ES2821782T3 - Episomas estables basados en vectores lentivirales no integrativos - Google Patents

Abstract

Polinucleótido que comprende (i) una primera repetición terminal larga derivada de un lentivirus, (ii) un origen de replicación eucariótico seleccionado de un grupo que consiste en los orígenes de replicación que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y una variante funcionalmente equivalente de las mismas que tienen al menos un 98 % de identidad de secuencia con las secuencias de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, (iii) una región de unión a matriz/armazón seleccionada del grupo que consiste en las regiones de unión a matriz/armazón que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y una variante funcionalmente equivalente de las mismas que tienen al menos un 98 % de identidad de secuencia con las secuencias de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, y (iv) una segunda repetición terminal larga derivada de dicho lentivirus, en el que dicho origen de replicación eucariótico y dicha región de unión a matriz/armazón se localizan entre dichas repeticiones terminales largas primera y segunda y en el que el polinucleótido no comprende el origen de replicación eucariótico que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 en combinación con la región de unión a matriz/armazón que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓN

Episomas estables basados en vectores lentivirales no integrativos

Campo de la invención

La presente invención cae en el campo de la transgénesis en eucariotas y, más específicamente, se refiere a episomas estables basados en vectores lentivirales no integrativos y su empleo para la generación de líneas celulares que expresan de manera estable un gen heterólogo de interés.

Antecedentes de la invención

Los lentivirus integrasa deficientes (IDLV) son lentivirus no replicativos que contienen mutaciones en el dominio catalítico de la integrasa viral. Como consecuencia de ello, los productos derivados de la retrotranscripción de ADNc circular llamado 1-LTR y 2-LTR se acumulan en el núcleo de la célula, pero no son capaces de integrarse en el genoma huésped (Figura 1) (Yáñez-Muñoz RJ etal., Nat. Med. 2006, 12: 348-353). Como cualquier otro ADN exógeno aquellos compuestos intermedios se pueden integrar en el ADN celular a frecuencias iguales (entre 103 a 105/célula).

Las propiedades extracromosomales (episomales) de los ADNc derivados de IDLV han evitado algunas de las desventajas de los lentivirus clásicos. Los vectores episomales muestran una mínima interferencia con el genoma celular, minimizando de este modo tanto el perfil de expresión dependiente de la posición de los transgenes entregados por el virus como el daño potencial debido a la mutagénesis de inserción. A pesar del entusiasmo inicial debido a estos nuevos vectores, una preocupación importante se deriva de su incapacidad para replicar de manera autónoma. Por lo tanto, las divisiones celulares sucesivas conducen a la extinción de las secuencias lentivirales por la dilución de las células que llevan los episomas, lo que limita su aplicabilidad a un conjunto limitado de tejidos y células con baja actividad mitótica o nula, como el sistema nervioso. Esto hace que las terapias génicas basadas en estos vectores se limitan a tejidos senescentes diana o células con muy baja tasa de divisiones celulares para garantizar la permanencia del fenotipo corregido impulsado por el transgén. Por desgracia, muchas enfermedades potencialmente tratables por terapia génica se basan en modificar las células en división elevada o tejidos sometidos a ciclos de expansión de división celular, como las células hematopoyéticas o las células madre epiteliales, así como a curas basadas en células madre/IPS que no son diana de estos vectores.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido que comprende:

(i) una primera repetición terminal larga derivada de lentivirus

(ii) un origen de replicación eucariótico seleccionado del grupo que consiste en orígenes de replicación que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ iD NO: 3 y una variante funcionalmente equivalente de las mismas que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con las secuencias de s Eq ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias,

(iii) una región de unión a matriz/armazón seleccionada del grupo que consiste en regiones de unión a matriz/armazón que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y una variante funcionalmente equivalente de las mismas que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con las secuencias de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, y

(iv) una segunda repetición terminal larga derivada de dicho lentivirus, en el que dicho origen de replicación eucariótico y dicha región de unión a matriz/armazón se sitúan entre la primera y la segunda repeticiones terminales largas y en el que el polinucleótido no comprende el origen de replicación eucariótico que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 en combinación con la región de unión a matriz/armazón que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4.

En un segundo aspecto la invención se refiere a un vector que comprende el polinucleótido del primer aspecto.

En un tercer aspecto la invención se refiere a una célula que comprende el polinucleótido del primer aspecto o el vector del segundo aspecto.

En un cuarto aspecto la invención se refiere a un lentivirus recombinante que comprende el polinucleótido del primer aspecto y una integrasa lentiviral que comprende una mutación que hace que dicha integrasa sea incapaz de catalizar la integración del genoma viral en un genoma celular.

En un quinto aspecto la invención se refiere a un método in vitro para la generación de un lentivirus recombinante de acuerdo con el cuarto aspecto, que comprende

(i) poner en contacto una célula eucariótica con un polinucleótido de acuerdo con el primer aspecto o con un vector de acuerdo con el segundo aspecto, en el que la célula expresa los productos de los genes lentivirales gag, pol, rev y una proteína de envuelta viral en condiciones adecuadas para la entrada del polinucleótido o el vector en dicha célula y

(ii) el mantenimiento de la célula en condiciones adecuadas para el ensamblaje del lentivirus.

En un sexto aspecto, la invención se refiere a una población celular estable que expresa un polinucleótido de interés que comprende el polinucleótido según el primer aspecto en el que dicho polinucleótido comprende la secuencia de un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en el que

- el promotor se localiza en una posición 5' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y con respecto al origen de replicación y en una posición 3' con respecto a la primera repetición terminal larga y - el polinucleótido de interés se localiza en una posición 5' o en una posición 3' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de replicación.

En un séptimo aspecto la invención se refiere a un método in vitro para generar la población celular estable del sexto aspecto, que comprende las etapas de

(i) poner en contacto las células con el lentivirus recombinante de acuerdo con el cuarto aspecto, en la cual el lentivirus recombinante comprende la secuencia de un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en el que

- el promotor se localiza en una posición 5' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y con respecto al origen de replicación y en una posición 3' con respecto a la primera repetición terminal larga y - el polinucleótido de interés se localiza en una posición 5' o en una posición 3' respecto a la región de unión a matriz/armazón y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de replicación y (ii) crecimiento y mantenimiento de las células.

En un octavo aspecto la invención se refiere al uso de la población celular estable de acuerdo con el sexto aspecto para la producción in vitro de un producto de interés.

En un noveno aspecto la invención se refiere a un método in vitro para la producción de un producto de interés que comprende el cultivo de una población celular estable de acuerdo con el sexto aspecto en condiciones que permitan la expresión del polinucleótido de interés.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Representación esquemática de etapas relevantes en ciclo lentiviral. (Superior)

Se muestran las etapas tempranas en infección de lentivirus (entrada, desencapsidación y retrotranscripción). La inhibición de retrotranscripción se remarca por un indicativo transversal de las restricciones de IDLV. (Inferior) A la derecha se muestran de manera lineal esquemática, productos derivados 1-LTR y 2-LTR de la retrotranscripción. Los dos últimos no son sustratos comunes para la integración por la enzima viral, pero se generan por n HeJ y HR respectivamente.

Figura 2. Diseño esquemático de plásmidos y vectores de LentiSome. (A) Se representan los elementos básicos contenidos en los plásmidos lanzadera pLS. Además de los elementos lentivirales mantenidos en los vectores, la unidad de transcripción contiene el promotor CMV/p5 (eC/p5) y los casetes reporteros, marcados por un triángulo y recuadros sombreados respectivamente. Las secuencias ori y S/MAR se muestran en relación con la unidad transcripcional en la mitad en el sentido hacia la posición 3' del vector. S/MAR se nombra por su tamaño en Kpb (véase el texto para detalles).

Figura 3. Análisis estructural de elementos requeridos para replicación episomal. La figura muestra el análisis de SIDD realizado sobre los plásmidos pLS que representan la G(x) en Kcal/mol (véase el texto) a lo largo de la secuencia del plásmido carente de secuencias procariotas. Los recuadros grises delimitan los elementos contenidos en los plásmidos lanzadera lentivirales tal como indica anteriormente el esquema de constructo de control (sin Ori/SMAR). La región correspondiente a la secuencia de S/MAR está sombreada en azul oscuro. Las secuencias de ori están en negro. La región con la mínima G(X) en cada constructo se ha remarcado con una región sombreada.

Figura 4. Expresión a largo plazo de LentiSomes replicantes en células HEK293A después del enriquecimiento por FACsorter de células de expresión eGFP. Se sometieron a ensayo conjuntos de LentiSomes en cada panel. Los cultivos se mantuvieron sin selección al establecer los episomas (5 días después de la transducción) y en los puntos de tiempo indicados el número de células eGFP+ se anotó por análisis FACS. Véase la figura 2 para la asignación de números y componentes combinados en cada caso. Los números en el gráfico corresponden a número de LS (véase la leyenda).

Figura 5. Análisis de transferencia de Southern para replicar episomalmente LentiSomes en células HEK293A. (A) Imagen representativa obtenida con el ADN genómico de la células transducidas-LS indicadas hibridadas con una sonda neo específica (izquierda) y una sonda al locus AAVS1. (B) Transferencia de Southern de extractos de Hirt a los 5 días después de la transducción con los clones indicados. La imagen de FISH a la derecha sondeada con el pLS (círculos blancos) muestra el número abundante de plásmidos y productos intermedios en células de transducidas con LS 5. Una transferencia Southern en tales condiciones es lo suficientemente sensible para desarrollar las bandas positivas.

Figura 6. Análisis PCR de LentiSomes replicantes episómicos. El ADN genómico de cultivos de eGFP+ en 69 duplicaciones de población tras la transducción con el LS indicado se usó para realizar qPCR 2-LTRusando cebadores específicos. El número de copias de 2LTR se detectó por qPCR de ADN genómico y se normalizó con respecto al gen de la albúmina, que es un gen de copia única en las células HEK293A. Los niveles previos se obtuvieron con muestras de células parentales no transducidas (HEK293A) y se obtuvo un control de PCR positivo con muestras transducidas con lentivirus competentes de integración. El número de células analizadas para cada cultivo fueron de media 104. Se representa un experimento representativo de cada tres independientes, y los valores son las medias de tres réplicas en la reacción.

Figura 7. Análisis FISH de LS de células HEK293A transducidas a 54 días después de la transducción. Propagaciones de metafase de campo representativo de células eGFP+ con LentiSomes replicantes episomalmente. La mayoría de las manchas blancas dobles son señales de sonda de control de centrómero positivo 4q13.3, mientras que secuencias de LS se detectan como puntos no dobles (las vistas ampliadas se indican mediante números).

Descripción detallada de la invención

Los inventores de la presente invención han desarrollado un sistema para la transgénesis estable de células eucariotas basado en vectores lentivirales que llevan una mutación que impide la integración mediada por integrasa en el genoma celular mediante la incorporación en estos vectores de un origen de replicación eucariótico y una región de unión a matriz/armazón (S/MAR) para la asociación con la matriz nuclear. Mediante la incorporación de estos elementos en vectores, los autores de la presente invención han realizado episomas lentivirales capaces de replicar y segregar en las células hijas, consiguiendo de esta manera una expresión estable de un transgén tanto en células quiescentes como dividiendo activamente las células sin la intervención de proteínas virales (véase la figura 4 y la tabla 1). Esta estrategia da como resultado un sistema de expresión con una mayor seguridad biológica en comparación con sistemas similares de la técnica anterior.

La cotransfección de una línea celular de empaquetamiento con el vector lentiviral diseñado por los inventores en la presencia de las proteínas necesarias para el empaquetamiento del vector en partículas lentivirales no integradoras infecciosas permite la producción de un nuevo tipo de lentivirus no integrador adecuado para la expresión estable de un transgén en una célula diana.

Por otra parte, los inventores han observado que no todas las combinaciones de orígenes de replicación eucariotas bien conocidos y S/MAR son igualmente eficaces para el establecimiento estable de episomas lentivirales. Por lo tanto, algunas de las combinaciones dan lugar a lentivirus que no son capaces de generar una expresión significativa estable del gen de interés (véase LS 4, 8 y 12 en la figura 4).

Basándose en los hallazgos anteriores, se han desarrollado los siguientes aspectos de la invención.

Polinucleótido de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido, en lo sucesivo polinucleótido de la invención, que comprende

(i) una primera repetición terminal larga derivada de un lentivirus,

(ii) un origen de replicación eucariótico seleccionado del grupo que consiste en los orígenes de replicación que tienen la secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, Se Q ID NO: 3 y una variante funcionalmente equivalente de la misma, que tienen al menos un 98 % de identidad de secuencia con las secuencias de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias,

(iii) una región de unión a matriz/armazón seleccionada del grupo que consiste en las regiones de unión a matriz/armazón que tienen la secuencia SEQ ID NO: 4, Se Q ID NO:5, SEQ ID NO: 6 y una variante funcionalmente equivalente de la misma, que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con las secuencias de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, y

(iv) una segunda repetición terminal larga derivada de dicho lentivirus,

en el que dicho origen de replicación eucariótico y dicha región de unión a matriz/armazón están situados entre dichas primera y segunda repeticiones terminales largas y en el que el polinucleótido no comprende el origen de replicación eucariótico que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 en combinación con la región de unión a matriz/armazón que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4.

El término “polinucleótido”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero unicatenario o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos o de ribonucleótidos.

Primera repetición terminal larga

El primer elemento del polinucleótido de la invención es una primera repetición terminal larga. Durante el curso natural de la transcripción inversa, las secuencias de los extremos 5' (R-U5) y 3' (U3-R) de ARN genómico retroviral se fusionan a través de la secuencia de repetición directa R, y duplicada para formar una molécula dúplex lineal con repeticiones terminales largas.

La inserción subsiguiente de esta molécula en un sitio dentro del ADN cromosómico de una célula huésped infectada permite que el ADN viral funcione como una plantilla para la transcripción de nuevas moléculas de ARN virales.

