CN106170552A - 基于非整合型慢病毒载体的稳定附加体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及非整合型慢病毒载体及其用于分裂和非分裂真核细胞的稳定转基因的用途。本发明还提供了获得这些载体的方法，这些载体用于产生重组慢病毒的用途，以及这些重组慢病毒用于获得能够稳定产生感兴趣产物的细胞的用途。

Description

基于非整合型慢病毒载体的稳定附加体

技术领域

本发明属于真核细胞转基因领域，更具体地，涉及基于非整合型慢病毒载体的附加体及其用于建立稳定表达感兴趣的异源基因的细胞系的用途。

背景技术

整合酶缺陷型慢病毒(IDLV)是在病毒整合酶的催化结构域中包含突变的非复制型慢病毒。因此，名为1-LTR和2-LTR的逆转录环状cDNA外产物(off-product)在细胞核中聚积，但是不能整合到宿主基因组中(图1)(RJ et al.,Nat.Med.2006,12:348–353)。作为任何其他外源性DNA，那些中间体能够以相同频率整合到细胞内的DNA(10³至10⁵/细胞)中。

源自IDLV的cDNA的染色体外(附加体)特性已被避免典型慢病毒的一些不利缺点。附加型载体展示了对细胞基因组最小程度的干扰，因此最小化了由病毒传递的转基因的位置依赖性表达谱以及因插入突变造成的潜在伤害。尽管早期热衷获得这些新型载体，但是主要问题是源于它们不能自主复制。然后，连续的细胞分裂通过稀释带有附加体的细胞，导致慢病毒载体序列消失，从而将它们的适用性限制于一组作为神经系统的很窄的低至没有核分裂能力的组织和细胞。由此得出结论，基于这些载体的基因疗法受限于具有非常低的细胞分裂速率的靶标衰老组织或细胞，以确保由转基因驱动矫正的表型的持久性。不幸的是，许多潜在的通过基因疗法可治疗的疾病依赖于进行生命细胞分裂的修饰高度分裂的细胞或组织(如造血或上皮干细胞)以及基于干/iPS细胞的不是这些载体靶标的治疗。

发明内容

在第一方面，本发明涉及一种多核苷酸，其包括

(i)源自慢病毒的第一长末端重复序列，

(ii)真核复制起点，其选自具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3序列及其功能等价变体的复制起点组成的群组，

(iii)支架/基质结合区(scaffold/matrix attachment region)，其选自具有SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6序列及其功能等价变体的支架/基质结合区组成的群组，以及

(iv)源自所述慢病毒的第二长末端重复序列，

其中所述真核复制起点和所述支架/基质结合区位于所述第一和第二长末端重复序列之间。

在第二个方面，本发明涉及一种包括根据第一方面的多核苷酸的载体。

在第三个方面，本发明涉及一种包括根据第一方面的多核苷酸或根据第二方面的载体的细胞。

在第四个方面，本发明涉及一种包括根据第一方面的多核苷酸和慢病毒整合酶的重组慢病毒，所述慢病毒整合酶包括引起所述整合酶无法催化病毒基因组整合到细胞基因组中的突变。

在第五个方面，本发明涉及用于产生根据第四方面的重组慢病毒的体外方法，包括

(i)将真核细胞与根据第一方面的多核苷酸或根据第二方面的载体接触，其中所述细胞在足以使多核苷酸或载体进入所述细胞的条件下表达慢病毒基因gag、pol、rev和病毒包膜蛋白的产物，以及

(ii)使细胞维持在足以组装慢病毒的条件下。

在第六个方面，本发明涉及能够表达感兴趣的多核苷酸的稳定细胞群，所述感兴趣的多核苷酸包括根据第一方面的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸序列，其中

-所述启动子位于相对于支架/基质结合区以及相对于复制起点的5’端并且位于相对于第一长末端重复序列的3’端，并且

-所述感兴趣的多核苷酸位于相对于支架/基质结合区的5’端或3’端并且位于相对于复制起点的5’端或3’端。

在第七个方面，本发明涉及一种用于产生第六个方面的稳定细胞群的体外方法，包括以下步骤：

(i)使细胞与根据第四个方面的重组慢病毒接触，其中所述重组慢病毒包括与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸序列，其中

-所述启动子位于相对于支架/基质结合区，并且相对于复制起点的5’端并且位于相对于第一长末端重复序列的3’端，以及

-所述感兴趣的多核苷酸位于相对于支架/基质结合区的5’端或3’端，并且位于相对于复制起点的5’端或3’端，

(ii)生长并维护所述细胞。

在第八个方面，本发明涉及根据第六方面的稳定细胞群的用途，所述稳定细胞群用于在体外生产感兴趣的产物。

在第九个方面，本发明涉及一种用于生产感兴趣的产物的体外方法，包括在能够使感兴趣的多核苷酸表达的条件下培养根据第六个方面的稳定细胞群。

附图说明

图1.慢病毒周期中的相关步骤的图示。(上面)显示了慢病毒感染的早期步骤(进入、脱衣壳化和逆转录)。逆转录的抑制通过IDLV限制的叉号标注。(下面)在右侧示意性地显示了线性、1-LTR和2-LTR的逆转录外产物。后两个没有用于被病毒酶整合的共同底物，但是分别由NHEJ和HR产生。

图2.慢病毒体(LentiSome)质粒和载体的示意性设计。(A)描绘了包含在穿梭pLS质粒中的基本元件。除保持在载体中的慢病毒元件外，转录单元还包含CMV/p5启动子(eC/p5)和报告盒，分别由三角和阴影盒表示。相对于转录单元，复制起点(ori)和S/MAR序列显示在载体的3’端。S/MAR根据它们的Kbp大小来命名(具体参见文本)

图3.附加体复制所需的元件结构分析。该图显示了在pLS质粒上沿着没有原核生物序列的质粒序列运行的SIDD分析，以Kcal/mol表示G(x)(参见文本)。灰盒圈定了包含在穿梭慢病毒质粒中的元件，在上面显示了所述质粒的对照构建体示意图(缺少Ori/SMAR)。与S/MAR序列相对应的区被涂以深蓝色的阴影。Ori序列为黑色。每个结构中具有最小值G(X)的区已用阴影区突出显示。

图4.由FAC分选仪(FACsorter)富集eGFP表达细胞之后，在HEK293A细胞中复制的慢病毒体的长期表达。在每个板中对成套的慢病毒体进行分析。在建立附加体的时候，在没有选择压的情况下连续培养(转导5天之后)，并且在指示的时间点保持培养物，通过FACS分析对eGFP+细胞的数目进行评分。参考图2对在每种情况下组合的数字和组分的分配。图表中的数字与LS号码对应(参见说明)。

图5.在HEK293A细胞中附加型复制漫病毒体的Southern印迹杂交分析。(A)用来自指示的LS转导的细胞的基因组DNA与特异性的neo探针(左)和AAVS1基因座探针杂交获得的代表性图像。(B)转导5天后的Hirt提取物与指示克隆的Southern印迹杂交。右侧的用pLS(白色圆圈)探针的FISH图像显示了用LS 5转导的细胞中存在大量的质粒和中间体。Southern印迹杂交在足够发展为阳性条带的敏感条件下进行。

图6.附加型复制慢病毒体的PCR分析。在用指示的LS转导后，在69个群体倍增下的eGFP+培养物的基因组DNA通过使用特异性引物用来进行2-LTR qPCR。2LTR的拷贝数由基因组DNA的qPCR来检测并进行相对于白蛋白基因的归一化，其在HEK293A细胞中是单拷贝基因。背景水平用来自未转导的亲本细胞(HEK293A)的样品获得，阳性PCR对照用能够整合的慢病毒转导的样品获得。用于分析每种培养物的细胞的数目平均为10⁴。三个独立的实验中代表性的实验被表示出来，数值是反应中的三个重复的平均值。

图7.在转导后54天，LS转导的HEK293A细胞的FISH分析。携带附加型复制慢病毒体的eGFP+细胞的中期涂片的代表性区域。大部分双白点是阳性着丝粒对照探针4q13.3的信号，然而LS序列被检测到为非双点(放大图由数字表示)。

具体实施方式

本发明的发明人已经开发了一种用于真核细胞的稳定的转基因系统，其基于携带阻止整合酶介导的整合到基因组中的突变的慢病毒载体，通过将真核复制起点和支架/基质结合区(S/MAR)整合到这些载体中以与核基质结合。通过将这些元件整合到载体中，本发明的作者制得了能够复制和分离为子细胞的慢病毒附加体，因而实现了在休眠细胞和活跃的分裂细胞中转基因的稳定表达，同时没有病毒蛋白的干扰(参见图4和表1)。相比现有技术的相似系统，该策略获得了具有较高生物安全性的表达系统。

在包装载体所需的蛋白存在的情况下，将含有发明人设计的慢病毒载体的细胞系共转染到有传染性的非整合型慢病毒颗粒中，让适合于转基因在靶细胞中稳定表达的新型非整合型慢病毒产生。

此外，发明人已经观察到不是所有已知的真核复制起点和S/MAR的组合对慢病毒附加体的稳定建立都同等有效。因此，一些组合产生了不能产生感兴趣的基因显著稳定表达的慢病毒(参见图4中的LS 4、8和12)。

基于上述发现，以下发明方面已被开发。

本发明的多核苷酸

在第一方面，本发明涉及一种多核苷酸，下文中的本发明的多核苷酸，包括

(i)源自慢病毒的第一长末端重复序列，

(ii)真核复制起点，其选自于具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3序列及其功能等价变体的复制起点组成的群组，

(iii)支架/基质结合区，其选自于具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6序列及其功能等价变体的支架/基质结合区组成的群组，以及

(iv)源自所述慢病毒的第二长末端重复序列，

其中所述真核复制起点和所述支架/基质结合区位于所述第一和第二长末端重复序列之间。

如在此所使用的术语“多核苷酸”，指的是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单或双链聚合物。

第一长末端重复序列

本发明的多核苷酸的第一元件是第一长末端重复序列。在反转录的自然过程中，来自逆转录病毒基因组RNA的5’(R-U5)和3’(U3-R)末端的序列通过直接重复序列R融合，并复制以形成带有长末端重复序列的线性双链分子。该分子后续插入到受感染的宿主的染色体DNA内的位点使得病毒DNA对新病毒RNA分子的转录起到模板的作用。

如在此所使用的，术语“长末端重复序列”或“LTR”，指的是通过逆转录病毒RNA的反转录合成的DNA的每个末端的数百个碱基对的序列，所述逆转录病毒RNA控制病毒DNA整合到宿主DNA中，并表达病毒基因。如在此所使用的，LTR指的是在通过逆转录病毒RNA的反转录合成的DNA中发现的LTR的DNA序列和与LTR的所述DNA序列互补的RNA序列。5’LTR和3’LTR用于促进病毒的RNA的转录和多聚腺苷酸化。LTR包含病毒复制所必需的所有其它顺式作用的序列。每种LTR都包括U3、R和U5区。

术语“第一长末端重复序列”或“第一LTR”或“5’LTR”指的是5'慢病毒LTR，其可或不可从其相应的天然5'LTR通过缺失和/或突变内生序列和/或添加异源序列被修饰。5'LTR可以是天然或合成的。

本发明的多核苷酸的第一和第二LTR都源自慢病毒。如在此所使用的术语“慢病毒”，指的是由于它们整合到宿主基因组中的能力因此在自然界中引起缓慢发展的疾病的一群(或科学上的属)逆转录酶病毒。这些病毒尤其包括人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人类免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、绵羊髓鞘脱落病毒(VISNA)和山羊关节脑炎病毒(CAEV)。在一个优选实施方式中，所述慢病毒是HIV。因此在一个特定实施方式中，第一和第二LTR源自HIV。

如在此所使用的术语“人类免疫缺陷病毒”或“HIV”，意在包括HIV-1和HIV-2。“HIV-1”指人类免疫缺陷病毒1型。HIV-1包括，但不限于，细胞外病毒颗粒，以及与HIV-1感染的细胞有关的HIV-1形式。“HIV-2”指人类免疫缺陷病毒2型。HIV-2包括，但不限于，细胞外病毒颗粒，以及与HIV-2感染的细胞有关的HIV-2形式。优选地，HIV是HIV-1。

在一个优选实施方式中，本发明的多核苷酸的第一LTR包括显示于SEQ ID NO:7中的序列。在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸的第一LTR由显示于SEQ ID NO:7中的序列组成。

真核复制起点

本发明的多核苷酸包括真核复制起点。如在此所使用的术语“真核复制起点”(eukaryotic origin of replication，eukaryotic replication origin，或eukaryoticori)，指的是在真核生物中起始复制的特定基因组序列。如在此所使用的术语“真核生物”，包括原生生物界、真菌界、植物界和动物界。

真核复制起点是本发明的多核苷酸的一部分，其选自于具有SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3及其功能等价变体的复制起点组成的群组。

