CN107405357A - 多重shRNAs及其应用 - Google Patents

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Abstract

公开了核酸分子，例如shRNA簇和人工miRNA簇。还公开了与本文公开的核酸分子相关的使用方法、成分、细胞、病毒颗粒，和试剂盒。本公开提供，至少部分，核酸分子例如编码shRNA样分子的shRNA簇以及编码修饰型pri‑miRNA样分子的人工miRNA簇。这里公开的所述shRNA簇和人工miRNA簇可被用于，例如，生产人工RNA分子，例如，RNAi分子。与所述核酸分子(例如shRNA簇和人工miRNA簇)相关的细胞、病毒颗粒、组合物(例如药物组合物)、试剂盒和方法，也被公开了。这里公开的所述核酸分子(例如shRNA簇和人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞、病毒颗粒、组合物(例如药物组合物)、试剂盒和方法可被用于治疗或预防疾病，例如HIV感染和/或AIDS。

Description

多重shRNAs及其应用
技术领域
本公开涉及多重shRNAs及其应用。
背景技术
随着临床试验的成功，使用核糖核酸干扰(RNAi)治疗包含癌症和HIV-1感染在内的许多疾病的兴趣又重新燃起(Davidson and McCray(2011).Nat Rev Genet12:329–340)。虽然短发夹RNA(shRNA)可被用于抑制人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的复制(Lee et al.(2005).Blood106:818–826；Lee et al.(2002).Nat Biotechnol20:500–505；DiGiusto etal.(2010).Sci Transl Med2:36ra43)，但是在常用的Pol III启动子下表达的shRNA的一个潜在问题是shRNA的过量表达能够通过与内源性微小RNA(miRNA)竞争细胞质运输而产生毒性(Grimm et al.(2006).Nature441:537–541；McBride et al.(2008).Proc Natl AcadSci USA105:5868–5873；Boudreau et al.(2008)RNA14:1834–1844)。此外，在细胞质中由Dicer酶处理的shRNA也能够结合所有的Ago蛋白，进一步妥协了内源性miRNA的功能(Grimmet al.(2010).J Clin Invest120:3106–3119)。
使用传统shRNA治疗HIV-1的主要问题是逃逸突变的快速产生，因为HIV-1极易出错的反转录导致其进化非常迅速(Boden et al.(2003).J Virol77:11531–11535；Dasetal.(2004).J Virol78:2601–2605)。因此，为了使问题最小化，重要的是能够在单个载体中表达多重shRNA以靶向宿主因子和病毒基因。然而，使用相同启动子的串联重复序列来表达多重shRNA的尝试是不成功的，因为表达盒由于同源重组的原因容易被删除(Brake etal.(2008).Mol Ther16:557–564)。类似地，使用相同的miRNA骨干来表达多重shRNA也很可能由于同源重组而导致删除。或者，可以使用天然产生的多顺反子miRNA簇来表达多重shRNA(Liu et al.(2008).Nucleic Acids Res36:2811–2824；Aagaard et al.(2008).Gene Ther15:1536–1549；Chung et al.(2012).Hum Gene Ther23:1200–1208)。然而，目前能够在多顺反子miRNA骨架中表达的shRNA的最大数量有限(Liu et al.(2008).NucleicAcids Res36:2811–2824)。虽然数学建模认为四个shRNA的组合可能足以克服逃逸，但是这要求所有四个shRNA都要匹配病毒变种100次循环中的每一次并且所述病毒准种存在于患者体内(McIntyre et al.(2011).AIDS Res Ther 8:1)。
MiRNA被转录为长的(长达几kb)初级miRNA(pri-miRNA)，包含具有长的5’和3’侧翼序列的miRNA双链(Lee et al.(2004).EMBO J23:4051–4060；Cai et al.(2004).RNA10:1957–1966)。pri-miRNA在细胞核内被Drosha/DGCR8复合物加工成pre-miRNA，然后pre-miRNA被转运至细胞质中，被Dicer进一步加工成成熟miRNA(Lee et al.(2003).Nature425:415–419；Han et al.(2004).Genes Dev18:3016–3027)。通常，长段的侧翼序列被用来设计内源性miRNA骨架中的shRNA(shRNA-miR)，希望它会导向Drosha/DGCR8的加工，正如初级miRNA(Chang et al.(2006).Nat Methods3:707–714)。然而，通过这种方法得到的具有不同miRNA骨架的多重shRNA因为长段的侧翼序列而不实用。
将shRNA运送至体内相关的(HIV-1敏感的)靶标细胞仍然是巨大的挑战。通过VSV-G假型慢病毒载体运送shRNA是常用策略，因为VSV受体在大多数细胞类型中广泛表达。VSV-G假型允许许多不同细胞类型的转导。然而，HIV-1的主要靶标CD4T细胞只有在激活后才能被VSV-G假型慢病毒转导，所述激活能够影响它们的指令系统以及长期存活(Agosto etal.(2009).J Virol83:8153–8162；Yu et al.(2009).PLoS Pathog5:e1000633)。
尽管有目前的治疗方法，还是有必要开发治疗和预防HIV和AIDS的新治疗方法。
发明内容
本公开提供，至少部分，核酸分子例如编码shRNA样分子的shRNA簇以及编码修饰型pri-miRNA样分子的人工miRNA簇。这里公开的所述shRNA簇和人工miRNA簇可被用于，例如，生产人工RNA分子，例如，RNAi分子。与所述核酸分子(例如shRNA簇和人工miRNA簇)相关的细胞、病毒颗粒、组合物(例如药物组合物)、试剂盒和方法，也被公开了。这里公开的所述核酸分子(例如shRNA簇和人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞、病毒颗粒、组合物(例如药物组合物)、试剂盒和方法可被用于治疗或预防疾病，例如HIV感染和/或AIDS。
一方面，本公开提供核酸分子，例如shRNA簇，其编码多个shRNA样分子，其中所述多个shRNA样分子中的每一个分子包含：茎区，其包含人工RNA分子，所述人工RNA分子包含引导链和随从链，所述引导链与靶标mRNA基本互补；和骨干区，其包含5’侧翼区、末端环区、以及3’侧翼区。
在一个实施例中，至少一个shRNA样分子的骨干区在所述多个shRNA样分子中不重复，例如所述多个shRNA样分子不包含完全相同或基本相同的骨干区。在一个实施例中，所述多个shRNA样分子的骨干区与单一的天然产生的miRNA簇编码的pri-miRNA的骨干区不相同或基本不相同，例如，所述多个shRNA样分子中至少两个分子来自不同的天然产生的miRNA簇编码的pri-miRNA。在一个实施例中，至少一个shRNA样分子的骨干区在所述多个shRNA样分子中不重复，并且所述多个shRNA样分子的骨干区与单一的天然产生的miRNA簇编码的pri-miRNA的骨干区不相同或基本不相同。
在一个实施例中，所述多个shRNA样分子包含两个或更多个(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多)shRNA样分子。在另一个实施例中，所述多个shRNA样分子包含四个或更多个(例如5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多)shRNA样分子。还在另一个实施例中，所述多个shRNA样分子包含七个或更多个(例如8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多)shRNA样分子。还在另一个实施例中，所述多个shRNA样分子包含十个或更多个(例如11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多)shRNA样分子。
在一个实施例中，所述shRNA簇是人工miRNA簇，例如本文所述的人工miRNA簇。在一个实施例中，所述shRNA簇编码一个或更多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多)基于miRNA的shRNA分子(shRNA-miR分子)。在一个实施例中，所述shRNA簇编码一个或更多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多)不是来自天然产生的pri-miRNA的shRNA分子。
在一个实施例中，所述shRNA簇包含编码第一shRNA样分子的第一核苷酸序列和编码第二shRNA样分子的第二核苷酸序列。在一个实施例中，所述第一shRNA样分子来自天然产生的第一miRNA的pri-miRNA(例如，产生或包含第一miRNA的天然产生的pri-miRNA)。在另一个实施例中，所述第一shRNA样分子不是来自天然产生的pri-miRNA。在一个实施例中，所述第二shRNA样分子来自天然产生的第二miRNA的pri-miRNA(例如，产生或包含第二miRNA的天然产生的pri-miRNA)。在另一个实施例中，所述第二shRNA样分子不是来自天然产生的pri-miRNA。
在一个实施例中，所述骨干区具有下述一个、两个，或三个特征：
(1)所述末端环的长度为大约3至大约50个核苷酸，例如大约5至大约40个核苷酸，大约8至大约30个核苷酸，大约10至大约20个核苷酸，或大约12至大约18个核苷酸；
(2)所述5’侧翼区的长度为大约5至大约300个核苷酸，例如大约10至大约200个核苷酸，大约15至大约150个核苷酸，大约20至大约100个核苷酸，大约30至大约50个核苷酸，或大约15至大约30个核苷酸，例如，大约15，20，或30个核苷酸；
(3)所述3’侧翼区的长度为大约5至大约300个核苷酸，例如大约10至大约200个核苷酸，大约15至大约150个核苷酸，大约20至大约100个核苷酸，大约30至大约50个核苷酸，或大约15至大约30个核苷酸，例如，大约15，20，或30个核苷酸。
不受理论约束，相信在一个实施例中，所述5’侧翼区和3’侧翼区可以形成双链区，例如部分双链区。在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含编码第三shRNA分子的第三核苷酸序列。在一个实施例中，所述第三shRNA样分子来自天然产生的第三miRNA的pri-miRNA(例如，产生或包含第三miRNA的天然产生的pri-miRNA)。在一个实施例中，所述第三miRNA由不同于表达第一miRNA、第二miRNA或两者的转录本的转录本天然表达，例如，与第一miRNA、第二miRNA或两者不是由同一个天然产生的miRNA簇编码。在另一个实施例中，所述第三shRNA样分子不是来自天然产生的pri-miRNA。
在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含编码第四shRNA分子的第四核苷酸序列。在一个实施例中，所述第四shRNA样分子来自天然产生的第四miRNA的pri-miRNA(例如，产生或包含第四miRNA的天然产生的pri-miRNA)。在一个实施例中，所述第四miRNA由不同于表达第一、第二，或第三miRNA的转录本的转录本天然表达，例如，与第一、第二，或第三miRNA不是由同一个天然产生的miRNA簇编码。在另一个实施例中，所述第四shRNA样分子不是来自天然产生的pri-miRNA。
在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含编码第五shRNA分子的第五核苷酸序列。在一个实施例中，所述第五shRNA样分子来自天然产生的第五miRNA的pri-miRNA(例如，产生或包含第五miRNA的天然产生的pri-miRNA)。在一个实施例中，所述第五miRNA由不同于表达第一、第二、第三，或第四miRNA的转录本的转录本天然表达，例如，与第一、第二、第三，或第四miRNA不是由同一个天然产生的miRNA簇编码。在另一个实施例中，所述第五shRNA样分子不是来自天然产生的pri-miRNA。
在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含编码第六shRNA分子的第六核苷酸序列。在一个实施例中，所述第六shRNA样分子来自天然产生的第六miRNA的pri-miRNA(例如，产生或包含第六miRNA的天然产生的pri-miRNA)。在一个实施例中，所述第六miRNA由不同于表达第一、第二、第三、第四，或第五miRNA的转录本的转录本天然表达，例如，与第一、第二、第三、第四，或第五miRNA不是由同一个天然产生的miRNA簇编码。在另一个实施例中，所述第六shRNA样分子不是来自天然产生的pri-miRNA。
在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含编码第七shRNA分子的第七核苷酸序列。在一个实施例中，所述第七shRNA样分子来自天然产生的第七miRNA的pri-miRNA(例如，产生或包含第七miRNA的天然产生的pri-miRNA)。在一个实施例中，所述第七miRNA由不同于表达第一、第二、第三、第四、第五，或第六miRNA的转录本的转录本天然表达，例如，与第一、第二、第三、第四、第五，或第六miRNA不是由同一个天然产生的miRNA簇编码。在另一个实施例中，所述第七shRNA样分子不是来自天然产生的pri-miRNA。
在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含编码第8，第9，第10，第11，第12，第13，第14，第15，第16，第17，第18，第19，或第20shRNA样分子的第8，第9，第10，第11，第12，第13，第14，第15，第16，第17，第18，第19，或第20核苷酸序列。在一个实施例中，所述第8，第9，第10，第11，第12，第13，第14，第15，第16，第17，第18，第19，或第20shRNA样分子来自天然产生的第8，第9，第10，第11，第12，第13，第14，第15，第16，第17，第18，第19，或第20miRNA的pri-miRNA(例如，产生或包含第8，第9，第10，第11，第12，第13，第14，第15，第16，第17，第18，第19，或第20miRNA的天然产生的pri-miRNA)。在一个实施例中，所述第8，第9，第10，第11，第12，第13，第14，第15，第16，第17，第18，第19，或第20shRNA样分子不是来自天然产生的pri-miRNA。
在一个实施例中，所述shRNA簇具有一个、两个，或所有的下述特征：
(1)所述末端环区与天然产生的pri-miRNA的末端环区基本上同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)；
(2)所述5’侧翼区与天然产生的pri-miRNA分子的5’侧翼区基本上同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)；或
(3)所述3’侧翼区与天然产生的pri-miRNA的3’侧翼区基本上同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。
在一个实施例中，所述shRNA簇编码多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多)人工RNA分子，例如，由所述多个shRNA样分子所产生的。在一个实施例中，所述人工RNA分子是RNAi分子。在一个实施例中，所述人工RNA分子是siRNA分子。在一个实施例中，所述人工RNA分子不包含天然产生的miRNA。
在一个实施例中，由第一和第二shRNA样分子产生(例如，加工而成)的人工RNA分子，靶向不同的mRNA，例如，由不同基因转录的mRNA。
在一个实施例中，由所述多个(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多)shRNA样分子产生(例如，加工而成)的人工RNA分子中的每一个分子，靶向不同的mRNA，例如，由不同基因转录的mRNA。在一个实施例中，由所述多个(例如，3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20，或更多)shRNA样分子产生(例如，加工而成)的人工RNA分子中的至少两个分子，靶向同一基因转录的相同的mRNA或不同的mRNA。
在一个实施例中，所述人工RNA分子，在细胞中表达时，基本抑制(例如，降低表达水平)靶标mRNA的表达(例如，通过靶标mRNA的断裂，抑制靶标mRNA的翻译，或两种方式都有)。在一个实施例中，所述细胞是T细胞，例如CD4+T细胞，干细胞，例如造血干细胞，或CD34+细胞。在一个实施例中，所述细胞是休眠T细胞。在另一个实施例中，所述细胞是激活的T细胞。在一个实施例中，所述细胞是外周血单核细胞(PBMC)或从PBMC中分离的细胞。
在一个实施例中，所述mRNA由哺乳动物(例如人)的基因编码，例如编码病毒的受体或共受体的基因，例如，HIV共受体，例如CCR5或CXCR4。在一个实施例中，所述靶标mRNA由病毒基因编码，例如，HIV基因(例如HIV-1基因)，例如Gag,Env,Tat,Pol2,Pol1或Vif。
在一个实施例中，所述多个人工RNA分子，在细胞中表达时，基本抑制一个或更多个(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多个)病毒基因的表达，例如，一个或更多个(例如，2,3,4,5个，或所有)选自Gag,Env,Tat,Pol2,Pol1,或Vif的HIV基因。在一个实施例中，所述多个人工RNA分子，在细胞中表达时，基本抑制HIV Gag,Env,Tat,Pol2,Pol1,和Vif基因的表达。
在一个实施例中，所述引导链与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)。在一个实施例中，所述引导链与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)。
在一个实施例中，所述shRNA簇编码一个或多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10，或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链；以及一个或多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10，或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链。
在另一个实施例中，所述shRNA簇编码一个或多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10，或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链；以及四个或更多个(例如5,6,7,8,9,10，或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链。
还在另一个实施例中，所述shRNA簇编码一个人工RNA分子，其包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链，以及六个人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链。
在一个实施例中，所述随从链与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％相同)。
在一个实施例中，所述随从链与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％相同)。
在一个实施例中，所述shRNA簇编码一个或更多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％相同)的随从链；以及一个或更多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％相同)的随从链。
在另一个实施例中，所述shRNA簇编码一个或更多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％相同)的随从链；以及四个或更多个(例如5,6,7,8,9,10,或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％相同)的随从链。
还在另一个实施例中，所述shRNA簇编码一个人工RNA分子，其包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％相同)的随从链，以及六个人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％相同)的引导链。
在一个实施例中，所述病毒是RNA病毒。在一个实施例中，所述病毒是快速进化的病毒。在一个实施例中，所述病毒基因来自RNA病毒。在一个实施例中，所述病毒来自快速进化的病毒。
在一个实施例中，所述shRNA样分子来自这里所述的miRNA(例如，miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150)的pri-miRNA。在一个实施例中，所述多个shRNA样分子来自两个或更多个(例如，三个，四个，五个，六个，或所有)miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150的pri-miRNA。在一个实施例中，所述多个shRNA样分子来自miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,和miR-150的pri-miRNA。
在一个实施例中，所述末端环区与miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150的pri-miRNA的末端环区基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。