El término “repetición terminal larga “o “LTR”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de varios cientos de pares de bases en cada extremo del ADN sintetizado por la transcripción inversa de ARN retroviral que controla la integración del ADN viral en el ADN del huésped y la expresión de los genes del virus. Como se usa en el presente documento, LTR se refiere tanto a la secuencia de ADN de la LTR según se encuentra en el ADN sintetizado por la transcripción inversa del ARN retroviral como a la secuencia de ARN que es complementaria a dicha secuencia de ADN de la LTR. La LTR 5' y la LTR 3' sirven para promover la transcripción y la poliadenilación del ARN del virus. La LTR contiene todas las otras secuencias que actúan en cis necesarias para la replicación viral. Cada LTR comprende una U3, R y región U5.

El término “puño repetición terminal larga “o “primera LTR” o “LTR 5'” se refiere a un lentiviral LTR 5' que puede o no puede ser modificado a partir de su correspondiente LTR 5' nativa mediante la supresión y/o la mutación de secuencias endógenas y/o la adición de secuencias heterólogas. El LTR 5' puede ser natural o sintético.

Tanto la primera como la segunda LTR del polinucleótido de la invención se derivan de un lentivirus. El término “lentivirus”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo (o género científico) de los retrovirus que en la naturaleza dan lugar al desarrollo de la enfermedad lentamente debido a su capacidad de incorporar en un genoma huésped. Estos virus incluyen, en particular, virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), virus de inmunodeficiencia humana tipo 2 (VIH-2), virus de inmunodeficiencia simia (VIS), virus de inmunodeficiencia felina (VIF), virus de anemia infecciosa equina (VAIE), virus de inmunodeficiencia bovina (BIV), virus visna de las ovejas (VISNA) y virus de encefalitis y artritis caprina (CAEV). En una realización preferida, el lentivirus es VIH. Por lo tanto, en una realización particular, la primera y la segunda LTR derivan de VIH.

El término “virus de inmunodeficiencia humana” o “VIH”, como se usa en el presente documento, tiene la intención de incluir el VIH-1 y VIH-2. “VIH-1” significa virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1.

VIH-1 incluye, pero no se limita a, partículas de virus extracelulares y el VIH-1 forma junto con el VIH-1 células infectadas. VIH-2 significa virus de inmunodeficiencia humana de tipo 2. El VIH-2 incluye, pero no se limita a, partículas de virus extracelulares y VIH-2 forma junto con el VIH-2 células infectadas. Preferiblemente, VIH es VIH-1.

En una realización preferida, la primera LTR del polinucleótido de la invención comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 7. En una realización particular, la primera LTR del polinucleótido de la invención consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 7.

Origen de replicación eucariótico

El polinucleótido de la invención comprende un origen de replicación eucariótico. Los términos “origen de replicación eucariótico” u “origen de replicación eucariota” u “ori eucariota”, como se usan en el presente documento, se refieren a una secuencia del genoma particular, en la que la replicación se inicia en eucariotas. El término “eucariota”, como se usa en el presente documento, comprende los reinos Protista, Fungi, Plantae y Animalia.

El origen de replicación eucariótico que es parte del polinucleótido de la invención se selecciona del grupo que consiste en los orígenes de replicación que tienen la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y una variante funcionalmente equivalente de los mismos que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con las secuencias de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

El origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 corresponde al origen de replicación del gen de la pglobina como se ha descrito por Aladjem et al. (Science, 1995, 270: 815-819).

El origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 deriva de una secuencia de consenso de secuencias de replicación autónomas asociadas con secuencias alfasatélites previamente aisladas de células CV-1 de mono y fibroblastos de piel humana, tal como se ha descrito por Price et al. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278 (22): 19649-59.

El origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3 corresponde al origen de replicación de la región del promotor de c-myc humano ha se ha descrito por McWinney y Leffak (McWinney C. y Leffak M., Nucleic Acid Research 1990, 18(5): 1233-1242).

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 1, en la que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tienen al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 2, en la que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 3, en la que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

El término “variante funcionalmente equivalente”, como se usa en el presente documento, se refiere a una variante de cualquiera de los orígenes de replicación de la secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 que es sustancialmente idéntica y lleva a cabo sustancialmente la misma función que la secuencia de la que deriva. Como se usa en el presente documento, “sustancialmente idéntica” significa que la secuencia de ácido nucleico tiene un grado de identidad de secuencia de al menos un 98 % o al menos un 99 %, con la secuencia de la que se deriva. El grado de identidad de secuencia entre dos polinucleótidos se puede determinar por métodos convencionales, por ejemplo, por algoritmos de alineación estándar conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, BLAST Altschul S. F. et al. Basic Local Alignment Search Tool. J. Mol. Biol. 5 de octubre de 1990; 215:403-10). El grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de los polinucleótidos.

En un aspecto preferido, la variante del origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 comprende la siguiente secuencia de consenso CCTMDAWKSGBYTSMAAWTWBCMYTTRSCAAATTCC (SEQ ID NO:25)

en la que M es A o C; D es A, G o T; W es A o T; K es G o T; S es C o G; B es C, G o T; Y es C o T; R es A o G y H es A, C o T.

En otro aspecto, la variante del origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en A6, A7, A15, A16, A1, A5 y A39 como se muestra en la tabla I en el documento de Price et al. (J.Biol.Chem., 2003, 278:19649-19659).

El término “sustancialmente la misma función”, como se usa en el presente documento, significa que la variante mantiene sustancialmente la capacidad de iniciar la replicación en eucariotas. La persona experta sabe cómo determinar si una variante particular es capaz de iniciar la replicación en eucariotas y, por lo tanto, si es funcionalmente equivalente a los orígenes de replicación de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o s Eq ID NO: 3. La capacidad de una secuencia particular de iniciar la replicación se puede determinar por cualquier método adecuado conocido por el experto, por ejemplo, la resistencia a la digestión por DpnI (Frappier L. et al., Proc Natl Acad Sci. EE.UU., 1987, 84: 6668-72) por el ensayo de fragmento etiquetado temprano (Pearson et al., Somat. Cell. Mol. Genet. 1994,20: 147-152) y el ensayo de replicación autónoma basado en la incorporación de bromodesoxiuridina y el cambio de densidad (Araujo F. D. et al., supra; Frappier L. et al., supra).

Región de unión a matriz/armazón

El polinucleótido de la invención comprende una región de unión a matriz/armazón. El término “región de unión a matriz/armazón” o “S/MAR”, como se usa en el presente documento, se refiere a elementos de ADN ricos en AT no consensuados, de varios cientos de pares de bases de longitud, que organizan el ADN nuclear del genoma eucariota en unos 60.000 dominios de cromatina, por unión periódica al armazón o matriz del núcleo celular. Por lo general se encuentran en regiones no codificantes, tales como las regiones de flanqueo, regiones fronterizas de la cromatina e intrones.

La parte de S/MAR formadora del polinucleótido de la invención se selecciona del grupo que consiste en la S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y una variante funcionalmente equivalente de la misma que tienen al menos un 98 % de identidad de secuencia con las secuencias de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

La S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4 corresponde al 1,8 kpb S/MAR del gen de IFN-y humano (hIFN-y grande) se ha descrito por Bode et al. (Bode J. y otros, Science, 1992, 255: 195-7).

La S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 5 corresponde a 0,7 Kpb de la región mínima de S/MAR del gen de IFN-y humano (hIFN-y corto) como se ha descrito por Ramezani (Ramezani A. y otros, Blood 2003, 101: 4717-24).

La S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 6 corresponde a 0,2 Kpb de la región mínima de S/MAR del gen de la dihidrofolato reductasa humano (hDHFR) como se ha descrito por Mesner L. D. et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 2003, 100: 3281-86).

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 4, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende la S/MAR tiene la secuencia SEQ ID NO: 5 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 5, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende la S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 6 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 6, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

El término “variante funcionalmente equivalente”, como se usa en el presente documento, se refiere a una variante de cualquiera de las S/MAR de la secuencia SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 que es sustancialmente homóloga y lleva a cabo sustancialmente la misma función que la S/MAR de la que deriva. Como se usa en el presente documento, “sustancialmente homóloga” significa que la secuencia de ácido nucleico tiene un grado de identidad de secuencia de al menos un 98 % o al menos un 99 % con la secuencia de la que se deriva.

En una realización preferida, la variante funcionalmente equivalente de la S/MAR es una secuencia seleccionada basándose en las seis reglas establecidas que juntas o individualmente se han sugerido que contribuyen a la función de S/MAR (Kramer et al. (1996) Genomics 33, 305; Singh et al. (1997) Nucl. Acids Res 25, 1419). Estas reglas se han fusionado para dar el programa informático MAR-Wiz disponible de manera gratuita en http://genomecluster.secs.oakland.edu/MAR-Wiz.

El término “sustancialmente la misma función”, como se usa en el presente documento, significa que la variante mantiene sustancialmente las mismas funciones de la S/MAR de que se deriva, en particular, la capacidad de unirse específicamente a la nuclear de la matriz. El experto sabe cómo determinar si una variante particular es capaz de unirse específicamente a la matriz nuclear, por ejemplo, por los ensayos MAR in vitro o in vivo descritos por Mesner et al. (Mesner L. D. et al., supra). En otra realización, una secuencia específica puede considerarse como una variante de una S/MAR según la presente invención si la variante particular muestra propensión a separación de hebras de ADN. Esta propiedad puede determinarse usando un programa específico basado en métodos a partir de mecánica estadística de equilibrio. La técnica de análisis de desestabilización doble inducida por tensión (SIDd ) “[...] calculates the extent to which the imposed level o f superhelical stress decreases the free energy needed to open the dúplex at each position along a DNA sequence. The results are displayed as an SIDD profile, in which sites o f strong destabilization appear as deep minima [...]” tal como se define en el documento de Bode et al. (2005) J. Mol. Biol.

358,597. Los datos obtenidos a partir del análisis de SIDD (mínimo en la representación de salida) se han corroborado experimentalmente con regiones desapareadas de bases determinadas experimentalmente o se correlacionan con papeles funcionales de S/MAR del mismo modo que actividad de unión o retención de vector de plásmido. En general, estos datos sugieren que las propiedades de SIDD pueden incorporarse a cualquier estrategia computacional para buscar secuencias genómicas para sitios que tienen las características para funcionar como S/MAR, aunque los datos disponibles actualmente no son de apoyo suficiente para estimar sus fuerzas de unión relativas. El algoritmo de SIDD y la base matemática (Bi y Benham (2004) Bioinformatics 20, 1477) y el análisis del perfil de SIDD pueden realizarse usando el recurso de Internet disponible de manera gratuita en WebSIDD (http://www.genomecenter.ucdavis.edu/benham). Por consiguiente, en otra realización, el polinucleótido se considera una variante de la secuencia de S/MAR si muestra un perfil similar de SIDD al de S/MAR.

En un aspecto particular, el polinucleótido dado a conocer comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID N: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma y la S/MAR tiene la secuencia SEQ ID NO: 4 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 1, en la que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, y la S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 5 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 5, en la que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 1, en la que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, y la S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 6 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 6, en la que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 2, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, y la S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 4, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 2, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, y la S/MAR tiene la secuencia SEQ ID NO: 5 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 5, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 2, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, y la S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 6 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 6, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 3, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de la secuencia, y la S/MAR tiene la secuencia SEQ ID NO: 4 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 4, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 3, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, y la S/MAR tiene la secuencia SEQ ID NO: 5 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 5, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende el origen de replicación que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 3, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, y la S/MAR tiene la secuencia SEQ ID NO: 6 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 6, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias.

Ciertas S/MAR contienen regiones ricas en adenina. La presencia de regiones ricas en adenina en un polinucleótido es perjudicial para la transcripción del polinucleótido (si el polinucleótido es ADN) o para la replicación del polinucleótido (si el polinucleótido es ARN), ya que puede conducir a la terminación prematura de la transcripción/replicación y para la generación de transcripciones incompletas. En consecuencia, puesto que S/MAR son regiones que pueden realizar su actividad en cualquier orientación, es decir, son reversibles, el experto entenderá que en aquellos casos en los que la S/MAR contiene una región rica en adenina, la S/MAR se inserta en el polinucleótido de la invención con una orientación de manera que cualquier región rica en adenina en una cadena de la S/MAR no afecta negativamente a la transcripción de la secuencia del polinucleótido.

Por consiguiente, si el polinucleótido de la invención es un ADN de cadena sencilla (ssADN) o un ARN de cadena sencilla (ssARN), el polinucleótido comprende una secuencia que es el complemento inverso de la hebra de la S/MAR que comprende la región rica en adenina. Si el polinucleótido de la invención es un ADN de doble cadena (dsADN), entonces la S/MAR se inserta en el polinucleótido de manera que la hebra de la S/MAR que comprende la región rica en adenina no forma parte de la cadena codificante de dicho dsADN.

Los términos “ADN de cadena sencilla” o “ssADN”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a un polinucleótido de ADN que comprende una sola hebra.

Los términos “ARN de cadena sencilla” o “ssARN”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a un polinucleótido de ARN que comprende una sola hebra.

Los términos “ADN de doble cadena” o “dsADN”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a un polinucleótido de ADN que comprende dos cadenas de ADN antiparalelas y sustancialmente complementarias unidas por enlaces de hidrógeno.

El término “región rica en adenina”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una región en un polinucleótido en la que la adenina es el nucleótido más abundante. En una realización preferida, la región rica en adenina es una secuencia de poliadenina. El término “secuencia de poliadenina” o “secuencia de poliA”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende múltiples monofosfatos de adenosina consecutivos.

El término “hebra codificante”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la cadena de ADN que es complementaria a la cadena molde. Tal hebra de codificación presenta la misma secuencia de base que el ARNm (aunque con timina sustituida por uracilo) y corresponde a los codones que se traducen en proteínas.

En una realización más particular, cuando el polinucleótido de la invención comprende la S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 6 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 6, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, si dicho polinucleótido es un ssADN o un ssARN, entonces dicho polinucleótido comprende una secuencia que es el complemento inverso a la cadena de la S/MAR que comprende la secuencia poliA.

En otra realización más particular, cuando el polinucleótido de la invención comprende la S/MAR que tiene la secuencia SEQ ID NO: 6 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 6, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, si dicho polinucleótido es un dsADN, entonces la S/MAR se inserta en el polinucleótido de manera que la hebra de la S/MAR que comprende la región rica en adenina no forma parte de la cadena codificante de dicho dsADN.

