ES2590925T3 - Microorganismos marcados y métodos de marcado - Google Patents

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ES2590925T3
ES2590925T3 ES11161778.3T ES11161778T ES2590925T3 ES 2590925 T3 ES2590925 T3 ES 2590925T3 ES 11161778 T ES11161778 T ES 11161778T ES 2590925 T3 ES2590925 T3 ES 2590925T3
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Rodolphe Barrangou
Christophe Fremaux
Philippe Horvath
Dennis Romero
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Abstract

Un proceso para preparar un ingrediente alimenticio que comprende obtener una bacteria marcada mediante un método que comprende las etapas de: (a) exponer una bacteria progenitora que comprende un locus CRISPR a un bacteriófago para introducir una unidad espaciadora de repeticiones adicionales en el locus CRISPR para producir una bacteria marcada, en el que la unidad espaciadora de repetición adicional proporciona la marca, (b) seleccionar un mutante insensible a bacteriófago; (c) comparar un locus CRISPR o una parte del mismo procedente de la bacteria progenitora y el mutante insensible a bacteriófago; (d) seleccionar una bacteria marcada que comprende dicha unidad espaciadora de repetición adicional en el locus CRISPR que no está presente en la bacteria progenitora; y que comprende además la etapa de añadir la bacteria marcada, o un cultivo celular que comprende dicha bacteria marcada, a dicho ingrediente alimenticio.

Description

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Oenacoccus.
En otras realizaciones adicionales, los bacteriófagos incluyen, pero no de forma limitativa, aquellos bacteriófagos capaces de infectar Lactococcus lactis (por ejemplo, L. lactis subsp. lactis y L. lactis subsp. cremoris, y L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis), Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii o Bifidobacterium longum.
En algunas realizaciones particularmente preferidas, los bacteriófagos incluyen, pero no de forma limitativa, aquellos bacteriófagos capaces de infectar bacterias que comprenden uno o más loci CRISPR heterólogos. En algunas realizaciones, las bacterias comprenden uno o más loci CRISPR heterólogos, y/o uno o más genes cas heterólogos, y/o una o más repeticiones de CRISPR heterólogas, y/o uno o más espaciadores de CRISPR heterólogos.
La infección de bacterias por fagos es el resultado de la inyección o transferencia de ADN de fagos en células. En algunas realizaciones, la infección da como resultado la expresión (es decir, la transcripción y traducción) del ácido nucleico del bacteriófago en el interior de la célula y la continuación del ciclo vital del bacteriófago. En algunas realizaciones que implican el bacteriófago recombinante, se expresan también las secuencias recombinantes en el genoma del fago (por ejemplo, los ácidos nucleicos indicadores)
Se ha descubierto que las secuencias espaciadoras de CRISPR en procariotas tienen a menudo similitudes significativas con una variedad de moléculas de ADN incluyendo elementos genéticos tales como cromosomas, bacteriófagos y plásmidos conjugativos). Se ha notificado que las células que transportan estos espaciadores de CRISPR no se pueden infectar por moléculas de ADN que contienen secuencias homólogas a los espaciadores (Véase, Mojica et al., [2005]).
En algunas realizaciones de la presente invención, las bacterias progenitoras se exponen (por ejemplo, iterativamente, secuencialmente, simultáneamente o de forma sustancialmente simultánea) a más de un bacteriófago. En algunas realizaciones preferidas, las bacterias se exponen a mezclas de uno o más (por ejemplo, algunos) fagos diferentes. En algunas realizaciones preferidas alternativas, las bacterias progenitoras son sensibles a cada uno de los bacteriófagos a los cuales se exponen.
En algunas realizaciones, cada una de las secuencias marcadoras de cada uno de los bacteriófagos y/o cada una de las secuencias duplicadas (por ejemplo, la repetición de CRISPR duplicada) de la bacteria progenitora se integra en el mismo locus CRISPR. En otras realizaciones, cada una de las secuencias marcadoras y/o cada una de las secuencias duplicadas se integran en uno o ambos extremos del mismo locus CRISPR. En otras realizaciones adicionales, cada una de las secuencias marcadoras y/o cada una de las secuencias duplicadas se integran en el extremo 5' y/o el extremo 3' del mismo locus CRISPR. En algunas realizaciones preferidas, cada una de las secuencias marcadoras y/o cada una de las secuencias duplicadas se integra en el extremo 5' del mismo locus CRISPR.
