JP6694386B2 - 非組込み型レンチウイルスベクターに基づく安定化エピソーム - Google Patents
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Description
ポリヌクレオチドであって、
(i)レンチウイルス由来の、第1長鎖末端反復配列(first long terminal repeat)と、
(ii)配列番号1の配列を有する複製開始点、配列番号2の配列を有する複製開始点、配列番号3の配列を有する複製開始点、およびそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、真核生物の複製開始点と、
(iii)配列番号4の配列を有する足場/マトリックス付着領域、配列番号5の配列を有する足場/マトリックス付着領域、配列番号6の配列を有する足場/マトリックス付着領域、およびそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、足場/マトリックス付着領域と、
(iv)前記レンチウイルス由来の、第2長鎖末端反復配列と
を含んでなり、
前記真核生物の複製開始点および前記足場/マトリックス付着領域が、前記第1長鎖末端反復配列と第2長鎖末端反復配列の間に配置されてなる、ポリヌクレオチドに関する。
(i)真核細胞を、第1の態様によるポリヌクレオチドまたは第2の態様によるベクターと接触させる工程であり、ここで前記細胞が、前記細胞内への前記ポリヌクレオチドまたはベクターの移行に適した条件下で、レンチウイルス遺伝子gag、pol、revの産物およびウイルスエンベロープタンパク質を発現する工程と、
(ii)レンチウイルスの集合に適した条件下で前記細胞を維持する工程と
を含んでなる、in vitro法に関する。
−前記プロモーターが、前記足場/マトリックス付着領域および前記複製開始点に対して5’側に位置し、前記第1長鎖末端反復配列に対して3’側に位置し、かつ
−前記対象ポリヌクレオチドが、前記足場/マトリックス付着領域に対して5’側または3’側に位置し、前記複製開始点に対して5’側または3’側に位置する、安定化細胞集団に関する。
(i)細胞を第4の態様による組換えレンチウイルスに接触させる工程であり、ここで前記組換えレンチウイルスが、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドの配列を含んでなり、
−前記プロモーターが、前記足場/マトリックス付着領域および前記複製開始点に対して5’側に位置し、前記第1長鎖末端反復配列に対して3’側に位置し、かつ
−前記対象ポリヌクレオチドが、前記足場/マトリックス付着領域に対して5’側または3’側に位置し、前記複製開始点に対して5’側または3’側に位置する工程と、
(ii)前記細胞を増殖させかつ維持する工程と
を含んでなる、in vitro法に関する。
第1の態様によれば、本発明は、
ポリヌクレオチドであって、
(i)レンチウイルス由来の、第1長鎖末端反復配列と、
(ii)配列番号1の配列を有する複製開始点、配列番号2の配列を有する複製開始点、配列番号3の配列を有する複製開始点、およびそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、真核生物の複製開始点と、
(iii)配列番号4の配列を有する足場/マトリックス付着領域、配列番号5の配列を有する足場/マトリックス付着領域、配列番号6の配列を有する足場/マトリックス付着領域、およびそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、足場/マトリックス付着領域と、
(iv)前記レンチウイルス由来の、第2長鎖末端反復配列と
を含んでなり、
前記真核生物の複製開始点および前記足場/マトリックス付着領域が、前記第1長鎖末端反復配列と第2長鎖末端反復配列の間に配置されてなる、ポリヌクレオチドに関し、以下、このポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドと称する。
本発明のポリヌクレオチドの第1エレメントは、第1長鎖末端反復配列である。通常の逆転写過程では、レトロウイルスゲノムRNAの5’(R−U5)および3’(U3−R)末端由来の配列がダイレクトリピート配列Rを通して融合し、複製して、末端反復配列を有する直鎖の二本鎖分子を形成する。続いて、感染した宿主細胞の染色体DNAの部位にこの分子が挿入されることによって、ウイルスDNAは、新しいウイルスRNA分子を転写するための鋳型として機能する。
本発明のポリヌクレオチドは、真核生物の複製開始点を含む。本明細書で用いられる用語「真核生物の複製開始点」または「真核生物の複製起点」または「真核生物のori」は、真核生物においてそこから複製が開始される、特定のゲノム配列を指す。本明細書で用いられる用語「真核生物」は、原生生物界、真菌界、植物界および動物界を含む。
MはAまたはC、DはA、GまたはT、WはAまたはT、KはGまたはT、SはCまたはG、BはC、GまたはT、YはCまたはT、RはAまたはG、HはA、CまたはTを表す。
本発明のポリヌクレオチドは、足場/マトリックス付着領域を含む。本明細書で用いられる用語「足場/マトリックス付着領域」または「S/MAR」は、長さ数百塩基対の非コンセンサス様ATリッチDNAエレメントを指し、これは、細胞核のタンパク質の足場またはマトリックスへ周期的に付着することによって、真核生物ゲノムの核DNAを約60,000クロマチンドメインにまとめるものである。足場/マトリックス付着領域は、典型的にはフランキング領域、クロマチン境界領域およびイントロンのような非コード領域に見出される。
用語「第2長鎖末端反復配列」または「第2LTR」または「3’LTR」は3’レンチウイルスLTRを指し、これは、内在性配列の欠失および/もしくは変異ならびに/または異種性配列の付加によって、対応する未変性の3’LTRが改変されていてもよいか、または改変されていなくてもよい。前記3’LTRは天然のもの、または合成されたものであってよい。
