于感染埃希杆菌属以外的其它属，测试了弗氏志贺菌的两种菌株。该物种与世界范围的腹泻疾病志贺菌病相关。志贺菌每年在美国造成约500,000例腹泻，包括27,000次耐药性感染。测量了imcB/coi操纵子被替换成卡那霉素抗性标记的P1基因组的递送。经测定，所得的P1颗粒有效地递送基因组至弗氏志贺菌的两个菌株，菌落形成单位数介于对大肠杆菌MG1655和大肠杆菌BL21的观察结果之间(图9)。这些结果确认了P1基因组可被递送并稳定地维持在多个属中，从而使得有可能将P1用作CRISPR抗微生物剂的多物种递送载体。

I.靶向抗生素抗性细菌

我们将P1CRISPR噬菌体(靶向ftsA)和环丙沙星的组合与单独使用P1CRISPR噬菌体来杀灭大肠杆菌R182(一种环丙沙星抗性菌株)进行比较(图10A)。环丙沙星(Cip)剂量为最高的治疗相关浓度(每毫升4微克)，已知R182对该浓度的环丙沙星耐受。用靶向大肠杆菌ftsA基因的CRISPR噬菌体以一系列感染复数(MOI)感染大肠杆菌。正如预期的，单独环丙沙星不会降低细菌的活力(图10A)。相比之下，增加CRISPR噬菌体MOI导致了活细菌细胞减少有不依赖于抗生素的增加(图10A)。

此外，将P1CRISPR噬菌体(靶向ftsA)和亚胺培南(大肠杆菌感染中的一种标准护理抗生素)的组合与单独的P1CRISPR噬菌体相比较其杀灭大肠杆菌R182(一种环丙沙星抗性菌株)的效力(图10B)。亚胺培南保持恒定的剂量(大肠杆菌R182的LD50)，导致0.3-log的基线CFU降低。用CRISPR噬菌体以一系列MOI感染大肠杆菌细胞。在MOI＝2时，观察到联合处理相对于单独的噬菌体或抗生素而言效果显著(P<0.05)。在更高MOI时，CRISPR噬菌体发挥主导杀灭效果，表明噬菌体+抗生素的组合可具有累加效应。

最后，我们比较了活大肠杆菌R182细胞在暴露于亚胺培南、靶向ftsA的P1CRISPR噬菌体或这二者的组合后的减少(图10C)。对于相关的条件(对于每个条件n＝3)，将亚胺培南保持恒定剂量(大肠杆菌R182的LD50)，而CRISPR噬菌体保持为MOI＝2。在有或没有亚胺培南的CRISPR噬菌体感染后120分钟，观察到细菌杀灭。

J.靶向小鼠中的大肠杆菌感染

靶向大肠杆菌的CRISPR噬菌体可降低大腿肌感染的小鼠模型中的活菌计数(图11A)。给小鼠施以1.6x10⁶CFU的大肠杆菌的大腿肌内注射，然后大腿肌内注射1.9x10¹¹pfu的靶向ftsA的CRISPR噬菌体进行噬菌体处理，或者施用50uL TBS(无处理对照)。在噬菌体处理后30、60、120、180和240分钟测量大腿组织的活菌计数。观察到噬菌体处理一致地导致约0.3-log降低，并且在两个时间点的细菌计数降低是统计上显著的(P<0.05)和(P<0.001)。

图11B显示，靶向大肠杆菌的CRISPR噬菌体在小鼠模型中增加动物存活时间。通过腹膜内(IP)注入5％猪粘蛋白中的剂量为1.5x10⁷CFU的大肠杆菌菌株R260来感染小鼠，然后让其不经处理或者通过IP注入单剂量的靶向大肠杆菌基因ftsA的CRISPR噬菌体(剂量＝1.9x10¹¹pfu，MOI＝约100)进行处理。经测定，单剂量噬菌体处理显著延长了小鼠存活(Wilcoxon检验，P<0.05)。

L.延长的间隔区长度可引发杀灭

CRISPR RNA间隔区不是野生型长度的I-E型系统可引发细胞杀灭。设计具有32-nt间隔区(野生型长度)(+0)或44-nt间隔区(+12)的CRISPR RNA来靶向大肠杆菌MG1655基因组中lacZ基因周围的四个位置(p1、as1、p2和s1)(图12)。该延长是在44-nt间隔区的3'端以与靶标序列实质上相同。将表达每种CRISPR RNA为重复-间隔区-重复的质粒转化进表达I-E型Cas3和Cascade蛋白的大肠杆菌MG1655中。转化效率的下降反映基因组攻击和细胞死亡，其中仅一些细胞能够通过对靶标序列、间隔区或Cas蛋白的突变来逃避杀灭。如数据中所示，所有设计的CRISPR RNA均导致与无间隔区对照相比有10³至10⁵的转化效率降低，证明了具有更长间隔区的CRISPR RNA可引发靶向杀灭。出乎意料的是，更大的复合物仍能够募集和激活Cas3。晶体结构表明，在整个复合物上发生的大的构象改变是激活Cas3所需要的(Mulepati等人，Science 345(6203):1479-84(2014)；Jackson等人，Science 345(6203):1473-9(2014)；Rutkauskas等人，Cell Rep pii:S2211-1247(15)00135-7(2015)；Gong等人，Proc Natl Acad Sci U S A.111(46):16359-64(2014))，并且预计，添加额外的蛋白质亚基将会破坏这些构象改变。数据表明这种情况并未发生，并且显示，延长的间隔区引发与正常长度间隔区相似的杀灭水平(基于相似的转化效率降低)。

