CN101353667B

CN101353667B - Hiv毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒

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Publication number: CN101353667B
Application number: CN2008101184365A
Authority: CN
Inventors: 童贻刚; 李敬云; 张昕; 安小平; 周育森
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2008-08-15
Filing date: 2008-08-15
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2028-08-15
Also published as: CN101353667A

Abstract

本发明公开了一种HIV毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒。本发明构建了表达HIV Gag蛋白的质粒、表达报告基因的重组慢病毒质粒和表达HIV Rev蛋白的辅助质粒。所述三种质粒和从毒株中扩增的HIV逆转录酶和蛋白酶基因片段在辅助质粒pVSV-G的作用下可得到含有毒株的HIV逆转录酶和蛋白酶基因的假型慢病毒。将该假型慢病毒感染哺乳动物细胞，即可得到基于报告基因的毒株耐药表型分析细胞模型。本发明的细胞模型可对毒株进行快速、安全的耐药表型分析，报告基因使该细胞模型具备极高的敏感性，该HIV毒株耐药分析细胞模型适合于中国人群HIV毒株的表型耐药分析。

Description

HIV毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒

技术领域

本发明涉及HIV毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒。

背景技术

人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)，又称艾滋病毒，由HIV感染而引起的疾病称为艾滋病，全称为获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiency syndrome，AIDS)，该病患者的免疫功能部份或完全丧失，CD4+细胞数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。该病传播速度快、病死率高，且目前无法治愈，引起了各国政府和社会的关注。HIV的流行呈世界性分布，非洲为HIV的发源地和重灾区，欧洲和美洲也为主要流行区，近年HIV在亚洲的流行呈高速增长的趋势。我国自1985年首次发现HIV感染者，至今已有60～80万人发生了感染，专家估计，如果不迅速采取有效的预防措施，按目前的年平均30％的增长速度，到2010年，我国的HIV感染者将超过1000万。在非洲的有些国家，HIV的感染率达总人口30％以上。因此，预防和治疗艾滋病，已不仅仅是挽救个人生命的问题，而是关系到民族存亡的大事。

HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(lentivirus)，目前已发现两种HIV，分别为HIV-1和HIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-2主要分布于非洲西部，在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到，毒力和传播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程较慢且较缓和。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1为主进行的。

艾滋病病毒(HIV)颗粒呈球形，直径90nm～130nm。病毒的核心呈中空锥形，由两条相同的单链RNA链、逆转录酶和蛋白质组成。核心之外为病毒衣壳，呈20面体立体对称，含有核衣壳蛋白质。最外层为包膜，包膜上的糖蛋白有刺突状结构，是HIV与宿主细胞受体结合位点和主要的中和位点。HIV RNA中含有gag、env和pol基因以及6种调控基因〔tat，vif，vpr，vpx(vpu)，nef，rev〕。gag基因编码病毒的核心蛋白；pol基因编码病毒复制所需要的酶类(逆转录酶、整合酶和蛋白酶)；env基因所编码的病毒包膜蛋白，是HIV免疫学诊断的主要检测抗原。

HIV主要侵犯人体的CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞，其感染过程包括病毒的吸附、侵入、逆转录、基因组的整合、表达及释放等过程。当感染发生时，病毒的外膜糖蛋白gp120首先与细胞表面的CD4分子结合并与辅助受体CCR5或CXCR4等结合，gp120空间构象发生改变，暴露出跨膜蛋白gp41与细胞膜作用，导致病毒包膜与细胞膜融合，病毒核心进入细胞内，脱壳后病毒基因组在RT作用下以病毒RNA为模板合成cDNA，再以此cDNA为模板合成双链DNA，在病毒整合酶IN的作用下随机整合到细胞染色体上成为前病毒而长期存在并随细胞的分裂而传至子代细胞。该前病毒即为病毒复制时的转录模板，病毒进行复制时，早期转录的长链mRNA经剪接后表达病毒的调节蛋白，待调节蛋白的量到达一定阈值后，病毒进入晚期转录，产生的未拼接的mRNA部分用来指导合成病毒的结构蛋白，部分作为病毒的基因组，与结构蛋白进行装配成为病毒核心颗粒，由胞膜出芽时获得包膜及膜蛋白。

