JP2019528766A - レンチウイルス製造用無血清懸濁系 - Google Patents

Abstract

レンチウイルスベクター産生系は、（ａ）細胞成長を制御するためのレンチウイルス培養補充物と、（ｂ）ＤＨＤＭＳ、ＤＯＰＥ、およびコレステロールを含む、トランスフェクション効率を高めるためのトランスフェクション試薬と、（ｃ）プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびカフェインを含む、レンチウイルス産生を増強するためのレンチウイルス産生亢進剤を含み、本レンチウイルスベクター産生系は、無血清である。レンチウイルスベクター産生方法は、レンチウイルス産生系を使用することを含む。レンチウイルスベクター産生のための別の方法は、（ａ）無血清培地中で真核細胞を培養することと、（ｂ）細胞成長を制御するためにレンチウイルス培養補充物を提供することと、（ｃ）ＤＨＤＭＳ、ＤＯＰＥ、およびコレステロールを含む、トランスフェクション効率を高めるためのトランスフェクション試薬を用いて、細胞をレンチウイルスベクターでトランスフェクトすることと、（ｄ）レンチウイルス産生を増強することができる、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウムを含むレンチウイルス産生亢進剤を使用して、レンチウイルス産生を提供することと、を含む。【選択図】なし

Description

大規模無血清懸濁液中の新たなレンチウイルスベクター産生系。

近年、レンチウイルスベクターが遺伝子療法における遺伝子移入ベクターとしての使用について注目の的となってきた。現行の新世代療法の１つであるＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、癌細胞を認識し殺滅するためにＴ細胞の表面上に遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる効率的な遺伝子移入ツールとしてレンチウイルスベクターを採用する。それ故、前臨床および臨床研究者は、はるかに大規模で、高い力価の、動物無血清培地でのレンチウイルス産生を求めてきた。レンチウイルス産生は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を開発する高コストに寄与する。

現行のレンチウイルス産生系は、フラスコまたは細胞工場における細胞成長を支持するためにウシ胎仔血清を必要とする接着細胞を主に使用する。この系は小規模での研究目的には適しているが、大型のインキュベーターや大型の細胞培養容器を必要とする大規模では適していない。接着細胞を培養することは操作者にとってより困難であり、大量のレンチウイルスベクターを産生するためには、費用を増大させるとともに、より多くの尽力を必要とする。

カフェインは、血清ベースの培養系におけるレンチウイルスベクター産生を増強するためにすでに使用されていたが、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である酪酸ナトリウムは、カフェインと同様に約５０％しか作用しないことが示された。Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｅａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈｅｒ Ｔｉｔｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ Ｃａｆｆｅｉｎｅ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：９３−１００（２０１１）。

本発明者らは、無血清懸濁プラットフォームにおいて高力価でベクターを産生するための新たなレンチウイルス系を開発した。この技術は、新たな培地、新たな細胞、新たなトランスフェクション試薬、新たなレンチウイルス亢進剤、および精製されていないレンチウイルスベクターを４℃条件下で２４〜４８時間安定化するための任意の安定化剤からなる良好な製造加工（ＧＭＰ）試薬の新たに開発された妥当なセットを採用する。この新しい系により、約１．５Ｅ＋０８（ＴＵ／ｍｌ）の濃縮されていないレンチウイルスベクターを供給することができる。

本明細書に従って、レンチウイルスベクター産生系は以下を含む。
細胞成長を制御するためのレンチウイルス培養補充物、
ＤＨＤＭＳと少なくとも１つのヘルパーおよび／または中性脂質とを含むトランスフェクション試薬、
プロピオン酸ナトリウムと、酪酸ナトリウムと、カフェインとを含むレンチウイルス産生増強剤。

ここでレンチウイルスベクター産生系は無血清である。

一部の実施形態において、少なくとも１つのヘルパーおよび／または中性脂質はＤＯＰＥを含む。一部の実施形態において、少なくとも１つのヘルパーおよび／または中性脂質は、ＤＯＰＥとコレステロールとを含む。

一部の実施形態において、系は、懸濁２９３細胞、２９３Ｆ細胞、またはこれらの誘導体中のレンチウイルスの産生のために設計される。

一部の実施形態において、２９３Ｆ細胞、またはそれに由来する細胞は、約１×１０⁶〜約２０×１０⁶の密度で成長することができ、５日後以降に２０％未満の細胞死となる。

一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、アミノ酸および／またはジペプチドと、糖源、糖アルコール、および／または炭素源とを含む。一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物はアミノ酸とグルコースとを含む。

一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、約１％〜約１０％で添加される。一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物中の該グルコースの浸透圧は、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約６５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約６２５ｍＯｓｍ／ｋｇである。一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物中のグルコースの濃度は、約８５ｍｇ／ｍｌ〜約１１５ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ〜約１１０ｍｇ／ｍｌ、約９５ｍｇ／ｍｌ〜約１０５ｍｇ／ｍｌの範囲である。

一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１３００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧、またはそれらの間の任意の浸透圧もしくは範囲を有する。

一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。

一部の実施形態において、ＤＨＤＭＳは約０．４〜０．６ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、ＤＯＰＥは、約０．２〜０．５ｍＭ／ｍＬで含まれる。一部の実施形態において、コレステロールは、０．１〜０．６ｍＭ／ｍＬで含まれる。一部の実施形態において、唯一のヘルパーおよび／または中性脂質はＤＯＰＥである。

一部の実施形態において、レンチウイルス亢進剤はバルプロ酸を含む。一部の実施形態において、プロピオン酸ナトリウムおよび／または酪酸ナトリウムは水溶液として提供される。一部の実施形態において、カフェインはレンチウイルス発現培地中に提供される。一部の実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約３〜１５ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、酪酸ナトリウムは、約１．５〜３ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、カフェインは、約０．７５〜３ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、バルプロ酸は、約０．５〜１ｍＭで含まれる。

一部の実施形態において、レンチウイルスベクター産生のための方法は、本明細書で説明する任意のレンチウイルスベクター産生系を使用することを含む。

一部の実施形態において、レンチウイルスベクター産生のための方法は、無血清培地中で真核細胞を培養することと、細胞成長を制御するためのレンチウイルス培養補充物を提供することと、トランスフェクション効率を高めるためにＤＨＤＭＳ、ＤＯＰＥ、およびコレステロールを含むトランスフェクション試薬を用いて、細胞にレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることと、レンチウイルス産生を増強することができるプロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびカフェインを含むレンチウイルス産生増強剤を提供することとを含む。

一部の実施形態において、該培養真核細胞は、高密度条件下での成長に適応した浮遊培養物中にある。一部の実施形態において、細胞は、少なくとも約１×１０⁶〜２０×１０⁶個／ｍＬの細胞密度を有する浮遊細胞培養物中で成長する

一部の実施形態において、本方法は、２９３細胞、２９３細胞の誘導体、２９３Ｆ細胞、または２９３Ｆ細胞の誘導体の培養のためのものである。

一部の実施形態において、本方法は、約２．５×１０⁸ＴＵ／ｍｌの非濃縮レンチウイルスベクターを産生することができる。いくつかの態様において、浮遊細胞培養物の容積は、約１０ｍＬ〜約５Ｌである。いくつかの態様において、細胞生存度は５日後以降に少なくとも８０％である。

さらなる目的および利点は、一部には以下の説明に記載され、一部には説明から明白になるか、または実践によって習得され得る。目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘された要素および組合せによって実現および達成されることになる。

前述の概要および以下の詳細な説明のいずれも、例示および説明に過ぎず、特許請求の範囲を制限するものではないことを理解されたい。

本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、１つの（いくつかの）実施形態（複数可）を例解し、説明とともに、本明細書に記載の原理を説明する役割を果たす。

図１Ａおよび図１は、Ｂレンチウイルス産生における培養補充物の影響を示す。図１Ａ：ウイルス産生時に、培養培地は、種々の細胞密度で１％、５％、および１０％のＥｘｐｉＣＨＯ（商標）−Ｆｅｅｄ培養補充物を提供された。トランスフェクションの４８時間後に、レンチウイルスベクターをそれぞれ収集し、力価を測定した。 図１Ｂ：種々の量のＥｘｐｉＣＨＯ（商標）−Ｆｅｅｄ補充物の存在下で浮遊細胞の生存度を監視した。 図２Ａおよび図２Ｂは、新たなトランスフェクション試薬のスクリーニングを示す。図２Ａ：ＪＭＰ（登録商標）Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（ＤｏＥ）で設計した新たなトランスフェクション試薬を、本実験でスクリーニングした。合計１２の候補を設計し、１２の新たなトランスフェクション試薬のうちの８を次のＤｏＥ実行のために選択した。 図２Ｂ：いくつかのよりＪＭＰ（登録商標）で設計したＤｏＥ実験を実施した（データ非表示）。性能および配合組成に基づいて１２の試薬を選択した。 図３Ａ〜図３は、Ｃレンチウイルス亢進剤の同定を示す。新たなレンチウイルス亢進剤リードを同定するためのベークオフ実験を、ＤｏＥのためのＪＭＰ（登録商標）ソフトウェアを使用することによって設計した。図３Ａ：対照レンチウイルス亢進剤を含む３２の候補を検査した。 図３Ｂ：２つのＤｏＥ亢進剤実験からの、ＪＭＰ（登録商標）による分析、および予測プロファイラグラフを示す。 図３Ｃ：２つのＤｏＥ亢進剤実験からの、ＪＭＰ（登録商標）による分析、および予測プロファイラグラフを示す。 レンチウイルス産生系の比較からの結果を提供する。具体的には、異なるトランスフェクション試薬を用いたレンチウイルスベクター１ｍｌあたりの力価、レンチウイルス培養補充物の有無、レンチウイルス亢進剤の有無、および酪酸ナトリウムの有無を示す。 無血清大規模懸濁レンチウイルス産生プロトコルの一実施形態を提供する。 実施例６のレンチウイルス力価の測定における使用のための４ウェル×４ウェルパターンを提供する。 実施例７に対応するレンチウイルス浮遊細胞培養の流れ図を提供する。

