DE3788796T2

DE3788796T2 - Serumfreies medium zur proliferation von lymphokin-aktivierten töterzellen.

Info

Publication number: DE3788796T2
Application number: DE87907471T
Authority: DE
Inventors: Frederick Darfler
Original assignee: Life Technologies Inc
Current assignee: Life Technologies Inc
Priority date: 1986-10-20
Filing date: 1987-10-20
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2007-10-21
Also published as: DE3788796D1; WO1988002774A1; JPH01501121A; EP0287652B1; CA1324098C; AU8235487A; AU610843B2; EP0287652A4; EP0287652A1

Description

Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die zur in vitro-Züchtung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen geeignet sind. Die Erfindung beschreibt außerdem ein Serumfreies Medium, das die Vermehrung solcher Zellen ermöglicht.
Eine der vielversprechensten Vorgehensweisen bei der Behandlung von Krebs betrifft die Konzeption der passiven Immuntherapie. Diese Vorgehensweise betrifft die Übertragung von zuvor sensibilisierten immunologischen Reagenzien, beispielsweise Zellen oder Antikörper, die fähig sind, eine anti-Tumor-Antwort hervorzurufen, auf einen Krebspatienten (S. A. Rosenberg, Canc. Treat. Rep. 68 (1984), 233-255). Unter den vielen möglichen immunologischen Reagenzien, die verabreicht werden können, sind Lymphokine, beispielsweise Interleukin-2 (I1-2) oder Interferon. Leider leiden Krebspatienten üblicherweise an einer Immunsuppression, und die Immuntherapie war daher weniger erfolgreich als erhofft (Rosenberg (1984)). Vor kurzem beschrieben Grimm und Mitarbeiter einen neuen Ansatz der Immuntherapie, der zur Überwindung dieses Hemmnisses signifikant beiträgt (Grimm, E. A. et al., J. Exper. Med. 155 (1982), 1823-1841, Grimm, E. A. et al., J. Exper. Med. 157 (1983), 884-897, Grimm, E. A. et al., J. Exper. Med. 158 (1983), 1356-1361). Diese Forscher stellten fest, daß die Lymphocyten-Zellen des peripheren Bluts (PBL) die Fähigkeit zur bevorzugten Erkennung und Zerstörung von Tumorzellen erwarben, nachdem sie einem Patienten entnommen und in vitro in Gegenwart von Interleukin-2 inkubiert worden waren. Dieser Befund ist im Hinblick auf den immunsupprimierten Zustand der typischen Krebspatienten besonders signifikant, da er dem Arzt die Möglichkeit gibt, durch Entnahme einer kleinen Zahl von Lymphocyten und durch in vitro-Züchtung dieser Zellen eine große Zahl von Tumor-spezifischen immunkompetenten Zellen herzustellen. Da diese Zellen durch die Gegenwart eines Lymphokins zum Abtöten von Tumorzellen aktiviert wurden, erhielten sie die Bezeichnung Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK).
Obgleich die Experimente ursprünglich unter Verwendung von natürlichen Lymphokinen durchgeführt wurden, ist bald erkannt worden, daß auch durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellte Lymphokine diese Aktivierung vermitteln können (Rayner, A. A. et al., Cancer 55 (1985), 1327-1333, Itoh, K. et al., J. Immunol. 134 (1985), 3124-3129, Mule, J. J. et al., J. Immunol. 135 (1985), 646-652).
Da PBL-Zellen im menschlichen Blut und im lymphatischen Gewebe natürlich vorkommen, wurde ursprünglich angenommen, daß die Verabreichung eines Lymphokins an einen Krebspatienten die Folge haben würde, daß vom Patienten LAK- Zellen erzeugt werden. Der immunsupprimierte Zustand der meisten Krebspatienten und die Gegenwart von spezifischen Faktoren, die die Induktion von LAK-Zellen unterdrücken, haben bisher diese potentielle therapeutische Behandlung verhindert. Daher ist es zur Produktion von LAK-Zellen erforderlich, PBL-Zellen in vitro in Gegenwart eines Lymphokins zu züchten und anschließend die in vitro erhaltenen LAK-Zellen an Krebspatienten zu verabreichen.