抗HIV药物的大量应用导致了耐药性问题出现，因此建立快速、高效、低成本的HIV毒株耐药分析技术为当前急需解决的关键问题。目前进行HIV毒株耐药分析的方法主要有两种：一种是测定毒株的核苷酸序列，与HIV耐药突变数据库进行比对，从而预测毒株是否产生耐药性，这种方法即基因型耐药分析方法，具有一定的指导意义，但是不够准确；另外一种是表型耐药分析方法，即通过耐药实验检测毒株对某种药物的抗性，该方法结果准确，但是操作复杂，周期长，往往需要分离病毒，并且HIV的分离培养并不是件容易的事情，成功率不太高。

发明内容

本发明的目的是提供HIV毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒。

本发明提供了一种表达HIV的Gag基因(gag)的重组表达质粒。

所述表达HIV的Gag基因(gag)的重组表达质粒可为表达HIV的Gag基因同时缺失其蛋白酶-逆转录酶的重组表达质粒，具体可为图1所示的pGag。

本发明还提供了一种混合质粒，包括表达HIV的Gag基因的重组表达质粒和表达报告基因的重组慢病毒质粒。

所有常规报告基因均可使用，如荧光素酶基因(包括萤火虫荧光素酶和海洋腔肠荧光素酶)，荧光蛋白基因(包括绿色荧光蛋白及其各种衍生物，红色荧光蛋白等)，氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)，β-半乳糖苷酶基因(β-Gal)或葡萄醛酸糖苷酶基因(GUS)。

所述混合质粒还可包括表达HIV的Rev基因(rev)的重组表达质粒和表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白(VSV外膜糖蛋白)基因的重组表达质粒。

所述表达HIV的Gag基因(gag)的重组表达质粒可为表达HIV的Gag基因同时缺失其蛋白酶-逆转录酶的重组表达质粒，具体可为图1所示的pGag；所述表达报告基因的重组慢病毒质粒具体可为图2所示的pLenti-Luc；所述表达HIV的Rev基因的重组表达质粒具体可为图3所示的pRev；所述可表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因的重组表达质粒具体可为pVSV-G。

本发明还提供了一种假型慢病毒，是通过如下方法得到的：将所述混合质粒和如下DNA片段共转染哺乳动物细胞，得到假型慢病毒；所述DNA片段是含有HIV逆转录酶基因和HIV蛋白酶基因的DNA片段；所述哺乳动物细胞为HEK 293细胞、293T细胞、293FT细胞或Hela细胞。

所述含有HIV逆转录酶基因和HIV蛋白酶基因的DNA片段可以以待进行耐药表型分析的毒株为模板用如下引物进行扩增得到：

外引物：

PRRT-OUT5B：5’-AGCAATGAGCCAAG(T/C)AACAA-3’；

PRRT-OUT3B：5’-TTTGTGTGCTGG(T/C)ACCCAT-3’。

内引物：

PRRT-IN5B：5’-GTACTGAGAGACAGGTAAT-3’；

PRRT-IN3B：5’-TGTTGT(G/C)TCAGTTAGGGTGA-3’。

以上引物是根据中国株HIV序列设计的。

含有所述假型慢病毒的细胞也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种HIV毒株耐药分析细胞模型，是用所述假型慢病毒感染的哺乳动物细胞；所述哺乳动物细胞优选HEK 293细胞、293T细胞、293FT细胞或Hela细胞。

所述假型慢病毒、所述细胞模型均可应用于HIV毒株耐药表型分析。

当采用上述根据中国株HIV序列设计的引物扩增所述含有HIV逆转录酶基因和HIV蛋白酶基因的DNA片段时，HIV毒株耐药表型分析细胞模型适合于中国人群HIV毒株的表型耐药分析。