En algunas realizaciones, cada una de las secuencias marcadoras y/o cada una de las secuencias duplicadas procedentes de la bacteria progenitora se integra iterativamente, simultáneamente o de forma sustancialmente simultánea. En realizaciones en las que cada una de las secuencias marcadoras y/o cada una de las secuencias duplicadas se integran secuencialmente, la primera secuencia marcadora y/o la primera secuencia duplicada se integra en la bacteria progenitora. Una segunda secuencia marcadora procedente de un segundo bacteriófago y/u otra secuencia duplicada se integran a continuación en la bacteria progenitora En algunas realizaciones preferidas, la secuencia marcadora y/o la secuencia duplicada se integran en el extremo 5' del mismo locus CRISPR.
En algunas realizaciones preferidas, cada una de las secuencias marcadoras y/o cada una de las secuencias duplicadas se integra en un extremo (por ejemplo, el extremo 5') del mismo locus CRISPR adyacente (es decir, próximo a) entre sí. De esta manera, en algunas realizaciones, cada una de las secuencias marcadoras y/o las secuencias duplicadas se integra secuencialmente, por lo cual, las primeras secuencias se integran en la bacteria progenitora en un extremo (por ejemplo, comprendido en o en el extremo 5' y/o el extremo 3') En algunas realizaciones preferidas, una segunda secuencia marcadora y/o una secuencia duplicada se integran a continuación en la bacteria progenitora adyacente (por ejemplo, directamente adyacente) a la primera pareja de secuencias. En algunas realizaciones, las segundas secuencias se integran en la bacteria progenitora adyacente (por ejemplo, directamente adyacentes) al extremo 5' o al extremo 3' de las primeras secuencias. En algunas realizaciones preferidas, las segundas secuencias se integran en la bacteria progenitora adyacente (por ejemplo, directamente adyacentes) al extremo 3' de las primeras secuencias. En realizaciones en las que se proporcionan secuencias adicionales, estas se integran a continuación.
En algunas realizaciones, cada una de las secuencias se integran adyacentes (es decir, próximas) entre sí comprendidas dentro o en el extremo 3' y/o en el extremo 5' del mismo locus CRISPR de la bacteria progenitora. En algunas realizaciones preferidas, cada una de las secuencias se integra adyacentes (es decir, próximas) entre sí en el extremo 5' del mismo locus CRISPR de la bacteria progenitora. En algunas realizaciones particularmente
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CRISPR está directamente unida, directamente enlazada o directamente fusionada de tal forma que no hay nucleótidos intercalados entre la secuencia duplicada y la secuencia marcadora.
En algunas realizaciones especialmente preferidas, una unidad espaciadora de repetición de CRISPR se integra en el genoma de la bacteria progenitora para producir una bacteria marcada. En algunas realizaciones preferidas, la secuencia duplicada se deriva, es derivable, se obtiene o es obtenible a partir del genoma de la bacteria progenitora. En algunas realizaciones adicionales, la secuencia marcadora se deriva, es derivable, se obtiene o es obtenible a partir del genoma del bacteriófago que se utiliza para infectar la bacteria progenitora.
En algunas realizaciones adicionales, las múltiples unidades espaciadoras de repetición CRISPR están integradas en el genoma de la bacteria progenitora. En algunas realizaciones, las múltiples unidades espaciadoras de repetición de CRISPR comprenden una primera unidad espaciadora de repetición de CRISPR que comprende una secuencia duplicada y una secuencia marcadora y una segunda unidad espaciadora de repetición de CRISPR que comprende una segunda secuencia duplicada y una segunda secuencia marcadora. En algunas realizaciones preferidas, la segunda secuencia duplicada tiene típicamente la misma secuencia (por ejemplo, más de aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96, %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 %, o aproximadamente un 100 % de identidad) con la primera secuencia duplicada. En algunas realizaciones, la secuencia marcadora tiene típicamente una secuencia diferente (por ejemplo, menos de aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 2 %, aproximadamente un 1 % o aproximadamente un 0 % de identidad) con la primera secuencia marcadora. Este también es el caso de las realizaciones que contienen otras secuencias integradas de unidades espaciadoras de repetición CRISPR.
En algunas realizaciones preferidas, la configuración de las múltiples unidades espaciadoras de repetición CRISPR es tópicamente:
[secuencia duplicada -secuencia marcadora]n
en laquen =2, 3,4, 5, o ≥6.