Die in vitro-Erzeugung von LAK-Zellen wurde ursprünglich in einem Medium versucht, das menschliches Serum enthielt (Grimm, E. A. et al., J. Exper. Med. 157 (1983), 884-887). Die außergewöhnlichen Kosten solcher Seren, ihre begrenzte Verfügbarkeit und die Möglichkeit, daß sie durch Mikroorganismen, besonders durch Viren, kontaminiert sein könnten, gaben Anlaß zu Untersuchungen mit dem Ziel, alternative Kulturmedien zu finden, auf denen sich PBL-Zellen vermehren lassen und LAK-Zellen erzeugt werden können.
Mazumder, A. et al. (J. Exper. Med. 159 (1984), 495-507, und Rosenstein, M. et al., J. Natl. Canc. Inst. 72 (1984), 1161-1165) zeigten, daß Kulturmedien, die fötale Kälberseren enthielten, die Herstellung von LAK-Zellen stimulieren konnten. Es wurde jedoch festgestellt, daß bei der Induzierung der Bildung von LAK-Zellen die fötalen Kälberseren wesentlich weniger wirksam als menschliche Seren waren (Imir, P. et al., Clin. Immunol. Immunopath. 36 (1985), 289-296). Diese Forscher stellten fest, daß die Zahl der LAK- Zellen, die in menschlichen Seren erzeugt werden konnten, mehr als achtmal höher all die war, die durch Züchtung nach einer äquivalenten Impfung mit PBL-Zellen in einem Medium, das Rinderseren enthielt, produziert werden konnte. Imir et al. kamen durch diese Ergebnisse zu der Überzeugung, daß fötale Kälberseren anscheinend die Erzeugung von LAK-Zellen hemmten und das daher menschliche Seren ein bevorzugter Kulturzusatz sind. Ferner schien die Verwendung von fötalen Kälberseren entweder auf die Vorläufer der LAK-Zellen oder die LAK-Zellen selber direkt toxisch zu wirken (Imir et al., (1985)).
Als Antwort auf die vorstehend erwähnten Einschränkungen beschrieben Froelich, C. J. et al. (J. Immunol. Meth. 86 (1986), 205-211) ein Serum-freies Medium, das sowohl die Vermehrung von PBL als auch die Erzeugung von LAK-Zellen unterstützen kann. Das von diesen Forschern beschriebene Medium war das Dulbecco-Modified-Eagle-Medium, das mit Rinderserum-Albumin und den drei Fettsäuren Linolsäure, Ölsäure und Palmitinsäure versetzt war. Das Medium enthielt außerdem Insulin, Transferrin und Ethanolamin. Dieses Medium ermöglichte die Vermehrung von LAK-Zellen, allerdings mit einer signifikant niedrigeren Effizienz als Medien, die menschliche Seren enthielten. Froelich, C. J. et al., (1986), stellten fest, daß die LAK-Zellen in diesem Serumfreien Medium durch Zusatz von Natriumpyruvat und Indomethacin, einem Inhibitor der Prostaglandin-Biosynthese, effizienter erzeugt werden konnten. Es wurde jedoch festgestellt, daß sich die LAK-Zellen in dem von Froelich et al. beschriebenen Serum-freien Medium auch mit diesen Zusätzen wesentlich weniger als in menschliche Seren enthaltenden Medien vermehrten (Froelich et al., (1986)).
Ferner entstand bei der Aufnahme von Rinderserum-Albumin in das Serum-freie Medium die Frage, ob in vitro eine Immunantwort gegen das fremde Rinder-Albumin entsteht und demzufolge die LAK-Zellen indirekt aktiviert und vermehrt werden. Ferner ergaben sich aus der möglichen Entstehung einer Immunantwort in vivo bei einem Patienten aufgrund der Gegenwart des fremden Rinder-Albumins Fragen hinsichtlich der Eignung von Rinder-Albumin zur Verwendung bei der Züchtung von PBL-Zellen, die anschließend einem Patienten wieder zurückgegeben werden.