本发明构建了表达HIV Gag蛋白的辅助质粒、表达报告基因的重组慢病毒质粒和表达HIV的Rev基因的重组表达质粒。将上述3种质粒、pVSV-G质粒和从病人体内扩增的含有HIV逆转录酶和HIV蛋白酶基因片段共转染哺乳动物细胞，基因片段在共转染细胞内与缺失的HIV PR-RT基因发生同源重组，在HIV其他辅助蛋白的作用下拯救出含病人体内HIV逆转录酶和蛋白酶基因的假型慢病毒，用该重组假型慢病毒上清液感染新鲜的细胞，同时在假型慢病毒复制和再感染的过程中加入逆转录酶和蛋白酶抑制剂AZT，发现耐药毒株实验组再感染细胞中荧光素酶活性远高于敏感毒株对照组。

应用本发明的细胞模型可以对毒株进行快速、安全的表型耐药分析。本发明的细胞模型使用单次感染的报告病毒，具有良好的安全性，而报告基因使该模型具备极高的敏感性。该耐药表型分析系统克服了HIV毒株常规基因型耐药分析的不足，耐药性结果更加可靠。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为HIV Gag基因表达质粒pGag示意图

图2为重组慢病毒质粒pLenti-luc示意图

图3为HIV Rev基因表达质粒pRev示意图

图4为质粒pLenti-Luc的构建流程图

图5为中间质粒pEGFP-N1-lac示意图

图6为中间质粒pUC19-Luc示意图

图7为中间质粒pEGFP-N1-lac-luc示意图

图8为中间质粒pLenti-Link示意图

图9为质粒pLenti-Luc的酶切鉴定图。

图10为中间质粒pGag-Pol示意图

图11为质粒pGag的构建示意图

图12为质粒pGag的酶切鉴定图

图13为血清HIV PR-RT基因片段的扩增结果。

图14为AZT药物对耐药株和敏感株的抑制作用比较。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

AZT(Zidovudine，齐多呋啶)是1987年美国食品与药品管理局(FDA)批准的第一个治疗艾滋病的药物，是一种抗逆转录药物，以下以AZT为例，进一步阐述本发明的技术方案。

各种DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I(Klenow大片段)、克隆载体质粒pUC18/pUC19及碱性磷酸酶CIAP均购自Takara公司，含EGFP的真核表达载体pEGFP-N1购自Clontech公司，表达VSV糖蛋白的质粒pVSV-G来源于addgene质粒保存机构(原名pCMV-VSV-G)，真核表达质粒pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)、质粒pG5Luc、质粒pEGFP-N1、293FT细胞和细胞转染试剂Lipofectamine^TM2000购自Invitrogen公司，细胞培养基DMEM购自GIBCO公司，优等胎牛血清购自德国BIO-CHROM公司，质粒提取试剂盒分别购自北京博大公司和Qiagen公司，玻璃奶DNA纯化试剂盒购自北京博大公司，Luciferase Assay System购于Promega公司。含HIV-1NL4-3株的重组质粒pHIV-NL4-3来源于美国国立卫生研究院艾滋病试剂参比品保存机构(AIDS Research and Reference Reagent Program，NIAID，NIH)。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、HIV毒株的耐药表型分析

一、质粒pLenti-Luc的构建

参见图4构建含荧光素酶基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc。

1、中间质粒pEGFP-N1-lac的构建

BamHI和PvuII双酶切质粒pUC19，回收209bp片段；PvuII和EcoRI双酶切质粒pUC19，回收92bp片段；将上述两种片段混合，与经BamHI和EcoRI双酶切并脱磷的载体pEGFP-N1连接，转化大肠杆菌DH5a，经IPTG诱导后挑取绿色菌落，进行酶切鉴定，得到能够同时在大肠杆菌和真核细胞中表达EGFP蛋白的重组质粒pEGFP-N1-lac(见图5)。

2、中间质粒pUC19-Luc的构建

XbaI和NcoI双酶切含荧光素酶基因的质粒pG5Luc，切胶回收1656bp的Luc基因片段，Klenow处理后，与经SmaI酶切的载体pUC19相连。连接产物转化DH5α后，挑选重组克隆进行酶切鉴定，得到中间质粒pUC19-Luc(见图6)。

