JP2015515859A5 - - Google Patents
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Description
本発明の他の実施形態は、本発明の図面および明細書、並びに特許請求の範囲の記載に照らせば、当業者にとって明らかであろう。
[本発明1001]
以下の工程を含む、培養された真核細胞である組換えタンパク質を産生する方法:
高密度培養培地において細胞を含む浮遊培養物を得る工程であって、前記浮遊培養物が、約2×10 6 から約2×10 7 細胞/mlの間の細胞密度を有する、工程;
発現タンパク質を産生することが可能な遺伝子配列を含む発現ベクターを含む発現可能な核酸を、前記細胞にトランスフェクトする工程;
前記トランスフェクトされた細胞を第1の期間にわたってインキュベートする工程;
前記トランスフェクトされた細胞を、少なくとも1つの発現増強物質組成物と接触させる工程;
前記ベクターが前記タンパク質を発現するように、前記トランスフェクトされた細胞を、前記発現増強物質組成物の存在下で第2の期間にわたってインキュベートする工程;および
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程。
[本発明1002]
前記培養された真核細胞が、高密度条件下での増殖に適応した浮遊培養物である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記浮遊培養物が、293細胞、293細胞の派生物、293F細胞、293F細胞の派生物、PER−C6細胞、PER−C6細胞の派生物、CHO細胞、CHO細胞の派生物、CapT細胞、CapT細胞の派生物、COS細胞、COS細胞の派生物、COS−7細胞、COS−7の派生物、Sp2/0細胞、またはSp2/0細胞の派生物を含み、前記細胞が、高密度条件下での増殖に適応している、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記浮遊培養物が293F細胞の派生物を含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記浮遊培養物の量が、約200μLから約5Lの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記発現増強物質組成物が、バルプロ酸(VPA、酸およびナトリウム塩)、プロピオン酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ガラクトースを含む糖、アミノ酸混合物、もしくは酪酸のうちの少なくとも1つ、または前述の任意の組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記発現増強物質組成物がバルプロ酸を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
バルプロ酸(VPA)の濃度が、約0.20mMから約25mMの範囲である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
バルプロ酸の前記濃度が、約0.25mMから約24mM、約0.26mMから約23mM、0.27mMから約23mM、0.28mMから約23mM、0.29mMから約22mM、約0.30mMから約21mM、約0.31mMから約20mM、約0.32mMから約19mM、約0.33mMから約17mM、約0.34mMから約18mM、約0.35mMから約17mM、約0.36mMから約16mM、約0.37mMから約15mM、約0.40mMから約14mM、約0.41mMから約13mM、約0.42mMから約12mM、約0.43mMから約11mM、約0.44mMから約10mM、約0.45mMから約9mM、約0.46mMから約8mM、約0.47mMから約7mM、約0.48mMから約6mM、約0.49mMから約5mM、約0.50mMから約4mM、約0.50mMから約4mM、約0.55mMから約3mM、0.6mMから約2mMまたは0.75から約1.5mM、約0.15mMから約1.5mM、約0.16mMから約1.5mM、約0.17mMから約1.5mM、約0.18mMから約1.5mM、約0.19mMから約1.5mM、約0.20mMから約1.5mM、約0.25mMから約1.5mM、約0.30mMから約1.5mM、約0.40mMから約1.5mM、約0.50mMから約1.5mM、約0.60mMから約1.5mM、約0.70mMから約1.5mM、約0.80mMから約1.5mM、約0.90mMから約1.5mM、または約0.10mMから約1.5mMの範囲である、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記発現増強物質組成物がプロピオン酸ナトリウムを含む、本発明1006の方法。
[本発明1011]
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約0.2mMから約100mMの範囲である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの前記最終濃度が、約0.5から約80mM、約0.4mMから約70mM、約0.5mMから約60mM、約0.6mMから約50mM、約0.7mMから約40mM、約0.8mMから約30mM、約0.9mMから約20mM、約1mMから約15mM、約2mMから約10mM、約3mMから約9mM、約4mMから約8mM、または約5mMから約7mMの範囲であり、特定の好ましい非限定的な実施形態において、NAPPの最適な最終濃度が、約1mMから約10mM、約1mMから約2mM、約2mMから約3mM、約3mMから約4mM、約4mMから約5mM、約5mMから約6mM、約6mMから約7mM、約7mMから約8mM、約8mMから約9mM、または約9mMから約10mMの範囲であってもよく、特定の好ましい非限定的な実施形態において、NAPPの最適な最終濃度が、約1mM、約1.5mM、約2mM、約2.5mM、約3mM、約3.5mM、約4mM、約4.5mM、約5mM、約5.5mM、約6mM、約6.5mM、約7mM、約7.5mM、約8mM、約8.5mM、約9mM、約9.5mM、または約10mMであってもよい、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記発現増強物質組成物が酢酸リチウムを含む、本発明1006の方法。