Die vorliegende Erfindung stützt sich auf den Befund, daß die Aktivierung der Kinase C, die ein natürliches und endogenes, in PBL-Zellen vorkommendes Enzym ist, den PBL- Zellen die Entwicklung zu proliferierenden LAK-Zellen ermöglicht.
Es wurde festgestellt, daß Kinase C der physiologische Rezeptor für Phorbolester ist, einer besonderen Klasse von Tumor-fördernden Substanzen (Farrar, W.L. et al., Lymphokine Res. 4 (1985), 87-93). Es wurde festgestellt, daß Interleukin-2 das Enzym Kinase C aktivieren kann. Es wurde festgestellt, daß die aktivierte Kinase C das Interleukin-2- Rezeptor-Molekül von intakten Lymphocyten phosphorylieren kann, was darauf hindeutet, daß sie eine Rolle bei der Immunantwort von Tieren spielen dürfte (Farrar et al., (1985), Taguchi, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 135 (1986), 239-247).
Nach erfolgter Aktivierung durch das Lymphokin können sich LAK-Zellen vermehren und Gamma-Interferon produzieren. Es wird angenommen, daß das so produzierte Gamma-Interferon zusammen mit dem exogen zugesetzten Interleukin-2 in Wechselwirkung tritt, um die weitere Produktion von Gamma- Interferon zu stimulieren. Ferner wird vermutet, daß vorhandenes Gamma-Interferon an der Expression von zellulären Rezeptorstellen für das Interleukin-2-Molekül beteiligt ist (K. Shiiba, Cancer, Immunol. Immunother. 21 (1986), 119-128). Es wird angenommen, daß das von den LAK-Zellen produzierte Gamma-Interferon für die cytotoxischen und therapeutischen Eigenschaften der Zellen verantwortlich ist (Rosenstein, M. et al., Cancer Res. 44 (1984), 1946-1953, und Rayner, A.A. et al., J. Natl. Canc. Inst. 75 (1985), 67-74).
Faßt man zusammen, so erfordert die Behandlung von Krebspatienten mit der von Grimm et al. (1983) entdeckten LAK-Zelltherapie die Verwendung eines Zellkulturmediums, das sowohl wirtschaftlich als auch bei der Erzeugung solcher Zellen wirksam ist. Obgleich menschliche Seren LAK-Zellen wirksam erzeugen können, ist ihre Verwendung untragbar kostspielig, sie können ein potentieller Träger von Viren sein und sind nur begrenzt verfügbar. Anstrengungen zur Verwendung von alternativen nicht-menschlichen Seren oder Serum-freien Medien erwiesen sich als nicht vollständig zufriedenstellend. Daher besteht weiterhin ein Bedarf nach einem alternativen Züchtungsverfahren, in dem LAK-Zellen ökonomisch und wirksam erzeugt werden können.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Stoffzusammensetzungen, die die Erzeugung von LAK-Zellen in einem definierten, Serum-freien Kulturmedium ermöglichen. Das Zellkulturmedium ermöglicht die Vermehrung von LAK- Zellen mit einer Effizienz, die im wesentlichen der bei Verwendung eines Kulturmediums mit menschlichem Serum erhältlichen äquivalent ist. Das erfindungsgemäße Zellkulturmedium ist jedoch den ein solches Serum enthaltenden Kulturmedien darin überlegen, daß die Verwendung eines definierten Serumfreien Mediums die Aufklärung des Mechanismus erleichtern kann, der die Aktivierung von PBL-Zellen zu LAK-Zellen reguliert.
