CN109929877A - Hmgcr基因在提高lv包装效率和感染力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及HMGCR(3‑hydroxy‑3‑methylglutaryl‑CoA reductase,3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶1)基因在提高慢病毒的滴度和感染力中的应用。本发明公开了一种HMGCR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，另外还公开了一种包括所述HMGCR基因的真核表达载体。本发明通过将pcDNA4‑HMGCR载体与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞，能够在明显提高细胞生产的慢病毒的能力的同时大大提高了慢病毒的滴度和感染力，为基础研究和临床应用领域提供了一种新型的大规模高感染力的慢病毒包装方法。并且本发明具有操作步骤简单、成本低廉及非动物源性生产等特点。

Description

HMGCR基因在提高LV包装效率和感染力中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及HMGCR基因在提高LV包装效率和感染力中的应用。

背景技术

慢病毒(Lenti virus，LV)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体，基因组为RNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。慢病毒具有宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中。然而，目前LV生产的滴度仍然较低，临床级LV的大规模生产仍然是一项挑战，并限制了慢病毒在疾病治疗中的应用。

293T细胞是HEK-293(人胚肾细胞)细胞株插入了SV40T-antigen的温度敏感基因形成的高转染效率衍生株。

近年来，通过对慢病毒生产过程的多个步骤进行优化(例如，转染条件，质粒比例，细胞培养条件等)以提高病毒生产力(Ansorge S,et al.,2010)。有研究表明，病毒生产细胞的培养基中脂质含量，尤其是胆固醇含量可以极大地影响HIV-1感染和复制(Ono A,etal.,2007)。在LV生产期间培养基中补充胆固醇有利于病毒颗粒的出芽并增加其感染性(Chen Y,et al.,2009)。然而，在甲基-β-环糊精(胆固醇补充剂的组分之一)的存在下，会产生一定的细胞毒性。此外，细胞培养中使用的胆固醇通常来自动物来源，不符合cGMP要求。

将胆固醇直接添加到培养基中的替代方案是通过在LV生产细胞中过表达关键的胆固醇合成酶：3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1(HMGCR)来从源头上增加LV生产细胞中的胆固醇生物合成。HMGCR催化HMG-CoA还原为辅酶A和甲羟戊酸，这是胆固醇生物合成途径中的一个限速步骤(Sharpe LJ,et al.,2013)。因此，过表达HMGCR有助于提高293T细胞生产LV的效率，并增加生产的LV的感染能力。

参考文献：

Ansorge S,Henry O,Kamen A.Recent progress in lentiviral vector massproduction.Biochem Eng J 2010；48:362-377.

Ono A,Waheed AA,Freed EO.Depletion of cellular cholesterol inhibitsmembrane binding and higher-order multimerization of human immunodeficiencyvirus type 1Gag.Virology 2007；360:27-35.

Chen Y,Ott CJ,Townsend K et al.Cholesterol supplementation duringproduction increases the infectivity of retroviral and lentiviral vectorspseudotyped with the vesicular stomatitis virus glycoprotein(VSV-G).BiochemEng J 2009；44:199-207.

Sharpe LJ,Brown AJ.Controlling cholesterol synthesis beyond 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase(HMGCR).J Biol Chem 2013；288:18707-18715.

发明内容

为了更好的提高细胞产LV的效率，本研究将HMGCR基因构建到真核表达载体pcDNA4-Myc-6His中，得到pcDNA4-HMGCR，最终将得到的pcDNA4-HMGCR与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞，从而在LV生产的过程中过表达HMGCR，以增加LV的产量。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种HMGCR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

应该理解，在保持功能不变的情况下，与上述序列(及本发明中的其他序列)具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列也在本发明的保护范围之内。所述的序列的差异由碱基的取代、缺失或添加所致，本领域技术人员有能力，例如通过非保守碱基的替换，获得功能相似的序列，这样的序列在本发明的保护范围之内。

本发明第二个方面公开了一种真核表达载体，包括权利要求1所述的HMGCR基因。

优选的，所述真核表达载体包括CMV启动子和Zeocin(博来霉素)筛选标记。

应该理解，在不改变功能的情况下，可以对真核表达载体其中一个或多个成分进行替换，例如可以选择除Zeocin之外的其他合适的筛选标记，而不超出本发明的保护范围。

优选的，所述真核表达载体的骨架载体为pcDNA4-Myc-6His。

应当理解，本发明并不限于骨架载体pcDNA4-Myc-6His，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适骨架载体来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。