具有SEQ ID NO:1序列的复制起点相对应于如已被Aladjem等人描述的β-球蛋白基因的复制起点(Science,1995,270:815-819)。

具有SEQ ID NO:2序列的复制起点来自于自主复制序列的共有序列，所述自主复制序列与以前从猴CV-1细胞和人皮肤成纤维细胞中分离的阿尔法-卫星序列有关，如Priceet al Journal of Biological Chemistry,2003,278(22):19649-59所描述的。

具有SEQ ID NO:3序列的复制起点相对应于，如McWinney和Leffak所描述的人类c-myc启动子区的复制起点(McWinney C.and Leffak M.,Nucleic AcidResearch 1990,18(5):1233-42)。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:1序列及其功能等价变体的复制起点。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:2序列及其功能等价变体的复制起点。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:3序列及其功能等价变体的复制起点。

如在此所使用的术语“功能等价变体”，指的是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3序列的复制起点的任何变体，其与其来源序列实质相同并且行使实质相同的功能。如在此所使用的，“实质相同”的意思是核酸序列与其来源序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的程度。两种多核苷酸之间的序列一致性的程度可通过常规方法确定，例如，通过现有技术公知的标准比对算法例如，例如BLASTAltschul S.F.et al.Basic Local Alignment Search Tool.J Mol.Biol.1990Oct5；215:403-10)。在一个优选实施方式中，序列一致性的程度通过多核苷酸的整个长度来确定。

在一个优选实施方式中，具有SEQ ID NO:2序列的复制起点的变体包括以下共有序列

CCTMDAWKSGBYTSMAAWTWBCMYTTRSCAAATTCC(SEQ ID NO:25)

其中M是A或C；D是A、G或T；W是A或T；K是G或T；S是C或G；B是C、G或T；Y是C或T；R是A或G，以及H是A、C或T。

在另一个实施方式中，具有SEQ ID NO:2序列的复制起点的变体包括选自于显示于表I中的A6、A7、A15、A16、A1、A5和A39组成的群组的序列，如Price等人(J.Biol.Chem.,2003,278:19649-19659)的描述。

如在此所使用的术语“实质上相同的功能”，意思是变体实质上保持在真核生物中起始复制的能力。本领域技术人员知道如何确定特定变体是否能够在真核生物中起始复制，并因此是否功能上等价于SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的复制的起点。特定序列起始复制的能力可由本领域技术人员公知的任何适合方法测定，例如，通过DpnI的抗消化法(Frappier L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84:6668-72)、通过最早的标记片段试验(Pearson et al,Somat.Cell Mol.genet.1994,20:147-152)以及基于溴脱氧尿苷掺入和密度变化的自主复制试验(AraujoF.D.et al.,supra；Frappier L.et al.,supra)。

支架/基质结合区

本发明的多核苷酸包括支架/基质结合区。如在此所使用的术语“支架/基质结合区”或“S/MAR”，指的是有非一致特征的富含AT的数百个碱基对长度的DNA元件，其通过周期性的附着到蛋白支架或细胞核的基质将真核基因组的核DNA组织到一些60,000个染色质的结构域中。它们通常被发现于非编码区例如侧翼区、染色质边界区和内含子中。

形成本发明的多核苷酸的部分的S/MAR选自于具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6序列及其功能等价变体的S/MAR组成的群组。

具有SEQ ID NO:4序列的S/MAR对应于人类IFN-γ基因(hIFN-γ^large)的1.8kbp的S/MAR，已被Bode等人(Bode J.et al.,Science,1992,255:195-7)描述。

具有SEQ ID NO:5序列的S/MAR对应于人类IFN-γ基因(hIFN-γ^short)的S/MAR的0.7Kbp最小区，已被Ramezani(Ramezani A.et al.,Blood 2003,101:4717-24)描述。

具有SEQ ID NO:6序列的S/MAR对应于人类脱氢叶酸还原酶基因(hDHFR)的S/MAR的0.2Kbp最小区，已被Mesner L.D.et al.,ProcNatlAcadSci USA,2003,100:3281-86描述。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:4序列的S/MAR或其功能等价变体。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:5序列的S/MAR或其功能等价变体。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:6序列的S/MAR或其功能等价变体。

如在此所使用的术语“功能等价变体”，是指任何与其来源S/MAR实质上同源并且行使实质上相同功能的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6序列的S/MAR的变体。如在此所使用的，“实质上同源”意思是核酸序列与其来源序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的程度。

在一个优选实施方式中，S/MAR的功能等价变体是基于设定的六条规则选择的序列，已经表明这六条规则共同或单独有助于S/MAR功能(Kramer et al(1996)Genomics 33,305；Singh et al(1997)Nucl.Acids Res 25,1419)。这些规则已被合并到MAR-Wiz计算机程序中，可在http；//genomecluster.secs.oakland.edu/MAR-Wiz免费获取。

如在此所使用的术语“实质上相同功能”，意思是变体实质上与其来源S/MAR保持相同功能，特别是，与核基质特异性结合的能力。本领域技术人员知道如何确定特定变体是否能够与核基质特异性结合，例如通过由Mesner等人(Mesner L.D.et al,supra)描述的体外或体内MAR试验。在另一个实施方式中，如果特定变体显示了DNA链分离的倾向，特异序列可以被视为根据本发明的S/MAR的变体。该特性可使用专用程序根据平衡统计力学方法确定。应力诱导型复式脱稳(SIDD)分析技术”[…]计算超螺旋应力的施加水平减少打开沿着DNA序列上的每个位点的双链所需的自由能的程度。结果作为SIDD曲线显示，其中强失稳的位点作为深的最小值出现[…]，如“在Bode et al(2005)J.Mol.Biol.358,597中定义。从SIDD分析(输出表示中最小)中获得的数据已被实验证实用实验确定的未配对区的碱基或与S/MAR的功能作用有关，同样与结合活性或质粒载体的保留有关。总的来说，这些数据表明SIDD特性可被掺入到任何计算策略中，从而为位点寻找具有作为S/MAR行使功能的特征的基因组序列，尽管当前可获得的数据并不足以支持估计它们的相对结合强度。SIDD算法和数学基础(Bi and Benham(2004)Bioinformatics 20,1477)以及SIDD曲线分析可采用在WebSIDD(http://www.genomecenter.ucdavis.edu/benham)免费获得的因特网资源实施。因此，在另一个实施方式中，多核苷酸被视为S/MAR序列的变体，如果其显示了与S/MAR相似的SIDD曲线。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:1序列或其功能等价变体的复制起点和具有SEQ ID NO:4序列或其功能等价变体的S/MAR。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:1序列或其功能等价变体的复制起点和具有SEQ ID NO:5序列或其功能等价变体的S/MAR。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:1序列或其功能等价变体的复制起点和具有SEQ ID NO:6序列或其功能等价变体的S/MAR。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:2序列或其功能等价变体的复制起点和具有SEQ ID NO:4序列或其功能等价变体S/MAR。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:2序列或其功能等价变体的复制起点和具有SEQ ID NO:5序列或其功能等价变体的S/MAR。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:2序列或其功能等价变体的复制起点和具有SEQ ID NO:6序列或其功能等价变体的S/MAR。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括有SEQ ID NO:3序列或其功能等价变体的复制起点和具有SEQ ID NO:4序列或其功能等价变体的S/MAR。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:3序列或其功能等价变体的复制起点和具有SEQ ID NO:5序列或其功能等价变体的S/MAR。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:3序列或其功能等价变体的复制起点和具有SEQ ID NO:6序列或其功能等价变体的S/MAR。

某些S/MAR包含富含腺嘌呤区。富含腺嘌呤区在多核苷酸中的存在对多核苷酸的转录(如果多核苷酸是DNA)或对多核苷酸的复制(如果多核苷酸是RNA)是不利的，因为它可以导致转录/复制的提前终止以及不完全的转录的发生。因此，由于S/MAR是可在任何方向执行其活性的区，即它们是可逆的，所以本领域技术人员将理解在S/MAR包含富含腺嘌呤区的那些情况中，所述S/MAR以一个方向被插入到本发明的多聚核苷酸中，这样在S/MAR的一个链中的富含腺嘌呤区不会负面影响多核苷酸序列的转录。因此，如果本发明的多核苷酸是单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)，则多核苷酸包括与S/MAR链反向互补的序列，所述S/MAR链包括富含腺嘌呤区。如果本发明的多核苷酸是双链的DNA(dsDNA)，则S/MAR被插入到多核苷酸中，以便包括富含腺嘌呤区的S/MAR链不形成所述dsDNA的编码链部分。

如在此所使用的术语“单链DNA”或“ssDNA”，指的是仅包括一条链的DNA多核苷酸。

如在此所使用的术语“单链RNA”或“ssRNA”，指的是仅包括一条链的RNA多核苷酸。

如在此所使用的术语“双链DNA”或“dsDNA”，指的是包括通过氢键结合的两条反平行的或实质上互补的DNA链的DNA多核苷酸。

如在此所使用的术语“富含腺嘌呤区”，指的是在多核苷酸中腺嘌呤是最丰富的核苷酸的区。在一个优选实施方式中，所述富含腺嘌呤区是多聚腺嘌呤序列。如在此所使用的术语“多聚腺嘌呤序列”或“polyA序列”，指的是包括多个连续的单磷酸腺苷的多核苷酸序列。

如在此所使用的术语“编码链”，指的是与模板链互补的DNA链。该编码链具有与mRNA相同的碱基序列(虽然胸腺嘧啶被尿嘧啶替换)并与被翻译为蛋白的密码子相对应。

在更具体的实施方式中，当本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:6序列或其功能等价变体的S/MAR时，如果所述多核苷酸是ssDNA或ssRNA，那么所述多核苷酸包括与包括polyA序列的S/MAR链反向互补的序列。

在另外更具体的实施方式中，当本发明的多核苷酸包括具有序列SEQ ID NO:6或其功能等价变体的S/MAR时，如果所述多核苷酸是dsDNA，那么S/MAR被插入到多核苷酸中，这样包括富含腺嘌呤区的S/MAR链不会形成所述dsDNA的编码链部分。

第二长末端重复序列

术语“第二长末端重复序列”或”第二LTR”或“3'LTR”指的是3'慢病毒LTR，其可或不可由其相应的天然的3'LTR通过缺失和/或突变内源序列和/或添加异源序列被修饰。3'LTR可以是天然的或合成的。

本发明的多核苷酸第二LTR来源于与作为第一LTR相同的慢病毒。在一个特定实施方式中，所述第二LTR源自HIV。

在一个优选实施方式中，所述第二LTR包括自灭活突变。如在此所使用的术语“突变”，指的是核酸序列中的改变。所述突变包括，但不限于，替换(即交换一个或多个核苷酸为其他的核苷酸)、倒位(即基因内的DNA片段被倒置，到末端两个180°旋转是必要的，一个用于使序列反向，另一个用于以保持DNA的极性)、易位(即基因片段改变位置为相同基因的另外的不同位点或基因组的另外的位点)、核苷酸插入或缺失(即一个或多个核苷酸(插入或添加)的添加或一个或多个核苷酸的减少(缺失)作为在阅读框中的结果变化，在翻译期间，发生从形成非功能蛋白到缺失所述蛋白的阅读错误)。如在此所使用的术语“自失活突变”，指的是引起LTR具有与其相应的天然LTR相比降低的促进转录本转录能力的突变。LTR促进转录本转录的能力可由本领域技术人员通过适合分析LTR的启动子活性的任何技术确定，例如通过用Zufferey等人描述的试验(Zuffereyet al.,Journal of Virology,1998,72:9873-80)测定源自LTR内部启动子的RNA产生量。术语“降低的促进转录本转录的能力”意思是与其天然对应物相比，在突变的LTR的启动子活性方面的任何显著的降低，例如，与其相应的天然LTR相比，在突变的LTR的启动子活性方面降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。对自灭活(SIN)慢病毒载体的产生有用的慢病毒的LTR中的突变在现有技术中(Zufferey R et al.,J.Virol.1998,72:9873–9880)已被描述。

在一个优选实施方式中，当本发明的多核苷酸被整合到慢病毒载体中时，与包括相应的天然LTR的等效的载体相比，在第二LTR上存在的自失活突变不会影响所述载体的转导能力，即载体被转移到靶标细胞中的能力保持基本上不受影响。本领域技术人员可通过本领域技术人员已知的任何技术测定慢病毒载的转导能力，例如，通过Zufferey等人(Zuffereyet al.,supra)描述的方法测定载体在靶标细胞中的滴度。

在一个特定实施方式中，所述突变是缺失。

在另一个特定的实施方式中，所述突变影响LTR的U3区。如在此所使用的术语“LTR的U3区”，指的是包括增强子和启动子元件的LTR的区域。在HIV-1LTR的特定情况中，U3区包括负责调控HIV-1LTR启动子活性的所有主要的决定因素，像所谓的负应答元件、NFκB和NF-ATc结合位点、Sp1结合位点和TATA框。

