JP7290368B2 - 核酸およびｒｎａに基づく抗菌剤の効率的な送達のための方法および組成物 - Google Patents

核酸およびｒｎａに基づく抗菌剤の効率的な送達のための方法および組成物 Download PDF

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Description

［優先権の陳述］
本出願は、２０１５年６月１５日に出願された米国仮出願番号６２／１７５，７４９の合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、その内容全体は、参照により本明細書中に援用される。
［連邦支援の研究に関する陳述］
本発明は、全米科学財団により授けられた助成金番号ＭＣＢ－１４５２９０２の下での政府支援でなされた。政府は本発明における特定の権限を有する。
［本発明の分野］
本発明は、バクテリオファージＤＮＡおよびファージミドＤＮＡのメチル化パターンを改変するための方法および組成物に関する。本発明は、さらに、改変されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素を含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージを用いた、細菌の選択的な死滅のための方法および組成物に関する。
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）は、ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（ｃａｓ）と組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成し、多くの細菌および古細菌の大部分において適応免疫を与える。ＣＲＩＳＰＲが仲介する免疫付与は、同一配列を含む侵入者による将来の感染を妨害するために用いることのできる、プラスミドおよびファージなどの侵襲性遺伝因子由来のＤＮＡの組込みを介して生じる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、超可変配列の「スペーサー」配列によって隔てられた短いＤＮＡ「リピート」のＣＲＩＳＰＲアレイおよび隣接するｃａｓ遺伝子のセットからなる。システムは、外来核酸の干渉および配列特異的ターゲッティングを通してファージおよびプラスミドなどの侵襲性遺伝因子に対する適応免疫を提供することによって作用する（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１５：１７０９－１７１２；Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－４；Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２７：１６７－７０；Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ａｎｄ Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２２：１８４３－１８４５；Ｂｈａｙａ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４５：２７３－２９７；Ｔｅｒｎｓ ａｎｄ Ｔｅｒｎｓ．２０１１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：３２１－３２７；Ｗｅｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４６：３１１－３３９；Ｂａｒｒａｎｇｏｕ Ｒ．２０１３．ＲＮＡ．４：２６７－２７８）。典型的に、侵襲性ＤＮＡ配列は、新規の「スペーサー」として獲得され（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１５：１７０９－１７１２）、それぞれがＣＲＩＳＰＲリピートと対になり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座において新規のリピート－スペーサーユニットとして挿入される。「スペーサー」は、全てのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに普遍的なＣａｓ１およびＣａｓ２タンパク質によって獲得され（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７－４７７；Ｙｏｓｅｆ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４０：５５６９－５５７６）、一部のシステムでは、Ｃａｓ４タンパク質が関与している（Ｐｌａｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１９４：２４９１－２５００；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１２．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４７２３２）。生じるリピート－スペーサーアレイは、長いｐｒｅ－ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）として転写され（Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－４）、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列特異的な認識を駆動するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に処理される。具体的には、ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより仲介される配列特異的核酸切断のために、ヌクレアーゼを相補標的に向かってガイドする（Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｎａｔｕｒｅ．４６８：６７－７１；Ｈａｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２９：１３５５－１３５８；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３９：９２７５－９２８２；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－８２１；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６；Ｍａｇａｄａｎ ｅｔ ａｌ．２０１２．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．７：ｅ４０９１３；Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１３．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．１０：８４１－８５１）。
これらの普及したシステムは、細菌の半分近く（約４６％）および大部分の古細菌（約９０％）で生じる。それらは、ｃａｓ遺伝子の内容、ｃｒＲＮＡ生物発生を駆動する生化学的プロセスにおける多様性および組織化、ならびに、標的認識および切断を仲介するＣａｓタンパク質複合体に基づいて、６つの主なタイプに分類される（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ． ２０１１．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７－４７７；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４１：４３６０－４３７７；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：７２２－７３６；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．６０：３８５－３９７））。Ｉ型およびＩＩＩ型では、特殊化されたＣａｓエンドヌクレアーゼがｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを処理して、それから、ｃｒＲＮＡに相補な核酸を認識および切断することが可能な大きなマルチ－Ｃａｓタンパク質複合体に集合する。異なるプロセスは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関与する。ここで、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）がｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズするメカニズムにより処理される。ハイブリダイズしたｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩにより切断され、各スペーサーの５’末端を除去する第２のイベントが続き、ｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９の両方と結合したままの成熟ｃｒＲＮＡが生産される。成熟複合体は、それから、複合体内のスペーサー配列と相補の標的ｄｓＤＮＡ配列（「プロトスペーサー」配列）を探して両鎖を切断する。ＩＩ型システムでの複合体による標的の認識および切断は、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体上のスペーサー配列と標的「プロトスペーサー」配列（本明細書において、スペーサー配列と相補の鎖として定義される）との間で相補の配列を必要とするだけでなく、プロトスペーサー配列の５’末端に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も必要とする。必要とされる正確なＰＡＭ配列は、異なるＩＩ型システム間で変化し得る。
Ｉ型システムは、細菌および古細菌において最も普及していて（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７－４７７）、ＤＮＡを標的化する（Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－４）。抗ウイルス防御に関するＣＲＩＳＰＲ関連複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）と呼ばれる３～８個のＣａｓタンパク質の複合体は、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを処理して（Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－４）、ｃｒＲＮＡが、ｃｒＲＮＡのスペーサー部分に相補である「プロトスペーサー」と呼ばれるＤＮＡ配列を認識するように維持する。ｃｒＲＮＡスペーサーとプロトスペーサーとの間の相補性とは別に、標的化は、プロトスペーサーの３’末端に位置するプロトスペーサー－隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とする（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５：７３３－７４０；Ｓｏｒｅｋ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８２：２３７－２６６）。Ｉ型システムについては、ＰＡＭは、Ｃａｓｃａｄｅによって直接認識される（Ｓａｓｈｉｔａｌ ｅｔ ａｌ．２０１２． Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ４６：６０６－６１５；Ｗｅｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ４６：５９５－６０５）。必要とされる正確なＰＡＭ配列は、異なるＩ型システム間で変化し得て、確立された生物情報学および実験手順を通して同定することができる（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：１１１６－１１１２１；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９；Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５：７３３－７４０）。プロトスペーサーが認識された時点で、Ｃａｓｃａｄｅは一般に、エンドヌクレアーゼＣａｓ３を動員して、それは、標的ＤＮＡを切断および分解する（Ｓｉｎｋｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．２０１１．ＥＭＢＯ Ｊ．３０：１３３５－１３４２；Ｓｉｎｋｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．２０１３．ＥＭＢＯ Ｊ．３２：３８５－３９４）。
バクテリオファージ（またはファージ）は、複製するために宿主の細胞機構に頼る細菌性ウイルスである。一般に、ファージは、一般に、３つのカテゴリーに分類される：溶菌性、溶原性、およびテンペレート。溶菌性バクテリオファージは、宿主細胞に感染して、非常に多くの回数の複製を受けて、そして、細胞溶解を引き起こして、新たに作られたバクテリオファージ粒子を放出する。溶原性バクテリオファージは、細菌性ゲノム内または染色体外プラスミドとしてのいずれかで、宿主細胞内に永久に存在する。テンペレートバクテリオファージは、溶菌性または溶原性であることが可能であり、細胞の増殖状態および生理学的状態に応じて、他方に対して一方を選択する。
ファージは、１９５０年代にさかのぼって、合成ＤＮＡをパッケージおよび送達するために用いられている（Ｌｅｎｎｏｘ，Ｅ．ｓ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １（２）：１９０－２０６（１９５０））。今では、３つの一般的なアプローチが採用されている。第一のアプローチの下では、合成ＤＮＡは、バクテリオファージゲノム中にランダムに組み換えられて、それは通常、選択可能なマーカーを含む。このアプローチは、現代の分子生物学技術の到来前に、ファージ研究の初期にしばしば用いられた。第二のアプローチの下では、ファージ内の制限部位を用いて、合成ＤＮＡをインビトロで導入する。Ｅ．ｃｏｌｉ λファージは、組み込まれた制限部位を有するλバクテリオファージのいくつかの商業的供給源が利用可能である主要な例である（Ｃｈａｕｔｈａｉｗａｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６，５７７－５９１（１９９２））。第三のアプローチの下では、ファージパッケージ部位および溶菌性の複製起点を一般にコードするプラスミドは、バクテリオファージ粒子の集合の部分としてパッケージされる（Ｗｅｓｔｗａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅａｄ．Ｅｎｇｌ．１４８，９４３－９５０（２００２）；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，１０３－１０７（１９９０））。生じるプラスミドは、「ファージミド」を作っている（ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｃｏｉｎｅｄ）。ファージミドは、個々の遺伝子または構築物を送達するため、例えば、内因性パスウェイを再プログラムするため、または、細胞死を誘導するために、主に用いられている（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，１０３－１０７（１９９０）；Ｌｕ＆Ｃｏｌｌｉｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４，１１１９７－１１２０２（２００７）；Ｃｉｔｏｒｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）３２（１１）：１１４１－１１４５；Ｂｉｋａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）３２（１１）：１１４６－１１５０；Ｋｉｔｔｌｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．１，５８３－５８９（２０１２））。
大部分のファージは、進化的な理由で所定の細菌株に制限される。不適合株へのそれらの遺伝物質の注入は逆効果であり、したがって、ファージは、株の制限された代表例（ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎ）に特異的に感染するように進化されている。しかしながら、一部のファージは、それらの遺伝物質を広範囲の細菌に注入することができることが発見されている。古典的な例は、Ｐ１ファージであり、ＤＮＡを様々なグラム陰性細菌に注入することが示されていて、一部は、その天然のＥ．ｃｏｌｉ宿主を十分に超える（Ｗｅｓｔｗａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅａｄ．Ｅｎｇｌ．１４８，９４３－９５０（２００２）；Ｋａｉｓｅｒ＆Ｄｗｏｒｋｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １８７，６５３－６５４（１９７５）；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５５，３１７－３２９（１９８３）。
Ｐ１などのファージは、合成ＤＮＡを送達するための一般化されたプラットフォームを提供することができるが、それらはユビキタスなバリア：制限修飾（Ｒ－Ｍ）系に直面する。これらの細菌防御システムは、ＤＮＡを特定の配列でメチル化するメチラーゼ（メチルトランスフェラーゼ）および／または非メチル化（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型）またはメチル化（ＩＶ型）のＤＮＡを切断する制限酵素からなる。これらのシステムが、外来のメチル化パターンを有するＤＮＡと直面すると、制限酵素は、多くの位置でＤＮＡを切断し、修復の潜在性を制限する。メチル化を受けない任意の外来ＤＮＡは、制限酵素を逃れることができるが、これが生じる可能性は低い。ほとんどの細菌は、別個のメチル化パターンを産生する多数のＲ－Ｍ系をコードするので、合成ＤＮＡをランダムの細菌に導入することは、大きなチャレンジを提起し得る。
本発明は、バクテリオファージおよびファージミドＤＮＡのメチル化を改変するための方法、および、ゲノム標的化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの送達におけるバクテリオファージ粒子の使用のための方法および組成物を提供することにより、当該分野の以前の欠点を克服する。
一態様では、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡのメチル化パターンを改変する方法は、（１）生産宿主細菌の内因性制限修飾系（Ｒ－Ｍ系）の少なくとも１つの酵素の活性を破壊するステップ（それにより、破壊された内因性Ｒ－Ｍ系の少なくとも１つの酵素の活性を有する改変された生産宿主細菌を生産する）、および／または、（２）生産宿主細菌に、少なくとも１つの異種メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入するステップ（それにより、異種メチルトランスフェラーゼを発現する改変された生産宿主細菌を生産する）を含む、生産宿主細菌のメチル化活性を変更するステップ；変更されたメチル化活性を有する改変された生産宿主細菌に、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を感染させるステップ（それにより、前記バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡをメチル化する）；および、改変されたメチル化パターンを有するバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を生産するステップを含む。一部の態様では、感染させるステップは、生産宿主細菌のメチル化活性を変更するステップの前に行なうことができる。
別の態様では、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡのメチル化パターンを改変する方法は：生産宿主細菌に、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を感染させるステップ（ここで、生産宿主細菌は、内因性Ｒ－Ｍ系の少なくとも１つの酵素の破壊および／または少なくとも１つの異種メチルトランスフェラーゼの発現を介して変更されたメチル化活性を有し、それにより、前記バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡをメチル化する）；および、改変されたメチル化パターンを有するバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を生産するステップを含む。
さらなる態様では、本発明は、目的の異種核酸を、標的宿主細菌中に、バクテリオファージを介して導入する効率を高める方法を提供し、生産宿主細菌に、少なくとも１つの目的の異種核酸を含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を感染させるステップ（ここで、生産宿主細菌は、内因性制限修飾系（Ｒ－Ｍ系）の少なくとも１つの酵素の破壊および／または少なくとも１つの異種メチルトランスフェラーゼの発現を介して変更されたメチル化活性を有し、それにより、前記バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡをメチル化する）；改変されたメチル化パターンを有するおよび前記の少なくとも１つの目的の異種核酸を含む／コードするバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を生産するステップ；および、標的宿主細菌に、前記バクテリオファージ粒子を感染させるステップを含み、ここで、標的宿主細菌は、生産宿主細菌のものと実質的に類似する（すなわち適合する）メチル化パターン（またはＲ－Ｍ系（単数または複数））を有し、それにより、前記標的宿主バクテリオファージ中に前記の目的の異種核酸を導入する効率を高める。
一部の態様では、本発明の方法によって生産されるバクテリオファージ粒子が提供される。本発明のさらなる態様は、標的宿主細菌の制限修飾系（単数または複数）と実質的に類似する改変されたＤＮＡメチル化パターンを含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供する。一部の態様では、少なくとも１つの目的の異種核酸は、バクテリオファージによる生産宿主細菌の感染の前に、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡに導入されて、それにより、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡと一緒に、前記の少なくとも１つの目的の異種核酸をメチル化する。さらなる態様では、前記の少なくとも１つの目的の異種核酸は、ＣＲＩＳＰＲアレイ（例えば、Ｉ型またはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ）をコードする。さらなる態様では、前記の少なくとも１つの目的の異種核酸は、組み換えＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたは組み換えＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする。
本発明のさらなる態様は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチドを含むバクテリオファージＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供する。さらなる態様では、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチドを含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子が提供される。
本発明の別の態様は、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供し、ここで、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、：（ａ）Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチド；およびｃ）ｔｒａｃｒ核酸を含む組み換えＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、場合により、ｔｒａｃｒ核酸およびＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチドは、互いに融合されて、単一ガイド核酸を形成する。
本発明のさらなる態様は、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供し、ここで、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチド；および（ｂ）１つまたは複数のＩ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組み換えＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。一部の態様では、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチド、および、Ｃａｓ３ポリペプチド、またはＣａｓ３’ポリペプチドおよびＣａｓ３’’ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
さらなる態様では、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムまたはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｔｒａｃｒ核酸、および／または、１つまたは複数のＩ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、不必要な部位または相補部位において、バクテリオファージＤＮＡに組み込まれる。
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの標的細菌種または株を選択的に死滅させる方法を提供し、前記の少なくとも１つの標的細菌種または株を、本発明のバクテリオファージ粒子と接触させるステップを含み、ここで、前記バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡ内に含まれるＣＲＩＳＰＲアレイは、前記の少なくとも１つの標的細菌種または株内の標的ＤＮＡと実質的な相補性を有する少なくとも１つのスペーサーを含む。本発明の一部の態様では、バクテリオファージ粒子は、標的細菌種または株とは異なる細菌種または株において生産される。
本明細書においてさらに提供されるのは、バクテリオファージ粒子、発現カセット、および、本発明の組み換え核酸分子、ＣＲＩＳＰＲアレイ、および／または異種ポリヌクレオチドを含む細胞である。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明において詳細に示される。
ＣＲＩＳＰＲ抗菌剤の送達のためのプラットフォームとしての、バクテリオファージ粒子を生産する一般的なプロセスの概略を提供する。 メチルトランスフェラーゼを有さない細菌株由来のプラスミドＤＮＡは、メチル化ＤＮＡを標的化する制限酵素によって分解されないことを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株由来のＤＮＡは、左の２レーンであり、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Δｄａｍ Δｄｃｍ ΔｈｓｄＲＭＳ株（メチルトランスフェラーゼ遺伝子を欠く）由来のＤＮＡは、右の２レーンである（図２Ａ）。ＤＮＡを、Ｄｐｎ１とともに（＋）またはともなわずに（－）インキュベートした。図２Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉのメチルトランスフェラーゼ陽性株において生産した場合の、Ｐ１バクテリオファージ粒子から抽出されたｄｓＤＮＡを示す。レーン１：ＶＷＲ ２－ｌｏｇ ＤＮＡラダー。レーン２、４、６：ｄａｍ＋ｄｃｍ＋Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生産されたファージ由来のＤＮＡ。レーン３、５、７：ｄｃｍ－ｄａｍ－Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生産されたファージ由来のＤＮＡ。レーン２－３：ＡｌｅＩ、ＮｈｅＩ、およびＸｈｏＩによって消化されたＤＮＡ。レーン４－５：ＡｌｅＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、およびＤｐｎＩＩによって消化されたＤＮＡ。レーン６－７：ＡｌｅＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、およびＳｔｙＤ４１によって消化されたＤＮＡ。ＤＮＡサイズマーカーを左に示す。 合成配列を導入するためのファージゲノムにおける異なる部位の使用を示す。図３Ａは、Ｐ１バクテリオファージゲノムへの合成ＤＮＡ配列の導入を示す概要を提供する。ＩＳ１、およびｓｉｍＡＢＣは、バクテリオファージＰ１ゲノム内の不必要な遺伝子であり、ｃｏｉ／ｉｍｃＢは、溶菌サイクルを引き起こすためだけに必要な相補可能（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｂｌｅ）遺伝子である。ｃｏｉ／ｉｍｃＢ機能は、プラスミドベクター由来のｃｏｉ遺伝子の誘導性の発現によって補われ得る。図３Ｂは、Ｐ１ゲノムの効率的な送達を示し、ｋａｎ耐性遺伝子は、ファージゲノム内の異なる部位（ランディング部位）に組み込まれる。 ｓｉｍＡＢの破壊は、第二のバクテリオファージの再感染および維持を可能にすることを示す。図４Ａは、重複感染を試験するための実験手順を提供する。Ｐ１－ΔｉｍｃＢ／ｃｏｉ：：ｋａｎＲ（ＬＢ００１）またはＰ１－ΔｓｉｍＡＢＣ：：ｋａｎＲ（ＬＢ００２）のいずれかを保有する細胞に、ファージＰ１－ΔｉｍｃＢ／ｃｏｉ：：ｃｍＲを感染させて、ｋａｎ、ｃｍ、およびｋａｎ＋ｃｍプレート上にプレーティングした。図４Ｂは、Ｐ１－ΔｉｍｃＢ／ｃｏｉ：：ｋａｎＲまたはＰ１－ΔｓｉｍＡＢＣ：：ｋａｎＲのいずれかを保有する細胞におけるＰ１－ΔｉｍｃＢ／ｃｏｉ：：ｃｍＲの送達効率を示す。＊コロニーが検出されなかったことを意味する。 Ｐ１ファージミドのパッケージおよび送達に対する、Ｐ１ゲノムをパッケージおよび送達するＰ１粒子の対照比較を示す。図５Ａは、Ｐ１ゲノムまたは改変されたファージミドのパッケージおよび送達を示す概要を提供する。図５Ｂは、Ｐ１粒子が、Ｐ１ファージミドに関してするよりも、Ｐ１ゲノムを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５およびＢＬ２１中に効率的にパッケージおよび送達することを示す。 Ｐ１ゲノム（Ｐ１ ｃｏｉ－ｉｃｍＢ：：ｋａｎＲ）は、異なる環境条件下で送達され得ることを示す。略称：ＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）；最小培地（Ｍ９グルコース）、血清（ウシ胎児血清）。 バクテリオファージを介したＤＮＡ送達を示す。図７Ａは、＋／－ＤＮＡメチル化を有するＰ１バクテリオファージ（すなわち、ＤＮＡメチル化（＋）またはＤＮＡメチル化（－）のいずれかである細菌において生産されたＰ１）を用いたＥ．ｃｏｌｉへのＤＮＡ送達を示す。カナマイシン選択下で増殖したＣＦＵによって測定される感染されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の数を、株および感染の間で比較した。図７Ｂは、バクテリオファージＬＢ００２＋／－メチル化による、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅへのＤＮＡ送達における違いを示す。それから、カナマイシン選択下で増殖したＥ．ｃｏｌｉまたはＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＣＦＵによって測定されるＬＢ００２感染単位を、感染間で比較した。図７Ｃは、＋／－ＤＮＡメチル化であるＭ１３変異バクテリオファージを用いたＥ．ｃｏｌｉへのＤＮＡ送達を示す。それから、感染されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の数を、株ごとに比較した。ＴＯＰ１０Ｆ’：ｄａｍおよびｄｃｍをコードするが制限酵素を欠く；ＥＭＧ２：制限－メチル化システムは無傷である（非メチル化二本鎖ＤＮＡを分解する）；ＪＭ１１０：ｄａｍおよびｄｃｍをコードせず、制限酵素を欠く。 Ｉ－Ｅ型ＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３が、ゲノム－標的化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを備えたＰ１の送達後の増殖に負の影響を及ぼすことを示す。細菌増殖は、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ６００）によって測定した。図８Ｂは、Ｉ－Ｅ型ＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３が、ゲノム－標的化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを備えたＰ１の送達後の生存に負の影響を及ぼすことを示す。それから、それぞれの細菌株に関する異なる多重感染度（ＭＯＩ）での生存細菌細胞の数を比較した。図８Ｃ－８Ｄは、ゲノム－標的化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを異なる位置にコードするＰ１ゲノムの送達が、Ｉ－Ｅ型ＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３の存在下でＥ．ｃｏｌｉを死滅させることを示す。図８Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／ファージ処理が、増殖を排除することを示し、図８Ｄは、培養中のＣＲＩＳＰＲ／ファージ処理が、生存能力の縮小をもたらすことを示す。 ２株のＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉへのバクテリオファージＰ１ ｉｍｃＢ－ｃｏｉ：：ｋａｎＲの効率的な送達を示す。 図１０Ａにおいて、ＣＲＩＳＰＲファージ（ｆｔｓＡを標的化）は、抗生物質耐性細菌を死滅させることが示される。Ｃｉｐ＝シプロフロキサシン。図１０Ｂは、ＣＲＩＳＰＲファージが、効果的な抗生物質と組み合わせた場合に、相加的な抗菌効果を発揮することを示す。ＩＭ＝イミペネム。図１０Ｃは、ＣＲＩＳＰＲファージが、抗生物質イミペネムの存在または不存在下で、１２０分以内にＥ．ｃｏｌｉを死滅させることを示す。 Ｅ．ｃｏｌｉを標的化するＣＲＩＳＰＲファージが、大腿筋感染のマウスモデルにおいて、生菌数を低減させること（図１１Ａ）、および、Ｅ．ｃｏｌｉを標的化するＣＲＩＳＰＲファージが、マウスモデルにおいて動物生存時間を増大させること（図１１Ｂ）を示す。 Ｉ－Ｅ型システムにおける延長されたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡスペーサーが、細胞の死滅を誘発することができることを示す。３２ｎｔｓ（＋０）および４４ｎｔｓ（＋１２）の長さを有するスペーサーを有するリピート－スペーサー－リピート（アレイ）を試験した（天然（野生型）Ｉ－Ｅ型システムは、３２－ｎｔの長さを有するスペーサーに依拠する）。使用したスペーサー（ｐ１、ａｓ１、ｐ２およびｓ１）は、図１２の上にｌａｃＺ遺伝子の概要で示すように、ｌａｃＺを標的化した。ＤＮＡ干渉プロセスの概要を、図１２の中央に提供し、ゲノムＤＮＡに結合するスペーサーおよびＣａｓｃａｄｅ複合体およびその後のＣａｓ３の動員を示す。図１２の下は、非標的化プラスミドに関して試験された４つのスペーサーのそれぞれをコードするプラスミドに関して、Ｉ－Ｅ型タンパク質（Ｃａｓ３、Ｃａｓｃａｄｅ）を発現しているＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５細胞中への形質転換効率を示すグラフを提供する。形質転換効率は、非標的化スペーサーをコードするプラスミドに関して報告される。