Ｉ．レンチウイルス産生系
Ａ．細胞
本明細書で使用される「細胞」という用語は、あらゆる種類の真核生物および原核生物細胞を指し、それらを含む。一部の実施形態において、この用語は、真核細胞、特に哺乳類動物細胞を指す。ある特定の例示的であるが非限定的な実施形態において、「細胞」という用語は、ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞もしくはヒト２９３細胞、または例えば懸濁液中で成長することができる２９３変異体のような、その変異体を指すことを意味する。一部の実施形態において、浮遊培養において成長し、増殖し、トランスフェクトすることができる２９３細胞の変異体、特に、高密度（例えば、≧約２×１０⁶個／ｍｌ、より大きな≧約３×１０⁶個／ｍｌ、または場合により≧約４×１０⁶個／ｍｌもしくは約２０×１０⁶個／ｍｌ）で培養することができる当該変異体である。このような変異体の例は、ＥＸＰＩ２９３（商標）Ｆ細胞などの２９３Ｆ細胞である。

一部の実施形態において、細胞を培養しトランスフェクションの作業の流れを行う背景で使用されるときの「高密度」という用語は一般的に、高い効率でトランスフェクトされる能力をなおも保有しながら、約１×１０⁶個／ｍｌ以上、約２×１０⁶個／ｍｌ以上、約３×１０⁶個／ｍｌ以上、またはさらには任意で約４×１０⁶個／ｍｌ以上、または約２０×１０⁶個／ｍｌ以上の密度まで適切な細胞培養培地中で成長するまたは培養されることができ、高レベル（例えば、２００μｇ／ｍｌ以上、最大で約１ｍｇ／ｍｌのレベル）で標的タンパク質を発現することができる、既知の細胞株、または既知の細胞株の変異体を指す。

一部の実施形態において、細胞は、高密度細胞培養に適応している。これは、約８０％またはそれを上回る細胞生存率を維持しながら、高密度培養培地において高密度で成長するように適応した細胞系列または同じ親細胞系列由来の（非クローン）細胞集団を指す。かかる細胞は、約４０、５０、６０、７０、または８０以上の連続継代にわたって高密度で細胞を維持し、成長培地の割合を所望の高密度培養培地に徐々に置き換えることによって、細胞の親集団から単離されるか、または選別され得る。任意に、プロセス中、異なるプールの細胞は個々に伝播され、選択手順を経てもよく、それと同時にトランスフェクション効率およびまたはレンチウイルスベクター産生効率を評価し、その結果、高密度で持続および成長し、高効率でトランスフェクトされ、高レベルの所望の組換えタンパク質を発現することができる細胞の非クローン集団が選択され得る。様々な細胞型および系列がこの選択手順を経ることができることは当業者には容易に明らかであろうが、２９３線維芽細胞由来の細胞系列が高密度成長条件に適応するための選択プロセスに特に適していることが決定された。一部の場合には、高密度成長培養に適応し、本明細書の使用に適している細胞は、高効率でトランスフェクトされることもでき、かつ／または少なくとも約２００μｇ／ｍＬを超過する細胞培養から最大で約２ｍｇ／ｍＬの細胞培養、より典型的には約５００μｇ／ｍｌの細胞培養から約１ｍｇ／ｍＬの細胞培養という収量で組換えタンパク質を発現することもできる。いくつかのシナリオにおいて、高密度成長培養に適応し、本明細書での使用のために受け入れられる細胞はまた、高い効率でトランスフェクトすることができ、約１×１０⁶〜約２０×１０⁶個／ｍｌ、約２×１０⁶〜約２×１０⁶個／ｍｌ、または約２．５×１０⁶〜約６×１０⁶個／ｍｌの範囲の密度で持続およびトランスフェクトすることができる。一部の実施形態において、細胞は、高密度培養に適応し得、約１×１０⁶〜約２０×１０⁶、約１×１０⁶〜約４×１０⁶、約１×１０⁶〜約３×１０⁶、約１×１０⁶〜約２×１０⁶の範囲の密度でトランスフェクトされ得る。

一部の実施形態において、細胞は浮遊培養で成長する。これは、培養槽中の細胞の大部分またはすべてが浮遊状態で存在し、培養槽中の細胞の少数が槽の表面または槽内の別の表面に接着するか、またはいずれも接着しない、細胞培養を意味する。一部の実施形態において、浮遊培養は、培養槽中の細胞の約７５％以上が浮遊状態であり、培養槽上の表面または培養槽に接着しない。一部の実施形態において、浮遊培養は、培養槽中の細胞の約８５％以上が浮遊状態で存在し、培養槽上の表面または培養槽に接着しない。一部の実施形態において、浮遊培養は、培養槽中の細胞の約９５％以上が浮遊状態で存在し、培養槽上の表面または培養槽に接着しない。

レンチウイルスベクター産生系は、２９３Ｆ細胞、またはそれに由来する細胞が、５日後以降に２０％未満の細胞死を伴いながら、約１×１０⁶〜約２０×１０⁶の密度で成長することができることを可能にする。

Ｂ．レンチウイルス培養補充物
レンチウイルス産生系は、レンチウイルス培養補充物を含む。レンチウイルス培養補充物は、産生時間中に細胞成長を遅延させ、レンチウイルスベクター産生の最大産生を可能にしながら細胞成長を制御するのに役立ち、トランスフェクトされていない細胞によって「貪食される」ウイルスを最小限にする。図１Ａおよび図１Ｂを参照されたい。

ある特定の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、場合によりグルコースとアミノ酸とを含む細胞培養フィードを含む。１つの例示的な細胞培養補充物、またはフィードは、ＣＴＳ（商標）ＬＶ−ＭＡＸ（商標）であるのに対し、別の例示的な細胞培養補充物、またはフィードは、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィード（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍにおけるＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの製品）である。

一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、アミノ酸と、ジペプチドと、糖源と、糖アルコールと、炭素源とを含む。一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、鉱物および／もしくは微量金属、ならびに／またはビタミンおよび／もしくはビタミン前駆体をさらに含む。

一部の実施形態において、ジペプチドは、Ｌ−アラニル−Ｌ−システインおよびＬ−アラニル−Ｌ−チロシンが含まれる。一部の実施形態において、アミノ酸は、任意のアミノ酸または任意の必須アミノ酸を含む。一部の実施形態において、「アミノ酸」という用語は、アミノ酸またはそれらの誘導体（例えば、アミノ酸類似体）、ならびにそれらのＤ形態およびＬ形態を指す。かかるアミノ酸の例としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリン、Ｎ−アセチルシステインが挙げられる。一部の実施形態において、培養補充物に含まれるアミノ酸としては、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、および／またはバリンが挙げられる。一部の実施形態において、糖源、糖アルコール、および炭素源は、Ｄ−グルコース、ｉ−イノシトール、およびピルビン酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、補充物はグルコースを含む。

一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は表１に列挙された成分を含む。

一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、約１％から約１０％で添加される。一部の実施形態では、レンチウイルス培養補充物は約１％、３．５％、５％、または１０％で添加される。一部の実施形態では、レンチウイルス培養補充物は約３．５％で添加される。

一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物はグルコースを含み得る。一部の実施形態において、該レンチウイルス培養補充物中のグルコースの浸透圧は、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約６５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約６２５ｍＯｓｍ／ｋｇであり得る。一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物中のグルコースの濃度は、約８５ｍｇ／ｍｌ〜約１１５ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ〜約１１０ｍｇ／ｍｌ、約９５ｍｇ／ｍｌ〜約１０５ｍｇ／ｍｌであり得る。

一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、複数のアミノ酸を含み得、各アミノ酸は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌの濃度を有し得る。一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１３００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧、またはそれらの間の任意の浸透圧もしくは範囲を有し得る。一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し得る。

一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１３００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧、またはそれらの間の任意の浸透圧もしくは範囲を有する。一部の実施形態において、レンチウイルス培養補充物は、約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。

Ｃ．トランスフェクション試薬
レンチウイルス産生系は、細胞への巨大分子の侵入を容易にするトランスフェクション試薬または組成物も含む。一実施形態において、トランスフェクション試薬は、「脂質凝集体」としてカチオン性脂質と１つ以上の中性／ヘルパー脂質とを含む。

一部の実施形態において、脂質凝集体には、少なくとも第１のカチオン性脂質と、任意に少なくとも第１の中性脂質とが含まれてもよく、該脂質凝集体は、水溶液条件下で核酸とのカチオン性複合体を形成するのに好適であり、該カチオン性脂質は、以下の構造