在一个优选实施方式中，所述突变是在第二LTR的U3区中的缺失。U3区中的能够降低LTR促进转录本转录的能力的任何缺失都适合本发明的多核苷酸，例如，TATA盒的缺失和/或转录因子的一个或多个结合位点的的缺失。在一个更优选的实施方式中，第二LTR的U3区中的缺失包括包含在-418(5’)和-18(3’)位之间的序列的缺失，编号表明相对于在R起点，在+1位的帽位点的核苷酸位置。在一个特定实施方式中，在U3区中包括缺失的第二LTR包括SEQ ID NO:8序列。在一个更具体的实施方式中，包括U3区中的缺失的第二LTR由SEQID NO:8序列构成。

在本发明的多核苷酸中，真核复制起点和S/MAR位于第一和第二LTR之间。在一个优选实施方式中，复制起点位于相对于S/MAR的5’端，多核苷酸元件从5’至3’的顺序为：

-第一LTR

-复制起点

-S/MAR

-第二LTR

在另一个特定实施方式中，所述S/MAR位于相对于复制起点的5’端，多核苷酸元件从5’至3’的顺序为：

-第一LTR

-S/MAR

-复制起点

-第二LTR

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸进一步包括选自

-多克隆位点

-与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸，其中所述启动子位于相对于支架/基质结合区，并且相对于复制起点的5’端并且相对于第一长末端重复序列的3’位，以及

所述感兴趣的多核苷酸位于相对于支架/基质结合区的5’端或3’端，并且相对于复制起点的5’端或3’端，以及

-其组合

的多核苷酸序列。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括多克隆位点。如在此所使用的术语“多克隆位点”，指的是包括多个彼此接近的限制性内切酶靶标位点，从而在单一位点中将多核苷酸切开的DNA片段。因此，在多核苷酸用所述内切酶处理后，有可能插入具有可相容的末端的感兴趣的基因，所述末端是钝性的、5’-突出的或3′-突出的。原则上，有可能使用本领域已知的任何多克隆位点例如可从pUC18、pUC19等类型的载体中获得的多克隆位点。感兴趣的多核苷酸的插入通过采用例如Sambrook等人(Molecular Cloning:ALaboratory Manual(1982)；“DNA Cloning:A Practical Approach,”Volumes l and II)所述的标准分子生物学方法进行。多克隆位点优选包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个限制性内切核酸酶的靶标位点，每个靶标位点均由至少4、至少5或至少6个核苷酸组成。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸。

如在此所使用的术语“启动子”，指的是作用为控制一种或多种多核苷酸的转录，位于多核苷酸序列上游的核酸片段，其通过依赖DNA的RNA聚合酶结合位点、转录起始位点以及任何其它DNA序列的存在在结构上被确定，所述其它DNA序列包括，但不限于，转录因子结合位点、抑制因子和激活蛋白结合位点，以及本领域公知的直接或间接作用以调控来自启动子的转录的量的核苷酸的任何其它序列。所述启动子可以是组成型的或诱导型的。“组成型启动子”是在大部分生理和发育条件下活跃的启动子。“诱导型“启动子是依赖于生理或发育条件被调节的启动子。“组织特异性”启动子仅仅在特定类型的分化的细胞/组织中是活跃的。在一个优选实施方式中，所述启动子是病毒启动子，更优选所述启动子源自腺相关的病毒(AAV)。术语“腺相关的病毒”或“AAV”指的是属于细小病毒科(Parvoviridae)的依赖病毒属(Dependovirus)的病毒。在一个更特定的实施方式中，源自AAV的启动子是p5启动子或其功能等价变体。如在此所使用的术语“p5启动子”，指的是控制Rep68和Rep78的表达的AAV的启动子(YueY.B.et al.,Humgene Ther 2010,21(6):728-38)。在一个更特定的实施方式中，源自AAV的启动子包括SEQ ID NO:9序列。在一个甚至更特定的实施方式中，源自AAV的启动子由SEQ ID NO:9序列组成。在一个特定实施方式中，启动子是p5启动子的功能性等价变体。如在p5启动子的语境中使用的术语“功能性等价变体”，指的是与p5启动子实质上同源并且行使实质上相同功能的变体。术语“实质上同源”在上文已被定义。与p5启动子行使实质上相同功能的变体是能够控制位于所述变体的下游的感兴趣的多核苷酸表达的变体。

如在此所使用的术语“”可操纵地连接的”，指的是启动子序列相对于感兴趣的多核苷酸的功能关系和位置(例如启动子或增强子与编码序列是可操纵地连接的，如果其影响所述序列的转录)。通常，可操纵地连接的启动子与感兴趣的序列相邻。然而，增强子并不必须与感兴趣的序列相邻以控制其表达。当本发明的多核苷酸包括与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸时，多核苷酸的组分具有以下配置：

-所述启动子位于

S/MAR和复制起点的上游，即，在相对于S/MAR和相对于复制起点的5’端，

以及

第一LTR的下游，即，在相对于第一LTR的3’端；以及

-所述感兴趣的多核苷酸位于

S/MAR的上游或下游，即，在相对于S/MAR的5’端或在3’端以及

复制起点的上游或下游，即，在相对于复制起点的5’端或3’端。

在一个特定实施方式中，包括与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸的本发明的多核苷酸进一步包括与启动子可操纵地连接的增强子区。如在此所使用的术语“增强子”，指的是转录因子与其结合以提高基因转录的DNA序列元件。在一个更特定的实施方式中，增强子区是巨细胞病毒启动子的增强子区。在一个甚至更特定实施方式，巨细胞病毒启动子的增强子区，包括SEQ ID NO:10序列。在另一个进一步更特定实施方式，巨细胞病毒启动子的增强子区由SEQ ID NO:10序列组成。

如在此所使用的术语“感兴趣的多核苷酸”，指的是其在细胞中具有所需要的表达的多核苷酸。感兴趣的多核苷酸可以是编码多肽或蛋白的基因，或一旦转录就产生能够与抑制其表达的mRNA(如microRNA、siRNA或shRNA)杂交的RNA的多核苷酸。在一个特定实施方式中，感兴趣的多核苷酸选自于筛选基因、编码感兴趣的蛋白的多核苷酸及其组合。

术语“筛选基因”，如在此所使用的，指的是表达赋予了抗生素抗性的基因，允许合成培养基中所缺乏的必需营养的基因，或对已经整合所述筛选基因的细胞提供选择性优势的基因。

在一个优选实施方式中，所述筛选基因是编码赋予了抗生素抗性的蛋白质的基因，例如编码赋予了潮霉素抗性的蛋白质的基因、编码赋予了新霉素抗性的蛋白质的基因、编码赋予了嘌呤霉素抗性的蛋白质的基因嘌呤霉素等。在一个更优选的实施方式中，所述筛选基因编码赋予了新霉素抗性的蛋白质。

作为一种选择，所述筛选基因是允许合成培养基中没有的必需营养的基因。一个示例包括大肠杆菌(Escherichia coli)的trpB基因，其编码色氨酸合酶的β亚基。该基因允许哺乳类细胞在含有吲哚而不是色氨酸的培养基中存活和增殖。第二个示例包括鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)的hisD基因，其编码组氨醇脱氢酶，组氨醇脱氢酶在两个阶段中催化L-组氨醇+组氨酸的NAD依赖性氧化。只有表达hisD产物的哺乳类细胞才可以在缺乏组氨酸并含有组氨醇的培养基中存活(Hartman SC and RC Mulligan,Proc.Natl.Acad Sci.USA.1988,85(21):8047-51。

对已经整合所述基因的细胞提供选择性优势的筛选基因的示例包括在DHFR缺陷型基因工程的细胞中编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因。DHFR蛋白催化5,6-二氢叶酸还原为5,6,7,8-四氢叶酸，这是嘌呤代谢中关键的步骤。通过使DHFR缺陷型细胞在缺乏嘌呤前体次黄嘌呤和胸腺嘧啶(HT)的条件下生长，使用DHFR能使DHFR缺陷型细胞的遗传选择成为可能(RJ Kaufman and PA Sharp,J.Mol.Biol,1982,159:601-21)。

如在此所使用的术语“感兴趣的蛋白”，指的是其在细胞中所期望的表达的任何蛋白。在一个特定实施方式中，感兴趣的蛋白是荧光蛋白，优选绿色荧光蛋白或GFP。如在此所使用的术语“荧光蛋白”，指的是当在合适的波长下用电磁辐射激发时具有内在荧光的蛋白。代表性的荧光蛋白可包括，但不限于，sgGFP、sgBFP、BFP蓝移GFP(Y66H)、蓝色荧光蛋白、CFP—青色荧光蛋白、青色GFP、DsRed、单体RFP、EBFP、ECFP、EGFP、GFP(S65T)、红移GFP(rsGFP)、野生型GFP、非-UV激发(wtGFP)、野生型GFP、UV激发(wtGFP)、GFPuv、HcRed、rsGFP、天蓝色GFP、sgBFP.TM.、sgBFP.TM.(超级辉光BFP)、sgGFP.TM.、sgGFP.TM.(超级辉光GFP)、wtGFP、黄色GFP和YFP。在一个优选实施方式中，所述荧光蛋白是GFP。

如在此使用的术语“绿色荧光蛋白”或“GFP”指的是具有26.9kDa的分子量并且当暴露于紫外蓝光时发出亮绿色荧光的239氨基酸的蛋白。虽然许多其他海洋生物具有类似的绿色荧光蛋白，但是习惯上GFP是指首先从维多利亚多管发光水母(A.victoria)中分离出来的蛋白。来自维多利亚多管发光水母的GFP具有在395nm的波长下的主要的最强激发光和在475nm下的次级激发光。其发射最大值是在509nm。GFP的荧光量子产率(quanticfluorescence yield)是0.79。在维多利亚多管发光水母中，GFP通过能量转移将水母素的蓝色化学发光转化为绿色荧光。

又或者，所述感兴趣的蛋白可以是治疗上感兴趣的蛋白，这样本发明的多核苷酸可被用于在体外表达所述蛋白或用于需要所述表达的蛋白的的疾病治疗。因此，本发明提供了包括编码治疗上感兴趣的蛋白的一种或多种感兴趣的多核苷酸的多核苷酸，所述治疗上感兴趣的蛋白包括，不限于，促红细胞生成素(EPO)，瘦蛋白，促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)，生长激素释放激素(GHRH)，促性腺激素释放激素(GnRH)，促甲状腺激素释放激素(TRH)，催乳激素释放激素(PRH)，褪黑激素释放激素(MRH)，催乳素抑制激素(PIH)，生长激素抑制素，促肾上腺皮质激素(ACTH)，生长激素(somatotropin)或生长素(growthhormone，GH)，黄体化激素(LH)，促卵泡激素(FSH)，促甲状腺素(TSH或促甲状腺刺激激素)，催乳素，后叶催产素，抗利尿激素(ADH或后叶加压素)，褪黑激素，副中肾管抑制因子(Müllerian inhibiting factor)，降钙素，甲状旁腺素，胃泌素，胆囊收缩素(CCK)，分泌素，I型胰岛素样生长因子(IGF-I)，II型胰岛素样生长因子(IGF-II)，心房钠尿肽(ANP)，人绒毛促性腺激素(hCG)，胰岛素，胰高血糖素，生长抑素，胰多肽(PP)，瘦蛋白，神经肽Y，肾素，血管紧缩素I，血管紧缩素II，第八因子，第九因子，组织因子，第七因子，第十因子，凝血酶，第五因子，第十一因子，第十三因子，白介素1(IL-1)，白介素2(IL-2)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白介素6(IL-6)，白介素8(IL-8和趋化因子)，白介素12(IL-12)，白介素16(IL-16)，白介素15(IL-15)，白介素24(IL-24)，α、β、γ干扰素，CD3，ICAM-1，LFA-1，LFA-3，包括RANTES 1α的趋化因子，MIP-1α，MIP-1β，神经生长因子(NGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子β(TGF-β)，骨形态发生蛋白(BMPs)，成纤维细胞生长因子(FGF和KGF)，表皮生长因子(EGF等等)，血管内皮生长因子(VEGF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，胶质细胞生长因子，角质化细胞生长因子，内皮生长因子，α-1抗胰蛋白酶，肿瘤坏死因子，粒细胞和小噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，心肌营养素1(CT-1)，抑瘤素M(OSM)，双调蛋白(AR)，环孢霉素，纤维蛋白原，乳铁蛋白，组织型纤溶酶原激活物(tPA)，胰凝乳蛋白酶，免疫球蛋白，水蛭素，超氧化物歧化酶，伊米苷酶，β-葡糖脑苷脂酶，α-L-糖苷酶-α，α-L-艾杜糖醛酸酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，加硫酶，人α-半乳糖苷酶A，α-1蛋白酶抑制剂，乳糖酶，胰腺酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)，腺甙脱氨酶，免疫球蛋白，白蛋白，A和B型肉毒杆菌毒素，胶原酶，人脱氧核糖核酸酶I，透明质酸酶，木瓜蛋白酶，L-天冬酰胺酶，重组水蛭素，链激酶，诸如WO0331155、WO200519244和WO0393293中描述的那些贝塔细胞转化因子(TGF-β)抑制肽，其内容通过引用并入本文，以及适合干扰RNA分子转录的表达盒(shRNA、siRNA、miRNA、修饰的U1核糖核蛋白RNA)。