En algunas realizaciones especialmente preferidas, la configuración de las múltiples unidades espaciadoras de repetición CRISPR es tópicamente:
[repetición CRISPR -secuencia marcadora]n
en laquen =2, 3,4, 5, o ≥6.
En algunas preferidas, la configuración de las múltiples unidades espaciadoras de repetición CRISPR es:
5'-[secuencia duplicada -secuencia marcadora]n-3'
en laquen =2, 3,4, 5, o ≥6.
En algunas realizaciones especialmente preferidas, la configuración de las múltiples unidades espaciadoras de repetición CRISPR es:
5'-[repetición CRISPR -secuencia marcadora]n
en laquen =2,3,4, 5,o ≥6.
En algunas realizaciones preferidas, las múltiples unidades espaciadoras de repetición CRISPR están integradas en la bacteria progenitora.
En algunas realizaciones, la parte de la secuencia marcadora de la unidad espaciadora de repetición CRISPR está integrada adyacente a: (i) una secuencia duplicada que sea homóloga (por ejemplo, idéntica) a una secuencia natural en la bacteria progenitora; (ii) una secuencia duplicada que sea homóloga (por ejemplo, idéntica) a una secuencia natural del locus CRISPR de la bacteria progenitora; o (iii) lo más preferiblemente, una secuencia duplicada que sea homóloga (por ejemplo, idéntica) de una repetición CRISPR natural en el locus CRISPR de la bacteria progenitora.
Después de cada exposición de una bacteria progenitora a un bacteriófago dado en experimentos independientes, la secuencia marcadora de cada una de las bacterias marcadas se presenta en una secuencia de nucleótidos diferente, creando de esta forma una secuencia que es única para cada bacteria. Así, tras la exposición de un bacteriófago dado, la secuencia marcadora que está integrada en una bacteria progenitora se selecciona entre el genoma del bacteriófago. Como se ha indicado anteriormente, no se pretende que la presente invención esté
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limitada por eventos de integración aleatoria, ni tampoco ningún mecanismo ni medio de acción completo.
Este hallazgo sorprendente se utilizó para el desarrollo de la presente invención, ya que la secuencia marcadora seleccionada proporciona una marca o etiqueta única en la bacteria marcada. Sorprendentemente, también se ha descubierto que cuando la misma bacteria progenitora se expone al mismo bacteriófago, la secuencia marcadora que está integrada en experimentos independientes/diferentes es de una secuencia diferente, dando como resultado de esta forma una etiqueta única en la bacteria marcada después de cada exposición.
En algunas realizaciones, una secuencia marcadora seleccionada aleatoriamente se identifica en la bacteria marcada debido a una o más de las siguientes propiedades de la secuencia marcadora: (1) la ubicación de la secuencia marcadora en uno o más loci CRISPR del mutante insensible al bacteriófago (como se indica en el presente documento, la secuencia marcadora se suele encontrar en uno o ambos extremos 5' y/o 3' (más preferiblemente en el extremo 5') del locus CRISPR de la bacteria marcada; (2) la secuencia marcadora tiene un elevado grado de homología o identidad (por ejemplo, 100 % de identidad) respecto de una secuencia en el genoma del bacteriófago a la que fue expuesta la bacteria progenitora; y/o (3) la secuencia marcadora está fusionada, vinculada o unida a, (por ejemplo, directamente fusionada, vinculada o unida a) al menos una secuencia (por ejemplo, una repetición CRISPR; es decir, una unidad espaciadora de repetición CRISPR) que está duplicada a partir del genoma de la bacteria progenitora. Típicamente, como se describe en el presente documento, esta unidad espaciadora de repetición CRISPR está situada en uno y/o en ambos extremos (por ejemplo, el extremo 5' y/o 3'; más preferiblemente en el extremo 5') del locus CRISPR de la bacteria marcada. Así, en algunas realizaciones, las unidades espaciadoras de repetición CRISPR se integran en ambos extremos del locus CRISPR de la bacteria progenitora de tal forma que las secuencias se encuentran en el extremo 5' y el extremo 3' del locus CRISPR. En algunas realizaciones, una de las secuencias duplicadas es la primera secuencia del extremo 5' del locus CRISPR y la secuencia marcadora está situada inmediatamente después de la secuencia duplicada. En algunas realizaciones, la otra secuencia duplicada es la última secuencia del extremo 3' del locus CRISPR y la secuencia marcadora está situada inmediatamente antes de la secuencia duplicada.