ここで、本発明は、以降に、付随する図面および実施例に関して説明されて、そこに本発明の実施態様が示される。この説明は、本発明が実施され得る全ての異なる手段または本発明に加えられ得る全ての特徴の、詳細な一覧であることを意図しない。例えば、一実施態様に関して説明される特徴は、他の実施態様に取り込まれ得て、特定の実施態様に関して説明される特徴は、その実施態様から取り除かれ得る。したがって、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略することができることを検討する。加えて、本明細書において示唆される様々な実施態様に対する非常に多くの変更および追加は、本開示に照らして当業者に明らかであり、本発明から逸脱しない。それ故に、以下の説明は、本発明の一部の特定の実施態様を説明することを意図し、それらの全ての並べ替え、組み合わせ、および変更を徹底的に特定することを意図しない。
別段の定義がされない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人により一般に理解されるのと同一の意味を有する。本発明において、本発明の説明に用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の限定を意図しない。
本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照が提供される文章および／または段落に関連のある教示に関して、それらの全体で参照により援用される。
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に説明される本発明の様々な特徴は、任意の組み合わせで用いることができることが明確に意図される。さらにまた、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせは、除外または省略することができることも検討する。説明すると、明細書が、組成物は構成要素Ａ、ＢおよびＣを含む、と述べる場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせが、単独でまたは任意の組み合わせで、省略および放棄され得ることが明確に意図される。
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形を同様に含むことが意図される。また、本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある列挙された項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択肢で（「または」）解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。
本明細書において用いられる用語「約」は、例えば用量または期間のような測定可能な値を言及する場合、規定の量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を指す。
本明細書において用いられる、「ＸおよびＹの間」および「約ＸおよびＹの間」のような語句は、ＸおよびＹを含むと解釈されるべきである。本明細書において用いられる「約ＸおよびＹの間」のような語句は、「約Ｘおよび約Ｙの間」を意味し、「約ＸからＹまで」のような語句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。
本明細書において用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた特徴、整数、ステップ、改変、エレメント、および／または、構成要素の存在を特定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、改変、エレメント、構成要素、および／または、それらの群の存在または追加を排除しない。
本明細書において用いられる、移行句「から本質的になる」は、クレームの範囲が、クレーム内に挙げられた規定の材料またはステップおよびクレームされた発明の基本的および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈すべきであることを意味する。したがって、用語「から本質的になる」は、本発明のクレームにおいて用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。
本明細書において用いられる「キメラ」は、少なくとも２つの構成要素が、異なる供給源（例えば、異なる生物、異なるコード領域）に由来する、核酸分子またはポリペプチドを指す。
本明細書において用いられる「相補」は、コンパレータ―ヌクレオチド配列との１００％相補性または同一性を意味することができ、または、１００％未満の相補性（例えば、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などの相補性）を意味することができる。相補または相補可能（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｂｌｅ）は、突然変異と「相補である（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」または「相補である（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）」という観点から用いてもよい。したがって、例えば、ファージゲノム内の「相補可能」部位は、ファージ機能の一面（例えば溶菌サイクル）に必須である遺伝子を含む部位であるが、この機能は、ゲノム内またはプラスミド上の異なる位置から遺伝子を発現することによって回復することができる。
本明細書において用いられる用語「相補」または「相補性」は、塩基対合による、許容的な塩および温度条件下での、ポリヌクレオチドの自然な結合を指す。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」は、相補配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する「部分的」であってよく、または、一本鎖分子間に全体的な相補性が存在する場合は完全であってよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に重大な効果を有する。
本明細書において用いられる「接触する（ｃｏｎｔａｃｔ）」、「接触する（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」、「接触される（ｃｏｎｔａｃｔｅｄ）」、および、それらの文法的変形は、所望の反応（例えば、組込み、形質転換、スクリーニング、選択、死滅、同定、増幅など）を行なうのに適切な条件下に、所望の反応の構成要素を一緒に置くことを指す。そのような反応を行なうための方法および条件は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６；Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照）。
ヌクレオチド配列の「フラグメント」または「部分」は、参照核酸またはヌクレオチド配列に対して縮小された長さのヌクレオチド配列を意味すると理解され（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多くのヌクレオチドが縮小される）、参照核酸またはヌクレオチド配列と同一またはほとんど同一（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一）の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、および／またはからなる。本発明によるそのような核酸フラグメントまたは部分は、適切な場合、それがその構成成分であるより大きなポリヌクレオチド内に含まれてよい。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドのフラグメントは、その機能を保持するポリペプチドをコードする機能性フラグメント（例えば、野生型ポリペプチドと比較して長さが縮小されているが、Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを処理する、ＤＮＡを結合する、および／または、複合体を形成する）Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドのフラグメント）であってよい。Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの機能性フラグメントは、前記Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドのフラグメントによってコードされ得る。代表的な実施態様では、本発明は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの機能性フラグメントを含んでよい。Ｃａｓ９機能性フラグメントは、制限されないが、ＨＮＨヌクレアーゼ活性、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＰＡＭ認識および結合活性を含む、ネイティブのＣａｓ９ヌクレアーゼの１つまたは複数の活性を保持する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの機能性フラグメントは、Ｃａｓ９ポリヌクレオチドのフラグメントによってコードされ得る。
本明細書において用いられる用語「遺伝子」は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗－マイクロＲＮＡ、制御ＲＮＡなどを生産するために用いることが可能な核酸分子を指す。遺伝子は、機能性タンパク質または遺伝子産物を生産するために用いることが可能であってよく、または可能でなくてよい。遺伝子は、コードおよび非コード領域の両方（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終結配列および／または５’および３’非翻訳領域）を含むことができる。遺伝子は、「単離」されてよく、それによって、その天然の状態で核酸と関連して通常見られる構成要素から実質的または本質的にフリーである核酸が意味される。そのような構成要素は、他の細胞物質、組み換え生産による培養培地、および／または、核酸の化学合成で用いられる様々な化学物質を含む。
本明細書において用いられる用語「ゲノム」は、生物の染色体／核ゲノムならびに任意のミトコンドリアおよび／またはプラスミドゲノムを含む。
本明細書において用いられる「ヘアピン配列」は、ヘアピンを含むヌクレオチド配列（例えば、１つまたは複数のヘアピン構造を形成するもの）である。ヘアピン（例えば、ステムループ、フォールドバック）は、二本鎖領域によっていずれか側にさらに隣接される一本鎖を形成するヌクレオチドの領域を含む二次構造を有する核酸分子を指す。そのような構造は、当技術分野でよく知られている。当技術分野で知られているように、二本鎖領域は、塩基対合内にいくつかのミスマッチを含むことができ、または、完全に相補であることができる。一部の実施態様では、リピートヌクレオチド配列は、前記リピートヌクレオチド配列内に配置されたヘアピン配列を含む、から本質的になる、からなる（すなわち、少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多く）のリピートヌクレオチド配列が、前記リピートヌクレオチド配列内であるヘアピンのいずれか側に存在する）。一部の実施態様では、核酸構築物のヘアピン配列は、ｔｒａｃｒ核酸の３’末端に位置することができる。
「異種」または「組み換え」ヌクレオチド配列は、それが導入される宿主細胞と天然に関連しないヌクレオチド配列であり、非天然起源の多コピーの天然起源ヌクレオチド配列を含む。
本明細書において用いられる「異種メチルトランスフェラーゼ」は、それが導入される細菌宿主細胞（例えば、生産宿主細菌）内に天然に見られないメチルトランスフェラーゼである。したがって、生産宿主細菌に導入される「異種メチルトランスフェラーゼ」は、生産宿主細菌において見られるメチルトランスフェラーゼ（単数または複数）とは異なる、古細菌種由来または細菌株または種由来のメチルトランスフェラーゼであってよい。
異種メチルトランスフェラーゼを用いて、生産宿主細菌に、標的株のものと類似するメチル化パターン（ｐａｔｔｅｒｓ）を与えることができる。本発明で有用なＤＮＡ ＭＴａｓｅの非限定の例は、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉにおいてＩＩ型Ｒ－Ｍ系に対して保護するために導入することのできるファージΦ５０由来のＬｌａＰＩを含む（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３（１４）：４３６３－７０（１９９１））。生産宿主細菌において発現され得るさらなるＤＮＡ改変酵素は、アデニン残基をアセトイミデートする（ａｃｅｔｉｍｉｄａｔｅ）ポリペプチドをコードするものを含む。一部のＲ－Ｍ系は、アデニンメチル化に感受性である。バクテリオファージＤＮＡにおいてアデニン残基をアセトイミデートするポリペプチドは、そのようなシステムに対してＤＮＡを保護する。生産宿主細胞においてアデニン残基をアセトイミデートすることのできるポリペプチドの非限定の例は、ファージＭｕ由来のｍｏｍ遺伝子およびＭｕ様プロファージ配列を含み（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ（ＦｌｕＭｕ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ａ型Ｚ２４９１株（Ｐｎｍｅ１）およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅバイオタイプａｅｇｙｐｔｉｕｓ ＡＴＣＣ１１１１６を参照）、それは、アデニン残基をＮ（６）－メチルアデニンに変換して、それによって、アデニン感受性制限酵素に対して保護する。個々のメチルトランスフェラーゼによって与えられるメチル化パターンは、Ｐａｃｂｉｏ ＳＭＲＴシーケンシングのような確立されたＤＮＡシーケンシング技術を用いて評価することができる（Ｏ’Ｌｏｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５：ｅ０１１８５３３）。生産された時点で、生産株は、標的株へのＤＮＡ送達のためのバクテリオファージ粒子を生産するために用いることができる。
細菌の「制限修飾系」（Ｒ－Ｍ系）は、（１）特定の配列においてＤＮＡをメチル化するメチルトランスフェラーゼ、および／または、（２）非メチル化（Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ型）またはメチル化（ＩＶ型）であるＤＮＡを切断する制限酵素を含む。Ｒ－Ｍ系は、細菌の防御システムを構成し、ここで、外来メチル化パターンを有するＤＮＡは、多数の位置でＲ－Ｍ系の制限酵素によって切断される。ほとんどの細菌は、１つよりも多いＲ－Ｍ系を含む。Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１，１８０５－１８１２（２００３）。Ｉ型メチルトランスフェラーゼは、機能性のために、適合する特異性タンパク質の存在を必要とする。ＩＩ型およびＩＩＩ型メチルトランスフェラーゼは、機能するために、いかなるさらなるタンパク質も必要としない。したがって、本発明で有用なメチルトランスフェラーゼおよび制限酵素は（修飾または阻害のための標的として、または、生産宿主細菌において発現される異種ポリペプチドとして、それにより、生産宿主細菌のＲ－Ｍ系を修飾する）、細菌の制限修飾系（例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ型）に含まれる任意のメチルトランスフェラーゼまたは制限酵素を含むことができる。
相同性を有する異なる核酸またはタンパク質は、本明細書において「相同体」と呼ぶ。相同体という用語は、同一および他の種由来の相同配列、および、同一および他の種由来のオルソロガス配列を含む。「相同性」は、位置同一性（すなわち配列類似性または同一性）のパーセントの観点からの、２以上の核酸および／またはアミノ酸配列の間の類似性のレベルを指す。また、相同性は、異なる核酸またはタンパク質間の類似の機能特性の概念を指す。したがって、本発明の組成物および方法は、本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に対する相同体をさらに含む。本明細書において用いられる「オルソロガス」は、種分化の間に共通の祖先遺伝子から生じる異なる種における相同ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を指す。本発明のヌクレオチド配列の相同体は、本発明の前記ヌクレオチド配列と実質的な（例えば、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％）配列同一性を有する。したがって、例えば、本発明で有用な、リピート、ｔｒａｃｒ核酸、Ｃａｓ９ポリペプチド、Ｃａｓ３ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、Ｃａｓ３’’ポリペプチド、および／または、Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの相同体は、任意の公知のリピート、ｔｒａｃｒ核酸、Ｃａｓ９ポリペプチド、Ｃａｓ３ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、Ｃａｓ３’’ポリペプチド、および／または、Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドと、約７０％相同またはそれよりも高くてよい。
本明細書において用いられる、ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）、ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）、およびそれらの文法的変形は、２つの相補のヌクレオチド配列またはいくつかのミスマッチの塩基対が存在する実質的に相補の配列の結合を指す。ハイブリダイゼーションの条件は当該分野でよく知られていて、ヌクレオチド配列の長さおよびヌクレオチド配列間の相補性の程度に基づき変化する。一部の実施態様では、ハイブリダイゼーションの条件は、高ストリンジェンシーであってよく、または、それらは、ハイブリダイズされる配列の長さおよび相補性の量に応じて、中ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシーであってよい。ヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの目的に関して低、中および高ストリンジェンシーを構成する条件は、当該分野でよく知られている（例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６；Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照）。
本明細書において用いられる用語「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増大した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」「増強した（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」「増強する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」および「増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（およびそれらの文法的変形）は、コントロールと比べて、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれよりも高い上昇を表す。したがって、例えば、標的ＤＮＡの増大した転写は、コントロールと比べて、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれよりも高い標的遺伝子の転写の増大を意味することができる。
「ネイティブ」または「野生型」の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、天然起源または内因性の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を指す。したがって、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物において天然起源または内因性であるｍＲＮＡである。「相同」核酸は、それが導入される宿主細胞と天然に関連するヌクレオチド配列である。したがって、例えば、本明細書において用いられる用語「内因性制限酵素」は、生産宿主細菌において自然発生の（ネイティブの）制限酵素を意味する。
また、本明細書において用いられる用語「核酸」、「核酸分子」、「核酸構築物」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」は、直鎖または分岐の一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡ、またはそれらのハイブリッドを指す。また、用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ｄｓＲＮＡが合成的に生産される場合は、一般的でない塩基、例えば、イノシン、５－メチルシトシン、６－メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその他もまた、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、およびリボザイム対合に用いることができる。例えば、シチジンおよびウリジンのＣ－５プロピンアナログを含むポリヌクレオチドは、高アフィニティでＲＮＡと結合し、遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤となることが示されている。他の修飾、例えば、ホスホジエステル主鎖、またはＲＮＡのリボース糖基内の２’－ヒドロキシに対する修飾もすることができる。本開示の核酸構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよいが、好ましくはＤＮＡである。したがって、本発明の核酸構築物は、ＤＮＡの形態で記載され用いられ得るが、使用目的に応じて、ＲＮＡの形態で記載され用いられてもよい。
本明細書において用いられる「合成の」核酸またはポリヌクレオチドは、天然に見られないが人の手によって構築される核酸またはポリヌクレオチドを指し、結果として、天然の産物でない。
明細書において用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたは核酸分子の５’から３’末端のこれらのヌクレオチドの配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含み、ｃＤＮＡ、ＤＮＡフラグメントまたは部分、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば化学合成）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡを含み、そのいずれかは一本鎖または二本鎖であってよい。用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、および、「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において交換可能に用いられて、ヌクレオチドのヘテロポリマーも指す。別段の指示がされる場合を除き、本明細書において提供される核酸分子および／またはポリヌクレオチドは、本明細書において、５’から３’の方向で左から右に示され、米国の配列規則（連邦規則法典第３７巻セクション１．８２１～１．８２５）および世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５に示されるヌクレオチドの特徴を表すための標準的なコードを用いて表される。
本明細書において用いられる用語「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」は、２つの配列が最適に並べられた場合の、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した、参照（「クエリー」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の直鎖ポリヌクレオチド内の同一のヌクレオチドのパーセンテージを指す。一部の実施態様では、「パーセント同一性」は、アミノ酸配列内の同一のアミノ酸のパーセンテージを指し得る。
「プロトスペーサー配列」は、標的二本鎖ＤＮＡを指し、具体的には、ＣＲＩＳＰＲリピート－スペーサー配列、ＣＲＩＳＰＲリピート－スペーサー－リピート配列および／またはＣＲＩＳＰＲアレイの、スペーサー配列と完全または実質的に相補である（およびハイブリダイズする）標的ＤＮＡ（例えば、または、ゲノム内の標的領域）の部分を指す。
本明細書において用いられる用語「縮小する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「縮小された（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「縮小する（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」、「縮小（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、「減少する（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」、「抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）」、および、「低減する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」（およびそれらの文法的変形）は、例えば、コントロールと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の低減を説明する。特定の実施態様では、縮小は、検出可能な活性または量をもたらさず、または本質的にもたらさない（すなわち、ほんのわずかな量、例えば、約１０％未満または実に約５％未満）。したがって、例えば、Ｃａｓ３ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼにおける突然変異は、Ｃａｓ３ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を、コントロール（例えば、野生型Ｃａｓ３）と比較して、少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％縮小することができる。
本明細書において用いられる「リピート配列」は、例えば、野生型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の任意のリピート配列、または、「スペーサー配列」によって分離される合成のＣＲＩＳＰＲアレイのリピート配列（例えば、リピート－スペーサー－リピート配列）を指す。本発明で有用なリピート配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の任意の公知または後に同定されるリピート配列であってよく、または、ＣＲＩＳＰＲＩ型システムまたはＣＲＩＳＰＲＩＩ型システムにおいて機能するように設計された合成のリピートであってよい。したがって、一部の実施態様では、リピート配列は、野生型ＣＲＩＳＰＲ Ｉ型遺伝子座または野生型ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型遺伝子座由来のリピート配列と同一または実質的に同一であってよい。一部の実施態様では、リピート配列は、野生型リピート配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれより多くの連続したヌクレオチドの野生型リピート配列）の一部を含んでよい。