−第1LTR
−複製開始点
−S/MAR
−第2LTR
となる。
−第1LTR
−S/MAR
−複製開始点
−第2LTR
となる。
−マルチクローニング部位、
−プロモーターに作動的に連結する対象ポリヌクレオチド(ここで、前記プロモーターは、足場/マトリックス付着領域および複製開始点に対して5’側に位置し、第1長鎖末端反復配列に対して3’側に位置し、かつ前記対象ポリヌクレオチドは、足場/マトリックス付着領域に対して5’側または3’側に位置し、複製開始点に対して5’側または3’側に位置する)、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含んでなる。
−プロモーターは、
S/MARおよび複製開始点の上流、すなわちS/MARおよび複製開始点に対して5’側、かつ
第1LTRの下流、すなわち第1LTRに対して3’側に位置し、
−対象ポリヌクレオチドは、
S/MARの上流または下流、すなわちS/MARに対して5’側または3’側、かつ
複製開始点の上流または下流、すなわち複製開始点に対して5’側または3’側に位置する。
ここで、前記プライマー結合部位配列が、第1LTRに対して3’側に位置し、複製開始点およびS/MARに対して5’側に位置し、かつ
前記ポリヌクレオチドが、
−マルチクローニング部位、
−プロモーターに作動的に連結する対象ポリヌクレオチド(ここで、前記プロモーターは、S/MARおよび複製開始点に対して5’側に位置し、第1LTRに対して3’側に位置し、かつ前記対象ポリヌクレオチドは、S/MARに対して5’側または3’側に位置し、複製開始点に対して5’側または3’側に位置する)、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含む場合、
前記プライマー結合部位は、前記ポリヌクレオチド配列に対して5’側に位置する。
−マルチクローニング部位、
−S/MARおよび複製開始点に対して5’側に位置し、第1LTRに対して3’側に位置するプロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドであって、
S/MARに対して5’側または3’側に位置し、かつ複製開始点に対して5’側または3’側に位置する対象ポリヌクレオチド、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含む場合、
前記セントラルポリプリン配列は、前記ポリヌクレオチド配列に対して5’側に位置する。本明細書で用いられる用語「セントラルポリプリン配列」または「cPPT」は、細胞感染の間に、ウイルスゲノムの核への移入を増大させるセントラルDNAフラップを形成して、形質導入をさらに効率的なものとするポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態によれば、cPPTはHIVに由来する。さらに特定の実施形態によれば、HIV由来のcPPTは、配列番号15の配列を含む。さらに特定の実施形態によれば、HIV由来のcPPTは、配列番号15の配列を含む。
別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関し、以下これを本発明のベクターと称する。本明細書で用いられる用語「ベクター」は、1つ以上の対象ポリヌクレオチドを宿主細胞内に送達可能で、かつ任意に発現可能なコンストラクトを指す。ベクターの例としては、ウイルスベクター、ネイキッドDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性縮合試薬と会合したDNAまたはRNA発現ベクター、リポソーム内に被包されたDNAまたはRNA発現ベクター、および産生細胞のような特定の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであってよい。本明細書で用いられる用語「クローニングベクター」は、伝播に適し、かつベクターの精製に適した様々な異種生物において十分なポリヌクレオチドまたは遺伝子コンストラクトまたは発現ベクターを得るために適したベクターを指す。本明細書で用いられる用語「発現ベクター」は、標的細胞内でのポリヌクレオチドの発現に適したベクターを指す。本発明の発現ベクターはレンチウイルスベクターである。本明細書で用いられる用語「レンチウイルスベクター」は、細胞内での転写および翻訳後に、レンチウイルス遺伝子であるgag、pol、rev、およびエンベロープウイルスタンパク質をコードする遺伝子の発現によって、新しい細胞への感染能をもつウイルス粒子が産生されるために必要な配列を含む核酸配列を指す。
本発明のポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、前記ポリヌクレオチドまたはベクターによって形質転換される、前記ポリヌクレオチドまたはベクターをトランスフェクトされる、または前記ポリヌクレオチドまたはベクターに感染することが可能な細胞を形質転換するため、前記細胞にトランスフェクトするため、または前記細胞を感染させるために用いることができる。したがって別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のヌクレオチドを含むベクターを含む細胞に関する。以下、この細胞を本発明の細胞と称する。
本発明のポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含むベクターを、レンチウイルス遺伝子であるgag、pol、revの産物、およびエンベロープウイルスタンパク質を発現する細胞へトランスフェクトすることによって、組換えレンチウイルスを作製するために用いることができる。
(i)真核細胞を、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターと接触させる工程であり、ここで前記細胞が、前記細胞内への前記ポリヌクレオチドまたはベクターの移行に適した条件下で、レンチウイルス遺伝子gag、pol、revの産物およびウイルスエンベロープタンパク質を発現する工程と、