在一个特定实施方式中，感兴趣的多核苷酸是筛选基因，优选编码赋予了抗生素抗性的蛋白质的筛选基因，更优选编码赋予了新霉素抗性的蛋白质的基因。

在另一个特定实施方式中，感兴趣的多核苷酸是编码感兴趣的蛋白，更优选绿色荧光蛋白(GFP)。

在一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括第一感兴趣的多核苷酸和第二感兴趣的多核苷酸。在该情况中，第一和第二感兴趣的多核苷酸可与相同启动子可操纵地连接或每个感兴趣的多核苷酸与单独的启动子可操纵地连接，其可以相同或不同。上述任何启动子可有利于调节感兴趣的第一多核苷酸和第二多核苷酸的表达。

在一个更优选的实施方式中，本发明的多核苷酸包括第一感兴趣的多核苷酸和第二感兴趣的多核苷酸，其中第二感兴趣的多核苷酸通过编码共翻译自处理序列的序列与第一感兴趣的多核苷酸可操纵地连接。术语“可操纵地连接”已在上文定义。如在此所使用的术语“共翻译自处理序列”，指的是在翻译期间将自己从从生长的蛋白中直接分离的多肽序列。在一个特定实施方式中，共翻译自处理序列序列是“顺式水解酶元件”或“chysel元件”。术语“顺式水解酶元件”或“chysel元件”指的是一段小肽(通常在19至33个氨基酸之间)，在其翻译期间，其与核糖体的出口通道相互作用以诱导在该肽的C端最后的肽键的“跳跃”。chysel元件被发现于类似FMDV的某些细小核糖核酸病毒(picornavirus)中，其中它们能快速的共翻译自处理序列多聚蛋白。当插入到两个基因之间时，chysel元件在其翻译期间诱导了“跳跃”，之后核糖体继续翻译第二基因从而产生两个分离的蛋白。chysel元件说明性的非限制性实施例包括明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asignavirus)的T2A、猪捷申病毒-1(Porcine teschovirus-1)的P2A、马甲型鼻炎病毒(Equine rhinitis A virus)的F2A或E2A)。在一个特定实施方式中，顺式水解酶元件源自猪捷申病毒。在一个更特定的实施方式中，编码共翻译自处理序列的序列包括序列SEQ ID NO:11。在一个甚至更特定实施方式中，编码共翻译自处理序列的序列由序列SEQ ID NO:11构成。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括第一感兴趣的多核苷酸和第二感兴趣的多核苷酸，所述第一感兴趣的多核苷酸优选编码感兴趣的蛋白的多核苷酸，更优选编码GFP的多核苷酸，所述第二感兴趣的多核苷酸优选筛选基因，更优选编码赋予了抗生素抗性的蛋白的基因，甚至更优选编码赋予了嘌呤霉素基因抗性的蛋白的基因，其中第一和第二感兴趣的多核苷酸通过共翻译自处理序列，优选源自猪捷申病毒的顺式水解酶元件，更优选SEQ ID NO:11的序列可操纵地连接。

本发明的多核苷酸可用于构建作为产生重组慢病毒的第三代系统的一部分的转移质粒。因此，本发明的多核苷酸可包括产生没有复制能力的慢病毒所必需的所有病毒处理元件，以及提高病毒滴度的元件和全部载体功能元件。

因此，在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸进一步包括源自慢病毒的引物结合位点序列，其中所述引物结合位点序列位于相对于第一LTR的3’端以及相对于复制起点和S/MAR的5’端，其中如果所述多核苷酸进一步包括选自

-多克隆位点

-与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸，其中所述启动子位于相对于S/MAR，并且相对于复制起点的5’端以及相对于第一LTR的3’端，以及

-所述感兴趣的多核苷酸位于相对于S/MAR的5’端或3’端，并且相对于复制起点的5’端或3’端，以及

-其组合

的多核苷酸序列，

则所述引物结合位点位于相对于该多核苷酸序列的5’端。

如在此所使用的术语“引物结合位点序列”或“PBS序列”，指的是结合逆转录的tRNA引物的多核苷酸序列。在一个特定实施方式中，PBS序列源自HIV。在一个更特定的实施方式中，源自HIV的PBS序列包括SEQ ID NO:12序列。在一个甚至更特定实施方式，源自HIV的PBS序列由SEQ ID NO:12序列构成。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸进一步包括源自定位于第一和第二LTR之间的慢病毒的包装信号序列。如在此所使用的术语“包装信号序列”，指的是能够使病毒RNA包装到病毒体中的多核苷酸序列。在一个特定实施方式中，包装信号序列是源自HIV的ψ序列。在一个更特定的实施方式中，源自HIV的包装信号序列包括SEQ ID NO:13序列。在一个甚至更特定实施方式中，源自HIV的包装信号序列由SEQ ID NO:13序列构成。在一个优选实施方式中，包装信号序列位于第一LTR的附近。在另一个优选实施方式中，包装信号序列位于第二LTR的附近。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸进一步包括源自位于第一和第二LTR之间的慢病毒的Rev应答元件(RRE)。如在此所使用的术语“rev应答元件”或“RRE”，指的是提高从细胞核中转运出未剪接的病毒RNA的多核苷酸序列，所述细胞核提了病毒滴度。在一个特定实施方式中，RRE源自HIV。在一个更特定的实施方式中，源自HIV的RRE包括SEQ IDNO:14序列。在一个甚至更特定实施方式中，源自HIV的RRE由SEQ ID NO:14序列构成。在一个特定实施方式中，RRE位于剪接供体位点和剪接接受位点之间。如在此所使用的术语“剪接供体位点”或“SD”，指的是存在于内含子的5'末端和核酸序列或结构域，所述内含子用前述编码序列或外显子标记了内含子起始和其边界。如在此所使用的术语“剪接接受位点”或“SA”，指的是存在于内含子的3'末端的核酸序列或结构域，所述内含子用下面的编码序列(外显子)标记了内含子起始和其边界。在一个特定实施方式中，SD是HIV-1基因组中gag基因的5’剪接位点。在一个特定实施方式中，AD是HIV-1基因组中pol基因的3’剪接位点。关于HIV-1基因组SD和AD的具体描述参见例如，Kammler et al.,Retrovirology 2006,3:89。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸进一步包括源自慢病毒的中央多嘌呤区(central polypurine tract，cPPT)，其中所述中央多嘌呤区位于相对于第一LTR的3’端和相对于复制起点和S/MAR的5’端，其中如果多核苷酸进一步包括选自

-多克隆位点

-与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸，其中

所述启动子位于相对于S/MAR和复制起点的5’端，并且位于相对于第一LTR的3’端，并且

所述感兴趣的多核苷酸位于相对于S/MAR的5’端或3’端，并且相对于复制起点的5’端或3’端，以及

-其组合

的多核苷酸序列，

则所述中央多嘌呤区位于相对于所述多核苷酸序列的5’端。如在此所使用的术语“中央多嘌呤区”或“cPPT”，指的是一种核苷酸序列，细胞感染期间，其产生增加病毒基因组进入细胞核的中央DNA折叠片(central DNA flap)，导致更有效的转导的核苷酸序列。在一个特定实施方式中，cPPT源自HIV。在一个更特定的实施方式中，来自HIV的cPPT包括SEIDNO:15序列。在一个甚至更特定实施方式中，来自HIV的cPPT包括SEQID NO:15序列。

在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸包括PBS序列、包装信号序列、RRE和cPPT，优选SEQ ID NO:12的PBS序列、SEQ ID NO:13的包装信号序列、SEQ ID NO:14的RRE以及SEQ ID NO:15的cPPT。

本发明的多核苷酸还可以包括对其在原核生物中的增殖所必需的元件。因此，在一个特定实施方式中，本发明的多核苷酸进一步包括原核复制起点和筛选标记物。如在此所使用的术语“原核复制起点”，指的是在原核生物中起始复制的特定序列。原核生物中的复制起点的示意的非限制性实施例是源自大肠杆菌中pBR322的pUC的起点；源自沙门氏菌(Salmonella)的pSC101和源自p15A的15A起点。如在此所使用的术语“原核生物”，包括细菌域和古生菌域。在一个特定实施方式中，原核复制起点是pUC载体的起点。在一个更特定的实施方式中，原核起点包括SEQ ID NO:16序列。在一个甚至更特定的实施方式中，原核起点由SEQ ID NO:16序列组成。术语“筛选标记”在上文已详细说明并且同样适用。在一个特定实施方式中，筛选标记是编码赋予了抗生素抗性的蛋白的基因。在一个更特定的实施方式中，编码赋予了抗生素抗性的蛋白的筛选标记是编码赋予了氨苄青霉素抗性的蛋白的基因。

本发明的载体

在另一方面，本发明涉及一种载体，在下文中本发明的载体，包括本发明的多核苷酸。如在此所使用的术语“载体”，指的是能够将一种或多种感兴趣的多核苷酸输送到宿主细胞中并任选表达的构建体。载体的示例包括，但不限于，病毒载体，裸DNA或RNA表达载体，质粒，粘粒或噬菌体载体，与阳离子缩合剂有关的DNA或RNA表达载体，包裹在脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核细胞，例如生产细胞。所述载体可以是克隆载体或表达载体。如在此所使用的术语“克隆载体”，指的是适合增殖的载体，以在适合载体纯化的不同的异源生物体中获得大量的多核苷酸或基因构建体或表达载体。如在此所使用的术语“表达载体”，指的是适合在靶标细胞中表达多核苷酸的载体。本发明的表达载体是慢病毒载体。如在此所使用的术语“慢病毒载体”，指的是包括必需序列的核酸序列，这样在细胞中转录和翻译所述序列以及表达慢病毒基因gag、pol、rev和编码包膜病毒蛋白的基因之后，产生有感染新细胞的能力的病毒颗粒。

本发明的载体可通过本领域普遍公知的技术获得。参见Brown T,“Gene Cloning”(Chapman&Hall,London,GB,1995)；Watson R,et al.,“Recombinant DNA”,2nd Ed.(Scientific American Books,New York,NY,US,1992)；Alberts B,et al.,“MolecularBiology of the Cell”(Garland Publishing Inc.,New York,NY,US,2008)；Innis M,etal.,Eds.,“PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications”(Academic PressInc.,San Diego,CA,US,1990)；Erlich H,Ed.,“PCRTechnology.Principles andApplications for DNA Amplification”(Stockton Press,New York,NY,US,1989)；Sambrook J,et al.,“Molecular Cloning.A Laboratory Manual”(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,US,1989)；Bishop T,et al.,“Nucleic Acidand Protein Sequence.A Practical Approach”(IRL Press,Oxford,GB,1987)；Reznikoff W,Ed.,“Maximizing Gene Expression”(Butterworths Publishers,Stoneham,MA,US,1987)；Davis L,et al.,“Basic Methods in Molecular Biology”(Elsevier Science Publishing Co.,New York,NY,US,1986),Schleef M,Ed.,“Plasmidfor Therapy and Vaccination”(Wiley-VCH Verlag GmbH,Weinheim,DE,2001)。

本发明的细胞

本发明的多核苷酸以及包括所述多核苷酸的表达载体可被用于转化、转染或感染细胞，所述细胞可被所述多核苷酸或载体转化、转染或感染。因此，在另一方面，本发明涉及一种细胞，在本发明下文中的细胞，包括本发明的多核苷酸或包括本发明的核苷酸的载体。

本发明的细胞可通过由本领域技术人员公知的技术(例如感染、转导、转染、电穿孔和转化)使用被分离并整合到人工脂质体中的本发明多核苷酸或形成本发明的载体的部分导入本发明的多核苷酸或本发明的载体到细胞中获得。

本发明的细胞可以是原核的或真核的细胞。术语“原核的”和“真核”已在上文定义。在一个具体实施方式中，本发明的细胞是真核的细胞。在一个更特定的实施方式中，所述真核是包装细胞，即允许通过转染本发明的多核苷酸或本发明的慢病毒载体产生重组病毒载体的细胞。在一个具体实施方式中，所述包装细胞是人胚胎肾细胞系293(HEK293)。在一个更特定的实施方式中，所述包装细胞是包含SV40大T-抗原的人胚胎肾细胞系293(HEK293T)。

本发明的重组慢病毒和产生其的体外方法

本发明的多核苷酸或包括所述多核苷酸的载体可用于产生重组慢病毒，在表达慢病毒基因gag、pol、rev和包膜病毒蛋白的产物的细胞中通过所述多核苷酸或包括所述多核苷酸的载体的转染获得。

因此，在另一方面，本发明涉及一种重组慢病毒，在本发明下文中的重组慢病毒，包括本发明的多核苷酸和慢病毒整合酶，所述慢病毒整合酶包括引起所述整合酶无法催化病毒基因组整合到细胞基因组中的突变。