（式（Ｉ））、およびその塩を有し、式中、
Ｒ₁およびＲ₂は、独立して、８〜３０個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基、
８〜３０個の炭素原子を有し、アルコール、アミノアルコール、アミン、アミド、エーテル、ポリエーテル、エステル、メルカプタン、アルキルチオ、もしくはカルバモイル基のうちの１つ以上で任意に置換されたアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基であるか、またはＲ₁が−（ＣＨ₂）_q−Ｎ（Ｒ₆）_tＲ₇Ｒ₈であり、
Ｒ₃およびＲ₄は、独立して、水素、または８〜３０個の炭素原子を有し、アルコール、アミノアルコール、アミン、アミド、エーテル、ポリエーテル、エステル、メルカプタン、アルキルチオ、もしくはカルバモイル基のうちの１つ以上で任意に置換された、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基であり、
Ｒ₅〜Ｒ₈は、独立して、水素、またはアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基であり、
Ｒ₉は、水素、またはアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基、炭水化物、またはペプチドであり、
ｒ、ｓ、およびｔは、１または０であり、示されるＲ基の存在または不在を示し、ｒ、ｓ、またはｔのうちのいずれかが１である場合、示されるＲ基が結合する窒素は、正に荷電しており、ｒ、ｓ、またはｔのうちの少なくとも１つが１であり、
ｑは、１〜６の範囲の整数であり、
Ｘ^v-は、アニオンであり、ｖはアニオンの価数であり、Ａはアニオンの数であり、
Ｌは、（ＣＨ₂）_nであり、式中、ｎは、１以上１０以下の範囲の整数であり、これは、１つ以上のＺＲ₁₀基で任意に置換され、ＺはＯまたはＳであり、Ｒ₁₀は、水素、またはアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基であり、あるいは
｛−（ＣＨ₂）_k−Ｙ−（ＣＨ₂）_m｝_p−であり、ｋおよびｍは、独立して、１以上１０以下の範囲の整数であり、ｐは１以上６以下の範囲の整数であり、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＮＲ₁₁、ＮＲ₁₁ＣＯ、またはＮＲ₁₁ＣＯＲ₁₁Ｎであり、Ｒ₁₁は、いずれの他のＲ₁₁からも独立して、水素またはアルキル基であり、
Ｒ₁〜Ｒ₁₀のアルキル、アルケニル、またはアルキニル基の１つ以上のＣＨ₂基は、Ｏ、Ｓ、Ｓ−Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、ＮＲ₁₂ＣＯ、ＮＲ₁₂ＣＯＯ、またはＮＲ₁₂ＣＯＮＲ₁₂で置き換えられてもよく、Ｒ₁₂は、いずれの他のＲ₁₂からも独立して、水素、またはアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基であり、
Ｒ₁〜Ｒ₁₂のアルキル、アルケニル、またはアルキニル基は、１つ以上のＯＲ₁₃、ＣＮ、ハロゲン、Ｎ（Ｒ₁₃）₂、ペプチド、または炭水化物基で任意に置換され、Ｒ₁₃は、他のＲ₁₃から独立して、水素、またはアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基であり、
Ｒ₃およびＲ₄のうちの少なくとも１つは、アルキル基として存在する場合、ＯＲ₁₃およびＮ（Ｒ₁₃）₂基のいずれでも置換される。

一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造式によるＤＨＤＭＳ（ジヒドロキシ−ジミリスチルスペルミン四塩酸塩）である。

一部の実施形態では、中性脂質（またはヘルパー）は、ＤＯＰＥ、コレステロール、またはＤＯＰＣから選択され得る。一実施形態において、中性脂質は、コレステロール、ＤＯＰＥ、またはＤＯＰＣのうちの１つであり得る。ある実施形態において、中性脂質は、コレステロールである。ある実施形態において、中性脂質は、ＤＯＰＥである。ある実施形態において、中性脂質は、ＤＯＰＣである。一部の実施形態において、２つの中性脂質、例えば、ＤＯＰＥおよびコレステロールが採用される。一部の実施形態において、ただ１つの中性脂質が採用される。

一部の実施形態において、トランスフェクション試薬は、ＤＨＤＭＳと、ＤＯＰＥと、コレステロールとを含む。一部の実施形態において、トランスフェクション試薬であるＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥ：コレステロールのモル比は、約０．４〜０．６５ｍＭのＤＨＤＭＳ、約０．１または０．１２５〜０．２５のＤＯＰＥ、および約０．２〜０．４または０．３７５のコレステロールの範囲である。一部の実施形態において、トランスフェクション試薬であるＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥ：コレステロールのモル比は、約０．４５〜０．５５ｍＭのＤＨＤＭＳ、約０．１〜０．２５のＤＯＰＥ、および約０．３〜０．４コレステロールの範囲である。一部の実施形態において、トランスフェクション試薬であるＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥ：コレステロールのモル比は、約０．４７５〜０．５ｍＭのＤＨＤＭＳ、約０．１〜０．１２５ＤＯＰＥ、および約０．３２５〜０．３５のコレステロールの範囲である。一部の実施形態において、トランスフェクション試薬であるＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥ：コレステロールのモル比は、約０．５〜０．５２５ｍＭのＤＨＤＭＳ、約０．１２５〜０．１５のＤＯＰＥ、および約０．３５〜０．３７５のコレステロールの範囲である。トランスフェクション試薬は、高い細胞密度での複数のプラスミドの送達に適している。図２Ａ〜図２Ｄを参照されたい。

一部の実施形態において、ＤＨＤＭＳは、約０．４〜０．６５ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、ＤＯＰＥは、約０．０５〜０．５ｍＭ／ｍＬで含まれる。一部の実施形態において、コレステロールは、０．１〜０．６ｍＭ／ｍＬで含まれる。

一部の実施形態において、ＤＨＤＭＳおよびＤＯＰＥが含まれる。一部の実施形態において、ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥの比は約０．６：０．４〜０．７：０．３の範囲である。一部の実施形態において、ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥの比は約０．６２５：０．３７５〜０．６７５：０．３２５の範囲である。一部の実施形態では、ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥの比は約０．６：０．４〜０．６２５：０．３７５の範囲である。

一部の実施形態において、ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥ：コレステロールの比（任意のゼロ量を含む）は、表２のものから選択してもよく、すべての数は「約」で修飾されるものと見なされる。他のヘルパーおよび／または中性脂質は、ＤＯＰＥおよび／またはコレステロールに置換することができる。

一部の実施形態において、ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥ：コレステロール（任意のゼロ量を含む）のモル比は表２、４または表５から選択され、すべての数は「約」によって修飾されているものとみなされる。

一部の実施形態において、ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥ：コレステロールのモル比は、表４由来の実行番号１×Ｒ３、１×Ｒ４、１×Ｒ６、１×Ｒ７、１×Ｒ９、１×Ｒ１０、１×Ｒ１１、１×Ｒ１２、または表５由来の２×ｂＲ１３もしくは２×ｂＲ１４から選択される。

いくつかの態様においておよび本節における先行段落において考察された比のいずれかへ任意に適用されて、ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥ：コレステロールのモル比は合計１．０になり、ＤＨＤＭＳモル比は約０．４〜０．６の範囲であり、ＤＯＰＥモル比は約０．２〜０．５の範囲であり、コレステロールモル比は約０．１〜０．６の範囲である。例えば、ＤＨＤＭＳが０．５のモル比であり、ＤＯＰＥが０．２のモル比である場合、コレステロールモル比は、モル比が合計１．０になるように０．３である。

Ｄ．レンチウイルス産生増強剤
レンチウイルス産生系は、レンチウイルス産生増強剤も含む。レンチウイルス産生増強剤は、プロピオン酸ナトリウムと、酪酸ナトリウムと、カフェインとを含む。

一部の実施形態において、プロピオン酸ナトリウムおよび／または酪酸ナトリウムは水中で提供される。一部の実施形態において、カフェインは、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地のような細胞培養発現培地中に提供される。一部の実施形態において、カフェインは、終濃度４０ｍＭまで培地中に溶解してもよい。

一部の実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約７．５〜１５ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、酪酸ナトリウムは、約１．５〜３ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、カフェインは、約０．７５〜３ｍＭで含まれる。

一部の実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約３〜約５ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約５〜８ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、酪酸ナトリウムは、約１．５〜２．５ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、酪酸ナトリウムは、約２．５〜３ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、カフェインは、約２〜３ｍＭで含まれる。一部の実施形態において、カフェインは、約１〜２ｍＭで含まれる。

一部の実施形態において、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびカフェインの量はそれぞれ、表３に提供されている量から選択してもよく、すべての数は「約」によって修飾されているとみなされる。

一部の実施形態において、レンチウイルス産生増強剤成分は、表３、表６、または表７にある成分のいずれかから選択され、すべての数字は「約」によって修飾されているとみなされる。一部の実施形態において、増強剤成分は、表６の実行１×Ｒ５、１×Ｒ６、１×Ｒ１３、１×Ｒ１４、１×Ｒ１５、１×Ｒ１６、１×Ｒ１７、１×Ｒ１８、１×Ｒ１９、１×Ｒ２２、１×Ｒ２６、１×Ｒ２７、１×Ｒ２９、１×Ｒ３０、または１×ｘＲ３１における成分のうちのいずれかから選択される。

一部の実施形態において、レンチウイルス産生増強剤は、バルプロ酸を任意に含む。一部の実施形態において、レンチウイルス産生増強剤は、バルプロ酸を含んでいない。一部の実施形態において、バルプロ酸は、約０．５〜１ｍＭで含まれ得る。

一部の実施形態において、レンチウイルス産生増強剤は、トランスフェクションの約４８時間後まで、トランスフェクション時（約０時間）のような１つまたは１つを超える時点で添加される。レンチウイルス産生増強剤は、レンチウイルスベクターの細胞パッケージングを促進するためにトランスフェクションの約１６時間後に添加してもよい。一部の実施形態において、レンチウイルス産生増強剤は、トランスフェクション時に添加されることがある。一部の実施形態において、レンチウイルス産生増強剤は、トランスフェクション時およびトランスフェクション約１６時間後に添加されることがある。一部の実施形態において、レンチウイルス産生増強剤は、トランスフェクションの約１０〜１６時間後に添加されることがある。

Ｅ．細胞培養培地
レンチウイルス産生系細胞を培養するために種々の細胞培養培地を使用してもよい。無血清培地はしばしば研究者によって望まれている。先の第Ｉ．Ａにおいて先に説明した細胞の成長を支持する任意の無血清培地を使用してもよい。培地はまた、無タンパク質であってもよい。

「無血清培地」（「ＳＦＭ培地」とも称される場合がある）は、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、子ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒト血清など）を含有しない培地であり、一般的に、ＳＦＭという文字で表される。「無タンパク質」培養培地という句は、タンパク質を含有しない（例えば、血清アルブミンもしくは接着因子などの血清タンパク質、成長因子などの栄養素タンパク質、またはトランスフェリン、セルロプラスミンなどの金属イオンキャリアタンパク質のない）培養培地を指す。一部の実施形態において、ペプチドが存在する場合、ペプチドは、より小さいペプチド、例えば、ジペプチドまたはトリペプチドである。一部の実施において、デカペプチド長以上のペプチドは、無タンパク質培地中に存在するアミノ酸の約１％以下、約０．１％以下、および約０．０１％以下である。