在一个实施例中，所述5’侧翼区与miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150的pri-miRNA的5’侧翼区基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。
在一个实施例中，所述3’侧翼区与miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150的pri-miRNA的3’侧翼区基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。
在一个实施例中，所述shRNA簇包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)核苷酸序列，其中每一个序列与表4-5公开的修饰型pri-miRNA样分子的核苷酸序列基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。在一个实施例中，所述shRNA簇包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)表4-5公开的修饰型pri-miRNA样分子的核苷酸序列。在一个实施例中，所述shRNA簇包含七个表4-5公开的修饰型pri-miRNA样分子的核苷酸序列。
在一个实施例中，所述shRNA簇包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)核苷酸序列，其中每一个序列与表4-5公开的引导链核苷酸序列基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。
在一个实施例中，所述shRNA簇包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)表4-5公开的引导链核苷酸序列。
在一个实施例中，所述shRNA簇包含七个表4-5公开的引导链核苷酸序列。
在一个实施例中，所述shRNA簇包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)核苷酸序列，其中每一个序列与表4-5公开的随从链核苷酸序列基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。
在一个实施例中，所述shRNA簇包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)表4-5公开的随从链核苷酸序列。在一个实施例中，所述shRNA簇包含七个表4-5公开的随从链核苷酸序列。
在一个实施例中，所述shRNA簇包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)核苷酸序列，其中每一个序列与表4-5公开的末端环区、5’侧翼区，或3’侧翼区的核苷酸序列基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。
在一个实施例中，所述shRNA簇包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)表4-5公开的末端环区、5’侧翼区，或3’侧翼区的核苷酸序列。在一个实施例中，所述shRNA簇包含七个表4-5公开的末端环区、5’侧翼区，或3’侧翼区的核苷酸序列。
在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含多个间隔序列(例如，长度为大约0至大约250个核苷酸，大约1至大约200个核苷酸，大约10至大约150个核苷酸，大约20至大约100个核苷酸，或大约30至大约50个核苷酸)，所述间隔序列位于两个shRNA样分子的编码序列之间。
在一个实施例中，所述shRNA簇在细胞核中被有效加工，例如通过Drosha/DGCR8。在另一个实施例中，所述shRNA簇保留了至少一部分天然pri-miRNA(例如，miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150的pri-miRNA)的二级结构。
在一个实施例中，所述茎区在所述引导链和随从链之间不包含凸起或错配。在另一个实施例中，所述干区在所述引导链和随从链之间包含凸起或错配。
在一个实施例中，所述引导链的长度为大约15至大约30个核苷酸，例如大约18至大约25个核苷酸或大约19至大约21个核苷酸。在另一个实施例中，所述随从链的长度为大约15至大约30个核苷酸，例如大约18至大约25个核苷酸或大约19至大约21个核苷酸。
在一个实施例中，shRNA簇是表达盒。
在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含启动子，例如Pol II启动子或Pol III启动子，例如，可操作地连接至shRNA样分子(例如，所述多个shRNA样分子)。
在一个实施例中，所述启动子是组成型启动子、诱导型启动子、普适启动子、组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子、和/或发育阶段特异性启动子。在一个实施例中，所述启动子是EF-1α派生的启动子。在另一个实施例中，所述启动子是CMV派生的启动子。
在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含一个或更多个(例如，两个或三个)选择标记。在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含报告基因。
在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含多聚腺苷酸化信号。在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含一个或更多个(例如，两个)长末端重复序列(LTRs)。在一个实施例中，所述shRNA簇进一步包含内部核糖体进入位点(IRES)。
在一个实施例中，所述shRNA簇是病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，例如自我失活型(SIN)逆转录病毒或慢病毒载体。
一方面，本公开提供一种核酸分子，例如人工miRNA簇，编码多个修饰型pri-miRNA样分子，例如基于miRNA的shRNA分子(shRNA-miR分子)，所述核酸分子包含：编码第一修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)的第一核苷酸序列，所述第一修饰型pri-miRNA样分子来自第一miRNA的天然产生的pri-miRNA(例如，产生或包含第一miRNA的天然产生的pri-miRNA)；以及编码第二修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)的第二核苷酸序列，所述第二修饰型pri-miRNA样分子来自第二miRNA的天然产生的pri-miRNA(例如，产生或包含第二miRNA的天然产生的pri-miRNA)，所述第一和第二miRNA由不同的转录本天然表达或者不属于同一个天然产生的miRNA簇。
在一个实施例中，所述多个修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)中的每一个分子包含：茎区、末端环区、5’侧翼区和3’侧翼区，所述干区包含人工RNA分子，所述人工RNA分子包含引导链和随从链，所述引导链与靶标mRNA基本互补。
在一个实施例中，所述修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)具有一个或更多个(例如，2个或所有)以下特征：
(1)与天然产生的pri-miRNA的末端环区基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)的末端环区；
(2)与天然产生的pri-miRNA的5’侧翼区基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)的5’侧翼区；或
(3)与天然产生的pri-miRNA的3’侧翼区基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)的3’侧翼区。
在一个实施例中，所述末端环的长度为大约3至大约50个核苷酸，例如，大约5至大约40个核苷酸，大约8至大约30个核苷酸，大约10至大约20个核苷酸，或大约12至大约18个核苷酸。
在一个实施例中，所述5’侧翼区的长度为大约5至大约300个核苷酸，例如，大约10至大约200个核苷酸，大约15至大约150个核苷酸，大约20至大约100个核苷酸，大约30至大约50个核苷酸，或大约15至大约30个核苷酸，例如，大约15，20或30个核苷酸。
在一个实施例中，所述3’侧翼区的长度为大约5至大约300个核苷酸，例如，大约10至大约200个核苷酸，大约15至大约150个核苷酸，大约20至大约100个核苷酸，大约30至大约50个核苷酸，或大约15至大约30个核苷酸，例如，大约15，20或30个核苷酸。
不受理论约束，相信在一个实施例中，所述5’侧翼区和所述3’侧翼区可以形成双链区，例如部分双链区。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含编码第三修饰型pri-miRNA样分子的第三核苷酸序列，所述第三修饰型pri-miRNA样分子来自第三miRNA的天然产生的pri-miRNA(例如，产生或包含第三miRNA的天然产生的pri-miRNA)。
在一个实施例中，所述第三miRNA由不同于表达第一miRNA、第二miRNA或两者的转录本的转录本天然表达，例如，与第一miRNA、第二miRNA或两者不属于同一个天然产生的miRNA簇。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含编码第四修饰型pri-miRNA样分子的第四核苷酸序列，所述第四修饰型pri-miRNA样分子来自第四miRNA的天然产生的pri-miRNA(例如，产生或包含第四miRNA的天然产生的pri-miRNA)。
在一个实施例中，所述第四miRNA由不同于表达第一、第二或第三miRNA的转录本的转录本天然表达，例如，与第一、第二或第三miRNA不属于同一个天然产生的miRNA簇。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含编码第五修饰型pri-miRNA样分子的第五核苷酸序列，所述第五修饰型pri-miRNA样分子来自第五miRNA的天然产生的pri-miRNA(例如，产生或包含第五miRNA的天然产生的pri-miRNA)。
在一个实施例中，所述第五miRNA由不同于表达第一、第二、第三或第四miRNA的转录本的转录本天然表达，例如，与第一、第二、第三或第四miRNA不属于同一个天然产生的miRNA簇。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含编码第六修饰型pri-miRNA样分子的第六核苷酸序列，所述第六修饰型pri-miRNA样分子来自第六miRNA分子的天然产生的pri-miRNA(例如，产生或包含第六miRNA的天然产生的pri-miRNA)。
在一个实施例中，所述第六miRNA分子由不同于表达第一、第二、第三、第四或第五miRNA的转录本的转录本天然表达，例如，与第一、第二、第三、第四或第五miRNA不属于同一个天然产生的miRNA簇。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含编码第七修饰型pri-miRNA样分子的第七核苷酸序列，所述第七修饰型pri-miRNA样分子来自第七miRNA的天然产生的pri-miRNA(例如，产生或包含第七miRNA的天然产生的pri-miRNA)。
在一个实施例中，所述第七miRNA由不同于表达第一、第二、第三、第四、第五或第六miRNA的转录本的转录本天然表达，例如，与第一、第二、第三、第四、第五或第六miRNA不属于同一个天然产生的miRNA簇。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含编码来自天然产生的第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19或第20miRNA的pri-miRNA(例如，产生或包含第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19或第20miRNA的天然产生的pri-miRNA)的第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19或第20修饰型pri-miRNA样分子的第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19或第20核苷酸序列。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)编码两个或更多个(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多个)来自天然产生的pri-miRNA的修饰型pri-miRNA样分子。在一个实施例中，所述多个(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多个)修饰型pri-miRNA样分子中至少两个(例如，2,3,4,5,或更多个)分子来自同一天然产生的pri-miRNA。在一个实施例中，所述多个(2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多个)修饰型pri-miRNA样分子中的每一个分子来自不同的天然产生的pri-miRNA。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)编码七个来自天然产生的pri-miRNA的修饰型pri-miRNA样分子。在一个实施例中，所述七个修饰型pri-miRNA样分子中的每一个分子来自不同的自天然产生的pri-miRNA。在一个实施例中，所述七个不同的天然产生的pri-miRNA不属于同一miRNA簇。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步编码至少一个(例如1,2,3,4,5,或更多个)不是来自天然产生的pri-miRNA的shRNA分子。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)编码多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多个)人工RNA分子。在一个实施例中，所述人工RNA分子是RNAi分子。在一个实施例中，所述人工RNA分子是siRNA。在一个实施例中，所述人工RNA分子不包含天然产生的miRNA。
在一个实施例中，由所述第一和第二修饰型pri-miRNA样分子产生的所述人工RNA分子，靶向不同的mRNA，例如，由不同的基因转录的mRNA。
在一个实施例中，由所述多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多个)修饰型pri-miRNA样分子编码的人工RNA分子中的每一个分子，靶向不同的mRNA，例如，由不同的基因转录的mRNA。在一个实施例中，由所述多个(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多个)修饰型pri-miRNA样分子产生(例如，加工而成)的人工RNA分子中的至少两个(例如2,3,4,5,或更多个)分子，靶向同一基因转录的相同的mRNA或不同的mRNA。
在一个实施例中，所述人工RNA分子，在细胞中表达时，基本抑制(例如，降低表达水平)靶标mRNA的表达(例如，通过靶标mRNA的断裂，抑制靶标mRNA的翻译，或两种方式都有)。在一个实施例中，所述细胞是T细胞，例如CD4+T细胞，干细胞，例如造血干细胞，或CD34+细胞。在一个实施例中，所述细胞是休眠T细胞。在另一个实施例中，所述细胞是激活的T细胞。在一个实施例中，所述细胞是外周血单核细胞(PBMC)或从PBMC中分离的细胞。
在一个实施例中，所述mRNA由哺乳动物(例如人)的基因编码，例如编码病毒的受体或共受体的基因，例如，HIV共受体，例如CCR5或CXCR4。在一个实施例中，所述靶标mRNA由病毒基因编码，例如，HIV基因(例如HIV-1基因)，例如Gag,Env,Tat,Pol2,Pol1或Vif。
在一个实施例中，所述多个人工RNA分子，在细胞中表达时，基本抑制一个或更多个(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多个)病毒基因的表达，例如，一个或更多个(例如，2,3,4,5个，或所有)选自Gag,Env,Tat,Pol2,Pol1,或Vif的HIV基因。在一个实施例中，所述多个人工RNA分子，在细胞中表达时，基本抑制HIV Gag,Env,Tat,Pol2,Pol1,和Vif基因的表达。
在一个实施例中，所述引导链与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)。在一个实施例中，所述引导链与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)编码一个或更多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链；以及一个或更多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10，或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链。
在另一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)编码一个或更多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链；以及四个或更多个(例如5,6,7,8,9,10，或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链。
还在另一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)编码一个人工RNA分子，其包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链，以及六个人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本互补(例如，至少80％,85％,90％,95％或100％互补)的引导链。
在一个实施例中，所述随从链与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％一致)。
在一个实施例中，所述随从链与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％一致)。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)编码一个或更多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％一致)的随从链；以及一个或更多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％一致)的随从链。
在另一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)编码一个或更多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％一致)的随从链；以及四个或更多个(例如5,6,7,8,9,10,或更多个)人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％一致)的随从链。
还在另一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)编码一个人工RNA分子，其包含与哺乳动物基因(例如，人类基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％一致)的随从链，以及六个人工RNA分子，每一个分子包含与病毒基因(例如，HIV基因)编码的靶标mRNA中的序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,95％,或100％一致)的引导链。
在一个实施例中，所述病毒是RNA病毒。在一个实施例中，所述病毒是快速进化的病毒。在一个实施例中，所述病毒基因来自RNA病毒。在一个实施例中，所述病毒来自快速进化的病毒。
在一个实施例中，所述pri-miRNA样分子来自这里所述的miRNA(例如，miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150)的pri-miRNA。在一个实施例中，所述多个修饰型pri-miRNA样分子来自两个或更多个(例如，三个，四个，五个，六个，或所有)miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150的pri-miRNA。在一个实施例中，所述多个修饰型pri-miRNA样分子来自miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,和miR-150的pri-miRNA。
在一个实施例中，所述末端环区与miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150的pri-miRNA的末端环区基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。
在一个实施例中，所述5’侧翼区与miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150的pri-miRNA的5’侧翼区基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。