本发明第三个方面公开了一种试剂盒，包括上述的HMGCR基因或上述的真核表达载体。

本发明第五个方面公开了上述的HMGCR基因、上述的真核表达载体或上述的试剂盒在提高慢病毒包装效率和感染力中的应用。

本发明第六个方面公开了一种构建上述的真核表达载体的方法，包括以下步骤：

S1：合成如权利要求1所述的HMGCR基因；

S2：将HMGCR基因和骨架载体酶切后连接；

S3：将连接后的质粒转化至感受态细胞中，进行扩大培养后抽取质粒；

S4：将抽取得到的质粒进行测序鉴定。

在本发明的一个实施例中，在S1中，首先在NCBI数据库查找NM_000859的基因序列，然后在该序列的上下游分别设计酶切位点，优选地，在上游设计Apa I酶切位点，在下游设计Pme I酶切位点，人工合成该序列。

在本发明的一个实施例中，在S2中，使用Apa I和Pme I酶切骨架载体和HMGCR基因。具体的，所述骨架载体为pcDNA4-Myc-6His质粒，酶切反应体系包括：pcDNA4-Myc-6His质粒或者HMGCR基因2μl、Apa I 1μl、Pme I 1μl、10×Cutsmart(NEB)5μl，用水补足至50μl。37℃下酶切2h后进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用刀片将大片段切下并进行回收纯化。将纯化产物通过T4-DNA酶连接，酶连反应体系包括：pcDNA4(100μM)1μl、HMGCR(100μM)1μl、10×T4连接缓冲液(NEB)1μl、T4PNK(NEB)0.5μl，用水补足至10μl。

优选的，在S3中，所述感受态细胞为感受态细胞DH5α。具体的，将连接后的质粒转化至感受态细胞DH5α中，均匀涂至LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。挑取单个菌落进行扩大培养后抽取质粒。

优选的，在S4中，测序鉴定的引物包括：

上游测序引物CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(SEQ ID NO:2)；

下游测序引物BGH：5’-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’(SEQ ID NO:3)。

经过测序鉴定，构建成功的质粒命名为pcDNA4-HMGCR。

本发明第七个方面公开了一种提高慢病毒滴度的方法，包括以下步骤：

S1：将上述的真核表达载体与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞；

S2：收集慢病毒原液并检测其滴度。

优选的，所述慢病毒包装系统质粒包括pLenti-CMV-mCherry-3FLAG-PGK-Puro、psPAX2和pHCMV-VSV-G。

更优选的，所述pLenti-CMV-mCherry-3FLAG-PGK-Puro、psPAX2和pHCMV-VSV-G的质量比例为(1:1:1)-(1:1:2)。

在本发明的一个实施例中，pcDNA4-HMGCR：pLenti-CMV-mCherry-3FLAG-PGK-Puro：psPAX2：pHCMV-VSV-G：转染试剂(lipofectmine 2000)＝1ug：1ug：1ug：1ug：8ul。具体的，将稀释好的真核表达载体、慢病毒包装系统质粒和转染试剂在常温下孵育5min；然后将它们混匀得到混合液，在常温下孵育20min；将细胞培养板中的培养基弃上清，把残液吸干净，加入新鲜不含双抗的培养基；将混合液加入培养板中；转染6小时后，更换新鲜完全培养基；继续培养48小时后，显微镜下观察荧光，并且收集细胞上清液测慢病毒滴度。

本发明第八个方面公开了一种提高慢病毒感染力的方法，包括以下步骤：

S1：将上述的真核表达载体与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞；

S2：收集慢病毒原液并进行浓缩纯化；

S3：将浓缩纯化后的慢病毒原液感染细胞。

在S3中，感染细胞之后，可以通过计算MOI值(感染复数)评价慢病毒的感染力。

优选的，所述细胞为哺乳动物细胞，更优选地，所述细胞为人胚肾细胞株，最佳的，所述细胞为293T细胞。

应当理解，在本发明的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的细胞种类，并且本发明的保护范围之内。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

本发明通过将pcDNA4-HMGCR载体与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞，能够在明显提高细胞生产的慢病毒的能力的同时大大提高了慢病毒的滴度和感染力，为基础研究和临床应用领域提供了一种新型的大规模高感染力的慢病毒包装方法。并且本发明具有操作步骤简单、成本低廉及非动物源性生产等特点。