一部の実施形態において、細胞培養培地は、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ１４３５１−０１）である。この培地は、２９３細胞の高密度浮遊培養およびトランスフェクションのために特別に開発された、化学的に定義された特殊な培地であり、ヒトまたは動物起源の生成物を含有していない。Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地には、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ試薬が配合されている。懸濁成長およびトランスフェクションの適用のために、この培地はいかなる補充もなしに使用してもよい。さらに、抗生物質は必要ないが、有益なときにペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンＢを含有する５ｍＬ／Ｌの抗生物質−抗真菌剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号１５２４０）を使用してもよい。

一部の実施形態において、約８０％を超える当該細胞の生存度を維持し、当該浮遊細胞が効率的にトランスフェクトされ、多量の組換えタンパク質を発現する能力を維持しながら、最大約２×１０⁷個／ｍｌの細胞密度で、哺乳類細胞、一部の実施形態において、懸濁液中で成長する細胞の成長を持続させることができる任意の培養培地を含む高密度培養培地が使用され得る。使用される高密度培養培地は、異なる用途および使用によって異なってもよく、使用される細胞系の性質、一過的に発現される所望のタンパク質、発現ベクターの細胞内への移入のために選択されたトランスフェクションモダリティの性質、ならびに以下に記載される系に添加される任意の発現亢進剤の量および性質に依存し得る。それにもかかわらず、本一過性発現系および方法に使用するために企図される高密度培養培地は、典型的には、無血清、無タンパク質であり、浮遊細胞を最大約２×１０⁷細胞／ｍｌ、より典型的には約２×１０⁶細胞／ｍｌ〜約１×１０⁷細胞／ｍｌの密度に増殖および成長させることを可能にし、さらに一過性発現系において産生されたタンパク質の収量が少なくとも２００μｇ／ｍＬの細胞培養から最大２ｍｇ／ｍＬの細胞培養の、より典型的には約５００μｇ／ｍｌの細胞培養〜約１ｍｇ／ｍＬの細胞培養を超過することを可能にする。一部の実施形態において、使用される高密度培養培地は、約１×１０⁶〜約２０×１０⁶個／ｍｌ、約２×１０⁶〜約２×１０⁶個／ｍｌ、または約２．５×１０⁶〜約６×１０⁶個／ｍｌの範囲の密度の細胞のトランスフェクションを容易にするであろう。

本明細書で使用するのに好適な例示的な高密度培養培地としては、ＨｕＭＥＣ基礎無血清培地、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＣＴＳ（商標）ＸｅｎｏＦＲＥＥ ＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）−３４ ＳＦＭ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）ＮＳＣ培地、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ（商標）−８培地、培地２５４、培地，１０６、培地，１３１、培地，１５４、培地，１７１、培地１７１、培地２００、培地２３１、ＨｅｐｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ、ヒト内皮−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、培地１５４ＣＦ／ＰＲＦ、培地１５４Ｃ、培地１５４ ＣＦ、培地１０６、培地２００ＰＲＦ、培地１３１、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ（商標）−６培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）−３４培地、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）アストロサイト培地、ＡＩＭ Ｖ（登録商標）培地ＣＴＳ（商標）、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）Ｃ−１００基礎培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）−ＩＩ完全培地、ＣＤ ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ ＣＨＯ培地、ＣＤ ＤＧ４４培地、ＳＦ−９００（商標）培地、ＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地、ＬＨＣ基礎培地、ＬＨＣ−８培地、２９３ ＳＦＭ培地、ＣＤ ２９３培地、ＡＥＭ成長培地、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞培地、ＡＩＭ Ｖ（登録商標）培地、ＥＸＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ培地、ＬＨＣ培地、ＬＨＣ−８培地、ＬＨＣ−９培地、およびそれらの任意の派生物または修飾物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態において、高密度培養培地は、ＣＤ ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ ＣＨＯ培地、ＣＤ ＤＧ４４培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、ＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地、もしくは同様の培地、またはそれらの修飾形態であってもよい。上に列記される例示的な高密度培養培地は、２９３細胞、２９３細胞変異型、または高密度培養系における使用に適応した任意の他の細胞の高密度成長、伝播、トランスフェクション、および維持に特に好適であり得る。

Ｆ．レンチウイルスプラスミド
種々のレンチウイルスプラスミドを本方法において使用してもよい。例えば、１以上のレンチ発現（移入）プラスミド、ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ、およびレンチパッケージングプラスミド、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルスパッケージングミックスを使用してもよい。＃２７７．ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＴ．ｈＰＧＫ．ｅＧＦＰ、Ｗｐｒｅ（２７７−ｅＧＦＰ）を含む他のレンチウイルスベクターを使用してもよい。他の非限定的なレンチウイルスプラスミドも使用してもよい。

組込みレンチウイルスベクターおよび組込み欠損レンチウイルスベクターの両方を使用してもよい（それぞれ、ＩＣＬＶおよびＩＤＬＶ）。

無血清大規模懸濁レンチウイルス産生プロトコルを図５に示す。これは、本明細書に記載のレンチウイルス産生系を使用する方法の一実施形態である。

本発明の無血清懸濁ＬＶ産生系は、使いやすく、規模拡大可能であり、非常に効率的である。この系は、従来の方法よりも１０倍多くのレンチウイルスベクターを産生することができる。本系およびトランスフェクション試薬は、レンチウイルス発現およびパッケージングベクターを無血清懸濁成長細胞へと高い細胞密度で効率的に送達することができる。また、培養補充物は、最大量のレンチウイルス粒子を産生するために、細胞を対数期中期に維持する。したがって、この系およびその構成要素の利点には、単純さ、培養物の均一性、高いレンチウイルス力価産生、規模拡大の容易さ、およびレンチウイルス産生系の密封自動化の実現可能性が含まれる。

ＩＩ．レンチウイルス産生系における使用のための方法
Ａ．第１のレンチウイルス産生系
レンチウイルス浮遊細胞培養についての以下の指針に従い得る。細胞は、標準的なレンチウイルス浮遊細胞培養プロトコルによって成長させ得る。細胞は、およそ４×１０⁶〜５×１０⁶個／ｍＬの生細胞密度に到達すると、通常は３〜４日ごとに、継代培養し得る。細胞は、約３日間または４日間の培養の後、０．３×１０⁶〜０．６×１０⁶個の細胞に分裂させ得る。細胞成長は、毎日同じ時刻に毎日細胞を計数することによって監視し得る。細胞倍加時間は約２４時間である。解凍日から２週間後、細胞はレンチウイルス産生の準備ができている。細胞培養の間、楕円軌道振盪器を１２５ｍＬから１Ｌの振盪フラスコについて約１２５ｒｐｍで使用し得る。インキュベーターは、約３７℃、約８％のＣＯ₂、および約７５〜８０％の湿度へ設定し得る。培養培地は使用前に約３７℃の水浴中で加温し得る。

試薬および方法
・１２５ｍＬポリカーボネート製の使い捨ての滅菌した換気性Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振盪フラスコ、
・１５ｍＬの滅菌コニカルチューブ、
・５０ｍＬの滅菌コニカルチューブ、
・Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地、
・レンチ発現（移入）ベクター：ｐＬＥＮＴＩ６．３／Ｖ５−ＧＷ−ＥｍＧＦＰ、
・レンチパッケージングミックス：ＶｉｒａＰｏｗｅｒレンチウイルスパッケージングミックス。
・レンチウイルス浮遊細胞
・レンチウイルス培養補充物
・レンチウイルストランスフェクション試薬
・レニットウイルス亢進剤

細胞が金曜日の朝に０．６×１０⁶個／ｍＬの細胞数に分裂する場合、当該細胞は１Ｌフラスコ中で約２５０ｍＬの培養培地で３日間培養され得る。例えば、月曜日の午前１０時ちょうどに、細胞を計数することによって細胞が調製され、約４．５×１０⁶個／ｍＬの細胞密度が予想され得る。細胞を新たに加温した培養培地で３．０×１０⁶個／ｍＬに希釈し、さらに３０時間培養し得る。

トランスフェクションは、例えば火曜日の午後４時ちょうどに実施され得る。細胞は、予想される約５．５〜６．０×１０⁶個／ｍＬと計数され得る。表４は、追加のトランスフェクション指針を提供する。

火曜日の午後に、細胞をレンチウイルス補充物とともに播種することができる。３０ｍＬのトランスフェクションが選択される場合、１７．５ｍＬ中１０５×１０⁶個／ｍＬのような高密度細胞を用いて実施され得る。３．５％のレンチウイルス培養補充物を添加することができ、それは３０ｍＬのトランスフェクションで１．５ｍＬになるだろう。新鮮な加温培養培地を使用して全容積を２５．５ｍＬにすることができる（１．０５ｍＬのレンチウイルス培養補充物および１７．５ｍＬの細胞懸濁液を使用したため、６．９５ｍＬの新鮮培地）。総容積３０ｍＬを達成するためにさらに４．５ｍＬをＤＮＡ／試薬複合体から添加してもよい。

ＤＮＡ／トランスフェクション試薬は次のように調製することができる。２本のチューブにはＴｕｂｅ−１とＴｕｂｅ−２と標識され得る。Ｔｕｂｅ−１：２．２５のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地と１５０μＬのレンチウイルストランスフェクション試薬を混合し、室温で約５分間インキュベートし得る。チューブ２：２．２５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地を４５μｇ（μＬ）のＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルスパッケージングミックス（ＶｉｒａＰｏｗｅｒ１μｇ／μＬ）および３０μｇ（μＬ）のｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＧＷ／ＥｍＧＦＰプラスミド（ｐＬｅｎｔｉ発現ベクター１μｇ／μＬ））と混合され得る。Ｔｕｂｅ−１およびＴｕｂｅ−２は、Ｔｕｂｅ−２溶液をＴｕｂｅ−１に混合しながら添加することによって組み合わせられ得る。