在一个实施例中，所述3’侧翼区与miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150的pri-miRNA的3’侧翼区基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)核苷酸序列，其中每一个序列与表4-5中公开的修饰型pri-miRNA样分子的核苷酸序列基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)表4-5中公开的修饰型pri-miRNA样分子的核苷酸序列。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含七个表4-5中公开的修饰型pri-miRNA样分子的核苷酸序列。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)核苷酸序列，其中每一个序列与表4-5中公开的引导链的核苷酸序列基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)表4-5中公开的引导链的核苷酸序列。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含七个表4-5中公开的引导链的核苷酸序列。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)核苷酸序列，其中每一个序列与表4-5中公开的随从链的核苷酸序列基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)表4-5中公开的随从链的核苷酸序列。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含七个表4-5中公开的随从链的核苷酸序列。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)核苷酸序列，其中每一个序列与表4-5中公开的末端环区、5’侧翼区或3’侧翼区的核苷酸序列基本同源(例如，至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个核苷酸的不同)。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含一个或更多个(例如2,3,4,5,6,或7个)表4-5中公开的末端环区、5’侧翼区或3’侧翼区的核苷酸序列。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)包含七个表4-5中公开的末端环区、5’侧翼区或3’侧翼区的核苷酸序列。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含多个间隔序列(例如，长度为大约0至大约250个核苷酸，大约1至大约200个核苷酸，大约10至大约150个核苷酸，大约20至大约100个核苷酸，或大约30至大约50个核苷酸)，所述间隔序列位于两个修饰型pri-miRNA样分子的编码序列之间。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)在细胞核中被有效加工，例如通过Drosha/DGCR8。在另一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)保留了至少一部分天然pri-miRNA(例如，miR-30a,miR-21,miR-20a,miR-16-1,miR-122,miR-185,或miR-150的pri-miRNA)的二级结构。
在一个实施例中，所述干区在所述引导链和随从链之间不包含凸起或错配。在另一个实施例中，所述茎区在所述引导链和随从链之间包含凸起或错配。
在一个实施例中，所述引导链的长度为大约15至大约30个核苷酸，例如大约18至大约25个核苷酸或大约19至大约21个核苷酸。在另一个实施例中，所述随从链的长度为大约15至大约30个核苷酸，例如大约18至大约25个核苷酸或大约19至大约21个核苷酸。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)是表达盒。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含启动子，例如Pol II启动子或Pol III启动子，例如，可操作地连接至修饰型pri-miRNA样分子(例如，所述多个修饰型pri-miRNA样分子)。
在一个实施例中，所述启动子是组成型启动子，诱导型启动子，普适启动子，组织特异性启动子，细胞类型特异性启动子，和/或发育阶段特异性启动子。在一个实施例中，所述启动子是EF-1α派生的启动子。在另一个实施例中，所述启动子是CMV派生的启动子。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含一个或更多个(例如，两个或三个)选择标记。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含报告基因。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含多聚腺苷酸化信号。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含一个或更多个(例如，两个)长末端重复序列(LTRs)。在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)进一步包含内部核糖体进入位点(IRES)。
在一个实施例中，所述核酸分子(例如，人工miRNA簇)是病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，例如自我失活型(SIN)逆转录病毒或慢病毒载体。
另一方面，本公开提供编码七个修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)的核酸分子(例如，人工miRNA簇)，所述核酸分子包含：编码来自产生miR-30a的天然pri-miRNA的第一修饰型pri-miRNA样分子的第一核苷酸序列，编码来自产生miR-21的天然pri-miRNA的第二修饰型pri-miRNA样分子的第二核苷酸序列，编码来自产生miR-20a的天然pri-miRNA的第三修饰型pri-miRNA样分子的第三核苷酸序列，编码来自产生miR-16-1的天然pri-miRNA的第四修饰型pri-miRNA样分子的第四核苷酸序列，编码来自产生miR-122的天然pri-miRNA的第五修饰型pri-miRNA样分子的第五核苷酸序列，编码来自产生miR-185的天然pri-miRNA的第六修饰型pri-miRNA样分子的第六核苷酸序列，编码来自产生miR-150的天然pri-miRNA的第七修饰型pri-miRNA样分子的第七核苷酸序列，所述七个修饰型pri-miRNA样分子中的每一个分子包含：茎区，所述干区包含人工RNA分子，所述人工RNA分子包含引导链和随从链，所述引导链与选自人类CCR5基因和HIV(例如,HIV-1)Gag,Env,Tat,Pol2,Pol1和Vif基因组成的组的基因编码的靶标mRNA基本互补；末端环区，例如本文所述的末端环区；5’侧翼区，例如本文所述的5’侧翼区；和3’侧翼区，例如本文所述的3’侧翼区。
一方面，本公开提供转录本，例如，本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)编码的初级RNA转录本或加工的RNA转录本。
一方面，本公开提供本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇)编码的多个shRNA样分子。
另一方面，本公开提供本文所述的核酸分子(例如，人工miRNA簇)编码的多个修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)。
还在另一方面，本公开提供本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)编码的多个人工RNA分子。
一方面，本公开提供包含本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)的细胞。
在一个实施例中，所述细胞被病毒感染，例如RNA病毒，例如HIV(例如，HIV-1)。在一个实施例中，所述病毒是快速进化的病毒。在一个实施例中，所述细胞分离自或来自患者，例如，感染HIV(例如，HIV-1)或患有AIDS的患者。
另一方面，本公开提供包含本文所述的多个shRNA样分子或本文所述的多个修饰型pri-miRNA样分子的细胞。
在一个实施例中，所述细胞被病毒感染，例如RNA病毒，例如HIV(例如，HIV-1)。在一个实施例中，所述病毒是快速进化的病毒。在一个实施例中，所述细胞分离自或来自患者，例如，感染HIV(例如，HIV-1)或患有AIDS的患者。
一方面，本公开提供包含本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)的病毒颗粒。
在一个实施例中，所述病毒颗粒是逆转录病毒或慢病毒。
另一方面，本公开提供包含本文所述的多个shRNA样分子或本文所述的修饰型pri-miRNA样分子的病毒颗粒。
在一个实施例中，所述病毒颗粒是逆转录病毒或慢病毒。
还在另一方面，本公开提供包含本文所述的多个人工RNA分子(例如，RNAi分子)的病毒颗粒。
在一个实施例中，所述病毒颗粒是逆转录病毒或慢病毒。
一方面，本公开提供用于抑制细胞(例如，本文所述的细胞)内基因(例如，本文所述的基因)表达的方法，所述方法包含使细胞与本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)在允许人工RNA分子(例如，本文所述的人工RNA分子)表达的条件下接触。
在一个实施例中，所述细胞被病毒感染，例如RNA病毒，例如HIV(例如，HIV-1)。在一个实施例中，所述病毒是快速进化的病毒。在一个实施例中，所述细胞分离自或来自患者，例如，感染HIV(例如，HIV-1)或患有AIDS的患者。
在一个实施例中，所述基因是哺乳动物细胞基因，例如，编码HIV共受体(例如，CCR5或CXCR4)的基因。在一个实施例中，所述基因是病毒基因，例如，HIV(例如HIV-1)基因，例如Gag,Env,Tat,Pol2,Pol1或Vif。
在一个实施例中，所述细胞与所述核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)在体内接触。在一个实施例中，所述细胞与所述核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)活体外接触。在一个实施例中，所述细胞与所述核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)在体外接触。
另一方面，本公开提供用于抑制细胞(例如，本文所述的细胞)内基因(例如，本文所述的基因)表达的方法，所述方法包含使细胞与本文所述的病毒颗粒在允许人工RNA分子(例如，本文所述的人工RNA分子)表达的条件下接触。
在一个实施例中，所述细胞被病毒感染，例如RNA病毒，例如HIV(例如，HIV-1)。在一个实施例中，所述病毒是快速进化的病毒。在一个实施例中，所述细胞分离自或来自患者，例如，感染HIV(例如，HIV-1)或患有AIDS的患者。在一个实施例中，所述基因是哺乳动物细胞基因，例如，编码HIV共受体(例如，CCR5或CXCR4)的基因。在一个实施例中，所述基因是病毒基因，例如，HIV(例如HIV-1)基因，例如Gag,Env,Tat,Pol2,Pol1或Vif。
在一个实施例中，所述细胞与所述核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)在体内接触。在一个实施例中，所述细胞与所述核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)活体外接触。在一个实施例中，所述细胞与所述核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)在体外接触。
一方面，本公开提供用于治疗或预防疾病(例如，HIV(例如HIV-1)感染或AIDS)的方法，所述方法包含向感染了HIV或患有AIDS，或可能感染了HIV或患有AIDS的受试者施用细胞(例如，本文所述的细胞)，从而治疗或预防疾病，例如HIV感染或AIDS。
另一方面，本公开提供用于治疗或预防疾病(例如，HIV(例如HIV-1)感染或AIDS)的方法，所述方法包含：从感染了HIV或患有AIDS，或可能感染了HIV或患有AIDS的受试者身上分离细胞；使所述分离的细胞与本文所述的病毒颗粒接触；并对所述受试者施用接触了病毒颗粒的细胞，从而治疗或预防疾病，例如HIV感染或AIDS。
还在另一方面，本公开提供用于治疗或预防疾病(例如，HIV(例如HIV-1)感染或AIDS)的方法，所述方法包含向感染了HIV或患有AIDS，或可能感染了HIV或患有AIDS的受试者施用本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)，从而治疗或预防疾病，例如HIV感染或AIDS。
还在另一方面，本公开提供用于治疗或预防疾病(例如，HIV(例如HIV-1)感染或AIDS)的方法，所述方法包含向感染了HIV或患有AIDS，或可能感染了HIV或患有AIDS的受试者施用本文所述的病毒颗粒，从而治疗或预防疾病，例如HIV感染或AIDS。
一方面，本公开提供用于治疗或预防受试者HIV感染或AIDS的本文所述的细胞。
另一方面，本公开提供用于治疗或预防受试者疾病(例如，HIV感染或AIDS)的本文所述的shRNA簇或本文所述的核酸分子。
还在另一方面，本公开提供用于治疗或预防受试者疾病(例如，HIV感染或AIDS)的本文所述的病毒颗粒。
一方面，本公开提供本文所述的细胞在制造用于治疗或预防受试者疾病(例如，HIV(例如HIV-1)感染或AIDS)的药物中的用途。
另一方面，本公开提供本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)在制造用于治疗或预防受试者疾病(例如，HIV(例如HIV-1)感染或AIDS)的药物中的用途。
还在另一方面，本公开提供本文所述的病毒颗粒在制造用于治疗或预防受试者疾病(例如，HIV(例如HIV-1)感染或AIDS)的药物中的用途。
一方面，本公开提供生产能够表达本文所述的多个人工RNA分子的细胞的方法，所述方法包含：使细胞(例如，本文所述的细胞)与本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)接触，并且任选地，在允许所述人工RNA分子表达的条件下培养细胞，从而生产所述细胞。
在一个实施例中，所述方法包含使所述细胞与本文所述的病毒颗粒接触。在一个实施例中，所述方法进一步包含，在使所述细胞与所述核酸分子接触之前，从受试者(例如，感染了HIV(例如HIV-1)或患有AIDS的受试者)身上分离细胞。
另一方面，本公开提供生产能够表达本文所述的多个人工RNA分子(例如，RNAi分子)的细胞的方法，所述方法包含：使细胞(例如，本文所述的细胞)与本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)接触，并且任选地，在允许所述人工RNA分子表达的条件下培养细胞，从而生产所述细胞。
在一个实施例中，所述方法进一步包含，在使所述细胞与所述核酸分子接触之前，从受试者(例如，感染了HIV或患有AIDS的受试者)身上分离细胞。
一方面，本公开提供本文所述核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)的设计方法，所述方法包含改变天然pri-miRNA的骨干区域，所述骨干区域包含5’侧翼区、末端环区和3’侧翼区。
在一个实施例中，所述方法包含一个、两个，或所有下述特征：
(1)在所述5’侧翼区、末端环区或3’侧翼区中的一个、两个或所有序列中添加一个或更多个(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多个)核苷酸；
(2)在所述5’侧翼区、末端环区或3’侧翼区中的一个、两个或所有序列中删除一个或更多个(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多个)核苷酸；或者
(3)在所述5’侧翼区、末端环区或3’侧翼区中的一个、两个或所有序列中替换一个或更多个(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,或更多个)核苷酸。
一方面，本公开提供一种组合物，例如，药物组合物，包含本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)以及药学上可接受的载体。
另一方面，本公开提供一种组合物，例如，药物组合物，包含本文所述的细胞以及药学上可接受的载体。
还在另一方面，本公开提供一种组合物，例如，药物组合物，包含本文所述的病毒颗粒以及药学上可接受的载体。
一方面，本公开提供一种试剂盒，包含本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)以及所述核酸分子的使用说明。
另一方面，本公开提供一种试剂盒，包含本文所述的细胞以及所述细胞的使用说明。
还在另一方面，本公开提供一种试剂盒，包含本文所述的病毒颗粒以及所述病毒颗粒的使用说明。
一方面，本公开提供用于预防细胞被HIV-1感染的人工miRNA簇，包含多重的基于miRNA的shRNA。在一个实施例中，所述多重的基于miRNA的shRNA包含七个shRNA。在另一个实施例中，所述人工miRNA簇对控制HIV-1感染的细胞的复制也是有效的。
另一方面，本公开提供用于治疗感染了HIV-1的患者的方法，包含向患者施用有效量的多重的基于miRNA的shRNA。在一个实施例中，所述多重的基于miRNA的shRNA包含七个shRNA。
还在另一方面，本公开提供用于预防HIV-1感染的方法，包含向患者施用有效量的多重的基于miRNA的shRNA。在一个实施例中，所述多重的基于miRNA的shRNA包含七个shRNA。
附图说明
所附的图，其中相同的参考编号在所有单独的视图中指相同的或功能上相似的元件，其包含在说明书中并组成了说明书的一部分，进一步说明实施方式，并与详细的说明书一起，用于解释本文公开的实施方式。
图1A-1D根据公开的实施方式，显示了多重shRNA-miR的优化设计。编码(图1A)pri-miR-30或(图1B)pri-miR-150的具有指定长度的侧翼序列的质粒(10,50和100ng)与在海肾萤光素酶的3′UTR中含有靶标序列的psiCHECK-2载体(100ng)共转染并在24小时之后通过双荧光素酶试验检测基因沉默。条形图表示三个重复的+SD数值。(图1C)是设计用于表达指定的1个，2个，4个和7个shRNA-miR的单一和多重的shRNA-miR的示意图。“X”代表限制性酶切位点。(图1D)示意地显示了shRNA-miR在HIV-1基因组中的靶点位置。
图2A-2C根据公开的实施方式，示例了多重shRNA-miR构建表达的shRNA-miR的能力。(图2A)编码指定的单一或多重shRNA-miR(2shRNA＝CCR5和Vif；4shRNAs＝CCR5,Gag,Pol 1和Vif；7shRNAs＝CCR5,Gag,Env,Tat,Pol 1,Pol 2和Vif)的质粒(10,50和100ng)与在海肾萤光素酶的3′UTR中包含shRNA-miR靶标序列的psiCHECK载体(100ng)共转染293FT细胞。24小时之后通过双荧光素酶试验确定基因沉默。图中显示了规范化为表达非shRNA-miR转染的mCherry载体阴性对照，海肾萤光素酶(Rluc，报告基因)比荧火虫荧光素酶(Fluc，内部对照)的比例。所述实验进行了三次。(图2B)Jurkat细胞被单一的、双重的或多重的shRNA-miR编码构建转染并通过Annexin V染色法测定细胞凋亡。十字孢碱用作阳性对照。(图2C)对指定的shRNAmiR表达载体转导的PBMC在转导后2天和4天进行MTS试验。条形图表示三个重复的平均+SD值。
图3A-3C根据公开的实施方式，显示了多重shRNA-miR对CCR5的作用。(图3A)仅编码CCR5shRNA-miR或编码多重shRNA-miR的慢病毒转导TZM-bl细胞并在48小时后通过流式细胞术测定CCR5的表达。(图3B)用pNL4-3质粒与编码非shRNA-miR的质粒(mock)、只编码CCR5shRNA-miR的质粒，或编码多重shRNA-miR的质粒一起共转染293T细胞。用48小时后收集的上清液感染TZM-bl细胞并在另一个48小时后，分析细胞裂解液的荧光素酶活性。(图3C)TZM-bl细胞转导编码指定shRNA-miR的HIV-1env假型慢病毒并被HIV-1NL4-3(左)和HIV-1BaL(右)以0.01MOI感染。在感染后第9天通过ELISA法测定培养液上清中的p24抗原水平。
图4A-4B根据公开的实施方式，显示了由表达多重shRNA-miR的HIV-1env-假型慢病毒载体转导和保护的休眠的和活化的T细胞。(图4A)活化的和(图4B)休眠的T细胞用编码非shRNA-miR(mock)、只编码CCR5shRNA-miR或7个shRNA-miR(根据GFP表达计算的转导效率显示在处理示意图的下面)的HIV-1env-假型慢病毒载体转导，用HIV-1NL4-3(见左列图)或HIV-1Bal(见右列图)感染，在感染后第0，3，9和15天通过ELISA法测定培养液上清中的p24抗原水平(见顶部)。在感染后第0，3，9和15天通过流式细胞术分析细胞中GFP的表达(见底部)。
图5A-5C根据公开的实施方式，显示了用表达多重shRNA-miR的HIV-1env-假型慢病毒载体转导的HIV阳性供体PBMC中HIV-1复制的抑制。(图5A)处理和检测的时间进程。(图5B)用编码非shRNA-miR(mock)、编码Tat shRNA-miR或7个shRNA-miR的HIV-1env-假型慢病毒载体转导来自4个不同HIV阳性供体的PBMC并在感染后指定的天数通过ELISA法测定培养液上清中的p24抗原水平。(图5C)对图5B中Tat shRNA-miR转导的细胞第35天的培养液上清进行测序，得到HIV-1基因组中Tat shRNA-miR的靶标区域。
图6A-6C根据公开的实施方式，显示了防止7shRNA-miR处理的HIV阳性PBMC移植的Hu-PBL小鼠中CD4T细胞丢失和内源性HIV-1复制。(图6A)处理和分析的时间进程。
图6B-6C用编码非shRNA-miR(mock)、只编码Tat shRNA-miR或7个shRNA-miR的HIV-1env假型慢病毒载体活体外转导的两个阳性供体(图6B抗逆转录病毒治疗中)和(图6C未经治疗的)的PBMC移植NOD/SCID/IL2-Rγc-/-小鼠并在第8，29和43天监测CD4T细胞数量，在第43天监测血清p24水平。显示了CD3门控细胞的CD4和CD8T细胞重建的代表性点阵图(左)和4只小鼠CD4T细胞水平的累积数据(中)以及细胞质p24水平(右)。标示了p24水平群体间的P值。
图7显示了示例的shRNA-miRNA结构和序列。左列显示了每一个shRNA-miR的发夹。预测的siRNA序列用下划线标出。剪头指示Drosha切割位点。右列显示了通过单一或多重shRNA-miR构建的深度测序获得的占优势的小RNA序列。