(ii)レンチウイルスの集合に適した条件下で前記細胞を維持する工程とを含んでなる、本発明の組換えレンチウイルスを作製するためのin vitro法に関する。
特定の実施形態によれば、前記細胞は、以下のポリヌクレオチド、
−rev遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター、
−VSV由来のエンベロープ糖タンパク質Gをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター、および
−gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター
をトランスフェクトすることによって得られる。
−本発明のポリヌクレオチドまたはベクター、
−rev遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター、
−ウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター、および
−gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター
とを共トランスフェクトされる。
本発明の組換えレンチウイルスが、対象ポリヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチドを含む際、前記組換えレンチウイルスは、前記対象ポリヌクレオチドを安定的に発現する細胞株を得るために用いることができる。したがって別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む対象ポリヌクレオチドを発現できる安定化細胞に関し、以後これを本発明の安定化細胞と称する。前記ポリヌクレオチドは、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドの配列を含んでなり、ここで
−プロモーターは、S/MARおよび複製開始点に対して5’側に位置し、第1LTRに対して3’側に位置し、かつ
−対象ポリヌクレオチドは、S/MARに対して5’側または3’側に位置し、かつ複製開始点に対して5’側または3’側に位置する。
(i)細胞を本発明の組換えレンチウイルスに接触させる工程であり、ここで前記組換えレンチウイルスが、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドの配列を含んでなり、
−前記プロモーターが、前記S/MARおよび前記複製開始点に対して5’側に位置し、前記第1LTRに対して3’側に位置し、かつ
−前記対象ポリヌクレオチドが、前記S/MARに対して5’側または3’側に位置し、前記複製開始点に対して5’側または3’側に位置する工程と、
(ii)前記細胞を増殖させかつ維持する工程とを含んでなる、in vitro法に関する。
哺乳類細胞の培養およびトランスフェクション
ヒト胎児腎細胞株HEK293A(CRL−1573、ATCC)を、1%Glutamax(Invitrogen、Prat del Llobregat、バルセロナ、スペイン)、10mg/ml抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)および10%ウシ胎仔血清(Gibco、Invitrogen)を補充したDMEM(Lonza、Lonza Iberica SA、バルセロナ、スペイン)中で、標準的な条件下で培養した。細胞を選択的な条件下で培養する際には、培地を450μg/mlのG418(Geneticin、Invitrogen、LifeTechnologies)を含むDMEMに交換した。
ウイルスは、リン酸カルシウム法を用いて、4つのプラスミドをHEK293T細胞へ一過性にトランスフェクトすることによって産生した。トランスフェクションの前日に、細胞を15cmディッシュに1.1×107細胞/ディッシュにてまいた。細胞には、エンドトキシンフリーDNA(Qiagen、ラス・マタス、マドリード、スペイン)をトランスフェクトした。トランスフェクションカクテルは、3μgのpRSV−Rev、3.75μgのpMD.2G(VSV−G)、非組込み型レンチウイルスベクター産生のための13μgのpMDLg/pRREまたは13μgのpMDLg/pD64VRRE、および35μgのトランスファープラスミド(pLSシリーズ)を含む、1xHBS、0.125 CaCl2であった。前記カクテルは、82μLのプラスミドDNA、476μLの2.5M CaCl2、および3343μLのミリQ水に、3900μLの2xHBS pH7.02を1滴ずつ滴下して混合することによって調製した。このトランスフェクションミックスを、細胞に滴下して加えた。細胞をトランスフェクションミックスと共に4〜6時間インキュベータ内でインキュベートした後、洗浄して培地を交換した。48時間後に培地を回収し、低速の遠心分離によって透明にした後、0.45mm孔径のPVDFフィルターを通して濾過した。ウイルスストックは、SW28 Beckmanローターを用いて、90.000g(26.000rpm)、2時間4℃にて超遠心分離することによって濃縮した。レンチウイルスを含むペレットを風乾させた後、4℃にて400〜600μlの培地に一晩再懸濁させた。
以下に述べるように、数通りの希釈によって参照HEK293T細胞に形質導入を行い、FACS解析を行って、生物学的なウイルス力価を算出した(形質導入単位/ml、T.U./mL)。形質導入の1日前に、2×105の参照細胞を6ウェルのマルチウェルプレートにまき、培地を、8μg/mLのPolybrene(商標)を含む培地を用いて1/10、1/100および1/1000のように規則的に希釈したレンチウイルス上清1mLに交換し、4〜6時間37℃にて接種を行った。接種材料を通常の培地に交換し、FACSを用いる前に細胞を48時間培養した。
