CN108486161A - 一种hiv指示细胞系及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基因编辑系统，提供了一种表达载体，还提供了一种HIV指示细胞或者HIV指示细胞系的制备方法，还提供了采用该方法制备的HIV指示细胞或者HIV指示细胞系，以及该基因编辑系统和表达载体的用途。与现有的慢病毒相比，本发明提供的制备方法对细胞毒性小，不会造成宿主细胞死亡从而更容易筛选工程化细胞，目的基因CD4和CCR5能够持久、稳定表达，不会因传代次数增加而提高目的基因丢失的概率，本发明为抗HIV药物和治疗手段的效果验证提供一种新的工程化指示细胞系及其制备方法。

Description

一种HIV指示细胞系及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种HIV指示细胞系及其制备方法。

背景技术

原代细胞是指从机体的组织经蛋白酶水解或其它方法获得，并在体外进行模拟机体培养的细胞。而现普遍认为细胞系是可长期连续传代的培养细胞。在科研应用上，原代细胞与细胞系各有优势。相对而言细胞系由于可以连续传代所以不用担心来源问题，科研人员建立起大量对各种细胞系的实验规程(如培养、转染等)使得实验中对细胞系的操作相对容易掌握，且细胞系遗传物质被研究的比较透彻更能清楚说明科研操作对细胞的影响和作用。相反，原代细胞每次使用都要从组织中重新分离(传代不超过10代)，不同个体来源的细胞多少有些区别，导致实验重复率较低，但原代细胞遗传物质、对外界的反应、形态和生理病理状态跟生物机体更为接近。为了一步步深入探讨科学问题，科研者经常会同时(或先后)用细胞系和原代细胞做研究。然而在常规检测性实验中，细胞系因其廉价、易培养、遗传背景清晰、实验重复性高等优点而更受欢迎。对抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的药物或治疗手段的检测也不例外。

HIV是以CD4T淋巴细胞为主要攻击对象和宿主的整合型逆转录病毒，分HIV-1和HIV-2两种，较常见的HIV-1又分为R5嗜性(以CCR5为辅助受体)和X4嗜性(以CXCR4为辅助受体)，而前者在感染初期占绝对优势。在抗HIV药物或治疗手段的研究开发和抗病毒效果检测中，细胞是不可或缺的工具，常见的实验方案是：对细胞实施用药或治疗操作，在这之前或之后使用HIV攻击细胞，观察细胞状态和胞内病毒载量，从而评价药物或治疗手段的效果。前述研究必须使用可被HIV攻击的细胞，如原代T细胞(或PBMC)，或者THP-1、TZM-bl、Jukat-CCR5等。这些细胞的共同点为细胞膜表面展示HIV进入细胞所必需的CD4和CCR5(或CXCR4)蛋白，其中THP-1为悬浮细胞(培养和转染稍难于贴壁细胞)，而TZM-bl和Jukat-CCR5都为工程化改造的细胞系，前者人为表达CD4和CCR5，后者本身含CD4人为表达CCR5，但两者都没有带报告基因，研究者不能通过目测直接判断HIV病毒侵染情况。此外，在美国NIH的艾滋病研究项目里，科研者也建立了十几株工程化改造的细胞系作为HIV的指示细胞(GHOSTIndicator Cells)，可见细胞系在HIV研究中的重要性。

但是，现已开发的可被HIV感染的工程化细胞系都是以慢病毒为载体，将CD4、CCR5或CXCR4等编码基因及其启动子随机插入亲代细胞中实现过表达，随后经过筛选所得。然而慢病毒携带的遗传物质在宿主细胞基因组中随机整合，插入位点不可控，对细胞筛选和后续使用都带来麻烦，比如说随机插入生理相关基因导致细胞死亡或传代过程中插入片段丢失。

基因编辑技术，尤其是CRISPR-Cas9的发展，可以解决以上由慢病毒带来的随机整合问题，达到精准编辑、定点插入的效果。CRISPR-Cas9是第三代基因编辑技术，其构建简单、效率高、使用成本低，它由PAM位点、sgRNA和tracrRNA，以及Cas9内切酶组成。在基因编辑过程中，sgRNA和Cas9通过tracrRNA结合组成复合体，sgRNA负责识别靶位点从而引导Cas9在靶位点附近切割产生DNA双链断裂，断裂的DNA双链使用非同源性末端接合(Non-homologous end joining,NHEJ)或者同源重组(Homologous Recombination，HR)的方式进行修复。同源序列的存在是发生同源重组的前提条件，可根据sgRNA识别的靶位点设计上下游同源臂，并根据实验需求在同源臂中间插入启动子及目的基因，即可实现启动子和目的基因在宿主基因组的定点插入。插入位点首选安全港基因(safe harbor，)，研究表明在基因组的安全港基因中引入外源序列对培养细胞的毒性很小。

目前现有技术是利用慢病毒载体，把HIV进入人体相关基因(如CD4、CCR5或CXCR4)及其启动子随机整合插入宿主细胞系基因组的随机位点，随后通过筛选获得工程化HIV指示细胞系。现有技术以慢病毒作为载体，目的基因随机插入宿主细胞基因组，对细胞毒性大，容易引起细胞死亡，导致工程化细胞筛选难度大，筛选效率低下；且插入的目的基因容易在后续传代过程中丢失，即筛选的工程化细胞系不能稳定表达目的基因，传代次数有限，不利于工程化细胞系的持续使用，造成资源浪费。