图8描绘了7个shRNA-miR产生的单个siRNA读数的频率。用指定的单一或7个shRNA-miR转染293T细胞并在48小时后从细胞裂解液中获得小RNA，克隆并深度测序。通过除以内源性miR-16的读数对小RNA读数规范化(表3)。使用下列公式计算相对表达：(7shRNA-miR转染的细胞中指定shRNA-miR的小RNA读数/内源性miR-16的小RNA读数)/(单一shRNA-miR转染的细胞中单个shRNA-miR的小RNA读数/内源性miR-16的小RNA读数)X100。
图9以数据图表显示了载体转导的PBMC中mCherry(仅载体、单一的、和多重的shRNA-miR)随时间的表达。
图10描绘了转导了VSV-G或HIV的env-假型慢病毒的活化的(A CD4)和休眠的(RCD4)CD4T细胞并在48小时后通过流式细胞计检查确定mCherry的表达。
图11描绘了用图4中转导了编码7个shRNA-miR的HIV-1env-假型慢病毒的活化的和休眠的CD4T细胞在感染后第0，3，9和15天监测GFP的表达，以确定HIV抗性细胞的富集。
图12为多重shRNA-miR的示意图。合成的Ultramer寡核苷酸被克隆至具有指定限制酶位点的pLVX载体中。所述插入序列可以在表3中找到。
具体实施方式
下面结合附图对具体实施方式做更加全面的描述，其中显示了本发明说明性的实施方式。这里公开的实施方式可以以许多不同形式体现而不应解释为对这里所列实施方式的限制；相反地，提供这些实施方式以便本公开完整和彻底，并全面传达本发明对本领域技术人员的范围。在当前的描述中会省略不必要的已知功能和操作的描述以使本发明清楚，在实施例中可以找到对所述实施方式的进一步讨论。全文中相同的编号指相同的元件。如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列表项目的任一以及所有组合。
这里使用的术语，其目的仅在于描述具体的实施方式而不用于限制本发明。如本文所使用的，单数形式“一个”(“a”，“an”)和“所述”(“the”)意在也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。需要进一步理解的是，术语“包含”(“comprises”和/或“comprising”)，在本说明书中使用时，明确指出所陈述的特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，并不排除存在或添加一个或多个其它的特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其组合。
除非另有限定，这里使用的所有术语(包括技术的和科学的术语)具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。需要进一步理解的是，术语，例如常用词典中定义的术语，应解释为具有与相关技术领域背景下的含义一致的含义而不应解释为理想化的或过于正式的含义，除非这里明确定义。
定义
如本文所使用的，冠词“一个”(“a”和“an”)指一个或多于一个(例如，至少一个)所述冠词的语法对象。
如本文所使用的，术语“或者”在这里用于表示“和/或”并且与“和/或”互换使用，除非上下文另有明确指示。
如本文所使用的，术语“大约”和“大概”应通常表示所计算的量的可接受的误差程度，考虑到测量的性质或精度。示范性的误差程度为指定数值或数值范围的20％以内，典型地，10％以内，更典型地，5％以内。
如本文所使用的，术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”，以及“多核苷酸”可交换使用。它们指任何长度的核苷酸的多聚形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。所述多核苷酸可以是单链的或双链的，并且如果是单链的，可以是编码链或非编码(反义)链。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及核苷酸类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组件中断。多核苷酸在聚合后可以进一步被修饰，例如通过与标记组件的结合。所述核酸可以是重组的多核苷酸或基因组、cDNA、酶处理、半合成或合成来源的核苷酸，所述合成来源指不是天然产生的或者与另一个多核苷酸以非天然排列的方式连接。
如本文所使用的，术语“基因”指核酸，例如编码功能RNA(例如，编码或非编码RNA，例如mRNA或miRNA)或多肽的DNA位点或区域。基因可以包括包含外显子和(任选地)内含子序列。所述核酸也可以任选地包括非编码序列，例如启动子和/或增强子序列。
如本文所使用的，术语“mRNA”指从基因转录而来并由其翻译为多肽的核酸，可以包括非翻译区，例如5'UTR和/或3'UTR。要理解的是，本文所述的shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子(例如shRNA-miR分子)或人工RNA分子(例如RNAi分子)可以包含与mRNA分子的任何序列(包括翻译区、5'UTR、3'UTR、以及既包含翻译区又包含部分5'UTR或3'UTR的序列)互补的核苷酸序列。本文所述的shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子(例如shRNA-miR分子)或人工RNA分子(例如RNAi分子)可以包含与mRNA分子跨越起始密码子或终止密码子的区域互补的核苷酸序列。
如本文所使用的，“编码”特定分子的序列是指，当可操作地连接至合适的调控序列时，在体外或体内被转录(DNA的情况)或翻译(mRNA的情况)为RNA或多肽的核酸。
如本文所使用的，术语“可操作地连接”指序列和调控序列以允许所述序列表达的方式连接。调节序列包含，例如，启动子，增强子，以及本技术领域公认的并选择用来引导所述序列表达的其它表达控制元件。
如本文所使用的，术语“重组子”指通过重组DNA技术获得的材料，例如，来自编码所需RNA的外源性DNA构建转化的细胞。
如本文所使用的，术语“载体”指用于引导核酸进入细胞的媒介物。载体包括，但不限于，质粒、噬菌粒、病毒、细菌和来自病毒或细菌来源的媒介物。载体也可以包括适配子，所述适配子形成所述RNAi分子的一部分或结合所述RNAi分子(Dassie et al.,NatureBiotechnology 27,839-846(2009),Thou and Rossi,Silence,1:4(2010),McNamera etal.,Nature Biotechnology 24,1005-1015(2006))。如本文所使用的，“质粒”是环状的双链DNA分子。用于本发明的有用的载体类型是病毒载体，其中异源DNA序列被插入到可以被修饰以删除一个或多个病毒基因或其部分的病毒基因组中。一些载体在宿主细胞中能够自我复制(例如，具有在宿主细胞中发挥功能的复制起始点的载体)。其它载体可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中并因此随着宿主基因组一起复制。
如本文所使用的，术语“转染的细胞”或“转导的细胞”指经过遗传修饰的细胞。遗传修饰可以是稳定的或短暂的。转染或转导(即，将载体或构建引入细胞)的方法包括，但不限于，脂质体融合(转座体)、病毒感染，以及常规核酸转染方法如电穿孔法、磷酸钙沉淀和显微注射。成功的转染或转导将在转导的细胞中产生预期效果，例如基因表达、基因沉默、增强基因靶标，或触发靶标生理事件。
如本文所使用的，术语“分离的”指从其原始或天然环境(例如，自然环境，如果是天然产生的)中取出的材料。例如，存在于活体动物体内的天然产生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是同样的多核苷酸或多肽，通过人为干涉从天然系统中的一些或所有共存材料中分开的，是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为这样的载体或组合物不是其天然产生的环境中的一部分。
如本文所使用的，术语“源自”表示来源于或取自特定资源。在序列片段的情况下，所述术语表示存在于特定资源中的完整序列的一部分(例如，大约50％或更多，大约60％或更多，大约70％或更多，大约75％或更多，大约80％或更多，大约85％或更多，大约90％或更多，大约95％或更多，或大约99％或更多)并从所述资源克隆或复制。
如本文所使用的，术语“合成的”指通过化学合成制备的材料。
如本文所使用的，术语“人工的”指不是天然产生的或不同于那些从天然资源中分离的材料。
这里所述的组合物和方法包含，至少部分，具有特定序列的核酸，或与其基本一致或相似的序列，例如，与所述特定序列至少80％,85％,90％,95％一致或具有更高一致性的序列。
在核苷酸序列的语境中，术语“基本同源”或“基本一致”在这里用于指第一核酸序列包含足够的或最小数量的与第二核酸序列中对齐的核苷酸一致的核苷酸，以便第一和第二核苷酸序列编码具有共有功能活性的核酸或多肽，或编码共有结构的核酸或多肽域或共有功能核酸或多肽活性。例如，核苷酸序列可以具有与参考序列(例如，本文提供的序列)至少大约80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％一致性。
序列间的同源性或序列一致性(所述术语在这里可交换使用)按照如下方法进行计算。为了确定两个核酸序列的同源性，对齐所述序列以实现最佳比对目的(例如，可以在第一和第二核酸序列中的一个或两个中引入空位以获得最佳对齐并且为了比对目的可以忽视非同源序列)。在典型的实施例中，用于比对目的的对齐的参考序列的长度是所述参考序列长度的至少30％，例如至少40％,50％,或60％，例如至少70％,80％,90％,或100％。然后比较相应核苷酸位置的核苷酸。如果第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的核苷酸占据，那么所述分子在所述位置一致。
两个序列之间的同源性是所述序列共享的一致位置的数量的函数，考虑到为获得两个序列最佳对齐需要引入的空位数量以及每个空位的长度。
序列的比较以及两个序列之间同源性的确定可以使用数学算法来完成。在一些实施例中，使用Needleman and Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453算法，用Blossum 62或PAM250矩阵，以及16,14,12,10,8,6或4的空位权重和1,2,3,4,5或6的长度权重来确定两个氨基酸序列之间的同源性，该算法已经纳入GCG软件包的GAP程序中(在www.gcg.com可获得)。在一些实施例中，使用GCG软件包的GAP程序(在www.gcg.com可获得)，用NWSgapdna.CMP矩阵和40,50,60,70或80的空位权重和1,2,3,4,5或6的长度权重来确定两个核苷酸序列之间的同源性。一个合适的参数组(应该使用所述参数组，除非另有说明)是Blossum 62评分矩阵和12的空位罚分、4的空位扩大罚分以及5的移码空位罚分。
两个核苷酸序列之间的同源性可以使用E.Meyers and W.Miller((1989)CABIOS,4:11-17)的算法，用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分以及4的空位罚分来确定，该算法已经纳入ALIGN程序(版本2.0)中。
本文所述的核酸序列可以用作“查询序列”针对公共数据库进行检索，例如，确定其它的家族成员或相关序列。这样的检索可以使用Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10中的NBLAST和XBLAST程序(2.0)进行。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸序列同源的核苷酸序列。为了获得比对目的的空位对齐，可以利用Altschul et al.,(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402所述的Gapped BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
这里公开的组合物和方法也包含，至少部分，具有与参考序列基本同源或同源的序列的核酸。
如本文所使用的，术语“基本互补”指核苷酸序列，其序列中的大部分(例如，至少大约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％)或全部碱基是互补的，或一个或更多个(例如，不多于20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％或1％)碱基是非互补的，或错配的。互补序列可以是允许沃森-克里克碱基配对、摆动碱基配对或两种碱基配对法则的序列的反向互补，由此G与C或U配对，且A与U或T配对。一个序列可以与另一个序列的全长互补或者可以与另一个序列的特定部分或长度互补。本领域技术人员将认识到U可以存在于RNA中，而T可以存在于DNA中。因此，RNA序列中的U可以与RNA序列或DNA序列中的A或G配对，而RNA或DNA序列中的A可以与RNA序列中的U或DNA序列中的T配对。基本互补的两个序列可以相互杂交，例如，在低严紧度、中严紧度、高严紧度或非常高的严紧度条件下。
如本文所使用的，与两个互补的核酸序列相关的术语“摆动碱基配对”指G与尿嘧啶U碱基配对而不是C，当所述核酸链的一条或两条包含核糖核酸碱基U时。
如本文所使用的，术语“在低严紧度、中严紧度、高严紧度或非常高的严紧度条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的操作指南可以在CurrentProtocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6(通过引用将其包含在本文中)中找到。所述参考书中描述了水溶液和非水溶液方法，可以使用任何一种方法。本文所指的特定杂交条件如下：(1)低严紧度杂交条件是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中在大约45C条件下杂交，然后在0.2X SSC，0.1％SDS溶液中在至少50C条件下洗涤两次(对于低严紧度条件，洗涤温度可以升至55C)；(2)中严紧度杂交条件是在6X SSC溶液中在大约45C条件下杂交，然后在0.2X SSC，0.1％SDS溶液中在60C条件下洗涤一次或更多次；(3)高严紧度杂交条件是在6X SSC溶液中在大约45C条件下杂交，然后在0.2X SSC，0.1％SDS溶液中在65C条件下洗涤一次或更多次；以及优选地(4)非常高的严紧度杂交条件是在0.5M磷酸钠，7％SDS溶液中在65C条件下杂交，然后在0.2X SSC，0.1％SDS溶液中在65C条件下洗涤一次或更多次。非常高的严紧度杂交条件(4)是合适的条件并且应该使用该条件，除非另有说明。
如本文所使用的，术语“治疗”(“treat”、“treating”或“treatment”)指患有疾病和/或经历疾病症状的受试者(例如，人类)，将，在一个实施例中，当对其施用治疗剂时比从不施用所述治疗剂时遭受的症状更轻和/或恢复更快。在一个实施例中，当治疗HIV感染或AIDS时，在HIV感染或AIDS得到有效治疗后，检测受试者体内HIV的试验将检测到更少的HIV。例如，诊断试验，例如PCR(例如qPCR)，在施用治疗剂对HIV感染或AIDS进行有效治疗后从受试者的生物样品中将检测到更少的HIV或检测不到HIV。治疗可以是，例如部分或全部缓解、改善、减轻、抑制或减小严重程度和/或降低发病率并且选择性地延迟发作一种或多种效果或症状的显现、特征，和/或特定感染的病因、疾病、病症和/或状况(例如HIV感染)。在一个实施例中，治疗针对的是没有表现出相关感染、疾病、病症和/或状况的某些迹象的受试者，和/或仅表现出所述感染、疾病、病症和/或状况的早期迹象的受试者。在一个实施例中，治疗针对的是表现出相关感染、疾病、病症和/或状况的一种或多种确定迹象的受试者。在一个实施例中，治疗针对的是诊断为感染HIV或患有AIDS的受试者。
如本文所使用的，术语“预防”(“prevent”、“preventing”或“prevention”)是指受试者(例如人类)不太可能患上所述病症(例如，HIV感染或AIDS)，如果受试者在暴露于引起病症的试剂，例如HIV，之前(例如1天，2天，1周，2周，3周，或1个月或更长)接受治疗剂。
如本文所使用的，术语“受试者”或“患者”可以是人类或非人类的动物。
shRNA簇和修饰型pri-miRNA簇的设计
如本文所使用的，“shRNA簇”是指位于同一核酸短距离内(例如，在大约10Kb内，例如，在大约5kb,4kb,3kb,2kb或1kb内)的编码shRNA样分子一组核苷酸序列。在一个实施例中，shRNA簇编码的shRNA样分子在共同的调控序列(例如，启动子)的控制下表达。在一个实施例中，所述shRNA样分子被转录为单一转录本。
如本文所使用的，“miRNA簇”是指位于同一核酸(例如，同一染色体)的短距离内(例如，在大约10Kb内，例如，在大约5kb,4kb,3kb,2kb或1kb内)的编码miRNA样分子的一组核苷酸序列。在一个实施例中，miRNA簇编码的修饰型pri-miRNA样分子在共同调节序列(例如，启动子)的调控下表达。在一个实施例中，所述修饰型pri-miRNA样分子被转录为单一转录本。
在例如Chan et al.(2012)Genomics 100(3):141–148中描述了定义和分析miRNA簇的示范性方法，通过引用将其全文包含于本文中。
本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)可以编码人工RNA分子，例如，干扰RNA或小的抑制RNA分子(RNAi分子)。RNAi分子包括，但不限于，在所有加工阶段的短干扰RNA(siRNA)，重复相关的siRNA(rasiRNA)，以及微RNA(miRNA)。这些分子可以具有不同的起源：siRNA可以是合成的或从具有碱基配对RNA的两条不同链的双链前体(dsRNA)加工而来；来自基因组重复序列的siRNA被称为rasiRNA；以及miRNA来自形成碱基配对发夹的单一转录本。siRNA和miRNA的碱基配对可以是完美的(即，完全互补)或不完美的，在双链区包括凸起。在哺乳动物细胞中利用RNAi分子的机制在下面详细描述。
RNAi可被用作哺乳动物细胞中基因功能的体外、活体外(ex vivo)或体内研究的有力工具并用于人类和兽医背景的治疗并作为基因功能体外和体内研究的工具。通过RNAi抑制靶标基因通常是序列特异性的。
不希望受到理论约束，相信至少有三种在哺乳动物细胞中利用RNAi的机制。第一是siRNA分子的细胞质传递，其是化学合成的或酶加工的dsRNA。使用标准的转染方法将这些siRNA引入细胞中。所述siRNA进入RISC中沉默靶标mRNA的表达。
第二机制是表达短发夹RNA(shRNA)的基因表达盒的核传递，例如，通过病毒载体。所述shRNA在RNAi途径的内源性触发器(Lu et al.,2005,Advances in Genetics 54:117-142)微干扰RNA(miRNA)上成型。常规的shRNA模仿pre-miRNA，由RNA聚合酶II或III转录为形成茎环结构的单链分子。一旦产生，它们就离开细胞核，被DICER酶切，并进入所述RISC中作为siRNA。
第三机制类似于第二机制，除了所述shRNA是在初级miRNA(例如，shRNA-miR)上而不是pre-miRNA转录本上(Fewell et al.,2006,Drug Discovery Today 11:975-982)成型。使用这种转录本产生更符合正常生理的降低毒性作用的shRNA。所述shRNA-miR首先被酶切产生shRNA，然后被DICER再次酶切产生siRNA。然后所述siRNA被并入所述RISC中用于靶标mRNA降解。
为了mRNA降解、翻译抑制或脱腺苷酸化，通过所述RISC装载复合物(RLC)将成熟miRNA或siRNA装入RNA诱导沉默复合物(RISC)中。随后，引导链引导所述RISC与靶标mRNA以序列特异的方式结合，RISC的Slicer组件水解连接所述靶标mRNA核苷酸与所述RNA引导链的核苷酸10和11的磷酸二酯键。Slicer与不同类别的小RNA一起形成RNAi效应复合物，即RISC的核心。因此，在一个实施例中，所述“引导链”是与所述“随从链”相对与RISC相关的双链RNA的一部分，其与RISC不相关。。
如本文所使用的，术语“修饰的pri-miRNA样分子”或“shRNA-miR分子”指微RNA嵌入的shRNA(基于miRNA的shRNA)，其中siRNA双链的引导链和随从链被并入存在的(天然的)pri-miRNA中或修饰的或合成的(设计的)pri-miRNA。当转录时，修饰的pri-miRNA样分子或shRNA-miRNA分子形成与天然pri-miRNA相同或相似的结构。所述修饰型pri-miRNA样分子或shRNA-miR分子随后可以被Drosha及其辅助因子加工成修饰型pri-miRNA或shRNA。所述修饰的pri-miRNA样分子或shRNA-miR分子可以具有与天然pri-miRNA的5’侧翼区、末端环区和/或3’侧翼区基本相同的5’侧翼区、末端环区和/或3’侧翼区。在一些实施例中，天然pri-miRNA的5’侧翼区、末端环区和/或3’侧翼区中可以引入一个或更多个插入、缺失和替换，从而产生修饰的pri-miRNA样分子或shRNA-miR分子的骨干。由于不希望受到理论约束，相信任何天然产生的pri-miRNA可以提供用于设计修饰型pri-miRNA样分子或shRNA-miR分子的骨干。例如，可以使用miRBase中描述的任何miRNA。miRBase Release 21：2014年6月在mirbase.org/pub/mirbase网站上公众可以获得，通过引用将其全部包含于本文中(Kozomara and Griffiths-Jones NAR 2014 42:D68-D73；Kozomara and Griffiths-Jones NAR 201139:D152-D157；Griffiths-Jones et al.NAR 2008 36:D154-D158；Griffiths-Jones et al.NAR 2006 34:D140-D144；Griffiths-Jones NAR 2004 32:D109-D111)。
初级miRNA和miRNA前体的典型结构特征，以及它们与miRNA生物合成和小干扰RNA/短发夹RNA设计之间的相关性在本领域是已知的，例如，Krol et al.(2004)TheJournal of Biological Chemistry,279,42230-42239中所描述的。