細胞(5〜10×106)をトリプシン処理するかまたはスクレイプして、13mLのPEコニカルチューブに移し、PBSによって洗浄した後、卓上遠心分離機を用いて低速(1,500rpm)にてペレット化した。ペレットを溶解緩衝液(100mM NaCl、50mMトリスpH8.0、100mM EDTAおよび1%SDS)中に再懸濁し、マイクロチューブに移した後、プロテイナーゼK(0.5μg/mL)を用いて56℃にて緩やかに攪拌しながら一晩消化した。その後250μLの飽和NaClを加え、混合して室温に5分間静置した後、minifugeを用いて13,000rpmにて遠心分離した。ペレットを崩さないように750μLの上清を抽出し、500μLのイソプロパノールと混合した後、13,000rpm、RTにおいて遠心分離により沈殿させ、70%エタノールを用いて洗浄、風乾させた後、RTにて1×TE中に一晩再懸濁させた。再懸濁させたDNAを連続希釈したものを、NanoDrop ND1000分光光度計(NanoDrop Technologies、Bonsai Tecnologies Group SL、アルコベンダス、マドリード、スペイン)を用いて定量した。
トリプシン処理した細胞(典型的には5〜10×106細胞)を、13mLのPEコニカルチューブに移し、卓上遠心分離機を用いて、RTにおいて3〜5分間低速(1000〜1500rpm)にてペレット化した。ペレットを冷PBSによって洗浄した後、上記のように遠心分離した。再懸濁したペレットをマイクロ遠心チューブに移し、4℃、13,000rpmにて5分間遠心分離した。ピペッティングまたはボルテックスすることなく、ペレットをHirtの溶解緩衝液(0.6%SDSおよび10mM EDTA)に再懸濁し、RTにて15分間インキュベートした。5M NaClを最終濃度が1.4Mになるように加え、反転しながら穏やかに混合し、4℃にて一晩静置することによってゲノムDNAを沈殿させた。マイクロ遠心分離機を用い、4℃、13,000rpmにて30〜60分間、タンパク質およびゲノムDNAを遠心分離した。低分子DNAを含む上清をフェノール抽出し、エタノール沈殿させた後、100〜200μLの水に再懸濁させた。
消化したサンプルを1×TAE中の0.8%アガロースゲルに負荷し、定電圧70〜100Vにて、色素の先端がゲルの終端から1〜3cmに到達するまで泳動を行い、分離した。対照として、検出対象の配列を含む定量化されたプラスミドを泳動して、大きさおよび量(20pg、200pgおよび2ng)の基準を提供した。300nmの紫外線光の下で、ゲルの写真を撮影した。ゲルを蒸留水で洗浄した後、2×SSCによって、RTにおいて15分間平衡化した。0.5N NaOHを用いて、毛管現象により、ゲルをナイロンメンブレンHybond−N plus(GE Healthcare)に、RTにおいて一晩ブロットした。メンブレンをStratalinker(Stratagene)内での照射によって固定した後、ハイブリダイゼーションに使用した。
Butler, SL et al., J. Virol. 2002, 76(8): 3739. DOI: 10.1128/JVI.76.8.3739−3747.2002に記載されるSYBR Greenの方法論を用いて定量PCRを行い、LentiSomeを用いて形質導入した培養に由来する、組み込まれなかったエピソーム型2−LTRを決定した。HEK293A細胞内のアルブミンのコピー数を、幾らかの改変を加えた以前の記載に従って測定した。すべてのアッセイにおいて、標準化DNAの連続希釈によってPCRの効率を決定し、個々の遺伝子プライマーの特異性については、各qPCRアッセイの終了時に、融解曲線によって確認した。pRRl.sin18.CMV.eGFP.Wpreプラスミド(Addgene)を、102〜109コピーに相当する0.01pgないし100ngの範囲の量に希釈して検量線を得た。以下に挙げる特異的プライマーを用いた増幅によって得たCt値を補間して、実験サンプル中のコピーの絶対数を算出した。Ct値を用い、希釈したゲノムDNAの試験サンプルにおける単一コピーのアルブミン遺伝子に相似させて細胞当量を算出し、ゲノムDNAを標準化した。2−LTRのqPCRに対する陽性対照は、合成し、通常のプラスミド内でクローン化したLTR−LTRエレメントを含む断片とした。
形質導入を行ってから72時間後にフローサイトメトリー解析を行った。細胞をトリプシン処理して回収し、培養用の1×PBSを用いて2回洗浄した後、CherryFPの励起に適したレーザーを備えたFACS DIVA(Becton Dickinson、サン・アグスティン・デル・グアダリクス、マドリード、スペイン)ソーターを用いて解析した。すべての場合において、10,000イベントを三重に測定した。
細胞株を、培養フラスコ内で、37℃にて、空気中5%CO2雰囲気下でインキュベートした。分裂中期の細胞は、標準的な細胞遺伝学的方法によって調製した。コルセミド(0.1μg/mL、1.5時間、37℃;GIBCO、ストラックライド、英国)によって有糸分裂を停止させた後に低張処理(75mm KCl、15分間、37℃)を行い、次にメタノール/酢酸(3:1)によって固定した後、スライドグラス上に広げた。
FISH分析のため、細胞を最初にコルセミド(Invitrogen)によって処理し、次に低張性の塩溶液によって処理した後に回収した。
実施例1:分裂頻度の高い細胞内でのレンチウイルス−エピソーム(LentiSome)の維持
本アプローチについての説明
本発明者らは、2か月の培養期間に数十の集団倍加を示して指数関数的に増殖する細胞内での、エピソーム1−LTRおよび2−LTRの維持および分離における、哺乳類のoriおよびS/MAR配列の一連の組み合わせの効果について系統的に分析した。