发明内容

克服现有技术的不足，本发明提供一种基因编辑系统，提供了一种表达载体，还提供了一种HIV指示细胞或者HIV指示细胞系的制备方法，还提供了采用该方法制备的HIV指示细胞或者HIV指示细胞系，以及该基因编辑系统和表达载体的用途。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种基因编辑系统，所述基因编辑系统包括敲除细胞的安全港基因的CRISPR系统和同源重组工具，所述同源重组工具含有细胞的安全港基因上游同源臂序列、细胞的安全港基因下游同源臂序列、CD4的编码序列、CD4基因的启动子序列、CCR5的编码序列、CCR5基因的启动子序列以及报告基因序列，所述CD4的编码序列、CD4基因的启动子序列、CCR5的编码序列、CCR5基因的启动子序列以及报告基因序列均位于细胞的安全港基因上游同源臂序列和细胞的安全港基因下游同源臂序列之间，所述基因编辑系统能够将CD4基因、CCR5基因和报告基因定点整合到所述细胞的安全港基因，使得所述细胞表达CD4和CCR5，以及在HIV感染该细胞后表达报告基因。

优选地，所述细胞的安全港基因为AAVS1基因。

优选地，所述CRISPR系统包括Cas9核酸酶和针对AAVS1基因的gRNA。

优选地，所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述细胞的安全港基因上游同源臂序列如SEQ ID NO:25所示，所述细胞的安全港基因下游同源臂序列如SEQ ID NO:26所示。

优选地，所述同源重组工具含有SEQ ID NO:27所示的序列。

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体表达上述所述的基因编辑系统。

本发明提供了一种HIV指示细胞或者HIV指示细胞系的制备方法，所述制备方法是采用上述所述的基因编辑系统对细胞或细胞系进行编辑后，或者采用上述所述的表达载体转入细胞或者细胞系后得到所述HIV指示细胞或者HIV指示细胞系。

本发明提供了采用上述所述的方法制备的HIV指示细胞或者HIV指示细胞系。

本发明提供了上述所述的基因编辑系统、或者上述所述的表达载体在制备HIV指示细胞或者HIV指示细胞系中的用途。

本发明基于CRISPR-Cas9基因编辑系统介导的同源重组技术提供了一种基因编辑系统，该基因编辑系统能够在宿主细胞系的基因组安全港基因AAVS1定点整合目的基因CD4和CCR5及其启动子使其高水平表达CD4受体和CCR5辅助受体；同时整合插入报告基因GFP，GFP基因在截断的HIV-1长末端重复序列(long terminal repeal，LTR)的控制下条件性表达，只有当细胞被HIV-1感染后才表达GFP，利用此改造的细胞系可以在荧光显微镜下通过细胞计数或利用流式细胞术等方法，简便快速的观察、判断和测定HIV-1的感染效率。

本发明的有益效果在于：

与现有的慢病毒改造技术所制备的细胞系的相比，本发明提供的制备方法对细胞毒性小，不会造成宿主细胞死亡从而更容易筛选工程化细胞，目的基因CD4和CCR5能够持久、稳定表达，不会因传代次数增加而提高目的基因丢失的概率，本发明为抗HIV药物和治疗手段的效果验证提供一种新的工程化指示细胞系及其制备方法。

附图说明

图1为pX458商品化质粒的图谱；

图2为pX458-hAAVS1T16质粒的图谱；

图3为pDonor-TALEN-EGFP质粒的图谱；

图4为pDonor-haavs1T16-EGFP质粒的图谱；

图5为NL4.3-Bal商品化质粒的图谱；

图6为pDonor-haavs1T16-LTR-EGFP质粒的图谱；

图7为pGSI商品化质粒的图谱；

图8为pGSI-CD4质粒的图谱；

图9为pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-EGFP质粒的图谱；

图10为pIRES-EGFP商品化质粒的图谱；

图11为pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-IRES-EGFP质粒的图谱；

图12为pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-IRES-CCR5-EGFP质粒的图谱；

图13为用流式细胞仪分析细胞表面表达的CD4和CCR5的结果；

图14为完成同源重组后的Hela-T16-R5细胞基因组AAVS1位点的结构图；

图15为HIV病毒NL4-3bal感染Hela-T16-R5细胞株系的显微图片；

图16为本发明构建的Hela-T16-R5细胞株系与商品化的HIV易感细胞株感染效率比较。

具体实施方式

实施例1

一、CRISPR-Cas9基因编辑载体pX458-hAAVS1T16的构建

1.1引物退火

(1)委外合成针对AAVS1基因的gRNA对应的靶序列aavs1-T16-L和aavs1-T16-R(如表1所示)；

表1 aavs1-T16-L和aavs1-T16-R的核苷酸序列

aavs1-T16-L	caccGcccctggaagatgccatgac	SEQ ID NO:1
			aavs1-T16-R	aaacgtcatggcatcttccaggggC	SEQ ID NO:2