如在此所使用的术语“重组慢病毒”，指的是包括至少一种异源多核苷酸的慢病毒。术语“慢病毒”在上文已被定义。

如在此所使用的术语“慢病毒整合酶”，指的是慢病毒特别是HIV-1病毒int区的基因产物，特征是具有三个明显可识别的结构域：两侧为N-末端和C-末端区域的中心催化核心结构域，后者参与DNA结合。大多数逆转录病毒整合酶的单一多肽链包括大约290个残基。然而，存在一些重要的变体。例如，PFV整合酶明显更长，包括392个残基，ASV整合酶被编码为323个氨基酸长的蛋白，其在转译后被加工为由286个残基组成的最终多肽，其是具有全酶活性。特别地，所述HIV-1病毒的整合酶是病毒int区的基因产物，具有288氨基酸并被命名为IN。在一个具体实施方式中，慢病毒整合酶是包括突变的HIV-1整合酶，所述突变引起所述整合酶无法催化病毒基因组整合到细胞基因组中。术语“HIV-1整合酶”，如在此所使用的，指的是HIV-1整合酶多肽的成熟处理形式，在Uniprot数据库(2013年10月16日发行，第26版)中的登录号为C7B8I1。术语HIV-1整合酶也被用于指来自病毒的其他株或分离株的HIV-1整合酶。公众可容易地获得大量的HIV-1整合酶的核酸和氨基酸序列。参见HIV序列数据库，http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html；Los AlamosHIV Databases and Compendia,http://www.hiv.lanl.gov/。

本发明的重组慢病毒的慢病毒整合酶包括导致所述整合酶不能催化病毒基因组整合到细胞基因组中的突变。在一个优选实施方式中，所述突变是I型突变，即，与II型突变截然不同，直接影响整合的突变，所述II型突变引起影响病毒体形态和/或反转录多效性缺陷。I型突变的说明性的非限制性的实施例是影响三个残基中任何一个的那些突变，所述三个残基参与所述整合酶催化核心结构域：DX_39-58DX₃₅E(HIV-1的整合酶的D64、D116和E152残基)。在一个特定实施方式中，所述突变引起所述整合酶无法催化病毒基因组整合到细胞基因组中，其是所述整合酶的催化核心结构域的DDE模序的一个或多个氨基酸的替换，优选所述DEE模序的第一天冬氨酸残基被天冬酰胺残基的替换。在一个特定的实施方式中，所述整合酶包括SEQ ID NO:17序列。在一个更特定的实施方式中，所述整合酶由序列SEQ ID NO:17组成。

在一个特定的实施方式中，本发明的重组慢病毒包括来自水泡性口炎病毒(VSV)的包膜糖蛋白G。如在此所使用的术语“糖蛋白G”，指的是来自VSV包膜的蛋白，所述VSV包膜由于介导病毒附着到宿主细胞上，从而使病毒进入，其中，所述病毒被吞噬，然后介导病毒包膜与核内体膜(例如Uniprot KB数据库登录号Q6EH37)融合。术语糖蛋白G也用于指来自其他株或分离株病毒的VSV糖蛋白G并且也指其功能性等价变体。如在此使用的，“VSV糖蛋白G的功能性等价变体”被理解为在非许可的温度下能与VSV tsO45的热敏型G突变互补，并且在氨基酸序列中具有与VSV糖蛋白G序列最低一致性的多肽。参见Lefkowitz E,et al.,Virology 1990；178(2):373-383。VSV糖蛋白G的功能性等价变包括显示与上述糖蛋白G的不同天然变体具有至少60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、90％、95％、97％、99％的相似性或一致性的多肽。VSV糖蛋白G的变体可以是天然的和人工的。表达“天然变体”指的是在其他株中天然发生的如上定义的VSV糖蛋白G的所有那些变体。表达“人工变体”指的是重组的或合成的多肽。如在此所使用的术语“VSV”或“水泡性口炎病毒”，指的是弹状病毒科(rhabdoviridae)的大约11kb大小的负链RNA病毒。VSV也被称为“水泡性口炎印第安纳病毒”或“VSIV”。目前，八个VSV亚型已被现有技术描述。参见http:// viralzone.expasy.org/complete_by_species/21.html#tab6,October 2013。

在另一方面，本发明涉及一种用于产生本发明所述的重组慢病毒的体外方法，包括

(i)将真核细胞与本发明的多核苷酸或本发明的载体接触，其中所述细胞在足以使多核苷酸或载体进入所述细胞的条件下表达慢病毒基因gag、pol、rev和病毒包膜蛋白的产物，

(ii)使细胞维持在足以组装慢病毒的条件下。

术语“体外方法”意味着所述方法没有在主体(人或动物)的身体上实施，而是在从所述主体中分离的细胞上实施。

术语“重组慢病毒”和“真核细胞”。在一个特定实施方式中，真核相比为包装细胞，即允许通过转染本发明的多核苷酸或本发明的慢病毒载体产生重组病毒载体的细胞。在一个特定实施方式中，所述包装细胞是人类胚胎肾细胞系293(HEK293)。在一个更特定的实施方式中，所述包装细胞是包括SV40大T-抗原的人胚胎肾细胞系293(HEK293T)，SV40大T-抗原(HEK293T)允许含有SV40复制起点的转染质粒的附加体复制。

如在此所使用的术语“gag”，指的是编码衣壳p55蛋白的基因，所述衣壳由3个蛋白亚基(MA、CA和NC)形成。在一个特定实施方式中，所述gag基因源自HIV-1。

如在此所使用的术语“pol”，指的是编码病毒复制过程所必需的病毒酶的基因：蛋白酶(PRO)、反转录酶(RT)和整合酶(INT)。在特定实施方式中，所述pol基因源自HIV-1。

如在此所使用的术语“rev”，指的是编码负责处理信使RNA并将其运送到细胞质的Rev蛋白的基因。在一个特定实施方式，所述rev基因源自HIV-1。

如在此所使用的术语“包装”或“病毒包膜”，涉及覆盖通常源自宿主细胞膜部分的病毒衣壳的病毒结构。所述病毒包膜包括来自宿主细胞膜的磷脂和蛋白，还可包括病毒糖蛋白。如在此所使用的术语“病毒包膜蛋白”，涉及病毒包膜的蛋白成分。在一个优选实施方式中，包膜病毒蛋白是来自水泡性口炎病毒(VSV)的糖蛋白G。术语“糖蛋白G”和“水泡性口炎病毒”已被上文定义。

如在此所使用的术语“适合于进入的条件”，意思是本领域技术人员公知的那些条件，通过那些条件多核苷酸或载体能够进入真核细胞。可用于将多核苷酸或载体引入到真核细胞中的说明性的非限制性的技术示例包括使用本发明的多核苷酸(单独的或整合到人工脂质体中作为前述载体的一部分)的感染、转导、转染、电穿孔和转化。

根据产生本发明的重组慢病毒的方法的第一步骤，本发明的多核苷酸或载体与真核细胞接触，所述真核细胞表达慢病毒基因gag、pol、rev的产物和编码来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G的基因的产物。所述细胞可通过使真核与一种或多种多核苷酸接触来获得，所述多核苷酸包括慢病毒基因gag、pol和rev以及编码来自VSV的包膜糖蛋白G的基因。将多核苷酸引入到真核细胞中的任何上述技术都可用来获得包括慢病毒基因gag、pol和rev的产物以及编码来自VSV的包膜糖蛋白G的基因的产物的真核细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞通过转染一种或多种多核苷酸，优选一种或多种载体获得，包括慢病毒基因gag、pol和rev以及来自VSV的包膜糖蛋白G的基因。在一个具体实施方式中，所述细胞通过转染以下多核苷酸获得：

-包括rev基因的多核苷酸或载体

-包括来自VSV的包膜糖蛋白G的基因的多核苷酸或载体，以及

-包括gag和pol基因的多核苷酸或载体。

在一个特定的实施方式中，所述多核苷酸或载体包括gag和pol基因，其进一步包括rev应答元件(RRE)。术语“rev应答元件”已在上文定义。

在一个特定的实施方式中，所述真核细胞包括慢病毒基因gag、pol和rev的产物和病毒包膜蛋白，其通过共转染上述多核苷酸或载体获得。所述细胞可用于实施产生本发明的重组慢病毒的体外方法。因此，在一个特定的实施方式中，所述细胞表达慢病毒基因gag、pol、rev的产物和病毒包膜蛋白，其在与本发明的多核苷酸或载体接触之前，已被编码gag基因、pol基因、rev基因的一种或多种多核苷酸和编码病毒包膜蛋白的多核苷酸转染。

在另一个特定的实施方式，所述细胞与本发明的多核苷酸或载体和一种或多种多核苷酸同时接触，优选一种或多种载体，包括慢病毒基因gag、pol和rev和编码病毒包膜蛋白的基因。在一个更特定的实施方式中，所述细胞被本发明的多核苷酸或载体和一种或多种多核苷酸共转染，优选一种或多种载体，包括慢病毒基因gag、pol和rev和编码病毒包膜蛋白的基因。在一个甚至更特定的实施方式，所述细胞共转染以下多核苷酸：

-本发明的多核苷酸或载体，

-包括rev基因的多核苷酸或载体，

-包括编码病毒包膜蛋白的基因多核苷酸或载体以及

-包括gag和pol基因的多核苷酸或载体。

用于产生本发明的重组慢病毒的体外方法的步骤(ii)包括在足以组装慢病毒的条件下维持由步骤(i)获得的细胞。术语“足以组装慢病毒的条件”意思是本领域技术人员公知的允许病毒蛋白表达并组装释放到细胞的培养基中的新病毒颗粒的那些条件。这些条件根据细胞的类型变化。促进重组慢病毒释放到培养基中的示例性的条件可按照本发明实施例中的条件进行。使生产细胞生长适当的时间段以促进病毒载体释放到媒介中。通常，可使细胞生长约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时。当所述细胞为HEK293T时，组装慢病毒充足的条件包括转染后将细胞在新鲜培养基中在标准培养条件下培育数小时，优选转染后约24至约48小时之间，更优选转染后约48小时。

在一个特定的实施方式中，用于产生本发明的重组慢病毒的体外方法进一步包括纯化由所述细胞产生的重组慢病毒。所述纯化可通过本领域技术人员公知的任何技术进行。说明性地，重组慢病毒的纯化可通过收集所述体外方法的步骤(ii)之后获得的细胞的培养物以及将所述培养物的低速离心和过滤来进行。任选地，病毒留存物(viral stock)可通过超速离心浓缩。

本发明的稳定细胞和细胞群，产生其的体外方法及用来体外生产感兴趣的产物的 其用途

当本发明的重组慢病毒包括本发明的多核苷酸(所述多核苷酸包括感兴趣的多核苷酸)时，所述重组慢病毒可用于获得稳定表达所述感兴趣的多核苷酸的细胞系。因此，在另一方面本发明涉及一种稳定细胞，在本发明下文中的稳定细胞，其可表达包括本发明的多核苷酸的感兴趣的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸的序列，其中

-所述启动子位于相对于S/MAR和相对于复制起点的5’端，并且相对于第一LTR的3’端，并且

-所述感兴趣的多核苷酸位于相对于S/MAR的5’端或3’端，并且相对于复制起点的5’端或3’端。

如在此所使用的术语“稳定细胞”，涉及显示出沿着连续的通道表达感兴趣的多核苷酸的细胞。在优选实施方式中，用本发明的重组慢病毒细胞转导后至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天，所述细胞显示感兴趣的多核苷酸的表达。在优选实施方式中，在至少2、4、6、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、5000、10000个或更多通道的含有本发明的重组慢病毒的细胞转导后，所述细胞显示出感兴趣的多核苷酸的表达。

在另一方面，本发明涉及一种包括多种本发明的细胞的稳定细胞群。在一个具体实施方式中，本发明的稳定细胞群包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、多达100％的稳定表达感兴趣的多核苷酸的细胞。

在一个特定的实施方式中，所述稳定细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞。在一个更特定的实施方式中，所述哺乳动物细胞是包括SV40大T-抗原的人胚胎肾细胞系293(HEK293T)，其允许包含SV40复制起点的转染质粒的附加型复制。

术语“启动子”、“可操纵地连接的”、“S/MAR”、“复制起点”和“第一LTR”已在上文定义。

在另一方面，本发明涉及一种用于产生本发明的稳定细胞群的体外方法，包括以下步骤：

(i)使细胞与本发明的重组慢病毒接触，其中重组慢病毒包括与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸的序列，其中

-所述启动子位于相对于S/MAR和相对于复制起点的5’端以及相对于第一LTR的3’端，并且

-所述感兴趣的多核苷酸位于相对于S/MAR的5’端或3’端以及相对于复制起点的5’端或3’端，和

(ii)生长并维护所述细胞。

术语“体外方法”、“稳定细胞群”、“重组慢病毒”、“感兴趣的多核苷酸”、“启动子”、“可操纵地连接的”、“S/MAR”、“复制起点”和“第一LTR”已在上文定义。