Ein erster Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Lymphokin-aktivierten Killerzelle, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Inkontaktbringen einer Lymphocyten-Zelle von peripherem Blut (PBL) mit einer Menge eines Kulturmediums, die ausreicht, um die in vitro-Züchtung der Lymphocyten-Zelle von peripherem Blut zu ermöglichen, wobei das Medium im wesentlichen frei von Serum ist und enthält:
(i) ein Lymphokin; und
(ii) eine nicht-proteinartige Verbindung, die zur Aktivierung des Enzyms Kinase C fähig ist, welche ein Diacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Diacylglycerins, oder ein Vorläufer eines Diacylglycerins, ein Acetylacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Acetylacylglycerins oder ein Vorläufer eines Acetylacylglycerins ist; und
(b) Halten der PBL-Zelle im Kulturmedium unter Bedingungen, die ausreichen, um die Produktion von Lymphokinaktivierten Killerzellen zu ermöglichen.
Ein zweiter Gesichtspunkt betrifft Lymphokin-aktivierte Killer-Zellen (LAK), die durch das Verfahren im ersten Gesichtspunkt hergestellt werden.
Ein dritter Gesichtspunkt betrifft die Verwendung von aktivierten LAK-Zellen, die an Hand des ersten Gesichtspunkt produziert wurden, zur Herstellung eines Wirkstoffs zur Unterdrückung des Wachstums oder der Entwicklung einer Krebszelle.
Ein vierter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft eine Stoffzusammensetzung, die umfaßt: (a) eine in vitrogezüchtete Lymphocyten-Zelle vom peripheren Blut oder eine Lymphokin-aktivierte Killer-Zelle und (b) eine exogen zugesetzte, nicht-proteinartige Verbindung, die zur Aktivierung des Enzyms Kinase C fähig ist, welche ein Diacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Diacylglycerins, oder ein Vorläufer eines Diacylglycerins, ein Acetylacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Acetylacylglycerins oder ein Vorläufer eines Acetylacylglycerins ist, wobei die Stoffzusammensetzung im wesentlichen frei von Serum ist.
Ferner betrifft ein fünfter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ein Kulturmedium, das ein Lymphokin und eine exogen zugesetzte, nicht-proteinartige Verbindung enthält, die zur Aktivierung des Enzyms Kinase C fähig ist, welche ein Diacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Diacylglycerins, oder ein Vorläufer eines Diacylglycerins, ein Acetylacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Acetylacylglycerins oder ein Vorläufer eines Acetylacylglycerins ist, wobei das Kulturmedium im wesentlichen frei von Serum ist. Das Kulturmedium kann außerdem einen Wirkstoff enthalten, der zur Hemmung des Abbaus der nicht-proteinartigen Verbindung fähig ist, z. B. 1-Monooleoyl-rac-glycerin, Dioctanoylethylenglycol, Dioctanoylglyceramid oder Dioctanoylbutantriol. Eine derartige nicht-proteinartige Verbindung kann ein Acetylacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Acetylacylglycerins oder ein Vorläufer eines Acetylacylglycerins sein. Der Wirkstoff ist vorzugsweise ein Inhibitor des Enzyms Diacylglycerin-Kinase oder Diacylglycerin-Lipase.
Bevorzugte Merkmale, Verfahren und Ausführungsformen eines erfindungsgemäßen Gesichtspunktes werden gegebenenfalls auch bei den anderen vier erfindungsgemäßen Gesichtspunkten vorgezogen.

Beschreibungen der bevorzugten Ausführungsformen

I. Die in vitro-Züchtung von PBL-Zellen

Es wird von der "Haltung" einer Zelle in einem Gewebekulturmedium gesprochen, wenn die Züchtung unter Bedingungen erfolgt, die ausreichen, um entweder die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten oder das proliferierende Wachstum zu fördern. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Lebensfähigkeit der Zelle" die Fähigkeit einer Zelle zum Abbau von Nährstoffen und zu direkten biosynthetischen Abläufen. Der Begriff "proliferierendes Wachstum" betrifft die Fähigkeit einer Zelle, Tochterzellen zu erzeugen. Um die Lebensfähigkeit von Zellen aufrechtzuerhalten, ist das proliferierende Wachstum der Zelle nicht erforderlich.