Segunda repetición terminal larga

Los términos “segunda repetición terminal larga” o “segunda LTR” o “3' LTR” se refieren a una 3' LTR lentiviral, que puede o no puede modificarse a partir de su LTR 3' nativa correspondiente mediante la supresión y/o la mutación de secuencias endógenas y/o la adición de secuencias heterólogas. La LTR 3' puede ser natural o sintética.

La segunda LTR del polinucleótido de la invención se deriva del mismo lentivirus que la primera LTR. En una realización particular, la segunda LTR deriva de VIH.

En una forma de realización preferida, la segunda LTR comprende una mutación de auto-inactivación. El término “mutación”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un cambio en una secuencia de ácido nucleico. Dicha mutación incluye, pero no se limita a, la sustitución (es decir, el intercambio de uno o más nucleótidos por otros), inversión (es decir, un segmento de ADN dentro de un gen se invierte, a tal fin son necesarias dos rotaciones de 180°, una para la inversión de la secuencia y la otra para el mantenimiento de la polaridad del ADN), translocación (es decir, un segmento de un gen cambia de posición para estar en otro sitio diferente del mismo gen o en otro sitio del genoma), y las inserciones o deleciones de nucleótidos (es decir, la adición de uno o más nucleótidos (inserciones o adiciones) o la pérdida de uno o más nucleótidos (deleciones) teniendo como consecuencia cambios en el marco de lectura, un error de lectura que ocurre durante la traducción que va desde la formación de proteínas no funcionales a la ausencia de dicha proteína). El término “mutación de auto-inactivación”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una mutación que provoca que la LTR tenga una capacidad reducida para promover la transcripción de una transcripción en comparación con su correspondiente LTR nativa. La capacidad de una LTR de promover la transcripción de una transcripción se puede determinar por el experto mediante cualquier técnica adecuada para el análisis de la actividad promotora de una LTR, por ejemplo, mediante la determinación de la cantidad de producción de ARN derivado del promotor interno de LTR con el ensayo descrito por Zufferey et al. (Zufferey et al., Journal of Virology, 1998, 72: 9873-80).

El término “capacidad reducida para promover la transcripción de una transcripción” significa cualquier reducción significativa en la actividad del promotor de la LTR mutada en comparación con su contraparte nativa, por ejemplo, una reducción de al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o el 100 % en la actividad del promotor de la LTR mutada en comparación con su LTR nativa correspondiente. Las mutaciones en la LTR de lentivirus útiles para la generación de vectores lentivirales de auto-inactivación (SIN) se han descrito en la técnica (Zufferey R et al., J. Virol.

1998, 72: 9873 hasta 9880).

En una realización preferida, cuando el polinucleótido de la invención se incorpora en un vector lentiviral, la mutación de auto-inactivación presente en la segunda LTR no afecta a la capacidad de transducción de dicho vector en comparación con un vector equivalente que comprende la LTR nativa correspondiente, es decir, la capacidad del vector para transferirse a una célula diana permanece esencialmente sin afectar. El experto puede determinar la capacidad de transducción de un vector lentiviral mediante cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, la determinación de los títulos de vector en las células diana por el método descrito por Zufferey et al. (Zufferey et al., supra).

En una realización particular, la mutación es una deleción.

En otra realización particular, la mutación afecta a la región U3 de la LTR. El término “región U3 de la LTR”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la región de la LTR que comprende elementos potenciadores y promotores. En el caso particular de la VIH-1 LTR, la región U3 contiene todos los determinantes principales responsables de la regulación de la actividad de promotor de VIH-1 LTR, como el denominado elemento de respuesta negativa, NFkB y sitios de unión de NF-ATc, sitios de unión de Sp1 y una caja TATA.

En una realización preferida, la mutación es una deleción en la región U3 de la segunda LTR. Cualquier deleción en la región U3 que es capaz de reducir la capacidad de la LTR de promover la transcripción de una transcripción es adecuada para el polinucleótido de la invención, por ejemplo, una deleción de la caja TATA y/o una deleción de uno o más de los sitios de unión para los factores de transcripción. En una realización más preferida, la deleción en la región U3 de la segunda LTR comprende la deleción de la secuencia comprendida entre las posiciones -418 (5') y -18 (3'), indicando la numeración las posiciones de nucleótidos en relación con el sitio de caperuza al inicio de R, en la posición 1. En una realización particular, la segunda LTR que comprende una deleción en la región U3 comprende la secuencia SEQ ID NO: 8. En una realización más particular, la segunda LTR que comprende una deleción en la región U3 consiste en la secuencia SEQ ID NO: 8.

En los polinucleótidos de la invención, el origen de replicación eucariótico y la S/MAR están situados entre la primera y la segunda LTR. En una realización preferida, el origen de replicación se sitúa en una posición 5' con respecto a la S/MAR, siendo el orden de los elementos del polinucleótido de 5' a 3':

- Primera LTR

- Origen de replicación

- S/MAR

- Segunda LTR

En otra realización particular, la S/MAR se encuentra en una posición 5' con respecto al origen de la replicación, siendo el orden de los elementos del polinucleótido de 5' a 3':

- Primera LTR

- S/MAR

- Origen de replicación

- Segunda LTR

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En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende además una secuencia de polinucleótido elegida entre

- un sitio de clonación múltiple,

- un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en el que el promotor se sitúa en una posición 5' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y con respecto al origen de replicación y en una posición 3' con respecto a la primera repetición terminal larga y el polinucleótido de interés se sitúa en una posición 5' o en una posición 3' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de replicación y

- una combinación de los mismos.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende un sitio de clonación múltiple. El término “sitio de clonación múltiple”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un fragmento de ADN que comprende varios sitios diana para endonucleasas de restricción cercanas entre sí de tal manera que escinden el polinucleótido en una sola posición. Por lo tanto, después del tratamiento del polinucleótido con dichas endonucleasas es posible insertar un gen de interés que tiene extremos compatibles, pudiendo ser dichos extremos romos, 5'-saliente o 3'-salientes. En principio, es posible utilizar cualquier sitio de clonación múltiple conocido en la técnica, tal como que el que se puede obtener a partir de vectores del tipo de pUC18, pUC19, etc. La inserción de polinucleótidos de interés se lleva a cabo utilizando métodos de biología molecular estándar tal como se describe, por ejemplo, por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982), “DNA C loning: A Practica! Approach," Volúmenes l y II). El sitio de clonación múltiple comprende preferiblemente al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios diana para una endonucleasa de restricción, formados cada uno de ellos por al menos 4, al menos 5 o al menos 6 nucleótidos.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor.

El término “promotor”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciones para controlar la transcripción de uno o más polinucleótidos, situados aguas arriba de la(s) secuencia(s) de polinucleótido(s), y que se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para ARN polimerasa dependiente de a Dn , sitios de iniciación de la transcripción, y cualesquiera otras secuencias de ADN, incluyendo, pero sin limitarse a, sitios de unión de factores de transcripción, represor, y sitios de unión de proteína activadora, y cualesquiera otras secuencias de nucleótidos conocidas en la técnica para actuar directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a partir el promotor. Dicho promotor podría ser tanto constitutivo como inducible. Un “promotor constitutivo” es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor “inducible” es un promotor que se regula en función de condiciones fisiológicas o de desarrollo. Un promotor “específico de tejido” solo está activo en tipos específicos de células/tejidos diferenciados. En una realización preferida, el promotor es un promotor vírico, más preferiblemente un promotor derivado de un virus adenoasociado (AAV). El término “virus adenoasociado” o “AAV” se refiere a virus que pertenecen al género Dependovirus de la familia Parvoviridae. En una realización más particular, el promotor derivado de un AAV es el promotor p5 o una variante funcionalmente equivalente del mismo. El término “promotor p5”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al promotor de AAV que controla la expresión de Rep68 y Rep 78 (Yue Y. B.et al., Hum Gene Ther 2010, 21 (6): 728­ 38). En una realización más particular, el promotor derivado de un AAV comprende la secuencia SEQ ID NO: 9. En una realización aún más particular, el promotor derivado de un AAV consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9. En una realización particular, el promotor es una variante funcionalmente equivalente del promotor p5. El término “variante funcionalmente equivalente”, tal como se utiliza en el contexto del promotor p5, se refiere a una variante que es sustancialmente homóloga al promotor p5 y realiza sustancialmente la misma función. El término “sustancialmente homólogo” significa que la secuencia de ácido nucleico tiene un grado de identidad de secuencia de al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, a menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con la secuencia de la que se deriva. Una variante que realiza sustancialmente la misma función que el promotor p5 es una variante que es capaz de controlar la expresión de un polinucleótido de interés situados en dirección 3' de dicha variante.

El término “unido operativamente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la relación funcional y ubicación de una secuencia promotora con respecto a un polinucleótido de interés (por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia). Generalmente, un promotor unido operativamente es contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un promotor no tiene que ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión.

Cuando el polinucleótido de la invención comprende un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor, los componentes del polinucleótido tienen la siguiente disposición:

- el promotor se encuentra

aguas arriba de la S/MAR y el origen de replicación, es decir, en una posición 5' con respecto a la S/MAR y con respecto al origen de la replicación, y

aguas abajo de la primera LTR, es decir, en una posición 3' con respecto a la primera LTR; y

- el polinucleótido de interés se encuentra

aguas arriba o aguas abajo de la S/MAR, es decir, en una posición 5' o en la posición 3' con respecto a la S/MAR y

aguas arriba o aguas abajo del origen de replicación, es decir, en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de la replicación.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención que comprende un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor comprende además una región potenciadora unida operativamente al promotor. El término “potenciador”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un elemento de secuencia de ADN en el que los factores de transcripción se unen para aumentar la transcripción de genes. En una realización más particular, la región potenciadora es la región potenciadora del promotor de citomegalovirus. En una realización aún más particular, la región potenciadora del promotor de citomegalovirus comprende la secuencia SEQ ID NO: 10. En una realización aún más particular, la región potenciadora del promotor de citomegalovirus consiste en la secuencia SEQ ID NO: 10.

El término “polinucleótido de interés”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier polinucleótido cuya expresión en una célula es deseable. El polinucleótido de interés puede ser un gen que codifica un polipéptido o proteína o un polinucleótido que, una vez transcrito, genera un ARN que es capaz de hibridar con un ARNm que inhibe su expresión como, por ejemplo, un microARN, un siARN o shARN. En una realización particular, el polinucleótido de interés se selecciona a partir de un gen de selección, un polinucleótido que codifica una proteína de interés y una combinación de los mismos.

El término “gen de selección”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un gen cuya expresión confiere resistencia a un antibiótico, un gen que permite sintetizar un nutriente esencial que está ausente en el medio de cultivo o un gen que proporciona una ventaja selectiva a células que han incorporado dicho gen de selección.

En una realización preferida, el gen de selección es un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a un antibiótico, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a la higromicina, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a la neomicina, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a puromicina, etc. En una realización más preferida, el gen de selección codifica una proteína que confiere resistencia a la neomicina.

Alternativamente, el gen de selección es un gen que permite sintetizar un nutriente esencial que está ausente en el medio de cultivo. Un ejemplo incluye el gen trpB de Escherichia coli, que codifica la subunidad beta del triptófano sintetasa. Este gen permite la supervivencia y proliferación de células de mamífero en medio que contiene indol en lugar de triptófano. Un segundo ejemplo incluye el gen hisD de Salmonella typhimurium, que codifica la histidinol deshidrogenasa, que cataliza la oxidación dependiente de NAD de L-histidinol L-histidina en dos etapas. Solo las células de mamíferos que expresan el producto de hisD pueden sobrevivir en medio que carece de histidina y que contiene histidinol (Hartman SC y RC Mulligan, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 1988, 85 (21): 8047-51).

Un ejemplo de un gen de selección que proporciona una ventaja selectiva a células que han incorporado dicho gen incluye el gen que codifica dihidrofolato reductasa (DHFR) en células manipuladas genéticamente para ser deficientes en DHFR. La proteína DHFR cataliza la reducción de 5,6-dihidrofolato a 5,6,7,8-tetrahidrofolato, una etapa esencial en el metabolismo de las purinas. El uso de DHFR permite la selección genética de células deficientes de DHFR mediante el cultivo de las mismas en ausencia de precursores de purina hipoxantina y timidina (HT) (RJ Kaufman y PA Sharp, J. Mol Biol, 1982, 159: 601-21).

El término “proteína de interés”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proteína cuya expresión en una célula es deseable. En una realización particular, la proteína de interés es una proteína fluorescente, preferiblemente la proteína verde fluorescente o GFP. El término “proteína fluorescente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que tiene fluorescencia intrínseca cuando se excita con radiación electromagnética a la longitud de onda apropiada.

Proteínas fluorescentes representativas pueden incluir, pero no se limitan a, sgGFP, sgBFP, BFP desplazada al azul GFP (Y66H), proteína azul fluorescente, CFP - proteína cian fluorescente, Cian GFP, DsRed, RFP monomérica, EBFP, ECFP, EGFP, GFP (S65T), GFP desplazada al rojo (rsGFP), GFP de tipo silvestre, no excitación de UV (wtGFP), GFP de tipo silvestre, excitación de UV (wtGFP), GFPuv, HcRed, rsGFP, Sapphire GFP, sgBFP.TM., sgBFPTM. (BFP súper brillante), sgGFP.TM., sgGFP.TM. (Gf P súper brillante), peso GFP, GFP amarilla y YFP. En una realización preferida, la proteína fluorescente es GFP.

El término “proteína verde fluorescente” o “GFP”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína de 239 aminoácidos con un peso molecular de 26,9 kDa y que emite fluorescencia brillante verde cuando se expone a la luz azul ultravioleta. Aunque muchos otros organismos marinos tienen proteínas fluorescentes verdes similares, GFP se refiere tradicionalmente a la proteína primero aislada de la medusa A. victoria. GFP de A. victoria tiene una excitación principal máxima a una longitud de onda de 395 nm y una menor a 475 nm. Su máximo de emisión es a 509 nm. El rendimiento cuántico de fluorescencia de GFP es de 0,79. En A. victoria, GFP transduce la quimioluminiscencia azul de aequorina en luz verde fluorescente por la transferencia de energía.