[本発明1014]
前記培養物におけるLiAcの最終濃度が、約0.25から約25mMの範囲である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記培養物におけるLiAcの前記最終濃度が、約0.26mMから約20mM、約0.27mMから約15mM、約0.28mMから約10mM、約0.29mMから約5mM、約0.3mMから約4.5mM、約0.31mMから約4mM、約0.35mMから約3mM、約0.5mMから約2.5mM、約1mMから約3mM、約1.5mMから約2.5mM、または約2mMから約3mMの範囲である、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記発現増強物質組成物が酪酸を含む、本発明1006の方法。
[本発明1017]
前記培養物における酪酸の最終濃度が、約0.25から約25mM、約0.26mMから約20mM、約0.27mMから約15mM、約0.28mMから約10mM、約0.29mMから約5mM、約0.3mMから約4.5mM、約0.31mMから約4mM、約0.35mMから約3mM、約0.5mMから約2.5mM、約1mMから約3mM、約1.5mMから約2.5mM、または約2mMから約3mMの範囲である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記浮遊培養物の量が、約25mLμlから約50Lの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記浮遊培養物の量が、約100mLμlから約1Lの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記浮遊培養物の量が、約200mLμlから約500mLの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約1×10 6 から約20×10 6 細胞/mlの間である、本発明1001の方法。
[本発明1022]
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約2×10 6 から約6×10 6 の範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記発現ベクターがpCDNA3.3の派生物である、本発明1001の方法。
[本発明1024]
pCDNA3.3の前記派生物がWPREエレメントを含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記発現ベクターがWPREエレメントを含む、本発明1001の方法。
[本発明1026]
前記トランスフェクション工程の後に、前記高密度培養培地の交換、補充、または補給を必要としない、本発明1001の方法。
[本発明1027]
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、交換、補充、または補給されない、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記高密度培養培地が、トランスフェクトされた細胞の増殖を、80%を上回ったままの細胞生存率で、2.5×10 6 細胞/mlを超える細胞密度で促進することが可能な、無血清/無タンパク質の、化学的に規定された培養培地である、本発明1001の方法。
[本発明1029]
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、前記培地の補給、交換、または補充を必要としない、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記発現タンパク質を精製する工程をさらに含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を発現する、本発明1001の方法。
[本発明1033]
前記発現増強タンパク質が、AKT、P18、P21、Bcl−X L 、およびPKBaからなるリストから選択される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を一過性に発現する、本発明1032の方法。
[本発明1035]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を安定に発現する、本発明1032の方法。
[本発明1036]
前記第1の期間が、約2時間から約4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第1の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までであってもよい、本発明1001の方法。
[本発明1037]
前記第2の期間が、約10時間から約10日、約2時間から5日、約2.5時間から4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第1の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までであってもよい、本発明1001の方法。
[本発明1001]
以下の工程を含む、培養された真核細胞である組換えタンパク質を産生する方法:
高密度培養培地において細胞を含む浮遊培養物を得る工程であって、前記浮遊培養物が、約2×10 6 から約2×10 7 細胞/mlの間の細胞密度を有する、工程;
発現タンパク質を産生することが可能な遺伝子配列を含む発現ベクターを含む発現可能な核酸を、前記細胞にトランスフェクトする工程;
前記トランスフェクトされた細胞を第1の期間にわたってインキュベートする工程;
前記トランスフェクトされた細胞を、少なくとも1つの発現増強物質組成物と接触させる工程;
前記ベクターが前記タンパク質を発現するように、前記トランスフェクトされた細胞を、前記発現増強物質組成物の存在下で第2の期間にわたってインキュベートする工程;および
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程。
[本発明1002]