(2)用ddH₂O将上述引物稀释成100μM的浓度；

(3)在98μL ddH₂O中加入稀释后的aavs1-T16-L和aavs1-T16-R各1μL，90℃退火30s，室温冷却。

1.2载体准备

(1)pX458质粒(图1)扩增和提取，并测定质粒浓度；

(2)采用限制性内切酶Bbs I对pX458进行酶切，37℃酶切1h后加loading buffer终止反应。

(3)1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化质粒pX458，并测定回收产物浓度，-20℃保存备用。

1.3连接转化

(1)将切胶回收的线性化pX458载体与退火后的gRNA双链进行连接反应；

(2)连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。

(3)将复苏后的TOP10细胞涂布LB固体平板(Amp⁺)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。

(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp⁺)中扩大培养。

(5)使用引物SeqF(5’-TTCCTTgACCCTggAAggTg-3’)(SEQ ID NO:3)，对上述菌液分别测序；

(6)将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用，该质粒命名为pX458-hAAVS1T16(图2)。

二、同源重组载体pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-IRES-CCR5-EGFP的构建(一)pDonor-haavs1T16-EGFP载体构建

1.pDonor-haavs1T16-EGFP上游同源臂载体改造

1.1PCR扩增上游同源臂

以293T基因组为模板，引物为aavs1-T16-SnaBI-L/aavs1-T16-SalI-R(如表2所示)，扩增上游同源臂目的片段T16-F，过柱纯化PCR产物。

表2 aavs1-T16-SnaBI-L/aavs1-T16-SalI-R的核苷酸序列

aavs1-T16-SnaBI-L	gttctagtggttggctacgtagagctctactggcttctgc	SEQ ID NO:4
			aavs1-T16-SalI-R	tagcttatcgataccgtcgacgctggaagagctagcacag	SEQ ID NO:5

1.2载体酶切

SnaBI和SalI-HF双酶切pDonor-TALEN-EGFP(图3)，37℃酶切1h，80℃酶失活20min。

1.3重组转化

(1)将酶切的pDonor-TALEN-EGFP与目的片段T16-F进行重组反应；

(2)重组产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。

(3)将复苏后的DH5α细胞涂布LB固体平板(Amp⁺)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。

(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp⁺)中扩大培养。

(5)使用引物Donor-F(5’-gatgaagtggttcgcatcctc-3’)(SEQ ID NO:6)，对上述菌液分别测序；

(6)将测序正确的菌液提取质粒，命名为pDonor-haavs1T16-F-EGFP，并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

2.pDonor-haavs1T16-EGFP下游同源臂载体改造

2.1PCR扩增下游同源臂

以293T基因组为模板，引物为aavs1-T16-NotI-L/aavs1-T16-BstBI-R(如表3所示)，扩增上游同源臂目的片段T16-R，过柱纯化PCR产物。

表3 aavs1-T16-NotI-L/aavs1-T16-BstBI-R的核苷酸序列

aavs1-T16-NotI-L	tccactagttctagagcggccgctccgagagctcagctagtc	SEQ ID NO:7
			aavs1-T16-BstBI-R	actgcaggctctagattcgaagctactggccttatctcacag	SEQ ID NO:8

2.2载体酶切

NotI-HF和BstBI双酶切pDonor-haavs1T16-F-EGFP，37℃酶切1h，过柱纯化酶切产物。

2.3重组转化

(1)将酶切纯化的pDonor-haavs1T16-F-EGFP与目的片段T16-R进行重组反应；

(2)连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。

(3)将复苏后的DH5α细胞涂布LB固体平板(Amp⁺)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。

(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp⁺)中扩大培养。

(5)使用引物PEGFP-C-5(5’-catggtcctgctggagttcgtg-3’)(SEQ ID NO:9)，对上述菌液分别测序；

(6)将测序正确的菌液提取质粒，命名为pDonor-haavs1T16-EGFP(图4)，并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

(二)pDonor-haavs1T16-LTR-EGFP载体构建

1pDonor-haavs1T16-LTR-EGFP的5’LTR载体改造

1.1PCR扩增LTR

以NL4.3-BaL质粒(图5)为模板，引物为LTR-AfeI-L/LTR-AfeI-R(如表4所示)，扩增目的片段LTR-5’，1％琼脂糖凝胶纯化PCR产物。

表4 LTR-AfeI-L/LTR-AfeI-R的核苷酸序列

LTR-AfeI-L	gctttcagatccgctagcgctCTGGAAGGGCTAATTTGGTCCCA	SEQ ID NO:10
			LTR-AfeI-R	catggtggcgaccggtagATCTCTCTCCTTCTAGCCTCCG	SEQ ID NO:11

1.2载体酶切

AfeI单酶切pDonor-haavs1T16-EGFP(图4)，37℃酶切1h，65℃酶失活20min。

1.3重组转化

(1)将酶切的pDonor-haavs1T16-EGFP与纯化的目的片段LTR-5’进行重组反应；

(2)连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。

(3)将复苏后的DH5α细胞涂布LB固体平板(Amp⁺)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。

(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp⁺)中扩大培养。

(5)使用引物EF1αfoward(5’-tcaagcctcagacagtggttc-3’)(SEQ ID NO:12)，对上述菌液分别测序；

(6)将测序正确的菌液提取质粒，命名为pDonor-haavs1T16-LTR-5’-EGFP，并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