附图说明

图1为本发明实施例中使用的骨架载体pcDNA4-Myc-6His的质粒图谱；

图2为本发明实施例中使用的慢病毒载体质粒pLenti-CMV-mCherry-3FLAG-PGK-Puro的质粒图谱；

图3为本发明实施例中使用的慢病毒包装辅助质粒psPAX2的质粒图谱；

图4为本发明实施例中使用的慢病毒包装辅助质粒pHCMV-VSV-G的质粒图谱；

图5为本发明实施例2中未加入转染试剂之前的293T细胞在显微镜下的照片(图中左图为对照组，右图为实验组)；

图6为本发明实施例2中293T细胞转染后的mCherry荧光表达照片(图中左图为对照组，右图为实验组)；

图7为本发明实施例3中LV感染后293T细胞在显微镜下的照片，感染复数(MOI)为1(图中左图为对照组，右图为实验组)；

图8为本发明实施例3中LV感染后293T细胞的mCherry荧光表达照片，感染复数(MOI)为10(图中左图为对照组，右图为实验组)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的主要试验步骤如下：

一、一种构建真核表达载体的方法，包括以下步骤：

S1：合成HMGCR基因；

S2：将HMGCR基因和骨架载体酶切后连接；

S3：将连接后的质粒转化至感受态细胞中，进行扩大培养后抽取质粒；

S4：将抽取得到的质粒进行测序鉴定。

二、一种提高慢病毒滴度的方法，包括以下步骤：

S1：将真核表达载体与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞；

S2：收集慢病毒原液并检测其滴度。

三、一种提高慢病毒感染力的方法，包括以下步骤：

S1：将真核表达载体与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞；

S2：收集慢病毒原液并进行浓缩纯化；

S3：将浓缩纯化后的慢病毒原液感染细胞。

实施例1pcDNA4-HMGCR重组过表达载体构建

本实施例公开了一种pcDNA4-HMGCR重组过表达载体的构建方法，具体包括以下步骤：

1.1 HMGCR基因序列合成

在NCBI数据库查找NM_000859的基因序列，人工合成该序列，并在序列上游设计Apa I酶切位点，下游设计Pme I酶切位点得到HMGCR基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

1.2载体构建

1.2.1使用Apa I和Pme I分别酶切pcDNA4-Myc-6His质粒(质粒图谱如图1所示)和合成的HMGCR DNA，在37℃下酶切2h后进行琼脂糖凝胶电泳，酶切体系如下：

2μg(2μl)	pcDNA4-Myc-6His或HMGCR DNA
		1μl	Apa I
1μl	Pme I
		5μl	10×Cutsmart
41μl	ddH<sub>2</sub>O
		50μl	合计

1.2.2使用捷瑞胶回收试剂盒(GK2043-200)纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作。

1.2.3将酶切后的产物连接

使用T4酶进行连接，室温下反应10min，酶连体系如下：

1.2.4将连接后的质粒转化至感受态细胞DH5α中，均匀涂至LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。

1.3挑取单个菌落扩大培养并质粒小提。

1.4测序鉴定质粒构建成功，并命名为pcDNA4-HMGCR。其中测序引物的名称以及序列如表1所示。

表1测序引物名称及序列

引物名称	引物序列
		上游测序引物CMV-F	CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG(SEQ ID NO:2)
下游测序引物BGH	TAGAAGGCACAGTCGAGG(SEQ ID NO:3)

实施例2

本实施例提供了一种提高慢病毒滴度的方法，包括以下步骤：

1.1将293T细胞(购于美国ATCC细胞库)接种于细胞培养板上。

1.2待细胞汇合度达80％的时候进行转染试验；具体步骤为：

1.2.1配制DNA和转染试剂：

当细胞培养板为6孔板时，每孔比例为质粒pcDNA4-HMGCR(过表达孔)或PBS(对照孔)：pLenti-CMV-mCherry-3FLAG-PGK-Puro：psPAX2：pHCMV-VSV-G：转染试剂(lipofectmine 2000)＝1ug：1ug：1ug：1ug：8ul。其中，慢病毒载体质粒pLenti-CMV-mCherry-3FLAG-PGK-Puro、病毒包装辅助质粒psPAX2和慢病毒包装辅助质粒pHCMV-VSV-G的质粒图谱分别如图2-图4所示。