前記培養された真核細胞が、高密度条件下での増殖に適応した浮遊培養物である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記浮遊培養物が、293細胞、293細胞の派生物、293F細胞、293F細胞の派生物、PER−C6細胞、PER−C6細胞の派生物、CHO細胞、CHO細胞の派生物、CapT細胞、CapT細胞の派生物、COS細胞、COS細胞の派生物、COS−7細胞、COS−7の派生物、Sp2/0細胞、またはSp2/0細胞の派生物を含み、前記細胞が、高密度条件下での増殖に適応している、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記浮遊培養物が293F細胞の派生物を含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記浮遊培養物の量が、約200μLから約5Lの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記発現増強物質組成物が、バルプロ酸(VPA、酸およびナトリウム塩)、プロピオン酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ガラクトースを含む糖、アミノ酸混合物、もしくは酪酸のうちの少なくとも1つ、または前述の任意の組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記発現増強物質組成物がバルプロ酸を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
バルプロ酸(VPA)の濃度が、約0.20mMから約25mMの範囲である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
バルプロ酸の前記濃度が、約0.25mMから約24mM、約0.26mMから約23mM、0.27mMから約23mM、0.28mMから約23mM、0.29mMから約22mM、約0.30mMから約21mM、約0.31mMから約20mM、約0.32mMから約19mM、約0.33mMから約17mM、約0.34mMから約18mM、約0.35mMから約17mM、約0.36mMから約16mM、約0.37mMから約15mM、約0.40mMから約14mM、約0.41mMから約13mM、約0.42mMから約12mM、約0.43mMから約11mM、約0.44mMから約10mM、約0.45mMから約9mM、約0.46mMから約8mM、約0.47mMから約7mM、約0.48mMから約6mM、約0.49mMから約5mM、約0.50mMから約4mM、約0.50mMから約4mM、約0.55mMから約3mM、0.6mMから約2mMまたは0.75から約1.5mM、約0.15mMから約1.5mM、約0.16mMから約1.5mM、約0.17mMから約1.5mM、約0.18mMから約1.5mM、約0.19mMから約1.5mM、約0.20mMから約1.5mM、約0.25mMから約1.5mM、約0.30mMから約1.5mM、約0.40mMから約1.5mM、約0.50mMから約1.5mM、約0.60mMから約1.5mM、約0.70mMから約1.5mM、約0.80mMから約1.5mM、約0.90mMから約1.5mM、または約0.10mMから約1.5mMの範囲である、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記発現増強物質組成物がプロピオン酸ナトリウムを含む、本発明1006の方法。
[本発明1011]
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約0.2mMから約100mMの範囲である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの前記最終濃度が、約0.5から約80mM、約0.4mMから約70mM、約0.5mMから約60mM、約0.6mMから約50mM、約0.7mMから約40mM、約0.8mMから約30mM、約0.9mMから約20mM、約1mMから約15mM、約2mMから約10mM、約3mMから約9mM、約4mMから約8mM、または約5mMから約7mMの範囲であり、特定の好ましい非限定的な実施形態において、NAPPの最適な最終濃度が、約1mMから約10mM、約1mMから約2mM、約2mMから約3mM、約3mMから約4mM、約4mMから約5mM、約5mMから約6mM、約6mMから約7mM、約7mMから約8mM、約8mMから約9mM、または約9mMから約10mMの範囲であってもよく、特定の好ましい非限定的な実施形態において、NAPPの最適な最終濃度が、約1mM、約1.5mM、約2mM、約2.5mM、約3mM、約3.5mM、約4mM、約4.5mM、約5mM、約5.5mM、約6mM、約6.5mM、約7mM、約7.5mM、約8mM、約8.5mM、約9mM、約9.5mM、または約10mMであってもよい、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記発現増強物質組成物が酢酸リチウムを含む、本発明1006の方法。
[本発明1014]
前記培養物におけるLiAcの最終濃度が、約0.25から約25mMの範囲である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記培養物におけるLiAcの前記最終濃度が、約0.26mMから約20mM、約0.27mMから約15mM、約0.28mMから約10mM、約0.29mMから約5mM、約0.3mMから約4.5mM、約0.31mMから約4mM、約0.35mMから約3mM、約0.5mMから約2.5mM、約1mMから約3mM、約1.5mMから約2.5mM、または約2mMから約3mMの範囲である、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記発現増強物質組成物が酪酸を含む、本発明1006の方法。
[本発明1017]