2pDonor-haavs1T16-LTR-EGFP的3’LTR载体改造

2.1PCR扩增上游同源臂

以NL4.3-BaL质粒(图5)基因组为模板，引物为LTR-NotI-L/LTR-NotI-R(如表5所示)，扩增上游同源臂目的片段LTR-3’，1％琼脂糖凝胶纯化PCR产物。

表5 LTR-NotI-L/LTR-NotI-R的核苷酸序列

LTR-NotI-L	cactagttctagagcggccgcTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAG	SEQ ID NO:13
			LTR-NotI-R	ctgagctctcggagcggccCTCACTGCAACCTCTACCTCCTG	SEQ ID NO:14

2.2载体酶切

NotI-HF单酶切pDonor-haavs1T16-LTR-5’-EGFP，37℃酶切1h，65℃酶失活20min。

2.3重组转化

(1)将酶切的pDonor-haavs1T16-LTR-5’-EGFP与目的片段LTR-3’进行重组反应；

(2)连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。

(3)将复苏后的DH5α细胞涂布LB固体平板(Amp⁺)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。

(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp⁺)中扩大培养。

(5)使用引物PEGFP-C-5(5’-catggtcctgctggagttcgtg-3’)(SEQ ID NO:9)，对上述菌液分别测序；

(6)将测序正确的菌液提取质粒，命名为pDonor-haavs1T16-LTR-EGFP(图6)，并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

(三)pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-EGFP载体构建

1.委外合成SEQ ID NO:15，其中含有CD4基因的CDS区，并将其克隆到pGSI载体(图7)上，形成pGSI-CD4(图8)；

2.PCR扩增CD4

以质粒pGSI-CD4为模板，引物为CD4-AfeI-L/CD4-AfeI-R(如表6所示)，扩增目的片段CD4，1％琼脂糖凝胶纯化PCR产物。

表6 CD4-AfeI-L/CD4-AfeI-R的核苷酸序列

CD4-AfeI-L	gctttcagatccgctagcGCCA	SEQ ID NO:16
			CD4-AfeI-R	AATTAGCCCTTCCAGagcGCT	SEQ ID NO:17

3.载体酶切

AfeI单酶切pDonor-haavs1T16-LTR-EGFP(图6)，37℃酶切1h，65℃酶失活20min。

4.重组转化

(1)将酶切的pDonor-haavs1T16-LTR-EGFP与纯化的目的片段CD4进行重组反应；

(2)重组产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。

(3)将复苏后的DH5α细胞涂布LB固体平板(Amp⁺)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。

(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp⁺)中扩大培养。

(5)使用引物EF1αfoward(5’-tcaagcctcagacagtggttc-3’)(SEQ ID NO:12)和引物CD4.W1F(5’-CAggTggAgTTCTCCTTCCC-3’)(SEQ ID NO:18)，对上述菌液分别测序；

(6)将测序正确的菌液提取质粒，命名pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-EGFP(图9)，并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

(四)pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-IRES-EGFP载体构建

1.PCR扩增IRES

以pIRES2-EGFP质粒(图10)为模板，引物为IRES-MluI-L/IRES-MluI-R(如表7所示)，扩增目的片段IRES，1％琼脂糖凝胶纯化PCR产物。

表7 IRES-MluI-L/IRES-MluI-R的核苷酸序列

IRES-MluI-L	agacatgtagccccatttgaattctgcagtcgacggtac	SEQ ID NO:19
			IRES-MluI-R	cccgactctagaacgcgtggttgtggccatattatcatcgt	SEQ ID NO:20

2.载体酶切

MluI单酶切pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-EGFP(图9)，37℃酶切1h，80℃酶失活20min。

3.重组转化

(1)将酶切的pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-EGFP与纯化的目的片段IRES进行重组反应；

(2)重组产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。

(3)将复苏后的DH5α细胞涂布LB固体平板(Amp⁺)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。

(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp⁺)中扩大培养。

(5)使用引物IRES-MluI-L(5’-agacatgtagccccatttgaattctgcagtcgacggtac-3’)(SEQ ID NO:19)对上述菌液分别测序；

(6)将测序正确的菌液提取质粒，命名为pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-IRES-EGFP(图11)，并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

(五)pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-IRES-CCR5-EGFP载体构建

1.PCR扩增CCR5

以Hela细胞基因组为模板，引物为CCR5-MluI-L/CCR5-MluI-R(如表8所示)，扩增目的片段IRES，1％琼脂糖凝胶纯化PCR产物。

表8 CCR5-MluI-L/CCR5-MluI-R的核苷酸序列

CCR5-MluI-L	atgataatatggccacaaccatggattatcaagtgtcaagtccaatct	SEQ ID NO:21
			CCR5-MluI-R	cccgactctagaacgcgttcacaagcccacagatatttcctgc	SEQ ID NO:22

2.载体酶切

MluI单酶切pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-IRES-EGFP(图11)，37℃酶切1h，80℃酶失活20min。

3.重组转化

(1)将酶切的pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-IRES-EGFP与纯化的目的片段CCR5进行重组反应；

(2)重组产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。

(3)将复苏后的DH5α细胞涂布LB固体平板(Amp⁺)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。