一部の実施態様では、リピート配列は、少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、またはそれより多くのヌクレオチド、またはその中の任意の範囲）を含む、から本質的になる、またはからなる。他の実施態様では、リピート配列は、少なくとも約１～約１５０個のヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる。さらに他の実施態様では、リピート配列は、少なくとも約１個のヌクレオチド～約１００個のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲または値を含む、から本質的になる、またはからなる。さらなる実施態様では、リピート配列は、約３個のヌクレオチド～約１００個のヌクレオチド、約１０個のヌクレオチド～約１００個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約１００個のヌクレオチド、約２０～約５０個のヌクレオチド、約２０～約４０個のヌクレオチド、約２０～約３０個のヌクレオチド、約３０～約４０個のヌクレオチド、約２５～約４０個のヌクレオチド、約２５～約４５個のヌクレオチド、および／または、約２５～約５０個のヌクレオチド、または、その中の任意の範囲または値を含むことができ、から本質的になることができ、または、からなることができる。代表的な実施態様では、リピート配列は、約２５個のヌクレオチド～約３８個のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲または値を含むことができ、から本質的になることができ、または、からなることができる。さらに、さらなる実施態様では、リピート配列は、約２９個のヌクレオチドを含むことができ、から本質的になることができ、または、からなることができる。また、さらなる実施態様では、リピート配列は、少なくとも約２０～３０個のヌクレオチドの長さのみを有するヘアピンを含むことができ、から本質的になることができ、または、からなることができる。さらに他の実施態様では、リピート配列は、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる。１つよりも多いスペーサーヌクレオチド配列がＣＲＩＳＰＲアレイ内に存在する場合は、それぞれのスペーサーヌクレオチド配列は、「リピートヌクレオチド配列」によって互いから分離される。したがって、一部の代表的な実施態様では、スペーサー配列の５’末端に連結されたリピート配列は、約３個のヌクレオチドの長さであってよく（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０個のヌクレオチドまたはそれよりも多い）、野生型リピートヌクレオチド配列の同一領域（例えば、５’末端）と、少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い）同一性を有する。他の実施態様では、スペーサー配列の３’末端に連結されたリピート配列の一部は、野生型リピートヌクレオチド配列と少なくとも約５０％またはそれよりも高い同一性を有する、１０個またはそれよりも多いヌクレオチドを有してよい。また、さらなる実施態様では、リピート配列は、少なくとも約２０～３０個のヌクレオチドの長さのみを有するヘアピンを含むことができ、から本質的になることができ、または、からなることができる。
本明細書において用いられる「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、少なくとも２つのリピート配列、または前記リピート配列のそれぞれの部分、および、少なくとも１つのスペーサー配列を含む核酸分子を意味し、ここで、２つのリピート配列の一方、またはその一部は、スペーサー配列の５’末端に連結されて、２つのリピート配列の他方、またはその一部は、スペーサー配列の３’末端に連結される。組み換えＣＲＩＳＰＲアレイでは、リピート配列およびスペーサー配列の組み合わせは、合成であり、人により作られ、天然に見られない。一部の実施態様では、「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、５’から３’に、少なくとも１つのリピート－スペーサー配列（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個またはそれよりも多くのリピート－スペーサー配列、および、その中の任意の範囲または値）を含む核酸構築物を指し、ここで、アレイの３’ｍｏｓｔリピート－スペーサー配列の３’末端は、リピート配列に連結されて、それにより、前記アレイ内の全てのスペーサーは、５’末端および３’末端の両方にリピート配列が隣接する。
本発明のＣＲＩＳＰＲアレイは、任意の長さであってよく、上述のリピート配列と交互する任意の数のスペーサー配列を含んでよい。一部の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１～約１００個のスペーサー配列を含むことができ、から本質的になることができ、または、からなることができ、それぞれ、その５’末端およびその３’末端で、リピート配列に連結される（例えば、それぞれのＣＲＩＳＰＲアレイがリピートで始まってリピートで終わるように、リピート－スペーサー－リピート－スペーサー－リピート－スペーサー－リピート－スペーサー－リピートなど）。したがって、一部の実施態様では、本発明の組み換えＣＲＩＳＰＲアレイは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個、またはそれよりも多くの、スペーサー配列を含むことができ、から本質的になることができ、または、からなることができ、それぞれ、その５’末端およびその３’末端で、リピート配列に連結される。
本明細書において用いられる「ＣＲＩＳＰＲファージ」は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの少なくとも１つの構成要素をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含むバクテリオファージＤＮＡを含むファージ粒子を意味する（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｃｒＲＮＡ；例えばｆｔｓＡを標的化するｃｒＲＮＡの挿入を含むＰ１バクテリオファージ）。
本明細書において用いられる「配列同一性」は、２つの最適に並べられたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、構成要素（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）のアライメントのウインドウ全体で不変である程度を指す。「同一性」は、制限されないが：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載のものを含む公知の方法により、容易に計算することができる。
本明細書において用いられる「スペーサー配列」は、標的ＤＮＡ（すなわち、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接する、ゲノム内の標的領域または「プロトスペーサー配列」）に相補のヌクレオチド配列である。スペーサー配列は、標的ＤＮＡと完全に相補または実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い））であることができる。したがって、一部の実施態様では、スペーサー配列は、標的ＤＮＡと比較して、１、２、３、４、または５個のミスマッチを有してよく、そのミスマッチは、連続または不連続であってよい。一部の実施態様では、スペーサー配列は、標的ＤＮＡに対して７０％の相補性を有してよい。他の実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列は、標的ＤＮＡに対して８０％の相補性を有してよい。さらに他の実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列は、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などの相補性を有してよい。代表的な実施態様では、スペーサー配列は、標的ＤＮＡに対して１００％相補性を有する。特定の実施態様では、スペーサー配列は、少なくとも約８個のヌクレオチド～約１５０個のヌクレオチドの長さである標的ヌクレオチド配列の領域にわたって、完全な相補性または実質的な相補性を有する。代表的な実施態様では、スペーサー配列は、少なくとも約２０個のヌクレオチド～約１００個のヌクレオチドの長さである標的ヌクレオチド配列の領域にわたって、完全な相補性または実質的な相補性を有する。一部の実施態様では、スペーサー配列の５’領域は、標的ＤＮＡに対して１００％相補であってよく、一方で、前記スペーサーの３’領域は、前記標的ＤＮＡに対して実質的に相補であってよく、したがって、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列の全体的な相補性は、１００％未満である。したがって、例えば、２０個のヌクレオチドスペーサー配列の３’領域内の最初の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個などのヌクレオチド（シード領域）は、標的ＤＮＡと１００％相補であってよく、一方で、スペーサー配列の５’領域内の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補）である。一部の実施態様では、スペーサー配列の３’末端の最初の７～１２個のヌクレオチドは、標的ＤＮＡと１００％相補であってよいが、スペーサー配列の５’領域内の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと、実質的に相補である（例えば、少なくとも約５０％相補（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い））。一部の実施態様では、スペーサー配列の３’末端における最初の７～１０個のヌクレオチドは、標的ＤＮＡと７５％～９９％相補であってよいが、スペーサー配列の５’領域内の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと、少なくとも約５０％～約９９％相補である。他の実施態様では、スペーサー配列の３’末端における最初の７～１０個のヌクレオチドは、標的ＤＮＡと１００％相補であってよいが、スペーサー配列の５’領域内の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補）である。代表的な実施態様では、スペーサー配列の最初の１０個のヌクレオチド（シード領域内）は、標的ＤＮＡと１００％相補であってよいが、スペーサー配列の５’領域内の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補）である。例示的な実施態様では、スペーサー配列の５’領域（例えば、５’末端の最初の８ヌクレオチド、５’末端の最初の１０個のヌクレオチド、５’末端の最初の１５個のヌクレオチド、５’末端の最初の２０個のヌクレオチド）は、標的ＤＮＡと約７５％またはそれよりも高いの相補性（７５％～約１００％の相補性）を有してよいが、スペーサー配列の残部は、標的ＤＮＡに対して約５０％またはそれよりも高い相補性を有してよい。したがって、例えば、スペーサー配列の５’末端における最初の８ヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に対して１００％の相補性を有してよく、または、１つまたは２つの突然変異を有してよく、したがって、それぞれ、標的ＤＮＡと約８８％相補または約７５％相補であってよいが、スペーサーヌクレオチド配列の残部は、標的ＤＮＡに対して少なくとも約５０％またはそれよりも高い相補であってよい。
一部の実施態様では、本発明のスペーサー配列は、約１５個のヌクレオチド～約１５０個のヌクレオチドの長さであってよい。他の実施態様では、本発明のスペーサーヌクレオチド配列は、約１５個のヌクレオチド～約１００個のヌクレオチドの長さであってよい（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個のヌクレオチドまたはそれよりも多い）。一部の特定の実施態様では、スペーサーヌクレオチド配列は、約８～約１５０個のヌクレオチド、約８～約１００個のヌクレオチド、約８～約５０個のヌクレオチド、約８～約４０個のヌクレオチド、約８～約３０個のヌクレオチド、約８～約２５個のヌクレオチド、約８～約２０個のヌクレオチド、約１０～約１５０個のヌクレオチド、約１０～約１００個のヌクレオチド、約１０～約８０個のヌクレオチド、約１０～約５０個のヌクレオチド、約１０～約４０、約１０～約３０、約１０～約２５、約１０～約２０、約１５～約１５０、約１５～約１００、約１５～約５０、約１５～約４０、約１５～約３０、約２０～約１５０個のヌクレオチド、約２０～約１００個のヌクレオチド、約２０～約８０個のヌクレオチド、約２０～約５０個のヌクレオチド、約２０～約４０個、約２０～約３０個、約２０～約２５個、少なくとも約８個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３２個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４４個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１１０個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１３０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１５０ヌクレオチド個の長さ、またはそれよりも多く、および、その中の任意の値または範囲の長さであってよい。
一部の実施態様では、スペーサーは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける野生型スペーサーＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲＣａｓシステムの典型的な長さ（例えば、約３２個のヌクレオチド長さ）に対して、改変することができる（すなわち、より長く（延長）またはより短くされる）。一部の実施態様では、スペーサーは、標的ＤＮＡに相補のさらなるヌクレオチドを含むようにスペーサーの３’末端を延長することによって、より長くされる。したがって、上述のように、一部の態様では、スペーサー配列は、少なくとも約１５個のヌクレオチド～約１５０個のヌクレオチドの長さ、約１５個のヌクレオチド～約１００個のヌクレオチドの長さ、約２０個のヌクレオチド～約１５０個のヌクレオチドの長さ、約２０個のヌクレオチド～約１００個のヌクレオチドの長さなど（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０個のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲または値）である標的ヌクレオチド配列の領域にわたって、完全な相補性または実質的な相補性を有する。一部の態様では、その３’末端におけるスペーサーは、標的ＤＮＡの連続するヌクレオチドの一部に対して、完全な相補または実質的に相補であってよい（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれよりも高い）。
代表的な実施態様では、本発明のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲリピート－スペーサー核酸のスペーサー配列は、少なくとも約１６個のヌクレオチドを含み、前記スペーサーの３’末端において、前記の少なくとも約１６個のヌクレオチドの少なくとも約１０個の連続するヌクレオチドは、標的核酸の１０個の連続するヌクレオチドと少なくとも約９０％の相補性を有し、ここで、標的核酸は、目的の生物のゲノム内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接する。
代表的な実施態様では、本発明のＩ型ＣＲＩＳＰＲリピート－スペーサー核酸のスペーサー配列は、少なくとも約１５個のヌクレオチドを含み、前記スペーサーの５’末端において、前記の少なくとも約１５個のヌクレオチドの少なくとも約７個の連続するヌクレオチドは、標的核酸の７個の連続するヌクレオチドと少なくとも約９０％相補性を有し、ここで、標的核酸は、目的の生物のゲノム内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接する。
本明細書において用いられる、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列の関連における語句「実質的に同一」または「実質的な同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いた測定または目視検査により、最大一致に関して比較およびアライメントした場合、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する２以上の配列またはサブシーケンスを指す。特定の実施態様では、実質的な同一性は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５、９６、９６、９７、９８、または９９％同一性を有する２以上の配列またはサブシーケンスを指し得る。
本明細書において用いられる、２つの核酸分子またはヌクレオチド配列の関連における語句「実質的に相補」、または、「実質的な相補性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いた測定または目視検査により、最大一致に関して比較およびアライメントした場合、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％のヌクレオチド相補性を有する２以上の配列またはサブシーケンスを指す。特定の実施態様では、実質的な相補性は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５、９６、９６、９７、９８、または９９％の相補性を有する２以上の配列またはサブシーケンスを指し得る。
配列比較のために、典型的に、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列としての役割がある。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および比較配列がコンピューターに入力され、必要な場合はサブシーケンス座標が指定されて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。それから、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列（単数または複数）のパーセント配列同一性を計算する。
比較ウインドウを並べるための最適な配列アライメントは当業者に広く知られ、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの類似性検索方法などのツールにより、および場合により、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、および、ＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムのコンピューター実施により、行ない得る。試験配列および参照配列のアライメントされた区分の「同一性分数」は、２つの並べられた配列が共有する同一の構成要素の数を、参照配列セグメント（すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定部分）内の構成要素の全数で割った数である。パーセント配列同一性は、同一性分数に１００をかけて表される。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列またはその一部に対して、または、より長いポリヌクレオチド配列に対して、され得る。本発明の目的に関し、「パーセント同一性」は、翻訳ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０およびポリヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０を用いて決定されてもよい。
ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターを通じて一般に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードと並べた場合に、一部の正の値の閾値スコアＴと一致する、または満たす、クエリー配列内の長さＷのショートワードを特定することにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に特定するステップを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるためのサーチを始める種として作用する。それから、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基のペアに関する恩恵スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下した場合、１つまたは複数の負のスコアの残基アライメントの蓄積に起因して累積スコアが０以下になった場合、または、いずれかの配列が終わりに到達した場合に、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
パーセント配列同一性の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３ ５７８７ （１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの評価基準は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で一致が偶然に生じる確率の示度を提供する。例えば、参照ヌクレオチド配列に対する試験ヌクレオチド配列の比較における最小和確率が約０．１未満～約０．００１未満である場合に、試験核酸配列は参照配列と類似すると考えられる。したがって、本発明の一部の実施態様では、参照ヌクレオチド配列に対する試験ヌクレオチド配列の比較における最小和確率は、約０．００１未満である。
本明細書において用いられる「標的ＤＮＡ」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的領域」、または、「ゲノム内の標的領域」は、ＣＲＩＳＰＲアレイ内のスペーサー配列と完全に相補または実質的に相補である（例えば、少なくとも７０％相補（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い））生物のゲノムの領域を指す。一部の実施態様では、標的領域は、生物のゲノムにおいて、ＰＡＭ配列（標的領域のすぐ３’に配置されたＰＡＭ配列）にすぐ隣接して配置された、約１０～約４０個の連続するヌクレオチドの長さであってよい。
一部の態様では、標的ヌクレオチド配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に近接または隣接して位置する。ＰＡＭは、特定のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに特異的であることが多いが、ＰＡＭ配列は、確立された実験的および計算的なアプローチを通して当業者により決定され得る。したがって、例えば、実験的なアプローチは、標的ＤＮＡのインビトロ切断（Ｐａｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３９－８４３）または標的プラスミドＤＮＡの形質転換（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：１１１６－１１２１；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９）などを介して、全てのあり得るヌクレオチド配列が隣接する配列を標的化するステップ、および、標的化を受けない配列メンバーを同定するステップを含む。一部の態様では、計算的なアプローチは、天然のスペーサーのＢＬＡＳＴサーチを行なってバクテリオファージまたはプラスミド内のオリジナルの標的ＤＮＡ配列を同定するステップ、および、これらの配列を並べて標的配列に近接する保存配列を決定するステップを含み得る（Ｂｒｉｎｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ．２０１４．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８０：９９４－１００１；Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５：７３３－７４０）。
本明細書において用いられる「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸」または「ｔｒａｃｒ核酸」は、任意のｔｒａｃｒＲＮＡ（またはそのコードするＤＮＡ）を指す。ｔｒａｃｒ核酸は、５’から３’に、バルジ、ネクサスヘアピン、および末端ヘアピン、および場合により、５’末端に、上側ステムを含む（Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ．５６（２）：３３３－３３９を参照）。ｔｒａｃｒ核酸は、成熟または未熟ｃｒＲＮＡのリピート部分へのハイブリダイズにおいて機能し、Ｃａｓ９タンパク質を標的部位へ動員し、そして、構造的再配列を誘導することによってＣａｓ９の触媒活性を促進し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡに関する配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに特異的であり、可変であってよい。公知または後に同定される任意のｔｒａｃｒ核酸を、本発明で使用することができる。一部の実施態様では、ｔｒａｃｒ核酸をＣＲＩＳＰＲアレイと融合して単一ガイド核酸を形成することができ、したがって、ｔｒａｃｒ核酸およびＣＲＩＳＰＲアレイは、単一ガイドとして導入することができる。
本発明の任意のポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列および／または組み換え核酸分子（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むポリヌクレオチド、本発明の異種メチルトランスフェラーゼ、Ｃａｓｃａｄｅポリペプチド、Ｃａｓ９ポリペプチド、Ｃａｓ３ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、Ｃａｓ３’’ポリペプチド、組み換えＩ型およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなどをコードするポリヌクレオチド）は、任意の目的の種における発現のためにコドン最適化され得る。コドン最適化は当技術分野で広く知られていて、種特異的なコドン使用頻度を用いたコドン使用バイアスに関するヌクレオチド配列の改変を含む。コドン使用頻度は、目的の種に関して最も高く発現される遺伝子の配列解析に基づいて作られる。ヌクレオチド配列が核内で発現される場合、コドン使用頻度は、目的の種に関して高発現の核遺伝子の配列解析に基づいて作られる。ヌクレオチド配列の改変は、種特有のコドン使用頻度を、天然のポリヌクレオチド配列に存在するコドンと比較することにより決定される。当該分野において理解されるように、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブのヌクレオチド配列と１００％未満の同一性（例えば、５０％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）を有するが、依然としてオリジナルのヌクレオチド配列によりコードされるものと同一の機能を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を生じさせる。したがって、本発明の代表的な実施態様では、本発明のヌクレオチド配列および／または組み換え核酸分子は、特定の目的の生物／種での発現のためにコドン最適化され得る。
一部の実施態様では、本発明の組み換え核酸分子、ヌクレオチド配列およびポリペプチドは、「単離される」。「単離された」核酸分子、「単離された」ヌクレオチド配列または「単離された」ポリペプチドは、人の手によりその天然環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない、核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドである。単離された核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造上の構成要素、または、ポリヌクレオチドと関連して一般に見いだされる他のポリペプチドまたは核酸から、少なくとも部分的に切り離された、精製された形態で存在し得る。代表的な実施態様では、単離された核酸分子、単離されたヌクレオチド配列および／または単離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれよりも高い純度である。
他の実施態様では、単離された核酸分子、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、非天然の環境（例えば組み換え宿主細胞）内に存在し得る。したがって、例えばヌクレオチド配列に関しては、用語「単離された」は、それが天然に生じる染色体および／または細胞から切り離されることを意味する。また、ポリヌクレオチドは、それが天然に生じる染色体および／または細胞から切り離され、それから、それが天然に生じない遺伝的状況、染色体および／または細胞（例えば、異なる宿主細胞、異なる制御配列、および／または天然に見られるのと異なるゲノム内の位置）に挿入される場合もまた、単離される。したがって、ポリヌクレオチドおよびそれらのコードされるポリペプチドは、人の手により、それらの天然環境から離れて存在し、したがって、天然の産物ではない点で「単離される」が、一部の実施態様では、組み換え宿主細胞内に導入され存在することができる。
本発明のさらなる実施態様では、ｔｒａｃｒ核酸および／またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むポリヌクレオチド、または、および、異種メチルトランスフェラーゼ、Ｃａｓ９ポリペプチド、Ｃａｓ３ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、Ｃａｓ３’’ポリペプチド、Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドおよび／またはＩ型およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードするポリヌクレオチドは、様々なプロモーター、ターミネーター、および、様々な生物または細胞における発現に関する他の調節エレメントと作動可能に関連することができる。したがって、代表的な実施態様では、少なくとも１つのプロモーターおよび／またはターミネーターは、本発明のポリヌクレオチドに動作可能に連結することができる。本発明で有用な任意のプロモーターを用いることができ、例えば、制限されないが、本明細書に記載の構成的、誘導性、発生学的に調節されたものなどを含む、目的の生物と機能性のプロモーターを含む。本明細書において用いられる調節エレメントは、内因性または異種であってよい。一部の実施態様では、対象生物由来の内因性調節エレメントを、天然には生じない遺伝的コンテキストに挿入することができ（例えば、天然に見られるのとは異なるゲノム内の位置）、それにより、組み換えまたは非ネイティブの核酸を生産する。
本明細書において用いられる「動作可能に連結」または「動作可能に関連」は、示された因子が互いに機能的に関連し、また一般に、物理的にも関連することを意味する。したがって、本明細書において用いられる用語「動作可能に連結」または「動作可能に関連」は、機能的に関係がある単一核酸分子上のヌクレオチド配列を指す。したがって、第二のヌクレオチド配列に動作可能に連結された第一のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列が、第二のヌクレオチド配列と機能的関係で配置される状況を意味する。例えば、プロモーターがヌクレオチド配列の転写または発現を果たす場合に、プロモーターは前記ヌクレオチド配列と動作可能に関連する。当業者は、制御配列（例えばプロモーター）は、制御配列がその発現を方向付けるように機能する限り、それが動作可能に関連するヌクレオチド配列と隣接している必要はないことを理解するだろう。したがって、例えば、介在する非翻訳でなお転写される配列が、プロモーターとヌクレオチド配列との間に存在してよく、プロモーターは依然としてヌクレオチド配列に「動作可能に連結」していると考えることができる。
「プロモーター」は、プロモーターと動作可能に関連するヌクレオチド配列の転写を制御または調節するヌクレオチド配列（すなわち、コード配列）である。コード配列は、ポリペプチドおよび／または機能性ＲＮＡをコードし得る。典型的に、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに関する結合部位を含むヌクレオチド配列を指し、転写の開始を管理する。一般に、プロモーターは、５’または対応するコード配列のコード領域のスタートに対して上流に見られる。プロモーター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして作用する他のエレメントを含んでよい。これらは、限定されないが、－３５エレメントコンセンサス配列および－１０コンセンサス配列を含む（Ｓｉｍｐｓｏｎ．１９７９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：３２３３－３２３７）。