前記培養物における酪酸の最終濃度が、約0.25から約25mM、約0.26mMから約20mM、約0.27mMから約15mM、約0.28mMから約10mM、約0.29mMから約5mM、約0.3mMから約4.5mM、約0.31mMから約4mM、約0.35mMから約3mM、約0.5mMから約2.5mM、約1mMから約3mM、約1.5mMから約2.5mM、または約2mMから約3mMの範囲である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記浮遊培養物の量が、約25mLμlから約50Lの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記浮遊培養物の量が、約100mLμlから約1Lの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記浮遊培養物の量が、約200mLμlから約500mLの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約1×10 6 から約20×10 6 細胞/mlの間である、本発明1001の方法。
[本発明1022]
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約2×10 6 から約6×10 6 の範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記発現ベクターがpCDNA3.3の派生物である、本発明1001の方法。
[本発明1024]
pCDNA3.3の前記派生物がWPREエレメントを含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記発現ベクターがWPREエレメントを含む、本発明1001の方法。
[本発明1026]
前記トランスフェクション工程の後に、前記高密度培養培地の交換、補充、または補給を必要としない、本発明1001の方法。
[本発明1027]
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、交換、補充、または補給されない、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記高密度培養培地が、トランスフェクトされた細胞の増殖を、80%を上回ったままの細胞生存率で、2.5×10 6 細胞/mlを超える細胞密度で促進することが可能な、無血清/無タンパク質の、化学的に規定された培養培地である、本発明1001の方法。
[本発明1029]
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、前記培地の補給、交換、または補充を必要としない、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記発現タンパク質を精製する工程をさらに含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を発現する、本発明1001の方法。
[本発明1033]
前記発現増強タンパク質が、AKT、P18、P21、Bcl−X L 、およびPKBaからなるリストから選択される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を一過性に発現する、本発明1032の方法。
[本発明1035]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を安定に発現する、本発明1032の方法。
[本発明1036]
前記第1の期間が、約2時間から約4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第1の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までであってもよい、本発明1001の方法。
[本発明1037]
前記第2の期間が、約10時間から約10日、約2時間から5日、約2.5時間から4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第1の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までであってもよい、本発明1001の方法。
Claims (15)
- 培養された293細胞または293細胞の派生物において組換えタンパク質を産生する方法であって、
高密度培養培地において293細胞または293細胞の派生物を含む浮遊培養物を得る工程であって、前記浮遊培養物が、約2×106から約2×107細胞/mlの間の細胞密度を有する、工程;
発現タンパク質を産生することが可能な遺伝子配列を含む発現ベクターを含む発現可能な核酸を、前記293細胞または293細胞の派生物にトランスフェクトする工程;
前記トランスフェクトされた293細胞または293細胞の派生物を第1の期間にわたってインキュベートする工程;
前記トランスフェクトされた293細胞または293細胞の派生物を、バルプロ酸(VPA、酸およびナトリウム塩)を含む少なくとも1つの発現増強物質組成物と接触させる工程;
前記ベクターが前記タンパク質を発現するように、前記トランスフェクトされた293細胞または293細胞の派生物を、前記発現増強物質組成物の存在下で第2の期間にわたってインキュベートする工程;および
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた293細胞または293細胞の派生物を収集する工程
を含み、前記トランスフェクション工程の後に、前記高密度培養培地の交換、補充、または補給を必要としない、方法。 - 前記培養された293細胞または293細胞の派生物が、高密度条件下での増殖に適応した浮遊培養物である、請求項1に記載の方法。
- 前記浮遊培養物が、293細胞、293細胞の派生物、293F細胞、または293F細胞の派生物を含み、前記細胞が、高密度条件下での増殖に適応しており;