複合体溶液を室温で１０分間インキュベートしてもよい。１０分のインキュベーション後、調製した細胞に４．５ｍＬのＤＮＡ／試薬複合体を添加することができる。

翌日（水曜日の午前９時ちょうど）、フラスコにＬＶ Ｅｎｈａｎｃｅｒを１．２ｍＬ添加する。

トランスフェクションの４８時間後（木曜日の午後、午後４時）に、５０ｍＬの滅菌コニカルチューブにＬＶＶを採取し、室温で１０分間、３０００ｒｐｍで細胞をスピンダウンする。上清を回収し、再度３０００ｒｐｍで１０分間遠心する。上清を回収し、０．４５μＭフィルターでろ過する。

ウイルスを回収した後にｐＨを調整するために、回収した上清にレンチウイルス安定化剤を任意に添加する。レンチウイルス安定化剤は、任意に、収集した上清の約１％（約３００μＬ）として添加され得る。一部の状況において、ウイルスを安定化させるために産生系のｐＨが約５〜８に調整される。

翌日の精製のために４℃でレンチウイルスベクターを保存し、次のように、レンチウイルスベクターの連続希釈でＨｔ１０８０細胞を感染させることによってウイルス力価を測定する。

レンチウイルス力価（ＧＦＰ＋）の測定は、次のように実施され得る。

材料：
・レンチウイルス：細胞上清または濃縮レンチウイルスベクターを集める。
・細胞株：ＨＴ１０８０。
・培養培地：Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ＤＭＥＭ高グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補充物、ピルビン酸＋１０％ＦＢＳ。
・Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）（原液）：滅菌Ｈ₂Ｏ中１００ｍｇ／ｍＬ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮＣＯ６６３３９１）、および
・希釈用Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル丸底プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ０５５３９２００）。

１日後（午前）に、高処理量フロー分析のために９６ウェルプレートフォーマットを使用してレンチウイルス力価の測定を開始する。午前１１時ちょうどの午前中に、１００μＬの培地中に７０００個／ウェルの細胞密度でＨＴ１０８０細胞を９６ウェルプレートに播種する（感染時に約３０％コンフルエント）。

午後４時ちょうどの午後に、次のように新鮮なウイルス希釈液を調製する。（Ａ）１５ｍＬの新しい培地と１２μＬの１０ｍｇ／ｍＬ Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）（最終濃度８μｇ／ｍＬ）を組み合わせる。十分にボルテックスにかけて組み合わせる。（Ｂ）ウイルスあたりの試料、４ウェル×４ウェルのパターンで９６ウェル丸底プレートの１６ウェルに（Ａ）で調製した培地１３５μＬを加える（図６を参照されたい）。（Ｃ）第１行目の各ウェルに１５μＬのレンチウイルス上清試料（または濃縮ウイルス一定分量）を添加する（各ウェルの総容量１５０μＬ）。（Ｄ）ピペットを用いて十分に混合する（１：１０）。（Ｅ）１５μＬを第１行目から第２行目に移すことによって第１行目の連続希釈を実施し（利用可能な場合、多重チャネルピペットを用いる）、十分に混合し（１：１００）、第２行目から第３行目まで１５μＬを移して十分に混合し（１：１０００）、第３行目から第４行目まで１５μＬを移し、十分に混合する（１：１０，０００）。ウイルスが濃縮された場合、さらに希釈する必要があり得る。

細胞を感染させるために、ＨＴ１０８０細胞から播種培地を除去し、（利用可能な場合は多重チャネルピペットを使用して）調製した希釈液１００μＬを各対応するウェルへ移すことによって感染させる。９６ウェル感染細胞プレートを室温で３０分間、２０００ｒｐｍで回転させ、感染細胞プレートを一晩インキュベートする。

２日後（午前）に、ウイルスを含有する培地を除去し、新鮮なＨＴ１０８０培養培地（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）なし）と置き換え、細胞をさらに３日間インキュベートし、ＧＦＰ陽性細胞の％を解析する（フローサイトメトリー分析を使用してもよい）。

ＴＵ／ｍＬ単位で力価を計算するために、％ＧＦＰ陽性度に基づいて使用する適切な希釈係数を決定する。１〜２０％の所望の感染範囲を使用してもよい。

力価は次の式から計算され得る。
力価＝［Ｆ＊Ｃ／Ｖ］＊Ｄ
Ｆ＝ＧＦＰ＋細胞の頻度（％ＧＦＰ＋細胞／１００）
Ｃ＝形質導入時のウェルあたりの細胞数（７０００個）
Ｖ＝接種量（ｍＬ）（０．１ｍＬ）
Ｄ＝レンチウイルス希釈係数。

Ａ．第２のレンチウイルス産生系プロトコル
第２のレンチウイルス産生系プロトコルは次のように実施され得る。

材料
・１２５ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌポリカーボネート製の、使い捨ての、滅菌済みの、ベントアップ振盪フラスコ
・温度３７℃、８％ＣＯ₂、および７５〜８０％の湿度制御されたインキュベーターの中の楕円軌道振盪器
・細胞生存度を測定するための装置と試薬

プロトコル概要
・解凍および回収：３〜４日
・継代培養：３〜４日ごと
・使用前に培地を３７℃に加温
・楕円軌道振盪器速度：１２５ｍＬ〜１Ｌの振盪フラスコにつき１２５ｒｐｍ

成長特性：特殊培養培地中での高密度懸濁成長

細胞倍加時間：
・倍加時間（ＤＴ）：約２４時間
・計算式：ＤＴ＝Ｔ×ＬＮ（２）／ＬＮ（Ｘｅ／Ｘｂ）
・Ｔ：細胞培養時間（時）
・Ｘｅ：終了時の細胞密度
・Ｘｂ：開始時の細胞密度

生存度を確認するために、細胞が損なわれていないことを確認するために最初の３〜４日間の細胞成長および生存度を監視する。解凍２４時間後に、生存度は８０％まで下落することがあるが、７０％を下回ってはいけない。解凍後３〜４日後までに、生存度は９０〜９５％にならなければならない

継代培養条件図７は、培養細胞に従うことができるレンチウイルス浮遊細胞培養の流れ図を提供する。継代培養のために、一部の実施形態では、細胞は５×１０⁶個／ｍＬを超えて成長するべきではない。継代番号４０の後に細胞を廃棄することができる。

細胞培養の規模拡大細胞は振盪器、スピナーフラスコまたはバイオリアクターで規模拡大してもよい。培養系に最適な振盪器、スピナーまたはインペラの速度と播種密度を決定する。一部の実施形態において、細胞は継代培養のために０．３ｘ１０⁶〜０．６ｘ１０⁶個の生細胞／ｍＬで播種すべきである。最適な振盪器速度は１２５ｍＬ〜１Ｌの振盪フラスコに対しておよそ１２５ｒｐｍであり、Ｃｅｌｌｉｇｅｎ（登録商標）撹拌タンクバイオリアクターにおける最適インペラ速度は７０〜１００ｒｐｍである。

考慮すべき指針細胞をトランスフェクション実験に使用する前に、細胞を解凍から回収させるために最低３回継代培養する。最良の挙動のために、細胞密度を３〜５×１０⁶個／ｍＬで維持する。本発明者らは、２５０ｍＬまたは５００ｍＬのポリカーボネート製の、使い捨ての滅菌Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振盪フラスコ中に細胞を維持することを推奨する。細胞懸濁の作業容積は、振盪フラスコの大きさの３０〜４０％である。例えば、５００ｍＬの振盪フラスコでは、作業容積は１５０ｍＬ〜２００ｍＬである。ガラスフラスコを使用してもよいが、潜在的な毒性を避けるために各使用後にそれらを徹底的にきれいにする。

実施例１．細胞培養
ＬＶ浮遊細胞を、細胞培養インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ ２、７０〜８０％湿度）で、１２５ｒｐｍで楕円軌道振盪器の上で、３０％〜４０％の振盪フラスコの大きさの容積のポリカーボネート製の使い捨て滅菌Ｖｅｎｔ−ｕｐ振盪フラスコ（１２５ｍＬ〜１Ｌ）中で培養した。細胞を３〜４日ごとに分裂させ、密度は４〜５×１０⁶／ｍＬの間にした。

実施例２：レンチウイルス産生実験
開発の必要性に基づき、レンチウイルス（ＬＶ）産生実験を２つのフォーマット、すなわち、９６ウェルプレートおよび１２５ｍＬ振盪フラスコをそれぞれ１ｍＬおよび３０ｍＬ培養容積で実施した。細胞密度は４×１０⁶／ｍＬとした。レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を、同時トランスフェクションレンチ発現（移入）プラスミド（ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ）およびレンチパッケージングプラスミド（ＶｉｒａＰｏｗｅｒレンチウイルスパッケージングミックス）によって充填し、全ＤＮＡは３μｇ／ｍＬとした。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉを、トランスフェクション試薬およびＤＮＡ希釈物の両方について、７．５μＬ／ｍＬのＤＮＡ／試薬複合体形成培地とし、全複合体容積は１５０μｌ／ｍＬとした。複合体形成時間は１０〜２０分とした。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３は、ＬＶ補充物およびＬＶ亢進剤の開発におけるトランスフェクション試薬であり、量は５〜８ｕｌ／ｍＬの間で種々であった。５％ＬＶ培養補充物を発生実験全体に含めた。本明細書に記載の発生の前に、５ｍＭカフェインをＬＶ亢進剤として先に使用し、トランスフェクション１６〜１８時間後に添加した。トランスフェクションの４８時間後、ＬＶＶを含有する細胞上清を、細胞をスピンダウンすることにより集め、ウイルス力価を測定した。