プロモーターは、本発明のポリヌクレオチドおよび組み換え核酸構築物を含む、組み換え核酸構築物ポリヌクレオチド、発現カセットおよびベクターの調製での使用のための、例えば、構成的、誘導性、時間的に調節された、発生学的に調節された、化学的に調節された、プロモーターを含んでよい。これらの様々なタイプのプロモーターは、当技術分野で知られている。
したがって、一部の実施態様では、本発明の構築物の発現は、目的の生物で機能性の適切なプロモーターに作動可能に結合している本発明の組み換え核酸構築物を用いて、構成的な、誘導性の、時間的に調節された、発生学的に調節された、化学的に調節された、プロモーターによりなされ得る。代表的な実施態様では、抑制は、例えば目的の生物で機能性の誘導性プロモーターに作動可能に結合している本発明の組み換え核酸構築物を用いて、可逆的になされ得る。
プロモーターの選択は、発現のための定量的、時間的および空間的要求に応じて変化し、および、形質転換される宿主細胞にも応じて変化する。多くの異なる生物のためのプロモーターは、当該分野でよく知られている。当該分野に存在する広範囲の知識に基づき、適切なプロモーターを、特定の目的宿主生物のために選択することができる。したがって、例えば、モデル生物において、高度に構成的に発現される遺伝子の上流のプロモーターについて多くが知られ、そのような知識は、必要に応じて、他のシステムで容易に利用および実施することができる。
本発明で有用な例示的なプロモーターは、細菌において機能性のプロモーターを含む。細菌で有用なプロモーターは、制限されないが、Ｌ－アラビノース誘導性（ａｒａＢＡＤ、ＰＢＡＤ）プロモーター、任意のｌａｃプロモーター、Ｌ－ラムノース誘導性（ｒｈａＰＢＡＤ）プロモーター、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、λファージプロモーター（ｐＬ、ｐＬ－９Ｇ－５０）、アンヒドロテトラサイクリン－誘導性（ｔｅｔＡ）プロモーター、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ－１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｌｐｐ－ｌａｃ、ｃｓｐＡ、Ｔ７－ｌａｃオペレーター、Ｔ３－ｌａｃオペレーター、Ｔ４遺伝子３２、Ｔ５－ｌａｃオペレーター、ｎｐｒＭ－ｌａｃオペレーター、Ｖｈｂ、プロテインＡ、コリネ細菌－Ｅ．ｃｏｌｉ様のプロモーター、ｔｈｒ、ｈｏｍ、ジフテリア毒素プロモーター、ｓｉｇＡ、ｓｉｇＢ、ｎｕｓＧ、ＳｏｘＳ、ｋａｔｂ、α－アミラーゼ（Ｐａｍｙ）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３（２つのオーバーラップするＲＮＡポリメラーゼσ因子認識部位、σＡ、σＢからなる）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３、ｒｐｌＫ－ｒｐｌＡ、フェレドキシンプロモーター、および／またはキシロースプロモーターを含み得る（Ｋ．Ｔｅｒｐｅ Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：２１１－２２２（２００６）；Ｈａｎｎｉｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５４－６０（１９９８）；および、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ４０：２２１－２２９（２００５）を参照）。
本発明の一部の実施態様では、誘導性プロモーターを用いることができる。したがって、例えば、化学的に調節されるプロモーターを用いて、外因性の化学的レギュレーターの適用を介して生物での遺伝子発現を調節することができる。化学的に調節されるプロモーターを介した、本発明のヌクレオチド配列の発現の調節は、本発明のＲＮＡおよび／またはポリペプチドが、例えば、生物が誘導性化学物質で処理された場合にのみ合成されるのを可能にする。目的に応じて、プロモーターは、化学物質の適用が遺伝子の発現を誘導する場合は化学物質－誘導性プロモーターであってよく、または、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する場合は、化学物質－抑制性プロモーターであってよい。一部の態様では、プロモーターは、光の特定の波長の適用が遺伝子発現を誘導する場合は、光－誘導性プロモーターを含んでもよい（Ｌｅｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｎａｔｕｒｅ ４３８：４４１－４４２）。
一部の実施態様では、本発明の核酸構築物は、「発現カセット」であってよく、または、発現カセット内に含まれてよい。本明細書において用いられる「発現カセット」は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む組み換え核酸構築物を意味し、ここで、前記組み換え核酸構築物は、少なくとも１つの制御配列（例えば、プロモーター）と動作可能に関連する。したがって、本発明の一部の態様は、本発明のポリヌクレオチドを発現するように設計された発現カセットを提供する。
目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってよく、それの構成要素の少なくとも１つが、それの他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。また、発現カセットは、天然起源であるが異種発現に有用である組み換え型で得られたものであってもよい。
また、発現カセットは、場合により、選択された宿主細胞内で機能性の転写および／または翻訳終結領域（すなわち終結領域）を含んでもよい。様々な転写終結因子が発現カセットでの使用に利用可能であり、目的の異種ヌクレオチド配列を超えた（ｂｅｙｏｎｄ）転写の終結および正しい（ｃｏｒｒｅｃｔ）ｍＲＮＡのポリアデニル化に関与する。終結領域は、転写開始領域に対してネイティブであり得て、動作可能に連結された目的のヌクレオチド配列に対してネイティブであり得て、宿主細胞に対してネイティブであり得て、または、別の起源（すなわち、プロモーターに対して、目的のヌクレオチド配列に対して、宿主、またはそれらの任意の組み合わせに対して、外因または異種）に由来し得る。本発明の一部の実施態様では、ターミネーターは、本発明の組み換え核酸分子およびＣＲＩＳＰＲアレイに動作可能に連結することができる。
また、発現カセットは、形質転換された宿主細胞を選択するために用いることのできる選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。本明細書において用いられる「選択可能なマーカー」は、発現した場合に、マーカーを発現している宿主細胞に、区別できる表現型を与え、したがって、そのマーカーを有さないものからそのような形質転換された細胞が区別されるのを可能にする、ヌクレオチド配列を意味する。そのようなヌクレオチド配列は、マーカーが、化学的手段により、例えば選択剤（例えば抗生物質など）を用いることにより、選択することのできる形質を与えるかどうか、または、マーカーが単に、例えばスクリーニング（例えば蛍光）による、観察または試験を介して同定することのできる形質であるかどうかに応じて、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードし得る。もちろん、適切な選択可能なマーカーの多くの例が当該分野で知られていて、本明細書に記載の発現カセットにおいて用いることができる。
発現カセットに加えて、本明細書に記載の組み換えポリヌクレオチド（例えば、ｔｒａｃｒ核酸および／またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むポリヌクレオチド、および、本発明の異種メチルトランスフェラーゼ、Ｃａｓｃａｄｅポリペプチド、Ｃａｓ９ポリペプチド、Ｃａｓ３ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、Ｃａｓ３’’ポリペプチド、組み換えＩ型およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードするポリヌクレオチドなど）は、ベクターと連結して使用することができる。用語「ベクター」は、核酸（単数または複数）を細胞に移行、送達または導入するための組成物を指す。ベクターは、移行、送達または導入されるヌクレオチド配列（単数または複数）を含む核酸分子を含む。宿主生物の形質転換での使用のためのベクターは、当該分野でよく知られている。ベクターの全般的なクラスの非限定的な例は、限定されないが、二本鎖または一本鎖の直鎖または環状型の、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、バクテリオファージ、人工染色体、またはアグロバクテリウムバイナリーベクターを含み、自己で伝達または動員が可能であってよく、または不可能であってよい。本明細書に定義されるベクターは、細胞ゲノムへの組込みにより原核生物宿主を形質転換することができ、または、染色体外に存在することができる（例えば、複製起点を有する自己複製プラスミド）。さらにシャトルベクターが含まれ、それは、天然または設計によって、２つの異なる宿主生物における複製が可能なＤＮＡビヒクル、例えば、広範囲の宿主プラスミド、または、多数の複製起点を有するシャトルベクターを指す。一部の代表的な実施態様では、ベクター内の核酸は、宿主細胞での転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下であり、作動可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主内で機能する二機能性発現ベクターであり得る。ゲノムＤＮＡの場合は、これは、それ自身のプロモーターまたは他の調節エレメントを含み得て、ｃＤＮＡの場合は、これは、宿主細胞での発現のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下であり得る。したがって、本発明の組み換えポリヌクレオチドおよび／または本発明の組み換えポリヌクレオチドを含む発現カセットは、本明細書に記載されて当技術分野で知られているように、ベクター内に含まれ得る。
本明細書において用いられる用語「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」、「導入する（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」、「送達する（ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）」および「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、例えば、宿主細胞のメチル化活性を変更するため、または、導入された（異種／外因的な）ＣＲＩＳＰＲアレイの少なくとも１つのスペーサーと実質的な相補性を有する標的ＤＮＡを含む細胞を死滅させるために、本発明の組み換えポリヌクレオチドが細胞に送達されるプロセスを指し得る。したがって、目的のポリヌクレオチドの関連において、目的のポリヌクレオチドの関連における用語「接触させる」、「導入する」、「送達する」および「投与する」（およびそれらの文法的変形）は、ポリヌクレオチドが細胞内部へのアクセスを獲得して、「形質転換」、「トランスフェクション」、および／または、「形質導入」のような用語を含むような様式で、目的のポリヌクレオチドを、宿主生物または前記生物の細胞（例えば、細菌細胞のような宿主細胞）に提示することを意味する。１つよりも多いポリヌクレオチドが導入される場合は、これらのポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチドまたは核酸構築物の一部として、または、別個のポリヌクレオチドまたは核酸構築物として集めることができ、同一または異なる発現構築物または形質転換ベクター上に配置することができる。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換イベントおよび／または別個の形質転換イベントで細胞中に導入することができる。したがって、本発明の一部の態様では、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、宿主細菌の細胞中に導入することができる。
本明細書において用いられる用語「形質転換」、「トランスフェクション」、および「形質導入」は、細胞への異種ポリヌクレオチドの導入を指す。細胞へのそのような導入は、安定または一過的であり得る。したがって、一部の実施態様では、宿主細胞または宿主生物は、本発明の核酸分子により安定的に形質転換される。他の実施態様では、宿主細胞または宿主生物は、本発明の組み換え核酸分子により一過的に形質転換される。
ポリヌクレオチドの関連における「一過的な形質転換」は、ポリヌクレオチドが細胞に導入されて、細胞のゲノム内に組み込まれないことを意味する。
細胞内に導入されるポリヌクレオチドの関連における「安定に導入される（ｓｔａｂｌｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」または「安定に導入された（ｓｔａｂｌｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」は、導入されたポリヌクレオチドが細胞のゲノム内に安定的に取り込まれ、したがって、細胞がポリヌクレオチドで安定的に形質転換されることを意図する。
本明細書において用いられる「安定した形質転換」または「安定的に形質転換される」は、核酸分子が細胞内に導入されて、細胞のゲノム内に組み込まれることを意味する。したがって、組み込まれた核酸分子は、その子孫により、より具体的には、複数の後に続く世代の子孫により、受け継がれることが可能である。また、本明細書において用いられる「ゲノム」は、核およびプラスチドゲノムも含み、したがって、例えばプラスミドゲノムへの核酸構築物の組込みを含む。また、本明細書において用いられる安定した形質転換は、染色体外に例えばミニ染色体またはプラスミドとして維持される導入遺伝子も指し得る。
一過的な形質転換は、例えば、生物内に導入された１つまたは複数の導入遺伝子によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの存在を検出することのできる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタンブロットにより、検出され得る。細胞の安定した形質転換は、例えば、生物（細菌など）に導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイにより、検出することができる。細胞の安定した形質転換は、例えば、前記細胞に導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイにより、検出することができる。また、細胞の安定した形質転換は、例えば、導入遺伝子の標的配列（単数または複数）とハイブリダイズする特異的なプライマー配列を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当技術分野でよく知られている他の増幅反応により検出することもでき、導入遺伝子配列の増幅をもたらし、標準的な方法に従って検出することができる。また、形質転換は、当技術分野でよく知られているダイレクトシーケンスおよび／またはハイブリダイゼーションのプロトコルにより検出することもできる。
したがって、一部の実施態様では、本発明のポリヌクレオチド配列、核酸構築物、発現カセット、および／または、ベクターは、一時的に発現され得て、および／または、それらは宿主生物のゲノム中に安定的に組み込まれ得る。
本発明のポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の方法によって細胞中に導入することができる。例示的な形質転換の方法は、コンピテント細胞のエレクトロポレーションを介する形質転換、コンピテント細胞による受動的取り込み、コンピテント細胞の化学的形質転換、ならびに、細胞中への核酸の導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的（機械的）および／または生物学的なメカニズムを含み、それらの任意の組み合わせを含む。
本発明の一部の実施態様では、細胞の形質転換は、核の形質転換を含む。本発明の一部の実施態様では、細胞の形質転換は、プラスミドの形質転換およびコンジュゲーションを含む。
原核生物を形質転換する手順は広く知られていて当該分野においてルーチンであり、文献全体を通して記載される（例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９；Ｒａｎｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８：２２８１－２３０８（２０１３）を参照）。
したがって、ヌクレオチド配列は、当該分野でよく知られている任意の数の方法で、宿主生物またはその細胞に導入することができる。本発明の方法は、１つまたは複数のヌクレオチド配列が生物内に導入されるためには、それらが細胞の内部に接近しさえすれば、特定の方法に依存しない。１個よりも多いヌクレオチド配列が導入される場合は、それらは、単一の核酸構築物の一部として、または別個の核酸構築物として、集まることができ、同一または異なる核酸構築物上に位置することができる。したがって、ヌクレオチド配列は、単一の形質転換イベントで、または別個の形質転換イベントで、目的の細胞内に導入することができる。
本発明者らは、異種ＤＮＡをバクテリオファージゲノム中に組み込むための、ｓｉｍＡＢＣ、ｉｍｃＢ／ｃｏｉ、ｒｅｓ－ｍｏｄ、ｄａｒＡ、ｐｈｄ－ｄｏｃ、ｋｉｌＡ、ｔＲＮＡ１、２、ｃｉｘＬ、ｃｉｘＲおよびＩｓ１を含む、新規の組込み部位を同定している。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、導入された異種ポリヌクレオチド（単数または複数）を含むものを含むファージＤＮＡは、標的宿主細菌と実質的に類似するメチル化パターン（Ｒ－Ｍ系）を有する生産宿主細菌内でファージを増殖させることによって、標的宿主細菌に実質的に類似するようにメチル化され得ることを見いだしている。ファージの効率的なメチル化は、（例えば、Ｐ１について）パッケージの前の、または、一本鎖ＤＮＡ（例えばＭ１３）のパッケージングに関する、ファージＤＮＡの迅速な複製に起因して予期されず、あるいは、ＤＮＡパッケージングの前のメチル化を防ぐことが予期される。
したがって、一部の態様では、本発明は、バクテリオファージＤＮＡおよびファージミドＤＮＡのメチル化パターンを改変するための方法および組成物に関する。
したがって、一部の実施態様では、本発明は、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡのメチル化パターンを改変するインビボの方法を提供し、（１）生産宿主細菌の内因性制限修飾系（Ｒ－Ｍ系）の少なくとも１つの酵素の活性を破壊するステップ（それにより、破壊された内因性Ｒ－Ｍ系の少なくとも１つの酵素の活性を有する改変された生産宿主細菌を生産する）、および／または（２）生産宿主細菌に、少なくとも１つの異種メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入するステップ（それにより、異種メチルトランスフェラーゼを発現する改変された生産宿主細菌を生産する）；変更されたメチル化活性を有する改変された生産宿主細菌に、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を感染させるステップ（それにより、前記のバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡをメチル化する）；および、コントロール生産宿主細菌において増殖されたバクテリオファージと比較して、改変されたメチル化パターンを有するバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を生産するステップ（ここで、コントロール生産宿主細菌は、本明細書に記載の変更されたそのメチル化活性を有していない）を含む、生産宿主細菌のメチル化活性を改変するステップを含む。
一部の態様では、感染させるステップは、生産宿主細菌のメチル化活性を変更するステップの前に行なってよい。したがって、一部の態様では、本発明は、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡのメチル化パターンを改変するインビボの方法を提供し：変更されたメチル化活性を有する改変された生産宿主細菌に、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を感染させるステップ（それにより、前記のバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡをメチル化する）；以下を含む生産宿主細菌のメチル化活性を変更するステップ、（１）生産宿主細菌の内因性制限修飾系（Ｒ－Ｍ系）の少なくとも１つの酵素の活性を破壊するステップ（それにより、破壊された内因性Ｒ－Ｍ系の少なくとも１つの酵素の活性を有する改変された生産宿主細菌を生産する）、および／または（２）生産宿主細菌に、少なくとも１つの異種メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入するステップを含む（それにより、異種メチルトランスフェラーゼを発現する改変された生産宿主細菌を生産する）；および、コントロール生産宿主細菌において増殖されたバクテリオファージと比較して、改変されたメチル化パターンを有するバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を生産するステップ、を含む（ここで、コントロール生産宿主細菌は、本明細書に記載の変更されたそのメチル化活性を有していない）。
バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡのメチル化パターンを改変するインビボの方法がさらに提供されて：生産宿主細菌に、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を感染させるステップ（ここで、生産宿主細菌は、内因性Ｒ－Ｍ系の少なくとも１つの酵素の破壊および／または少なくとも１つの異種メチルトランスフェラーゼの発現を介して変更されたメチル化活性を有し、それにより、前記のバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡをメチル化する）；および、コントロール生産宿主細菌において増殖されたバクテリオファージと比較して、改変されたメチル化パターンを有するバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を生産するステップを含む（ここで、コントロール生産宿主細菌は、本明細書に記載の変更されたそのメチル化活性を有していない）。
一部の実施態様では、生産宿主細菌の２以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個など）の内因性制限修飾系の酵素が、破壊されてよく、または、活性が変更されてよい。
生産宿主細菌は、任意のグラム陽性またはグラム陰性細菌であってよい。したがって、一部の実施態様では、生産宿主細菌は、制限されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含む。代表的な実施態様では、生産宿主細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉであってよい。さらなる実施態様では、生産宿主細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉの株ＭＧ１６５５、ＢＷ２５１１３、ＢＬ２１、ＴＯＰ１０、またはＭＧ１６５５ Δｄａｍ Δｄｃｍ ΔｈｓｄＲＭＳであってよい。
本発明の一部の実施態様では、生産宿主細菌のメチル化活性は改変されない。したがって、一部の実施態様では、そのメチル化活性を変更するように改変されていない生産宿主細菌に、組み換えバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を感染させることができる。
任意の公知または後に同定されるバクテリオファージＤＮＡを本発明で用いることができる。一部の実施態様では、バクテリオファージＤＮＡは、溶原性またはテンペレートバクテリオファージ由来であってよい。一部の実施態様では、バクテリオファージＤＮＡは、ファージミドと組み合わせる場合、溶菌性バクテリオファージ由来であってよい。
一部の実施態様では、バクテリオファージＤＮＡは、テンペレートバクテリオファージ由来であってよい。しかしながら、ＵＶ曝露、飢餓、温度変更、誘導性化学物質の存在、および／または、溶菌性転写因子の誘導性発現のようなイベントは、新たなファージの増殖を引き起こす溶菌サイクルを誘導し得る。本発明の一部の実施態様では、バクテリオファージＤＮＡは、制限されないが、Ｐ１ファージ、Ｍ１３ファージ、λファージ、Ｔ４ファージ、ＰｈｉＣ２ファージ、ＰｈｉＣＤ２７ファージ、ＰｈｉＮＭ１ファージ、Ｂｃ４３１ｖ３ファージ、ファージ、Ｐｈｉ１０ファージ、Ｐｈｉ２５ファージ、Ｐｈｉ１５１ファージ、Ａ５１１様ファージ、Ｂ０５４、０１７６１様ファージ、またはカンピロバクターファージ（例えば、ＮＣＴＣ１２６７６およびＮＣＴＣ１２６７７）のＤＮＡを含んでよい。一部の実施態様では、生産宿主細菌は、グラム陰性細菌であってよく、バクテリオファージＤＮＡは、例えば、Ｐ１ファージ、Ｍ１３ファージ、λファージ、Ｐｈｉ１０、Ｐｈｉ２５、Ｐｈｉ１５１、カンピロバクターファージ（例えば、ＮＣＴＣ１２６７６およびＮＣＴＣ１２６７７）、またはＴ４ファージであってよい。他の実施態様では、生産宿主細菌は、グラム陽性細菌であってよく、バクテリオファージＤＮＡは、例えば、ＰｈｉＣ２ファージ、ＰｈｉＣＤ２７ファージ、ＰｈｉＮＭ１ファージ、Ｂ０５４、０１７６１様ファージ、またはＢｃ４３１ｖ３ファージであってよい。
任意の公知または後に同定されるファージミドＤＮＡを本発明で用いてよい。一部の実施態様では、本発明で有用なファージミドＤＮＡは、制限されないが、Ｐ１ファージミド、Ｍ１３ファージミド、λファージミド、Ｔ４ファージミド、ＰｈｉＣ２ファージミド、ＰｈｉＣＤ２７ファージミド、ＰｈｉＮＭ１ファージミド、Ｂｃ４３１ｖ３ファージミド、Ｐｈｉ１０ファージミド、Ｐｈｉ２５ファージミド、Ｐｈｉ１５１ファージミド、Ａ５１１様ファージミド、Ｂ０５４、０１７６１様ファージミド、カンピロバクターファージミド（例えば、ＮＣＴＣ１２６７６およびＮＣＴＣ１２６７７）のＤＮＡを含んでよい。
内因性Ｒ－Ｍ系の酵素の活性は、ポリペプチドの機能および活性の破壊に関して当技術分野でよく知られているまたは後に開発される方法を用いて破壊され得る。そのような方法は、限定されないが、点突然変異（例えば、ミスセンス、またはナンセンス、または、フレームシフトをもたらす単一塩基対の挿入または欠失）、挿入、欠失、および／またはトランケーションの生成を含んでよい。一部の実施態様では、ポリペプチド阻害剤を用いて、細菌の制限修飾系（Ｒ－Ｍ系）の酵素の活性を破壊または抑制してよい。そのようなポリペプチド阻害剤は、当技術分野で知られている。ポリペプチド阻害剤は、例えば、バクテリオファージＤＮＡ、ファージミドＤＮＡ内にコードされてよく、および／または、バクテリオファージ粒子内にタンパク質としてパッケージされてよい。例えば、Ｐ１ファージは、Ｅ．ｃｏｌｉで見られるＩ型制限酵素を阻害する２つのポリペプチド阻害剤をコードする（Ｌｏｂｏｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６、７０３２－７０６８（２００４））。一部の実施態様では、内因性Ｒ－Ｍ系は、ポリペプチド阻害剤、宿主メチル化酵素の活性を刺激して送達されたＤＮＡのメチル化および保護を加速するポリペプチドの、導入によって阻害または破壊され得る。
Ｒ－Ｍ系酵素の阻害剤は、限定されないが、ＲＥａｓｅ（制限エンドヌクレアーゼ）を分解するタンパク質を含み、それにより、宿主Ｒ－Ｍ酵素システムがファージＤＮＡを切断するのを防止する。内因性の細菌のＲ－Ｍ系酵素の活性を破壊または改変するために本発明で使用され得るＲ－Ｍ酵素阻害剤の非限定的な例は、（ａ）Ｉ型Ｒ－Ｍ系の全ての主なクラスを阻害するタンパク質ＡｒｄＡを生産するＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｏｒｆ１８；および、（ｂ）Ｉ型Ｒ－Ｍ酵素ＥｃｏＫＩを隔離するタンパク質Ｏｃｒを生産するバクテリオファージＴ７由来のｇｐ０．３を含む。Ｒ－Ｍ系の酵素の活性をブロックするために用いられ得るタンパク質のさらなる非限定の例は、マスキングタンパク質を含む。マスキングタンパク質は、ファージ頭部にパッケージされて、そして、ＤＮＡ注入の際にファージＤＮＡに結合し、それにより、Ｒ－Ｍ認識部位をマスキングする。本発明で有用なマスキングタンパク質の非限定的な例は、ＤａｒＡおよびＤａｒＢタンパク質を含む（Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１５７（１）：１５６－６６（１９８７））。これらのタンパク質は、溶菌サイクル中にＰ１バクテリオファージによって発現されて、頭部にパッケージされる。宿主細菌へのＤＮＡ注入の際に、それらは結合して、Ｉ型Ｒ－Ｍ認識部位をマスクする。
追加的または選択的に、生産宿主細菌の内因性Ｒ－Ｍ系は、少なくとも１つの異種メチルトランスフェラーゼの発現を通して変更／改変され得る。生産宿主細菌のメチル化パターンが標的細菌のメチル化パターンと実質的に類似するように生産宿主細菌の内因性メチル化パターンを変更する任意のメチルトランスフェラーゼを、本発明で使用することができる。異種メチルトランスフェラーゼは、標的細菌株として生産宿主細菌と実質的に類似するメチル化パターンを与える限り、同一または異なる生物由来であってよい。本発明で有用なＤＮＡ ＭＴａｓｅの非限定的な例は、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉにおいてＩＩ型Ｒ－Ｍ系に対して保護するために導入され得る、ファージΦ５０由来のＬｌａＰＩを含む（ＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６５：１８９１－１８９９（１９９９））。個々のメチルトランスフェラーゼによって与えられるメチル化パターンは、それから、Ｐａｃｂｉｏ ＳＭＲＴシーケンシングのような確立されたＤＮＡシーケンシング技術を用いて評価される（Ｏ’Ｌｏｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５：ｅ０１１８５３３．）。生産された時点で、生産株は、標的株へのＤＮＡ送達のためのバクテリオファージ粒子を生産するために用いられる。
さらなる異種ＤＮＡ改変酵素は、標的細菌のＲ－Ｍ系と実質的に類似する生産宿主細菌のＲ－Ｍ系が作られるように、生産宿主細菌において発現され得る。この目的に有用な、そのようなＤＮＡ改変酵素の例は、ＤＮＡ内のアデニン残基をアセトアミドアデニンに変換するポリペプチドをコードするものを含む。バクテリオファージＤＮＡ内のアデニン残基をアセトアミドアデニンに変換するポリペプチドは、アデニンメチル化に感受性の制限酵素に対してＤＮＡを保護する。生産宿主細菌において、ＤＮＡ内のアデニン残基をアセトアミドアデニンに変換することのできるポリペプチドの非限定的な例は、ファージＭｕおよびＭｕ様プロファージ配列由来のｍｏｍ遺伝子を含み（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎ ｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ（ＦｌｕＭｕ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ａ型Ｚ２４９１株（Ｐｎｍｅ１）およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅバイオタイプａｅｇｙｐｔｉｕｓ ＡＴＣＣ１１１１６；（Ｄｒｏｚｄｚ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４０（５）：２１１９－３０（２０１２）を参照）、それは、アデニン残基をＮ（６）－メチルアデニンに変換して、それにより、アデニン感受性制限酵素に対して保護する。
一部の実施態様では、本明細書に記載のポリペプチド阻害剤および他のＤＮＡ改変酵素をコードするポリヌクレオチドは、送達されたＤＮＡを標的宿主細菌のＲ－Ｍ系から保護する使用のために、ファージゲノムに直接的に導入され得る。
細菌にバクテリオファージ粒子を感染させるプロセスはよく知られていて、例えば、細菌宿主細胞を、バクテリオファージ粒子と、規定の条件下でインキュベートするステップを含んでよい。細菌宿主細胞における複製に続いて、溶菌サイクルが、制限されないが、ＵＶ曝露、飢餓、温度変更、または、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を得るための溶菌性転写因子の誘導性発現を含む異なる確立された方法を通して引き起こされ得る。