Alternativa o adicionalmente, la proteína de interés puede ser una proteína de interés terapéutico de tal manera que el polinucleótido de la invención puede utilizarse para la expresión de dicha proteína in vitro o para el tratamiento de enfermedades que requieren la expresión de dicha proteína. Por lo tanto, la invención proporciona polinucleótidos que comprenden uno o más polinucleótidos de interés que codifican una proteína de interés terapéutico incluyendo, sin limitación, eritropoyetina (EPO), leptinas, hormona liberadora de corticotropina (CRH), hormona liberadora de hormona del crecimiento (GHRH), hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), hormona liberadora de prolactina (PRH), hormona liberadora de melatonina (MRH), hormona inhibidora de prolactina (PIH), somatostatina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), somatotropina u hormona del crecimiento (GH), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante del folículo (FSH), tirotropina (TSH 30 u hormona estimulante de la tiroides), prolactina, oxitocina, hormona antidiurética (ADH o vasopresina), melatonina, factor de inhibición Mülleriano, calcitonina, hormona paratiroidea, gastrina, colecistoquinina (CCK), secretina, factor de crecimiento similar a la insulina tipo I (IGF-I), factor de crecimiento similar a la insulina tipo II (IGF-II), péptido natriurético atrial (ANP), coriónica humana gonadotropina (hCG), insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático (PP), leptina, neuropéptido Y, renina, angiotensina I, angiotensina II, factor VIII, factor IX, factor tisular, factor VII, factor X, trombina, factor V, factor XI, factor XIII, interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2), factor-alfa de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8 y quimiocinas), interleucina 12 (IL-12), interleucina 16 (IL-16), interleucina 15 (IL-15), interleucina 24 (IL-24), interferones alfa-, beta-, gamma-, CD3, ICAM-1, LFA-1, LFA-3, quimiocinas incluyendo 1a RANTES, MIP-1a, MIP-1 p, factor de crecimiento neuronal (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor beta de crecimiento transformante (TGF-beta), proteínas morfogénicas óseas (BMPs), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF y KGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF y similares), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento glial, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento endotelial, alfa-1 antitripsina, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de micrófagos y granulocitos (GM-CSF), cardiotrofina 1 (CT-1), oncostatina M (OSM), anfiregulina (AR), ciclosporina, fibrinógeno, lactoferrina, activador plasminógeno de tipo tisular (tPA), quimotripsina, inmunoglobulinas, hirudina, superóxido dismutasa, imiglucerasa, p-glucocerebrosidasa, a-L- glucosidasa-a, a-L- iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, galsulfasa, galactosidasa-a-humana A, a-1 inhibidor de la proteinasa, lactasa, enzimas pancreáticas (lipasa, amilasa, proteasa), adenosina deaminasa, inmunoglobulinas, albúmina, toxinas botulínicas tipo A y B, colagenasa, desoxirribonucleasa I humana, hialuronidasa, papaína, L-asparaginasa, lepirudina, estreptoquinasa, factor de transformación de células beta (TGF-p) inhibidor de péptidos tales como los descritos en los documentos WO0331155, WO0393293 y WO200519244, casetes de expresión adecuados para la molécula de ARN de transcripción de interferencia (shRNA, siRNA, miRNA, ribonucleoproteína U1 modificado ARN).

En una forma de realización particular, el polinucleótido de interés es un gen de selección, preferiblemente un gen de selección que codifica una proteína que confiere resistencia a un antibiótico, más preferiblemente un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a la neomicina.

En otra realización particular, el polinucleótido de interés es una polinucleótido que codifica una proteína de interés, más preferiblemente la proteína verde fluorescente (GFP).

En una realización, el polinucleótido de la invención comprende un primer polinucleótido de interés y un segundo polinucleótido de interés. En este caso, el primer y el segundo polinucleótido de interés pueden unirse operativamente al mismo promotor o cada polinucleótido de interés puede unirse operativamente a promotores separados, los cuales pueden ser idénticos o diferentes. Cualesquiera de los promotores mencionados anteriormente pueden ser útiles para la regulación de la expresión del primer polinucleótido y de los segundos polinucleótidos de interés.

En una realización más preferida, el polinucleótido de la invención comprende un primer polinucleótido de interés y un segundo polinucleótido de interés, en el que el segundo polinucleótido de interés está unido operativamente al primer polinucleótido de interés por una secuencia que codifica una secuencia de auto-procesamiento cotraduccional. El término “unido operativamente” se ha definido anteriormente. El término “secuencia de autoprocesamiento cotraduccional”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polipéptido que dirige su propia separación de la proteína de crecimiento durante la traducción. En una realización particular, la secuencia de auto-procesamiento cotraduccional es un “elemento activo en cis hidrolasa” o “elemento chysel”. El término “elemento activo en cis hidrolasa” o “elemento de chysel” se refiere a un péptido pequeño (por lo general entre 19 y 33 aminoácidos) que, durante su traducción, interactúa con el túnel de salida del ribosoma para inducir el “saltar” del último enlace peptídico en el terminal C de este péptido. Los elementos chysel se encuentran en algunos de los picornavirus, como FMDV, en los que permiten las poliproteínas de autoprocesamiento cotraduccional rápidas.

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Cuando se inserta entre dos genes, un elemento chysel induce un “salto” durante su traducción tras lo cual el ribosoma continúa para traducir el segundo gen produciendo así dos proteínas discretas. Ejemplos ilustrativos no limitativos de elementos chysel incluyen T2A de Thosea asignavirus, P2A de teschovirus-1 porcino, F2A o E2A de virus A de la rinitis equina). En una realización particular, el elemento de hidrolasa que actúa en cis deriva de teschovirus porcino. En una realización más particular, la secuencia que codifica una secuencia de auto-procesamiento cotraduccional comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11. En una realización aún más particular, la secuencia que codifica una secuencia de auto-procesamiento cotraduccional consiste en la secuencia SEQ ID NO: 11.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende un primer polinucleótido de interés, preferiblemente un polinucleótido que codifica una proteína de interés, más preferiblemente un polinucleótido que codifica la GFP, y un segundo polinucleótido de interés, preferiblemente un gen de selección, más preferiblemente un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a un antibiótico, incluso más preferiblemente un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a la puromicina, en el que el primer y los segundos polinucleótidos de interés se unen operativamente por una secuencia de autoprocesamiento cotraduccional, preferiblemente un elemento de hidrolasa que actúa en cis derivado de teschovirus porcino, más preferiblemente la secuencia SEQ ID NO: 11.

El polinucleótido de la invención puede utilizarse para generar un plásmido de transferencia como parte de un sistema de tercera generación para la generación de lentivirus recombinante. Por lo tanto, el polinucleótido de la invención puede comprender todos los elementos de procesamiento virales necesarios para la producción de lentivirus incompetentes para la replicación, así como elementos para mejorar el título viral y la función global del vector.

Por lo tanto, en una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende además una secuencia de sitio de unión de cebador derivado de un lentivirus, en el que dicha secuencia de sitio de unión de cebador se encuentra en una posición 3' con respecto a la primera LTR y en una posición 5' con respecto al origen de replicación y a la S/MAR, y en el que si el polinucleótido comprende además una secuencia de polinucleótido elegida entre

- un sitio de clonación múltiple,

- un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en el que el promotor se encuentra en una posición 5' con respecto a la S/MAR y con respecto al origen de la replicación y en una posición 3' con respecto a la primera LTR y

el polinucleótido de interés se encuentra en una posición 5' o en una posición 3' con respecto a la S/MAR y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de la replicación y

- una combinación de los mismos,

entonces, el sitio de unión a cebador se encuentra en una posición 5' con respecto a dicha secuencia de polinucleótidos.

El término “secuencia de sitio de unión a cebador” o “secuencia de PBS”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polinucleótido que se une al cebador de ARNt de transcripción inversa. En una realización particular, la secuencia de PBS se deriva de VIH. En una realización más particular, la secuencia de PBS derivada de VIH comprende la secuencia SEQ ID NO: 12. En una realización aún más particular, la secuencia de PBS derivada de VIH consiste en la secuencia SEQ ID NO: 12.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende además una secuencia de señal de empaquetamiento derivada de un lentivirus situado entre la primera y la segunda LTR. El término “secuencia de señal de empaquetamiento”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polinucleótido que permite la encapsidación del ARN viral en viriones. En una realización particular, la secuencia de señal de empaquetamiento es la secuencia ^ derivada de VIH. En una realización más particular, la secuencia de señal de empaquetamiento derivada de VIH comprende la secuencia SEQ ID NO: 13. En una realización aún más particular, la secuencia de señal de empaquetamiento derivada de VIH consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13. En una realización preferida, la secuencia de señal de empaquetamiento se encuentra en la proximidad de la primera LTR. En otra forma de realización preferida, la secuencia de señal de se encuentra en próxima a la segunda LTR.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende además un elemento de respuesta Rev (RRE) derivado de un lentivirus situado entre la primera y la segunda LTR. El término “elemento de respuesta a rev” o “RRE”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polinucleótido que mejora el transporte de ARN viral no empalmado fuera del núcleo aumentando los títulos virales. En una realización particular, el RRE se deriva de VIH.

En una realización más particular, el RRE de VIH comprende la secuencia SEQ ID 20 NO: 14. En una realización aún más particular, el RRE de VIH consiste en la secuencia SEQ ID NO: 14. En una realización particular, el RRE se encuentra entre un sitio de empalme donante y un sitio de empalme de aceptador. El término “sitio de empalme de donante” o “SD”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia o dominio de un ácido nucleico presente en el extremo 5' de un intrón que marca el comienzo del intrón y su límite con la secuencia de codificación o exón anteriores. El término “sitio de empalme de aceptador” o “SA”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia o dominio de un ácido nucleico presente en el extremo 3' de un intrón que marca el comienzo del intrón y su límite con la secuencia de codificación siguiente (exón). En una realización particular el SD es el sitio de empalme 5' del gen gag en el genoma VIH-1.

En una realización particular, el AD es el sitio de empalme 3' del gen pol en el genoma de-VIH-1. Para una descripción detallada de los genomas SD Y AD de VIH-1 véase, por ejemplo, Kammler et al., Retrovirology 2006, 3:89.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende además un tracto de polipurina central (cPPT) derivado de un lentivirus, en el que dicho tracto de polipurina central se encuentra en una posición 3' con respecto a la primera LTR y en una 5' posición con respecto al origen de la replicación y a la S/MAR, y en el que si el polinucleótido comprende además una secuencia de polinucleótido seleccionada entre

- un sitio de clonación múltiple,

- un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en el que el promotor se encuentra en una posición 5' con respecto a la S/MAR y con respecto al origen de la replicación y en una posición 3' con respecto a la primera LTR y

el polinucleótido de interés se encuentra en una posición 5' o en una posición 3' con respecto a la S/MAR y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de la replicación y

- una combinación de los mismos,

entonces el tracto de polipurina central se encuentra en una posición 5' con respecto a dicha secuencia de polinucleótidos. El término “tracto de polipurina central” o “cPPT”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polinucleótidos que, durante la infección celular, crea un colgajo de ADN central que aumenta la importación nuclear del genoma viral, dando como resultado una transducción más eficiente. En una realización particular, el cPPT se deriva de VIH. En una más realización más particular, el cPPT de VIH comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15.

En una realización aún más particular, el cPPT de VIH comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende secuencia de PBS, una secuencia de señal de empaquetamiento, un RRE y un cPPT, preferiblemente la secuencia de PBS de SEQ ID NO: 12, la secuencia de señal de empaquetamiento de Se Q ID NO: 13, el RRE de SEQ ID NO: 14 y la cPPT de SEQ ID NO: 15.

El polinucleótido de la invención también puede comprender los elementos necesarios para su propagación en procariotas. Por lo tanto, en una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende además un origen de replicación procariota y un marcador de selección. El término “origen de replicación procariota”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia particular en la que se inicia la replicación en procariotas. Ejemplos ilustrativos no limitativos de orígenes de replicación en procariotas son el origen de pUC derivado de pBR322 en E. coli; pSC101 derivado de Salmonella y origen 15A derivado de p15A. El término “procariota” tal como se usa en el presente documento, comprende los dominios Bacteria y Archaea. En una realización particular, el origen de replicación procariota es el origen del vector pUC. En una realización más particular, el origen procariota consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 16. En una realización aún más particular, el origen procariota consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 16. El término “marcador de selección” se ha descrito en detalle anteriormente y es igualmente aplicable. En una realización particular, el marcador de selección es un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a un antibiótico. En una realización más particular, el marcador de selección que codifica una proteína que confiere resistencia a un antibiótico es un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a la ampicilina.

Vector de la invención

En otro aspecto, la invención se refiere a un vector, en adelante vector de la invención, que comprende el polinucleótido de la invención. El término “vector”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un constructo capaz de entregar, y que expresa opcionalmente, uno o más polinucleótidos de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, ADN desnudo o vectores de expresión de ARN, plásmido, cósmido o vectores de vectores de fago, ADN o vectores de expresión de ARN asociados con agentes de condensación catiónica, ADN o vectores de expresión de ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, tales como células productoras. El vector puede ser un vector de clonación o un vector de expresión. El término “vector de clonación”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un vector adecuado para la propagación y para obtener los polinucleótidos adecuados o construcciones génicos o vectores de expresión en diferentes organismos heterólogos adecuados para la purificación del vector. El término “vector de expresión”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un vector adecuado para la expresión de un polinucleótido en una célula

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diana. El vector de expresión de la invención es un vector lentiviral. El término “vector lentiviral”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende las secuencias necesarias de manera que después de transcribir y traducir dichas secuencias en una célula con expresión de los genes lentivirales gag, pol, rev y un gen que codifica una proteína viral con envoltura, se genera una partícula viral con capacidad para infectar una nueva célula.