実施例３：レンチウイルス力価測定
レンチウイルス力価は、Ｈｔ１０８０細胞を感染させることによって測定した。感染の４時間前に、９６ウェルプレートに１ウェルあたり７０００個を播種する。感染時には、細胞は約３０％コンフルエンスで培養槽に接着した。１０¹〜１０⁵のＬＶＶの連続希釈を、８μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）を含有する培養培地中で実施した。細胞を１０⁴および１０⁵のウイルス希釈物によって感染させた。細胞の感染後、感染したＨｔ１０８０プレートを２０００ｒｐｍで３０分間室温でスピンさせた。感染の１８時間後、培地をＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）を含有していない新鮮な培地と交換した。細胞をさらに７２時間インキュベートし、ＧＦＰ陽性細胞をＡｔｔｕｎｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによって測定した。力価は、１〜２０％ウェル間のＧＦＰ細胞の百分率に基づいて計算した。

トランスフェクション当日、３つの異なる細胞密度培養液３０ｍＬは、以下であった以下を調製する：１２５ｍＬの振盪フラスコ中に２．５×１０⁶／ｍＬ、４×１０⁶／ｍＬおよび５×１０⁶／ｍＬ。各密度の細胞は、異なる量のＬＶ培養補充物を、それぞれ３０ｍＬの０％、１％、５％および１０％を含有する４つのフラスコを有した。各３０ｍＬの培養細胞を、２１０μｌ（７μｌ／ｍＬ）のＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３を２．２５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地で希釈し、５４μｇのＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルスパッケージングミックスと３６μｇのｐＬｅｎｔｉ／Ｖ５−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ発現ベクターを希釈することによってトランスフェクトし、これらの２つの溶液を組み合わせて（合計４．５ｍＬ）、室温で１０分間インキュベートした後、細胞をトランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間後、細胞をスピンダウンすることによって細胞培養上清を回収した。

レンチウイルス産生における培養補充物の量の影響を示す結果を図１Ａに提供する。

次に、レンチウイルス浮遊細胞を、０％〜１０％（０％、１％、５％および１０％）を含有することに由来する異なる量のＬＶ培養補充物の下で培養し、細胞密度を６日間毎日測定した。結果を図１Ｂに示す。

実施例２：新たなトランスフェクション試薬のスクリーニング
ＪＭＰ（登録商標）実験設計（ＤＯＥ）プラットフォームを用いて、３つの中心となる化学物質すなわちＤＨＤＭＳ、ＤＯＰＥおよびコレステロールを可能性のあるトランスフェクション試薬として用いて、スクリーニング実験を設計した。

ＤＯＥプラットフォームにより、研究者らは、各パラメータを個別に変更してから最適化された製剤全体に対して各最適化パラメータを検討する代わりに、複数のパラメータを同時に変更することができた。パラメータ間の２次効果が結果に影響を与える可能性があるとき、ＤＯＥプラットフォームは、すべての候補パラメータを同時に変更することで、より効率的で正確な結果を可能にする。ＤＯＥプラットフォームを使用した実験でも、従来の実験手法よりも少ない実行回数を必要とし、経済的である。ＤＯＥプラットフォームに関する理論的考察については、Ｋａｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ Ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ Ｆａｃｔｏｒｉａｌ ａｎｄ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎｓ，ＮａｎｏＬｅｔｔｅｒｓ １５：７３００−７３０６ （２０１５）および補足資料を参照されたい。

ＤＨＤＭＳ、ＤＯＰＥ、およびコレステロールを異なるモル比で評価し、表４の各行で成分の合計を１とした。この表では、ソフトウェアの自動設計された繰り返しが実験の正確さ、１×Ｒ１と１×Ｒ２、１×Ｒ６と１×Ｒ７を制御するために実行される。

表５に基づき、新たなトランスフェクション試薬を作製した。これらの新たな製剤された試薬を用いて、９６深ウェルブロック、１ｍｌの培養容積、３μｇの全ＤＮＡ（ｐＬｅｎｔｉ発現ベクター＋ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）パッケージングミックス、これら２つのベクターは２：３（重量：重量）の比）において、トランスフェクションｐＬｅｎｔｉ／Ｖ５−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ発現ベクターとＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルスパッケージングミックスとの同時トランスフェクションによってＧＦＰ ＬＶＶをパッケージし、トランスフェクション試薬の５ｕｌ／ｍＬ量および６ｕＬ／ｍＬ量を試験し、細胞密度は４×１０⁶／ｍＬ、５％ＬＶ培養補充物入りとした。図２Ａに示される結果は、これら２つの用量の平均であり、ＴＵ／ｍＬで読み出された。

このＤｏＥの結果に基づき、ＤＨＤＭＳとＤＯＰＥ、ＤＨＤＭＳとコレステロール、ＤＨＤＭＳとＤＯＰＥとコレステロールの組み合わせのような、検査化合物の異なる組み合わせを作製することによって、より多数の試薬を設計した。本発明者らは、３０ｍＬ製造フォーマットで新たな試薬の各群を検査し、対照試薬としてリポフェクタミンを使用した。本発明者らは、ＤＯＰＥを含むＤＨＤＭＳが最も高い性能量を、具体的にはその他の２つのトランスフェクション試薬の組み合わせと比較して０．３５ ＤＯＰＥに対する０．６５ ＤＨＤＭＳのモル比であることを見出した。

性能および製剤組成に基づき１２個の試薬を選択し、このベークオフランにおけるレンチウイルストランスフェクション試薬を表６に示す。結果を図２Ｂに示す。

実施例３：レンチウイルス亢進剤の同定
次の実験を用いてレンチウイルス亢進剤を同定した。ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＧＷ／ＥｍＧＦＰおよびＶｉｒａＰｏｗｅｒレンチウイルスパッケージングミックスと複合体形成したＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクション試薬によって、９６深ブロック２つをトランスフェクトした。各ウェル（１ｍＬの反応）に対して、合計１５０μｌの複合体について７５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地中の７μｌのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３および７５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の３μｇの全ＤＮＡ（１．２μｇのｐＬｅｎｔｉ発現ベクターおよび１．８μｇのＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）ミックス）を組み合わせた。細胞に、５％ＬＶ培養補充物とともに、４×１０⁶／ｍＬをトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後に、ＪＭＰ（登録商標）によって設計された調製済みレンチウイルス亢進剤を、表７により、各レンチウイルス亢進剤について３つ組で添加した。

トランスフェクションの４８時間後、レンチウイルス力価アッセイを実施した。結果を図３Ａに示す。

結果をｊｍｐによって解析し、予測プロファイラーを図３Ｂにおいてグラフにした。２次ＤｏＥを以下のように設計および解析し、最適化された条件を見出した（表８を参照されたい）。

結果をｊｍｐによって解析し、予測プロファイラーを図３Ｃにおいてグラフにした。

実施例４：レンチウイルス産生系の比較
本発明者らは、我々の新たな開発した懸濁レンチウイルス産生系を、レンチウイルス産生について、Ｌｅｎｔｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＰＥＩ媒介性（２５ＫＤ線状ポリマー）を含有するトランスフェクション試薬としての（ＬＶＲ）、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００媒介性（ＬＫ２）トランスフェクション技術を用いて、トランスフェクション試薬を変えて、産生過程がレンチウイルス培養補充物、レンチウイルス亢進剤、および／または酪酸ナトリウムを含有したかどうかを変えて比較した。

ＬＶ２９３系におけるトランスフェクションは次のように行った。系は、３０ｍＬのＬＶ生産量を有する１２５ｍＬの振盪フラスコとした。２９３Ｆ細胞由来のＬＶ２９３細胞をトランスフェクション時に３．５Ｍ／ｍＬの密度で播種した。使用時、レンチウイルス培養補充物の終濃度は３．５％とし、亢進剤は４％、酪酸ナトリウムは５ｍＭとした。培養補充物はＥｘｐｉＣＨＯ（商標）−Ｆｅｅｄであり、レンチウイルス亢進剤は４．５３ ｍＭプロピオン酸ナトリウム、２．０ ｍＭ酪酸ナトリウム、および１．５ ｍＭカフェインとした。

簡潔にいえば、細胞をトランスフェクション当日に計数し、試料がそれを要求したときはいつでも、培養補充物を用いて最終的な２５．５ｍＬ系で希釈した。チューブＡ：トランスフェクション試薬（ＬＶＲまたはＬ２Ｋ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）のいずれか）を２．２５ｍＬのＧｉｂｃｏ（商標）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）に混合し、室温で５分間インキュベートした。チューブＢ：ＤＮＡ混合物（ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルス混合物４５μｇおよび３０μｇのｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＧＷ／ＧＦＰ）を別の２．２５ｍＬ Ｇｉｂｃｏ（商標）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）で希釈した。次いで、チューブＢをチューブＡに添加し、混合し、室温で１０分間インキュベートした。調製した細胞に最終混合物（およそ４．５ｍＬ）を添加した。試料中に要求された場合、トランスフェクション後１６時間に１．２ｍＬ（生産量の４％）の亢進剤を添加した。試料中に要求されたとき、酪酸ナトリウムをトランスフェクションの２４時間後に加えた。上清は、トランスフェクションの４８時間後であった回収し、力価を記載のように行った。

２９３Ｆ細胞におけるトランスフェクションでは、最終細胞密度は１Ｍ／ｍＬとした。総ＤＮＡ量を１μｇ／ｍＬに減らした（３０ｍＬ系用のＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルス混合物１８μｇおよび１２μｇのｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＧＷ／ＧＦＰ）。記載がない限り、トランスフェクションおよびウイルス回収手順はＬＶ２９３系におけるものと同じものとした。