用于产生本发明的稳定细胞群的体外方法的步骤(i)包括使细胞与本发明的重组慢病毒接触，以便细胞被转导，所述重组慢病毒包括与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸。如在此所使用的术语“转导”，指的是凭借外源多核苷酸序列通过病毒载体被引入到细胞中的过程。用重组慢病毒转导细胞的适合的条件是本领域技术人员公知的。举例说明，可以通过例如在细胞培养箱中，在37℃、在8μg/mL聚凝胺^TM存在的条件下，用慢病毒上清液孵育细胞4-6小时来进行，如在本申请实施例中说明的。

用于产生本发明的稳定细胞群的体外方法的步骤(ii)包括使细胞生长并维持。生长和维持细胞的条件根据细胞类型而变化，并且是本领域技术人员公知的。

虽然对于稳定细胞群的产生不是严格必需的，但是有可能选择已转导本发明的重组慢病毒的那些细胞。因此，在一个特定实施方式中，用于产生本发明的稳定细胞群的方法进一步包括筛选产生于步骤(i)的细胞。所述筛选可通本领域公知的过适合表达特定多核苷酸的细胞的筛选的任何技术完成。例如，克隆可从用于产生稳定细胞群的步骤(i)的方法的产生的细胞获得，通过例如细胞的限制性稀释。这样的克隆可通过适合多核苷酸的特异序列检测的本领域技术人员公知的任何技术进行分析以检测本发明的多核苷酸的整合，例如通过聚合酶链式反应(PCR)，或可以通过适合蛋白检测的本领域技术人员公知的任何技术，例如，荧光免疫检验法、流式细胞术、免疫印迹法等分析由本发明的多核苷酸编码的蛋白的存在。

当本发明的多核苷酸包括筛选基因时，根据筛选基因类型，筛选可通过将细胞放置在限制性条件下进行，即，假设对细胞有选择优势的基因表达的条件。例如，如果本发明的多核苷酸包括能够合成营养的筛选基因，则所述筛选包括将细胞放置在缺少所述营养的培养基中。当本发明的多核苷酸包括其表达赋予了抗生素抗性的筛选基因时，所述筛选包括将细胞放置在包括所述抗生素的培养基中。

在一个特定的实施方式中，本发明的多核苷酸包括赋予了抗生素，优选新霉素抗性的筛选基因，以便所述筛选包括将细胞放置在含有新霉素的培养基中。当本发明的多核苷酸包括编码荧光蛋白的基因时，所述筛选可通过荧光激活细胞分选(FACS)完成。

在另一方面，本发明涉及本发明的稳定细胞群用于体外产生感兴趣的产物的用途或涉及用于产生感兴趣的产物的体外方法，包括在允许感兴趣的多核苷酸表达的条件下培养本发明的稳定细胞群。

术语“稳定细胞群”和“体外方法”已在上文定义。术语“感兴趣的产物”，如在此所使用的，指的是其在细胞中的期望表达的任何多核苷酸的产物。感兴趣的产物可以是感兴趣的多肽或蛋白或一旦转录就产生能够与抑制其表达的mRNA杂交的RNA(例如microRNA、siRNA或shRNA)的多核苷酸。在一个特定的实施方式中，感兴趣的产物是感兴趣的蛋白。在一个更特定的实施方式中，感兴趣的蛋白是荧光蛋白。在一个甚至更特定实施方式中，感兴趣的产物是绿色荧光蛋白(GFP)。术语“感兴趣的蛋白”、“荧光蛋白”和“GFP”已在上文定义。

通过以下实施例对本发明进行描述，这些实施例仅是说明性的，对本发明的范围不构成限制。

实施例

材料和方法

哺乳动物细胞的培养和转染

将人胚胎肾细胞系HEK293A(CRL-1573，ATCC)在标准条件下，在补充1％Glutamax(Invitrogen，Prat del Llobregat，巴塞罗那，西班牙)、10mg/ml抗生素(青霉素和链霉素)和10％胎牛血清(Gibco，Invitrogen)的DMEM(Lonza，LonzaIbérica SA，巴塞罗那，西班牙)中进行培养。当细胞在筛选条件下培养时，将培养基替换为含有450μg/ml G418(遗传霉素，Invitrogen，LifeTechnologies)的DMEM。

由转染产生的慢病毒

根据磷酸钙法通过将四质粒瞬时转染到HEK293T细胞中产生病毒。转染前一天将细胞在15-cm皿中以1.1×10⁷细胞/皿进行接种。将细胞转染无内毒素的DNA(Qiagen，LasMatas，马德里，西班牙)。转染混合物为1xHBS、含3μg pRSV-Rev、3.75μg pMD.2G(VSV-G)、用于产生非整合型慢病毒载体的13μg pMDLg/pRRE或13μg pMDLg/pD64VRRE的0.125CaCl₂以及35μg的转移质粒(pLS系列)。该混合物用82μL质粒DNA、476μL CaCl₂ 2.5M和3343μLmilliQ水制备，并与3900μL2xHBS pH7.02逐滴混合。将转染混合物逐滴滴加到细胞中。在培养箱中将细胞与转染混合物孵育4-6h，然后洗涤，并更换培养基。48h后收集培养基，通过低速离心分离清除，并通过0.45-mm-孔大小的PVDF过滤器进行过滤。将病毒留存物在4℃下在SW28Beckman转子中以90.000g(26.000rpm)的速度通过超速离心浓缩2h。包含慢病毒的沉淀物在空气中干燥，并在400-600μl介质中在4℃重悬过夜。慢病毒的滴定和转导

生物病毒滴度通过参照HEK293T细胞在几个稀释度下转导来计算并通过FACS分析(转导单位/ml,T.U./mL)如下。转导的前一天，将2x10⁵参照细胞接种到6-孔的多孔板上，并在培培养箱在37℃通过用1mL的慢病毒上清液替换培养基孵育4-6h，所述慢病毒上清液在含有8μg/mL聚凝胺^TM的培养基中以1/10、1/100和1/1000定期稀释。用正常培养基代替接种物，在FACS之前将细胞培养48h。

通过对上清液(颗粒/mL)的qPCR定量测定含有全基因组的颗粒。稀释度为1/10至1/1000的变性颗粒被用作qPCR反应的模板(见以下引物和所用的具体条件)。在1ng至1pg范围的稀释度下运行质粒模板，获得标准曲线，并绘制参照值。测试的原始数据被插入到曲线中并转换为拷贝/细胞。

正则值在1:100的颗粒与T.U.的比中约为107-108T.U./ml。

基因组DNA的提取

将细胞(5-10x10⁶)受胰蛋白酶化或者将其刮下并转移到13mL-PE圆锥管中在PBS中洗涤，在台式离心机中低速(1500rpm)离心沉淀。将沉淀物重悬于裂解缓冲液中(100mMNaCl、Tris pH8.0 50mM、EDTA100mM和1％SDS)，转移到微型管中，用蛋白酶K(0.5μg/mL)在56℃下伴以缓慢搅拌消化过夜。然后加入250μL饱和的NaCl，混合并在微型离心机中以13000rpm速度离心之前，在室温下放置5min。在不扰动沉淀物的情况下，提取750μL上清液，并用500μL异丙醇沉淀，混合，在室温下在13000rpm离心下来，用70％乙醇洗涤，风干并在室温下重悬于1xTE中过夜，使用NanoDrop ND 1000分光光度计(NanoDropTechnologies，Bonsai Tecnologies Group SL，Alcobendas，马德里，西班牙)定量测定连续稀释的重悬DNA。

Hirt提取物

将胰蛋白酶化的细胞(通常5-10x106细胞)转移到13mL-PE圆锥管中，并在室温下在台式离心机中以低速(1000-1500rpm)离心沉淀3-5min。将沉淀物用冷的PBS洗涤，并进行如之前所述的离心。重悬的沉淀物被转移到微型离心管中，在4℃ 13.000rpm离心5分钟。将沉淀物重悬于Hirt′s裂解缓冲液中(0.6％SDS和10mM EDTA)，但不进行吹吸和涡旋，室温孵育15min。通过加入5M NaCl至终浓度1.4M使基因组DNA沉淀，通过颠倒缓慢混合，然后4℃储存过夜。将蛋白和基因组DNA在微型离心机中4℃、13.000rpm离心30-60min。含低分子量DNA的上清液用苯酚提取，乙醇沉淀，然后重悬于100-200μL水中。

Southern印迹杂交

将消化后的样品负载到1xTAE中的0.8％琼脂糖胶上，并通过在70-100V恒压下运行进行分离，直到染料的前端距离胶的末端1-3cm。负载包含待检测序列的对照的、定量的质粒以提供大小和数量(20pg、200pg和2ng)的参照。在300nm紫外光下对凝胶进行拍照。在蒸馏水中洗涤凝胶，然后在2xSSC中室温下平衡15min。用NaOH 0.5N，在室温下过夜，使凝胶通过毛细管作用在尼龙薄膜Hybond-Nplus(GE Healthcare)上形成印迹。薄膜通过在Stratalinker(Stratagene)中照射被固定，并用于进一步杂交。

用来检测neo的探针为质粒pcDNA3.1(Xmai-BstBI，0.8Kpb)(Invitrogen)的限制性内切核酸酶消化的纯化产物，用来检测AAVS1的探针为pZDonorAAVS1(KpnI-XmaI，0.7Kpb)(Sigma Aldrich)的限制性内切核酸酶消化的纯化产物。使用商购试剂盒RediPrime II(GE Healthcare)按照制造说明使用100μCi/反应的32P-alpha CTP进行标记。使用Micro Bio-Spin P-30(BioRad)柱根据制造说明除去没有整合的核苷酸，并通过闪烁计数来定量。膜在2xSSC湿润，在25cm管中用10-20mL PerfectHyb^TM Plus(SigmaAldrich)进行预杂交和杂交。含1-2x10⁷cpm/mL的杂交液进行66℃过夜。然后将膜在65℃在0.1x SSC0.5％SDS中通过连续的20分钟洗涤来进行洗涤。湿薄膜被暴露于磷屏成像系统的屏幕下，并使用STORM扫描仪显影。

实时荧光定量PCR

使用描述于Butler,SL et al.,J.Virol.2002,76(8):3739.DOI:10.1128/JVI.76.8.3739-3747.2002中的SYBR Green法测定源自用慢病毒体转导的培养物的非整合型的2-LTR的附加体形式的定量PCR。HEK293A细胞中白蛋白的拷贝数采用经过一些改良的前面描述的进行测定。在所有试验中，用系列稀释度的标准化DNA测定PCR的效率，单独的基因引物的特异性通过在每个qPCR试验结束时的熔解曲线来验证。标准曲线用范围在0.01pg至100ng的稀释量的pRRl.sin18.CMV.eGFP.Wpe质粒(Addgene)获得，其对应102-109个拷贝数。插入在使用下文所列的特异性引物扩增时获得的Ct值，并计算试验样品中的绝对拷贝数。使用与在基因组DNA和标准化的基因组DNA的稀释测试样品上的白蛋白单拷贝基因相似的Ct值计算细胞当量。2-LTR qPCR的阳性对照是包含被合成并并克隆到常规质粒中的LTR-LTR元件的片段。

所使用的引物是：

qLTRFw:TGTGTGCCCGTCTGTTGTGT(SEQ ID NO:18)

qLTRRv:GAGTCCTGCGTCGAGAGAGC(SEQ ID NO:19)

扩增子大小：95bp

qhAlbFw:GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT(SEQ ID NO:20)

qhAlbRv:ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC(SEQ ID NO:21)

扩增子大小：124bp

q2LTR R Rv2:TGAAGCACTCAAGGCAAGCTTTATT(SEQ ID NO:22)

q2LTR U5Fw2:GTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACT(SEQ ID NO:23)

扩增子大小：231bp

细胞仪分析

在转导后72小时进行流式细胞仪分析。将细胞胰蛋白酶化并进行收集，在培养级1X PBS中洗涤两次，然后在FACSDIVA(Becton Dickinson，San Agustín de Guadalix，马德里，西班牙)分类器中用适合Cherry FP激发的激光进行分析。在每种情况中，对10,000个事件进行计数，重复三次。

核型分析

细胞系在培养瓶中在5％CO₂的空气气氛中在37℃孵育。中期细胞通过标准的细胞遗传学方法制备。用秋水仙酰胺(0.1μg/mL，1.5小时，37℃；GIBCO，Strachclyde，UK)进行丝分裂阻滞，然后进行低渗处理(75mm KCl，15分钟，37℃)，在涂到载玻片上之前用甲醇/乙酸(3:1)固定。

荧光原位杂交分析(FISH)

对于FISH分析，细胞首先用秋水仙酰胺(Invitrogen)进行处理，然后用低渗盐溶液进行处理，之后收获。

一组探针被用于定位病毒的整合位点。使用来自载体质粒的DNA检测慢病毒体的整合位点。4q13.3染色体区带(cytoband)图谱的细菌人工染色体(BAC)，RP11-49L9，被用作对照。BAC从人BAC克隆文库RPCI-11(Children's Hospital Oakland ResearchInstitute，奥克兰，CA)中获得。1μg质粒或BAC DNA直接使用Nick Translation试剂盒((Cat#：07J00-001，Vysis)标记。该试剂盒被设计为使用荧光标记的dUTP(绿色光谱–或橙色光谱)进行DNA的荧光标记。标记后的DNA与Cot-1DNA和剪切的鲑鱼精DNA(Vysis，DowersGrove，IL，USA)共沉淀，以避免在基因组的重复DNA序列中非特异性杂交。沉淀后的DNA混合物重悬于杂交混合物中。