3、中间质粒pEGFP-N1-lac-luc的构建

BamHI和EcoRI双酶切质粒pUC19-Luc，回收含有Luc基因的长约1700bp的片段，连接到经EcoRI和BglII双酶切的含CMV启动子的质粒pEGFP-N1-lac上。连接产物转化DH5α后，挑选重组克隆进行酶切鉴定，获得了质粒pEGFP-N1-lac-luc(见图7)。

4、中间质粒pLenti-Link的构建

人工合成两条寡核苷酸序列如下：

5’-tatgaagcttggatccgaattcgggcccgtcgacggtac-3’(序列1)；

5’-cgtcgacgggcccgaattcggatccaagcttca-3’(序列2)。

上述两条寡核苷酸经变性后退火，形成末端分别为NdeI和KpnI的linker。用NdeI和KpnI双酶切慢病毒载体pLenti6/V5gwLacZ(购自Invitrogen公司)，与上述linker连接，转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，得到含多克隆位点的中间质粒pLenti-Link(见图8)。

5、质粒pLenti-Luc的构建

NdeI和EcoRI双酶切质粒pEGFP-N1-lac-luc，回收含有CMV早期启动子和Luc基因的长为2056bp的DNA片段，连接到含部分CMV启动子的经NdeI和EcoRI双酶切的质粒pLenti-Link上，转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，进行KpnI及ScaI酶切鉴定，结果见图9。图9中，1：KpnI酶切；2：SacI酶切；M：DNA分子量标准。琼脂糖凝胶电泳结果与预期完全相符。对阳性克隆进行序列分析，证实所筛选到克隆的插入序列是完全正确的。获得含完整CMV启动子的、能表达Luc基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc(图2)。

二、表达HIV Rev基因的辅助质粒pRev的构建

人工合成下列两条引物：

Rev-rEco：5’-CGGAATTCGGAGTGTATTAAGCTTGTGT-3’(序列3)；

Rev-fBam：5’-AGGGATCCAAAGAGCAGTGGGAATAGGA-3’(序列4)。

以质粒pHIV-NL4-3为模板，扩增HIV Rev基因。扩增产物经BamHI和EcoRI双酶切后插入经相同酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-)中，得到表达HIV Rev基因的辅助质粒pRev(图3)。

三、质粒pGag的构建

1、表达HIV Gag和Pol基因的中间质粒pGag-Pol的构建

人工合成下列两条引物：

RRE-fNde：5’-CATATGAGGGACAATTGGAGA-3’(序列5)；

RRE-r：5’-GGAGTGTATTAAGCTTGTGTAATTG-3’(序列6)。

以质粒pHIV-NL4-3为模板，扩增HIV的RRE序列(该序列为顺势作用元件，能将与之相连的RNA转录物高效转移至胞浆以利于表达)。扩增产物经NdeI和HindIII双酶切后回收，同时用BglII和NdeI双酶切pHIV-NL4-3，回收含Gag Pol基因的DNA片段，将上述两个片段与经BamHI和HindIII双酶切的整合表达载体pcDNA3.1(-)共同连接，得到表达HIV Gag和Pol基因的辅助质粒pGag-Pol(见图10)。

2、pGag质粒的构建

构建示意图见图11。

在HIV Pol基因的两侧设计两条引物：

HIV-PRRT-DEL-F：5’-GAGTATGTAGATGGGGCAGCCA-3’(序列7)；

HIV-PRRT-DEL-R：5’-GAGAAGCTAAAGGATACAGTTCCTTGT-3’(序列8)。

以pGag-Pol为模板，用引物HIV-PRRT-DEL-F和引物HIV-PRRT-DEL-R进行PCR扩增，扩增产物经5’磷酸化后进行自连，转化E.coliDH5α，使用引物设计的单一酶切位点XhoI(CTCGAG)筛选重组子。阳性克隆的酶切鉴定见图12，图12中，1：XhoI酶切；2：全长质粒PCR产物；3：HindIII酶切；M：DNA分子量标准。由图可见，得到了长约8kb的扩增产物。进一步进行DNA序列分析表明，得到了缺失HIV蛋白酶(Protease)和逆转录酶(RT)的HIV gag蛋白表达质粒pGag(见图1)。