図４Ａに示すように、本発明者らのレンチウイルス産生はその他の２つの系よりも優れている。

実施例５：第１のレンチウイルス産生プロトコル
レンチウイルス浮遊細胞の培養に関する次の指針に従った。細胞を標準的なレンチウイルス浮遊細胞培養プロトコルにより成長させた。細胞がおよそ４×１０⁶〜５×１０⁶個／ｍＬの生細胞密度に、典型的には３〜４日ごとに達したとき、細胞を継代培養した。約３または４日間の培養の後、細胞を０．３×１０⁶〜０．６×１０⁶個に分裂させた。毎日同じ時刻に毎日細胞を計数することによって細胞成長を監視した。細胞倍加時間は約２４時間であった。解凍日から２週間後、細胞はレンチウイルス産生の準備ができていた。細胞培養中、楕円軌道振盪器を１２５ｍＬ〜１Ｌの振盪フラスコに約１２５ｒｐｍで使用した。インキュベーターを約３７℃、約８％のＣＯ₂、および約７５〜８０％の湿度に設定した。使用前に培養培地を約３７℃の水浴中で加温した。

試薬および方法
・１２５ｍＬポリカーボネート、使い捨て、滅菌済み、Ｖｅｎｔ−ｕｐ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振盪フラスコ。
・１５ｍＬの滅菌コニカルチューブ。
・５０ｍＬの滅菌コニカルチューブ
・Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）Ｉ培地
・Ｌｅｎｔｉ発現（移入）ベクター：ｐＬＥＮＴＩ６．３／Ｖ５−ＧＷ−ＥｍＧＦＰ；
・レンチパッケージミックス：ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルスパッケージングミックス。
・レンチウイルス浮遊細胞
・レンチウイルス培養補充物
・レンチウイルストランスフェクション試薬
・レニットウイルス亢進剤
・（任意）ｐＨ調整用レンチウイルス安定化剤

例えば、細胞が金曜日の午前に０．６×１０⁶個／ｍＬの細胞数へ分裂する場合、細胞は１Ｌフラスコ中で約２５０ｍＬの培養培地で３日間培養され得る。例えば、月曜日の午前１０時ちょうどに、細胞を計数することによって細胞が調製され、約４．５×１０⁶個／ｍＬの細胞密度が予想され得る。新たに加温した培養培地で細胞を３．０×１０⁶個／ｍＬに希釈し、さらに３０時間培養し得る。

トランスフェクションは、例えば火曜日の午後４時ちょうどに実施され得る。細胞は、予想される約５．５〜６．０×１０⁶個／ｍＬで計数され得る。表９は、に追加のトランスフェクション指針を提供する。

火曜日の午後に、細胞をレンチウイルス補充物とともに播種した。３０ｍＬのトランスフェクションが選択された場合、１７．５ｍＬ中１０５×１０⁶細胞／ｍＬなどの高密度細胞を用いて実施することができる。３．５％のレンチウイルス培養補充物を添加したが、これは３０ｍＬのトランスフェクションで１．５ｍＬであろう。新鮮な加温培養培地を全容量２５．５ｍＬまで使用した（１．０５ｍＬのレンチウイルス培養補充物および１７．５ｍＬの細胞懸濁液を使用したため、６．９５ｍＬの新鮮培地）。総容積３０ｍＬを達成するための他の４．５ｍＬをＤＮＡ／試薬複合体から添加した。

ＤＮＡ／トランスフェクション試薬は次のように調製した。２本のチューブにはチューブ１およびチューブ２と標識した。チューブ１において：２．２５のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）Ｉ培地および１５０μＬのレンチウイルストランスフェクション試薬を混合し、室温で約５分間インキュベートした。チューブ２において：２．２５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）Ｉ培地を４５μｇ（μＬ）のＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルスパッケージングミックス（ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）１μｇ／μＬ）および３０μｇ（μＬ）のｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＧＷ／ＥｍＧＦＰプラスミド（ｐＬｅｎｔｉ発現ベクター１μｇ／μＬ）と混合した。チューブ１およびチューブ２は、チューブ２溶液をチューブ１へ混合しながら添加することによって組み合わせた。

プレートを室温で１０分間インキュベートした。インキュベーションの１０分後、調製した細胞に４．５ｍＬのＤＮＡ／試薬複合体を添加した。

翌日（水曜日の午前９時ちょうど）、１．２ｍＬのＬＶ亢進剤をフラスコに添加した。

トランスフェクションの４８時間後（木曜日の午後４時ちょうど）に、５０ｍＬの滅菌コニカルチューブにＬＶＶを採取し、室温で１０分間、３０００ｒｐｍで細胞をスピンダウンした。上清を回収し、３０００ｒｍｐで１０分間再度回転させた。上清を回収し、そして０．４５μＭフィルターでろ過した。

ウイルス回収後のｐＨ調整のために、回収した上清にレンチウイルス安定化剤を添加した。レンチウイルス安定化剤を、収集した上清の約１％として添加した（約３００μＬ）。一部の状況において、ウイルスを安定にするために産生系のｐＨを約５から８に調整した。

翌日の精製のためにレンチウイルスベクターを４℃で保存し、実施例６に記載のように、レンチウイルスベクターの連続希釈でＨｔ１０８０細胞を感染させることによってウイルス力価を測定した。

実施例６：実施例５の産生からのレンチウイルス力価（ＧＦＰ＋）の測定
レンチウイルス力価（ＧＦＰ＋）の測定は次のようにして行った。

材料：
・レンチウイルス：細胞上清または濃縮レンチウイルスベクターを集める。
・細胞株：ＨＴ１０８０、
・培養培地Ｇｉｂｃｏ（商標）ＤＭＥＭ高グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補充物、ピルビン酸＋１０％ＦＢＳ、
・Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標）（原液）：滅菌Ｈ₂Ｏ中の１００ｍｇ／ｍＬ（フィッシャーサイエンティフィックＮＣＯ６６３３９１）、および
・希釈用のＣｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェル丸底プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ０５５３９２００）。

１日後（午前）に、本発明者らは、高処理量フロー分析のために９６ウェルプレートフォーマットを用いてレンチウイルス力価の測定を開始した。午前１１時ちょうどに、１００μＬの培地中に７０００個／ウェルの密度でＨＴ１０８０細胞を含む９６ウェルプレートに播種した（感染時に約３０％コンフルエント）。

午後４時ちょうどに、次のようにして新鮮なウイルス希釈液を調製した。（Ａ）本発明者らは、１５ｍＬの新鮮な培養培地と１２μＬの１０ｍｇ／ｍＬ Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）（終濃度８μｇ／ｍＬ）を組み合わせた。十分にボルテックスして組み合わせた。（Ｂ）ウイルス試料あたり、（Ａ）で調製した１３５μＬの培地を９６ウェル丸底プレートの１６ウェルに４ウェル×４ウェルパターンで添加した（図６を参照されたい）。（Ｃ）第１列の各ウェルに１５μＬのレンチウイルス上清の１つの試料（または濃縮ウイルス一定分量）を添加した（各ウェル中の総容量１５０μＬ）。（Ｄ）ピペットを用いてよく混合した（１：１０）。（Ｅ）１５μＬを第１行から第２行に移して十分に混合し（１：１００）、１５μＬを第２行から第３行に移して十分に混合する（１：１０００）ことによって第１行の連続希釈（利用可能な場合、多重チャネルピペットを使用）を行い、１５μＬを第３行を第４行まで移し、十分に混合する（１：１０，０００）。ウイルスが濃縮されている場合は、さらに希釈する必要があり得る。

細胞を感染させるために、ＨＴ１０８０細胞から播種培地を除去し、１００μＬの調製された希釈液を対応する各ウェルに移すことによって感染させた（利用可能な場合、多重チャネルピペットを使用）。９６ウェル感染細胞プレートを２０００ｒｐｍで室温で３０分間回転させ、感染細胞プレートを一晩インキュベートした。

２日後（午前）に、ウイルスを含有する培地を除去し、新鮮なＨＴ１０８０培地（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）なし）と交換し、さらに３日間細胞をインキュベートし、ＧＦＰ陽性細胞の％を分析した（フローサイトメトリー分析を使用してもよい）。

ＴＵ／ｍＬの単位で力価を計算するために、本発明者らは％ＧＦＰ陽性に基づいて使用するのに適切な希釈係数を決定した。１〜２０％の所望の感染範囲を使用した。

力価は次の式から計算した。
力価＝［Ｆ＊Ｃ／Ｖ］＊Ｄ
Ｆ＝ＧＦＰ＋細胞の頻度（％ＧＦＰ＋細胞／１００）
Ｃ＝形質導入時のウェルあたりの細胞数（７０００細胞）
Ｖ＝接種量（ｍＬ）（０．１ｍＬ）
Ｄ＝レンチウイルス希釈係数。

９６ウェルプロトコルを用いて、次の計算を行った（表１０を参照されたい）。

％ＥｍＧＦＰ陽性細胞値が所望の１〜２０％の範囲内に収まるので、１０⁴を計算のために選択した。
Ｆ＝１８／１００
Ｃ＝７０００
Ｖ＝０．１
Ｄ＝１０⁴
力価＝（０．１８×７０００／０．１）×１０⁴＝１．２６×１０⁸ＴＵ／ｍＬ

等価物
上述の明細書は、当業者が実施形態を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。上述の説明および実施例は特定の実施形態を詳述し、本発明者らによって企図される最良の様式を説明する。しかしながら、上述の内容がいかに詳述されていても、実施形態は多くの方法で実施され得、添付の特許請求の範囲およびその等価物に従って解釈されるべきである。