为了进行FISH反应，将探针和中期的涂片加热，共変性并在37℃下杂交过夜。杂交之后用0.4xSSC/0,3％NP40和2xSSC/0,1％NP40进行两次洗涤，然后在抗褪色溶液中(Abbott Molecular)用DAPI进行染色体复染。

使用运行Chromofluor图像分析系统的计算机(Cytovision，AppliedImagingLtd，Newcastle，UK)连接的冷却的电荷耦合器件(CCD)照相机(PhotometricsSenSys camera)捕捉细胞图像。

结果

实施例1：维持在高度循环的细胞中的慢病毒-附加体(慢病毒体)

方法描述

我们已经系统地分析了哺乳动物的ori和S/MAR序列的一系列组合对在以指数方式生长的细胞中的附加体1-、2-LTR的维持和分离的效果，所述细胞伴随着在培养物中在跨度两个月的时间里很多群体的倍增。

从被证明为ori或S/MAR的很短但是非常有特点的序列收集中，我们挑选了几个共享的两个主要特征。第一，两个序列的长度必须限定为能够被容纳于慢病毒载体中的大小，因为其他感兴趣的序列将会进一步被克隆入慢病毒载体，第二，ori/SMAR元件的真核非病毒源的特性。最有特点的ori序列源自DNA病毒；用于临床的主要缺点是它们对作为SV40大T抗原、乳头瘤病毒E1/E2蛋白或疱疹病毒EBNA的功能激活的病毒蛋白的严格要求。然而，它们均不可避免地有助于表达这些基因的细胞的细胞转化。这一真核的特性意味着它们已经证实在哺乳动物细胞中发挥作用并对被引发的细胞信号响应，从而以每个细胞周期一个(one-per-cell-cycle)的速率复制。

我们已筛选到符合所述特征的三个ori序列，其绘制在人β-球蛋白基因座(Kitsberg D et al.,Nature,1993,366(6455):588–590)，人c-myc启动子区(McWhinneyC.andLeffak M.,Nucleic Acids Res.1990,18(5):1233–1242)和A34上，源自人DNA甲基化转移酶(dnmt)的36bp共有序列(Araujo F.D.et al.,J.Biol.Chem.,1999,274(14):9335–9341)。此外，筛选了四个S/MAR序列，并已证明了在附加体的维持中有活性、有丝分裂稳定以及含有用于甲基化作用的转录活性调节域。所选择的锚定元件为1.8Kbp的人IFN-γ基因(hIFN-γ大)(Bode J.et al.,Science,1992,255(5041):195-7)；相同基因的0.7Kpb最小区(hIFN-γShort)(Ramezani A.et al.,Blood,2003,101(12):4717–4724)；包含在仓鼠脱氢叶酸还原酶基因(hDHFR)中的0.2Kbp最小区(Mesner L.D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2003,100(6):3281–3286)以及最后绘制在小鼠免疫球蛋白κ基因(mIgΚ)的0.4Kbp区(Cockerill P.N.and GarrardW.T.,Cell,1986,44(2):273–282)。

为了研究所选择的元件是否能够在慢病毒格式中胜任提高1-/2-LTR附加体的持久性，我们制备了含有使病毒整合酶活性失活的pol基因突变(D64N)的自灭活慢病毒[al,supra]。共同命名为pLS1的质粒(图2，SEQ ID NO:24)包含转录单元，以在随着重复细胞的分裂进行pLS-derivedLentiSome^TM的转导时简单地提出其维持。报告盒携带了由脊髓灰质炎病毒T2A CHYSEL序列分离的eGFP/neoRORF，允许分别通过FACSorter或抗生素的选择获得结果。所述报告盒已被放置在弱的但是无处不在的启动子的控制下，所述启动子包括CMV增强子和来自腺相关的病毒2(eC/p5)的早期转录单元的p5启动子。为了确保包含在ori(ARS)中的自主复制序列的激活，将ori和S/MAR序列二者定位于转录方向的下游。在图2中显示了一组构建体。所述构建体的平均大小是9Kbp，以确保达4Kbp cDNA的进一步克隆。将每种质粒用于与辅助质粒组合以产生如在材料和方法部分所述的慢病毒批次。

结构稳定性的计算机模拟(in silico)评估

为了预测在计算机模拟中携带ori/SMAR序列的pLS质粒的序列相对稳定性，我们进行了应力诱导型DNA脱稳(SIDD)分析。该研究的读数是沿任何核苷酸序列分离链所需的预测能量(由ΔG°表示)的理论曲线，允许在开放构造中测定特定的区域并具有分离链(脱稳的)的高倾向性，如在转录终点证明的，也为了假定的复制起点。

在图3中显示了以在该研究中使用的12种质粒获得的数据。该图表示缺乏原核生物序列的每种转移慢病毒质粒的序列使用WebSIDD程序(www.genomecenter.ucdavis.edu/ benham)的脱稳曲线。上述每个曲线是包含在每种构建体中的元件的示意图，基础慢病毒结构图表示上述对照构建体(缺少Ori/SMAR)的示意图。与S/MAR序列对应的区域涂以深蓝色阴影。Ori序列为黑色。所有的质粒均包含最高概率的开放结构，表示为在横跨S/MAR序列区(图标中的阴影区)的负的G(x)(以Kcal/mol为单位)。这些数据支持了慢病毒骨架中克隆的所有S/MAR序列中的活性开放区域的想法，并与目前描述的S/MAR序列(Benham et alJ.Mol.Biol.274,181-196 1997)一致。

转导和表达动力学的稳定性

将携带所述的ori/SMAR组合的IDLV用于在低MOI(2T.U./cel)下的人癌细胞系HEK293A细胞的指数生长培养物的转导。FACSorting纯化eGFP+细胞之后，将培养物维持五个群体倍增数(PD，1PD等于在用于两倍通道/周的培养条件下18小时)以允许建立附加体。之后培养物在G418存在或不存在的条件下维持，每8-10PDs(6至7.5天)评分存在的eGFP+细胞。

我们首先评估携带九个组合中的一个的慢病毒体^TM的持久性，所述九个组合为前面提及的源自hIFNγ(LS 1、2、5、6、9和10)的或源自mIgΚ(LS 4、8和12)ori和S/MAR(图4，上面的图)在没有选择压的条件下培养到70PDs之后(大约附加体建立后1.7月)，eGFP+细胞的百分比基于每种转导的慢病毒体^TM是可变的。明显地，大部分含有hIFNγ基因S/MAR的附加体(LS 2、5、6、9和10)显示了伴随细胞分裂的稳定增殖，然而含有mIgΚsmall 0.4Kbp S/MAR(LS4、8、12)的那些则不然。同样明显的是，这些慢病毒体^TM总是难以产生是因为还没有解决。正如所预期的，在存在G418选择压的条件下维持的培养物产生了对抗生素有抗性的细胞的同类培养物，含有G418的选择压(数据未显示)。

通过检测的结束时间点，用含有ori或S/MAR序列的IDLV转导的细胞获得的对照值失去了eGFP+细胞，如预期(图4中十字符号)。LS 5、6或10转导的培养物显示功能性附加体被留在50％的细胞中，然而在转导了LS 1、4、8或12的培养物中，附加体在70PDs以少于5％的细胞群体继续存在。重要的是，在该研究中，附加体LS 2和9通过显示的高达70％的eGFP+细胞维持和有效地区分。转导了LS 5、9和10的培养物坚持更长直到120PDs(转导后三个月)，获得了几乎相同的结果，因为在培养物中的eGFP+细胞的比例为大约细胞培养物的40-55％。

我们用在前述实验中出现较好结果和包含另外一组慢病毒的那些慢病毒体^TM进行了第二次试验。这些包含不同选择的符合实验设计中提到的标准之一的小尺寸元件。该新元件是小的0.2Kbp的仓鼠脱氢叶酸还原酶(DHFR)的S/MAR。然后我们构建并获得了分别与β-球蛋白、A34或c-myc ori组合的LS 3、7和11，然后按照相同方法比较LS 1、2、3、5、7、9、10和11，因此丢弃含0.4Kbp S/MAR元件的LS。

在转导了LS9、10和11在70PDs的培养物(附加体建立后54天)中，维持在90％的细胞中的附加体显示高效的复制、放电和分离(图4，下面的图)，尤其是当c-myc ori序列与测试的所有的S/MAR序列结合时获得的持久性。表1显示了图4中表示的数据的简介。

表1.来自HEK293A中复制慢病毒体的长期表达的终点数据

(*)在试验结束时的eGFP+细胞的百分数(dpt)

(**)108PD的数据与第一栏试验的终点值相对应

(***)仅来自69PD的试验的数据被考虑进行该计算

结论

从之前的实验可以得出以下结论：(i)我们的方法在慢病毒骨架中的可行性和(ii)很明显，在慢病毒背景中必须遵从反复实验(trial and error)策略，因为不是所有组合都能同样有良好的耐受性或理论上的预测。

显然，没有预测的一般性规则来找到包含在允许高效持久性的慢病毒骨架中的元件的最优组合。然而有一些显示出值得注意的特征的序列，即含有mIgΚ0.4KbpS/MAR的LS，不论与ori序列组合与否，看似不能胜任分离；然而人c-myc和β-球蛋白基因中的ori。不论与S/MAR序列共存与否，看似有效地继续存在。显而易见的，无论哪个测试的S/MAR序列被放置在一起，系列的具有人c-myc ori序列的慢病毒体^TM继续存在，事实对立面与用S/MARmIgΚ获得的结果相比。

总之，尽管当通过DNA病毒、质粒和微环输送时很好地表征了ori和S/MAR序列(Nehlsen K.et al.,Gene Therapy and Molcular Biology,2006,10:233)，但是我们已经证明被慢病毒复制的中间体强加的基因特征排除了关于在分裂细胞中的持久性的任何预测。

实施例2:转导细胞中的慢病毒体^TM基因分析

转导细胞中的慢病毒体^TM的染色体外状态分析

哺乳动物的ori功能依赖于后成原理是当前公知的，例如存在结合转录因子、染色质结构或核定位。很少知道除了需要锚定蛋白之外，对发挥作用的S/MAR序列的要求。

据我们所知，没有数据说明在经典慢病毒或IDLV转导或感染期间，1-/2-LTR外产物的状态，然后我们想知道当存在于慢病毒基因结构中时，ori/SMAR序列是否有生理学作用。我们首先提出LS是否运输整合形式或到什么程度以及是否所有组合都同等有效。我们根据在文献中(参见Nehlsen K.et al.,supra)描述的标准步骤采用了旨在揭示这一点的一组技术。

Southern印迹杂交研究

连续培养(>70PDs)后，基因组和低分子量DNA(Hirt提取物)均从由转导了一组LS的细胞中纯化出来，样品首先通过Southern印迹杂交进行研究。将在所有的LS的3’端进行一次切割的酶消化的基因组被印迹，并用特异性neo探针杂交，所述neo探针针对的是内源性基因座AAVS1，其表示每个HEK293细胞的三倍。当膜与特异性的neo探针杂交时(图5A，左边)，通过这种技术在研究的样品中没有获得的任何特异性的信号。AAVS1探针与所有的样品杂交，表明在加载于每个孔的细胞等价物中最高2倍变化(图5A，右)。在实验条件下，neo探针的灵敏度比AAVS1探针高10倍，所述AAVS1探针检测到3个拷贝数/细胞，并且在每个孔中相当于1百万细胞等价物，然后可以得出结论慢病毒体的整合拷贝数目低于低于0,3/细胞。当Hirt提取物通过Southern印迹杂交进行研究时，获得了相似的阴性结果，虽然在该情况中实现了较低灵敏性，并限制于大于50拷贝数每细胞的检测。的确，当高拷贝数存在时，即附加体建立结束时，来自转导了LS 1、2、5和10的培养物的Hirt提取物在Southern印迹杂交中显示了特异性的条带(图5B，左)。重要的是，在该时间点对那些培养物进行的FISH研究显示在所有评分的细胞(与通过Southern印迹杂交检测相关的数据(图5B，右))中有大量的斑点。

这些结果可共同地被解释为，如果慢病毒体在培养物中以低数目地继续存在，并且支持不能通过Southern印迹杂交检测它们。的确，来自其他作者的附加体微环质粒pEPI的数据(Nehlsen，Broll and Bode，2006)表明在不加选择压连续培养后，如我们的情况那样建立附加体后，在CHO培养物中维持10-15个拷贝数，并且仅在早期通过Southern印迹杂交检测出所述拷贝数。