(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp⁺)中扩大培养。

(5)使用引物IRES-MluI-L(5’-agacatgtagccccatttgaattctgcagtcgacggtac-3’)(SEQ ID NO:19)和引物CCR5-1.W1F(5'-TCTACTCACTggTgTTCATC-3')(SEQ ID NO:23)对上述菌液分别测序；

(6)将测序正确的菌液提取质粒，命名为pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-IRES-CCR5-EGFP(图12)，并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

三、Hela-T16-R5细胞株系改造

1.24孔板贴壁培养Hela细胞，铺板密度为1.2×10^5cells/孔，用DMEM培养基(添加10％FBS)培养；

2.用无内毒素中提试剂盒提取质粒pDonor-haavs1T16-LTR-CD4-IRES-CCR5-EGFP(图12)与pX458-haavs1T16

(图2)；

3.使用Lipofectamine 3000Transfection Reagent，将上述质粒共同转化Hela细胞系；

4.从第五天开始，加入终浓度800ug/ml的G418筛选，每隔2-3天传代一次，每次更换含800ug/ml G418的新鲜DMEM培养基；

5.药物筛选12天后，消化细胞，取10^6个细胞，用PE anti-human CD4和APC anti-human CD195(CCR5)Antibody染色，用流式细胞仪分析细胞表面表达的CD4和CCR5分子，结果如图13所示：CCR5的表达效率为82.09％(b)，而CD4的表达效率为77.58％(a)。

完成同源重组后的Hela-T16-R5细胞基因组AAVS1位点的结构如图14所示：在AAVS1基因的靶序列T16上下游同源臂序列之间，插入了9719bp的外源序列(SEQ ID NO:24)，包括抗G418抗生素的抗性基因NeoR/KanR及其启动子PGK promoter，HIV-1进入细胞的受体CD4的编码序列及其启动子EF-1αpromoter，R5嗜性HIV-1进入细胞的辅助受体CCR5及其上游具有弱启动效果的IRES2序列(IRES2是翻译过程中核糖体的进入位点)，还具有由LTR条件性启动的绿色荧光蛋白报告基因GFP。AAVS1基因的靶序列T16上游同源臂序列如SEQ ID NO:25所示，AAVS1基因的靶序列T16下游同源臂序列如SEQ ID NO:26所示，同源重组总序列如SEQ ID NO:27所示。

四、Hela-T16-R5的验证

1.将上述筛选出来的Hela-T16-R5细胞株系用DMEM培养基(添加10％FBS)稀释悬浮并接种到24孔细胞培养板，铺板密度为1.2×10⁵个/孔；

2.培养24h后除去培养基，加入300微升含NL4-3bal(R5嗜性)病毒培养液，其中一组含病毒50微升，另一组含病毒100微升，对照组不含NL4-3bal病毒，37℃孵育；

3.孵育24小时后，去上清，加入500微升新鲜的培养基；

4.继续培养48小时，拍照观察，结果如图15：(a)(c)(e)分别为对照组、50微升病毒组和100微升病毒组在白光下的照片；(b)(d)(f)分别为对照组、50微升病毒组和100微升病毒组在荧光下的照片。由图所示，不加病毒的Hela-T16-R5细胞EGFP荧光蛋白不启动表达，加入病毒后，EGFP蛋白表达，并且随着NL4.3浓度增大，EGFP表达增强。

五、与现有HIV易感工程化细胞系的比较

1.将本发明构建的Hela-T16-R5细胞系，以及现有商品化的HIV易感工程化细胞系TZM-bl，分别用DMEM培养基(添加10％FBS)稀释悬浮并接种到24孔细胞培养板，铺板密度为1.2×10⁵个/孔；

2.培养24h后除去培养基，加入300微升含NL4-3bal(R5嗜性)病毒培养液，每组均含病毒50微升；

3.孵育24小时后，去上清，加入500微升新鲜的培养基；

4.继续培养48小时，每组取150微升上清液于-80℃保存待测，另每组补充150微升新鲜的培养基，继续培养；

5.继续培养72小时，每组取150微升上清液于-80℃保存待测；

6.用荧光酶标仪对保存的样品进行检测，对照标准曲线计算各组样品中P24蛋白的含量，结果如图16所示：在感染病毒的第4天和第7天，本发明构建的Hela-T16-R5细胞系，相比于商品化的HIV易感细胞系TZM-bl，所产生的病毒量(以P24表示)更多；且在Hela-T16-R5细胞系中，HIV病毒从第4天到第7天的扩增效率更高。说明，本发明所提供的外源基因(HIV病毒受体CD4、CCR5)在AAVS1安全港基因定点整合的技术方案，相比于现有技术中的慢病毒随机整合的方案(TZM-bl正由此方案构建所得)，其外源基因能更稳定的高表达，从而介导更多的HIV病毒进入细胞并进行繁殖扩增。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广东赤萌医疗科技有限公司

<120> 一种HIV指示细胞系及其制备方法

<130> 2018

<160> 27

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caccgcccct ggaagatgcc atgac 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaacgtcatg gcatcttcca ggggc 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttccttgacc ctggaaggtg 20

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttctagtgg ttggctacgt agagctctac tggcttctgc 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagcttatcg ataccgtcga cgctggaaga gctagcacag 40