本明細書で使用する場合、約という用語は、明示的に示されているかどうかにかかわらず、例えば整数、分数、および百分率を含む数値を指す。約という用語は、一般に、当業者が、列挙された値と等価である（例えば、同じ関数または結果を有する）と考えるであろう数値範囲（例えば、列挙された範囲の±５〜１０％）を指す。少なくともおよび約のような用語が数値または範囲のリストに先行する場合、この用語はリストに提供されているすべての値または範囲を変更する。一部の場合、約という用語は最も近い有効数字に丸められる数値を含むことがある。

Claims (59)

1. レンチウイルスベクター産生系であって、
   ａ．細胞成長を制御するためのレンチウイルス培養補充物と、
   ｂ．カチオン性脂質、ならびに少なくとも１つのヘルパー脂質および／または中性脂質を含む、脂質集合体と、
   ｃ．プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびカフェインを含む、レンチウイルス産生亢進剤と、を含み、
   無血清である、前記レンチウイルスベクター産生系。
2. 前記カチオン性脂質がＤＨＤＭＳを含む、請求項１に記載のレンチウイルス産生系。
3. 前記少なくとも１つのヘルパー脂質および／または中性脂質がＤＯＰＥを含む、請求項１に記載のレンチウイルス産生系。
4. 前記少なくとも１つのヘルパー脂質および／または中性脂質が、ＤＯＰＥとコレステロールとを含む、請求項１に記載のレンチウイルス産生系。
5. ２９３細胞におけるレンチウイルスの産生のために設計されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
6. 前記２９３細胞が浮遊培養におけるガウンである、請求項５に記載のレンチウイルスベクター産生系。
7. 前記２９３細胞が２９３Ｆ細胞またはその誘導体である、請求項５または６に記載のレンチウイルスベクター産生系。
8. 前記２９３Ｆ細胞、またはそれに由来する細胞が、５日後以降の細胞死が２０％未満で、約１×１０⁶〜約２０×１０⁶の密度で成長することができる、請求項７に記載のレンチウイルスベクター産生系。
9. 前記レンチウイルス培養補充物が、
   ａ．アミノ酸および／またはジペプチドと、糖源、糖アルコール、および／または炭素源と、を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
10. 前記レンチウイルス培養補充物がアミノ酸とグルコースとを含む、請求項７に記載のレンチウイルスベクター産生系。
11. 前記レンチウイルス培養補充物が、
    ａ．鉱物および／または微量金属、および／または
    ｂ．ビタミンおよび／またはビタミン前駆体、
    を含む、請求項９または１０のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
12. 前記レンチウイルス培養補充物が、Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン二量体と、Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン二水和物と、Ｄ−グルコースと、グリシンと、Ｌ−アラニンと、Ｌ−アルギニンと、Ｌ−アスパラギンと、Ｌ−アスパラギン酸と、Ｌ−グルタミン酸と、Ｌ−ヒスチジンと、Ｌ−ヒドロキシプロリンと、Ｌ−イソロイシンと、Ｌ−ロイシンと、Ｌ−リジンと、Ｌ−メチオニンと、Ｌ−フェニルアラニンと、Ｌ−プロリンと、Ｌ−セリンと、Ｌ−スレオニンと、Ｌ−トリプトファンと、Ｌ−バリンと、を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
13. 前記レンチウイルス培養補充物が、約１％〜約１０％で添加される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
14. 前記レンチウイルス培養補充物が、約１％、３．５％、５％、または１０％で添加される、請求項１３に記載のレンチウイルスベクター産生系。
15. 前記レンチウイルス培養補充物が、約３．５％で添加される、請求項１４に記載のレンチウイルスベクター産生系。
16. 前記レンチウイルス培養補充物中の前記グルコースの浸透圧が、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約６５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約６２５ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
17. 前記レンチウイルス培養補充物中の前記グルコースの濃度が、約８５ｍｇ／ｍｌ〜約１１５ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ〜約１１０ｍｇ／ｍｌ、約９５ｍｇ／ｍｌ〜約１０５ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
18. 前記レンチウイルス培養補充物が、約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、またはそれらの間の任意の浸透圧もしくは範囲を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
19. 前記レンチウイルス培養補充物が、約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
20. 前記ＤＨＤＭＳが約０．４〜０．６ｍＭで含まれる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
21. ＤＯＰＥが約０．２〜０．５ｍＭ／ｍＬで含まれる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
22. コレステロールが０．１〜０．６ｍＭ／ｍＬで含まれる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
23. 唯一のヘルパーおよび／または中性脂質がＤＯＰＥである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
24. ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥのモル比が、合計１．０になり、かつ約０．６：０．４〜０．７：０．３の範囲である、請求項２３に記載のレンチウイルスベクター産生系。
25. ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥのモル比が、合計１．０になり、かつ約０．６２５：０．３７５〜０．６７５：０．３２５の範囲である、請求項２３に記載のレンチウイルスベクター産生系。
26. ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥのモル比が、合計１．０になり、約０．６：０．４〜０．６２５：０．３７５の範囲である、請求項２３に記載のレンチウイルスベクター産生系。
27. ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥ：コレステロールのモル比が合計１．０になり、前記ＤＨＤＭＳモル比が約０．４〜０．６の範囲であり、前記ＤＯＰＥモル比が約０．２〜０．５の範囲であり、前記コレステロールモル比が約０．１〜０．６の範囲である請求項１〜２２のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
28. ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥ：コレステロールのモル比が、表２、４または５から選択される、請求項１〜２２または２５のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
29. ＤＨＤＭＳ：ＤＯＰＥ：コレステロールのモル比が、表４からの実行番号１×Ｒ３、１×Ｒ４、１×Ｒ６、１×Ｒ７、１×Ｒ９、１×Ｒ１０、１×Ｒ１１、１×Ｒ１２、または表５からの２×ｂＲ１３もしくは２×ｂＲ１４から選択される、請求項１〜２２、２５または２６のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
30. 前記レンチウイルス亢進剤がバルプロ酸を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
31. プロピオン酸ナトリウムおよび／または酪酸ナトリウムが水溶液として提供される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
32. カフェインがレンチウイルス発現培地中で提供される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
33. プロピオン酸ナトリウムが約３〜１５ｍＭで含まれる、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
34. プロピオン酸ナトリウムが約３〜５ｍＭで含まれる、請求項３３に記載のレンチウイルスベクター産生系。
35. プロピオン酸ナトリウムが約５〜約８ｍＭで含まれる、請求項３３に記載のレンチウイルスベクター産生系。
36. 酪酸ナトリウムが約１．５〜３ｍＭで含まれる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
37. 酪酸ナトリウムが約１．５〜２．５ｍＭで含まれる、請求項３６に記載のレンチウイルスベクター産生系。
38. 酪酸ナトリウムが約２．５ｍＭ〜３ｍＭで含まれる、請求項３６に記載のレンチウイルスベクター産生系。
39. カフェインが約０．７５〜３ｍＭで含まれる、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
40. カフェインが約２〜３ｍＭで含まれる、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
41. カフェインが約１〜２ｍＭで含まれる、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
42. バルプロ酸が約０．５〜１ｍＭで含まれる、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
43. 前記レンチウイルス産生亢進剤成分の量が、表３、表６、または表７における量のいずれかから選択される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系。
44. 前記亢進剤成分の量が、表６中の実行１×Ｒ５、１×Ｒ６、１×Ｒ１３、１×Ｒ１４、１×Ｒ１５、１×Ｒ１６、１×Ｒ１７、１×Ｒ１８、１×Ｒ１９、１×Ｒ２２、１×Ｒ２６、１×Ｒ２７、１×Ｒ２９、１×Ｒ３０、または１×Ｒ３１における量のいずれかから選択される、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター生産系。
45. 請求項１〜４４のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター産生系を使用することを含む、レンチウイルスベクター産生のための方法。
46. レンチウイルスベクター産生のための方法であって、
    ａ．無血清培地中で真核細胞を培養することと、
    ｂ．細胞成長を制御するためにレンチウイルス培養補充物を提供することと、
    ｃ．トランスフェクション効率を高めるために、ＤＨＤＭＳと、ＤＯＰＥと、コレステロールとを含むトランスフェクション試薬を用いて、前記細胞をレンチウイルスベクターでトランスフェクトすることと、
    ｄ．レンチウイルス産生を促進することができる、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびカフェインを含む、レンチウイルス産生増強剤を提供することと、
    を含む、方法。
47. 前記培養真核細胞が、高密度条件下での成長に適応した浮遊培養物中にある、請求項４５〜４６のいずれか１項に記載の方法。
48. 前記細胞が、少なくとも１×１０⁶個／ｍＬの細胞密度を有する浮遊細胞培養物中で成長する、請求項４７に記載の方法。
49. 前記細胞が、少なくとも１０×１０⁶個／ｍＬの細胞密度を有する浮遊細胞培養物中で成長する、請求項４７に記載の方法。
50. 前記細胞が、少なくとも２０×１０⁶個／ｍＬの密度を有する浮遊細胞培養物中で成長する、請求項４７に記載の方法。
51. 前記方法が、２９３細胞または２９３細胞の誘導体の培養のためである、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
52. 前記方法が、２９３Ｆ細胞または２９３Ｆ細胞の誘導体の培養のためである、請求項５１に記載の方法。
53. 前記レンチウイルス培養補充物が、請求項７〜１７のいずれか１項に従う、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
54. 前記トランスフェクション試薬が、請求項２〜４または２０〜２９のいずれか１項に従う、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
55. 前記レンチウイルス産生増強剤が、請求項３０〜４４のいずれか１項に従う、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
56. 前記レンチウイルス培養補充物が、細胞培養培地中の細胞播種の２４〜３６時間後に添加される、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
57. 前記方法により、約２．５×１０⁸ＴＵ／ｍｌの非濃縮レンチウイルスベクターを産生することができる、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
58. 前記浮遊細胞培養物の容積が、約１０ｍＬ〜約５Ｌである、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
59. 細胞生存度が、５日後以降に少なくとも８０％である、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。

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