任意で、前記浮遊培養物が293F細胞の派生物を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記発現増強物質組成物が、プロピオン酸ナトリウム、または酢酸リチウムをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- バルプロ酸(VPA)の濃度が、約0.20mMから約25mMの範囲であり;任意で、バルプロ酸の濃度が、約0.25mMから約24mM、約0.26mMから約23mM、0.27mMから約23mM、0.28mMから約23mM、0.29mMから約22mM、約0.30mMから約21mM、約0.31mMから約20mM、約0.32mMから約19mM、約0.33mMから約17mM、約0.34mMから約18mM、約0.35mMから約17mM、約0.36mMから約16mM、約0.37mMから約15mM、約0.40mMから約14mM、約0.41mMから約13mM、約0.42mMから約12mM、約0.43mMから約11mM、約0.44mMから約10mM、約0.45mMから約9mM、約0.46mMから約8mM、約0.47mMから約7mM、約0.48mMから約6mM、約0.49mMから約5mM、約0.50mMから約4mM、約0.50mMから約4mM、約0.55mMから約3mM、0.6mMから約2mMまたは0.75から約1.5mM、約0.15mMから約1.5mM、約0.16mMから約1.5mM、約0.17mMから約1.5mM、約0.18mMから約1.5mM、約0.19mMから約1.5mM、約0.20mMから約1.5mM、約0.25mMから約1.5mM、約0.30mMから約1.5mM、約0.40mMから約1.5mM、約0.50mMから約1.5mM、約0.60mMから約1.5mM、約0.70mMから約1.5mM、約0.80mMから約1.5mM、約0.90mMから約1.5mM、または約0.10mMから約1.5mMの範囲である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 以下のいずれかである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法:
前記発現増強物質組成物がプロピオン酸ナトリウムを含み、かつ任意で、前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約0.2mMから約100mMの範囲であり;
さらに任意で、前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの前記最終濃度が、約0.5から約80mM、約0.4mMから約70mM、約0.5mMから約60mM、約0.6mMから約50mM、約0.7mMから約40mM、約0.8mMから約30mM、約0.9mMから約20mM、約1mMから約15mM、約2mMから約10mM、約3mMから約9mM、約4mMから約8mM、または約5mMから約7mMの範囲であり;またさらに任意で、NAPPの最適な最終濃度が、約1mMから約10mM、約1mMから約2mM、約2mMから約3mM、約3mMから約4mM、約4mMから約5mM、約5mMから約6mM、約6mMから約7mM、約7mMから約8mM、約8mMから約9mM、または約9mMから約10mMの範囲であり;なおまたさらに任意で、NAPPの最適な最終濃度が、約1mM、約1.5mM、約2mM、約2.5mM、約3mM、約3.5mM、約4mM、約4.5mM、約5mM、約5.5mM、約6mM、約6.5mM、約7mM、約7.5mM、約8mM、約8.5mM、約9mM、約9.5mM、または約10mMであるか;あるいは、
前記発現増強物質組成物が酢酸リチウムを含み、かつ任意で、前記培養物におけるLiAcの最終濃度が、約0.25から約25mMの範囲であり;
さらに任意で、前記培養物におけるLiAcの前記最終濃度が、約0.26mMから約20mM、約0.27mMから約15mM、約0.28mMから約10mM、約0.29mMから約5mM、約0.3mMから約4.5mM、約0.31mMから約4mM、約0.35mMから約3mM、約0.5mMから約2.5mM、約1mMから約3mM、約1.5mMから約2.5mM、または約2mMから約3mMの範囲である。 - 前記浮遊培養物の量が、約200μLから約5Lの範囲であるか;前記浮遊培養物の量が、約25mLから約50Lの範囲であるか;前記浮遊培養物の量が、約100mLから約1Lの範囲であるか;または、前記浮遊培養物の量が、約200mLから約500mLの範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約1×106から約20×106細胞/mlの間であるか;または、前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約2×10 6 から約6×10 6 の範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記発現ベクターがWPREエレメントを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、交換、補充、または補給されない、請求項1に記載の方法。
- 前記高密度培養培地が、トランスフェクトされた細胞の増殖を、80%を上回ったままの細胞生存率で、2.5×106細胞/mlを超える細胞密度で促進することが可能な、無血清/無タンパク質の、化学的に規定された培養培地である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程をさらに含み;任意で、前記発現タンパク質を精製する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記293細胞または293細胞の派生物が、1種または複数種の発現増強タンパク質を発現する、前記方法であって、任意で以下のうち少なくとも1つをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法:
前記発現増強タンパク質が、AKT、P18、P21、Bcl−X L 、およびPKBaからなるリストから選択される;
前記293細胞または293細胞の派生物が、1種または複数種の発現増強タンパク質を一過性に発現する;
前記293細胞または293細胞の派生物が、1種または複数種の発現増強タンパク質を安定に発現する。 - 前記第1の期間が、約2時間から約4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、任意で、前記第1の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の期間が、約10時間から約10日、約2時間から5日、約2.5時間から4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、任意で、前記第2の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
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