En algunas realizaciones preferidas, la secuencia o secuencias marcadoras y/o la secuencia o secuencias duplicadas de la unidad espaciadora de repetición CRISPR se integra en un extremo del locus CRISPR de la bacteria progenitora de tal forma que la secuencia o secuencias se encuentran en el extremo 3' del locus CRISPR. En algunas realizaciones adicionales, la secuencia duplicada es la última secuencia del extremo 3' del locus CRISPR y la secuencia marcadora está situada inmediatamente antes de la secuencia duplicada. En algunas realizaciones preferidas, la secuencia o secuencias marcadoras y/o la secuencia o secuencias duplicadas se integran en un extremo del locus CRISPR de la bacteria progenitora de tal forma que las secuencias se encuentran en el extremo 5' del locus CRISPR. En algunas realizaciones, la secuencia duplicada es la primera secuencia del extremo 5' del locus CRISPR y la secuencia marcadora está situada inmediatamente después de la secuencia duplicada.
Tal como se describe en el presente documento, la secuencia o secuencias marcadoras es una marca específica de la cepa en el sentido de que la secuencia marcadora que se integra o inserta desde el bacteriófago en la bacteria progenitora es diferente cada vez que la bacteria progenitora (por ejemplo, la misma bacteria progenitora) se expone al bacteriófago (por ejemplo, al mismo bacteriófago). Así, la secuencia marcadora es de utilidad como marca única para una cepa bacteriana dada.
En algunas realizaciones, la secuencia o secuencias marcadoras y/o la secuencia o secuencias duplicadas se integran en uno o más loci CRISPR. En algunas realizaciones alternativas, la secuencia o secuencias marcadoras y/o la secuencia o secuencias duplicadas se integran en uno o más loci CRISPR diferentes. En realizaciones adicionales, dos o más secuencia(s) marcadoras y/o secuencia(s) duplicadas diferentes se integran en un locus CRISPR. En otras realizaciones adicionales, dos o más secuencia(s) marcadoras y/o secuencia(s) duplicadas diferentes se integran cada una de ellas en dos o más loci CRISPR diferentes.
L. Loci CRISPR marcados
El genoma de Streptococcus thermophilus LMG18311 contiene 3 loci CRISPR; las secuencias de 36 pb repetidas son diferentes en CRISPR1 (34 repeticiones), CRISPER2 (5 repeticiones), y CRISPR3 (una sola secuencia). Sin embargo, están perfectamente conservadas en cada locus. Las repeticiones de CRISPR1 y CRISPR2 están separadas entre sí por 33 y 4 secuencias de 30 pb de longitud. Todas estas secuencias intercaladas son diferentes entre sí. También se diferencias de las descubiertas en la cepa CNRZ1066 (41 secuencias intercaladas en CRISPR1) y en la cepa LMD-9 (16 en CRISPR1 y 8 en CRISPR3), que son ambas S. thermophilus.
La cepa DGCC7710 de Streptococcus thermophilus (depositada en la "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" francesa con número CNCM 1-2423) contiene al menos 3 loci CRISPR: CRISPR1, CRISPR2, y CRISPR3. En las cepas CNRZ1066 y LMG18311 para las que se conoce la secuencia del genoma completo (Bolotin et al., [2004) supra), CRISPR1 se sitúa en el mismo locus cromosómico: (entre str0660 (o stu0660) y str0661 (o stu0661). En la cepa DGCC7710, CRISPR1 se sitúa entre genes muy similares. CRISPR1 de la cepa DGCC7710 contiene 33 repeticiones, incluyendo la repetición terminal) y, por tanto, 32 espaciadores. Cada uno de estos
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iniciador se utiliza en inoculación directa. En algunas realizaciones preferidas, el cultivo es un cultivo iniciador concentrado utilizado en inoculación directa.
En algunas realizaciones, el cultivo iniciador bacteriano comprende una cepa o especia bacteriana (es decir, es un cultivo puro). Así, en estas realizaciones, prácticamente todo, o una parte significativa, del cultivo iniciador bacteriano comprende la misma cepa o especie bacteriana. Sin embargo, en algunas realizaciones alternativas, el cultivo iniciador comprende más de una o varias cepas o especies bacterianas (es decir, se trata de un cultivo mixto definido
Los cultivos iniciadores preparados cualquier técnica adecuada conocida en la materia son de utilidad en la presente invención (Véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.º 4.621.058). Por ejemplo, los cultivos iniciadores preparados mediante la introducción de un inóculo (por ejemplo, un cultivo bacteriano) en un medio de cultivo para producir un medio inoculado e incubar el medio inoculado para producir un cultivo iniciador. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a ningún método concreto para preparar los cultivos iniciadores.