Los vectores de la invención se pueden obtener por medio de técnicas ampliamente conocidas en la técnica. Véase Brown T, “Gene Cloning” (Chapman & Hall, Londres, GB, 1995); Watson R, et al., “ADN recombinante”, 2 a ed. (Scientific American Books, Nueva York, Nueva York, EE.UU., 1992) ;. Alberts B, et al., “Molecular Biology of the Cell” (Garland Publishing Inc., Nueva York, Nueva York, EE.UU., 2008); Innis M, et al., eds, “PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications” (Academic Press Inc., San Diego, CA, Estados Unidos, 1990); Erlich H, Ed., “PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification” (Stockton Press, Nueva York, Nueva York, EE.UU., 1989);. Sambrook J, et al., “Molecular Cloning. A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU., 1989); Bishop T, et al., “Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach” (IRL Press, Oxford, GB, 1987); Reznikoff W, Ed,. “Maximizing Gene Expression” (Butterworths Publishers, Stoneham, MA, EE.UU., 1987); Davis L, et al., “Basic Methods in Molecular Biology” (Elsevier Science Publishing Co., New York, Nueva York, EE.UU., 1986), Schleef M, Ed., “Plasmid for Therapy and Vaccination” (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, DE, 2001).

Célula de la invención

El polinucleótido de la invención y el vector de expresión que comprende dicho polinucleótido se puede usar para transformar, transfectar o infectar células que pueden transformarse, transfectarse o infectarse por dicho polinucleótido o vector. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una célula, en lo sucesivo célula de la invención, que comprende un polinucleótido de la invención o un vector que comprende el nucleótido de la invención.

La célula de la invención puede obtenerse introduciendo en una célula el polinucleótido de la invención o el vector de la invención mediante técnicas bien conocidas por el experto, tales como infección, transducción, transfección, electroporación y transformación usando el polinucleótido de la invención aislado, incorporado en liposomas artificiales o formando parte del vector de la invención.

La célula de la invención puede ser tanto una célula procariota como eucariota. Los términos “procariota” y “eucariota” se han definido anteriormente. En una realización particular, la célula de la invención es una célula eucariota. En una realización más particular, la célula eucariota es una célula de empaquetamiento, es decir, una célula que permite la producción de vectores virales recombinantes mediante transfección con el polinucleótido de la invención o con el vector lentiviral de la invención. En una realización particular, la célula de empaquetamiento es la línea celular de riñón embrionario humano 293 (HEK293). En una realización más particular, la célula de empaquetamiento es la línea celular de riñón embrionario humano 293 que comprende el antígeno T grande de SV40 (HEK293T).

Lentivirus recombinante de la invención y método in vitro para la generación del mismo

El polinucleótido de la invención, o el vector que comprende dicho polinucleótido, se puede utilizar para generar un lentivirus recombinante mediante transfección de dicho polinucleótido, o el vector que comprende dicho polinucleótido, en una célula que expresa el producto de los genes lentivirales gag, pol, rev y una proteína viral con envoltura.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un lentivirus recombinante, en lo sucesivo lentivirus recombinante de la invención, que comprende un polinucleótido de la invención y una integrasa lentiviral que comprende una mutación que provoca que dicha integrasa sea incapaz de catalizar la integración del genoma viral en el genoma celular.

El término “lentivirus recombinante”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un lentivirus que comprende al menos un polinucleótido heterólogo. El término “lentivirus” se ha definido previamente.

El término “integrasa lentiviral”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al producto génico de la región int de un lentivirus, en particular del virus VIH-1, que se caracteriza por tener tres dominios claramente identificables: el dominio de núcleo catalítico central flanqueado por los dominios N-terminal y C-terminal, este último implicado en la unión al ADN. Una cadena polipeptídica sencilla de la mayoría de las integrasas retrovirales comprende aproximadamente 290 residuos. Sin embargo, están presentes algunas variaciones importantes. Por ejemplo, PFV integrasa es significativamente más larga, comprendiendo 392 residuos, y ASV integrasa está codificada como una proteína larga de 323 aminoácidos que se procesa postraduccionalmente para el polipéptido final que consiste en 286 residuos, el cual es totalmente activo enzimáticamente. Particularmente, la integrasa del virus VIH-1 es el producto génico de la región int del virus, que tiene 288 aminoácidos y que se denomina IN. En una realización particular, la integrasa lentiviral es la integrasa de VIH-1 que comprende una mutación que provoca que dicha integrasa sea incapaz de catalizar la integración del genoma viral en un genoma celular. El término “integrasa de VIH-1”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la forma procesada madura del polipéptido de integrasa de VIH-1 definida con el número de acceso C7B8I1 en la base de datos Uniprot (lanzada el 16 de octubre 2013, Versión 27). El término

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integrasa de VIH-1 también se utiliza para referirse a integrasa de VIH-1 de otras cepas o aislamientos del virus. La secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos de un gran número de integrasas de VIH-1 están fácilmente disponibles para el público. Véase HIV Sequence Database (base de datos de secuencia de VIH), http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html; Los Alamos HIV Databases and Compendia, http://www.hiv.lanl.gov/.

La integrasa lentiviral del lentivirus recombinante de la invención comprende una mutación que provoca que dicha integrasa sea incapaz de catalizar la integración del genoma viral en un genoma celular. En una realización preferida, dichas mutaciones son mutaciones de tipo I, es decir, mutaciones que afectan directamente a la integración a diferencia de las mutaciones de tipo II, que provocan defectos pleiotrópicos que afectan a la morfogénesis del virión y/o a la transcripción inversa. Ejemplos ilustrativos no limitativos de mutaciones de tipo I son aquellas mutaciones que afectan a cualquiera de los tres residuos que participan en el dominio de núcleo catalítico de la integrasa: DX39-58DX35E (D64, D116 y residuos E152 de la integrasa del VIH-1). En una realización particular, la mutación que provoca que dicha integrasa sea incapaz de catalizar la integración del genoma viral en el genoma celular es la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos del motivo DDE del dominio de núcleo catalítico de la integrasa, preferiblemente la sustitución del primer residuo aspártico de dicho motivo DEE por un residuo de asparagina. En una realización particular, la integrasa comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17. En una realización más particular, la integrasa consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 17.

En una realización particular, el lentivirus recombinante de la invención comprende una envoltura de glicoproteína G de un virus de estomatitis vesicular (VSV). El término “glicoproteína G”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína de la envoltura del VSV que permite la entrada del virus, ya que media en la unión viral a la célula huésped, donde el virus se endocitocita, y luego media la fusión de la envoltura viral con la de la membrana endosómica (por ejemplo, Uniprot KB Database número de acceso Q6EH37). El término glicoproteína G también se utiliza para referirse a glicoproteína G de VSV a partir de otras cepas o aislados del virus y también a variantes funcionalmente equivalentes de los mismos. Tal como se utiliza en el presente documento, “variante funcionalmente equivalente de glicoproteína G de VSV” se entiende como un polipéptido capaz de complementar el mutante G sensible a la temperatura de VSV tsO45 a una temperatura no permisiva y que tiene una identidad mínima en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de la glicoproteína G de VSV. Véase Lefkowitz E, y otros, Virology 1990; 178 (2): 373­ 383. Las variantes funcionalmente equivalentes de glicoproteína G de VSV incluyen polipéptidos que muestran al menos 60 %, 65 %, 70 %, 72 %, 74 %, 76 %, 78 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % de similitud o identidad con las diferentes variantes naturales de glicoproteína G mencionada anteriormente. Las variantes de glicoproteína G de VSV pueden ser a la vez naturales y artificiales.

La expresión “variante natural” se refiere a todas aquellas variantes de Glicoproteína G de VSV definidas anteriormente que se producen naturalmente en otras cepas. La expresión “variante artificial” se refiere a un polipéptido recombinante o sintético. Los términos “VSV” o “virus de la estomatitis vesicular”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a virus de ARN de cadena negativa de aproximadamente 11 kb de tamaño de la familia Rhabdoviridae. VSV también se conoce como “virus de la estomatitis vesicular indiana” o “VSIV”. En la actualidad, se han descrito ocho subtipos de VSV en la técnica. Véase http://viralzone.expasy.org/complete_by_species/21.html#tab6, octubre de 2013.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para la generación de lentivirus recombinante de la invención que comprende

(i) poner en contacto una célula eucariota con el polinucleótido de la invención o con el vector de la invención, en el que la célula expresa los productos de los genes lentivirales gag, pol, re vy una proteína de envoltura viral en condiciones adecuadas para la entrada del polinucleótido o vector en dicha célula y

(ii) mantener la célula en condiciones adecuadas para el montaje del lentivirus.

El término “método in vitro’’ implica que dicho método no se lleva a cabo en el cuerpo de un sujeto, humano o animal, sino en células aisladas de dicho sujeto.

Los términos “ lentivirus recombinante” y “célula eucariota”. En una realización particular, la célula eucariota es una célula de empaquetamiento, es decir, una célula que permite la producción de vectores virales recombinantes mediante transfección con el polinucleótido de la invención o con el vector lentiviral de la invención. En una realización particular, la célula de empaquetamiento es la línea celular de riñón embrionario humano 293 (HEK293). En una realización más particular, la célula de empaquetamiento es la línea celular de riñón embrionario humano 293 que comprende el antígeno T grande de SV40 (HEK293T) que permite la replicación episomal de plásmidos transfectados que contienen el origen de replicación de SV40.

El término “gag”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica la proteína p55 de la cápside formada por 3 subunidades de proteínas (MA, CA y NC). En realización particular, el gen gag se deriva de VIH-1.

El término “pol”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica las enzimas virales

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necesarias para el proceso de replicación viral: proteasa (PRO), transcriptasa inversa (RT), e integrasa (INT). En una realización particular, el gen pol se deriva de VIH-1.

El término “rev”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica la proteína Rev responsable del procesamiento de ARN mensajero y su transporte al citoplasma. En una realización particular, el gen rev se deriva de VIH-1.

El término “envoltura” o “envoltura viral”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la estructura viral que cubre la cápside viral que normalmente se deriva de porciones de las membranas de célula huésped. La envoltura viral comprende fosfolípidos y proteínas de la membrana de la célula huésped, y puede incluir también glicoproteínas virales. El término “proteína de envoltura viral”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un componente de la proteína de la envoltura viral.

En una realización preferida, la envoltura de proteína viral es la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV). Los términos “glicoproteína G” y “virus de la estomatitis vesicular” se han definido anteriormente.

El término “condiciones adecuadas para la entrada”, tal como se usa en el presente documento, significa aquellas condiciones conocidas por el experto en la materia por las cuales un polinucleótido o vector puede entrada una célula eucariota. Ejemplos ilustrativos no limitativos de las técnicas que se pueden utilizar para introducir polinucleótidos o vectores en una célula eucariota incluyen infección, transducción, transfección, electroporación y transformación usando el polinucleótido de la invención, ya sea aislado o incorporado en liposomas artificiales o como una parte del vector mencionado anteriormente.

De acuerdo con la primera etapa del método para generar el lentivirus recombinante de la invención, se pone en contacto el polinucleótido o vector de la invención con una célula eucariota que expresa los productos de los genes lentivirales gag, pol, rev y el producto del gen que codifica la glicoproteína G de la envoltura a partir del virus de la estomatitis vesicular. Dicha célula se puede obtener poniendo en contacto una célula eucariota con uno o más polinucleótidos que comprenden los genes lentivirales gag, pol y rev y el gen que codifica la glicoproteína G de envoltura desde VSV. Cualquiera de las técnicas mencionadas anteriormente para la introducción de un polinucleótido en una célula eucariota se pueden utilizar para obtener la célula eucariota que comprende el producto de los genes lentivirales gag, pol y rev y el producto del gen que codifica la glicoproteína de envoltura G desde VSV. En una realización particular, dicha célula se obtiene por transfección con uno o más polinucleótidos, preferiblemente uno o más vectores que comprenden los genes de lentivirus gag, pol y rev y el gen que codifica la glicoproteína de envoltura G desde VSV. En una realización particular, la célula se obtiene mediante transfección con los siguientes polinucleótidos:

- un polinucleótido o vector que comprende el gen rev

- un polinucleótido o vector que comprende el gen que codifica la envoltura de glicoproteína G de VSV y

- un polinucleótido o vector que comprende los genes gag y pol.

En una realización particular, el polinucleótido o vector que comprende los genes gag y pol comprende además un elemento de respuesta a rev (RRE). El término “elemento de respuesta a rev” se ha definido previamente.

En una forma de realización particular, la célula eucariota que comprende el producto de los genes lentivirales gag, pol y rev y la proteína de envoltura viral se obtiene mediante cotransfección con los polinucleótidos o vectores mencionados anteriormente. Dicha célula se puede utilizar para llevar a cabo el método in vitro para la generación del lentivirus recombinante de la invención. Así, en una realización particular, la célula que expresa los productos de los genes lentivirales gag, pol, rev y la proteína de envoltura viral se han transfectado con uno o más polinucleótidos que codifican el gen gag, el gen pol, el gen rev y con un polinucleótido que codifica la proteína de envoltura viral antes de entrar en contacto con el polinucleótido o con el vector de la invención.

En otra realización particular, la célula se pone en contacto simultáneamente con el polinucleótido o vector de la invención y con uno o más polinucleótidos, preferiblemente uno o más vectores que comprenden los genes lentivirales gag, pol y rev y el gen que codifica la proteína de envoltura viral. En una realización más particular, la célula se cotransfecta con el polinucleótido o vector de la invención y con uno o más polinucleótidos, preferiblemente uno o más vectores, que comprenden los genes lentivirales gag, pol y rev y el gen que codifica la proteína de envoltura viral. En una realización aún más particular, la célula se co-transfecta con los siguientes polinucleótidos:

- el polinucleótido o vector de la invención,

- un polinucleótido o vector que comprende el gen rev,

- un polinucleótido o vector que comprende el gen que codifica la proteína de envoltura viral y

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- un polinucleótido o vector que comprende los genes gag y pol.