本発明は、さらに、バクテリオファージおよびファージミドを介して異種ＤＮＡを導入する効率を増大させるための、本発明のバクテリオファージ粒子の使用のための方法および組成物に関する。したがって、一部の実施態様では、少なくとも１つの目的の異種核酸は、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡ中に導入され得る。異種ポリヌクレオチドをバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡ中に導入するための方法は、当技術分野でよく知られている。一部の実施態様では、少なくとも１つの目的の異種核酸は、バクテリオファージＤＮＡ中に、例えば、相同組み換えを介して導入され得て、一方で、バクテリオファージＤＮＡは、宿主細菌（例えば、生産宿主細菌）内、または、標準的なクローニング技術を介してファージミドＤＮＡ中にある。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つの目的の異種核酸は、レポーター遺伝子（例えば、ｇｆｐ、ｌａｃＺ）、抗生物質耐性マーカー（例えば、ｃａｔ、ｂｌａ）、代謝経路（例えばカロテノイド生合成）における１つまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、遺伝子レギュレーター（例えば、ｄＣａｓ９、ｔｅｔＲ）、および／または、任意の内因性遺伝子のさらなるコピー（例えば、過剰発現のため）であってよい。
したがって、一部の実施態様では、本発明は、目的の異種核酸を、標的宿主細菌中に、バクテリオファージを介して導入する効率を増大させる方法を提供し、少なくとも１つの目的の異種核酸を、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡ中に、生産宿主細菌の感染の前に導入するステップ（ここで、生産宿主細菌は、内因性Ｒ－Ｍ系の少なくとも１つの酵素を破壊するように、および／または、少なくとも１つの異種メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むように、改変されていて、それにより、前記のバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡをメチル化する）、および、（前記の変更されたメチル化活性を有さない生産宿主細菌において生産されるバクテリオファージまたはファージミドＤＮＡと比較して）改変されたメチル化パターンを有する前記の少なくとも１つの目的の異種核酸を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを生産するステップ；前記の少なくとも１つの目的の異種核酸を含む前記の組み換えバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を生産するステップ；および、標的宿主細菌に、前記バクテリオファージ粒子を感染させるステップ、を含む（ここで、標的宿主細菌は、生産宿主細菌のものと実質的に類似するメチル化パターン（またはＲ－Ｍ系（単数または複数）を有し、それにより、コントロール生産宿主細菌において増殖したバクテリオファージを用いて前記の目的の異種核酸を導入するのと比較して、前記標的宿主細菌中に前記の目的の異種核酸を導入する効率を増大させる）（ここで、コントロール生産宿主細菌は、標的宿主細菌のものと実質的に類似するように変更されたそのメチル化活性を有していない）。一部の態様では、生産宿主細菌は、バクテリオファージによる感染後に、そのＲ－Ｍ系を変更する（例えば、内因性Ｒ－Ｍ系の少なくとも１つの酵素を破壊する、および／または、少なくとも１つの異種メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む）ように、改変され得る。
一部の実施態様では、目的の異種核酸を、標的宿主細菌中に、バクテリオファージを介して導入する効率を増大させる方法が提供され、生産宿主細菌に、少なくとも１つの目的の異種核酸を含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を感染させるステップ（ここで、生産宿主細菌は、内因性Ｒ－Ｍ系の少なくとも１つの酵素の破壊および／または少なくとも１つの異種メチルトランスフェラーゼの発現を介して変更されたメチル化活性を有し、それにより、前記のバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡをメチル化する）；改変されたメチル化パターンを有し、前記の少なくとも１つの目的の異種核酸を含む／コードする、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を生産するステップ；および、標的宿主細菌に、前記バクテリオファージ粒子を感染させるステップ、を含む（ここで、標的宿主細菌は、生産宿主細菌のものと実質的に類似するメチル化パターン（またはＲ－Ｍ系（単数または複数））を有し、それにより、コントロール生産宿主細菌において増殖されたバクテリオファージを用いて前記の目的の異種核酸を導入するのと比較して、前記標的宿主細菌中へ前記の目的の異種核酸を導入する効率を増大させる）（ここで、コントロール生産宿主細菌は、本明細書に記載の標的宿主細菌のものと実質的に類似するように変更されたそのメチル化活性を有していない）。一部の態様では、生産宿主細菌は、バクテリオファージによる感染後に、そのＲ－Ｍ系を変更する（例えば、内因性Ｒ－Ｍ系の少なくとも１つの酵素を破壊する、および／または、少なくとも１つの異種メチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む）ように改変され得る。
本発明は、さらに、ゲノム標的化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの送達のための、本発明のバクテリオファージ粒子の使用のための方法および組成物に関する。特定の実施態様では、方法および組成物は、本明細書に記載の改変されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むテンペレートバクテリオファージを用いた細菌の選択的な死滅のために提供される。
したがって、一部の実施態様では、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、少なくとも１つの目的の異種核酸によって形質転換され得て、ここで、前記の少なくとも１つの目的の異種核酸は、ＣＲＩＳＰＲアレイを含む。さらなる実施態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイまたはＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイであってよい。一部の実施態様では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、バクテリオファージＤＮＡ中に導入され、ファージミドＤＮＡ中には導入されない。一部の実施態様では、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、バクテリオファージＤＮＡ中に導入され、ファージミドＤＮＡ中には導入されない。したがって、一部の実施態様では、本発明は、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供し、ここで、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチドを含み、ＣＲＩＳＰＲアレイは、リピート－スペーサー－リピート配列、または少なくとも２以上のリピート－スペーサー配列を含み、前記の少なくとも２以上のリピート－スペーサー配列は、少なくとも第一のリピート－スペーサー配列および最後のリピート－スペーサー配列を含み、前記の第一のリピート－スペーサー配列のスペーサーの３’末端は、次のリピート－スペーサー配列のリピートの５’末端に連結され、最後のリピート－スペーサー配列は、３’末端においてリピートに連結される。
一部の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイである場合、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、（ａ）ｔｒａｃｒ核酸およびＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドを含むようにさらに形質転換され得る。したがって、一部の実施態様では、バクテリオファージＤＮＡは、組み換えＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｔｒａｃｒ核酸、および、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含むように改変され得る。他の実施態様では、ファージミドＤＮＡは、組み換えＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むように改変され得る。
したがって、一部の実施態様では、本発明は、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供し、ここで、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、（ａ）Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチド；およびｃ）ｔｒａｃｒ核酸を含む組み換えＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、場合により、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒ核酸は、互いに融合されて、（単一ガイド核酸を形成する（ｓｇＲＮＡ、ｓｇＤＮＡ）。一部の実施態様では、本発明は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチドを含むバクテリオファージＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供する。さらなる実施態様では、本発明は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチドおよび／または単一ガイド核酸を含むファージミドＤＮＡ（融合されたＣＲＩＳＰＲアレイおよびｔｒａｃｒ核酸）を含むバクテリオファージ粒子を提供する。
一部の実施態様では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたはその構成要素は、同一の、または、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むバクテリオファージとは異なる、または互いに異なる、バクテリオファージ内に導入され得る。したがって、例えば、組み換えファージは、標的細菌内に導入され得て、ここで、組み換えファージは、そのＤＮＡ内にアレイのみを含む。この場合、標的細菌は、導入されるＣＲＩＳＰＲアレイと適合するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含んでよく、または、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたはその構成要素は、１つまたは複数のさらなる組み換えバクテリオファージ内に導入され得る。したがって、バクテリオファージは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ；単一ガイド；Ｃａｓ９；ｔｒａｃｒ；ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイおよびＣａｓ９；ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイおよびｔｒａｃｒ；ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、Ｃａｓ９およびｔｒａｃｒ；ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイおよび単一ガイド；などだけを含むように、および、導入するように、改変され得る。
一部の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイがＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイである場合、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、Ｃａｓ３ポリペプチド、またはＣａｓ３’およびＣａｓ３’’ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または、Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、含むようにさらに形質転換されてよい。したがって、一部の実施態様では、バクテリオファージＤＮＡは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ、およびＩ型ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ３ポリペプチド、またはＣａｓ３’およびＣａｓ３’’ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および、Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド）を含むように改変されてよい。他の実施態様では、ファージミドＤＮＡは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むように改変されてよい。したがって、一部の実施態様では、本発明は、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供し、ここで、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチド；および（ｂ）１つまたは複数のＩ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、組み換えＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。一部の実施態様では、本発明は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチドを含むバクテリオファージＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供する。さらなる実施態様では、本発明は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチドを含むファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供する。
一部の実施態様では、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたはその構成要素は、同一の、または、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むバクテリオファージとは異なる、または互いに異なる、バクテリオファージ内に導入され得る。したがって、例えば、組み換えファージは、標的細菌中に導入され得て、ここで、組み換えファージは、そのＤＮＡ内に、ＣＲＩＳＰＲアレイのみを含む。この場合、標的細菌は、導入されるＣＲＩＳＰＲアレイと適合するＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含んでよく、または、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたはその構成要素は、１つまたは複数のさらなる組み換えバクテリオファージ内に導入され得る。したがって、バクテリオファージは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイ；Ｃａｓ３；１つまたは複数のＣａｓｃａｄｅポリヌクレオチド；ＣＲＩＳＰＲアレイおよびＣａｓ３、ＣＲＩＳＰＲアレイおよび１つまたは複数のＣａｓｃａｄｅポリペプチド；Ｃａｓ３および１つまたは複数のＣａｓｃａｄｅポリペプチド；ＣＲＩＳＰＲアレイ、Ｃａｓ３、および１つまたは複数のＣａｓｃａｄｅポリペプチド；などだけを含むように、および、導入するように、改変され得る。
一部の実施態様では、組み換えＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたは組み換えＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むバクテリオファージＤＮＡおよびファージミドＤＮＡは、本明細書に記載のように、そのように改変されないバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡと比較して改変されたＤＮＡメチル化パターンを含むように改変することができ、場合により、改変されたＤＮＡメチル化パターンは、標的宿主細菌の制限修飾系（単数または複数）と実質的に類似する改変されたＤＮＡメチル化パターンを含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡをもたらす。したがって、一部の実施態様では、前記の少なくとも１つの目的の異種核酸は、改変されたメチル化活性を有する生産宿主細菌中への前記のバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡの感染の前に、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡ中に導入してよい。そのような様式で、目的の核酸によって形質転換されたバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、生産宿主細菌内で複製しながら、宿主細菌メチル化機構によってメチル化される。宿主細胞の再パッケージおよび溶解は、その結果、生産宿主細菌内に存在するものに対応するメチル化パターンを有する前記の少なくとも１つの目的の異種核酸を含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を生産する。それから、生産宿主細菌によって生産されたバクテリオファージ粒子を用いて標的宿主細菌を感染することができ、それにより、目的の核酸を標的宿主細菌中に導入する。典型的に、標的宿主細菌は、生産宿主細菌の制限修飾系（単数または複数）（Ｒ－Ｍ系）と実質的に類似するＤＮＡメチル化パターンを有することに基づいて選択される。あるいは、生産宿主細菌のメチル化活性は、標的宿主細菌のＲ－Ｍ系に実質的に類似するように改変されて、それにより、標的宿主細菌のＲ－Ｍ系（単数または複数）と実質的に類似するメチル化パターンを有するバクテリオファージＤＮＡおよび／またはファージミドＤＮＡを生産するために用いることのできる生産宿主細菌を提供する。したがって、一部の実施態様では、生産宿主細菌のＤＮＡメチル化活性は、本明細書に記載のバクテリオファージ粒子による感染の前に変更されて、それにより、コントロール生産宿主細菌において増殖されたバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡと比較して改変されたメチル化パターンを有する形質転換されたバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を生産する（例えば、コントロール生産宿主細菌は、本明細書に記載の変更されたそのメチル化活性を有していない）。一部の実施態様では、形質転換されたバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡの変更されたメチル化パターンは、標的宿主細菌のメチル化活性（Ｒ－Ｍ系）に対応してよく、それにより、標的宿主細菌のものに対応しないメチル化パターンを有するバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡと比較して、標的宿主細菌への形質転換されたＤＮＡの送達を増大させる。
一部の実施態様では、生産宿主細菌は、標的細菌のものと実質的に類似するメチル化パターンを天然に含んでよい。したがって、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡが生産宿主細菌において生産される場合、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、生産宿主細菌ならびに標的宿主細菌の両方のメチル化パターンを有し、それにより、標的宿主細菌のものと実質的に同一でないメチル化パターンを有するバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡと比較して、標的宿主細菌への形質転換されたＤＮＡの送達を増大させる。
メチル化パターンは、細菌内に存在するメチル化のタイプ（例えばｍ４Ｃ）、ならびに、メチル化される特定の配列（例えばＧｍＡＴＣ）によって判定される。したがって、メチル化パターン間の類似性のレベルは、（天然またはメチル化パターン間の改変の結果であろうと、）標的部位が適切なタイプのメチル化を有する頻度を指す。したがって、実質的に類似するメチル化パターンは、本明細書に記載の適切なタイプのメチル化を有する標的部位の間で、少なくとも約２０％またはより高い類似性（例えば、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い、またはその中の任意の範囲または値）を有することを意味する。したがって、一部の実施態様では、メチル化パターンは、宿主および標的細菌の間で、約２０％～９９％またはそれよりも類似してよく、約３０％～９９％またはそれよりも類似してよく、約４０％～９９％またはそれよりも類似してよく、約５０％～９９％またはそれよりも類似してよく、約６０％～９９％またはそれよりも類似してよく、約７０％～９９％またはそれよりも類似してよく、約８０％～９９％またはそれよりも類似してよく、約８５％～９９％またはそれよりも類似してよく、約９０％～９９％またはそれよりも類似してよく、または、約９５％～９９％またはそれよりも類似してよい。標的宿主細菌および導入されたＤＮＡ（改変されたバクテリオファージＤＮＡ）のメチル化パターンの間の実質的な類似性は、導入されたＤＮＡが、標的宿主細菌と実質的に類似するメチル化パターンを共有しない導入されたＤＮＡのものよりも少なく分解されていることを意味する。一部の実施態様では、宿主細菌および標的細菌のメチル化パターンは、同一であってよい。
一部の実施態様では、本発明は、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供し、ここで、前記のバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、バクテリオファージＤＮＡ（ゲノム）中に組み込まれた少なくとも１つの目的の異種核酸、および、標的宿主細菌のＲ－Ｍ系（単数または複数）に実質的に類似する改変されたＤＮＡメチル化パターンを含む。したがって、例えば、（標的宿主細菌のＲ－Ｍ系（単数または複数）と実質的に類似する）改変されたメチル化パターンを有するバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、（１）ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチド、または、（ａ）Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチド；および／またはｃ）ｔｒａｃｒ核酸を含む（２）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含んでよい。一部の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイ（ａ）およびｔｒａｃｒ核酸（ｃ）をコードするポリヌクレオチドは、互いに融合することができる。さらなる実施態様では、（標的宿主細菌のＲ－Ｍ系（単数または複数）に実質的に類似する）改変されたメチル化パターンを有するバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、（１）ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチド、または、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチド；および／または（ｂ）１つまたは複数のＩ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む（２）組み換えＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含んでよい。一部の実施態様では、前記の少なくとも１つの目的の異種核酸は、組込みの不必要な部位または組込みの相補部位において、バクテリオファージＤＮＡ（例えば、ゲノム）中に組み込むことができる。
本明細書において用いられる「不必要な部位」は、バクテリオファージゲノムの維持、ファージ粒子の生産、および、パッケージされたＤＮＡの送達に必要でないバクテリオファージＤＮＡまたはゲノム内の部位を意味する。したがって、そのような機能を行なうのに必要でないバクテリオファージゲノム内の任意の部位は、目的の核酸をバクテリオファージゲノム中に組み込むための「ランディング」部位として用いることができる。バクテリオファージゲノム内の一部の例示的な不必要な部位は、限定されないが、（ａ）ファージによってコードされる制限修飾系（例えば、Ｐ１ファージ内のｒｅｓ／ｍｏｄ）、（ｂ）重複感染をブロックする遺伝子（例えば、ｓｉｍＡＢＣ）、（ｃ）制限修飾系の阻害剤（例えば、Ｐ１ファージ内のｄａｒＡ）、（ｄ）挿入配列エレメント（例えば、Ｐ１ファージ内のＩＳ１）、（ｅ）アディクションシステム（例えば、Ｐ１ファージ内のｐｈｄ／ｄｏｃ）または（ｆ）それらの任意の組み合わせを含んでよい。
本明細書において用いられる「相補部位」または「相補可能部位」は、バクテリオファージゲノムの維持、ファージ粒子の生産、および、パッケージされたＤＮＡの送達に必要であるが、目的の核酸の組込み（組込みの相補部位）によって破壊された核酸をコードする相補するポリヌクレオチドによって相補され得る、バクテリオファージＤＮＡまたはゲノム内の必要不可欠な部位を意味する。相補するポリヌクレオチドは、生産宿主細菌のゲノム中に組み込まれてよく、または、生産宿主細菌内のプラスミド上に含まれてよい。したがって、目的の核酸がバクテリオファージＤＮＡの相補部位に組み込まれる場合、宿主細菌は、プラスミド上またはそのゲノム内に、バクテリオファージ内の相補部位に対する相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）をコードするポリヌクレオチドを含んでよい。例示的な相補部位は、限定されないが、（ａ）溶菌サイクルのアクチベーター（例えば、Ｐ１ファージ内のｃｏｉ）、（ｂ）溶菌遺伝子（例えば、Ｐ１ファージ内のｋｉｌＡ）、（ｃ）ｔＲＮＡ（例えば、Ｐ１ファージ内のｔＲＮＡ１、２）、（ｄ）粒子成分（例えば、Ｐ１ファージ内のｃｉｘＬ、ｃｉｘＲ尾部繊維遺伝子）、または（ｅ）それらの任意の組み合わせを含んでよい。
したがって、一部の実施態様では、組み換えＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、組み換えＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチド（Ｉ型またはＩＩ型）および／またはｔｒａｃｒ核酸、１つまたは複数のＩ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、バクテリオファージＤＮＡ内の不必要な部位に組み込むことができる。一部の実施態様では、組み換えＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、組み換えＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードするポリヌクレオチド（Ｉ型またはＩ型）および／またはｔｒａｃｒ核酸、１つまたは複数のＩ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、バクテリオファージＤＮＡ内の相補部位に組み込むことができ、ここで、バクテリオファージに対する宿主細菌は、プラスミド上またはそのゲノム内に、バクテリオファージ内の相補部位をコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが組み込まれているファージゲノム内の部位に相補の遺伝子）。
本明細書において用いられる「Ｉ型ポリペプチド」は、任意のＣａｓ３ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、Ｃａｓ３’’ポリペプチド、および、抗ウイルス防御のためのＩ型Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）関連複合体（「Ｃａｓｃａｄｅ」）ポリペプチドの任意の１つまたは複数を指す。したがって、用語「Ｉ型ポリペプチド」は、Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、および／または、Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するポリペプチドを指す。それぞれのＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、少なくとも１つのＣａｓ３ポリペプチドを含む。Ｃａｓ３ポリペプチドは、一般に、ヘリカーゼドメインおよびＨＤドメインの両方を含む。しかしながら、一部のＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、ヘリカーゼおよびＨＤドメインは、別個のポリペプチド、Ｃａｓ３’およびＣａｓ３’’に見られる。具体的には、Ｃａｓ３’はヘリカーゼドメインをコードし、一方で、Ｃａｓ３’’はＨＤドメインをコードする。その結果として、両方のドメインがＣａｓ３機能に必要であるので、Ｉ型サブタイプは、Ｃａｓ３（Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆ）またはＣａｓ３’およびＣａｓ３’’（Ｉ－Ａ、Ｉ－Ｂ）のいずれかをコードする。
本明細書において用いられる「Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチド」は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおける、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのプロセッシングおよびその後の標的ＤＮＡに対する結合に関与するポリペプチドの複合体を指す。これらのポリペプチドは、限定されないが、Ｉ型サブタイプＩ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－ＥおよびＩ－ＦのＣａｓｃａｄｅポリペプチドを含む。Ｉ－Ａ型ポリペプチドの非限定的な例は、Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）、Ｃａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）、Ｃａｓ５、Ｃｓａ５、Ｃａｓ６ａ、Ｃａｓ３’および／またはＣａｓ３’’を含む。Ｉ－Ｂ型ポリペプチドの非限定的な例は、Ｃａｓ６ｂ、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）および／またはＣａｓ５を含む。ＩＣ型ポリペプチドの非限定的な例は、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）、および／またはＣａｓ７（Ｃｓｄ２）を含む。ＩＤ型ポリペプチドの非限定的な例は、Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）、Ｃｓｃ２、Ｃｓｃ１、および／またはＣａｓ６ｄを含む。Ｉ－Ｅ型ポリペプチドの非限定的な例は、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）および／またはＣａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）を含む。Ｉ－Ｆ型ポリペプチドの非限定的な例は、Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）および／またはＣａｓ６ｆ（Ｃｓｙ４）を含む。したがって、本発明の一部の実施態様では、本発明で有用なＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲアレイを処理して、処理されたＲＮＡを生産して、それからそれは、複合体を、処理されたＲＮＡ内のスペーサーに相補なＤＮＡと結合するために用いられる。一部の実施態様では、獲得に関与するＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドは、本発明の核酸分子内に含まれない（例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４）。当技術分野で知られているＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム由来のＣａｓｃａｄｅポリペプチドの任意のそのようなサブセット、または、のちに発見されるものは、本発明の核酸構築物内に含まれ得る。そのようなポリペプチドは、例えば、ＢＬＡＳＴ検索を介して同定され得る。