四、HIVPR-RT基因的扩增

从NCBI网站下载HIV全部全长中国株核苷酸序列，用VectorNTI8.0软件进行同源性序列比较分析，结合引物设计软件PrimerPremier5.0，设计四条通用引物如下：

外引物：

PRRT-OUT5B：5’-AGCAATGAGCCAAG(T/C)AACAA-3’；

PRRT-OUT3B：5’-TTTGTGTGCTGG(T/C)ACCCAT-3’。

内引物：

PRRT-IN5B：5’-GTACTGAGAGACAGGTAAT-3’；

PRRT-IN3B：5’-TGTTGT(G/C)TCAGTTAGGGTGA-3’。

利用全军艾滋病检测中心提供的HIV感染者血清，分离培养病毒，在分离病毒的细胞培养基中加入AZT，用RT-PCR分析用药后病毒滴度，并用ELISA检测培养物上清HIV P24的表达水平，利用此方法筛选出针对HIV逆转录酶抑制药物的耐药株和敏感株。

分别以HIV逆转录酶抑制剂耐药株病毒血清和HIV逆转录酶抑制剂敏感株病毒血清为模板，用Takara One Step RNA PCR KIT进行一步法RT-PCR扩增(先用外引物扩增，然后使用巢式引物进行第二轮PCR扩增)，获得血清HIV-1PR-RT基因。血清HIV PR-RT基因片段的扩增结果见图13。图13中，1：血清HIV PR-RT基因片段的扩增产物；M：DNA分子量标准。

五、HIV毒株的耐药表型分析

将下述四种质粒和步骤四得到的PCR产物共转染HEK293FT细胞：HIV Gag表达质粒pGag、荧光素酶重组慢病毒表达质粒pLenti-Luc、HIV Rev表达质粒pRev、疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因表达质粒pVSV-G。其中，辅助质粒表达的HIV组分协助重组慢病毒基因组复制、包装并且分泌出具有单次感染能力的假型慢病毒。HIV PR-RT基因PCR产物在转染至细胞内后，能借助其两侧的同源序列与质粒pGag在发生同源重组，从而拯救出pGag上通过定点突变缺失的HIV蛋白酶和逆转录酶，这两种酶为目前市场上绝大部分抗艾滋病药物的作用靶点。被拯救的HIV蛋白酶和逆转录酶连同辅助质粒表达的其他HIV组分协助重组慢病毒基因组复制、包装并且分泌出具有单次感染能力的假型慢病毒。将含有假型慢病毒的细胞培养上清加入到新鲜培养的细胞中，则可导致新鲜培养的细胞被感染并且表达假型慢病毒所携带的外源报告基因。在假型慢病毒分泌和再感染新鲜293FT细胞的过程中加入药物，可以通过观察药物对待测毒株荧光素酶表达的影响，判断待测毒株是针对该药物的耐药毒株还是敏感毒株。

1、HEK293FT细胞的培养

HEK293FT细胞用含10％胎牛血清和双抗(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)的DMEM培养基(GIBCO)进行培养。

2、假型慢病毒的获得

HEK293FT细胞于转染前一天铺于24孔板，密度约5x10⁵个细胞/孔。采用脂质体Lipofectamine^TM2000转染方法，操作参照Invitrogen公司的转染试剂使用说明。

进行完上述操作后的培养板，24个孔分为4组(甲组、乙组、丙组、丁组)，每6个孔一组，进行如下不同试验处理。

甲组和乙组(耐药株)：取pLenti-Luc、pGag、pRev和pVSV-G连同步骤四获得的耐药株HIV蛋白酶和逆转录酶(PR-RT)PCR产物各0.2μg，混合加入到50μl无血清和抗生素的DMEM培养液中；取Lipofectamine^TM20001μl加入到50μl无血清和抗生素的DMEM培养液中；室温孵育5min后将二者混合，再于室温放置20min；静置期间，用1ml无血清和抗生素的DMEM培养液洗涤细胞，总共洗涤3次；然后加入0.5ml的含血清但不含双抗的DMEM培养液；最后将上述Lipofectamine^TM2000和DNA的混合物滴加到培养板，每孔滴加100μl；放入含5％CO₂的孵箱中于37℃培养。