1.2.2转染

1.2.2.1将稀释好的DNA及转染试剂常温孵育5min；然后将稀释好的DNA和转染试剂混匀，常温孵育20min得到混合液；

1.2.2.2将孔板中的培养基弃上清，把残液吸干净，加入新鲜不含双抗的培养基，细胞的图片如图5所示；将混合液滴加于孔中；转染6小时后，更换新鲜完全培养基；

1.2.2.3继续培养至48小时后，显微镜下观察荧光，结果如图6所示，收集上清测滴度，结果如表2所示。

表2病毒滴度测试结果

从图6中可以看出，实验组的荧光效果明显强于对照组，说明实验组的慢病毒包装效率更高。从表1可以得出实验组是对照组的病毒滴度的1.23倍，即通过将pcDNA4-HMGCR载体与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞，能够明显提高细胞生产的慢病毒的滴度。

实施例3

本实施例提供了一种提高慢病毒感染力的方法，其中，实验组的步骤如下：

S1：将真核表达载体与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞；

S2：收集慢病毒原液并进行浓缩纯化；

S3：将浓缩纯化后的慢病毒原液感染细胞。

术语解释：

MOI值(Multiplicity Of Infection，感染复数)通常有两种含义：1)指平均每个细胞感染病毒的活性单位数；2)以病毒颗粒或基因组数表示病毒数量，如v.p.或v.g.，这时MOI的含义是指平均每个细胞感染病毒的病毒颗粒或基因组数。

病毒加量的计算公式：(细胞数×MOI值/病毒原液滴度)×10³＝病毒加量(ul)

对照组与实验组的唯一差别在于，在S1中，使用同等质量的PBS代替真核表达载体pcDNA4-HMGCR，将PBS与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞。

具体的，首先将293T接种于24孔的细胞培养板中，待细胞汇合度达70％的时候进行感染试验；安排MOI值为1和10进行感染实验，感染24小时后，更换新鲜完全培养液；继续培养至48h后，显微镜下观察荧光。其中图7为MOI＝1的感染图片(左图为对照组，右图为实验组)，图8为MOI＝10的感染图片(左图为对照组，右图为实验组)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 和元生物技术（上海）股份有限公司

<120> HMGCR基因在提高LV包装效率和感染力中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2667

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgttgtcaa gactttttcg aatgcatggc ctctttgtgg cctcccatcc ctgggaagtc 60