PCR分析

尽管Southern印迹杂交分析提供的信息对检测探针序列的特定位置是必需的，但是当在一小部分细胞中寻找低拷贝数的序列时，该技术给出的信息很少。因为附加体有可能以低拷贝数存在，并且可能在一小部分细胞中，所以具有持久性性表型的培养物中的IDLV序列进一步通过qPCR表征。

对基因组DNA样品进行高度灵敏的定量qPCR，以检测2-LTR附加体形式序列的相对丰富，所述序列在69PD时留在转导了LS 2、3、5、7、9、10和11的培养物中，并与用未转导的或用整合型慢病毒或用没有ori和S/MAR序列的IDLV转导的亲本HEK293A DNA获得的信号相比。通过特异性qPCR将细胞等价物归一化以检测单拷贝白蛋白基因。图6显示了通过qPCR使用HIV LTR引物获得的数值在1个拷贝数/细胞(LS 3、5、7)、2-3个拷贝数/细胞(LS 2、9以及10)或大于9个拷贝数/细胞(LS11)之间。这样的数值支持了只有少数附加体拷贝数存在于培养物中的观点。缺少IDLV-ori/SMAR转导的细胞获得的数值在检测极限以下，并被认为等于用未转导的对照细胞获得的那些数值(图6，HEK293通道)，因此落入背景值。

总之，来自qPCR分析的数据表明被2-LTR PCR特异检测到的附加体形式维持在频率低下，并且在稳定时在不同转导培养物之间是可变的。

慢病毒体的染色体外状态

如前述数据所显示的，虽然LS-类型载体的拷贝数低，但是某些组合在细胞分裂期间保持稳定，而其他的可能没有。我们进行了FISH分析作为确定的证据证明与LS衍生的中间体的染色体的联系。图7显示了在70PD时转导了LS 5、6、9、10或11的细胞的中期的涂片。如在转导了LS 5、6、10或11的细胞中所示的，我们一直能找到与中期染色体有关的强烈的荧光运动，但不是在染色体臂中的等同位置的复制信号。虽然对于大部分转导了LS 9的细胞来说，这也是正确的，但是又很少的例外(参见图7中的插入)，其中，在两个染色体臂上观察到强的双重信号，表明环状构建体的整合事件。这样的结果，而不是其他的，能够认同某些通过常规的qPCR和PCR(图6)获得的数据。

当比较这些不同技术获得的结果时，明显的矛盾支持了其他作者揭露的基本原理。确实，FISH分析与qPCR产生的数据高度相关，并支持前者应当是选择程序的理念。因此，由于不同技术获得的结果存在不一致性，我们同意其他作者强调的中期涂片中转基因的FISH可视化的数据的争辩。然而，与整合时发生的染色单体的双重信号对比，单强度信号表明典型的染色体外拷贝。

结论

我们已经证明有可能通过在病毒基因组中插入ori和S/MAR序列将自主复制和分离能力转移给慢病毒逆转录的外产物(1-/2-LTR)。有助于本发明功能的主要因素有可能在外产物的细胞核贩运；研究的哺乳动物的性质的序列；以及慢病毒载体转导时对细胞生理机能最小程度的干扰之中。

我们也已经将位于复制调控单元(ori/SMAR)的转录单元(报告子)作为文献中的主要问题。明显的是，获得了不可预见的结果，因为若干但不是所有组合都同样有效，在这个背景下，几乎没有是无效的，如来自mIgΚ的0.4Kbp S/MAR，尽管在其他非病毒体系中的元件已很好地表征了，例如用质粒和微环的方法。因此，需要反复实验(trial and error)的方法来证明附加体的全部功能，所述附加体在慢病毒遗传学的背景中保持着不能检测到整合。

此类新型的源自慢病毒的附加体载体(慢病毒体)可利用临床前和临床试验中常规慢病毒载体的现有技术的状态，并成为更安全的下一代基因治疗方法的载体选择。

Claims (56)

1.一种多核苷酸，包括：

(i)源自慢病毒的第一长末端重复序列，

(ii)真核复制起点，其选自于具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3序列及其功能等价变体的复制起点组成的群组，

(iii)支架/基质结合区，其选自于具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6序列及其功能等价变体的支架/基质结合区组成的群组，

(iv)源自所述慢病毒的第二长末端重复序列，

其中所述真核复制起点和所述支架/基质结合区位于所述第一和第二长末端重复序列之间。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述支架/基质结合区位于相对于复制起点的5’端。

3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一和第二长末端重复序列源自HIV。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一长末端重复序列包括SEQ IDNO:7序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述第二长末端重复序列包括自失活突变。

6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述自失活突变是在长末端重复序列的U3区的缺失。

7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，包括在U3区的缺失的长末端重复序列包括SEQ ID NO:8序列。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，进一步包括选自

-多克隆位点，

-至少一种与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷，其中所述启动子位于相对于支架/基质结合区并且相对于复制起点的5’端，并且相对于第一长末端重复序列的3’端，以及所述感兴趣的多核苷酸位于相对于支架/基质结合区的5’端或3’端，并且相对于复制起点的5’端或3’端，以及

-其组合

的多核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其特征在于，所述启动子源自腺相关的病毒。

10.根据权利要求8或9所述的多核苷酸，其特征在于，源自腺相关的病毒的启动子是p5启动子或其功能等价变体。

11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，所述启动子包括SEQ ID NO:9序列。

12.根据权利要求8-11中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，进一步包括与启动子可操纵地连接的增强子区。

13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其特征在于，所述增强子区是巨细胞病毒启动子的增强子区。

14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其特征在于，所述巨细胞病毒启动子的增强子区包括SEQ ID NO:10序列。

15.根据权利要求8-14中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述感兴趣的多核苷酸选自筛选基因、编码感兴趣的蛋白的多核苷酸及其组合。

16.根据权利要求15所述的多核苷酸，其特征在于，所述筛选基因编码赋予了抗生素抗性的蛋白。

17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其特征在于，所述抗生素是新霉素。

18.根据权利要求15-17中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述感兴趣的蛋白是绿色荧光蛋白。

19.根据权利要求8-18中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，进一步包括通过编码共翻译的自处理序列的序列与感兴趣的第一多核苷酸可操纵地连接的感兴趣的第二多核苷酸。

20.根据权利要求19所述的多核苷酸，其特征在于，所述共翻译的自处理序列是源自猪捷申病毒的顺式水解酶元件。

21.根据权利要求19所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码共翻译的自处理序列的序列包括SEQ ID NO:11序列。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述感兴趣的第一多核苷酸编码感兴趣的蛋白，并且感兴趣的第二多核苷酸是筛选基因。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，进一步包括源自慢病毒的引物结合位点序列，其中所述引物结合位点序列位于相对于第一长末端重复序列的3’端和位于相对于复制起点以及支架/基质结合区的5’端，并且其中如果多核苷酸进一步包括选自于

-多克隆位点，

-与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷，其中所述启动子位于相对于支架/基质结合区和相对于复制起点的5’端，并且相对于第一长末端重复序列的3’端，以及所述感兴趣的多核苷酸位于相对于支架/基质结合区的5’端或3’端并且相对于复制起点的5’端或3’端，以及

-其组合

的多核苷酸序列，

则所述引物结合点位于相对于该多核苷酸序列的5’端。

24.根据权利要求23所述的多核苷酸，其特征在于，所述引物结合位点序列源自HIV。

25.根据权利要求24所述的多核苷酸，其特征在于，所述引物结合位点序列包括SEQ IDNO:12序列。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的多核苷酸，进一步包括源自位于第一和第二长末端重复序列之间的慢病毒的包装信号序列。

27.根据权利要求26所述的多核苷酸，其特征在于，所述包装信号序列源自HIV。

28.根据权利要求27所述的多核苷酸，其特征在于，所述包装信号序列包括SEQ ID NO:13序列。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的多核苷酸，进一步包括源自位于第一和第二长末端重复序列之间的慢病毒的Rev应答元件。

30.根据权利要求29所述的多核苷酸，其特征在于，所述Rev应答元件源自HIV。

31.根据权利要求30所述的多核苷酸，其特征在于，所述Rev应答元件包括SEQ ID NO:14序列。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸，进一步包括源自慢病毒的中央多嘌呤区，其中所述中央多嘌呤区位于相对于第一长末端重复序列的3’端和相对于复制起点和支架/基质结合区的5’端，并且其中如果多核苷酸进一步包括选自于

-多克隆位点，

-与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷，其中所述启动子位于相对于支架/基质结合区，并且相对于复制起点的5’端，并且相对于第一长末端重复序列的3’端，以及所述感兴趣的多核苷酸位于相对于支架/基质结合区的5’端或3’端并且相对于复制起点的5’端或3’端，以及

-其组合

的多核苷酸序列，

则所述中央多嘌呤区位于相对于该多核苷酸序列的5’端。

33.根据权利要求32所述的多核苷酸，其特征在于，所述中央多嘌呤区源自HIV。

34.根据权利要求33所述的多核苷酸，其特征在于，所述中央多嘌呤区包括SEQ ID NO:15序列。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的多核苷酸，进一步包括原核复制起点和筛选标记。

36.根据权利要求35所述的多核苷酸，其特征在于，所述原核复制起点包括SEQ ID NO:16序列。

37.根据权利要求35或36所述的多核苷酸，其特征在于，所述筛选标记是编码赋予了抗生素抗性的蛋白的基因。

38.根据权利要求37所述的多核苷酸，其特征在于，所述抗生素是氨苄青霉素。

39.一种载体，包括根据权利要求1-38中任一项所述的多核苷酸。

40.一种细胞，包括根据权利要求1-38中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求39所述的载体。

41.一种重组慢病毒，包括根据权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸和慢病毒整合酶，所述慢病毒整合酶包括引起所述整合酶无法催化病毒基因组整合到细胞基因组中的的突变。

42.根据权利要求41所述的重组慢病毒，其特征在于，所述突变是所述整合酶的催化核心结构域的DDE模序的一种或多种氨基酸残基的替代。

43.根据权利要求42所述的重组慢病毒，其特征在于，所述突变是由天冬酰胺残基替代所述DDE模序的第一天冬氨酸残基。

44.根据权利要求43所述的重组慢病毒，其特征在于，所述整合酶包括SEQID NO:17序列。

45.根据权利要求41至44中任一项所述的重组慢病毒，进一步包括来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G。

46.用于产生根据权利要求41至45中任一项所述的重组慢病毒的体外方法，包括

(i)将真核细胞与根据权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求39所述的载体接触，其中所述细胞在足以使多核苷酸或载体进入所述细胞的条件下表达慢病毒基因gag、pol、rev和病毒包膜蛋白的产物，以及

(ii)使细胞维持在足以组装慢病毒的条件下。

47.根据权利要求46所述的体外方法，其特征在于，所述细胞表达慢病毒基因gag、pol、rev和病毒包膜蛋白的产物，其已转染编码gag基因、pol基因、rev基因和编码编码病毒包膜蛋白的多种多核苷酸的一种或多种多核苷酸，其中所述转染在与所述多核苷酸或与所述载体接触的同时或之前进行。

48.根据权利要求47所述的体外方法，其特征在于，编码gag基因、pol基因、rev基因和病毒包膜蛋白的一种或多种多核苷酸被提供为：

-包括gag和pol基因的多核苷酸，

-包括rev基因的多核苷酸，和

-包括编码病毒包膜蛋白的基因的多核苷酸。

49.根据权利要求46至48中任一项所述的体外方法，其特征在于，慢病毒基因gag、pol和rev源自HIV-1。

50.根据权利要求46至49中任一项所述的体外方法，其特征在于，病毒包膜蛋白是来自水泡性口炎病毒的糖蛋白G。

51.根据权利要求46至50中任一项所述的体外方法，进一步包括纯化由细胞产生的重组慢病毒。

52.能够表达感兴趣的多核苷酸的稳定细胞群，包括根据权利要求1-38中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸的序列，其中

-所述启动子位于相对于支架/基质结合区，并且相对于复制起点的5’端和位于相对于第一长末端重复序列的3’端，

-感兴趣的多核苷酸位于相对于支架/基质结合区的5’端或3’端，并且相对于复制起点的5’端或3’端。

53.用于产生根据权利要求52所述的稳定细胞群的体外方法，包括以下步骤：

(i)使细胞与根据权利要求41至45中任一项所述的重组慢病毒接触，其中所述重组慢病毒包括与启动子可操纵地连接的感兴趣的多核苷酸的序列，其中

-所述启动子位于相对于支架/基质结合区以及相对于复制起点的5’端，并且位于相对于第一长末端重复序列的3’端，以及

-感兴趣的多核苷酸位于相对于支架/基质结合区的5’端或3’端，并且相对于复制起点的5’端或3’端，以及

(ii)生长并维护所述细胞。

54.根据权利要求53所述的方法，进一步包括筛选在步骤(i)产生的细胞。

55.根据权利要求52所述的稳定细胞群用于在体外生产感兴趣的产物的用途。

56.一种生产感兴趣的产物的体外方法，包括在能够使感兴趣的多核苷酸表达的条件下培养根据权利要求52的稳定细胞群。