丙组和丁组(敏感株)：取pLenti-Luc、pGag、pRev和pVSV-G连同步骤四获得的野生株(NL4-3)HIV蛋白酶和逆转录酶(PR-RT)PCR产物各0.2μg，加入到50μl无血清和抗生素的DMEM培养液中；取Lipofectamine^TM20001μl加入到50μl无血清和抗生素的DMEM培养液中；室温孵育5min后将二者混合，再于室温放置20min；静置期间，用1ml无血清和抗生素的DMEM培养液洗涤细胞，总共洗涤3次；然后加入0.5ml的含血清但不含双抗的DMEM培养液；最后将上述Lipofectamine^TM2000和DNA的混合物滴加到培养板，每孔滴加100μl；放入含5％CO₂的孵箱中于37℃培养。

次日，甲组(AZT耐药株)和丙组(AZT敏感株)每孔加入终浓度为1μmol/L的抗HIV药物AZT，作为对照的乙组(AZT耐药株)和丁组(AZT敏感株)每孔加入10μl无菌去离子水，继续培养两天，两天后取含有重组假型慢病毒的细胞培养液的上清进行步骤3的操作。

3、HIV毒株的耐药分析

将新鲜的HEK293FT细胞铺于一个新的24孔板，密度约5x10⁵个细胞/孔。24个孔分为4组(甲组、乙组、丙组、丁组)，每6个孔一组。将步骤2得到的甲、乙、丙、丁组细胞培养液上清，对应的加入新24孔板的甲、乙、丙、丁组孔中，每孔500μl。次日，对不同组别进行如下处理：

甲组：每孔加入500μl含1μmol/L AZT药物的新鲜培养基。

乙组：每孔加入500μl不含药物的新鲜培养基。

丙组：每孔加入500μl含1μmol/L AZT药物的新鲜培养基。

丁组：每孔加入500μl不含药物的新鲜培养基。

继续培养两天后，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性，具体操作如下：

收集细胞，用PBS漂洗，吸出PBS后加入100μl1X裂解缓冲液(CCLR)裂解细胞，最后将细胞及所有液体移至新离心管，离心后取上清10ul加入50μl荧光素酶检测底物，充分混合后，立即用照度计(Tuner Biosystem，luninometer)检测荧光素酶活性。

甲组荧光素酶的活性为323291±10208，乙组荧光素酶的活性为340240±12278，丙组荧光素酶的活性为128037±12432，丁组荧光素酶的活性为385430±13088。

分别把耐药株不加AZT药物与加药两组、敏感株不加AZT药物与加药两组通过照度计检测到的数值进行比较，见图14。结果表明，耐药毒株在不加药和加药的情况下荧光素酶活性没有明显的变化，其比值接近1；而药物敏感株在不加药和加药的情况下荧光素酶活性差异十分显著，其比值接近3。表明AZT会抑制假型慢病毒的整合与复制，最终会导致HIV敏感株第二代感染的细胞中报告基因luc表达的荧光素酶活性减弱，而对HIV耐药株的荧光素酶表达不会发生影响。

上述结果说明，本发明提供的HIV毒株耐药表型分析细胞模型可以安全、灵敏的在体外对HIV毒株进行对于逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的耐药表型分析。

Claims

1.表达HIV的Gag基因的重组表达质粒pGag，其构建方法如下：

以质粒pHIV-NL4-3为模板，以RRE-fNde：5’-CATATGAGGGACAATTGGAGA-3’和RRE-r：5’-GGAGTGTATTAAGCTTGTGTAATTG-3’为引物，扩增HIV的RRE序列；扩增产物经NdeI和HindIII双酶切后回收；用BglII和NdeI双酶切pHIV-NL4-3，回收含Gag-Pol基因的DNA片段；将上述两个片段与经BamHI和HindIII双酶切的整合表达载体pcDNA3.1(-)共同连接，得到表达HIV Gag和Pol基因的辅助质粒pGag-Pol；