ori/SMAR配列を有するpLSプラスミドの配列に従った相対的な安定性をin silicoにおいて予測するため、本発明者らはストレス誘導DNA不安定化(SIDD)分析を行った。この試験によって読み出された情報は、いずれかのヌクレオチド配列に従った、鎖の分離に必要な予測エネルギー(ΔGoで表される)の理論特性であり、これによって、転写終止部位および推定上の複製起点に示されるような、構造が開かれており、かつ鎖が分離する傾向の高い(不安定化)、特定の領域の決定が可能となる。
記載するori/SMARの組み合わせを有するIDLVを、低いMOI(2T.U./細胞)にて用いて、指数関数的に増殖するヒト癌細胞株HEK293A細胞の培養に形質導入を行った。培養を集団倍加数(PDについて、1PDは、2回の継代/週を行う培養条件で18時間に相当する)が5になるまで維持して、エピソーム、およびFACSによる分離後に精製したeGFP+細胞を確立させた。その後、培養にG418を含むかまたは含まない状態で維持し、8〜10PD(6ないし7.5日間)ごとにeGFP+細胞の存在をスコア化した。
上記の実験から、レンチウイルス構造における本発明者らのアプローチは実現可能であり、かつ(ii)すべての組み合わせが同等に許容されるものでも、理論的に予測できるものでもないことから、レンチウイルスに関してはかなりの試行錯誤が必要であると結論付けられる。
形質導入された細胞内のLentiSome(商標)の、染色体外状態の分析
現状では、哺乳類oriの機能が、エピジェネティックな原則、例えば転写因子の結合、クロマチン構造、または核局在化に依存しているということは十分に理解されている。アンカータンパク質の必要性に加えて、S/MAR配列を機能的なものとするための要件についてはほとんど知られていない。
一組のLSを形質導入した後、持続的に培養した(>70PD)細胞からゲノムDNAおよび低分子量DNA(Hirt法抽出物)の両方を精製し、これらのサンプルを最初にサザンブロットに供した。すべてのLSの3’末端を1回切断する酵素によって消化したゲノムDNAをブロットし、特異的なneoプローブ、およびHEK293K細胞の1細胞あたり3つ示される内在性遺伝子座であるAAVS1に対するプローブとハイブリダイズさせた。フィルターと特異的なneoプローブとをハイブリダイズさせた際(図5A、左)、この技術によって試験したすべてのサンプルにおいて、特異的なシグナルは検出されなかった。AAVS1プローブとハイブリダイズさせたすべてのサンプルでは、1レーンあたりに負荷した細胞当量において、最大2倍の変動が明らかになった(図5A、右)。実験条件下でのneoプローブの感受性は、3コピー/細胞の割合で検出するAAVS1プローブに比較して10倍高く、各レーンには百万細胞当量が負荷されていることから、組み込まれたLentiSomeのコピー数は0.3/細胞よりも少ないと結論付けられる。Hirt法抽出物をサザンブロットによって試験した際にも同様に負の結果が得られたが、この場合の感受性は低く、コピー数の検出限界は1細胞あたり50までであった。実際に多数のコピーが存在した場合、すなわちエピソームが確立された後では、LS1、2、5および10を形質導入された培養に由来するHirt法抽出物は、サザンブロットにおいて特異的バンドを示した(図5B左)。重要なことに、この時点での培養に対して行ったFISH試験では、スコア化したすべての細胞が十分な数のスポットを示しており、このデータは、それらのサザンブロットによる検出と相関している(図5B右)。
サザンブロットによって提供された情報は探索される配列の特異的位置を検出するために必要であるにも関わらず、探索されるわずかな細胞内の配列のコピー数が少ない場合、この技術はあまり有益ではない。エピソームのコピー数が少なく、かつわずかな細胞内に存在していると考えられる場合に、持続性の表現型をもつ培養中のIDLV配列は、qPCRによってさらに特徴付けられる。
上に示したデータから示唆されるように、LS型ベクターのコピー数は少なく、ある種の組み合わせは細胞分裂の間に安定的に維持されるが、その他の組み合わせはそうではない可能性がある。本発明者らは、FISH分析を、LSに由来する中間体と染色体との会合を示す明確な証明として行った。図7は、LS5、6、9、10または11を形質導入された細胞の、70PDにおける分裂中期スプレッドを示す。LS5、6、10または11を形質導入された細胞にみられるように、本発明者らは、分裂中期の染色体に関してはっきりとした蛍光スポットを一貫して認めたが、染色体腕の同じ位置に複製されたシグナルはみられなかった。このことは、LS9を形質導入された細胞のほとんどに当てはまるが、まれに例外があり(図7の挿入図を参照されたい)、両方の染色体腕に環状コンストラクトの組込み現象を示すはっきりとした二重の点が観察される。このような結果は、従来のqPCRおよびPCRによって得られた特定のデータセットと一致するが(図6)、他とは一致しない。
本発明者らは、ウイルスゲノム内へのoriおよびS/MAR配列の挿入によって、レンチウイルスの逆転写脱離産物(1−/2−LTR)に自律複製および分離の能力を伝達可能であることを示した。本発明の機能に寄与する主な要因は、脱離産物の核輸送、検討する配列の哺乳類的性質、およびレンチウイルスベクターを用いた形質導入による細胞生理機能への最小限の干渉であると考えられる。
Claims (58)
- ポリヌクレオチドであって、
(i)レンチウイルス由来の、第1長鎖末端反復配列と、
(ii)配列番号1の配列を有する複製開始点、配列番号2の配列を有する複製開始点、配列番号3の配列を有する複製開始点、および前記配列番号1の配列、前記配列番号2の配列、前記配列番号3の配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、真核生物の複製開始点と、
(iii)配列番号4の配列を有する足場/マトリックス付着領域、配列番号5の配列を有する足場/マトリックス付着領域、配列番号6の配列を有する足場/マトリックス付着領域、および前記配列番号4の配列、前記配列番号5の配列、前記配列番号6の配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、足場/マトリックス付着領域と、