La etapa (ii) del método in vitro para la generación del lentivirus recombinante de la invención comprende mantener la célula obtenida en la etapa (i) en condiciones adecuadas para el montaje del lentivirus. El término “condiciones adecuadas para el montaje del lentivirus” significa aquellas condiciones conocidas por el experto en la materia que permiten la expresión de las proteínas virales y el montaje de nuevas partículas virales que se liberan en el medio de cultivo de las células. Estas condiciones variarán dependiendo del tipo de célula. Condiciones ejemplificativas que promueven la liberación de los lentivirus recombinantes en medio de cultivo se puede llevar a cabo como se describe en los ejemplos en el presente documento. Las células productoras se cultivan durante un período de tiempo adecuado con el fin de promover la liberación de vectores virales en el medio. Generalmente, las células se pueden cultivar durante aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas. Cuando la célula es HEK293T, las condiciones adecuadas para el montaje del lentivirus comprenden incubar las células en medio de cultivo fresco en condiciones de cultivo estándar durante varias horas después de la transfección, preferentemente entre aproximadamente 24 y aproximadamente 48 horas después de la transfección, más preferiblemente durante aproximadamente 48 horas después de la transfección.

En una realización particular, el método in vitro para generar el lentivirus recombinante de la invención comprende además purificar el lentivirus recombinante producido por la célula. Dicha purificación puede llevarse a cabo mediante cualquier método adecuado conocido por el experto. Ilustrativamente, la purificación del lentivirus recombinante puede realizarse mediante la recolección del medio de cultivo de las células obtenidas después de la etapa (ii) del método in vitro y centrifugación a baja velocidad y filtración de dicho medio. Opcionalmente, se pueden concentrar reservas de virus por ultracentrifugación.

Células estables y poblaciones celulares de la invención, método in vitro para la generación de las mismas y uso de las mismas para la producción in vitro de un producto de interés

Cuando el lentivirus recombinante de la invención comprende el polinucleótido de la invención que comprende un polinucleótido de interés, dicho lentivirus recombinante puede utilizarse para la obtención de una línea celular que expresa de forma estable dicho polinucleótido de interés. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una célula estable, en lo sucesivo célula estable de la invención, que expresa un polinucleótido de interés que comprende el polinucleótido de la invención en el que dicho polinucleótido comprende la secuencia de un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en el que

- el promotor se encuentra en una posición 5' con respecto a la S/MAR y con respecto al origen de replicación y en una posición 3' con respecto a la primera LTR y

- el polinucleótido de interés se encuentra en una posición 5' o en una posición 3' con respecto a la S/MAR y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de la replicación.

El término “célula estable”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que exhibe expresión de un polinucleótido de interés a lo largo de pasajes sucesivos. En realizaciones preferidas, las células muestran la expresión del polinucleótido de interés al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 90 días después de la transducción de la célula con el lentivirus recombinante de la invención. En realizaciones preferidas, las células muestran la expresión del polinucleótido de interés al menos después de 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 5000, 10000 o más pasajes después de la transducción de la célula con el lentivirus recombinante de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a una población de células estable que comprende una pluralidad de las células de la invención. En una realización particular, la población celular estable de la invención contiene al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, hasta un 100 % de las células que expresan establemente el polinucleótido de interés.

En una realización particular, la célula estable es una célula eucariota, preferiblemente una célula de mamífero. En una realización más particular, la célula de mamífero es la línea celular de riñón embrionario humano 293 que comprende el antígeno T grande de SV40 (HEK293T) que permite la replicación episomal de los plásmidos transfectados que contienen el origen de replicación de SV40.

Los términos “promotor”, “unido operativamente”, “S/MAR”, “origen de replicación” y “primera LTR” se han definido anteriormente.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para la generación de la población celular estable de la invención que comprende las etapas de

(i) poner en contacto células con el lentivirus recombinante de la invención, en el que el lentivirus recombinante comprende la secuencia de un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en el que

1

- el promotor se encuentra en una posición 5' con respecto a la S/MAR y con respecto al origen de replicación y en una 3' posición con respecto a la primera LTR y

- el polinucleótido de interés se encuentra en una posición 5' o en una posición 3' con respecto a la S/MAR y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de replicación, y

(ii) cultivar y mantener las células.

Los términos “método in vitro", “población estable de células”, “ lentivirus recombinante”, “polinucleótido de interés”, “promotor”, “unido operativamente”, “S/MAR”, “origen de replicación” y “primera LTR” se han definido anteriormente.

La etapa (i) del método in vitro para la generación de la población celular estable de la invención comprende poner en contacto células con el lentivirus recombinante de la invención que comprende un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor, de modo que la célula se transduce. El término “transducción”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al proceso mediante el cual una secuencia de polinucleótidos foráneos se introduce en una célula a través de un vector viral. Condiciones adecuadas para la transducción de una célula con un lentivirus recombinante son conocidas por el experto. A modo ilustrativo, se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la incubación de células con sobrenadante lentiviral durante 4-6 horas a 37 °C en una incubadora de cultivo celular en presencia de 8 pg/ml Polybrene™, como se explica en los ejemplos de la presente solicitud.

La etapa (ii) del método in vitro para la generación de la población celular estable de la invención comprende cultivar y mantener las células. Las condiciones para el crecimiento y mantenimiento de las células varían dependiendo del tipo de célula y son conocidas por el experto.

Aunque no es estrictamente necesario para la generación de una población de células estable, es posible seleccionar aquellas células que han sido transducidas con el lentivirus recombinante de la invención. Por lo tanto, en una realización particular, el método para generar la población celular estable de la invención comprende además la selección de las células generadas en la etapa (i). La selección se puede hacer por cualquier técnica conocida en la técnica adecuada para la selección de células que expresan un polinucleótido particular. Por ejemplo, los clones pueden obtenerse a partir de las células resultantes de la etapa (i) del método para la generación de una población celular estable, por ejemplo, limitando la dilución de las células. Tales clones se pueden analizar para detectar la incorporación del polinucleótido de la invención mediante cualquier técnica conocida para los expertos en la técnica adecuada para la detección de secuencias específicas de polinucleótidos, por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o puede analizarse para la presencia de una proteína codificada por el polinucleótido de la invención mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica adecuada para la detección de proteínas, por ejemplo, inmunofluorescencia, citometría de flujo, inmunotransferencia, etc.

Cuando el polinucleótido de la invención comprende un gen de selección, la selección puede llevarse a cabo poniendo las células en condiciones restrictivas según el tipo del gen de selección, es decir, condiciones en las que la expresión génica supone una ventaja de selección para las células. Por ejemplo, si el polinucleótido de la invención comprende un gen de selección que permite sintetizar un nutriente, la selección comprendería poner las células en un medio que carece de dicho nutriente. Cuando el polinucleótido de la invención comprende un gen de selección, cuya expresión confiere resistencia a un antibiótico, la selección comprendería poner las células en un medio de cultivo que comprende dicho antibiótico.

En una realización particular, el polinucleótido de la invención comprende un gen de selección que confiere resistencia a un antibiótico, preferiblemente a la neomicina, de modo que la selección comprendería la colocación de las células en un medio de cultivo que contiene neomicina.

Cuando el polinucleótido de la invención comprende un gen que codifica una proteína fluorescente, la selección se puede hacer mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la población de células estable de la invención para la producción in vitro de un producto de interés o a un método in vitro para la producción de un producto de interés que comprende cultivar una población celular estable de la invención en condiciones que permitan la expresión del polinucleótido de interés.

Los términos “población celular estable” y “método in vitro’’ se han definido previamente. El término “producto de interés”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al producto de cualquier polinucleótido cuya expresión en una célula es deseable. El producto de interés puede ser un polipéptido o proteína de interés o un polinucleótido que, una vez transcrito, genera una ARN que es capaz de hibridar con un ARNm que inhibe su expresión como, por ejemplo, un microARN, un siARN o shARN. En una realización particular, el producto de interés es una proteína de interés. En una realización más particular, la proteína de interés es una proteína fluorescente. En una realización aún más particular, el producto de interés es la proteína fluorescente verde (GFP). Los términos “proteína de interés”, “proteína fluorescente” y “GFP” se han definido anteriormente.

2

La invención se describe a través de los siguientes ejemplos, los cuales son simplemente ilustrativos y no limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos

Materiales y métodos

Cultivo celular de mamíferos y transfección

La línea celular de riñón embrionario humano HEK293A (CRL-1573, ATCC) se cultivó en condiciones estándar en DMEM (Lonza, Lonza Ibérica SA, Barcelona, España) suplementado con Glutamax al 1 % (Invitrogen, Prat del Llobregat, Barcelona, España), antibióticos 10 mg/ml (penicilina y estreptomicina) y suero bovino fetal al 10 % (Gibco, Invitrogen). Cuando las células se cultivaron en medio con condiciones selectivas se reemplazó por DMEM con G418 (geneticina, Invitrogen, Life Technologies) a un 450 pg/ml.

Generación de lentivirus por transfección

Los virus se produjeron por transfección transitoria de cuatro plásmidos en células HEK293T mediante el método de fosfato de calcio. Las células se sembraron a 1,1 * 107 células/placa en placas de 15 cm el día antes de la transfección. Las células se transfectaron con ADN libre de endotoxina (Qiagen, Las Matas, Madrid, España). El cóctel de transfección fue 1xHBS, 0,125 CaCl2 que contiene 3 pg de pRSV-Rev, 3,75 pg de pMD.2G (VSV-G), 13 pg de pMDLg/pRRE o 13 pg de pMDLg/pD64VRRE para la producción de vectores lentivirales no integrativos, y 35 pg de plásmido de transfección (serie pLS). El cóctel se preparó con 82 pl de ADN plásmido, 476 pl de CaCh 2,5 M y 3343 pl de agua milliQ y se mezcló gota a gota con 3900 pl de 2xHBS pH 7,02. La mezcla de transfección se añadió gota a gota a las células. Las células se incubaron con la mezcla de transfección durante 4-6 h en la incubadora y luego se lavó y el medio cambió. Se recogió el medio después de 48 h, se aclaró mediante centrifugación a baja velocidad, y se filtró a través de filtros PVDF de 0,45 mm de tamaño de poro. Las existencias virales se concentraron mediante ultracentrifugación en rotor Beckman SW28 a 90.000 g (26.000 rpm) durante 2 horas a 4 °C. Los sedimentos que contienen lentivirus se secaron al aire y se resuspendieron durante la noche a 4 °C en 400-600 pl de medio.

Titulación y transducción lentiviral

Se calcularon títulos virales biológicos por transducción en varias diluciones en células HEK293T referencia y análisis por FACS (unidades de transducción/ml, U.T./ml) como sigue. Un día antes de la transducción se sembraron 2x105 células de referencia en 6 pocillos de placas multipocillo y se inocularon mediante la sustitución del medio con 1 ml de sobrenadante lentiviral diluido con regularidad a 1/10, 1/100 y 1/ 1000 en medio con 8 pg / ml de Polybrene™ durante 4-6 horas a 37 °C en la incubadora. El inóculo se reemplazó con medio normal y las células se cultivaron durante 48 h antes de FACS.

El total de las partículas que contienen genoma se cuantificaron mediante qPCR en sobrenadantes (partículas/ml). Partículas desnaturalizadas en diluciones que van de 1/10 a de 1/1000 se utilizaron como molde en una reacción de qPCR (véase a continuación para cebadores y condiciones específicas utilizadas). Las curvas de calibración se obtuvieron utilizando una plantilla de plásmido en un intervalo de 1 ng a 1 pg de diluciones y se representaron gráficamente valores de referencia. Se interpolaron los datos en bruto de la prueba en la curva y se transformaron en copias/célula.

Los valores regulares fueron de alrededor de 107-108 U.T./ ml en una relación de 1:100 partículas a U.T.

Extracción de ADN genómico

Las células (5-10x106) o bien se trataron con tripsina o se rasparon y se transfirieron a un tubo cónico de13 ml-PE lavado en PBS y se sedimentaron en una centrífuga de sobremesa a de baja velocidad (1500 rpm). El sedimento se resuspendió en tampón de lisis (NaCl 100 mM, Tris pH 8,0 50 mM, EDTA 100 mM y SDS al 1 %), se transfirió a un microtubo y se digirió con proteinasa K (0,5 pg/ml) durante la noche a 56 °C con agitación baja. Después se añadieron 250 pl de NaCl saturado, se mezcló y se dejó 5 minutos a temperatura ambiente antes de centrifugarlo a 13.000 rpm en Minifuge. Se extrajeron 750 pl del sobrenadante sin perturbar el sedimento y se precipitó con 500 pl de isopropanol, se mezcló y se centrifugó a 13.000 rpm a temperatura ambiente, se lavó con etanol al 70 %, se secó al aire y se resuspendió durante la noche a temperatura ambiente en 1xTE. Las diluciones en serie del ADN resuspendido se cuantificaron utilizando espectofotómetro NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies, Bonsai Tecnologies Group SL, Alcobendas, Madrid, España).

Extracción de Hirt

Las células tripsinizadas (normalmente 5-10x106 células) se transfirieron a un tubo cónico de13 ml-PE tubo cónico y se sedimentaron durante 3-5 minutos en la centrífuga de sobremesa a baja velocidad (1000-1500 rpm) a temperatura ambiente. El sedimento se lavó con PBS frío y se centrifugó como antes. El sedimento resuspendido se transfirió a un tubo de microcentrífuga y se centrifugó a 13.000 rpm durante 5 min a 4 °C. El sedimento se resuspendió en tampón de lisis de Hirt (SDS al 0,6 % y EDTA 10 mM) sin pipeteo ni agitación con vórtex y se incubó 15 min a temperatura ambiente. El ADN genómico se precipitó mediante la adición de 5M de NaCl a una concentración final de 1,4 M, se mezcló suavemente por inversión y se almacenó durante la noche a 4 °C. Las proteínas y el ADN genómico se centrifugaron a 13.000 rpm en una microcentrífuga durante 30-60min a 4 °C. El sobrenadante que contiene ADN de bajo peso molecular se extrajo con fenol, se precipitó con etanol y se resuspendió en 100-200 pl de agua.