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatgaagtgg ttcgcatcct c 21

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tccactagtt ctagagcggc cgctccgaga gctcagctag tc 42

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actgcaggct ctagattcga agctactggc cttatctcac ag 42

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catggtcctg ctggagttcg tg 22

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gctttcagat ccgctagcgc tctggaaggg ctaatttggt ccca 44

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catggtggcg accggtagat ctctctcctt ctagcctccg 40

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcaagcctca gacagtggtt c 21

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cactagttct agagcggccg ctggaagggc taattcactc ccaaag 46

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctgagctctc ggagcggccc tcactgcaac ctctacctcc tg 42

<210> 15

<211> 1589

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gctttcagat ccgctagcgc caccatgaac cggggagtcc cttttaggca cttgcttctg 60

gtgctgcaac tggcgctcct cccagcagcc actcagggaa agaaagtggt gctgggcaaa 120

aaaggggata cagtggaact gacctgtaca gcttcccaga agaagagcat acaattccac 180

tggaaaaact ccaaccagat aaagattctg ggaaatcagg gctccttctt aactaaaggt 240

ccatccaagc tgaatgatcg cgctgactca agaagaagcc tttgggacca aggaaacttt 300

cccctgatca tcaagaatct taagatagaa gactcagata cttacatctg tgaagtggag 360

gaccagaagg aggaggtgca attgctagtg ttcggattga ctgccaactc tgacacccac 420

ctgcttcagg ggcagagcct gaccctgacc ttggagagcc cccctggtag tagcccctca 480

gtgcaatgta ggagtccaag gggtaaaaac atacaggggg ggaagaccct ctccgtgtct 540

cagctggagc tccaggatag tggcacctgg acatgcactg tcttgcagaa ccagaagaag 600

gtggagttca aaatagacat cgtggtgcta gctttccaga aggcctccag catagtctat 660

aagaaagagg gggaacaggt ggagttctcc ttcccactcg cctttacagt tgaaaagctg 720

acgggcagtg gcgagctgtg gtggcaggcg gagagggctt cctcctccaa gtcttggatc 780

acctttgacc tgaagaacaa ggaagtgtct gtaaaacggg ttacccagga ccctaagctc 840

cagatgggca agaagctccc gctccacctc accctgcccc aggccttgcc tcagtatgct 900

ggctctggaa acctcaccct ggcccttgaa gcgaaaacag gaaagttgca tcaggaagtg 960

aacctggtgg tgatgagagc cactcagctc cagaaaaatt tgacctgtga ggtgtgggga 1020

cccacctccc ctaagctgat gctgagtttg aaactggaga acaaggaggc aaaggtctcg 1080

aagcgggaga aggcggtgtg ggtgctgaac cctgaggcgg ggatgtggca gtgtctgctg 1140

agtgactcgg gacaggtcct gctggaatcc aacatcaagg ttctgcccac atggtccacc 1200

ccggtgcagc caatggccct gattgtgctg gggggcgtcg ccggcctcct gcttttcatt 1260

gggctaggca tcttcttctg tgtcaggtgc cggcaccgaa ggcgccaagc agagcggatg 1320

tctcagatca agagactcct cagtgagaag aagacctgcc agtgtcctca ccggtttcag 1380

aagacatgta gccccatttg aacgcgttct agagtcgggg cggccggccg cttcgagcag 1440

acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 1500

gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 1560

aacaagttag cgctctggaa gggctaatt 1589

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gctttcagat ccgctagcgc ca 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aattagccct tccagagcgc t 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caggtggagt tctccttccc 20

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agacatgtag ccccatttga attctgcagt cgacggtac 39

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cccgactcta gaacgcgtgg ttgtggccat attatcatcg t 41

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atgataatat ggccacaacc atggattatc aagtgtcaag tccaatct 48

<210> 22

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cccgactcta gaacgcgttc acaagcccac agatatttcc tgc 43

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tctactcact ggtgttcatc 20

<210> 24

<211> 9719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (819)..(819)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (845)..(845)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (920)..(921)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (928)..(928)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 24

gtcgacggta tcgataagct agcttgggct gcaggtcgag ggacctaata acttcgtata 60

gcatacatta tacgaagtta tattaagggt tccggatcag cttgatgggg atccagacat 120

gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt 180

tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca 240

agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt 300

tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtatggct gattatgatc ctctagagtc 360

gcagatccag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag 420

tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata 480

agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg 540

gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat ggctgattat 600

gatcctctag agtcgcagat ccagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca 660

caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat 720

ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt 780

ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcna gtaaaacctc tacaaaatgt 840