(iv)前記レンチウイルス由来の、第2長鎖末端反復配列と
を含んでなり、
前記真核生物の複製開始点および前記足場/マトリックス付着領域が、前記第1長鎖末端反復配列と第2長鎖末端反復配列の間に配置されてなる、ポリヌクレオチド。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチドであって、
(i)レンチウイルス由来の、第1長鎖末端反復配列と、
(ii)配列番号1の配列を有する複製開始点、配列番号2の配列を有する複製開始点、配列番号3の配列を有する複製開始点、および前記配列番号1の配列、前記配列番号2の配列、前記配列番号3の配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、真核生物の複製開始点と、
(iii)配列番号4の配列を有する足場/マトリックス付着領域、配列番号5の配列を有する足場/マトリックス付着領域、配列番号6の配列を有する足場/マトリックス付着領域、および前記配列番号4の配列、前記配列番号5の配列、前記配列番号6の配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、足場/マトリックス付着領域と、
(iv)前記レンチウイルス由来の、第2長鎖末端反復配列と
を含んでなり、
前記真核生物の複製開始点および前記足場/マトリックス付着領域が、前記第1長鎖末端反復配列と第2長鎖末端反復配列の間に配置されてなる、ポリヌクレオチド。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチドであって、
(i)レンチウイルス由来の、第1長鎖末端反復配列と、
(ii)配列番号1の配列を有する複製開始点、配列番号2の配列を有する複製開始点、配列番号3の配列を有する複製開始点、および前記配列番号1の配列、前記配列番号2の配列、前記配列番号3の配列に対して少なくとも98%の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、真核生物の複製開始点と、
(iii)配列番号4の配列を有する足場/マトリックス付着領域、配列番号5の配列を有する足場/マトリックス付着領域、配列番号6の配列を有する足場/マトリックス付着領域、および前記配列番号4の配列、前記配列番号5の配列、前記配列番号6の配列に対して少なくとも98%の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、足場/マトリックス付着領域と、
(iv)前記レンチウイルス由来の、第2長鎖末端反復配列と
を含んでなり、
前記真核生物の複製開始点および前記足場/マトリックス付着領域が、前記第1長鎖末端反復配列と第2長鎖末端反復配列の間に配置されてなる、ポリヌクレオチド。 - 前記足場/マトリックス付着領域が、前記複製開始点に対して5’側に位置する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第1長鎖末端反復配列および第2長鎖末端反復配列が、HIVに由来するものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第1長鎖末端反復配列が、配列番号7の配列を含むものである、請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第2長鎖末端反復配列が、自己不活性化変異を含むものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記自己不活性化変異が、前記末端反復配列のU3領域における欠失である、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
- U3領域における欠失を含む前記末端反復配列が、配列番号8の配列を含むものである、請求項8に記載のポリヌクレオチド。
- −マルチクローニング部位、
−少なくとも一つの、プロモーターに作動的に連結する対象ポリヌクレオチド(ここで、前記プロモーターは、足場/マトリックス付着領域および複製開始点に対して5’側に位置し、第1長鎖末端反復配列に対して3’側に位置し、かつ前記対象ポリヌクレオチドは、足場/マトリックス付着領域に対して5’側または3’側に位置し、複製開始点に対して5’側または3’側に位置する)、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 - 前記プロモーターが、アデノ随伴ウイルスに由来するものである、請求項10に記載のポリヌクレオチド。
- 前記アデノ随伴ウイルスに由来するプロモーターが、p5プロモーターまたはその機能的に等価な変異体である、請求項10または11に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターが、配列番号9の配列を含むものである、請求項12に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターに作動的に連結するエンハンサー領域をさらに含んでなる、請求項10〜13のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記エンハンサー領域が、サイトメガロウイルスプロモーターのエンハンサー領域である、請求項14に記載のポリヌクレオチド。
- 前記サイトメガロウイルスプロモーターのエンハンサー領域が、配列番号10の配列を含むものである、請求項15に記載のポリヌクレオチド。
- 前記対象ポリヌクレオチドが、選択遺伝子、対象タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれらの組み合わせから選択される、請求項10〜16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記選択遺伝子が、抗生物質への耐性を与えるタンパク質をコードするものである、請求項17に記載のポリヌクレオチド。