したがって、一部の実施態様では、バクテリオファージ粒子は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイおよび／または（ｉ）Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）ポリペプチド、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃｓａ５ポリペプチド、Ｃａｓ６ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、およびＣａｓ３’’ポリペプチド（Ｉ－Ａ型）；（ｉｉ）Ｃａｓ６ｂポリペプチド、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）ポリペプチド、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、およびＣａｓ３’’ポリペプチド（Ｉ－Ｂ型）；（ｉｉｉ）Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）ポリペプチド、Ｃａｓ７（Ｃｓｄ２）ポリペプチド、およびＣａｓ３ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型）；（ｉｖ）Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）ポリペプチド、Ｃｓｃ２ポリペプチド、Ｃｓｃ１ポリペプチド、およびＣａｓ６ｄポリペプチド、およびＣａｓ３ポリペプチド（Ｉ－Ｄ型）；（ｖ）Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）ポリペプチド、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）ポリペプチド、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）ポリペプチド、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）ポリペプチド、Ｃａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）ポリペプチド、およびＣａｓ３ポリペプチド（Ｉ－Ｅ型）；または（ｉｖ）Ｃｙｓ１ポリペプチド、Ｃｙｓ２ポリペプチド、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）ポリペプチド、Ｃａｓ６ｆポリペプチドおよび／またはＣａｓ３ポリペプチド（Ｉ－Ｆ型）を含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含んでよい。代表的な実施態様では、バクテリオファージ粒子は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイおよび１つまたは複数のＩ－Ｅ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド（すなわち、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）ポリペプチド、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）ポリペプチド、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）ポリペプチド、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）ポリペプチド、Ｃａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）ポリペプチド、Ｃａｓ３ポリペプチド）を含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含んでよい。
「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＩＩ型システムにおいて二本鎖ＤＮＡ切断を触媒する大きなグループのエンドヌクレアーゼを指す。これらのポリペプチドは、当技術分野でよく知られていて、それらの構造（配列）の多くが特徴付けられている（例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２；ＷＯ／２０１３／１８８６３８を参照）。二本鎖ＤＮＡの切断を触媒するためのドメインは、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインである。ＲｕｖＣドメインは、（－）鎖にニックを入れるのを担い、ＨＮＨドメインは、（＋）鎖にニックを入れるのを担う（例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０９（３６）：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６（２０１２年９月４日）を参照）。
一部の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｔｒａｃｒ核酸、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、Ｃａｓ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、Ｃａｓ３’ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、Ｃａｓ３’’ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または、１つまたは複数のＩ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結されてよい。一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドが、１つまたは複数のＩ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む場合、前記の少なくとも２つのポリヌクレオチドは、単一のプロモーターまたは別個のプロモーターに動作可能に連結されてよい。
一部の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイおよびｔｒａｃｒ核酸は、単一のプロモーターまたは異なるプロモーターに動作可能に連結されてよい。一部の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイおよびｔｒａｃｒ核酸が互いに融合される場合、ＣＲＩＳＰＲアレイおよびｔｒａｃｒ核酸をコードする融合ポリヌクレオチドは、単一のプロモーターに動作可能に連結されてよい。一部の実施態様では、１つまたは複数のＩ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも２つは、融合されて単一のポリヌクレオチドを形成してよく、それは場合により、プロモーターに動作可能に連結されてよい。一部の実施態様では、１型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドは、単一オペロン内に含まれてよく、場合により、プロモーターに動作可能に連結される。さらなる実施態様では、Ｃａｓ３ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または、Ｃａｓ３’’ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに融合されてよく、前記融合ポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結されてよく、それは発現の際に、融合ポリペプチドを生産する。代表的な実施態様では、Ｃａｓ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｃｓｅ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに融合されてよい。
加えて、本発明は、本発明の任意の方法によって生産されるバクテリオファージ粒子を提供する。一部の実施態様では、バクテリオファージ粒子は、バクテリオファージＤＮＡを含む。他の実施態様では、バクテリオファージ粒子は、ファージミドＤＮＡを含む。さらなる実施態様では、バクテリオファージ粒子は、ファージミドＤＮＡを含まない。一部の実施態様では、本発明は、バクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を提供し、それは、標的宿主細菌の制限修飾系（単数または複数）と実質的に類似する改変されたＤＮＡメチル化パターンを含む。
さらに本明細書において提供されるのは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの少なくともＣＲＩＳＰＲアレイを含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含むように改変された本発明のバクテリオファージ粒子を用いて、細菌（すなわち、標的細菌）を選択的に死滅させる方法である。一部の実施態様では、バクテリオファージＤＮＡおよび／またはファージミドＤＮＡがＣＲＩＳＰＲアレイのみを含む場合、標的細菌宿主は、活性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、少なくともｔｒａｃｒ核酸およびＣａｓ９ポリペプチド（ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、または少なくともＣａｓ３ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチドおよび／またはａＣａｓ３’’ポリペプチドおよび少なくともＣａｓｃａｄｅポリペプチドのサブセット（Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム））を含んでよい。他の実施態様では、バクテリオファージ粒子のバクテリオファージＤＮＡおよび／またはファージミドＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｔｒａｃｒ核酸および／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または、ＣＲＩＳＰＲアレイ、少なくともＣａｓ３ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチドおよび／またはＣａｓ３’’ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および、少なくともＣａｓｃａｄｅポリペプチドのサブセットをコードするポリペプチドを含む。
一部の実施態様では、細菌を選択的に死滅させるために用いられるバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、天然または本明細書に記載のように改変されたかのいずれかで、標的細菌のものに実質的に類似するメチル化パターンを含む。
したがって、本発明は、少なくとも１つの標的細菌種または株を選択的に死滅させる方法を提供し、前記の少なくとも１つの標的細菌種または株を、ＣＲＩＳＰＲアレイを含む組み換えＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムまたはＣＲＩＳＰＲアレイをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含む本発明のバクテリオファージ粒子と、接触させるステップを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲアレイは、前記の少なくとも１つの標的細菌種または株内の標的ＤＮＡと実質的な相補性（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相補性、またはその中の任意の範囲または値）を有する少なくとも１つのスペーサーを含む。一部の実施態様では、前記のバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡは、前記の少なくとも１つの標的細菌種または株内の標的ＤＮＡと１００％相補性を有する少なくとも１つのスペーサーを含む。
一部の実施態様では、バクテリオファージ粒子は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイまたはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイのみを含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含み、標的細菌宿主は、活性の内因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｉ型またはＩＩ型システムを有する任意の細菌種または株であってよい。活性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｉ型またはＩＩ型システムを有する例示的な細菌種または株は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（ＩＩ－Ａ型）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｉ、ＩＩＩ型）、Ｎｏｖｉｃｉｄａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＩＩ－Ｃ型）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｉ－Ｆ型）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＩＩ－Ａ型）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＩＩ－Ａ型）、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ（Ｉ－Ｆ型）、および／または、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＩＩ－Ａ型）を含む。他の実施態様では、バクテリオファージ粒子は、組み換えＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたは組み換えＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むバクテリオファージＤＮＡまたはファージミドＤＮＡを含み、宿主細菌は、内因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｉ型またはＩＩ型システムを有してよく、または有さなくてよく、したがって、宿主細菌は、標的ＤＮＡを含む任意の細菌宿主であってよい。
例示的な実施態様では、標的ＤＮＡは、標的株、種、または属に特有であってよく；異なる株、種、または属間で共有されてよく；ほとんどの細菌内に存在してよく；および／または、抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子、および／または、病原性アイランド内であってよい。一部の実施態様では、バクテリオファージ粒子は、標的細菌種または株とは異なる細菌種または株において生産または生成され得る。
一部の実施態様では、細菌は、例えば、ヒト、動物、植物において／に対して、および、農業、医業および／または産業の状況（例えば、発酵）において、標的化され得る。一部の実施態様では、本発明のバクテリオファージ粒子は、細菌株を完全に除去するための、または、その存在を滴定するための方法で使用され得る。
ここで、本発明を、以下の実施例に関して説明する。これらの実施例は、本発明に対する特許請求の範囲の制限を意図しないが、むしろ、特定の実施態様の例示であることを意図することが理解されるべきである。当業者が想到する例示された方法における任意の変型は、本発明の範囲内であることが意図される。
実施例１．宿主細菌のメチル化活性およびファージＤＮＡのメチル化パターンの改変
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８などの宿主生産株のメチル化パターンを、その内因性制限修飾系を欠失させて異種メチルトランスフェラーゼ遺伝子を導入することによって変更する。制限修飾遺伝子は、当技術分野で知られている手段、例えば、オンラインＲＥＢＡＳＥデータベース（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ４３：Ｄ２９８－Ｄ２９９．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ１０４６）を通して同定される。これらの制限修飾系は、当技術分野で知られている標準的な組み換え技術戦略を用いて欠失することができる。欠失した時点で、構成的または誘導性プロモーターの制御下で、外来メチルトランスフェラーゼ遺伝子を複製プラスミドに挿入し、または、宿主ゲノムに組み換える。これらの遺伝子は、天然配列または生産宿主のためにコドン最適化された配列を用いて標的株から直接得られる。あるいは、異種メチルトランスフェラーゼ遺伝子を用いて、標的株と類似するメチル化パターンを与えることができる。個々のメチルトランスフェラーゼによって与えられたメチル化パターンを、それから、ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴシーケンシング（Ｏ’Ｌｏｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５：ｅ０１１８５３３．）のような確立されたＤＮＡシーケンシング技術を用いて評価する。生産された時点で、生産株を用いて、標的株へのＤＮＡ送達のためのバクテリオファージ粒子を生産する。
Ｍ１３ファージおよびＰ１ファージを用いて、ファージミド（Ｍ１３）およびファージゲノム（Ｐ１）の送達に対するメチル化の影響を示す。Ｍ１３ファージは、ファージディスプレイに関するその広範囲の用途に基づく確立されたファージミドシステムを有する（Ｐａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２８、８４９－８５８（２０１０））。システムは、ｆ１起点を含む（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）プラスミドを効率的にパッケージするヘルパープラスミドの使用に基づく。それから、細胞は、ファージ粒子を構成的に生産し、集めて標的株に投与することができる。粒子は、Ｆ１線毛を認識し、それは、株がＦプラスミドを保有することを必要とする。Ｐ１ファージは、Ｍ１３よりもさらにいっそう複雑な、良く特徴付けられたファージである（Ｌｏｂｏｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６、７０３２－７０６８（２００４））。Ｐ１ファージに関する溶菌サイクルを動かすために、我々は、別個のプラスミドからｃｏｉ遺伝子を発現させた。
Ｍ１３ファージミドに関する改善された送達を示す：そのＲ－Ｍ系を無傷で全て有する（ＭＧ１６５５）、一部を有する（ＴＯＰ１０）、または有さない（ＭＧ１６５５ Δｄａｍ Δｄｃｍ ΔｈｓｄＲＭＳ）Ｅ．ｃｏｌｉにおいて調製されたＭ１３ファージの力価を試験する。ファージを、ＭＧ１６５５ Δｄａｍ Δｄｃｍ ΔｈｓｄＲＭＳにおいて試験して、力価における潜在的可変性を評価し、それから、ＭＧ１６５５においてＤＮＡメチル化の影響を評価する。ファージミド内の抗生物質耐性マーカーは、抗生物質耐性コロニーの数に基づき送達の読み出しとして役立つ。送達効率は、ＭＧ１６５５ Δｄａｍ Δｄｃｍ ΔｈｓｄＲＭＳに入る（ｇｏｉｎｇ ｉｎｔｏ）場合と同様であると予測されるが、ＭＧ１６５５に入る場合、ＭＧ１６５５に関して非常に上昇すると予測される。
腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉへのＭ１３ファージミドの送達：Ｍ１３ファージミドを、ＥＨＥＣの株（腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ）に送達する。ＥＨＥＣは、ＭＧ１６５５よりも多くのＲ－Ｍ系を保有し、Ｍ１３ファージミドの取り込みが低いことが示されている。ＥＨＥＣ由来のＩＩ型メチルトランスフェラーゼを、ＭＧ１６５５ Δｄａｍ Δｄｃｍ ΔｈｓｄＲＭＳ株内で発現して、ファージミドを含むＭ１３粒子を生産する。それから、粒子を、ＭＧ１６５５ Δｄａｍ Δｄｃｍ ΔｈｓｄＲＭＳおよびＦプラスミドを保有するＥＨＥＣ株に投与し、抗生物質耐性であるコロニーの数をカウントする。導入されたメチルトランスフェラーゼは、ＭＧ１６５５ Δｄａｍ Δｄｃｍ ΔｈｓｄＲＭＳコロニーの数に影響を及ぼさないと予測されるが（同様の粒子力価を示す）、ＥＨＥＣコロニーの数を非常に増大させると予測される（メチルトランスフェラーゼに起因する改善された効率を示す）。
Ｐ１ファージに関する改善された送達を示す：上述のものと類似するアプローチを、Ｐ１ＣＭファージを用いて続ける。主な違いは、Ｐ１ゲノム内のｄｍｔメチラーゼ遺伝子がさらに破壊されることである。我々は、ＥＣ１３５においてＰ１溶原菌を生成することを既に試していて、それは、液体培養において細胞溶解をもたらした。いくらかの量のメチル化が必要であると予測され；しかしながら、所定の位置のこのメチル化により、さらなるタイプのメチル化を導入して、Ｐ１ゲノムの送達効率を改善することができる。
実施例２．細菌を選択的に死滅させるための、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むバクテリオファージおよびファージミドＤＮＡ
Ｐ１ファージおよびＭ１３ファージミドを用いて、細菌の選択的な死滅のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの担体としてのバクテリオファージおよびファージミドＤＮＡの使用を試験する。Ｐ１ファージは、ファージ生物学の古典的モデルである（Ｌｏｂｏｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６，７０３２－７０６８（２００４））。そして一般に、ゲノムＤＮＡの一部を形質導入するために用いられる（Ｉｋｅｄａ＆Ｔｏｍｉｚａｗａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４，８５－１０９（１９６５））。ファージミドは、Ｐ１に関して開発されていて（Ｗｅｓｔｗａｔｅｒ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅａｄ．Ｅｎｇｌ．１４８，９４３－９５０（２００２）、様々なグラム陰性細菌にＤＮＡを送達するために、および、大きなＤＮＡライブラリーを形質導入するための手段として、用いられている（Ｋｉｔｔｌｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．１，５８３－５８９（２０１２）；Ｋａｉｓｅｒ＆ｗｏｒｋｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １８７，６５３－６５４（１９７５）。我々は、現在のところ、ｃｏｉ遺伝子を誘導的に発現する別個のプラスミドおよび野生型Ｐ１ファージを有する株を持っている。Ｐ１ファージは、正常な増殖条件下で溶原性である。ｃｏｉ遺伝子の発現は、ファージを溶菌サイクルに駆り立て、ファージ粒子を作る。
Ｍ１３ファージミドは、Ｆ１複製起点およびファージ機構の残りをコードするヘルパープラスミドを含むファージミドに依拠する。Ｍ１３による感染はＦ－線毛を必要とし、それは通常、一部のＥ．ｃｏｌｉ株に見られるＦプラスミドから発現される。Ｍ１３は、ファージディスプレイに関する標準的なプラットフォームとなっている（Ｐａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２８，８４９－８５８（２０１０））。
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いた標的化した死滅：Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム全体またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ由来のＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｍ１３ファージミド中にコードされて、Ｅ．ｃｏｌｉの標的化した死滅を示すために用いられる。標的株内に存在する抗生物質耐性遺伝子を用いて、このシステムを用いた選択的な死滅を示す。効率的な感染を確実にするために、標的株は、Ｆプラスミドもコードする。ファージ粒子を、標的細胞に投与して、細胞をプレーティングして、生存可能コロニーをカウントする。システムの送達は、ファージ無しまたは非標的化ファージと比較して、コロニーの数の大幅な減少をもたらすことが予測される。
Ｐ１ゲノム内の組込み部位の同定：相同組み換えを用いて、抗生物質耐性マーカーを、Ｐ１ゲノム内の異なる位置に組み込む。位置は、不必要および／または相補部位、例えば（ａ）ファージによってコードされる制限修飾系（例えば、Ｐ１ファージ内のｒｅｓ／ｍｏｄ）、（ｂ）重複感染をブロックする遺伝子（例えば、ｓｉｍＡＢＣ）、（ｃ）制限修飾系の阻害剤（例えば、Ｐ１ファージ内のｄａｒＡ）、（ｄ）挿入配列エレメント（例えば、Ｐ１ファージ内のＩＳ１）、（ｅ）アディクションシステム（例えば、Ｐ１ファージ内のｐｈｄ／ｄｏｃ）、（ｆ）溶菌サイクルのアクチベーター（例えば、Ｐ１ファージ内のｃｏｉ）、（ｇ）溶菌遺伝子（例えば、Ｐ１ファージ内のｋｉｌＡ）、（ｈ）ｔＲＮＡ（例えば、Ｐ１ファージ内のｔＲＮＡ１、２）、（ｉ）粒子成分（例えば、Ｐ１ファージ内のｃｉｘＬ、ｃｉｘＲ尾部繊維遺伝子）、または（ｊ）それらの任意の組み合わせを含む。
相補部位に関しては、欠失遺伝子（単数または複数）を、ｐＢＡＤ１８誘導性発現システムにクローニングする。それぞれの場合において、細胞溶解を、導入後に評価して（溶菌サイクルがまだ活性であるというサイン）、それから、形質導入粒子の数を、形質導入後の抗生物質耐性コロニーに基づいて測定する。この研究の全ては、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて行なわれる。
Ｐ１ファージに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素を持たせる：これらのアプローチをとるべきである：
１．Ｐ１に、Ｉ型またはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを発現している株への送達のためのリピート－スペーサー－リピートを持たせる。
２．Ｐ１に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（例えば、Ｓｔｈ１ Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ（ｔｒａｃｒ核酸に融合されたＣＲＩＳＰＲアレイ））を持たせる。
３．Ｐ１に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｉ－Ｅ型システムまたはＢ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｉ－Ｃ型システムを持たせる。
それぞれのアプローチのために、構築物は、抗生物質耐性マーカーを有する相同組み換えを用いて組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲアレイは、生産株には存在しないが標的株内に存在する別個の抗生物質耐性マーカーを標的化するように設計される。それから、ファージ粒子を標的株に投与して、生存可能コロニーの数をカウントする。設計されたファージは、ファージ無しまたは非標的化ファージと比較して生存可能コロニーの数が非常に減ることが予測される。
効率的な異株間および異種間の送達および死滅：設計されたファージの１つ（例えばＰ１）を、改変されたメチル化パターンを有するＥ．ｃｏｌｉの生産株（例えばＭＧ１６５５ Δｄａｍ Δｄｃｍ ΔｈｓｄＲＭＳ）において生産する。これは、標的株（例えばＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７）由来の異種メチルトランスフェラーゼ遺伝子または同様のメチル化パターンを産生することが知られる他の株由来のメチルトランスフェラーゼ（例えば、オンラインＲＥＢＡＳＥデータベースに挙げられるメチルトランスフェラーゼ）を導入することによって達成される。バクテリオファージは、内因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおけるＩ－Ｆ型システム）と適合するＣＲＩＳＰＲアレイをコードするように、および、ゲノム内の少なくとも１つのＰＡＭ隣接部位を標的化するように、設計される。あるいは、バクテリオファージは、完全なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、Ｉ－Ｅ型Ｃａｓｃａｄｅ遺伝子およびｃａｓ３およびＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲアレイ）をコードするように設計される。それから、ファージ粒子は、（例えば、Ｐ１に関するｃｏｉを誘導的に発現することによって、または、Ｍ１３に関する繊維状ファージの構成的生産を通して）生産されて、宿主とは違う異なる標的株を感染するために用いられる。例えば、ファージを用いて、ＤＮＡをＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉに送達する。送達は、選択マーカーを導入することによって、および、ファージに関する異なる多重感染度で行なわれる。死滅の程度は、液体培養の濁度の増大の停止またはコロニー形成単位の数の低減に基づいて測定される。標的株は、ファージを用いて選択的に死滅されて、一方で、非標的株は死滅を免れる。さらに、死滅効率は、標的株と実質的に類似するように改変されたそのメチル化パターンを有する生産株において生産されるバクテリオファージに関して高い（そのＲ－Ｍ系または任意の加えられたメチルトランスフェラーゼに対していかなる改変も有さない生産株に対して）。
Ｐ１ファージに関する方法
Ａ．ファージミドによる送達
１．Ｐ１ファージミドは、Ｐ１バクテリオファージゲノム由来の以下の構成要素をコードするプラスミドである（ｃｏｉ、ｃｉｎ、ｒｅｐＬ、ｐａｃＡ遺伝子）。
２．ファージミドは、Ｇｉｂｓｏｎクローニングを通して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム構成要素を導入するように改変される（ＣＲＩＳＰＲアレイ単独、または、ｃａｓ遺伝子とともに）
３．Ｐ１ファージミド－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓが構築された時点で、プロトコルファージミド－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓパッケージングを用いて、Ｐ１バクテリオファージにパッケージされる。
４．標的化プロトコルを用いて細菌株を標的化および除去するために、ファージミド－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓが用いられる。
Ｂ．改変されたＰ１バクテリオファージによる送達
１．Ｐ１バクテリオファージは、そのゲノム中に、バクテリオファージ機能を破壊しないように選択された規定の位置内にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム構成要素をクローニングすることによって改変され、これらの位置は、例えば、：
ａ．ｃｏｉ遺伝子の所定の位置（溶菌サイクルを引き起こすのを担う）。
ｂ．ｃｏｉ遺伝子およびｉｍｃＢ遺伝子の両方の所定の位置（ｃｏｉ－ｉｃｍＢ；両方とも、溶菌サイクルを引き起こすのを助ける）。
ｃ．包含部位を有する。
２．ｃｏｉ遺伝子は、Ｐ１バクテリオファージゲノムから増幅されて、ｐＢａｄ１８プラスミド中にクローニングされる。
３．Ｐ１－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓファージおよびｐＢａｄ１８－ｃｏｉが株内に共存する場合は、ｃｏｉの発現が誘導されて、プロトコルＰ１－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓパッケージングに従って、ファージ粒子が生産される