ggtanggctg attatgatcc tctagagtcg cagatcctct agagtcgcag atctgcaagc 900

tttctgatgg aattagaacn nggcaaanca atactgagaa tgaagtgtat gtggaacaga 960

ggctgctgat ctcgttcttc aggctatgaa actgacacat ttggaaacca cagtacttag 1020

aaccacaaag tgggaatcaa gagaaaaaca atgatcccac gagagatcta tagatctata 1080

gatcatgagt gggaggaatg agctggccct taatttggtt ttgcttgttt aaattatgat 1140

atccaactat gaaacattat cataaagcaa tagtaaagag ccttcagtaa agagcaggca 1200

tttatctaat cccaccccac ccccaccccc gtagctccaa tccttccatt caaaatgtag 1260

gtactctgtt ctcacccttc ttaacaaagt atgacaggaa aaacttccat tttagtggac 1320

atctttattg tttaatagat catcaatttc tgcagactta cagcggatcc cctcagaaga 1380

actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 1440

gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 1500

acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 1560

agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 1620

catcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 1680

gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 1740

gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 1800

gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 1860

ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 1920

cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 1980

cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 2040

cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 2100

catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 2160

caatggccga tcccatattg gctgcaggtc gaaaggcccg gagatgagga agaggagaac 2220

agcgcggcag acgtgcgctt ttgaagcgtg cagaatgccg ggcctccgga ggaccttcgg 2280

gcgcccgccc cgcccctgag cccgcccctg agcccgcccc cggacccacc ccttcccagc 2340

ctctgagccc agaaagcgaa ggagcaaagc tgctattggc cgctgcccca aaggcctacc 2400

cgcttccatt gctcagcggt gctgtccatc tgcacgagac tagtgagacg tgctacttcc 2460

atttgtcacg tcctgcacga cgcgagctgc ggggcggggg ggaacttcct gactagggga 2520

ggagtagaag gtggcgcgaa ggggccacca aagaacggag ccggttggcg cctaccggtg 2580

gatgtggaat gtgtgcgagg ccagaggcca cttgtgtagc gccaagtgcc cagcggggct 2640

gctaaagcgc atgctccaga ctgccttggg aaaagcgcct cccctacccg gtagaattcg 2700

cccttattcc acagggtacc gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac 2760

agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg 2820

cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg 2880

agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc 2940

cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg 3000

cccttgcgtg ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct 3060

tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg 3120

tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct 3180

tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc 3240

tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg 3300

tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc 3360

ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg 3420

ccggcctgct ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag 3480

gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc 3540

agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca 3600

aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc 3660

gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg 3720

ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc 3780

agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt 3840

cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa 3900

gctttcagat ccgctagcgc caccatgaac cggggagtcc cttttaggca cttgcttctg 3960

gtgctgcaac tggcgctcct cccagcagcc actcagggaa agaaagtggt gctgggcaaa 4020

aaaggggata cagtggaact gacctgtaca gcttcccaga agaagagcat acaattccac 4080

tggaaaaact ccaaccagat aaagattctg ggaaatcagg gctccttctt aactaaaggt 4140

ccatccaagc tgaatgatcg cgctgactca agaagaagcc tttgggacca aggaaacttt 4200

cccctgatca tcaagaatct taagatagaa gactcagata cttacatctg tgaagtggag 4260

gaccagaagg aggaggtgca attgctagtg ttcggattga ctgccaactc tgacacccac 4320

ctgcttcagg ggcagagcct gaccctgacc ttggagagcc cccctggtag tagcccctca 4380

gtgcaatgta ggagtccaag gggtaaaaac atacaggggg ggaagaccct ctccgtgtct 4440

cagctggagc tccaggatag tggcacctgg acatgcactg tcttgcagaa ccagaagaag 4500

gtggagttca aaatagacat cgtggtgcta gctttccaga aggcctccag catagtctat 4560

aagaaagagg gggaacaggt ggagttctcc ttcccactcg cctttacagt tgaaaagctg 4620

acgggcagtg gcgagctgtg gtggcaggcg gagagggctt cctcctccaa gtcttggatc 4680

acctttgacc tgaagaacaa ggaagtgtct gtaaaacggg ttacccagga ccctaagctc 4740

cagatgggca agaagctccc gctccacctc accctgcccc aggccttgcc tcagtatgct 4800

ggctctggaa acctcaccct ggcccttgaa gcgaaaacag gaaagttgca tcaggaagtg 4860

aacctggtgg tgatgagagc cactcagctc cagaaaaatt tgacctgtga ggtgtgggga 4920

cccacctccc ctaagctgat gctgagtttg aaactggaga acaaggaggc aaaggtctcg 4980

aagcgggaga aggcggtgtg ggtgctgaac cctgaggcgg ggatgtggca gtgtctgctg 5040

agtgactcgg gacaggtcct gctggaatcc aacatcaagg ttctgcccac atggtccacc 5100

ccggtgcagc caatggccct gattgtgctg gggggcgtcg ccggcctcct gcttttcatt 5160

gggctaggca tcttcttctg tgtcaggtgc cggcaccgaa ggcgccaagc agagcggatg 5220

tctcagatca agagactcct cagtgagaag aagacctgcc agtgtcctca ccggtttcag 5280

aagacatgta gccccatttg aattctgcag tcgacggtac cgcgggcccg ggatccgccc 5340

ctctccctcc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc 5400

gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa 5460

acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat 5520

gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac 5580

aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg 5640

cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt 5700

tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg 5760

gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac 5820

atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga 5880

cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac aaccatggat tatcaagtgt 5940