- 前記抗生物質がネオマイシンである、請求項18に記載のポリヌクレオチド。
- 前記対象タンパク質が緑色蛍光タンパク質である、請求項17〜19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 第2の対象ポリヌクレオチドをさらに含んでなり、当該第2の対象ポリヌクレオチドが、第1の対象ポリヌクレオチドに、同時翻訳性自己プロセシング配列をコードする配列によって作動的に連結されてなる、請求項10〜20のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記同時翻訳性自己プロセシング配列が、ブタテッショウウイルスに由来するシス作用性ヒドロラーゼエレメントである、請求項21に記載のポリヌクレオチド。
- 前記同時翻訳性自己プロセシング配列をコードする配列が、配列番号11の配列を含むものである、請求項21に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第1の対象ポリヌクレオチドが、対象タンパク質をコードし、前記第2の対象ポリヌクレオチドが選択遺伝子である、請求項21〜23のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- レンチウイルス由来のプライマー結合部位配列をさらに含んでなり、
ここで、前記プライマー結合部位配列が、第1長鎖末端反復配列に対して3’側に位置し、複製開始点および足場/マトリックス付着領域に対して5’側に位置し、かつ
前記ポリヌクレオチドが、
−マルチクローニング部位、
−プロモーターに作動的に連結する対象ポリヌクレオチド(ここで、前記プロモーターは、足場/マトリックス付着領域および複製開始点に対して5’側に位置し、第1長鎖末端反復配列に対して3’側に位置し、かつ前記対象ポリヌクレオチドは、足場/マトリックス付着領域に対して5’側または3’側に位置し、複製開始点に対して5’側または3’側に位置する)、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含む場合、
前記プライマー結合部位が前記ポリヌクレオチド配列に対して5’側に位置するものとされた、請求項1〜24のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 - 前記プライマー結合部位配列がHIVに由来するものである、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プライマー結合部位配列が配列番号12の配列を含むものである、請求項26に記載のポリヌクレオチド。
- 第1長鎖末端反復配列と第2長鎖末端反復配列の間に位置する、レンチウイルス由来のパッケージングシグナル配列をさらに含んでなる、請求項1〜27のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記パッケージングシグナル配列がHIVに由来するものである、請求項28に記載のポリヌクレオチド。
- 前記パッケージングシグナル配列が配列番号13の配列を含むものである、請求項29に記載のポリヌクレオチド。
- 第1長鎖末端反復配列と第2長鎖末端反復配列の間に位置する、レンチウイルス由来のRev応答エレメントをさらに含んでなる、請求項1〜30のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記Rev応答エレメントがHIVに由来するものである、請求項31に記載のポリヌクレオチド。
- 前記Rev応答エレメントが配列番号14の配列を含むものである、請求項32に記載のポリヌクレオチド。
- レンチウイルス由来のセントラルポリプリン配列をさらに含んでなり、
ここで、前記セントラルポリプリン配列が、第1長鎖末端反復配列に対して3’側に位置し、複製開始点および足場/マトリックス付着領域に対して5’側に位置し、かつ
前記ポリヌクレオチドが、
−マルチクローニング部位、
−足場/マトリックス付着領域および複製開始点に対して5’側に位置し、第1長鎖末端反復配列に対して3’側に位置するプロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドであって、
足場/マトリックス付着領域に対して5’側または3’側に位置し、かつ複製開始点に対して5’側または3’側に位置する対象ポリヌクレオチド、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含む場合、
前記セントラルポリプリン配列が前記ポリヌクレオチド配列に対して5’側に位置するものとされた、請求項1〜33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 - 前記セントラルポリプリン配列がHIVに由来するものである、請求項34に記載のポリヌクレオチド。
- 前記セントラルポリプリン配列が配列番号15の配列を含むものである、請求項35に記載のポリヌクレオチド。
- 原核生物の複製開始点と、選択マーカーとをさらに含んでなる、請求項1〜36のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記原核生物の複製開始点が配列番号16の配列を含むものである、請求項37に記載のポリヌクレオチド。
- 前記選択マーカーが、抗生物質への耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項37または38に記載のポリヌクレオチド。
- 前記抗生物質がアンピシリンである、請求項39に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜40のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