Los cultivos iniciadores desecados preparados cualquier técnica adecuada conocida en la materia son de utilidad en la presente invención (Véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos números. 4.423.079 y 4.140.800). En algunas realizaciones, los cultivos iniciadores desecados utilizados en la presente invención son preparaciones sólidas (por ejemplo, comprimidos, aglomerados, cápsulas, polvo, gránulos, harinas, cualquiera de los cuales se pueden humedecer, secar mediante pulverización, criodesecar o liofilizar en algunas realizaciones). En algunas realizaciones alternativas, los cultivos iniciadores desecados de la presente invención son tanto un aglomerado congelado a baja temperatura como un polvo liofilizado. Estos cultivos iniciadores desecados se pueden preparar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica.
En algunas realizaciones, los cultivos iniciadores utilizados en la presente invención comprenden concentrados que tienen concentraciones sustancialmente elevadas de al menos una especie de bacteria. En algunas realizaciones preferidas, los concentrados se diluyen con agua o se resuspenden en agua u otro diluyente adecuado (por ejemplo, un medio de cultivo adecuado, aceite mineral, o aceite vegetal) para su uso en la presente invención. En algunas realizaciones, los cultivos iniciadores desecados de la presente invención se preparan usando métodos bien conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, centrifugación, filtración, o una combinación de estas técnicas.
P. Productos
La presente invención es de utilidad en la producción de varios productos, incluyendo pero sin limitación alimentos y/o productos alimenticios. Así, se contempla que cualquier producto elaborado o que comprende un cultivo bacteriano es de utilidad en la presente invención. Estos incluyen, pero no se limitan a, fruta, legumbres, hortalizas y cultivos forrajeros incluyendo productos derivados, grano, y productos derivados de grano, productos lácteos y productos derivados de los lácteos, carne, aves de corral, marisco, enzimas y metabolitos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "alimento" se utiliza en un sentido amplio e incluye comida, productos alimenticios, ingredientes alimenticios, suplementos dietéticos, y alimentos funcionales. Aunque el término incluye alimento para seres humanos, se pretende que el término también abarque alimento para animales no humanos (es decir, "pienso"). Sin embargo, en algunas realizaciones preferidas, la presente invención proporciona alimentos para consumo humano. Tal como se usa en el presente documento, el término "ingrediente alimenticio" incluye una formulación adecuada para su adición a alimentos. En algunas realizaciones, las formulaciones se utilizan a bajos niveles en una amplia variedad de productos que requieren por ejemplo, acidificación o emulsión. Tal como se usa en el presente documento, el término "alimento funcional" se refiere a alimentos que pueden no solamente proporcionar un efecto nutritivo y/o una satisfacción por su sabor, sino que también pueden proporcionar un beneficio adicional al consumidor. En algunas realizaciones, la bacteria de la presente invención comprende o se añade a un ingrediente alimenticio, suplemento o alimento funcional. Se contempla que el alimento se proporcione en cualquier forma adecuada, incluyendo pero sin limitación, soluciones, sólidos, geles, emulsiones, etc., dependiendo del uso y/o del modo de aplicación y/o el modo de administración. Así, no se pretende que la presente invención esté limitada a ningún alimento de ninguna forma particular. En algunas realizaciones, la bacteria de la presente invención es de utilidad en las numeras preparaciones de productos alimenticios, incluyendo pero sin limitarse a productos de confitería, productos lácteos, productos cárnicos, productos de aves de corral, productos de pescado, y productos de panadería. En algunas realizaciones, las bacterias se utilizan como ingredientes en refrescos, zumos de frutas, bebidas que comprenden suero lácteo, infusiones saludables, bebidas de cacao, bebidas lácteas, bebidas que incluyen bacterias acidolácticas, queso, yogur, yogur líquido y vino. En algunas realizaciones adicionales, la presente invención proporciona métodos para preparar alimentos, incluyendo métodos que comprenden premezclar las bacterias de acuerdo con la presente invención con un ingrediente alimenticio (por ejemplo, un material de partida de un alimento). En algunas realizaciones preferidas, el alimento proporcionado en el presente documento es un producto lácteo. En algunas realizaciones especialmente preferidas, el producto lácteo se selecciona entre yogur, queso (por ejemplo, un requesón, un queso duro, un queso semiduro, un queso de pasta ácida), un suero de mantequilla, quark, una crema agria, kefir, una bebida a base de suero de leche fermentado, kumis, una bebida láctea y un yogur batido.