Transferencia de Southern

Las muestras digeridas se cargaron en un gel de agarosa al 0,8 % en 1xTAE y se separaron mediante circulación a 70-100 V de voltaje constante hasta que el frente de colorante es de 1-3 cm desde el extremo del gel. Los plásmidos de control cuantificados que contienen las secuencias que van a detectarse se cargaron para proporcionar una referencia para el tamaño y cantidad (20 pg, 200 pg y 2 ng). El gel se fotografió con 300 nm de luz ultravioleta. El gel se lavó en agua destilada y después se equilibró en 2xSSC durante 15 min a temperatura ambiente. El gel se transfirió por capilaridad en membranas de nylon Hybond-N plus (GE Healthcare) con NaOH 0,5 N durante la noche a temperatura ambiente. La membrana se fijó por irradiación una en un Stratalinker (Stratagene) y se utilizó para hibridación adicional.

Las sondas utilizadas fueron los productos purificados de la digestión de endonucleasa de restricción de los plásmidos pcDNA3.1 (Xmai-BstBI, 0,8 Kpb) (Invitrogen) para neo y pZDonor AAVS1 (Kpnl-Xmal, 0,7 Kpb) (Sigma Aldrich) para la detección de AAVS1. El etiquetado se realizó utilizando 100 pCi/reacción de 32P-alphaCTP utilizando el kit comercial Rediprime II (GE Healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los nucleótidos no incorporados se eliminaron usando una columna Micro Bio-Spin P-30 (BioRad) según las instrucciones del fabricante y se cuantificó por recuento de centelleo. Los filtros se humedecieron en 2xSSC y se prehibridaron e hibridaron en tubos de 25 cm con 10-20 ml de PerfectHyb™ Plus (Sigma Aldrich). La solución de hibridación contenía 1-2x107 cpm/ml y se dejó proseguir durante la noche a 66 °C. Después, los filtros se lavaron con lavados de 20 minutos sucesivos a 65 °C en 0,1x SSC SDS al 0,5 %. Las membranas húmedas se expusieron a pantalla PhosphorImager y se desarrollaron utilizando un escáner STORM.

PCR en tiempo real

La PCR cuantitativa para determinar las formas episómicas 2-LTR no integradas derivadas de cultivos transducidos con LentiSome se llevó a cabo utilizando la metodología SYBR Green descrita en Butler, SL et al., J. Virol. 2002, 76(8): 3739. DOI 10.1128/JVI.76.8.3739.3747.2002. El número de copias de albúmina en las células HEK293A se midió según se ha descrito anteriormente con algunas modificaciones. En todos los ensayos de PCR la eficiencia se determinó con diluciones en serie de los ADN estandarizados y la especificidad de cebadores génicos individuales se validó mediante la curva de fusión en el final de cada ensayo qPCR. Las curvas de calibración se obtuvieron con cantidades diluidas del plásmido pRRl.sin18.CMV.eGFP.Wpre (Addgene) que oscila desde 0,01 pg a 100 ng, que corresponde a 102-109 copias. Los valores de Ct obtenidos en la amplificación del uso de los cebadores específicos enumerados a continuación se interpoló y se calculó el número absoluto de copias en muestras experimentales. Se calcularon equivalentes celulares utilizando valores Ct de manera similar con el gen de copia única de albúmina en las muestras de ensayo diluidas del ADN genómico y ADN genómico estandarizado. El control positivo para 2-LTR qPCR fue un fragmento que contenía el elemento LTR-LTR sintetizado y clonado en un plásmido común.

Los cebadores utilizados fueron:

qLTR Fw: TGTGTGCCCGTCTGTTGTGT (SEQ ID NO: 18)

qLTR Rv: GAGTCCTGCGTCGAGAGAGC (SEQ ID NO: 19)

Tamaño del amplicón: 95 pb

qhAlb Fw: GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT (SEQ ID NO: 20)

qhAlb Rv: ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC (SEQ ID NO: 21)

Tamaño del amplicón: 124 pb

q2LTR R Rv2: TGAAGCACTCAAGGCAAGCTTTATT (SEQ ID NO: 22)

q2LTR U5 Fw2: GTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACT (SEQ ID NO: 23)

Tamaño del amplicón: 231 pb

Análisis de citómetro

El análisis de citometría de flujo se realizó después de 72 horas después de la transducción. Las células se tripsinizaron y se recogieron, se lavaron dos veces en 1X PBS de grado de cultivo y se analizaron en un clasificador fAc S DIVA (Becton Dickinson, San Agustín de Guadalix, Madrid, España) con un láser apropiado para excitación CherryFP. En todos los casos, se contaron 10.000 eventos por triplicado.

Cariotipo

La línea celular se incubó a 37 °C en frascos de cultivo en una atmósfera de CO2 al 5 % en aire. Las células en metafase se prepararon mediante métodos citogenéticos estándar. A la detención mitótica con colcemida (0,1 pg/ml, 1,5 horas, 37 °C; GIBCO, Strachclyde, Reino Unido) le siguió tratamiento hipotónico (75 mm de KCl, 15 minutos, 37 °C) y la fijación con metanol/ácido acético (3:1) antes de extenderse en láminas.

Fluorescencia en análisis de hibridación in situ (FISH)

Para el análisis FISH, las células se trataron primero con colcemida (Invitrogen), y luego se cosecharon después de un tratamiento con una solución de sal hipotónica.

Se utilizó un conjunto de sondas para localizar los sitios de integración del virus. Se detectó un sitio de integración de LentiSome utilizando el ADN del plásmido del vector. Un cromosoma artificial bacteriano (BAC), RP11- 49L9, que se asigna a la citobanda 4q13.3 se utilizó como control. El BAC se obtuvo de la Human BAC Clone Library RPCI-11 (Children's Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA). 1 pg de plásmido o ADN de BAC se marcó directamente utilizando el kit Nick T ranslation (n.° de Cat: 07J00-001, Vysis). Este kit está diseñado para el etiquetado de fluorescencia de ADN utilizando dUTP marcados con fluoróforo (espectro verde o espectro naranja). Los ADN marcados se co-precipitaron con Cot-1ADN y ADN de esperma de salmón fragmentado (Vysis, Dowers Grove, IL, EE.UU.) para prevenir la hibridación no específica en secuencias de ADN repetitivas genómicas. La mezcla de ADN precipitado se resuspendió en mezcla de hibridación.

Para llevar a cabo la reacción de FISH, los diferenciales de la sonda y en metafase se calentaron, se codesnaturalizaron y se hibridaron durante la noche a 37 °C. Después de dos lavados después de la hibridación con 0,4 XSSC/NP40 al 0,3 % y 2xSSC/NP40 al 0,1 %, los cromosomas se tiñeron con colorante de contraste con DAPI en solución antidesvanecimiento (Abbott Molecular).

Se capturaron imágenes celulares utilizando una cámara (cámara Photometrics SenSys) de dispositivo de acoplamiento de carga enfriado (CCD) conectada a un ordenador que ejecuta el sistema de análisis de imágenes de Chromofluor (Cytovision, Applied Imaging Ltd, Newcastle, Reino Unido).

Resultados

Ejemplo 1: mantenimiento de lentivirales episómicos (LentiSome) en células en reproducción elevada

Descripción del enfoque

Se analizó sistemáticamente el efecto de una serie de combinaciones de secuencias ori y S/MAR de mamífero sobre el mantenimiento y la segregación de las 1-, 2-LTR episomales en células que crecen exponencialmente a lo largo de docenas de duplicaciones de población que abarcan dos meses en cultivo.

A partir de una breve pero bien caracterizada colección de secuencias, ya sea como resultado ori o S/MAR, se seleccionaron algunas que comparten dos características principales. En primer lugar, la longitud de ambas secuencias debe limitarse a un tamaño capaz de alojarse en un vector lentiviral como otras secuencias de interés se clonarán adicionalmente en el vector lentiviral y segundo, la naturaleza eucariota no derivada víricamente de los elementos ori/SMAR. Aunque las secuencias ori mejor caracterizadas se derivan de virus de ADN, el principal inconveniente de utilizarlas en la clínica son sus estrictos requisitos de proteínas virales para activarse funcionalmente como antígeno T grande SV40, virus del papiloma, proteínas E1/E2 o virus del herpes e BnA. Sin embargo, todos ellos promueven inevitablemente la transformación celular de las células que expresan tales genes. La naturaleza eucariota implica que han demostrado ser funcionales en células de mamíferos y de respuesta a señales celulares activadas para replicarse en una razón de uno por ciclo celular.

Las tres secuencias ori seleccionadas que coinciden con tal mapa de características en el locus beta-globina humana (Kitsberg D et al., Nature, 1993, 366(6455): 588-590); la región promotora c-myc humana (McWhinney C. y Leffak M., Nucleic Acids Res. 1990, 18 (5): 1233-1242) y la A34, una secuencia de consenso 36 pb derivada de la enzima ADN-metil transferasa humana (dnmt) (Araujo Fd et al., J. Biol. Chem., 1999, 274 (14): 9335-9341). Además, se seleccionaron cuatro secuencias de S/MAR con actividad demostrada en el mantenimiento de episomas, estabilidad mitótica y que contienen un dominio regulatorio activo transcripcional para la metilación. Los elementos de anclaje seleccionados fueron el 1,8 Kpb del gen de IFN-y humano (hIFN-ygrande) (Bode J. et al., Science, 1992, 255 (5041):195-7); la región mínima de 0,7 Kpb del mismo gen (hIFN-Y°°rt°) (Ramezani A. et al., Blood, 2003, 101 (12): 4.717-4.724);

2

la región mínima de 0,2 Kpb contenida en el gen de reductasa deshidrofolato del hámster (hDHFR) (Mesner LD et al., Proc. Natl. Acad.Ciencia. EE.UU., 2003, 100 (6): 3281-3286) y, finalmente, una región de 0,4 Kpb asignada al gen kappa de inmunoglobulina de ratón (mIgK) (Cockerill PN y Garrard WT, Cell, 1986, 44 (2): 273-282).

Para estudiar si los elementos seleccionados podrían ser o no competentes en un formato lentiviral para promover la persistencia de los episomas 1-/2-LTR se generaron lentivirus de autoinactivación con la mutación (D64N) en el gen pol que inactiva la actividad de integrasa viral [Yañez et al., supra]. El plásmido denominado pLS 1 colectivamente (figura 2 y SEQ ID NO: 24) contiene una unidad de transcripción para abordar simplemente su mantenimiento tras la transducción de los LentiSome™ derivados de pLS a lo largo de divisiones celulares repetidas. El casete reportero lleva los ORF eGFP/neoR separados por una secuencia CHYSEL T2A de poliovirus permitiendo obtener resultados por o bien FACSorter o bien selección de antibióticos, respectivamente. El casete reportero se ha colocado bajo el control de un promotor débil pero ubicuo que abarca el potenciador del CMV y el promotor p5 de la unidad transcripcional temprana del virus adenoasociado 2 (eC/p5). Para garantizar la activación de las secuencias de replicación autónoma contenidas en el ori (ARS), tanto secuencias de ori como S/MAR se colocaron aguas abajo de la dirección de transcripción. El panel de constructos se muestra en la figura 2. El tamaño medio de los constructos fue de 9 kpb garantizando además la clonación de ADNc hasta 4 kpb. Cada plásmido se utilizó en combinación con plásmidos auxiliares para generar lotes de lentivirus tal como se describe en la sección de Materiales y métodos.

Evaluación in silico de la estabilidad estructural

Para predecir in silico la estabilidad relativa a lo largo de la secuencia de los plásmidos pLS que llevan secuencias ori/SMAR se realizó un análisis de desestabilización de ADN inducida por estrés (SIDD). La lectura del estudio es un perfil teórico de la energía predicha necesaria para separar hebras (representados por AG0) a lo largo de cualquier secuencia de nucleótidos, permitiendo la determinación de regiones específicas en la conformación abierta y con alta propensión a hebras separadas (desestabilizado) como se demuestra en los sitios de terminación transcripcional y también para origen de replicación putativa.

Los datos obtenidos con los 12 plásmidos utilizados a lo largo de este estudio se muestran en la figura 3. El diagrama representa los perfiles de desestabilización para la secuencia de cada plásmido lentiviral de transferencia sin secuencias procariotas usando el programa WebSIDD (www.genomecenter.ucdavis.edu/benham). Por encima de cada perfil se disponen los elementos contenidos en cada constructo y la leyenda sobre la estructura lentiviral básica se indica encima del esquema del constructo de control (sin Ori/SMAR). La región que corresponde a la secuencia de S/MAR está sombreada con azul oscuro. Las secuencias de ori están en negro. Todos los plásmidos contienen la probabilidad más alta de estructura abierta, indicada como G(x) negativa (en Kcal/mol) en la región que abarca la secuencia de S/MAR (región sombreada en el diagrama). Estos datos apoyan la idea de una región abierta activa en todas las secuencias de S/MAR clonadas en la cadena principal de lentiviral y está de conformidad con la descripción actual de las secuencias de S/MAR (Benham et al. J. Mol. Biol. 274, 181-196 (1997)).

Transducción y estabilidad de la cinética de expresión

Se usaron IDLV que portaban las combinaciones de ori/SMAR descritas para transducir en MOI baja (2 U.T./célula) en cultivos con crecimiento exponencial de la línea celular de carcinoma humano de células HEK293A. Los cultivos se mantuvieron durante cinco duplicaciones de población (PD; 1 PD es equivalente a 18 horas en las condiciones de cultivo empleadas para pasajes dos veces/semana) para permitir el establecimiento de episomas y después de células purificadas eGFP+ FACSorting. Después los cultivos se mantuvieron con o sin G418 y se calificaron cada 8-10 PD (6 a 7,5 días) con respecto a la presencia de células eGFP+.