- 請求項1〜40のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項41に記載のベクターを含んでなる、細胞。
- 請求項1〜40のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、ウイルスゲノムの細胞ゲノム内への組込みに対するインテグラーゼの触媒作用を不可能にする変異を含むレンチウイルスインテグラーゼとを含んでなる、組換えレンチウイルス。
- 前記変異が、前記インテグラーゼの触媒コアドメイン内のDDEモチーフの1つ以上のアミノ酸残基の置換である、請求項43に記載の組換えレンチウイルス。
- 前記変異が、前記DEEモチーフの第1アスパラギン酸残基の、アスパラギン残基による置換である、請求項44に記載の組換えレンチウイルス。
- 前記インテグラーゼが配列番号17の配列を含むものである、請求項45に記載の組換えレンチウイルス。
- 水疱性口内炎ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質Gをさらに含んでなる、請求項43〜46のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルス。
- 請求項43〜47のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスを作製するためのin vitro法であって、
(i)真核細胞を、請求項1〜36のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項41に記載のベクターと接触させる工程であり、ここで前記細胞が、前記細胞内への前記ポリヌクレオチドまたはベクターの移行に適した条件下で、レンチウイルス遺伝子gag、pol、revの産物およびウイルスエンベロープタンパク質を発現する工程と、
(ii)レンチウイルスの集合に適した条件下で前記細胞を維持する工程とを含んでなる、in vitro法。 - レンチウイルス遺伝子gag、pol、revの産物およびウイルスエンベロープタンパク質を発現する細胞が、gag遺伝子、pol遺伝子、rev遺伝子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、ウイルスエンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチドとをトランスフェクトされており、前記トランスフェクションが、前記ポリヌクレオチドもしくはベクターとの接触と同時に、またはそれに先立って行われる、請求項48に記載のin vitro法。
- 前記gag遺伝子、pol遺伝子、rev遺伝子およびウイルスエンベロープタンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが、
−gag遺伝子およびpol遺伝子を含むポリヌクレオチド、
−rev遺伝子を含むポリヌクレオチド、および
−ウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド
として提供される、請求項49に記載のin vitro法。 - レンチウイルス遺伝子gag、polおよびrevがHIV−1に由来するものである、請求項48〜50のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 前記ウイルスエンベロープタンパク質が水疱性口内炎ウイルス由来の糖タンパク質Gである、請求項48〜51のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 細胞によって産生された組換えレンチウイルスを精製する工程をさらに含んでなる、請求項48〜52のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 請求項1〜40のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む対象ポリヌクレオチドを発現可能な安定化細胞集団であって、前記ポリヌクレオチドが、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドの配列を含んでなり、
−前記プロモーターが、前記足場/マトリックス付着領域および前記複製開始点に対して5’側に位置し、前記第1長鎖末端反復配列に対して3’側に位置し、かつ
−前記対象ポリヌクレオチドが、前記足場/マトリックス付着領域に対して5’側または3’側に位置し、前記複製開始点に対して5’側または3’側に位置するものとされた、安定化細胞集団。 - 請求項54に記載の安定化細胞集団を作製するためのin vitro法であって、
(i)細胞を請求項43〜47のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスに接触させる工程であり、ここで前記組換えレンチウイルスが、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドの配列を含んでなり、
−前記プロモーターが、前記足場/マトリックス付着領域および前記複製開始点に対して5’側に位置し、前記第1長鎖末端反復配列に対して3’側に位置し、かつ
−前記対象ポリヌクレオチドが、前記足場/マトリックス付着領域に対して5’側または3’側に位置し、前記複製開始点に対して5’側または3’側に位置する工程と、
(ii)前記細胞を増殖させかつ維持する工程と
を含んでなる、in vitro法。 - 工程(i)において作製された細胞を選択することをさらに含んでなる、請求項55に記載の方法。
- 対象産物をin vitroで産生するための、請求項54に記載の安定化細胞集団の使用。
- 対象産物を産生するためのin vitro法であって、対象ポリヌクレオチドの発現が許容される条件下で、請求項54に記載の安定化細胞集団を培養する工程を含んでなる、in vitro法。
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