atagtgggga cagtgacact gaccatctgc atgatgtcca tgaacatgtt tactggtaac 120

aataagatct gtggttggaa ttatgaatgt ccaaagtttg aagaggatgt tttgagcagt 180

gacattataa ttctgacaat aacacgatgc atagccatcc tgtatattta cttccagttc 240

cagaatttac gtcaacttgg atcaaaatat attttgggta ttgctggcct tttcacaatt 300

ttctcaagtt ttgtattcag tacagttgtc attcacttct tagacaaaga attgacaggc 360

ttgaatgaag ctttgccctt tttcctactt ttgattgacc tttccagagc aagcacatta 420

gcaaagtttg ccctcagttc caactcacag gatgaagtaa gggaaaatat tgctcgtgga 480

atggcaattt taggtcctac gtttaccctc gatgctcttg ttgaatgtct tgtgattgga 540

gttggtacca tgtcaggggt acgtcagctt gaaattatgt gctgctttgg ctgcatgtca 600

gttcttgcca actacttcgt gttcatgact ttcttcccag cttgtgtgtc cttggtatta 660

gagctttctc gggaaagccg cgagggtcgt ccaatttggc agctcagcca ttttgcccga 720

gttttagaag aagaagaaaa taagccgaat cctgtaactc agagggtcaa gatgattatg 780

tctctaggct tggttcttgt tcatgctcac agtcgctgga tagctgatcc ttctcctcaa 840

aacagtacag cagatacttc taaggtttca ttaggactgg atgaaaatgt gtccaagaga 900

attgaaccaa gtgtttccct ctggcagttt tatctctcta aaatgatcag catggatatt 960

gaacaagtta ttaccctaag tttagctctc cttctggctg tcaagtacat cttctttgaa 1020

caaacagaga cagaatctac actctcatta aaaaacccta tcacatctcc tgtagtgaca 1080

caaaagaaag tcccagacaa ttgttgtaga cgtgaaccta tgctggtcag aaataaccag 1140

aaatgtgatt cagtagagga agagacaggg ataaaccgag aaagaaaagt tgaggttata 1200

aaacccttag tggctgaaac agatacccca aacagagcta catttgtggt tggtaactcc 1260

tccttactcg atacttcatc agtactggtg acacaggaac ctgaaattga acttcccagg 1320

gaacctcggc ctaatgaaga atgtctacag atacttggga atgcagagaa aggtgcaaaa 1380

ttccttagtg atgctgagat catccagtta gtcaatgcta agcatatccc agcctacaag 1440

ttggaaactc tgatggaaac tcatgagcgt ggtgtatcta ttcgccgaca gttactttcc 1500

aagaagcttt cagaaccttc ttctctccag tacctacctt acagggatta taattactcc 1560

ttggtgatgg gagcttgttg tgagaatgtt attggatata tgcccatccc tgttggagtg 1620

gcaggacccc tttgcttaga tgaaaaagaa tttcaggttc caatggcaac aacagaaggt 1680

tgtcttgtgg ccagcaccaa tagaggctgc agagcaatag gtcttggtgg aggtgccagc 1740

agccgagtcc ttgcagatgg gatgactcgt ggcccagttg tgcgtcttcc acgtgcttgt 1800

gactctgcag aagtgaaagc ctggctcgaa acatctgaag ggttcgcagt gataaaggag 1860

gcatttgaca gcactagcag atttgcacgt ctacagaaac ttcatacaag tatagctgga 1920

cgcaaccttt atatccgttt ccagtccagg tcaggggatg ccatggggat gaacatgatt 1980

tcaaagggta cagagaaagc actttcaaaa cttcacgagt atttccctga aatgcagatt 2040

ctagccgtta gtggtaacta ttgtactgac aagaaacctg ctgctataaa ttggatagag 2100

ggaagaggaa aatctgttgt ttgtgaagct gtcattccag ccaaggttgt cagagaagta 2160

ttaaagacta ccacagaggc tatgattgag gtcaacatta acaagaattt agtgggctct 2220

gccatggctg ggagcatagg aggctacaac gcccatgcag caaacattgt caccgccatc 2280

tacattgcct gtggacagga tgcagcacag aatgttggta gttcaaactg tattacttta 2340

atggaagcaa gtggtcccac aaatgaagat ttatatatca gctgcaccat gccatctata 2400

gagataggaa cggtgggtgg tgggaccaac ctactacctc agcaagcctg tttgcagatg 2460

ctaggtgttc aaggagcatg caaagataat cctggggaaa atgcccggca gcttgcccga 2520

attgtgtgtg ggaccgtaat ggctggggaa ttgtcactta tggcagcatt ggcagcagga 2580

catcttgtca aaagtcacat gattcacaac aggtcgaaga tcaatttaca agacctccaa 2640

ggagcttgca ccaagaagac agcctga 2667

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcaaatggg cggtaggcgt g 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagaaggcac agtcgagg 18

Claims (12)

1.一种真核表达载体，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的HMGCR基因。

2.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于，所述真核表达载体包括CMV启动子和Zeocin筛选标记。

3.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于，所述真核表达载体的骨架载体为pcDNA4-Myc-6His。

4.一种试剂盒，包括权利要求1-3中任意一项所述的真核表达载体。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的真核表达载体或权利要求4所述的试剂盒在提高慢病毒的包装效率和感染力中的应用。

6.一种构建权利要求1-3中任意一项所述的真核表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：合成如权利要求1所述的HMGCR基因；

S2：将HMGCR基因和骨架载体酶切后连接；

S3：将连接后的质粒转化至感受态细胞中，进行扩大培养后抽取质粒；

S4：将抽取得到的质粒进行测序鉴定。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在S2中，使用Apa I和Pme I酶切骨架载体和HMGCR基因。

8.一种提高慢病毒滴度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将权利要求1-3中任意一项所述的真核表达载体与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞；

S2：收集慢病毒原液并检测其滴度。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述慢病毒包装系统质粒包括pLenti-CMV-mCherry-3FLAG-PGK-Puro、psPAX2和pHCMV-VSV-G。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述pLenti-CMV-mCherry-3FLAG-PGK-Puro、psPAX2和pHCMV-VSV-G的质量比例为(1:1:1)-(1:1:2)。

11.一种提高慢病毒感染力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将权利要求1-3中任意一项所述的真核表达载体与慢病毒包装系统质粒共同转染细胞；

S2：收集慢病毒原液并进行浓缩纯化；

S3：将浓缩纯化后的慢病毒原液感染细胞。

12.根据权利要求8-10所述的方法或者权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细胞为293T细胞。