En primer lugar, se evaluó la persistencia de LentiSome™ que lleva cada una de las nueve combinaciones de los ori antes mencionados y, o bien la S/MAR derivada del hlFNy (LS 1, 2, 5, 6, 9 y 10) o de la mIgK (LS 4, 8 y 12) (figura 4, panel superior). Después de un período de 70 PD en cultivo sin condiciones selectivas (aproximadamente 1,7 meses después del establecimiento episomal) el porcentaje de células eGFP+ fue variable en basándose en cada LentiSome™ transducido. Sorprendentemente, la mayoría de los episomas que contienen el gen hlFNy S/MAR (LS 2, 5, 6, 9 y 10) mostraron una propagación estable con divisiones celulares, mientras que los que contienen el mIgK pequeño 0,4 Kpb S/MAR (LS 4, 8, 12) no la mostraron. También se observa que estos LentiSome™ fueron difíciles de producir de manera repetida por razones que no se han abordado todavía. Como era de esperar, los cultivos mantenidos en condiciones selectivas en presencia de G418 generan un cultivo homogéneo de células resistentes al antibiótico de la selección con G418 (datos no mostrados).

Los valores de control obtenidos con las células transducidas con IDLV sin secuencias de ori ni de S/MAR perdieron células eGFP+ para el punto temporal final del ensayo, tal como se esperaba (símbolos de cruz en la figura 4). Los cultivos transducidos con LS 5, 6 o 10 mostraron que episomas funcionales se dejaron en 50 % de las células, mientras que en cultivos transducidos con LS 1, 4, 8 o 12 los episomas persistieron en menos de 5 % de la población celular en 70 PD. Es importante destacar que, los episomas LS 2 y 9 se mantuvieron y se repartieron de manera eficiente a lo largo del estudio, como revela un elevado 70 % de las células eGFP+. Los cultivos transducidos con LS 5, 9 y 10 se siguieron durante más tiempo hasta 120 PD (tres meses después de la transducción) y se obtuvieron resultados casi iguales como la proporción de células eGFP+ en los cultivos fue alrededor de un 40-55 % del cultivo celular.

Se realizó un segundo ensayo con los LentiSomes™ que plantearon los mejores resultados en el ensayo anterior y se incluyó un conjunto adicional de lentivirus. Estos contienen un elemento diferente seleccionado por su pequeño tamaño que se ajusta a uno de los criterios mencionados en el diseño experimental. El elemento novedoso es 0,2 Kpb S/MAR pequeña del dehidrofolato reductasa de hámster (DHFR). Entonces se construyó y se produjo la LS 3, 7 y 11 en combinación con la p-globina, A34 u ori-c-myc, respectivamente, y se siguió el mismo enfoque comparando el conjunto de LS 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10 y 11, descartando así el Ls que contiene el elemento de 0,4 Kpb S/MAR.

En cultivos transducidos con LS 9, 10 y 11 a 70 PD (54 días después del establecimiento de episomas) los episomas persistieron en 90 % de las células, lo que sugiere una replicación, activación y segregación eficaces (figura 4, panel inferior) y, en particular, la persistencia se consiguió cuando las secuencias ori-c-myc se combinaron con todas las secuencias de S/MAR sometidas a prueba. La tabla 1 muestra un resumen de los datos representados en la figura 4.

Tabla 1. Datos de criterios de valoración de la expresión a largo plazo de LentiSomes en HEK293A replicantes.

(*) porcentaje de células eGFP+ al final del ensayo (dpt)

(**) datos en 108 PD corresponden al valor de criterio de valoración del ensayo de la primera columna

(***) solo datos de los ensayos aeb 69 PD se han considerado para este cálculo

Conclusiones

De los experimentos anteriores se puede concluir (i) la viabilidad de nuestro enfoque en la columna vertebral lentiviral

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y (ii) que de manera significativa en el contexto lentiviral, la estrategia de ensayo y error debe seguirse como si no todas las combinaciones fueran o bien toleradas igualmente o bien predichas teóricamente.

Aparentemente no hay una regla general predictiva para encontrar la combinación óptima de elementos que deben incluirse en la columna vertebral lentiviral que permite la persistencia eficiente.

Sin embargo, hay algunas secuencias que muestran características que vale la pena destacar, es decir, LS que contiene el mlgK 0,4 Kpb S/MAR no parece competente para la segregación, independientemente de la secuencia ori con la que se combina; mientras que el ori en los genes c-myc y p-globina humanos parece persistir de manera eficiente, independientemente de la secuencia de S/MAR de acompañamiento. De manera notable, el conjunto de LentiSome™ que lleva la secuencia ori-c-myc humano persistió independientemente de cómo se colocaran entre sí las secuencias S/MAR probadas, un hecho opuesto en comparación con los resultados obtenidos con S/MAR mlgK.

En conclusión, y a pesar de las secuencias de ori y S/MAR bien caracterizados cuando se entregaron por los virus de ADN, plásmidos y minicírculo (Nehlsen K. et al., Gene Therapy and Molecular Biology, 2006, 10: 233) se ha demostrado que las características genéticas impuestas por los productos intermedios de replicación lentivirales impiden cualquier predicción acerca de persistencia en células en división.

Ejemplo 2: análisis genético de LentiSome™ en células transducidas

Análisis del estado extra-cromosómico de los LentiSomes™ en células transducidas

Actualmente está bien establecido que la función de ori de mamífero se basa en principios epigenéticos, tales como la presencia de factores de transcripción unidos, estructura de cromatina o localización nuclear. Menos se sabe acerca de los requisitos para que las secuencias de S/MAR sean funcionales aparte de la necesidad de proteínas de anclaje.

Por lo que se sabe, no hay datos que aborden el estado de los productos derivados de 1-/2-LTR durante lentivirus clásico o transducción o infección de IDLV y después los investigadores se preguntaron si las secuencias de ori/SMAR podrían estar actuando fisiológicamente cuando están presentes en las estructuras genéticas de lentivirus. En primer lugar, se abordó si LS entregan formas íntegras o en qué medida y si todas las combinaciones son igualmente eficientes. Se utilizó un conjunto de técnicas dirigidas a descubrir este punto de acuerdo con el procedimiento estándar descrito en la bibliografía (véase Nehlsen K. et al., supra).

Estudios de transferencia de Southern

Tanto ADN genómico como de peso molecular bajo (extracto de Hirt) se purificó a partir células transducidas con un conjunto de LS después de cultivo continuado (> 70 PD) y se estudiaron las muestras primero por transferencia de Southern. El ADN genómico digerido con la enzima de corte una vez en el extremo 3' de todos los LS se transfirió y se hibridó con una sonda neo específica dirigida al locus endógeno AAVS1 que está representado tres veces por célula HEK293K. Cuando los filtros se hibridaron con la sonda neo específica (figura 5A, izquierda) no se obtuvo ninguna señal específica por esta técnica en ninguna de las muestras estudiadas. La sonda AAVS1 hibridada en todas las muestras que revelan un máximo de variación de 2 veces en los equivalentes celulares cargados por carril (figura 5A, derecha). La sensibilidad de la sonda neo en condiciones experimentales fue 10 veces mayor que la sonda AAVS1 que detecta 3 copias/célula y en cada carril es igual a 1 millón de equivalentes celulares, entonces puede concluirse que los números de copias integradas de los LentiSomes fueron inferiores a 0,3/célula. Cuando se estudiaron extractos de Hirt por transferencia de Southern, se obtuvieron resultados negativos similares, aunque en este caso se logró una sensibilidad menor y los límites para la detección de más de 50 copias por célula. De hecho, cuando estaba presente un gran número de copias, es decir, en el final del establecimiento episomal, el extracto de Hirt a partir de cultivos transducidos con LS 1, 2, 5 y 10 mostró una banda específica en la transferencia de Southern (figura 5B izquierda). Es importante destacar que estudios de FISH de esos cultivos en ese punto temporal mostraron un abundante número de puntos en todas las células calificadas, un dato que se correlaciona con su detección por transferencia de Southern (figura 5B derecha).

En conjunto, estos resultados podrían explicarse si LentiSome persistiera en números bajos en cultivo, y apoyara la incapacidad para detectarlos por transferencia de Southern. De hecho, datos de otros autores con el plásmido de minicírculo episomal pEPI (Nehlsen, Broll y Bode, 2006) indican que 10-15 copias se mantienen en cultivos de CHO después de cultivo continuado sin selección, y se detectó solo por transferencia de Southern momentos después del establecimiento episomal como es nuestro caso.

Análisis de PCR

A pesar de la información proporcionada por transferencia de Southern es necesario detectar ubicación específica de secuencias sondeadas de la técnica es poco informativa cuando se está buscando un bajo número de copias de una secuencia en una fracción de células. Como episomas, es probable que estén presentes en bajos números de copias y probablemente en una fracción de las células, las secuencias de IDLV en cultivos con fenotipo persistente se caracterizaron además por qPCR.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Polinucleótido que comprende

(i) una primera repetición terminal larga derivada de un lentivirus,

(ii) un origen de replicación eucariótico seleccionado de un grupo que consiste en los orígenes de replicación que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y una variante funcionalmente equivalente de las mismas que tienen al menos un 98 % de identidad de secuencia con las secuencias de SEQ ID NO: 1, SEQ ID No : 2 o SEQ ID NO: 3, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias,

(iii) una región de unión a matriz/armazón seleccionada del grupo que consiste en las regiones de unión a matriz/armazón que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 4, Se Q ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y una variante funcionalmente equivalente de las mismas que tienen al menos un 98 % de identidad de secuencia con las secuencias de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, en el que el grado de identidad de secuencia se determina a través de la longitud completa de las secuencias, y (iv) una segunda repetición terminal larga derivada de dicho lentivirus,

en el que dicho origen de replicación eucariótico y dicha región de unión a matriz/armazón se localizan entre dichas repeticiones terminales largas primera y segunda y en el que el polinucleótido no comprende el origen de replicación eucariótico que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 en combinación con la región de unión a matriz/armazón que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4.

2. Polinucleótido según la reivindicación 1 en el que las repeticiones terminales largas primera y segunda derivan de VIH.

3. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en el que la segunda repetición terminal larga comprende una mutación autoinactivadora.

4. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende además una secuencia de polinucleótido seleccionada de

- un sitio de clonación múltiple,

- al menos un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en el que el promotor se localiza en una posición 5' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y con respecto al origen de replicación y en una posición 3' con respecto a la primera repetición terminal larga y

el polinucleótido de interés se localiza en una posición 5' o en una posición 3' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de replicación y

- una combinación de los mismos.

5. Polinucleótido según la reivindicación 4 en el que el polinucleótido de interés se selecciona de un gen de selección, un polinucleótido que codifica una proteína de interés y una combinación de los mismos.

6. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5 que comprende además un segundo polinucleótido de interés unido operativamente al primer polinucleótido de interés por una secuencia que codifica una secuencia de autoprocesamiento co-traduccional.

7. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende además una secuencia de sitio de unión de cebador derivada de un lentivirus,

en el que la secuencia de sitio de unión de cebador se localiza en una posición 3' con respecto a la primera repetición terminal larga y en una posición 5' con respecto al origen de replicación y a la región de unión a matriz/armazón, y

en el que si el polinucleótido comprende además una secuencia de polinucleótido seleccionada de

- un sitio de clonación múltiple,

- un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en el que el promotor se localiza en una posición 5' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y con respecto al origen de replicación y en una posición 3' con respecto a la primera repetición terminal larga y

el polinucleótido de interés se localiza en una posición 5' o en una posición 3' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de replicación y

- una combinación de los mismos,

entonces el sitio de unión de cebador se localiza en una posición 5' con respecto a dicha secuencia de polinucleótido.

8. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende además una secuencia de señal de empaquetamiento derivada de un lentivirus localizada entre la primera y la segunda repetición terminal larga.

9. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende además un elemento de respuesta a Rev derivado de un lentivirus localizado entre la primera y la segunda repetición terminal larga.

10. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende además un tramo de polipurina central derivado de un lentivirus,

en el que dicho tramo de polipurina central se localiza en una posición 3' con respecto a la primera repetición terminal larga y en una posición 5' con respecto al origen de replicación y a la región de unión a matriz/armazón, y

en el que si el polinucleótido comprende además una secuencia de polinucleótido seleccionada de

- un sitio de clonación múltiple,

- un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en el que el promotor se localiza en una posición 5' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y con respecto al origen de replicación y en una posición 3' con respecto a la primera repetición terminal larga y

el polinucleótido de interés se localiza en una posición 5' o en una posición 3' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de replicación y

- una combinación de los mismos,

entonces el tramo de polipurina central se localiza en una posición 5' con respecto a dicha secuencia de polinucleótido.

11. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende además un origen de replicación procariótica y un marcador de selección.

12. Vector que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Célula que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o vector según la reivindicación 12.

14. Lentivirus recombinante que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y una integrasa lentiviral que comprende una mutación que provoca que dicha integrasa sea incapaz de catalizar la integración del genoma viral en un genoma celular.

15. Método in vitro para generar un lentivirus recombinante según la reivindicación 14 que comprende

(i) poner en contacto una célula eucariota con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o con un vector según la reivindicación 12, en el que la célula expresa los productos de los genes lentivirales gag, pol, rev y una proteína de envuelta viral en condiciones adecuadas para la entrada del polinucleótido o vector en dicha célula y

(ii) mantener la célula en condiciones adecuadas para el ensamblaje del lentivirus.

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Población de células estable que expresa un polinucleótido de interés que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que dicho polinucleótido comprende la secuencia de un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en la que

- el promotor se localiza en una posición 5' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y con respecto al origen de replicación y en una posición 3' con respecto a la primera repetición terminal larga y

- el polinucleótido de interés se localiza en una posición 5' o en una posición 3' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de replicación.

Método in vitro para generar la población de células estable según la reivindicación 16 que comprende las etapas de

(i) poner en contacto células con el lentivirus recombinante según la reivindicación 14, en el que el lentivirus recombinante comprende la secuencia de un polinucleótido de interés unido operativamente a un promotor en el que

- el promotor se localiza en una posición 5' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y con respecto al origen de replicación y en una posición 3' con respecto a la primera repetición terminal larga y

- el polinucleótido de interés se localiza en una posición 5' o en una posición 3' con respecto a la región de unión a matriz/armazón y en una posición 5' o en una posición 3' con respecto al origen de replicación, y

(ii) hacer crecer y mantener las células.

Uso de la población de células estable según la reivindicación 16 para la producción in vitro de un producto de interés.

Método in vitro para la producción de un producto de interés que comprende cultivar una población de células estable según la reivindicación 16 en condiciones que permiten la expresión del polinucleótido de interés.