不希望被理论约束，相信miRNA基因的初级转录产物，pri-miRNA在细胞核中被核糖核酸酶Drosha加工成pre-miRNA(Lee et al.(2003)Nature 425,415-419)并通过Exportin-5输出所述细胞核(Lund et al.(2003)Science 303,95-98)。所述60–90-ntmiRNA前体形成茎环结构，并且细胞质核糖核酸酶III类的酶Dicer(Hutvágner et al.(2002)Science 297,2056-2060)从pre-miRNA发夹茎切除miRNA。Dicer，无论独立时或在Drosha的帮助下，切割所述前体的双链以形成双链的miRNA/miRNA*双链(Lee et al.(2003)Nature 425,415-419)并且通常只有一条链(例如，与随从链相对的引导链)积累，该链进入RNAi诱导沉默复合物(RISC)(Khvorova et al.(2003)Cell 115,209-216)。
如本文所使用的，“茎环结构”指具有二级结构的核酸，包含已知或预测形成双链或双倍(茎部或茎区)的核苷酸区域，其一侧通过主要为单链核苷酸(环部或末端环区)的区域连接。术语“发夹”和“折回”结构也可以用于指茎环结构。这样的结构为本领域公知并且所述术语一直以其在本领域的已知含义使用。如本领域已知的，二级结构不需要精确的碱基配对。因此，所述茎可以包含一个或更多个碱基错配或凸起。或者，所述碱基配对可以是精确的，即，不包含任何错配。所述茎区可以包含如本文所述的人工RNA分子(例如RNAi分子)。
如本文所使用的，末端环区指两侧与RNAi分子(例如，双链siRNA或miRNA/miRNA*)的引导链和随从链连接的区域。
如本文所述，茎区可以是由RNAi分子(例如，双链siRNA或miRNA/miRNA*)的引导链和随从链形成的并与末端环区连接的区域。所述引导链可以在所述末端环区的5’或3’端。同样的，所述随从链可以在所述末端环区的3’或5’端。所述茎区可以形成具有或不具有一个或更多个错配或凸起的双链。
如本文所使用的，5’侧翼区指紧邻所述末端环区5’端链(引导链或随从链)的区域。如本文所使用的，3’侧翼区指紧邻所述末端环区3’端链(引导链或随从链)的区域。本文所述的5’侧翼区或3’侧翼区，以及由5’和3’侧翼区形成的结构，可以具有天然pri-miRNA对应区域的一种或多种结构特征。不希望受到理论约束，相信在一个实施例中，5’侧翼区和/或3’侧翼区的存在将提高包含在本文所述的shRNA样分子或修饰型pri-miRNA样分子内的RNAi分子(例如，siRNA和miRNA)的产量。所述5’侧翼区或3’侧翼区的长度可以不同。本文实施例中描述了示范性的用于选择5’侧翼区或3’侧翼区的方法(例如，确定所述5’侧翼区或3’侧翼区的最佳长度)。
技术人员可以基于编码所述pri-miRNA的天然基因的特征来设计和表达shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)，或人工RNA分子(例如，RNAi分子)。具体地，所述pri-miRNA结构可用于表达shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)，或人工RNA分子(例如，RNAi分子)，通过使用各种RNA pol II表达载体，从pol II启动子表达质粒中表达，或者甚至使用pol III依赖型启动子，从pol III启动子表达质粒中表达。在一些实施例中，表达载体可以采用包含编码shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)，或人工RNA分子(例如，RNAi分子)的序列的表达盒。在一些实施例中，编码shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)，或人工RNA分子(例如，RNAi分子)的表达载体可以基于自我失活型慢病毒(SIN)载体骨架。在一些实施例中，编码shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)，或人工RNA分子(例如，RNAi分子)的表达载体可以基于CMV或MSCV载体骨架。通常，合适的载体骨架包括用于构建常规shRNA表达载体的载体骨架。在shRNA表达载体的构建中表达盒的使用示例，对于编码本公开的修饰的pri-miRNA样分子或shRNA-miR分子的表达盒的构建同样有用，可以在，例如Gottwein E.and Cullen B.Meth.Enzymol.427:229-243,2007,Dickenset al.,Nature Genetics,39:914-921,2007,Chen et al,Science 303:83-86,2004；Zengand Cullen,RNA 9:112-123,2003中找到，通过引用将其内容专门并入到本文中。
RNAi分子(例如siRNA或shRNA)设计的示范指南，在本领域是公知的，例如，Elbashir,et al.(2001)EMBO J 20:6877-6888,Brown et al.(2002)Ambion TechNotes 9(1):3-5；Sui,et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.US A 99(8):5515-5520；Lee etal.Nature Biotechnology 20:500-505；Yu et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(9):6047-6052；Paul et al.(2002)Nature Biotechnology 20:505-508；Brummelkamp etal.(2002)Science 296:550-553；Jacque,et al..(2002)Nature 418:435-438；Miyagishiet al.(2002)Nature Biotechnology 20:497-500；Paddison et al.(2002)GenesDevel.16:948-958中所描述的，通过引用将其内容专门并入到本文中。
本文所述的核酸分子可被修饰，例如，为增强体内稳定性。修饰的核酸包括包含核苷酸类似物的分子，包含在碱基、糖或骨架中具有添加、缺失和/或替换的那些分子；以及交联或其它化学修饰的分子。修饰的核苷酸可以位于所述核酸分子的部分内，或者贯穿所述核酸分子。例如，所述shRNA样分子可被修饰，或者在其5'端、3'端或两端的区域内，和/或在所述引导链、随从链或两条链内，和/或在伸出所述5'端、3'端或两端的核苷酸内包含修饰的核酸。参见美国专利号6,107,094和5,898,031；美国公开号2008/0249039,2007/0191294,2008/0213891,2007/0135372和2005/0020521；通过引用将其所有内容专门并入到本文中。
载体
本公开提供载体，所述载体包括本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)，例如，用于表达本文所述的shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)，或人工RNA分子(例如，RNAi分子)的核酸分子。
在一些实施例中，编码本文所述的shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)，或人工RNA分子(例如，RNAi分子)的表达载体，可以以自我失活型慢病毒(SIN)载体骨架为基础。在一些实施例中，编码shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子(例如，shRNA-miR分子)，或人工RNA分子(例如，RNAi分子)的表达载体可以基于CMV或MSCV载体骨架。示范性的载体骨架和用于构建适用于本文所述的shRNA簇或核酸分子(例如，人工miRNA簇)的表达载体的方法，以及将这样的表达载体引入各种哺乳动物细胞内的方法，可以在，例如Premsrurit P K.et al.,Cell,145(1):145-158,2011,Gottwein E.and CullenB.Meth.Enzymol.427:229-243,2007,Dickens et al.,Nature Genetics,39:914-921,2007,Chen et al.,Science 303:83-86,2004；Zeng and Cullen,RNA 9:112-123,2003中找到，通过引用将其内容专门并入到本文中。
所述载体可以是靶向载体，例如使用flp重组入允许单一拷贝整合的colA基因座。在小鼠基因组中的其它靶点包括但不限于ROSA26和HPRT。此外，转座酶可以用于将模拟物引入动物基因组或动物细胞中。参见Premsrurit P K.et al.,Cell,145(1):145-158,(2011)，通过引用将其内容专门并入到本文中。
构建载体以及从载体构建中表达序列的总体原则，以及制作和使用所述载体的方法，记载在，例如，国际公布号WO 09/055,724中，通过引用将其包含在本文中。
本文所述的人工RNA分子(例如，RNAi分子)可以通过载体表达以产生持续沉默和高产量以传递到几乎任何细胞类型。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。典型的病毒载体包括逆转录病毒，包括慢病毒，腺病毒、杆状病毒和禽病毒载体。使用病毒载体介导的RNAi传递不仅允许了稳定的单拷贝基因组整合，也避免了经细胞表面Toll样受体3(TLR3)的非序列特异性反应。
可以衍生出逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括，但不限于，Moloney小鼠白血病病毒，脾坏死病毒、劳式肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒，长臂猿白血病病毒，人类免疫缺陷病毒，骨髓增殖性肉瘤病毒，和乳腺肿瘤病毒。逆转录病毒质粒载体可用于转导包装细胞系形成产细胞系。可转染的包装细胞系的例子包括，但不限于，Miller,HumanGene Therapy 1:5-14(1990)中记载的PE501,PA317,R-2,R-AM,PA12,T19-14x,VT-19-17-H2,RCRE,RCRIP,GP+E-86,GP+envAm12和DAN细胞系，通过引用将其全部包含于本文中。所述载体可以通过本领域任何已知的方法转导包装细胞。产细胞系产生包含编码DNA复制蛋白的多核苷酸的传染性逆转录病毒载体颗粒。然后这样的逆转录病毒载体颗粒可用于在体外或体内转导真核细胞。所转导的真核细胞将表达DNA复制蛋白。
在一些实施例中，可以利用慢病毒和慢病毒载体改变细胞基因结构。这种方法的优点在于，通过使用细胞类型特异性pol II启动子实现的组织特异性表达，广泛的细胞类型，包括不发生细胞分裂的细胞以及难以感染逆转录病毒的细胞的高效转导，以及通过使用四环素应答型和其它诱导型启动子实现的可诱导的并且可逆的基因敲除。通过产生和使用慢病毒工程细胞表达人工RNA分子(RNAi分子)的方法在本领域是已知的。关于这种方法的示范性描述，参见，例如，Stegmeier F.et al.,Proc Acad Sci USA 2005,102(37):13212-13217,Klinghoffer et al.,RNA 2010,16:879-884，将其内容专门并入本文中。无复制能力的重组慢病毒的高效生产可以，例如，通过表达载体与使用商业化包装细胞系的包装质粒的共转染实现，例如TLA-HEK293.TM.，和包装质粒，可从Thermo Scientific/OpenBiosystems,Huntsville,Ala商购获得。
在一些实施例中，使用腺相关病毒(AAV)改变细胞基因结构。AAV是天然产生的需要辅助病毒来产生感染性颗粒的缺损病毒(Muzyczka,N.,Curr.Topics inMicrobiol.Immunol.158:97(1992))。也是能够将其DNA整合进不分裂细胞的少数病毒之一。包含小至300个碱基对的AAV的载体可被包装并且可以整合，但是外源DNA的空间仅限于约4.5kb。产生和使用这种AAV的方法在本领域是已知的。参见，例如，国际公布号WO 2015/031686,美国专利号7,927,585,7,906,111,7,261,544,6,221,646,5,589,377,5,478,745,5,474,935,5,436,146,5,436,146,5,173,414,和5,139,941。例如，AAV载体可以包括用于DNA复制、包装以及宿主细胞整合的所有必要序列。重组的AAV载体可被转染至辅助病毒感染的包装细胞内，使用任何标准技术，包括脂质体转染法、电穿孔法、磷酸钙沉淀法，等。适合的辅助病毒包括腺病毒、巨细胞病毒、牛痘病毒或疱疹病毒。一旦包装细胞被转染和感染，它们将产生包含多核苷酸构建的感染性AAV病毒颗粒。然后这些病毒颗粒被用于转导真核细胞。
通常可以使用任何用于将核酸构建引入细胞的方法。引入核酸的物理方法包括注射含有所述构建的溶液，由所述构建包被的粒子轰击、将细胞、组织样品或生物体浸泡在所述核酸溶液中，或在所述构建存在的环境中进行细胞膜电穿孔。包装进病毒颗粒的病毒构建可用于实现表达构建有效引入细胞以及所编码的shRNA的转录。可以使用本领域已知的其它方法将核酸引入细胞，例如脂质体介导的载体运输、化学介导的运输，例如磷酸钙，等等。因此shRNA编码核酸构建可以与具有一种或多种下列活性：增强细胞对RNA的摄入、促进双链退火、稳定退火链或其它增强靶标基因抑制，的组件一起引入。
内源性miRNA的表达受RNA聚合酶II(Pol II)启动子调控。报道显示，与RNA聚合酶III启动子相比，shRNA也最有效地被Pol II启动子驱动(Dickins et al.,2005,Nat.Genet.39:914-921)。因此，在一些实施例中，所述RNAi分子的编码序列受到诱导型启动子或条件表达系统，包括，但不限于，RNA聚合酶II型启动子的调控。可用于本发明背景的启动子的例子是四环素诱导型启动子(包括TRE-tight)、IPTG诱导型启动子、四环素反式激活因子系统以及反式四环素反式激活因子(rtTA)系统。也可以使用组成型启动子，同样可以是细胞或组织特异性启动子。许多启动子是普适的，因此它们在所有的细胞和组织类型中表达。一个实施例使用四环素应答启动子，该启动子是体外和体内研究中最有效的条件基因表达系统之一。关于诱导型shRNA的示范性描述，参见国际公布号WO 2004/029219，欧洲公布号EP 2166107，以及Fewell et al.,2006,Drug Discovery Today 11:975-982。
为便于监控靶标基因敲除，包含RNAi表达构建的细胞可以另外包含标记或报告构建，例如荧光的构建。所述报告构建可以表达标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、海肾荧光素酶绿色荧光蛋白、GFPmut2、GFPuv4、黄色荧光蛋白(YFP)，例如VENUS，增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、增强型蓝绿色荧光蛋白(ECFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)，以及来自香菇珊瑚的柠檬黄和红色荧光蛋白(dsRED)。其它合适的检测标记包括氯霉素乙酰转移酶(CAT)，发光蛋白例如荧光素酶lacZ(β-半乳糖苷酶)和辣根过氧化物酶(HRP)，胭脂碱合酶(NOS)，章鱼碱合酶(OCS)以及碱性磷酸酶。所述标记基因可以分别地引入包含所述shRNA构建的细胞(例如，共转染，等等)。或者，所述标记基因可以位于所述shRNA构建上并且所述标记基因的表达可以受到同一个或不同的翻译单元的调控，例如，通过IRES(内部核糖体进入位点)。在本发明的一方面，标记基因可以并入“传感器”表达载体中用于高通量方法中，用于确定特定基因的敲除效率并确定特定靶标基因最有效的靶标序列。这种方法，包括设计和使用质粒以及用于检测特定shRNA分子效力的报告构建，记载在，例如国际公布号WO2009/055724中，通过引用将其全部内容特别包含于本文中。
报告基因也可以是对药物具有抗性的那些基因，所述药物例如新霉素、氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲喋呤、草丁膦、嘌呤霉素、多西环素和四环素。报告基因也可以是致死基因，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)序列，以及编码多种毒素的序列，包括白喉毒素、破伤风毒素、霍乱毒素以及百日咳毒素。进一步的负选择标记是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因，用于在6-硫代鸟嘌呤中负选择。
为了便于在shRNA文库感染的复杂的细胞群中定量特定的shRNA，每个shRNA构建可以另外包含条码。条码是连接到每个shRNA的独特的核苷酸序列(通常为19个碱基)。通过芯片杂交，所述条码可用于监测每个shRNA的丰度(Fewell et al.,2006,Drug DiscoveryToday 11:975-982)。在一些实施例中，每个shRNA构建也包含独特的条码。关于shRNA群组分析中条码的使用，更多信息参见WO 04/029219,Bernards et al.,2006,Nature Methods3:701-706,和Chang et al.,2006,Nature Methods 3:707-714。
典型的靶标基因
本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)可用于表达能够靶向任何基因的人工RNA分子(例如，RNAi分子)。例如，所述靶标基因可以包括哺乳动物基因(例如，人类基因)或病毒基因。在一个实施例中，所述靶标基因是编码病毒受体或共受体(例如，HIV共受体，例如CCR5或CXCR4)的哺乳动物基因。在另一个实施例中，所述靶标基因是病毒基因，例如，HIV基因，例如Gag,Env,Tat,Pol2,Pol1或Vif。可以基于本文提供的或本领域已知的基因序列设计人工RNA分子(例如，RNAi分子)。
提供的示范性的CCR和HIV基因序列如下：
智人CC趋化因子受体5(CCR5)
CTGTTTAAAGACAAAAAGGCCCCAAAAAGGAGGGATGGCACGAAACACCCTCCAATATGGGCATGGAGTCTAGAGTGACAAAGTGATCAAAAGTTCATTTCCTATGGGGTGTCCGAATGTACTTAATAATAAAAAGAGAACAAGAGCCATGCAAACTGAGAGGGACAAAGTAGAAAGAGTAGCAGACACCAAGCAACTAAGTCACAGCATGATAAGCTGCTAGCTTGTTGTCATTATTGTATCCAGAACAACATTTCATTTAAATGCTGAAGAATTTCCCATGGGTCCCCACTTTCTTGTGAATCCTTGGGCTGAACCCCCCCGTCCTGAGTGGTTACTAGAACACACCTCTGGACCAGAAACACAAGAGTGGAGTAACACACACTGCAAAGCTGTGCTTCCTTGTTTCAGCCTGTGAATCCTCACCTTGTTTCCCATCTAGCCTATATTTTTCAAACTAACTTGGCCATAGAATCATGTCGTATTTAGGGTGGAAGCTGCCCCAGGTCTAGCGCGTCATTTAACAGATGAGGAAATGGAAGCTTGGGCAGTGGAAGTATCTTGCCGAGGTCACACAGCAAGTCAGCAGCACAGCGTGTGTGACTCCGAGCCTGCTCCGCTAGCCCACATTGCCCTCTGGGGGTGAGTATGTCTTCACATCCTCCAATACCCCTAATGACAGACAAACAGAACATGGCAAAGCCTCAGCTCTGCATGGTGAAAGTAAGAACCAGCAATTGCCACAAACAGAAATACAGTGTTGGTCCGGCAGCCTCCGGGGGTTCTGCACAAGTGGATTACCAGTGAATACAAGGCTATCTATCTTCCGAAAAACCAAAGTTGTATTTATGCTATCTATTTTCTATAAAATTTTATATTAATTTACTTGTCCTATTTTTGAACTCTTTCAAAAGCACACTTTATATTTCCCCTGCTTAAACAGTCCCCCGAGGGTGGGTGCCCAAAAGGCTCTACACTTGTTATCATTCCCTCTCCACCACAGGCATATTGAGTAAGTTTGTATTTGGGTTTTTTTAAAACCTCCACTCTACAGTTAAGAAAACTAAGGCACAGAGCTTCAATAATTTGGTCAGAGCCAAGTAGCAGTAATGAAGCTGGAGGTTAAACCCAGCAGCATGACTGCAGTTCTTAATCAATGCCTTTTGAATTGCACATATGGGATGAACTAGAACATTTTCTCGATGATTCGCTGTCCTTGTTATGATTATGTTACTGAGCTCTGTTGTAGCACAGACATATGTCCCTATATGGGGCGGGGGTGGGGGTGTCTTGATCGCTGGGCTATTTCTATACTGTTCTGGCTTTTCCCAAGCAGTCATTTCTTTCTATCCTCCAAGCACCAGCAATTAGCTTTACCTTTTCAGCTTCTAGTTTGCTGAAACTAATCTGCTATAGACAGAGACTCCGGTGAACCAATTTTATTAGGATTTGATCAAATAAACTCTCTCTGACAAAGGACTGCTGAAAGAGTAACTAAGAGTTTGATGTTTACTGAGTGCATAGTATGTGCTAGATGCTGGCCGTGGATGCCTCATAGAATCCTCCCAACAACTCATGAAATGACTACTGTCATTCAGCCCAATACCCAGACGAGAAAGCTGAGGGTAAGACAGGTTTCAAGCTTGGCAGTCTGACTACAGAGGCCACTGGCTTAGCCCCTGGGTTAGTCTGCCTCTGTAGGATTGGGGGCACGTAATTTTGCTGTTTGGGGTCTCATTTGCCTTCTTAGAGATCACAAGCCAAAGCTTTTTATTCTAGAGCCAAGGTCACGGAAGCCCAGAGGACATCTTGTGGCTCGGGAGTAGCTCTCTGCTGTCTTCTCAGCTCTGCTGACAATACTTGAGATTTTCAGATGTCACCAACCGCCAAGAGAGCTTGATATGACTGTATATAGTATAGTCATAAAGAACCTGAACTTGACCATATACTTATGTCATGTGGAAAATTTCTCATAGCTTCAGATAGATTATATCTGGAGTGAAGGATCCTGCCACCTACGTATCTGGCATAGTGTGAGTCCTCATAAATGCTTACTGGTTTGAAGGGCAACAAAATAGTGAACAGAGTGAAAATCCCCACTAAGATCCTGGGTCCAGAAAAAGATGGGAAACCTGTTTAGCTCACCCGTGAGCCCATAGTTAAAACTCTTTAGACAACAGGTTGTTTCCGTTTACAGAGAACAATAATATTGGGTGGTGAGCATCTGTGTGGGGGTTGGGGTGGGATAGGGGATACGGGGAGAGTGGAGAAAAAGGGGACACAGGGTTAATGTGAAGTCCAGGATCCCCCTCTACATTTAAAGTTGGTTTAAGTTGGCTTTAATTAATAGCAACTCTTAAGATAATCAGAATTTTCTTAACCTTTTAGCCTTACTGTTGAAAAGCCCTGTGATCTTGTACAAATCATTTGCTTCTTGGATAGTAATTTCTTTTACTAAAATGTGGGCTTTTGACTAGATGAATGTAAATGTTCTTCTAGCTCTGATATCCTTTATTCTTTATATTTTCTAACAGATTCTGTGTAGTGGGATGAGCAGAGAACAAAAACAAAATAATCCAGTGAGAAAAGCCCGTAAATAAACCTTCAGACCAGAGATCTATTCTCCAGCTTATTTTAAGCTCAACTTAAAAAGAAGAACTGTTCTCTGATTCTTTTCGCCTTCAATACACTTAATGATTTAACTCCACCCTCCTTCAAAAGAAACAGCATTTCCTACTTTTATACTGTCTATATGATTGATTTGCACAGCTCATCTGGCCAGAAGAGCTGAGACATCCGTTCCCCTACAAGAAACTCTCCCCGGTAAGTAACCTCTCAGCTGCTTGGCCTGTTAGTTAGCTTCTGAGATGAGTAAAAGACTTTACAGGAAACCCATAGAAGACATTTGGCAAACACCAAGTGCTCATACAATTATCTTAAAATATAATCTTTAAGATAAGGAAAGGGTCACAGTTTGGAATGAGTTTCAGACGGTTATAACATCAAAGATACAAAACATGATTGTGAGTGAAAGACTTTAAAGGGAGCAATAGTATTTTAATAACTAACAATCCTTACCTCTCAAAAGAAAGATTTGCAGAGAGATGAGTCTTAGCTGAAATCTTGAAATCTTATCTTCTGCTAAGGAGAACTAAACCCTCTCCAGTGAGATGCCTTCTGAATATGTGCCCACAAGAAGTTGTGTCTAAGTCTGGTTCTCTTTTTTCTTTTTCCTCCAGACAAGAGGGAAGCCTAAAAATGGTCAAAATTAATATTAAATTACAAACGCCAAATAAAATTTTCCTCTAATATATCAGTTTCATGGCACAGTTAGTATATAATTCTTTATGGTTCAAAATTAAAAATGAGCTTTTCTAGGGGCTTCTCTCAGCTGCCTAGTCTAAGGTGCAGGGAGTTTGAGACTCACAGGGTTTAATAAGAGAAAATTCTCAGCTAGAGCAGCTGAACTTAAATAGACTAGGCAAGACAGCTGGTTATAAGACTAAACTACCCAGAATGCATGACATTCATCTGTGGTGGCAGACGAAACATTTTTTATTATATTATTTCTTGGGTATGTATGACAACTCTTAATTGTGGCAACTCAGAAACTACAAACACAAACTTCACAGAAAATGTGAGGATTTTACAATTGGCTGTTGTCATCTATGACCTTCTCTGGGACTTGGGCACCCGGCCATTTCACTCTGACTACATCATGTCACCAAACATCTGATGGTCTTGCCTTTTAATTCTCTTTTCGAGGACTGAGAGGGAGGGTAGCATGGTAGTTAAGAGTGCAGGCTTCCCGCATTCAAAATCGGTTGCTTACTAGCTGTGTGGCTTTGAGCAAGTTACTCACCCTCTCTGTGCTTCAAGGTCCTTGTCTGCAAAATGTGAAAAATATTTCCTGCCTCATAAGGTTGCCCTAAGGATTAAATGAATGAATGGGTATGATGCTTAGAACAGTGATTGGCATCCAGTATGTGCCCTCGAGGCCTCTTAATTATTACTGGCTTGCTCATAGTGCATGTTCTTTGTGGGCTAACTCTAGCGTCAATAAAAATGTTAAGACTGAGTTGCAGCCGGGCATGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCATTCTAGGAGGCTGAGGCAGGAGGATCGCTTGAGCCCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATAGTGTGATCTTGTATCTATAAAAATAAACAAAATTAGCTTGGTGTGGTGGCGCCTGTAGTCCCCAGCCACTTGGAGGGGTGAGGTGAGAGGATTGCTTGAGCCCGGGATGGTCCAGGCTGCAGTGAGCCATGATCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGTGAGACCCTGTCTCACAACAACAACAACAACAACAAAAAGGCTGAGCTGCACCATGCTTGACCCAGTTTCTTAAAATTGTTGTCAAAGCTTCATTCACTCCATGGTGCTATAGAGCACAAGATTTTATTTGGTGAGATGGTGCTTTCATGAATTCCCCCAACAGAGCCAAGCTCTCCATCTAGTGGACAGGGAAGCTAGCAGCAAACCTTCCCTTCACTACAAAACTTCATTGCTTGGCCAAAAAGAGAGTTAATTCAATGTAGACATCTATGTAGGCAATTAAAAACCTATTGATGTATAAAACAGTTTGCATTCATGGAGGGCAACTAAATACATTCTAGGACTTTATAAAAGATCACTTTTTATTTATGCACAGGGTGGAACAAGATGGATTATCAAGTGTCAAGTCCAATCTATGACATCAATTATTATACATCGGAGCCCTGCCAAAAAATCAATGTGAAGCAAATCGCAGCCCGCCTCCTGCCTCCGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATGCTGGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGACATCTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGTTTTTCCTTCTTACTGTCCCCTTCTGGGCTCACTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTGGAAATACAATGTGTCAACTCTTGACAGGGCTCTATTTTATAGGCTTCTTCTCTGGAATCTTCTTCATCATCCTCCTGACAATCGATAGGTACCTGGCTGTCGTCCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACGGTCACCTTTGGGGTGGTGACAAGTGTGATCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTCTCTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACAGTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACATTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTAAAAACTCTGCTTCGGTGTCGAAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTTATCTTCACCATCATGATTGTTTATTTTCTCTTCTGGGCTCCCTACAACATTGTCCTTCTCCTGAACACCTTCCAGGAATTCTTTGGCCTGAATAATTGCAGTAGCTCTAACAGGTTGGACCAAGCTATGCAGGTGACAGAGACTCTTGGGATGACGCACTGCTGCATCAACCCCATCATCTATGCCTTTGTCGGGGAGAAGTTCAGAAACTACCTCTTAGTCTTCTTCCAAAAGCACATTGCCAAACGCTTCTGCAAATGCTGTTCTATTTTCCAGCAAGAGGCTCCCGAGCGAGCAAGCTCAGTTTACACCCGATCCACTGGGGAGCAGGAAATATCTGTGGGCTTGTGACACGGACTCAAGTGGGCTGGTGACCCAGTCAGAGTTGTGCACATGGCTTAGTTTTCATACACAGCCTGGGCTGGGGGTGGGGTGGGAGAGGTCTTTTTTAAAAGGAAGTTACTGTTATAGAGGGTCTAAGATTCATCCATTTATTTGGCATCTGTTTAAAGTAGATTAGATCTTTTAAGCCCATCAATTATAGAAAGCCAAATCAAAATATGTTGATGAAAAATAGCAACCTTTTTATCTCCCCTTCACATGCATCAAGTTATTGACAAACTCTCCCTTCACTCCGAAAGTTCCTTATGTATATTTAAAAGAAAGCCTCAGAGAATTGCTGATTCTTGAGTTTAGTGATCTGAACAGAAATACCAAAATTATTTCAGAAATGTACAACTTTTTACCTAGTACAAGGCAACATATAGGTTGTAAATGTGTTTAAAACAGGTCTTTGTCTTGCTATGGGGAGAAAAGACATGAATATGATTAGTAAAGAAATGACACTTTTCATGTGTGATTTCCCCTCCAAGGTATGGTTAATAAGTTTCACTGACTTAGAACCAGGCGAGAGACTTGTGGCCTGGGAGAGCTGGGGAAGCTTCTTAAATGAGAAGGAATTTGAGTTGGATCATCTATTGCTGGCAAAGACAGAAGCCTCACTGCAAGCACTGCATGGGCAAGCTTGGCTGTAGAAGGAGACAGAGCTGGTTGGGAAGACATGGGGAGGAAGGACAAGGCTAGATCATGAAGAACCTTGACGGCATTGCTCCGTCTAAGTCATGAGCTGAGCAGGGAGATCCTGGTTGGTGTTGCAGAAGGTTTACTCTGTGGCCAAAGGAGGGTCAGGAAGGATGAGCATTTAGGGCAAGGAGACCACCAACAGCCCTCAGGTCAGGGTGAGGATGGCCTCTGCTAAGCTCAAGGCGTGAGGATGGGAAGGAGGGAGGTATTCGTAAGGATGGGAAGGAGGGAGGTATTCGTGCAGCATATGAGGATGCAGAGTCAGCAGAACTGGGGTGGATTTGGTTTGGAAGTGAGGGTCAGAGAGGAGTCAGAGAGAATCCCTAGTCTTCAAGCAGATTGGAGAAACCCTTGAAAAGACATCAAGCACAGAAGGAGGAGGAGGAGGTTTAGGTCAAGAAGAAGATGGATTGGTGTAAAAGGATGGGTCTGGTTTGCAGAGCTTGAACACAGTCTCACCCAGACTCCAGGCTGTCTTTCACTGAATGCTTCTGACTTCATAGATTTCCTTCCCATCCCAGCTGAAATACTGAGGGGTCTCCAGGAGGAGACTAGATTTATGAATACACGAGGTATGAGGTCTAGGAACATACTTCAGCTCACACATGAGATCTAGGTGAGGATTGATTACCTAGTAGTCATTTCATGGGTTGTTGGGAGGATTCTATGAGGCAACCACAGGCAGCATTTAGCACATACTACACATTCAATAAGCATCAAACTCTTAGTTACTCATTCAGGGATAGCACTGAGCAAAGCATTGAGCAAAGGGGTCCCATATAGGTGAGGGAAGCCTGAAAAACTAAGATGCTGCCTGCCCAGTGCACACAAGTGTAGGTATCATTTTCTGCATTTAACCGTCAATAGGCAAAGGGGGGAAGGGACATATTCATTTGGAAATAAGCTGCCTTGAGCCTTAAAACCCACAAAAGTACAATTTACCAGCCTCCGTATTTCAGACTGAATGGGGGTGGGGGGGGCGCCTTAGGTACTTATTCCAGATGCCTTCTCCAGACAAACCAGAAGCAACAGAAAAAATCGTCTCTCCCTCCCTTTGAAATGAATATACCCCTTAGTGTTTGGGTATATTCATTTCAAAGGGAGAGAGAGAGGTTTTTTTCTGTTCTTTCTCATATGATTGTGCACATACTTGAGACTGTTTTGAATTTGGGGGATGGCTAAAACCATCATAGTACAGGTAAGGTGAGGGAATAGTAAGTGGTGAGAACTACTCAGGGAATGAAGGTGTCAGAATAATAAGAGGTGCTACTGACTTTCTCAGCCTCTGAATATGAACGGTGAGCATTGTGGCTGTCAGCAGGAAGCAACGAAGGGAAATGTCTTTCCTTTTGCTCTTAAGTTGTGGAGAGTGCAACAGTAGCATAGGACCCTACCCTCTGGGCCAAGTCAAAGACATTCTGACATCTTAGTATTTGCATATTCTTATGTATGTGAAAGTTACAAATTGCTTGAAAGAAAATATGCATCTAATAAAAAACACCTTCTA
HIV-1 Gag
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HIV-1 Pol
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HIV-1 Tat
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编码人类CCR5的典型核苷酸序列也可以，例如在Samson et al.Biochemistry35:3362-3367(1996),Raport et al.J.Biol.Chem.271:17161-17166(1996)；Combadiereet al.J.Leukoc.Biol.60:147-152(1996)；Zhang et al.AIDS Res.Hum.Retroviruses13:1357-1366(1997)中找到。通过引用将其全部内容专门并入本文中。
编码HIV(例如HIV-1))Gap Env,Tat,Pol2,Pol1或Vif的典型核苷酸序列也可以在HIV Sequence Compendium 2013Foley B,Leitner T,Apetrei C,Hahn B,Mizrachi I,Mullins J,Rambaut A,Wolinsky S,and Korber B,Eds.Published by TheoreticalBiology and Biophysics Group,Los Alamos National Laboratory,NM,LA-UR 13-26007中找到，通过引用将其全部内容专门并入本文中。
典型的修饰型pri-miRNA样分子
表4显示了典型的修饰型pri-miRNA样分子的核苷酸序列，其中以粗体显示成熟siRNA序列。表5总结了典型的5’侧翼区、引导链、末端环区、随从链和3’侧翼区序列。
表4
表5
药物组合物和试剂盒
本公开提供组合物，例如，药物组合物，其可包括本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞或病毒颗粒，与药学上可接受的载体一起制成。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何的和所有的生理相容的溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延缓剂，等等。所述载体可以适合于，例如静脉的、肌肉的、皮下的、非肠道的、直肠的、脊柱的或表皮的给药方式(例如，通过注射或输液)。在一些实施例中，所述shRNA簇、核酸分子(例如，人工miRNA分子)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞或病毒颗粒在所述药物组合物中的纯度至少是大约90％，例如，至少是大约95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,或99.9％。
本文所述的组合物，例如，药物组合物，可以包括shRNA簇、核酸分子(例如，人工miRNA簇)、细胞或病毒颗粒的“治疗有效量”、“预防有效量”或“诊断有效量”。
“治疗有效量”指按照一定剂量并持续必要的时间给药以达到预期治疗效果的有效量。根据例如疾病状态、年龄、性别和个体重量，以及所述抗体或抗体部分在个体内引起预期反应的能力等因素，核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞或病毒颗粒的治疗有效量可能会不同。治疗有效量也是指核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、细胞或病毒颗粒的治疗有益效果胜过任何毒副作用的量。相对于未治疗患者，“治疗有效剂量”通常抑制可测量参数至少大约20％，例如，至少大约40％，至少大约60％，或至少大约80％。可测量参数可以是，例如，病毒载量、发烧、头痛、肌肉或关节痛、皮疹、出血、降低的血小板水平，以及降低的血压。核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、细胞或病毒颗粒抑制可测量参数的能力可以在动物模型系统中评估，预测减小、抑制或预防HIV感染的有效性。或者，组合物的这一性质可以通过测验核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、细胞或病毒颗粒抑制或降低HIV生存能力的能力(例如，通过本文所述的体外实验)来评估。
“预防有效量”指按照一定剂量并持续必要的时间给药以获得预期预防结果的有效量。通常，由于预防剂量用于患病前或疾病早期，因此，所述预防有效量将小于所述治疗有效量。
“诊断有效量”指按照一定剂量并持续必要的时间给药以获得预期诊断结果的有效量。通常，诊断有效量是可在体外、活体外或体内诊断病症(例如，HIV感染或AIDS)的量。
包含本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞或病毒颗粒的试剂盒同样属于本公开的范围。所述试剂盒可以包含一种或多种其它元件，包含使用说明；其它试剂，例如标记(例如放射性标记)，治疗剂，或用于螯合或者连接核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞、病毒颗粒的试剂；用于制备核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞或病毒颗粒用药的设备或其它材料；药学上可接受的载体；以及用于向受试者给药的设备或其它材料。
治疗或预防的方法
本公开提供用于抑制HIV感染的方法，例如，使用本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞或病毒颗粒。本公开也提供用于治疗或预防HIV感染和/或AIDS的方法，例如使用本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞或病毒颗粒。
本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、细胞或病毒颗粒，可以制成对受试者(例如人类或兽医的受试者)体内给药。这样制成的组合物可以包含本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)、细胞或病毒颗粒，设计成表达人工RNA分子(例如，RNAi分子)以降低靶标基因的表达，例如本文所述的靶标基因。组合物也可以包含药学上可接受的赋形剂。
例如，人工RNA分子可以在体内多种细胞类型中可靠地表达。在一些实施例中，将表达人工RNA分子的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)引入(例如，转导或转染)细胞中，例如，从受试者分离的细胞。在一些实施例中，对受试者施用所述转导或转染的细胞，从而治疗症状。可以通过多种机制使转导或转染的细胞有益于治疗HIV和AIDS。例如，在某种程度上，症状可以由表达不良基因的细胞群引起。这些细胞可以被融化并被施用的表达能够降低不良基因表达的人工RNA分子的细胞替换。这里所述的人工RNA分子可以靶向基本上任何基因，所述任何基因的表达下降能够帮助治疗或预防HIV感染和/或AIDS。
可以使用任何合适的细胞。例如，转染或转导的细胞可以是基本上任何类型的用于植入受试者体内的细胞。含有靶标基因的细胞可以是生殖系的或体细胞的、全能的或多能的，分裂的或不分裂的，实质的或上皮的，永生的或转化的，等等。所述细胞可以是干细胞或分化细胞。转导或转染后，可以给受试者施用干细胞，或者培养干细胞产生分化的干细胞(例如，培养胚胎干细胞产生神经、造血或胰腺干细胞)或培养产生分化细胞。