４．生産された溶解物は、１００％Ｐ１－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓファージを含むことが予測されて、プロトコル標的化に従って標的株を死滅させるために用いられる。
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成要素クローニング
１．一般に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成要素は、Ｐ１バクテリオファージゲノムまたはファージミドのいずれかにクローニングされる必要がある。クローニングされる構成要素は、標的株に依拠する。
２．標的株が活性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む場合は、クローニングする構成要素は、ゲノム標的化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ、リピートスペーサー－リピート）を発現しているＤＮＡのみである。図１の概要を参照。
３．標的株が活性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含まない場合は、クローニングする構成要素は、ゲノム標的化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｔｒａｃｒ核酸）およびｃａｓ遺伝子（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３’’、および／またはＣａｓｃａｄｅポリペプチド）に関するＤＮＡの両方を含む。図１の概要を参照。
４．ファージミド中へのクローニングは、Ｇｉｂｓｏｎクローニングスキームを用いて行なわれる。Ｐ１バクテリオファージへのクローニングは、相同組み換えを用いて行なわれる。
一般的なプロトコル
Ａ．ファージミド－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓパッケージング：
１．ファージミド－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを、テンペレートＰ１バクテリオファージを保有するＫｌ７３９株（Ｅ．ｃｏｌｉ株）に形質転換する。
２．それから株を、３７℃で一晩振とうして液体培養中で増殖させる。
３．翌日に、培養を１：１００に戻し希釈して、３７℃で１～２時間振とうする。
４．アラビノースを培養に加えて、ファージミド上のｃｏｉ遺伝子の発現を誘導して、バクテリオファージＰ１における（ｉｓ）溶菌サイクルを誘導する。培養を視覚的に検査することによって溶解が確認されるまで、さらに５時間、振とうを続ける。
５．溶解された培養にクロロホルムを添加して、上下にひっくり返すことによって混合する。これは、任意の溶解しなかった細胞の死滅を確実にする。
６．細胞デブリを、１０分間遠心分離することによって集めて、それから、上清を溶解物として集める。溶解物は、オリジナルのＰ１バクテリオファージＤＮＡおよびファージミド－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの混合物を含むファージ粒子を含む。
Ｂ．Ｐ１－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓパッケージング：
１．ｃｏｉ遺伝子をコードするｐＢａｄ１８プラスミドを、改変されたテンペレートＰ１－ＣＲＩＳＰＲバクテリオファージを保有するＫｌ７３９株（Ｅ．ｃｏｌｉ株）に形質転換する。
２．それから株を、３７℃で一晩振とうして液体培養中で増殖させる。
３．翌日に、培養を１：１００に戻し希釈して、３７℃で１～２時間振とうする
４．アラビノースを培養に加えて、ファージミド上のｃｏｉ遺伝子の発現を誘導して、バクテリオファージＰ１における（ｉｓ）溶菌サイクルを誘導する。培養を視覚的に検査することによって溶解が確認されるまで、さらに５時間、振とうを続ける。
５．溶解された培養にクロロホルムを添加して、上下にひっくり返すことによって混合する。これは、任意の溶解しなかった細胞の死滅を確実にする。
６．細胞デブリを、１０分間遠心分離することによって集めて、それから、上清を溶解物として集める。溶解物は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成要素を送達することが可能なＰ１－ＣＲＩＳＰＲバクテリオファージのみを含む。
Ｃ．標的化
１．標的化すべき株を、３７℃で一晩振とうすることによって、液体培養中で増殖させる。
２．翌日に、遠心分離によって培養から細胞を回収して、ＣａＣｌ２およびＭｇＳＯ４で補充されたＬＢ培地に再懸濁する。
３．培養物を、ＯＤ＝２に調節し、それから、少なくとも１つのファージ粒子によって全ての細胞が感染される可能性を最大にする、事前に計算された多重感染（すなわち、感染標的に対する薬剤（例えばファージ、ウイルスなど）の比；ＭＯＩ）で溶解物を感染させる。
４．チューブをひっくり返すことによって培養物を溶解物と混合させることによって、感染を行なう。
５．感染された細胞を、３７℃で３０分間、溶解物とともにインキュベートして、それから、３７℃で１時間振とうする。
６．それから、細胞を異なる希釈でプレーティングして、３７℃で一晩インキュベートする。
７．コロニー形成単位を翌日にカウントする。
実施例３．複数種のＤＮＡ送達およびＣＲＩＳＰＲ抗菌剤のための、広範な宿主バクテリオファージの改変
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）およびそれらのＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質は、抗菌剤のための強力な薬剤および広範に使用される抗生物質の潜在的な代替であることが分かっている（Ｇｏｍａａ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＭＢｉｏ ５，ｅ００９２８－９１３（２０１４）；Ｂｉｋａｒｄ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，１１４６－１１５０（２０１４）；Ｃｉｔｏｒｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，１１４１－１１４５（２０１４））。これらのシステムは、本来、相補遺伝物質を認識して切断するための細菌および古細菌におけるＲＮＡガイド免疫系として機能する（Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１，９６０－９６４（２００８）；Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）３２２，１８４３－１８４５（２００８）；Ｇａｒｎｅａｕ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６８，６７－７１（２０１０）；Ｅｄｇａｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９２，６２９１－６２９４（２０１０）；Ｍａｎｉｃａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８０，４８１－４９１（２０１１））。細菌ゲノムを標的化するためのガイドＲＮＡの設計は、標的部位において不可逆のＤＮＡ損傷を引き起こし得て、配列特異的な細胞死滅をもたらす（Ｇｏｍａａ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＭＢｉｏ ５，ｅ００９２８－９１３（２０１４）；Ｂｉｋａｒｄ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，１１４６－１１５０（２０１４）；Ｃｉｔｏｒｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，１１４１－１１４５（２０１４））。さらに、多剤耐性を保有するプラスミドを標的化するためのガイドＲＮＡの設計は、細菌を抗生物質に感受性にさせ得る（Ｂｉｋａｒｄ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，１１４６－１１５０（２０１４））。
それらの抗菌活性を発揮するために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、細菌細胞質へ送達されなければならない。現在までの送達戦略は、バクテリオファージゲノム内、またはバクテリオファージ粒子のためのパッケージングシグナルを含むファージミドと呼ばれるプラスミド内の、テンペレートまたは繊維状バクテリオファージによってパッケージされたＤＮＡ内のシステムのコード化に圧倒的に依拠している（Ｂｉｋａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，１１４６－１１５０（２０１４）；Ｃｉｔｏｒｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，１１４１－１１４５（２０１４）；Ｙｏｓｅｆ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１２，７２６７－７２７２（２０１５））。これらの実施例では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの送達は、強力な死滅またはプラスミド除去をもたらし、または、感染された細胞を抗生物質耐性の移行に対して免疫化した。これらは有望な証明になっているが、バクテリオファージは全て、個々の種または株に制限された狭い宿主範囲と関連する。結果として、それぞれの送達プラットフォームは、ＣＲＩＳＰＲが標的化し得る細菌の範囲を制限する。ＣＲＩＳＰＲ抗菌剤の潜在性を完全に実現するために、よりいっそう広範な宿主範囲に到達することのできる一般化された送達ビヒクルが必要である。
ここで、広範な宿主、テンペレートバクテリオファージＰ１は、ＤＮＡ送達およびＣＲＩＳＰＲ抗菌剤のために改変される。Ｐ１は、テンペレートバクテリオファージとして機能し、約９０ｋｂのゲノムが染色体外として存在し、シングルコピープラスミドはその溶原性状態で存在する（Ｌｏｂｏｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６、７０３２－７０６８（２００４））。重要なことに、Ｐ１は、そのゲノムを、プロテオバクテリア門内の様々な細菌にわたる著しく広範なグラム陰性細菌に注入することが示されている（Ｗｅｓｔｗａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４８，９４３－９５０（２００２））。さらに、Ｐ１は、ゲノムＤＮＡまたはファージミドのレアパッケージングを通したＤＮＡ送達のための標準的なプラットフォームであった（Ｗｅｓｔｗａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８，９４３－９５０（２００２）；Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４，８５－１０９（１９６５）；Ｔｈｏｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈ．１，Ｕｎｉｔ １．１７（２００７）；Ｋｉｔｔｌｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ １，５８３－５８９（２０１２）；Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４，８５－１０９（１９６５）；Ｔｈｏｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈ．１，Ｕｎｉｔ １．１７（２００７）；Ｋｉｔｔｌｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ １，５８３－５８９（２０１２））。我々は、Ｐ１ゲノムは、Ｐ１ファージミドよりも効率的に送達されて、そのゲノム内の少なくとも３つの別個のランディング部位内に合成ＤＮＡを収容し得ることを見いだした。改変されたゲノムは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉに効率的に送達されて、それにより、設計されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの送達の際に配列特異的な死滅を誘発することが示される。したがって、Ｐ１ゲノムの改変は、ＣＲＩＳＰＲ抗菌剤を様々な細菌に送達するための有望なストラテジーを表わす。
株、プラスミド、およびバクテリオファージの構築。本研究で用いた全ての株、プラスミド、およびバクテリオファージを、表１および表２に報告する。
Figure 0007290368000001

Figure 0007290368000002
Figure 0007290368000003
ｐＫＤ１３ΔＳａｌＩプラスミドは、ｐＫＤ１３プラスミド（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，６６４０－６６４５（２０００））を、ＳａｌＩ制限酵素を用いて消化して、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて平滑末端にして、そして、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションすることによって、生産した。
ｐＫＤ１３ΔＳａｌＩ－１Ｅプラスミドを生産するために、ｐＫＤ１３ΔＳａｌＩ主鎖を、プライマーｐＫＤ１３＿１Ｅａｒｒａｙ．ｆｗｄ／ｐＫＤ１３＿１Ｅａｒｒａｙ．ｒｅｖを用いたＰＣＲによって増幅した。強力な構成的プロモーター（Ｊ２３１００）をコードする化学的に合成された線状の二本鎖ＤＮＡ（例えばｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標））、ＫｐｎＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位によって改変された単一のＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲリピート、および、二重ターミネーターを、ＩＤＴから注文して、１Ｅａｒｒａｙ＿ｐＫＤ１３．ｆｗｄ／１Ｅａｒｒａｙ＿ｐＫＤ１３．ｒｅｖを用いたＰＣＲによって増幅した。それから、Ｇｉｂｓｏｎ集合（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ ４９８，３４９－３６１（２０１１））を用いて、増幅されたｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）を、ｐＫＤ１３ΔＳａｌＩ主鎖に、カナマイシン耐性カセットの上流にライゲーションした。ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ制限部位は、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）内に含まれて、改変されたリピート－スペーサーｐａｉｒｓ １の連続的な挿入を可能にした。このアプローチに従って、ｐＫＤ１３ΔＳａｌＩ－１Ｅ－ｆｔｓＡプラスミドを生産するために、Ｅ．ｃｏｌｉ内の必須ｆｔｓＡ遺伝子を標的化する改変されたスペーサーをｐＫＤ１３ΔＳａｌＩ－１Ｅに挿入した。
ｐｃｏｉプラスミドを生産するために、ｐＢＡＤ１８プラスミド（Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，４１２１－４１３０（１９９５））を、ＮｈｅＩ／ＳａｃＩによって線状化した。それから、ｃｏｉ遺伝子を、Ｚｙｍｏ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ精製キットを用いて単離されたＰ１溶原菌から、プライマーｃｏｉ．ｆｗｄ／ｃｏｉ．ｒｅｖを用いてＰＣＲ増幅した。これらのプライマーは、増幅されたｃｏｉ遺伝子の両末端に、ＮｈｅＩおよびＳａｃＩ部位を導入した。それから、ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＳａｃＩによって消化して、ｐＢＡＤプロモーター下流で、線状化されたｐＢＡＤ１８プラスミドにライゲーションした。
Ｐ１バクテリオファージゲノムにカナマイシン耐性カセットを組み込むために、カナマイシン耐性カセットを、５’末端にＰ１ゲノム特異的な相同領域を有するプライマーを用いて、ｐＫＤ１３からＰＣＲ増幅した。生じた線状ＰＣＲ産物を、ｐＫＤ４６プラスミド１９を保有するＥ．ｃｏｌｉ ＫＬ７３９株内に存在するＰ１バクテリオファージ溶原菌中に、λ－ｒｅｄが仲介する組み換えを通して組み込んだ。Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＬ７３９株は、標的細菌（例えば、Ｂｗ２５１１３、ＢＬ２１、ＭＧ１６５５、またはＳｈｉｇｅｌｌａ）のものと実質的に類似するＲ－Ｍ系を有するので選択した。
同じアプローチを、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）またはＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲアレイ／ｆｔｓＡスペーサーをＰ１バクテリオファージゲノムに組み込むために従った。これらの場合では、クロラムフェニコール（ｃｍ）耐性カセットは、ｐＫＤ３プラスミド（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，６６４０－６６４５（２０００））から増幅して、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲアレイｆｔｓＡスペーサーは、ｐＫＤ１３ΔＳａｌＩ－１Ｅ－ｆｔｓＡプラスミドから、カナマイシン耐性カセットとともに増幅された。全てのプラスミドは、コロニーＰＣＲによってスクリーニングされて、シーケンシングによって確認されている。
増殖条件。全ての株を、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）を含む１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ（商標）丸底チューブ内で、適切な抗生物質とともに、３７℃または３０℃および２５０ｒｐｍで培養した。同一株を、適切な抗生物質で補充されたＬＢ寒天（１．５％寒天を含むＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ培地）上にプレーティングして、３７℃でインキュベートした。抗生物質を、以下の最終濃度：５０μｇ／ｍｌカナマイシン、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、および３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールで投与した。ｐｃｏｉの発現を誘導するために、Ｌ－アラビノースを０．２％で投与した。
形質導入の分析。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳｈｉｇｅｌｌａ株の冷凍ストックを、ＬＢ寒天上にストリークして、個々のコロニーを単離した。個々のコロニーを３ｍｌのＬＢ培地中に接種して、３７℃および２５０ｒｐｍで一晩振とうした。それから、培養物をペレット化して、１ｍＬの感染培地に再懸濁して、ＡＢＳ６００をＮａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。ＡＢＳ６００値、および、ＡＢＳ６００＝１は８×１０８細胞／ｍＬと同等であるという仮説に基づき、数コロニー形成単位／ｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）を決定した。それから、培養物を、実験に基づいて特定のＭＯＩで、ピペッティングによって、バクテリオファージ溶解物と混合した。一部の場合では、培養物は、感染培地中に、標的化されたＭＯＩに適切なＣＦＵ／ｍＬに希釈する必要があった。それから、培養物／バクテリオファージの混合物を、３７℃および２５０ｒｐｍで６０～９０分振とうした。最後に、培養物／バクテリオファージ混合物の２００～３００μｌの適切な希釈を、適切な抗生物質で補充されたＬＢ寒天上にプレーティングして、３７℃で一晩インキュベートした。加えられたバクテリオファージ溶解物のｍＬあたりのプレート上で増殖したコロニーの数は、送達効率の示度と考えられた。
重複感染の実験のために、Ｐ１－ΔｉｍｃＢ／ｃｏｉ：：ｋａｎＲ、またはＰ１－ΔｓｉｍＡＢＣ：：ｋａｎＲのいずれかを保有するＥ．ｃｏｌｉの冷凍ストックを、適切な抗生物質で補充されたＬＢ寒天上に分離のためにストリークした。個々のコロニーを、適切な抗生物質で補充された３ｍＬのＬＢ培地に接種して、３７℃および２５０ｒｐｍで一晩振とうした。
上述したのと同一の形質導入プロトコルに従って、培養物にＰ１－ΔｉｍｃＢ／ｃｏｉ：：ｃｍＲを感染させて、カナマイシン、クロラムフェニコール、または両方で補充されたＬＢプレート上にプレーティングした。
ファージ粒子の生産。Ｐ１溶原菌およびｐｃｏｉプラスミドまたはＰ１ファージミドのいずれかを保有する株の冷凍ストックを、ＬＢ寒天上に単離のためにストリークした。個々のコロニーを３ｍｌのＬＢ培地中に接種して、３７℃および２５０ｒｐｍで一晩振とうした。一晩培養物を、５ｍＬのＰ１溶解培地（ＰＬＭ；１００ｍＭ ＭｇＣｌ２および５ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＬＢ培地）中に、１：１００に戻し希釈して（（Ｗｅｓｔｗａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４８，９４３－９５０（２００２））、３７℃および２５０ｒｐｍで振とうすることによって、ＡＢＳ６００＝約０．６～０．８まで増殖させた。それから、Ｌ－アラビノースを加えて、ｃｏｉ遺伝子の発現を誘導して、Ｐ１バクテリオファージ溶菌サイクルを引き起こした。培養物を、３７℃および２５０ｒｐｍで振とうすることによって、４～６時間、溶解したままにした。それから、溶解した培養物を、１５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆコニカルチューブに移して、クロロホルムを２．５ｗｔ％の終濃度まで加えて、チューブを数回ひっくり返すことによって混合した。それから、溶解した細胞デブリを、１０分間４℃で遠心分離によってペレット化して、上清を新鮮な１５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に置いた。全ての溶解物を、４℃で保管した。
Ａ．バクテリオファージにパッケージされたＤＮＡのメチル化の程度は、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有する株において生産した場合は、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有さない場合とは異なる。
ｐＣａｓ３に関するプラスミドＤＮＡを、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を欠くＭＧ１６５５およびＭＧ１６５５から抽出した。それから、ＤＮＡを、メチル化配列ＧＡｍＴＣのみを切断する制限酵素であるＤｐｎＩとともに（＋）または伴わずに（－）インキュベートした。それからサンプルを、ＤＮＡサイズマーカーと一緒にアガロースゲル電気泳動によって分析した。データは、ＭＧ１６５５から抽出されたプラスミドＤＮＡはＤｐｎＩによる切断を受け（図２Ａ、左の２レーン）、一方で、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を欠くＭＧ１６５５由来のＤＮＡは切断を受けないことを示す（図２Ａ、右の２レーン）。
図２Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉのメチルトランスフェラーゼ－陽性およびメチルトランスフェラーゼ－陰性株において生産された場合の、Ｐ１バクテリオファージ粒子から抽出されたｄｓＤＮＡを示す。Ｐ１誘導体ＬＢ００２は、ｄａｍおよびｄｃｍメチルトランスフェラーゼ遺伝子の両方を有する、または有さない、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２株において生産した。ファージＤＮＡを、Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｃ．からのファージＤＮＡ単離キットを用いて抽出した。続いて、ファージＤＮＡを、反応あたり１２０ｎｇのＤＮＡを用いた制限酵素分析によって分析した：レーン１：ＶＷＲ ２－ｌｏｇ ＤＮＡラダー；レーン２、４、６：ｄａｍ＋ｄｃｍ＋Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生産されたファージ由来のＤＮＡ；レーン３、５、７：ｄｃｍ－ｄａｍ－Ｅ．ｃｏｌにおいて生産されたファージ由来のＤＮＡ；レーン２－３：ＡｌｅＩ、ＮｈｅＩ、およびＸｈｏＩによって消化されたＤＮＡ；レーン４～５：ＡｌｅＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、およびＤｐｎＩＩによって消化されたＤＮＡ；レーン６－７：ＡｌｅＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、およびＳｔｙＤ４１によって消化されたＤＮＡ。ＤｐｎＩＩは、Ｄａｍによってメチル化されたＤＮＡによってブロックされる。ＳｔｙＤ４１は、Ｄｃｍによるオーバーラップするメチル化によってブロックされる。これらのデータは、メチラーゼを有さない細菌内で生産されたファージ由来のＤＮＡは、メチラーゼを有する細菌内で生産されたファージ由来のＤＮＡよりもメチル化されていないこと、および、メチラーゼを有する細菌内で生産されたファージ由来のＤＮＡは、全ての可能な部位においてメチル化されるのではないことを示す。
Ｂ．合成ＤＮＡ構築物の、ファージゲノムへの組込みに利用可能な多数の部位
Ｐ１ファージゲノムにおける外来ＤＮＡに関する同定されたランディング部位を示す概要を図３Ａに提供する。ＩＳ１、およびｓｉｍは、バクテリオファージＰ１ゲノム内の不必要な遺伝子であり、ｃｏｉ－ｉｍｃＢは相補可能である。挿入配列１（ＩＳ１）エレメントは、Ｐ１機能において公知の役割を有しておらず、ｓｉｍＡＢＣオペロンは、重複感染のブロックに関与する。いくつかのＰ１バクテリオファージ変異体を構築して、それは、これらの３つの部位のうちの１つを、これらの部位に挿入されているカナマイシン耐性をコードする遺伝子またはＥ．ｃｏｌｉにおいてｆｔｓＡ遺伝子を標的化するＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが隣接するこの同一の耐性遺伝子に関するＤＮＡ配列を挿入することによって破壊した。具体的には、Ｐ１粒子を、ｐｃｏｉおよびＰ１－ΔｉｍｃＢ／ｃｏｉ：：ｋａｎＲ、Ｐ１－ΔＩＳ１：：ｋａｎＲ、またはＰ１－ΔｓｉｍＡＢＣ：：ｋａｎＲのいずれかを保有するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＫＬ７３９において生産した。細胞は、ｃｏｉ誘導の際に溶解し、粒子を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３を感染させた。感染された細胞を、カナマイシンを含むＬＢ寒天上にプレーティングした。図３Ｂに示されるように、生じた粒子は、ＢＷ２５１１３細胞へのＰ１ゲノムの効率的な送達を可能にした。したがって、多数のランディング部位（組込み部位）は、Ｐ１複製、パッケージング、および送達を破壊しない合成構築物に利用可能である。
Ｃ．重複感染に対する、ｓｉｍＡＢＣオペロンの欠失の効果
ｓｉｍＡＢＣオペロンは、ペリプラズムから細胞質へのファージＤＮＡの移行をブロックすることにより、重複感染の防止に関与している（Ｋｌｉｅｍ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１，３５０－３５５（１９８９））。ＣＲＩＳＰＲ抗菌剤の関連において、重複感染は、細胞が非機能性ファージを受け入れる場合は、重要であり得る。重複感染におけるｓｉｍＡＢＣの影響を試験するために、我々は、カナマイシン耐性マーカーで置き換えられたｉｍｃＢ／ｃｏｉまたはｓｉｍＡＢＣ（Ｐ１－ΔｉｍｃＢ／ｃｏｉ：：ｋａｎＲ（ＬＢ００１）またはＰ１－ΔｓｉｍＡＢＣ：：ｋａｎＲ（ＬＢ００２））を有するＰ１ゲノムによって感染されたＭＧ１６５５細胞を生産した。それから、Ｐ１－ΔｉｍｃＢ／ｃｏｉ：：ｋａｎＲ（ＬＢ００１）またはＰ１－ΔｓｉｍＡＢＣ：：ｋａｎＲ（ＬＢ００２）のいずれかを保有する細胞に、ファージＰ１－ΔｉｍｃＢ／ｃｏｉ：：ｃｍＲを感染させて、ｋａｎ、ｃｍ、およびｋａｎ＋ｃｍプレート上にプレーティングした（図４Ａを参照）。それから、細胞に、ｉｍｃＢ／ｃｏｉ遺伝子座がクロラムフェニコール耐性マーカーで置き換えられたＰ１を、ＭＯＩ＝１０で感染させた。抗生物質のどちらかまたは両方にプレーティングされた生きているコロニーの数を測定した。
驚くべきことに、細胞が最初にｉｍｃＢ／ｃｏｉまたはｓｉｍＡＢＣを欠くＰ１を保有していたかどうかにかかわらず、導入されたＰ１ゲノムを維持した同様の数の細胞が観察された（図４Ｂ）。しかしながら、両方の抗生物質に対して耐性の細胞を評価した場合、ｓｉｍＡＢＣを欠くＰ１を最初に感染させた細胞のみが回収された。これらの結果は、ｓｉｍＡＢＣは重複感染をブロックしないが、その代わりに、溶原性サイクル中の複製またはコピー数制御の役割を果たすことを示唆する。したがって、合成ＤＮＡをｓｉｍＡＢに挿入することは、第二のＰ１バクテリオファージゲノムによる再感染を可能にした。
Ｄ．Ｐ１ゲノムは、Ｐ１ファージミドよりも効率的にパッケージおよび送達される
合成構築物をパッケージおよび送達する最も効率的な手段を、Ｐ１バクテリオファージ粒子において調べた。ファージミドは、合成構築物をコードする標準的な手段となっていて、Ｐ１ファージミドは、溶菌性複製起点、および、Ｐ１溶菌サイクルを駆動するｃｏｉ遺伝子の誘導性発現とともに、ｐａｃＡパッケージング部位を含む（Ｗｅｓｔｗａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４８、９４３－９５０（２００２）；Ｋｉｔｔｌｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ １，５８３－５８９（２０１２）））。Ｐ１ファージミドは、様々なグラム陰性細菌へのＤＮＡ送達およびＤＮＡライブラリーの移行のために用いられているが（同文献）、ファージミドは、パッケージングに関してＰ１ゲノムと争わなければならない。結果として、細胞は、Ｐ１ゲノムまたはファージミドのいずれかを受け取り得て、ＤＮＡ送達およびプログラム可能な死滅を潜在的に複雑化する。
ファージミドおよびＰ１ゲノムの送達を直接評価するために、我々は、Ｐ１内のｉｍｃＢ／ｃｏｉオペロンのゲノムコピーを、カナマイシン耐性マーカーで置き換えた。具体的には、Ｐ１粒子を、Ｐ１－ΔｉｍｃＢ／ｃｏｉ：：ｋａｎＲ（カナマイシン耐性）およびＰ１ファージミド（クロラムフェニコール耐性）またはｐｃｏｉ（アンピシリン耐性）のいずれかを保有するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＫＬ７３９細胞において生産した。それから我々は、このゲノムを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２亜株ＫＬ７３９内のｃｏｉの誘導性発現を有するプラスミドまたはＰ１ファージミドと組み合わせて、バクテリオファージ粒子を生産した。それから、粒子を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５またはＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１を感染させて、その後に、感染された細胞を、指示された抗生物質を含むＬＢ寒天上にプレーティングした。この実験はトリプリケートで行なった。
結果は図５に示され、Ｐ１ゲノムは、Ｅ．ｃｏｌｉの２つの異なる株に関して、Ｐ１ファージミドよりも効率的にパッケージおよび送達されることを示す。図５は、Ｐ１ゲノムは、ファージミドよりも約１００倍高い頻度で送達されて、ファージミドを受け取った細胞の約４％は、大過剰の細胞（多重感染度（ＭＯＩ）＝０．００３）にもかかわらず、Ｐ１ゲノムも受け取ったことを示す。粒子が、ｐｃｏｉプラスミドを用いて生産された場合、Ｐ１ゲノムは、約３００倍高い送達を示し、ファージミドが、Ｐ１溶菌サイクルまたは粒子生成を妨げ得ることを示唆した。また、ｐｃｏｉプラスミドは、Ｐ１ゲノムよりも約３３，０００倍低い頻度で送達された。同様の傾向は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ亜株ＢＬ２１を感染させた場合に観察されたが、この株は、ＭＧ１６５５よりも低い頻度で感染された。したがって、少なくともＰ１システムに関しては、ファージ自体を改変することは、より一層高い力価の改変された産物を有する溶解物を生じさせる。したがって、Ｐ１ゲノムは、Ｐ１ファージミドよりも効率的な送達ビヒクルを提供する。
Ｅ．Ｐ１送達効率は、環境条件によって変化する