以pGag-Pol为模板，以HIV-PRRT-DEL-F：5’-GAGTATGTAGATGGGGCAGCCA-3’和HIV-PRRT-DEL-R：5’-GAGAAGCTAAAGGATACAGTTCCTTGT-3’为引物，进行PCR扩增；扩增产物经5’磷酸化后进行自连，再使用酶切位点XhoI筛选得到重组表达质粒pGag。

2.一种混合质粒，包括表达HIV的Gag基因的重组表达质粒、表达报告基因的重组慢病毒质粒、表达HIV的Rev基因的重组表达质粒和表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因的重组表达质粒；

所述表达HIV的Gag基因的重组表达质粒pGag，其构建方法如下：

以pGag-Pol为模板，以HIV-PRRT-DEL-F：5’-GAGTATGTAGATGGGGCAGCCA-3’和HIV-PRRT-DEL-R：5’-GAGAAGCTAAAGGATACAGTTCCTTGT-3’为引物，进行PCR扩增；扩增产物经5’磷酸化后进行自连，再使用酶切位点XhoI筛选得到重组表达质粒pGag；

所述表达报告基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc，其构建方法如下：

用BamHI和PvuII双酶切质粒pUC19，回收209bp片段；用PvuII和EcoRI双酶切质粒pUC19，回收92bp片段；将上述两种片段混合，与经BamHI和EcoRI双酶切并脱磷的载体pEGFP-N1连接，得到重组质粒pEGFP-N1-lac；

用XbaI和NcoI双酶切含荧光素酶基因的质粒pG5Luc，切胶回收1656bp的Luc基因片段，Klenow处理后，与经SmaI酶切的载体pUC19相连，得到中间质粒pUC19-Luc；

用BamHI和EcoRI双酶切质粒pUC19-Luc，回收含有Luc基因的长1700bp的片段，连接到经EcoRI和BglII双酶切的含CMV启动子的质粒pEGFP-N1-lac上，得到质粒pEGFP-N1-lac-luc；

合成如下两条寡核苷酸序列：

5’-tatgaagcttggatccgaattcgggcccgtcgacggtac-3’和

5’-cgtcgacgggcccgaattcggatccaagcttca-3’；

上述两条寡核苷酸经变性后退火，形成末端分别为NdeI和KpnI的linker；用NdeI和KpnI双酶切慢病毒载体pLenti6/V5gwLacZ，与上述linker连接，得到质粒pLenti-Link；

用NdeI和EcoRI双酶切质粒pEGFP-N1-lac-luc，回收含有CMV早期启动子和Luc基因的长为2056bp的DNA片段，连接到经NdeI和EcoRI双酶切的质粒pLenti-Link上，得到重组慢病毒质粒pLenti-Luc；

所述表达HIV的Rev基因的重组表达质粒pRev，其构建方法如下：

以质粒pHIV-NL4-3为模板，以Rev-rEco：

5’-CGGAATTCGGAGTGTATTAAGCTTGTGT-3’和Rev-fBam：

5’-AGGGATCCAAAGAGCAGTGGGAATAGGA-3’为引物，扩增HIV Rev基因；扩增产物经BamHI和EcoRI双酶切后插入到经相同酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-)中，得到重组表达质粒pRev；

所述表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因的重组表达质粒为pVSV-G。

3.一种假型慢病毒，是通过如下方法得到的：将权利要求2所述混合质粒和如下DNA片段共转染哺乳动物细胞，得到假型慢病毒；所述DNA片段是含有HIV逆转录酶基因和HIV蛋白酶基因的DNA片段；所述哺乳动物细胞为HEK 293细胞、293T细胞、293FT细胞或Hela细胞。

4.含有权利要求3所述假型慢病毒的重组细胞。

5.一种HIV毒株耐药表型分析细胞模型，是用权利要求3所述假型慢病毒感染的哺乳动物细胞；所述哺乳动物细胞为HEK 293细胞、293T细胞、293FT细胞或Hela细胞。

6.权利要求3所述假型慢病毒、权利要求5所述细胞模型在HIV毒株耐药表型分析中的应用。