干细胞可以是从供体中新获得的干细胞，并且在一些实施例中，所述干细胞是自体干细胞。干细胞也可以来自体外扩增建立的干细胞系。合适的干细胞包括胚胎干细胞和成人干细胞，无论是全能的、万能的、多能的、还是较弱发育能力的。干细胞可以来自哺乳动物，例如啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)、灵长类动物(例如猴子、黑猩猩或人类)、猪，或反刍动物(例如奶牛、绵羊和山羊)。小鼠胚胎干细胞的例子包括：M.Qiu et al.,Genes Dev 9,2523(1995)中所述的JM1 ES细胞系，G.Friedrich,P.Soriano,Genes Dev 5,1513(1991)中所述的ROSA系，以及美国专利号6,190,910中所述的小鼠ES细胞。许多其它的小鼠ES系可以从杰克逊实验室(美国缅因州巴港)获得。此外，胚胎干细胞的例子记载在下述专利和公开的专利申请中：US 8,647,872,US 6,245,566；US 6,200,806；US 6,090,622；US 6,331,406；US 6,090,622；US 5,843,780；US 2002/0045259；US 2002/0068045。人类成人干细胞的例子包括下述专利和专利申请中记载的那些：US 8,999,706,US 7,259,011,US 6,387,367；US 6,265,175；US 6,242,252；US 6,184,035；US 6,129,911；US 5,968,829；US 5,958,767；US 5,958,767；US 5,958,767；US 5,958,767；US 5,958,767；US 5,789,246；US5,766,948；US 5,486,359；US 2014/0170122,US 2002/0016002；US 2002/0076400；US2002/0098584；以及，例如国际公布号WO 01/11011。制造和使用造血干细胞的例子记载在，例如，美国专利号US 8,617,885,US 8,383,404,7,927,785,US 7,807,464,US 7,767,453,US 5,763,197，美国公布号2012/0071397，国际公布号WO 1996/033281和WO 1996/022693中。在一些实施例中，合适的干细胞可以来自细胞融合或脱分化过程，例如美国公布号US2002/0090722，国际公布号WO 02/38741,WO 01/51611,WO 99/63061,和WO 96/07732所记载的。
转导或转染的细胞也可以用于制造治疗患者的药物。药学上可接受的赋形剂的例子包括细胞能够附着的基质、支架或其它基层(任选地形成实心或空心珠、管或膜)，以及有益于方便给药的试剂(例如，缓冲液和盐)，保存细胞的试剂(例如，螯合剂如EDTA、EGTA，或季铵或其它抗生素)，或促进移植的试剂。细胞可以被封装在膜或微胶囊中。细胞可被置于由海藻酸钠和聚丙烯酸酯组成的微胶囊中。(Sugamori et at(1989)Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs 35:791；Levesque et al.(1992)Endocrinology130:644；和Lim et al.(1992)Transplantation 53:1180)。
另外的封装细胞的方法在本领域是已知的。(Aebischer等.美国专利号4,892,538；Aebischer等.美国专利号5,106,627；Hoffman et al.(1990)Expt.Neurobiol.110:39-44；Jaeger et al.(1990)Prog.Brain Res.82:4146；以及Aebischer et al.(1991)J.Biomech.Eng.113:178-183,美国专利号4,391,909；美国专利号4,353,888；Sugamori etal.(1989)Trans.Am.Artif Intern.Organs 35:791-799；Sefton et al.(1987)Biotehnol.Bioeng.29:1135-1143；以及Aebischer et al.(1991)Biomaterials12:50-55)。
本领域技术人员可以基于细胞类型和治疗目的来选择细胞组合物的植入位置。典型的植入位置包括静脉或动脉内给药、肝脏给药(经门静脉注射)、腹膜腔、肾被膜或骨髓给药。
在一些实施例中，本公开提供核酸的修饰和修饰型核酸的传递(例如，活体外或体内的传递)。这些修饰型核酸可以包括本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)。这些修饰型核酸也可以包括，例如，shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子和人工RNA分子，如本文所述的。修饰型核酸的修饰和传递，包括含有RNA的修饰型核苷酸，例如那些在核糖骨架的2'-OH基团上具有化学修饰的，例如2'-O-甲基(2'OMe),2'-氟(2'F)取代，以及那些包含2'OMe，或2'F，或2'-脱氧，或“锁核酸”(LNA)修饰的，可以按照美国专利号6,627,616,6,897,068,6,379,966；美国专利申请公开号US.2005/0107325,US 2007/0281900和US2007/0293449；以及Vorhies and Nemunaitis J J,Methods Mol Biol.2009；480:11-29,Lopez-Fraga M et al.,Infect Disord Drug Targets.2008December；8(4):262-73,Watts et al.,Drug Discov Today.2008October；13(19-20):842-55,Lu and Woodle,Methods Mol Biol.2008；437:93-107,de Fougerolles et al.,Hum Gene Ther,2008February；19(2):125-32,Rossi J J,Hum Gene Ther.2008April；19(4):313-7,Belting M and Wittrup A.Methods Mol Biol.2009；480:1-10,Pushparaj et al.,J.Dent.Res.2008；87:992-1003,Shrivastava and Srivastava,BiotechnolJ.2008March；3(3):339-53,和Raemdonck K.et al.,Drug Discov Today,2008November；13(21-22):917-31,CastanottoD&Rossi J J,Nature 2009January；457:426-433,Davis Met al.,Nature 464,1067-1070(15April 2010)中所记载的来实现，通过引用将其内容全部包含于本文中。
联合疗法
本文所述的核酸分子(例如shRNA簇或人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞、病毒颗粒和组合物(例如药物组合物)可与其它疗法联合使用。例如，所述联合疗法可以包括与一种或多种另外的治疗剂(例如，抗HIV药剂、疫苗或增强免疫反应的药剂)共同制成和/或共同给药的本文所述的核酸分子(例如shRNA簇或人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞和组合物。这种联合疗法可以有利地利用更低剂量的所施用的治疗剂，由此避免与多种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。
如本文所使用的，“联合”指在受试者承受疾病(HIV感染或AIDS)痛苦之前或过程中对所述受试者实施两种(或更多种)不同的疗法。在一个实施例中，实施两种或多种预防性疗法，例如，在所述受试者感染HIV或确诊为HIV之前。在另一个实施例中，在所述受试者已经感染HIV或确诊为HIV感染或AIDS之后实施两种或多种疗法。在一些实施例中，当一种疗法的实施还在进行时，开始实施第二种疗法，因此存在重叠。这在本文中有时被称为“同时的”或“并行的实施”。在其它实施例中，一种疗法的实施在另一种疗法的实施开始前结束。在一些无论是哪种情况的实施例中，所述疗法由于联合使用而更加有效。例如，第二种疗法更加有效，例如，第二种疗法的减少会出现等价的效果减小，或者第二种疗法减少了症状加重，如果在缺少第一种疗法的情况下实施第二种疗法就会出现这种情况，或者第一种疗法出现类似的情况。在一些实施例中，这种实施使症状减轻，或者使其它与感染或病症相关的参数比实施一种疗法而不实施另一种疗法所观察到的参数更大。两种疗法的效果可以是部分加性的，完全加性的或大于加性的。这种实施可以是所实施的第一种疗法的效果在第二种疗法实施时还可以检测到。
可以与本文所述的shRNA簇、核酸分子(例如，人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞、病毒颗粒和组合物(例如药物组合物)结合的典型的HIV或AIDS疗法包括，但不限于，非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)(例如，奈韦拉平、地拉韦啶、依法韦仑、依曲韦林、利匹韦林、IDX899、RDEA-428和lersivirine)、核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)(例如，齐多夫定、去羟肌苷、扎西他宾、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨，或恩替卡韦)、核苷酸逆转录酶抑制剂(NtRTI)(例如，替诺福韦)、蛋白酶抑制剂(PI)(例如，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、那非那韦、安泼那韦、洛匹那韦、福沙那韦、阿扎那韦、替拉那韦，或达如那韦)、融合抑制剂(例如，恩夫韦肽)、CCR5拮抗剂(也称为进入抑制剂)(例如，马拉维若)，整合酶链转移抑制剂(INSTI)(例如，埃替拉韦、多替拉韦、雷特格韦)，或其任何的组合物。
在一些实施例中，另外的治疗药剂是第二shRNA簇、核酸分子(例如，人工miRNA簇)、人工RNA分子(例如，RNAi分子)、细胞、病毒颗粒或组合物(例如药物组合物)，如本文所述的。
筛选方法
包含本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)的构建，或这种构建的库，可被引入完整的细胞/生物体中并且可以用于筛选，例如高通量筛选(HTS)。例如，利用这种构建或库可以确定或研究潜在的药物靶点。可以使用不同程度影响靶标基因表达的一组核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)。特别是，可以用于测量基因表达降低的程度与特定表型之间的任何相关性。
可以使用本领域已知的方法建立核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)库。例如，核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)库可以基于现有的库，例如现有的shRNA库。如应用于常规shRNA库的，现有的用于表达盒的设计和构建、载体和载体骨架的选择和修饰、库的构建、靶标序列的设计以及库的验证的材料和方法可以应用于本公开包含shRNA簇或核酸分子(例如，人工miRNA簇)的库的构建。作为非限制性例子，这样的材料和方法记载在Chang et al.Nature Meth.3:707-714(2006)，国际公布号WO/2009/055724中，通过引用将其内容特别包含于本文中。
在一些方面，本公开提供用于体内筛选/评估基因功能的方法。包含用于表达shRNA样分子、修饰型pri-miRNA样分子或人工RNA分子的构建的细胞可被引入动物体内并且可以评估表型以确定降低的基因表达的作用。完整的动物可以产生自这种包含本文所述的核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)的构建的细胞(例如，ES细胞)。可以评估动物的表型。所述动物可以是基本上任何实验性的驯服的动物，例如非人类的灵长类动物、啮齿类动物、犬科动物、猫科动物，等等。也可以产生表达核酸分子(例如，shRNA簇或人工miRNA簇)库中不同成员的动物群体。可以评估这种动物的表型以确定，例如，靶标基因对疾病表型的影响、干细胞分化、药物敏感性、对病毒感染的易感性，或任何其它的感兴趣的表型。
实施例
实施例1：复用七个基于miRNA的shRNA以抑制HIV复制
本实施例描述了使用来自多个内源性miRNA的优化的侧翼序列表达大量的shRNA-miR的策略。发现所述miRNA双链的侧面连接30个核苷酸的序列满足shRNA-miR的有效加工。多个shRNA串联插入，每一个包含最小的来自不同miRNA的侧翼序列。转染细胞的深度测序显示了单个shRNA-miR的精确加工以及它们的表达并没有随着与启动子之间的距离而降低。此外，每个shRNA与其单一表达的配对物一样有功能活性。这个系统用于表达一个靶向CCR5的shRNA-miR和六个靶向HIV-1基因组的shRNA-miR。所述慢病毒构建用HIV-1包膜假型，以允许转导休眠的和激活的初级CD4T细胞。与一个shRNA-miR不同，所述七个shRNA-miR转导的T细胞在体外几乎阻止了HIV-1感染。此外，当来自HIV-1阳性个体的PBMC被转导并植入NOD/SCID/IL-2Rγc-/-小鼠(Hu-PBL模型)中时，观察到内源性HIV-1复制的有效抑制伴随着CD4T细胞数量的恢复。因此，我们的多重shRNA似乎为HIV-1感染提供了有前途的基因治疗方法。
多重shRNA-miR的设计
常规shRNA和shRNA-miR之间的本质区别在于前者类似于被细胞质中的Dicer加工的pre-miRNA，而后者类似于首先被细胞核中的Drosha/DGCR8加工的pri-miRNA(Han etal.,Genes Dev 18:3016–3027；Yi et al.Genes Dev17:3011–3016；ChendrimadaNature436:740–744)。虽然是基于在体外加工所选择的miRNA，但是有建议认为Drosha从所述下部茎段单链RNA连接处切下所述pri-miRNA～11个核苷酸，这不可能总是适用于所有的miRNA，尤其是在体内(Ma et al.,Proc Natl Acad Sci USA 110:20687–20692)。此外，仅包括这些侧翼序列是否允许pri-miRNA加工还不清楚。因此，测试了不同miRNA加工所需要的最小的侧翼序列。从具有150个核苷酸侧翼序列的miR-30a骨架开始，所述侧翼序列被缩短至30、20和15个核苷酸并测试其对miRNA功能的影响。为此，表达具有不同侧翼长度的miRNA的质粒与包含Rluc的3’UTR内相关靶点的psiCHECK载体一起共转染并在24h后通过双荧光素酶试验测定活性。图1A显示了具有150个核苷酸侧翼序列的pri-miR-30a的功能与具有30或20个核苷酸侧翼序列的pri-miR-30a的功能相似，而具有15个核苷酸侧翼序列的pri-miR-30a略微减弱了功能。同样测试了具有60或30，20，或15个核苷酸侧翼序列的pri-miR-150的功能并且没有检测到60和30个核苷酸侧翼之间的不同(图1B)，暗示了30个核苷酸侧翼序列足以确保适当的Drosha加工以保持miRNA的完整功能。因此，30个核苷酸侧翼用于所有的miRNA骨架。
复用七个shRNA-miR进入单一构建中而不减小单个shRNA的功能。多个shRNA不能使用相同的miRNA骨架的串联重复序列表达，因为侧翼序列的同源重组很可能消除所述插入。将人工miRNA簇设计成不同miRNA骨架下的多重shRNA-miR。首先，确定了相互之间具有或不具有间隔序列的2个shRNA-miR的串联表达不影响所述shRNA的功能，表明2个串联的miRNA可直接结合。因此，表达不同数量(1,2,4和7)的shRNA-miR，每一个具有不同的EF-1启动子控制下的miRNA骨架(在单个miRNA之间没有任何间隔序列)，如图1C所示。选取已经显示出常规shRNA对CCR5基因以及HIV-1基因组中高度保守区域的靶标功效的shRNA序列。
首先测试所述多重shRNA-miR中的shRNA-miR是否被正确地加工以及它们的表达是否受到每个单独的shRNA-miR相对于所述启动子的位置的影响。用深度测序确定产生自单个、2个，4个或7个shRNA-miR的siRNA。为此，用单个、2个，4个或7个shRNA-miR表达构建中的任何一个转染293T细胞，克隆48h后分离的小RNA并深度测序。在所有的构建中检测每个单元的siRNA。此外，对主要读数的分析显示精确的预期的6/7shRNA加工(图7)。只在1中(Env)，有两种形式，一个如预期的，而另一个具有1bp的改变。然而，众所周知，即使用一些内源性miRNA，备选加工也会出现。因此，产生的siRNA似乎是正确的。
读数频率的分析显示所述多重shRNA-miR中的单个shRNA-miR的表达没有受到所述shRNA-miR相对于所述启动子的位置的影响。虽然与单一的shRNA-miR相比，小RNA读数从7个shRNA-miR构建降低了3–8倍(图8，表1)，但是所述构建(CCR5,Gag,Env,Tat,Pol1,Pol2和Vif)中所有siRNA的读数明显高于含量最多的内源性miRNA、miR-16之一。因此，所述7个shRNA中的每个的水平似乎足以抑制所有靶基因。
表1.转染细胞中主要的小RNA读数
接下来，测试所述多重shRNA-miR中的单个shRNA-miR的功能。为此，将表达单一或多重shRNA-miR的质粒与包含Rluc的3’UTR内相关shRNA-miR靶点的psiCHECK载体一起共转染并在24h后通过双荧光素酶试验测定活性。与仅表达单个shRNA-miR的质粒相比，所有多重载体(表达2，4，7shRNA-miR)中的所有单个shRNA-miR显示出相似的功能(图2A)。这种情况出现在所有用于转染的不同浓度的质粒中。对单一、双重和多重shRNA-miR构建的毒性也进行了评估。如Annexin V染色所确定的，用多重shRNA-miR表达构建转染Jurkat细胞，对细胞不产生毒性(图2B)。
不同的shRNA-miR表达盒(表达1，2，4和7shRNA)被克隆进慢病毒载体中，所述慢病毒载体也表达mCherry或ZsGreen作为标记。所述载体用HIV-1包膜假型并将产生的慢病毒用于转导初级CD4T细胞。具有shRNA-miR的慢病毒滴度比具有单一shRNA-miR的慢病毒滴度低大约10倍，但通过超速离心浓缩后仍然足以进行实验。
为监测毒性，慢病毒转导后培养细胞4，7和12天，接着通过流式细胞仪检测mCherry+细胞的百分比。虽然mCherry表达水平在不同构建之间不同，但对于任何构建而言mCherry表达水平没有随时间下降(图9)。转导后第2天和第4天还通过MTS试验测试了所述转导的CD4T细胞的细胞活力。没有观察到转导细胞的活力降低(图2C)。因此，这些数据表明单一和多重shRNA-miR构建在体外是稳定的并且对细胞活力没有明显的不良影响。
shRNA-miR靶向细胞系中CCR5和多个HIV-1基因的功能
在TZM-bl细胞中测试了单一、双重和多重shRNA-miR构建敲除CCR5的能力。用编码2，4和7个shRNA-miR的慢病毒转导细胞并在48h后通过流式细胞仪检测CCR5的表达。如图3A所示，与只表达mCherry的慢病毒转导的细胞相比，所有3个构建能够有效沉默CCR5的表达。为检测抗病毒shRNA-miR的效果，用X4嗜性HIV-1分子克隆pNL4-3质粒与2，4或7shRNA-miR编码载体一起共转染293T细胞。通过感染编码Tat依赖型荧光素酶的TZM-bl细胞检测48h后获得的培养上清液的病毒复制。如预期的，来自CCR5shRNA-miR转染细胞的上清液与对照相比对病毒水平没有影响，而来自抗病毒shRNA处理样品的上清液显示出越来越低(7shRNA-miR<4shRNA-miR<2shRNA-miR)的感染水平，暗示了抗病毒shRNA-miR也是有功能的(图3B)。为评估慢病毒转导背景下CCR5和抗病毒shRNA-miR的抗病毒效果，用编码1,2,4或7shRNA-miR的HIV-1假型慢病毒转导TZM-bl细胞并在24h后用X4嗜性的NL4-3或R5嗜性的HIV-1Bal以0.01
的MOI感染。感染后9天检测培养上清液中的p24水平。同样，CCR5shRNA-miR转导对X4嗜性病毒没有影响，但抑制了50％的R5嗜性病毒，而抗病毒shRNA-miR显示出增强的抑制水平，7shRNA-miR几乎消除了X4嗜性和R5嗜性病毒的感染(图3C)。因此，人工miRNA簇似乎能够表达多个具有功能的shRNA-miR并因此可以作为抗HIV-1治疗的优秀候选。
休眠T细胞可被HIV-1-env假型shRNA-miR表达慢病毒有效转导
确定了多重shRNA-miR是有功能的，接下来检测CCR5仅相对于CCR5+6抗病毒shRNA-miR在活化的和休眠的初级CD4T细胞中抵抗HIV-1感染的效力。其目的在于开发出赋予所有T细胞HIV-1抗性的方法，不管T细胞的激活状态。因此，首先检测表达mCherry的VSV-G和HIV-1env假型慢病毒的转导效率。在使用PHA激活之前或激活2天后转导初级CD4T细胞并在转导后2天检测mCherry的表达。流式细胞检测分析显示VSV-G和HIV-1包膜假型病毒转导活化T细胞具有相等的效率，而只有后者能够实现休眠T细胞的有效转导(图10)。因此，将HIV-1包膜假型病毒用于检测抗病毒效力。为评估所述shRNA-miR，用表达非shRNA-miR、只表达CCR5shRNA-miR，或表达CCR5+6抗病毒shRNA-miR的HIV-1假型慢病毒转导休眠的或活化的CD4T细胞。在这个试验中，使用表达GFP的慢病毒监测转导的细胞。48h后，用HIV-1株NL4-3或Bal感染细胞培养物(感染前用PHA活化转导的休眠T细胞)。通过p24ELISA法检测第0,3,9和15天收集的培养上清液，得到释放的病毒水平。在活化的和休眠的CD4T细胞中所述三个LV构建之间转导水平相当(图4A-4B)。同样，类似于获得的TZM-bl细胞结果，CCR5shRNA-miR只对R5病毒有效，而7shRNA-miR表达LV在活化的和休眠的T细胞中几乎能够阻止X4和R5嗜性病毒的感染(图4A-4B)。此外，在受保护的CCR5shRNA-miR和7shRNA-miR转导的培养细胞中，表达GFP的细胞随时间增加。存活的GFP阳性细胞的高度富集以及在第15天实验结束时保存完好的细胞活力表明所述shRNA-miR转导细胞在HIV-1感染后的明显生存优势(图4A-4B)。得出的结论是用HIV-1包膜假型的7shRNA-miR表达慢病毒提供了在初级CD4T细胞中赋予HIV-1抗性的方法。
用HIV-1en-假型7shRNA-miR编码慢病毒转导的HIV阳性供体PBMC中HIV-1复制的抑制