M.编码来自大肠杆菌的I-E型CRISPR-Cas系统或来自Bacillus halodurans的I-C型CRISPR-Cas系统的噬菌体颗粒

将来自大肠杆菌的整个I-E型CRISPR-Cas系统或来自Bacillus halodurans的I-C型CRISPR-Cas系统编码进P1噬菌体基因组中，并用于证实大肠杆菌的靶向杀灭。在每种情形中，将编码I-C型CRISPR-Cas系统或I-E型CRISPR-Cas系统(如I-E型Cascade或I-C型Cascade多肽和Cas3多肽)的一种或多种多核苷酸以及CRISPR阵列引入至P1基因组中，处于噬菌体基因组中的选定位点处(如，非必需整合位点或整合的弥补位点处)。合成编码I-C型CRISPR-Cas系统或I-E型CRISPR-Cas系统的所述一种或多种多核苷酸或者利用PCR从来源菌株扩增，并克隆进供体质粒载体(例如：pKD3、pKD13等)中。该供体载体被设计成具有特定的抗生素抗性和匹配P1中的选定着陆位点的同源区。利用同源重组，将编码I-C型CRISPR-Cas系统或I-E型CRISPR-Cas系统的一种或多种多核苷酸克隆进生产菌株中存在的P1溶源体中。通过抗生素抗性选择阳性克隆。如果抗生素抗性标记侧接重组酶位点(如FRT位点)，则该抗性标记可通过表达本领域已知的重组酶而切除。

按照相同的方法，将编码靶向基因组的crRNA的CRISPR阵列编码进P1基因组中与cas基因的位点不同的着陆整合位点。该CRISPR阵列被设计成靶向靶标菌株而不是生产菌株中存在的特异性序列。

然后产生噬菌体颗粒并施用给靶标菌株，对活性菌落的数目进行计数。在一些方面，使用甲基化模式与靶标宿主细菌的甲基化模式实质上相似的生产宿主菌株产生噬菌体颗粒。相较于无噬菌体或非靶向噬菌体，所设计的噬菌体将大大降低活性菌落的数目。

讨论

广谱宿主的P1噬菌体被证明能有效递送DNA至多种细菌物种，因此可用作递送CRISPR抗微生物剂的平台。广谱宿主噬菌体的一个优点是，可从单种工业生产菌株生成单一平台并应用于针对一系列细菌。例如，可在共生性大肠杆菌的工业菌株中产生P1颗粒，然后用于对抗肠道病原体诸如肠出血性大肠杆菌、志贺菌或克雷伯杆菌的感染。将生产菌株与感染菌株分开的能力解决了培养大量批次的细菌性病原体以便产生对抗相同病原体的噬菌体颗粒的生物制造方面的挑战。其还使得有可能仅通过改变CRISPR阵列而便利地改良抗微生物剂以靶向不同物种。

前述内容示例了本发明，其不应该被理解为是对本发明进行限制。本发明由以下权利要求书限定，其中所述权利要求的等价内容应该包含在其中。

Claims

1.一种选择性杀死至少一个靶细菌物种的方法，包括：

使所述至少一个靶细菌物种与包含重组I型CRISPR-Cas系统的噬菌体接触，所述I型CRISPR-Cas系统包含：

编码I型CRISPR阵列的多核苷酸和一种或多种I型Cascade多肽的多核苷酸，以及

编码Cas3多肽或Cas3’和Cas3”多肽的多核苷酸；

其中包含在噬菌体DNA中的所述I型CRISPR阵列包含与所述至少一个靶细菌物种内的靶DNA具有实质互补性的至少一个间隔区；并且

其中所述I型CRISPR-Cas系统被整合入所述噬菌体DNA内，并且所述噬菌体并非噬菌粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述I型CRISPR-Cas系统被整合在噬菌体DNA内的非必需位点或弥补位点。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述非必需位点是(a)噬菌体编码的限制-修饰系统，(b)阻断超感染的基因，(c)限制-修饰系统的抑制剂，(d)插入序列元件，(e)沉溺系统，或(f)其任何组合。

4.根据权利要求2的方法，其中所述弥补位点是(a)裂解周期激活因子，(b)裂解基因，(c)tRNA，(d)颗粒组分，或(e)其任何组合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述I型CRISPR阵列包括重复-间隔区-重复序列，或两个或更多个重复-间隔区序列，其中所述两个或更多个重复-间隔区序列包含至少第一重复-间隔区序列和最终的重复-间隔区序列，并且所述第一重复-间隔区序列的间隔区的3’末端与下一重复-间隔区序列的重复序列的5’端相连，以及所述最终的重复-间隔区序列在3’端与重复序列相连。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶细菌物种是大肠杆菌(E.coli)物种。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶细菌物种是抗生素抗性的。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶细菌物种为多种细菌。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述噬菌体是温和噬菌体，其具有溶原性的或裂解性的性质。

10.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述噬菌体是具有裂解特性的裂解性噬菌体。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细菌物种是铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)或黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)。