caagtccaat ctatgacatc aattattata catcggagcc ctgccaaaaa atcaatgtga 6000

agcaaatcgc agcccgcctc ctgcctccgc tctactcact ggtgttcatc tttggttttg 6060

tgggcaacat gctggtcatc ctcatcctga taaactgcaa aaggctgaag agcatgactg 6120

acatctacct gctcaacctg gccatctctg acctgttttt ccttcttact gtccccttct 6180

gggctcacta tgctgccgcc cagtgggact ttggaaatac aatgtgtcaa ctcttgacag 6240

ggctctattt tataggcttc ttctctggaa tcttcttcat catcctcctg acaatcgata 6300

ggtacctggc tgtcgtccat gctgtgtttg ctttaaaagc caggacggtc acctttgggg 6360

tggtgacaag tgtgatcact tgggtggtgg ctgtgtttgc gtctctccca ggaatcatct 6420

ttaccagatc tcaaaaagaa ggtcttcatt acacctgcag ctctcatttt ccatacagtc 6480

agtatcaatt ctggaagaat ttccagacat taaagatagt catcttgggg ctggtcctgc 6540

cgctgcttgt catggtcatc tgctactcgg gaatcctaaa aactctgctt cggtgtcgaa 6600

atgagaagaa gaggcacagg gctgtgaggc ttatcttcac catcatgatt gtttattttc 6660

tcttctgggc tccctacaac attgtccttc tcctgaacac cttccaggaa ttctttggcc 6720

tgaataattg cagtagctct aacaggttgg accaagctat gcaggtgaca gagactcttg 6780

ggatgacgca ctgctgcatc aaccccatca tctatgcctt tgtcggggag aagttcagaa 6840

actacctctt agtcttcttc caaaagcaca ttgccaaacg cttctgcaaa tgctgttcta 6900

ttttccagca agaggctccc gagcgagcaa gctcagttta cacccgatcc actggggagc 6960

aggaaatatc tgtgggcttg tgaacgcgtt ctagagtcgg ggcggccggc cgcttcgagc 7020

agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa 7080

atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 7140

taaacaagtt agcgctctgg aagggctaat ttggtcccaa aaaagacaag agatccttga 7200

tctgtggatc taccacacac aaggctactt ccctgattgg cagaactaca caccagggcc 7260

agggatcaga tatccactga cctttggatg gtgcttcaag ttagtaccag ttgaaccaga 7320

gcaagtagaa gaggccaatg aaggagagaa caacagcttg ttacacccta tgagccagca 7380

tgggatggag gacccggagg gagaagtatt agtgtggaag tttgacagcc tcctagcatt 7440

tcgtcacatg gcccgagagc tgcatccgga gtactacaaa gactgctgac atcgagcttt 7500

ctacaaggga ctttccgctg gggactttcc agggaggtgt ggcctgggcg ggactgggga 7560

gtggcgagcc ctcagatgct acatataagc agctgctttt tgcctgtact gggtctctct 7620

ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc 7680

ctcaataaag cttgccttga gtgctcaaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg 7740

gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtggcgccc 7800

gaacagggac ttgaaagcga aagtaaagcc agaggagatc tctcgacgca ggactcggct 7860

tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 7920

gactagcgga ggctagaagg agagagatct accggtcgcc accatggtga gcaagggcga 7980

ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 8040

caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa 8100

gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 8160

ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 8220

gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 8280

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<212> DNA

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ctgcctccag ggatcctgtg tccccgagct gggaccacct tatattccca gggccggtta 10500

atgtggctct ggttctgggt acttttatct gtcccctcca ccccacagtg gggccactag 10560

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Claims (10)

1.一种基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括敲除细胞的安全港基因的CRISPR系统和同源重组工具，所述同源重组工具含有细胞的安全港基因上游同源臂序列、细胞的安全港基因下游同源臂序列、CD4的编码序列、CD4基因的启动子序列、CCR5的编码序列、CCR5基因的启动子序列以及报告基因序列，所述CD4的编码序列、CD4基因的启动子序列、CCR5的编码序列、CCR5基因的启动子序列以及报告基因序列均位于细胞的安全港基因上游同源臂序列和细胞的安全港基因下游同源臂序列之间，所述基因编辑系统能够将CD4基因、CCR5基因和报告基因定点整合到所述细胞的安全港基因，使得所述细胞表达CD4和CCR5，以及在HIV感染该细胞后表达报告基因。

2.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述细胞的安全港基因为AAVS1基因。

3.根据权利要求2所述的基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR系统包括Cas9核酸酶和针对AAVS1基因的gRNA。

4.根据权利要求3所述的基因编辑系统，其特征在于，所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求2所述的基因编辑系统，其特征在于，所述细胞的安全港基因上游同源臂序列如SEQ ID NO:25所示，所述细胞的安全港基因下游同源臂序列如SEQ ID NO:26所示。

6.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述同源重组工具含有SEQ IDNO:27所示的序列。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体表达如权利要求1-7任一所述的基因编辑系统。

8.一种HIV指示细胞或者HIV指示细胞系的制备方法，其特征在于，所述制备方法是采用如权利要求1-7任一所述的基因编辑系统对细胞或细胞系进行编辑后，或者采用如权利要求8所述的表达载体转入细胞或者细胞系后得到所述HIV指示细胞或者HIV指示细胞系。

9.采用如权利要求8所述的方法制备的HIV指示细胞或者HIV指示细胞系。

10.如权利要求1-6任一所述的基因编辑系统、或者如权利要求7所述的表达载体在制备HIV指示细胞或者HIV指示细胞系中的用途。