バクテリオファージによるＤＮＡ送達は、一般に、Ｐ１形質導入およびファージミド送達のために、ＰＬＭ培地（１００ｍＭ ＭｇＣｌ２および５ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＬＢ培地）のような特定の培地条件下で行なわれる（Ｋｉｔｔｌｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ １，５８３－５８９（２０１２））。しかしながら、実際的適用は、送達効率に影響を及ぼし得る様々な環境を伴う。そのような条件によってＰ１によるＤＮＡ送達がどのように影響を受けるのかを調べるために、ＬＢ培地中で増殖されたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３細胞を、異なる培地に移して、ｐｃｏｉプラスミドによって生産された粒子を用いたＰ１ゲノムの送達を測定した。感染力（ＤＮＡ送達）は、ＰＬＭからＭｇＣｌ２を除去した後も同様に残存したが、ＣａＣｌ２では残存せず（図６）、それは、細胞接着に関するＣａＣｌ２の重要性と一致する（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１７，１９－３０（１９７２））。しかしながら、ＰＬＭと同様のＣａＣｌ２レベルを有する最小培地が、非常に低減した送達を示したので、ＣａＣｌ２はＤＮＡ送達に十分でなかった。興味深いことに、ウシ胎児血清およびＰＬＭ培地（（１００ｍＭ ＭｇＣｌ２および５ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＬＢ培地）中の細胞は、同様の送達効率を生じ、Ｐ１は、よりインビボの状況において、ＤＮＡを効率的に送達できることを示唆した。
概して、これらのデータは、Ｐ１ゲノムが、異なる培地条件下で送達され得ることを示し、条件は、送達効率に大きな影響を有する。
Ｆ．ＤＮＡメチル化および送達
＋／－ＤＮＡメチル化を有するＰ１バクテリオファージ（すなわち、ＤＮＡメチル化（＋）またはＤＮＡメチル化（－）のいずれかである細菌において生産されたＰ１）を用いたＥ．ｃｏｌｉへのＤＮＡ送達を、図７Ａに示す。カナマイシン耐性カセットを保有するバクテリオファージＰ１を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５またはＭＧ１６５５ ΔｄａｍΔｄｃｍΔｈｄｓＲＭＳ（メチラーゼおよび非メチル化ＤＮＡを標的化する制限酵素を欠く）において生産した。ＭＧ１６５５を、ＭＧ１６５５またはＭＧ１６５５ ΔｄａｍΔｄｃｍΔｈｄｓＲＭＳにおいて生産されたファージＰ１によって感染させた。同様に、ＭＧ１６５５ ΔｄａｍΔｄｃｍΔｈｄｓＲＭＳを、ＭＧ１６５５またはＭＧ１６５５ ΔｄａｍΔｄｃｍΔｈｄｓＲＭＳにおいて生産されたファージＰ１によって感染させた。カナマイシン選択下で増殖されたＣＦＵにより測定した感染されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の数を、それから、株間および感染間で比較した。図７Ｂは、バクテリオファージＬＢ００２＋／－メチル化による、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅへのＤＮＡ送達の違いを示す。カナマイシン耐性カセットを保有するバクテリオファージＰ１を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５またはＭＧ１６５５ ΔｄａｍΔｄｃｍΔｈｄｓＲＭＳ（メチラーゼおよび非メチル化ＤＮＡを標的化する制限酵素を欠く）において生産した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒ４を、ＭＧ１６５５またはＭＧ１６５５ ΔｄａｍΔｄｃｍΔｈｄｓＲＭＳにおいて生産されたＬＢ００２によって感染させた。同様に、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ｐｎ）Ｒ１９６およびＫ．ｐｎ Ｒ６１５を、ＭＧ１６５５またはＭＧ１６５５ ΔｄａｍΔｄｃｍΔｈｄｓＲＭＳにおいて生産されたＬＢ００２によって感染させた。カナマイシン選択下で増殖されたＥ．ｃｏｌｉまたはＫ．ｐｎのＣＦＵによって測定したＬＢ００２感染単位を、それから、感染間で比較した。図７Ｃは、＋／－ＤＮＡメチル化であるＭ１３ＫＯ７（Ｍ１３の変異株）バクテリオファージを用いたＥ．ｃｏｌｉへのＤＮＡ送達を示す。Ｍ１３ＫＯ７は、メチラーゼ陽性（＋）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ１０Ｆ’）またはメチル化陰性（－）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１１０）において生産された。ＴＯＰ１０Ｆ’、ＥＭＧ２、およびＪＭ１１０細菌株を、続いて、メチラーゼ（＋）Ｅ．ｃｏｌｉまたはメチラーゼ（－）Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生産されたＭ１３ＫＯ７によって感染させた。それから、感染されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の数を、株ごとに比較した。ＴＯＰ１０Ｆ’：ｄａｍおよびｄｃｍをコードするが、制限酵素を欠く；ＥＭＧ２：制限－メチル化システムは無傷である（非メチル化二本鎖ＤＮＡを分解する）；ＪＭ１１０：ｄａｍおよびｄｃｍをコードせず、制限酵素を欠く。これらのデータは、メチラーゼを有する細菌内で生産されたファージは、メチラーゼを有さない細菌内で生産されたファージよりも高い生産的感染力（ＤＮＡ送達）を示すことを示す。
Ｇ．Ｅ．ｃｏｌｉにおける、ＤＮＡ送達およびＣＲＩＳＰＲが仲介する死滅
Ｅ．ｃｏｌｉにネイティブのＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用して、Ｐ１ゲノムがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの１つまたは複数の構成要素を収容して、その後に、ＣＲＩＳＰＲが仲介する死滅を引き起こすことができるかどうかという疑問を対処した。この目的のために、ｐｃａｓ３プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３Δｃａｓ３およびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３の冷凍ストックを、ＬＢ寒天上に単離のためにストリークして、ＣＡＳＣＡＤＥおよびＣａｓ３を発現している（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素、「＋ｃａｓ」）、またはしていない（「－ｃａｓ」）Ｅ．ｃｏｌｉを培養した。
具体的には、個々のコロニーを３ｍｌのＬＢ培地に接種して、３７℃および２５０ｒｐｍで一晩振とうした。それから、培養物をペレット化して、１ｍＬのＰＬＭ（１００ｍＭ ＭｇＣｌ２および５ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＬＢ培地）中に再懸濁して、ＡＢＳ６００をＮａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。それから培養物を、ＡＢＳ６００＝０．００１までＰＬＭ中に希釈して、それぞれの株に、指示された多重感染度（ＭＯＩ）で、ｆｔｓＡを標的化するｃｒＲＮＡを発現するように改変されたバクテリオファージＰ１（ＣＲＩＳＰＲファージ）を感染させて；適切な量のバクテリオファージ溶解物を添加して、０を含む異なるＭＯＩを達成した。培養物／ファージ混合物をピペッティングにより混合して、３７℃および２５０ｒｐｍで振とうした。それから、細菌の増殖を、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ６００）によって測定して、７時間まで３０分ごとに測定値をとって、条件間で比較した。それから、それぞれの細菌株に関する異なるＭＯＩでの生き残った細菌細胞の数を比較した。
図８Ａは、ＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３を発現している（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素、「＋ｃａｓ」）、または発現していない（「－ｃａｓ」））Ｅ．ｃｏｌｉが、Ｉ－Ｅ型ＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３は、ゲノム－標的化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを持っているＰ１の送達に続いて、増殖を負に影響することを示すことを示す。予測されるように、ＣＲＩＳＰＲ－ファージは、両方の細胞型において明らかな増殖遅延を示し、「＋ｃａｓ」グループにおいて、改善された増殖抑制を示す。このことは、ファージ単独に対する、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの改善された抗菌効果を示す。
ＣＲＩＳＰＲ－ファージは、両方の細胞型において、ＭＯＩ＞１で細胞を死滅させることが観察されていて、予測されるように「＋ｃａｓ」グループにおいて死滅が増大する。図８Ｂに示されるように、Ｉ－Ｅ型ＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３は、ゲノム標的化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを持っているＰ１の送達後の生存に負の影響を及ぼす。ＣＡＳＣＡＤＥおよびＣａｓ３を発現している（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素、「＋ｃａｓ」）、または発現していない（「－ｃａｓ」）Ｅ．ｃｏｌｉに、指示されたＭＯＩで、ｆｔｓＡを標的化するｃｒＲＮＡを発現するように改変されたバクテリオファージＰ１（ＣＲＩＳＰＲファージ）を感染させた。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲが、ファージ単独と比較して、有意に死滅を高めることを明らかに示す。
さらに、ゲノム標的化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを異なる位置にコードするＰ１ゲノムの送達は、Ｉ－Ｅ型ＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３の存在下でＥ．ｃｏｌｉを死滅させる。ＩＩ型／Ｃａｓ９ ＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓシステムとは異なり、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、全ての潜在的部位において強力な細胞死を引き起こすことができる（Ｇｏｍａａ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＭＢｉｏ ５，ｅ００９２８－９１３（２０１４）；Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１６）．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ２２３）。Ｅ．ｃｏｌｉ内の必須ｆｔｓＡ遺伝子を標的化するスペーサー（Ｇｏｍａａ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＭＢｉｏ ５，ｅ００９２８－９１３（２０１４））を、Ｐ１ゲノムのｃｏｉ／ｉｍｃＢ、ＩＳ１、またはｓｉｍＡＢＣランディング部位に挿入した。それから、Ｐ１ ｃｏｉ－ｉｍｃＢ遺伝子、ＩＳ１遺伝子、またはｓｉｍ遺伝子へのｆｔｓＡを標的化するｃｒＲＮＡの挿入を含む、生じたＰ１バクテリオファージを用いて、全てのＩ－Ｅ型Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５ｅ、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ７）の発現を有するまたは有さないＥ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３細胞を感染させた。それから細胞を、異なるＭＯＩでバクテリオファージと混合して、細菌細胞密度（培養の濁度）の変化を、増殖の７時間後に測定した。我々は、Ｃａｓタンパク質を欠く細胞を用いた全ての培養は、細胞密度の実質的な増大を示すが、より高いＭＯＩでは最終濁度はより低いことを見いだした（図８Ｃ）。対照的に、Ｉ－Ｅ型Ｃａｓタンパク質の全て（Ｃａｓ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５ｅ、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ７））を発現している細胞の培養は、検出可能な増殖をほとんど示さず（＊）、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／ファージ処理は、増殖を除去することを示した（図８Ｃ）。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素を持っているＰ１ゲノムを用いて、ＣＲＩＳＰＲが仲介する死滅を引き起こすことができることを示す。
培養中のＣＲＩＳＰＲ／ファージ処理が生存能力の低減をもたらすさらなる証拠を図８Ｄに提供する。Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ３を発現しているＥ．ｃｏｌｉに、（１）ｃｏｉ遺伝子の所定の位置のｆｔｓＡを標的化するｃｒＲＮＡのゲノム挿入を含むバクテリオファージＰ１を感染させ、または、（２）バクテリオファージを感染させず、そして、生き残った細菌細胞の数を比較した。ファージに曝露されたＥ．ｃｏｌｉは、生存能力の４－ｌｏｇ（～１００００ｘ）の喪失を示した。したがって、ＣＲＩＳＰＲを持ったファージの不存在下では、Ｃａｓタンパク質を有する、および有さない細胞の両方とも、７時間後に実質的な増殖を示す。しかしながら、最初の培養にファージが含まれた場合は、Ｃａｓタンパク質の完全なセットを発現している細胞に関して、検出可能な増殖は観察されなかった。
Ｈ．Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉへの効率的なＤＮＡ送達
Ｐ１ゲノムを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ以外の属を感染させ得るかどうか調べるために、２株のＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉを試験した。この種は、世界中の下痢症の細菌性赤痢と関連する。Ｓｈｉｇｅｌｌａは、米国において毎年約５００，０００症例の下痢を引き起こし、２７，０００の薬剤耐性感染を含む。カナマイシン耐性マーカーで置き換えられたｉｍｃＢ／ｃｏｉオペロンを有するＰ１ゲノムの送達を測定した。生じたＰ１粒子は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１に関して観察されたものの間の数コロニー形成単位により、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉの両方の株にゲノムを効率的に送達することが判定された（図９）。これらの結果は、Ｐ１ゲノムが送達され得て、多数の属において安定的に維持され得ることを確認し、ＣＲＩＳＰＲ抗菌剤に関する複数種送達ビヒクルとしてのＰ１の利用の潜在性を開く。
Ｉ．抗生物質耐性細菌の標的化
我々は、Ｐ１ ＣＲＩＳＰＲファージ（ｆｔｓＡを標的化）およびシプロフロキサシンの組み合わせを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒ１８２、シプロフロキサシン－耐性株を死滅させるためのＰ１ ＣＲＩＳＰＲファージ単独の使用と比較した（図１０Ａ）。シプロフロキサシン（Ｃｉｐ）投与量は、Ｒ１８２株が耐性であることが知られる最も高い治療的に関連のある濃度（４マイクログラム／ミリリットル）であった。Ｅ．ｃｏｌｉに、Ｅ．ｃｏｌｉ ｆｔｓＡ遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲファージを、様々な多重感染度（ＭＯＩ）で感染させた。予測されたとおり、シプロフロキサシン単独は、細菌生存能力を低減させなかった（図１０Ａ）。対照的に、ＣＲＩＳＰＲファージＭＯＩの増大は、生存可能な細菌細胞の低減において、抗生物質非依存性の増大をもたらした（図１０Ａ）。
加えて、Ｐ１ ＣＲＩＳＰＲファージ（ｆｔｓＡを標的化）およびＥ．ｃｏｌｉ感染における標準的なケア抗生物質（ｃａｒｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）であるイミペネムの組み合わせを、シプロフロキサシン耐性株であるＥ．ｃｏｌｉ Ｒ１８２の死滅に関して、Ｐ１ ＣＲＩＳＰＲファージ単独と比較した（図１０Ｂ）。イミペネムは、一定の投与量（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒ１８２に関するＬＤ５０）で維持して、ベースライン０．３－ｌｏｇＣＦＵの低減をもたらした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に、ＣＲＩＳＰＲファージを様々なＭＯＩで感染させた。ＭＯＩ＝２では、ファージまたは抗生物質単独に対して、組み合わせ治療の有意な効果（Ｐ＜０．０５）が観察された。より高いＭＯＩでは、ＣＲＩＳＰＲファージは、優勢な死滅効果を発揮して、ファージ＋抗生物質の組み合わせは、相加的効果を有し得ることが示唆された。
最後に、我々は、イミペネム（ｉｍｉｐｉｎｅｍ）、ｆｔｓＡを標的化するＰ１ ＣＲＩＳＰＲファージ、または両方の組み合わせに対する曝露後の、生存可能Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒ１８２細胞の喪失を比較した（図１０Ｃ）。関連のある条件について（それぞれの条件に関してｎ＝３）、イミペネムは、一定の投与量（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒ１８２に関してＬＤ５０）で維持されて、ＣＲＩＳＰＲファージは、ＭＯＩ＝２に維持された。細菌の死滅は、イミペネムを有する、または有さないＣＲＩＳＰＲファージ感染後１２０分に観察された。
Ｊ．マウスにおけるＥ．ｃｏｌｉ感染の標的化
Ｅ．ｃｏｌｉを標的化するＣＲＩＳＰＲファージは、大腿筋感染のマウスモデルにおいて、生菌数を低減させる（図１１Ａ）。マウスに、１．６×１０６ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉの大腿筋注入を投与して、その後に、ｆｔｓＡを標的化する１．９×１０１１ｐｆｕのＣＲＩＳＰＲファージまたは５０ｕＬ ＴＢＳ（未処理コントロール）の大腿筋注入のファージ処理を続けた。大腿組織由来の生菌数を、ファージ処理の３０、６０、１２０、１８０、および２４０分後に測定した。ファージ処理は、一貫して約０．３－ｌｏｇの低減をもたらすことが観察されて、および細菌数の低減は、２つの時点で統計的に有意だった（Ｐ＜０．０５）および（Ｐ＜０．００１）。
図１１Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉを標的化するＣＲＩＳＰＲファージは、マウスモデルにおいて動物生存時間を増大させることを示す。マウスに、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｒ２６０を、ＩＰ（腹腔内）注入によって、５％ｈｏｇムチン中１．５×１０７ＣＦＵの投与量で感染させて、それから、処理しないままにして、または、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子ｆｔｓＡを標的化するＣＲＩＳＰＲファージの単回投与でＩＰ注入によって処理した（投与量＝１．９ｘ１０＾１１ｐｆｕ、ＭＯＩ＝約１００）。単回投与ファージ処理は、マウス生存を有意に延長することが判定された（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ試験、Ｐ＜０．０５）。
Ｋ．ファージによって送達されたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａの様々な株を死滅させる能力
ｆｔｓＡを標的化するｃｒＲＮＡを発現しているＩ型ＣＲＩＳＰＲファージ粒子を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉからなる株のライブラリーを感染させた。表３の報告および表５の概要は、ＣＲＩＳＰＲファージ感染後の、それぞれの株に関する、未処理の増殖コントロールと比較した細菌集団における低減である。これらのデータは、ファージが、Ｅ．ｃｏｌｉ株にわたってＣＲＩＳＰＲ構築物を送達することができることを示す。
Figure 0007290368000004
Figure 0007290368000005

さらに、ｆｔｓＡを標的化するｃｒＲＮＡを発現しているＩ型ＣＲＩＳＰＲファージを用いて、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる株のライブラリーを感染させた。表４の報告および表５の概要は、ＣＲＩＳＰＲファージ感染後のそれぞれの株に関する未処理の増殖コントロールと比較した細菌集団における低減である。これらのデータは、ファージが、ＣＲＩＳＰＲ構築物を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ株にわたって送達することができることを示す。
Figure 0007290368000006
Figure 0007290368000007
Figure 0007290368000008
Figure 0007290368000009
Ｌ．延長されたスペーサー長は、死滅を誘発する
野生型の長さでないＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡスペーサーを用いたＩ－Ｅ型システムは、細胞死滅を誘発することができる。３２ｎｔスペーサー（野生型の長さ）（＋０）または４４ｎｔスペーサー（＋１２）を有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ゲノム内のｌａｃＺ遺伝子周辺の４つの位置（ｐ１、ａｓ１、ｐ２およびｓ１）を標的化するように設計した（図１２）。延長は、４４ｎｔスペーサーの３’末端に、標的配列と実質的の同一であるようになされた。それぞれのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをリピート－スペーサー－リピートとして発現しているプラスミドを、Ｉ－Ｅ型Ｃａｓ３およびＣａｓｃａｄｅタンパク質を発現しているＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５中に形質転換した。形質転換効率の低下は、ゲノム攻撃および細胞死を反映し、ほんの数個の細胞のみが、標的配列、スペーサー、またはＣａｓタンパク質に対する突然変異を通して死滅を逃れることが可能である。データに示されるように、全ての設計されたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、スペーサー無しのコントロールと比較して、形質転換効率の１０３～１０５の低減をもたらし、より長いスペーサーを有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、標的化された死滅を誘発することができることを示した。より大きな複合体でさえＣａｓ３を動員および活性化することが可能であることは驚きであった。結晶構造は、複合体全体にわたって生じる大きな立体構造変化が、Ｃａｓ３を活性化するために必要であることを示唆し（Ｍｕｌｅｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５（６２０３）：１４７９－８４（２０１４）；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５（６２０３）：１４７３－９（２０１４）；Ｒｕｔｋａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ｐｉｉ：Ｓ２２１１－１２４７（１５）００１３５－７（２０１５）；Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（４６）：１６３５９－６４（２０１４））、さらなるタンパク質サブユニットを加えることは、これらの立体構造変化を破壊することが予測された。データは、これが生じないことを示唆し、延長されたスペーサーは、形質転換効率における同様の低減に基づき、普通の長さのスペーサーと同様のレベルの死滅を誘発することを示す。
Ｍ．Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ由来のＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードするバクテリオファージ粒子
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ由来のＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの全体を、Ｐ１バクテリオファージゲノム中にコードし、Ｅ．ｃｏｌｉの標的化された死滅を示すために用いる。それぞれの場合において、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ならびに、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムまたはＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、Ｉ－Ｅ型ＣａｓｃａｄｅまたはＩ－Ｃ型ＣａｓｃａｄｅポリペプチドおよびＣａｓ３ポリペプチド）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、ファージゲノム内の選択部位（例えば、組込みの不必要な部位または組込みの相補部位）においてＰ１ゲノムに導入する。Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムまたはＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする前記の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＰＣＲを用いて供給株から合成または増幅されて、ドナープラスミドベクター（例：ｐＫＤ３、ｐＫＤ１３、またはその他）にクローニングされる。ドナーベクターは、特定の抗生物質耐性およびＰ１内の選択されたランディング部位にマッチする相同性領域を有して設計される。相同組み換えを用いて、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムまたはＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、生産株内に存在するＰ１溶原菌にクローニングする。陽性クローンは、抗生物質耐性によって選択される。抗生物質耐性マーカーが、リコンビナーゼ部位（例えばＦＲＴ部位）によって隣接される場合は、耐性マーカーは、当技術分野で知られているようにリコンビナーゼを発現することによって切除され得る。
同一のアプローチに従って、ゲノム標的化ｃｒＲＮＡをコードするＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃａｓ遺伝子に関するものとは異なるランディング部位組込み部位においてＰ１ゲノムにコードされる。ＣＲＩＳＰＲアレイは、生産株には存在しないが標的株内に存在する特定の配列を標的化するように設計される。
それから、ファージ粒子が生産されて、標的細菌株に投与されて、生存可能コロニーの数がカウントされる。一部の態様では、ファージ粒子は、標的宿主細菌のものと実質的に類似するメチル化パターンを有する生産宿主細菌株を用いて生産される。設計されたファージは、ファージ無しまたは非標的化ファージと比較して、生存可能コロニーの数を大きく低減させるであろう。
考察
広範な宿主Ｐ１バクテリオファージは、ＤＮＡを多数の細菌種に効率的に送達して、それにより、ＣＲＩＳＰＲ抗菌剤の送達に関するプラットフォームとして使用され得ることが示された。広範な宿主バクテリオファージの一つの利点は、単一のプラットフォームが、単一の、産業的生産株から生産され得て、様々な細菌に対して適用されることである。例えば、Ｐ１粒子は、共生Ｅ．ｃｏｌｉの産業株において作られて、それから、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａのような腸溶性病原体による感染と戦うために用いられ得る。生産株を感染株から分離する能力は、同一の病原菌に対するバクテリオファージ粒子を生成するために、細菌病原菌の大きなバッチを培養するバイオ製造の挑戦を対処する。それは、単にＣＲＩＳＰＲアレイを変更することによって、抗菌剤を、異なる種を標的するように容易に改変する可能性も生み出す。
前述は本発明の例示であり、その制限と解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の同等物はそこに含まれる。

Claims (12)

  1. 標的細菌を死滅させる方法であって、
    前記標的細菌とバクテリオファージとを接触させるステップを含み、
    前記バクテリオファージは、
    （ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含むＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ：
    （ｉ）前記標的細菌の標的ＤＮＡ配列と実質的に相補なスペーサー配列、ここで、前記標的ＤＮＡ配列はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接している、および、
    （ｉｉ）少なくとも２つのリピート配列；および
    （ｂ）Ｃａｓｃａｄｅと前記Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイとの複合体を認識する外因性のＣａｓ３ポリペプチドをコードする外因性の核酸構築物、および、前記Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイを認識するＣａｓｃａｄｅポリペプチドをコードする外因性の核酸構築物、
    を含み、
    前記Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、前記外因性のＣａｓ３ポリペプチドをコードする外因性の核酸構築物、および／または、前記Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドをコードする外因性の核酸構築物は、不必要な部位または相補部位において、前記バクテリオファージのＤＮＡに組み込まれており、
    前記標的細菌の標的ＤＮＡ配列が前記Ｃａｓ３ポリペプチドによって切断および分解され、それにより前記標的細菌が死滅される、
    方法。
  2. 請求項１の方法であって、
    前記標的ＤＮＡ配列が、必須の遺伝子または非必須の遺伝子中にある、
    方法。
  3. 請求項１の方法であって、
    前記スペーサー配列が、５’および３’末端の両方において前記少なくとも２つのリピート配列に連結される、
    方法。
  4. 請求項１の方法であって、
    前記スペーサー配列が、前記標的DNA配列に対して少なくとも７０％相補である、
    方法。
  5. 請求項１の方法であって、
    前記標的細菌がＥ.ｃｏｌｉである、
    方法。
  6. 請求項１の方法であって、
    前記細菌がＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである、
    方法。
  7. 請求項１の方法であって、
    前記細菌が抗生物質耐性である、
    方法。
  8. 請求項１の方法であって、
    前記スペーサー配列が約１５ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチドの長さを有する、
    方法。
  9. 請求項１の方法であって、
    前記バクテリオファージが溶菌性バクテリオファージ由来である、
    方法。
  10. 請求項９の方法であって、
    前記溶菌性バクテリオファージが広範宿主バクテリオファージである、
    方法。
  11. 請求項１の方法であって、
    前記不必要な部位が、（ａ）ファージによってコードされる制限修飾系、（ｂ）重複感染をブロックする遺伝子、（ｃ）制限修飾系の阻害剤、（ｄ）挿入配列エレメント、（ｅ）アディクションシステムまたは（ｆ）それらの任意の組み合わせ、である、
    方法。
  12. 請求項１の方法であって、
    前記相補部位が、（ａ）溶菌サイクルのアクチベーター、（ｂ）溶菌遺伝子、（ｃ）ｔＲＮＡ、（ｄ）粒子成分、または（ｅ）それらの任意の組み合わせ、である、
    方法。
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