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Tabla 3-1. Descripción de cepas marcadas en el locus CRISPR1 derivado de DGCC7710 usando D2972 como donante
Cepa marcada
Cepa progenitora Fago donante ADN donante insertado
Secuencia
Ubicación
DGCC7710 phi2972 +S46+S47
DGCC7710 D2972 33045-33073 (+)
25582-25611 (+)
DGCC77710 phi2972 +S48+S49
DGCC77710 D2972 25967-25938 (-)
6008-6037 (+)
DGCC77710 phi2972 +S50+S51
DGCC7710 D2972 34105-34134 (+)
29246-29275 (+)
DGCC7710 phi2972 +S52+54
DGCC7710 D2972 31582-31611 (+)
21732-21703 (-)
DGCC7710 phi2972 +S53+S54
DGCC7710 D2972 imagen29 29647-29618 (-)
16681-16652 (-)
DGCC7710 phi2972 +S61+S62
DGCC7710 D2972 31709-31737 (+)
17182-17211 (+)
DGCC7710 phi2972 +S55+S63+S41
DGCC7710 D2972 25693-25722 (+)
1114-1142 (+)
27381-27409 (+)
*(+/-): indica la cepa del cromosoma del fago
Ejemplo 4
5 Marcado de Streptococcus thermophilus DGCC77710 usando el bacteriófago D2972 mediante la inserción iterativa de unidades espaciadoras de repetición en el interior de CRISPR1
En este Ejemplo, S. thermophilus cepa DGCC7710 se marcó con un medio "natural" mediante inserción iterativa dentro de su locus CRISPR1 mediante la adición de unidades espaciadoras de repetición adicionales donde los
10 espaciadores proceden del bacteriófago D2972 y de bacteriófagos derivados de D2972.
En la primera iteración, la cepa progenitora (DGCC7710) se expuso al bacteriófago donante (D2972) y se aisló una cepa marcada, que se caracterizó usando la misma metodología que se ha descrito en el Ejemplo 1. En comparación con DGCC7710, esta cepa marcada (denominada DGCC7710phi2972 S6) tenía una unidad espaciadora
15 de repetición adicional como se describe en la Tabla 4 en su locus CRISPR1
Debido a la inserción de una unidad espaciadora de repetición en el locus CRISPR1 de la cepa DGCC7710phi2972 S6 , el bacteriófago donante D2972 ya no resultó virulento frente a DGCC7710phi2972 S6, y no se puede utilizar como bacteriófago donante para esta cepa. Este problema se superó usando un fago donante mutante derivado de D2972
20 que incluye un a modificación específica dentro de su genoma (es decir, un "fago mutado"). Este fago mutado se seleccionó exponiendo el bacteriófago donante a la cepa marcada, de tal forma que una modificación (es decir) del fago progenitor lo transforma en virulento para la cepa marcada.
DGCC7710phi2972 S6 se precultivó en medio de tipo lácteo a 42 ºC durante 18 horas. A continuación, un medio de tipo
25 lácteo se incocuó con el precultivo de DGCC7710phi2972 S6 a una concentración de aproximadamente 106 ufc/ml y con una suspensión de D2972 y una MOI (multiplicidad de infección) mayor de 100. El cultivo se incubó a 42 ºC durante 18 horas y a continuación se centrifugó durante 10 min a 10.000xg. El sobrenadante se recogió y se filtró usando un filtro de 0,45 µm. Se utilizaron diluciones adecuadas del sobrenadante filtrado para inocular un medio de glucosa agar M17 sembrado con una capa de DGCC7710phi2972 S6 usando métodos bien conocidos en la técnica. Las placas
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Tabla 7-1. Cebadores utilizados para la detección de las cepas marcadas descritas en los Ejemplos 1 a 6.