Die erfindungsgemäße in vitro-Züchtung der Zellen erfordert generell eine Berücksichtigung von vier grundlegenden Punkten: (1) die Art des Substrats oder der Phase, auf dem oder in der die Zellen gezüchtet werden sollen, (2) die Zusammensetzung und Konzentration der Gasatmosphäre, in der die Zellen inkubiert werden, (3) die Inkubationstemperatur und (4) die physiochemische und physiologische Zusammensetzung des Kulturmediums. (R. I. Freshney, in: Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc. N. Y., (1983), 55-78, Lambert, K. J. et al., in Animal Cell Biotechnology Bd.l, Spier, R. E. et al., (Hrsg.), Acad. Press N. Y. (1985), 86-122, wobei diese Verweise hiermit durch Bezugnahme mit eingeschlossen sind). Daher gehört zu den wichtigen Überlegungen, ob es wünschenswert ist, die Zellen in einer Suspension des Kulturmediums zu züchten oder sie im Kontakt mit einer festen Oberfläche wachsen zu lassen. Zu geeigneten festen Oberflächen gehören Glas, Kulturschalen aus Polystyrol oder Oberflächen von suspendierbaren Partikeln. In einer anderen Ausführungsform können die Zellen in Kügelchen aus permeablen Membranen oder in Hohlfasern gezüchtet werden. Obwohl jedes Züchtungsverfahren verwendet werden kann, das die Lebensfähigkeit der Zellen oder die Fähigkeit der PBL-Zellen zu einem proliferierenden Wachstum aufrechterhalten kann, ist es vorzuziehen, solche Zellen in einer Suspension in T- Flaschen oder Roller-Flaschen zu züchten (Mazumder, A. et al., Cancer 53 (1984), 896-905), obwohl andere Verfahren, beispielsweise die Züchtung in luftgerührten Fermentern oder Fermentern mit tiefem Tank oder in Hohlfasern und Ultrafiltrations-Vorrichtungen auch geeignet sein können. Das Volumen des Kulturmediums kann lediglich 50 ul aber auch 100 Liter betragen.
Obwohl die Zellen bei jeder Temperatur, bei der die Zellen lebensfähig bleiben, inkubiert werden können, werden die Zellen vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 30 und 45ºC gehalten und am meisten bevorzugt bei einer Inkubationstemperatur von 37ºC gezüchtet. Die gezüchteten Zellen ertragen auch einen beträchtlichen Rückgang der Temperaturen und können mehrere Tage bei 4ºC überleben und können eingefroren und auf -196ºC in Gegenwart von geeigneten Kryo- Konservierungsstoffen abgekühlt werden. Bei der Temperaturregulierung von gezüchteten Zellen ist die Beständigkeit der Temperatur wichtig; die Temperatur sollte innerhalb von ± 2ºC der gewünschten Temperatur gehalten werden.
Die Gasatmosphäre, in der die Zellen inkubiert sind, muß Sauerstoff und Kohlendioxid enthalten. Obwohl zahlreiche Gaszusammensetzungen und Konzentrationen möglich sind, ist es vorzuziehen, eine Gasatmosphäre zu verwenden, die Luft enthält, der Kohlendioxid zu einer Endkonzentration von 5% zugesetzt wurde. Ferner sollte die relative Feuchtigkeit der Atmosphäre mehr als 80% und vorzugsweise mehr als 90% sein.
Die Grundbestandteile eines üblichen Gewebekulturmediums sind von C. Waymouth beschrieben worden (In: Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrata for Serum-Free Animal Cell Culture, Alan R. Liss, NY, S. 23-68 (1984)), wobei hiermit diese Veröffentlichung durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist. Zu den Grundbestandteilen eines Kulturmediums gehören Ionen von anorganischen Salzen (wie beispielsweise Na&spplus;, K&spplus;, Ca²&spplus;, Mg²&spplus;, Cl&supmin;, (HPO&sub4;)²&supmin; und (HCO&sub3;)&supmin;. Ferner kann ein Kulturmedium Metallionen enthalten (wie beispielsweise Fe²&spplus; Zn²&spplus;, Cu²&spplus;, Mn²&spplus;, Co²&spplus; und (SeO&sub3;)²&supmin;. Die Kulturmedien können außerdem Spurenelemente enthalten, beispielsweise Sn, V, Cr, Al, As und Mo.