除了shRNA-miR防止感染的有效性以外，接下来测试了已经感染的细胞中HIV-1的复制是否能够得到抑制。为此，采用从未经治疗的或处于抗逆转录病毒治疗中的HIV-1阳性个体获得的PBMC。由于在这种情况下，主要依赖抗病毒shRNA-miR，因此使用只靶向Tat的shRN-miR或7shRNA-miR检测效力。首先，通过流式细胞仪确定mCherry表达从而确保所有载体的转导效率是相似的。为检测shRNA效力，来自HIV-1阳性供体的PBMC中的CD8T被耗尽，用shRNA-miR编码慢病毒转导，并在第二天活化(图5A)。培养细胞31天并在第0,3,15和31天确定p24抗原水平。如图5B所示，在对照慢病毒(表达非shRNA-miR)转导的细胞中，HIV-1复制在第15天出现峰值并下降至第31天，可能是因为感染导致CD4T细胞减少所致。相反，在7shRNA-miR转导的培养物中，在所有4个供体PMBC中HIV-1复制到第15天大大减少并且到第31天，几乎检测不到p24，即使所述培养物包含健康的细胞。在仅Tat shRNA-miR转导的细胞中，在第15天所有4个供体PMBC中的HIV-1复制减少。然而在随后的时间点，Tat shRNA-miR转导的细胞培养物显示出增加的HIV-1复制(图5B)，暗示了Tat shRNA-miR抗病毒活性的不足或逃逸突变体的出现。通过对上清液中存在的病毒的Tat shRNA-miR靶标区域进行测序来检测HIV-1逃逸突变体的存在。4个供体中，来自两个供体的培养物显示了病毒逃逸突变体的出现。供体2在Tat靶标序列(图5C)的18位核苷酸上具有突变而供体4在4位核苷酸上具有突变。在7shRNA-miR处理的培养物中，病毒不能被收回用于进行类似的研究。
多重基于miRNA的7shRNA-miR防止CD4T细胞丢失以及用HIV-1+患者的PBMC重建的Hu-PBL小鼠中的HIV-1抑制。
基因修饰的T细胞的移植被尝试作为HIV-1感染个体的潜在疗法(Surabhi andGaynor(2002).J Virol76:12963–12973)。因此，接下来通过在Hu-PBL小鼠模型中的临床前测试来检测7shRNA-miR处理细胞的再输注是否提供了治疗的可能性。为此，选择2个HIV-1感染个体，一个处于抗逆转录病毒治疗中(供体#1，病毒载量<20拷贝/ml；CD4/CD3比例＝0.34)而另一个未经治疗(供体#4，病毒载量67,420；CD4/CD3比例＝0.13)。用表达非shRNA-miR(mock)，只表达TatshRNA-miR或7shRNA-miRs的HIV-1env-假型慢病毒转导PBMC并注入NOD/SCID/IL2-Ryc-/-小鼠中以评估它们灌输、扩增和抵抗HIV-1复制的能力。在第7，28和42天监测CD4T细胞数量并在第42天监测血清p24水平(图6A)。在仅用慢病毒(无shRNA-miR)转导的T细胞重建的小鼠中，对于两个供体，在所有的测试时间点极少发现CD4T细胞并且细胞数量随着时间推移逐渐下降，与HIV-1介导的成了内源性病毒有效感染的异种活化CD4T细胞的减少一致。在仅Tat shRNA-miR转导的群体中，到第28天CD4T细胞扩增(在处于抗逆转录病毒治疗中的供体#1中特别明显)，但到第42天下降，表现出单一抗病毒shRNA-miR的起始有效性而在随后的时间点失效。相反，在7shRNA-miR转导的群体中，对于两个供体，CD4T细胞持续增加到第42天，构成了PBMC的87％(处于抗逆转录病毒治疗中的供体#1)和52％(未经治疗的供体#4)。相应地，在无shRNA-miR对照中的病毒载量最高，在仅TatshRNA-miR群体中的病毒载量居中，在7shRNA-miR群体中的病毒载量最低(图6B，C)。总之，这些结果显示了多重基于miRNA的7shRNA能够控制HIV-1复制并逆转CD4T细胞的丢失，因此提供了潜在的临床可行的治疗策略。
总的来说，建立了利用来自不同内源性miRNA的最小侧翼序列轻松表达大量shRNA-miR的通用平台，以表达独特的shRNA-miR。使用这个系统，表达了靶向CCR5和HIV-1基因组中六个区域的七个shRNA-miR并且结果显示这在体外以及Hu-PBL小鼠体内提供了更好的保护。
为了在治疗中以任何有意义的方式赋予HIV-1抗性，需要同时沉默宿主因子和HIV-1基因。然而，已知HIV-1通过突变所述靶点来逃逸，因此，重要的是能够靶向多个、高度保守的病毒区域。如果七个shRNA同时表达，通过确保至少四个shRNA对任何指定病毒株都有活性，使其能够覆盖几乎所有的HIV-1株。
对pri-miRNA的Drosha加工的认识加深将实现shRNA-miR的合理设计。虽然之前报道Drosha切割出现在自下部茎段ssRNA连接点～11nt(Han et al.Cell 125:887–901)，最近发现微处理器测量距离下部和上部茎段ssRNA连接点的距离以确定人类细胞中的切割位点，并且距离两个结构的优化距离对于Drosha加工的准确性至关重要(Ma et al.ProcNatl Acad Sci USA 110:20687–20692)。这个实施例显示的结果表明～30nt的侧翼序列的并入能够足以确保不同shRNA-miR的加工。在这个实施例中，以～30nt的其它miRNA侧翼为骨架的所有七个shRNA-miR都表现出效力。这个发现通过不同miRNA骨架中的shRNA-miR的串联表达实现了轻松的多重复用。在这里，每一个shRNA-miR将是容易改变和操纵的独立的分子。重要的是，多重构建中的单个shRNA-miR的功能与仅包含单一、非多重shRNA-miR的构建相比没有降低。此外，多重shRNA-miR稳定并且对细胞没有明显的不良影响。更重要的是，七个shRNA-miR转导的来自HIV-1阳性个体的休眠T细胞，当重组到Hu-PBL小鼠中时逆转了CD4T细胞减少的趋势，表明在人类中使用这种疗法的可行性。因此，慢病毒平台表达七个shRNA-miR为使用RNAi进行HIV-1基因治疗提供了显著的进步。
通常，VSV-G用于假型慢病毒，因为它对许多不同细胞类型的广泛嗜性。虽然如此，处于细胞周期的G0期的细胞，例如休眠的CD4T，对VSV-G假型慢病毒的转导具有高度抗性(Agosto,et al.(2009).J Virol83:8153–8162)。这项研究显示了来自LAI采用X4嗜性包膜包装的慢病毒载体能够有效递送shRNA进入休眠CD4T细胞。这特别重要，因为在HIV-1感染中，休眠记忆CD4T细胞是公知的潜在HIV-1感染的存储器并且shRNA的递送可能阻止这些细胞中的病毒再活化。此外，低分化T细胞在移植后能够坚持更长的时间，因为它们具有更长的端粒而且不易发生激活诱导细胞死亡。此外，在没有延长培养的情况下，T细胞库的扰动也可能最小化。由于活体外转导是唯一要求的外部操作，因此本文所述的方法将允许基因修饰细胞立即回输至患者体内，简化了用于广泛临床应用的所述疗法。
因此，这个实施例阐明了用于表达多重shRNA而不诱导毒性作用或影响其表达和效力的简化且灵活的设计。这个系统用于表达靶向CCR5基因和病毒基因组中六个区域的七个shRNA-miR并显示出其在体外和Hu-PBL模型体内抑制HIV-1感染的有效性。这个策略提供了基因治疗HIV-1感染的临床可行方法。
材料和方法
质粒和构建
修改PsiCHECK2载体以表达荧光素酶3’UTR中的shRNA靶点。为此，合成的靶标序列的正义和反义链的寡核苷酸退火并在XhoI和NotI位点克隆进psiCHECK2中。表2列出了寡核苷酸靶标序列。为了确定有效加工所需的最小侧翼序列，我们将具有不同长度的侧翼序列的miR-150和miR-30a克隆进pLB载体(Addgene质粒11619)中，位于U6启动子之前、HpaI和XhoI之间。插入载体中的序列如表3所示。shRNA在EcoRI和BamHI位点之间插入pLVX载体(Clontech质粒631987)。多重shRNA被合成为超体(IDT Technologies)并克隆进pLVX载体中(图11)。插入载体的序列如表3所示。
表2.用于插入psiCheck2载体中R-luc3’UTR中靶点的寡核苷酸序列
表3.用于产生shRNA的寡核苷酸序列
细胞培养
按照别处(Perez et al.,J Virol 83:7397–7410)所描述的方法培养293FT/T和TZM-bl细胞。在IRB批准的协议下，从健康的和HIV感染的成人志愿者中获得PBMC。用CD4T细胞富集试剂盒(Stemcell Technologies，加拿大卑斯省温哥华市)从PBMC中分离CD4T细胞。CD8Dynabeads(Invitrogen)用于从PBMC中耗尽CD8T细胞。耗尽CD8的PBMC和分离的CD4T细胞用慢病毒转导后用PHA激活并培养在37℃，补充了10％FBS、100U/ml的青霉素－链霉素和重组IL-2(20U/ml)的RPMI 1640培养基中。
DNA转染和双荧光素酶报告分析
使用10,50和100ng的shRNA载体与100ng包含靶标区域的psiCHECK2质粒，利用脂质体2000共转染293FT细胞。如前所述，24小时后进行双荧光素酶试验。
慢病毒载体的产生和转导
慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry购自Clontech。将靶向病毒的Gag,Env,Tat,Pol,Vif和细胞的共受体CCR5的寡核苷酸克隆进EF-1α启动子表达慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry中。转染前一天，将293T细胞在150mm培养皿中涂布覆盖70-80％。使用磷酸钙沉淀法(Promega)将慢病毒载体和辅助质粒pHR8.9VPR以及env质粒pCMV-VSV-G或HIV LAI包膜(由宾夕法尼亚大学的尤纳奥多尔蒂博士捐赠)共转染293T细胞。4h后更换培养基并收集上清液，如所述方法(Lee et al.(2005).Blood106:818–826；Agosto,et al.(2009).JVirol83:8153–8162)。如前所述(Lee et al.(2005).Blood106:818–826)，以5-50的感染复数(MOI)转导TZM-bl细胞、休眠/活化的CD4T细胞以及来自健康的和HIV感染患者的耗尽CD8的PBMC。转导后，用PBS洗涤细胞两次并在培养基中培养48h。通过流式细胞仪测试mCherry表达来确定转导效率。
TZM–bl报告细胞中的HIV复制试验
2μg的shRNA表达载体和100ng的HIV-1NL4-3质粒(美国国立卫生研究院艾滋病研究和参考试剂项目)利用脂质体2000试剂共转染293T细胞。转染后两天收集的上清液用于在10μg/ml DEAE-D中感染相等数量的TZM-bl细胞。如前所述，感染后48h使用荧光素酶检测系统(Promega)在细胞裂解液中确定Tat诱导的荧光素酶活性。
基于微-RNA的shRNA的毒性试验
为了确定shRNA构建的毒性，通过Neon转染系统(Life Technology)用单一、双重和多重shRNA构建转染Jurkat细胞。48h后收集转染的细胞，用抗Annexin V FITC抗体染色并通过流式细胞仪分析。为了确定在CD4T细胞中的细胞毒性，接下来通过流式细胞仪检测转导细胞中随时间推移的mCherry表达。慢病毒载体转导的CD8+耗尽的PBMC用PHA活化并培养在含IL-2的培养基中，在第0,4,7和12天通过流式细胞仪监测mCherry表达。还收集了转导后两天和四天的慢病毒转导细胞，按照厂家说明对其进行MTS试验(Promega)。
HIV-1挑战试验
未转导的和慢病毒载体转导的TZM-bl细胞用HIV-1R5嗜性的BaL株和X4嗜性的NL4-3株以0.01的MOI在37℃感染4小时。2×105个休眠CD4T细胞和来自正常和HIV阳性供体的CD8耗尽的PBMC在使用相应的慢病毒转导后用PHA(2μg/ml)活化并培养在含有IL2的培养基中。活化后用HIVBaL和NL4-3分别以0.01和0.001的MOI感染细胞48h。如前所述，从TZM-bl细胞和T细胞/PBMC中收集上清液并通过p24ELISA试验(PerkinElmer)分析HIV复制。
HIV-1的tatshRNA靶标区域的序列分析
如前所述(Schopman et al.(2010).Retrovirology 7:52；Sugiyama et al.(2011).Nucleic Acids Res 39:589–598)，在感染后第15天(对照)或第31天(Tat/7shRNA)分析来自四个不同的HIV阳性供体的病毒RNA中shRNA诱导的Tat-shRNA靶标区域中的突变。按照厂家说明，用QIAampRNA Kit(Qiagen)提取病毒RNA并用SuperscriptIIIFirstStrandSynthesis System for RT-PCR(Invitrogen,USA)合成第一链cDNA。使用Tat靶标正义引物5’-TGT TGC TTT CAT TGCCAA GT-3’和反义引物5’-TGA TGA GTC TGA CTGCCT TGA-3’PCR扩增DNA序列。使用下列热程序进行PCR：95℃2min，然后95℃30s,57.8℃30s,和72℃30s，35个循环，接着72℃5 min。凝胶纯化PCR产物并克隆进pCR2.1TOPO载体中，随后用M13R引物测序。
NOD/SCID-Hu PBL小鼠模型
NOD/SCIDIL2rγcnull小鼠购自杰克逊实验室(美国缅因州巴港)并在保罗福斯特医学院，TTUHSC动物设施的无特殊病原体条件下饲养。如Kumar et al.(2008).Cell134:577–586所述，产生Hu-PBL小鼠。简而言之，将小鼠置于亚致死量的(2Gy)全身照射中。慢病毒转导的HIV阳性供体的PBMC(2×106)经尾静脉注射(于0.2mlPBS中)入6至7周的小鼠体内。移植后7,28和42天通过人类CD45,CD3,CD4和CD8抗体对小鼠PBMC染色来检测细胞移植。所有的小鼠试验已得到TTUHSCIACUC的批准并且动物感染试验在TTUHSC的二级生物安全水平的动物设施中进行。
流式细胞术
通过与相关抗体一起冰浴30分钟，用流式细胞术确定细胞表面抗原表达。使用以下单克隆抗体：使用的人类特异性单克隆抗体是结合FITC或APC(2D7/CCR5；BDPharmingen)的抗CCR5抗体，抗人类CD45(PE),CD3(FITC),CD4(PB),CD8(APC)以及相应的同种型对照单克隆抗体(BD Pharmingen)。通过BD FACS Canto II获取数据并在BD FACSDiva软件3.0版本上分析。任何适用之处都用FlowJo软件3.0版本制作覆盖图。
小RNA深度测序
以前面所述的(Ma et al.(2013).Proc Natl Acad Sci USA110:20687–20692；Maet al.(2014).Mol Ther Nucleic Acids 3:e161)类似方式构建小RNA库并测序。简言之，所述构建转染293FT细胞后48h，用miRNeasy试剂盒(Qiagen，瓦伦西亚，加州)按照厂家说明纯化小RNA。采用改良的连接方法，用3′和5′接头(带条码)连接小RNA(50ng)，所述方法全面优化以使不同小RNA之间的连接偏好最小化。反转录连接的小RNA并采用KAPA文库扩增试剂盒(KAPA Biosystems，马萨诸塞州沃本市)扩增10个循环，并采用Illumina MiSeq(犹他州盐湖城)对文库进行测序。舍弃所有只测序一次的读数以降低噪音水平。
这个实施例也在Choi et al.Mol Ther.2015；23(2):310-320中阐述，名称为“Multiplexing seven miRNA-Based shRNAs to suppress HIV replication”，通过引用将其内容全部包含于本文中。
要认识的是，上述公开的变型以及其它特征和功能，或其替代，可很好地组合到许多其它不同的系统或应用中。同样，其中的各种目前不可预见或意料之外的可随后由本领域技术人员实现的替代、修饰、变型或改进，也包含在下述权利要求的范围内。
通过引用将本文提及的所有出版物、专利以及登录号的全部内容包含于此，犹如特别地单独地指明每一个单独的出版物或专利通过引用包含于此。
等同物
本文讨论了组合物和方法的具体实施例，以上说明书是示范性的而非限制性的。经审阅本说明书和下面的权利要求书，本发明的许多变型将对本领域技术人员是显而易见的。本发明的全范围应根据权利要求书，及其等同物的全范围，和说明书，以及这种变型来确定。

Claims (20)

1.编码多个shRNA样分子的shRNA簇，其中所述多个shRNA样分子中的每一个包含：
茎区，所述茎区包含人工RNA分子，所述人工RNA分子包含引导链和随从链，所述引导链与靶标mRNA基本互补，其中所述人工RNA分子，当在细胞中表达时，基本抑制所述靶标mRNA的表达；和
骨干区，所述骨干区包含5’侧翼区、末端环区和3’侧翼区，
至少一个shRNA样分子的骨干区在所述多个shRNA样分子中不重复并且所述多个shRNA样分子的骨干区与天然产生的miRNA簇编码的pri-miRNA的骨干区不相同。
2.根据权利要求1所述的shRNA簇，其中所述多个shRNA样分子包含4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多个shRNA样分子。
3.根据权利要求1所述的shRNA簇，其中所述多个shRNA样分子包含7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多个shRNA样分子。
4.根据权利要求1所述的shRNA簇，其中所述shRNA簇编码1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个基于miRNA的shRNA分子(shRNA-miR分子)和/或所述shRNA簇编码1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个不是来自天然产生的pri-miRNA的shRNA分子。
5.根据权利要求1所述的shRNA簇，其中所述靶标mRNA由选自CCR5或CXCR4的人类基因或选自HIV-1的Gag,Env,Tat,Pol2,Pol1或Vif的病毒基因编码。
6.编码多个修饰型pri-miRNA样分子的人工miRNA簇，所述人工miRNA簇包含：
编码第一修饰型pri-miRNA样分子的第一核苷酸序列，所述第一修饰型pri-miRNA样分子源自第一miRNA的天然产生的pri-miRNA；和
编码第二修饰型pri-miRNA样分子的第二核苷酸序列，所述第二修饰型pri-miRNA样分子源自第二miRNA的天然产生的pri-miRNA，
所述第一和第二miRNA不属于同一个天然产生的miRNA簇。
7.根据权利要求6所述的人工miRNA簇，其中所述多个修饰型pri-miRNA样分子中的每一个包含：
茎区，所述茎区包含人工RNA分子，所述人工RNA分子包含引导链和随从链，所述引导链与靶标mRNA基本互补；
末端环区，所述末端环区与天然产生的pri-miRNA的末端环区至少50％,60％,70％,80％,90％或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸不同；
5’侧翼区，所述5’侧翼区与天然产生的pri-miRNA的5’侧翼区至少50％,60％,70％,80％,90％或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸不同；
3’侧翼区，所述3’侧翼区与天然产生的pri-miRNA的3’侧翼区至少50％,60％,70％,80％,90％或100％一致，或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸不同。
8.根据权利要求6所述的人工miRNA簇，其中所述人工miRNA簇进一步包含编码第三修饰型pri-miRNA样分子的第三核苷酸序列，所述第三修饰型pri-miRNA样分子来自第三miRNA的天然产生的pri-miRNA，其中所述第三miRNA与所述第一miRNA、第二miRNA或其两者都不属于同一个天然产生的miRNA簇。
9.根据权利要求8所述的人工miRNA簇，其中所述人工miRNA簇进一步包含编码第四修饰型pri-miRNA样分子的第四核苷酸序列，所述第四修饰型pri-miRNA样分子来自第四miRNA的天然产生的pri-miRNA，其中所述第四miRNA与所述第一miRNA、第二miRNA或第三miRNA不属于同一个天然产生的miRNA簇。
10.根据权利要求9所述的人工miRNA簇，其中所述人工miRNA簇进一步包含编码第五修饰型pri-miRNA样分子的第五核苷酸序列，所述第五修饰型pri-miRNA样分子来自第五miRNA的天然产生的pri-miRNA，其中所述第五miRNA与所述第一miRNA、第二miRNA、第三miRNA或第四miRNA不属于同一个天然产生的miRNA簇。
11.根据权利要求10所述的人工miRNA簇，其中所述人工miRNA簇进一步包含编码第六修饰型pri-miRNA样分子的第六核苷酸序列，所述第六修饰型pri-miRNA样分子来自第六miRNA的天然产生的pri-miRNA，其中所述第六miRNA与所述第一miRNA、第二miRNA、第三miRNA、第四miRNA或第五miRNA不属于同一个天然产生的miRNA簇。
12.根据权利要求11所述的人工miRNA簇，其中所述人工miRNA簇进一步包含编码第七修饰型pri-miRNA样分子的第七核苷酸序列，所述第七修饰型pri-miRNA样分子来自第七miRNA的天然产生的pri-miRNA，其中所述第七miRNA与所述第一miRNA、第二miRNA、第三miRNA、第四miRNA、第五miRNA或第六miRNA不属于同一个天然产生的miRNA簇。
13.根据权利要求7所述的人工miRNA簇，其中所述多个人工RNA分子，当在细胞中表达时，基本抑制选自人类CCR5，人类CXCR4,HIV-1Gag,HIV-1Env,HIV-1Tat,HIV-1Pol2,HIV-1Pol1或HIV-1Vif中的2,3,4,5,6,7个或所有的基因的表达。
14.包含权利要求6所述的人工miRNA簇的细胞。
15.一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求14所述的细胞，从而治疗或预防所述疾病。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病指HIV-1感染或AIDS。
17.包含权利要求14所述的细胞的药物组合物。
18.表达多个人工RNA分子的细胞的生产方法，所述方法包括用权利要求6所述的人工miRNA簇接触细胞，并在允许所述人工RNA分子表达的条件下培养所述细胞。
19.包含权利要求6所述的人工miRNA簇的病毒颗粒。
20.设计核酸分子的方法，所述方法包括改变天然产生的pri-miRNA的骨干区，所述骨干区包含5’侧翼区、末端环区和3’侧翼区，所述方法包含一个、两个或所有下述操作：
(1)在5’侧翼区、末端环区或3’侧翼区中的一个、两个或所有序列中添加一个或更多个(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多个)核苷酸；
(2)在5’侧翼区、末端环区或3’侧翼区中的一个、两个或所有序列中删除一个或更多个(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多个)核苷酸；
(3)在5’侧翼区、末端环区或3’侧翼区中的一个、两个或所有序列中替换一个或更多个(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多个)核苷酸。
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