Cepa marcada
cebador CRISPR cebador TAG
DGCC7710phi2972 +S40
5'-tgctgagacaacctagtccctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-aagagtagctccctcaatatgc-3' (SEQ ID NO:54)
DGCC7710phi2972 +S41
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-ttactacccactattcctagtg-3' (SEQ ID NO:55)
DGCC7710phi2972 +S43
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-atagaggccaactaaccgttat-3' (SEQ ID NO:56)
DGCC7710phi2972 +S44
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-tatcaattgcggaaatgtggct-3' (SEQ ID NO:57)
DGCC7710phi2972 +S45
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-cactgctgcttcaataaacatt-3' (SEQ ID NO:58)
DGCC7710phi2972 +S46
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-agaacaagtttctgaacaaaaa-3' (SEQ ID NO:59)
DGCC7710phi858 +S42
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-aaccacttaatactttggctga-3' (SEQ ID NO:60)
DGCC7710phi2972 +S46+S47
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-agaacaagtttctgaacaaaaa-3' (SEQ ID NO:61)
DGCC7710phi2972 +S48+S49
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-gctactgcatcgttaaagactt-3' (SEQ ID NO:62)
DGCC7710phi2972 +S50+S51
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-gagttctatttctcgaattatt-3' (SEQ ID NO:63)
DGCC7710phi2972 +S52+S4
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-tggctggagccctcgtacatta-3' (SEQ ID NO:64)
DGCC7710phi2972 +S53+S54
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-aatgatacttggacccgaaacc-3' (SEQ ID NO:65)
DGCC7710phi2972 +S61+S62
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-tcaaacgtaagacgaatatcgc-3' (SEQ ID NO:66)
DGCC7710phi2972 +S55+S63+S41
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-aagagtagctccctcaatatgc-3' (SEQ ID NO:54)
DGCC7710phi2972 +S6
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-cacctcggaacctaatccaatt-3' (SEQ ID NO:67)
DGCC7710phi2972 +S6 phi4724 +S20
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-cacctcggaacctaatccaatt-3' (SEQ ID NO:67)
DGCC7710phi2972 +S6 phi4724 +S20 phi4733 +S 29
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-cacctcggaacctaatccaatt-3' (SEQ ID NO:67)
DGCC3198phi4241 +S64
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-caatctatctttgctcaaatgc-3' (SEQ ID NO:67)
DGCC3198phi4241 +S65
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-aagctcactgtcgccactctag-3' (SEQ ID NO:68)
DGCC3198phi4241 +S66
5'-tgctgagacaacctagtctctc-3' (SEQ ID NO:15) 5'-ggcatgccagtacctatcccaa-3' (SEQ ID NO:69)
DGCC3198phi4241 +S67
5'-ctgagattaatagtgcgattacg-3' (SEQ ID NO:51) 5'-tcaagaactaatggaaattgcag-3' (SEQ ID NO:70)
En estos experimentos, la muestra que contiene la cepa a detectar se trató usando cualquier método adecuado conocido en la técnica para clasificar las bacterias del resto de la muestra. Como en el ejemplo en el caso del yogur 5 o muestras de productos lácteos frescos que contienen S. thermophilus, la muestra se trató como se describe en Lick et al. (Lick et al., Milchwissenschaft 50:183-186 [1996]).
Dependiendo de la cantidad de bacteria incluida en el material resultante, las células de S. thermophilus se amplficaron mediante cultivo en medio M17-glucosa durante 18 horas a 42 ºC. A continuación, el ADN se extrajo de 10 las bacterias y se envió para una PCR específica. Los cebadores de PCR (cebador CRISPR y cebador TAG) se seleccionaron adecuadamente como se describe en la Tabla 7-I. La mezcla de reacción de la PCR (volumen final de 25 µl) contenía: tampón exento de Mg 1x (Promega), MgCl22,5 mM, cada una de las cuatro dNTP 2 mM, ADN 10 a 100 ng, cada cebador 0,2 µM, polimerasa Taq 1,25 U (Promega). Las condiciones de ciclación de la PCR fueron: predesnaturalización a 98 ºC durante 5 min, seguido de 33 ciclos alternando desnaturalización a 94 ºC durante 30 s,
15 hibridación a 56 ºC durante 30 s, y elongación a 72 ºC durante 1 min; seguido por una etapa de alargamiento final a 72 ºC durante 4 min. En una PCR de control, el ADN extraido se sometió a una segunda PCR dirigida a los genes del ARN 16S usando los siguientes cebadores universales: BSF8-20, 5'-agagtttgatcctggctcag-3' (SEQ ID NO:71) y BSRl 541-20, 5'-aaggaggtgatccagccgca-3' (SEQ ID NO:72; Véase, Wilmotte et al., FEBS Lett., 317:96-100 [1993]).
39
La mezcla reacción de la PCR (volumen final de 25 µl contenía): tampón exento de Mg 1x (Promega), MgCl2 2,5 mM, cada una de las cuatro dNTP 2 mM, ADN 10 a 100 ng, cada cebador 0,2 µM, polimerasa Taq 1,25 U (Promega). Las condiciones de ciclación de la PCR fueron las siguientes: predesnaturalización a 95 ºC durante 7 min, seguido de 35 ciclos alternando desnaturalización a 95 ºC durante 1 min, hibridación a 58 ºC durante 1 min 30
5 s, y elongación a 72 ºC durante 2 min 30 s; seguido por una etapa de alargamiento final a 72 ºC durante 5 min. Los productos de amplificación de la PCR se analizaron a continuación usando electroforesis en gel de agarosa (1 %, p/v) y se registró el tamaño de los fragmentos del ASDn amplificado. Para cada PCR específica, se prepararon controles usando el ADN extraido de la cepa progenitora (DGCC7710 o DGCC3198 dependiendo de la cepa marcada) y de una de las cepas marcadas (DGCCphi2972 S6).
10 Los resultados se presentan en la Tabla 7-2. Cada una de las reacciones de la PCR era específica de la cepa marcada analizada, ya que los productos de la PCR del tamaño adecuado siempre se obtuvieron de las PCR del control y las PCR específicas solamente dieron como resultado fragmentos de ADN amplificados cuando se utilizó ADN de la cepa marcada específica.
15
Tabla 7-2: Tamaño de los productos de la PCR obtenidos mediante PCR específica y PCR del control para ADN de cepas marcadas, ADN de la cepa progenitora, y DGCCphi2972 S6 DNA
PCR específicac
ADN de la cepa marcada específica ADN de DGCCphi2972 S6 ADN de la cepa progenitora
PCRa específica
PCRa del control PCRa específica PCRa del control PCRaespecífica del control PCRa
DGCC7710phi2972 +S40
240 1530 0 1530 0b 1530
DGCC7710phi2972 +S41
240 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S43
240 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S44
240 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S45
240 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S46
240 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi858 +S42
240 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S46+S47
310 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S48+S49
310 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S50+S51
310 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S52+S54
310 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S53+S54
310 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S61+S62
310 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S55+S63+S41
370 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S6
240 1530 240 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S6 phi4724 +S20
310 1530 0 1530 0 1530
DGCC7710phi2972 +S6 phi4724 +S20 phi4733 +S29
370 1530 0 1530 0 1530
DGCC3198phi4241 +S64
240 1530 0 1530 0 1530
DGCC3198phi4241 +S65
240 1530 0 1530 0 1530
DGCC3198phi4241 +S66
240 1530 0 1530 0 1530
DGCC3198phi4241 +S67
105 1530 0 1530 0 1530
a, tamaño aproximado del fragmento amplificado en pares de bases; b. 0 significa que no se ha detectado fragmento de la PCR; c, usando el cebador específico de la PCR que se ha indicado en la Tabla 7-1.
Ejemplo 8
Método para identificar cepas marcadas
20 En este ejemplo se describe un método para detectar la presencia de cepas marcadas en una muestra e identificar su naturaleza. Esto se realiza mediante la amplificación por PCR de uno o más loci de CRISPR y determinación parcial de la secuencia. Este método es de utilizada en diferentes realizaciones, ya que aunque el método descrito en el Ejemplo 7 es útil para detectar una cepa marcada, puede que no sea suficiente para su identificación formal.
25 Además, en algunos casos, la naturaleza de la cepa diana incluida en la muestra es desconocida. Así, el método de la PCR específica no puede usarse para su detección. En su caso, la cepa marcada se puede detectar e identificar mediante el análisis del locus CRISPR modificado.
Las células de S. thermophilus incluidas en una muestra se extrajeron de la muestra usando un método adecuado
30 conocido en la técnica y se sembraron en placas en las diluciones adecuadas sobre agar M17-glucosa y se volvieron a incubar durante 24 horas a 42 ºC para obtener colonias aisladas. Una o más colonias aisladas se repicaron a continuación y se hicieron crecer en medio M17-glucosa durante 18 horas a 42 ºC. De cada cultivo, las células se
40
imagen34

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