Das erfindungsgemäße Kulturmedium kann auch Aminosäuren, beispielsweise in tierischem Protein natürlich vorkommende, enthalten. Vitamine, wie beispielsweise B&sub1;&sub2;, C, A, E und Biotin sowie Lipide und fettlösliche Bestandteile, sind üblicherweise ebenfalls im Kulturmedium enthalten. Zu den Lipiden und fettlöslichen Bestandteilen, die in Kulturmedien verwendet werden, gehören unter anderem Linolsäure, Cholesterin, Lecithin, Sphingomyelin, Phospholipide und Ölsäure.
Die erfindungsgemäßen Kulturmedien enthalten auch Kohlehydrate, die als Energiequellen dienen. Obwohl Glucose und/oder Glutamin als Hauptenergiequelle in den erfindungsgemäßen Medien bevorzugt verwendet werden, können auch andere Zucker (beispielsweise Fructose, Galactose, Mannose, Maltose oder Lactose) verwendet werden. Die Konzentrationen der Zucker in solchen Medien übersteigen üblicherweise 1000 mg/l und können höher als 5000 mg/l sein.
Obwohl die erfindungsgemäßen Zellen in vitro de novo Nucleotide synthetisieren können, kann der Zusatz von Purin- oder Pyrimidin-Basen oder Nucleotiden die Effizienz der Züchtung erhöhen. Zu den Basen, die den erfindungsgemäßen Serum-freien Medien zugesetzt werden können, gehören Adenin und Hypoxanthin. Zu den Nucleotiden gehören Thymidin, Desoxyadenosin, Desoxycytidin und Desoxyguanosin.
PBL-Zellen sind gegenüber Veränderungen des pH-Werts des Kulturmediums empfindlich. Daher ist es erforderlich, den Kulturmedien pH-Wert-Puffer zuzusetzen. Unter den Puffern, die verwendet werden können, sind HEPES, Bicarbonatpuffer, Phosphatpuffer, Tris-Puffer und andere ähnliche Puffer. Es ist wünschenswert, daß derartige Puffer einen pH- Wert von etwa 6,5 bis 8,0 und vorzugsweise einen pH-Wert zwischen 6,8 und 7,4 aufrechterhalten können.
Es ist auch wünschenswert, den Kulturmedien Wachstumsfaktoren, Mitogene oder Hormone zuzusetzen. Zu den Wachstumsfaktoren und Hormonen, die zugesetzt werden können, gehören Insulin, Cortison oder Dexamethason, Interleukin-l, Interferone, Transferrin, etc . . Ferner ist es oft wünschenswert, dem Kulturmedium menschliches Albumin zuzusetzen.
Da PBL-Zellen langsamer als potentielle Kontaminanten, beispielsweise Bakterien, wachsen, kann es wünschenswert sein, dem Kulturmedium Antibiotika, beispielsweise Penicillin, Streptomycin, Gentamycin, etc., zuzusetzen.
Obwohl durch übliche Experimente die Entwicklung eines Zellkulturmediums möglich ist, das geeignete Mengen der vorstehend beschriebenen Bestandteile enthält, ist es in einer anderen Ausführungsform möglich, irgendeines aus der großen Zahl von kommerziell hergestellten Kulturmedien zu verwenden, in denen die spezifischen Kombinationen und Konzentrationen der Bestandteile bereits bekannt sind. Die Zusammensetzung solcher Kulturmedien ist von R. I. Freshney (in: Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique, Alan R. Liss., NY, (1983), S. 67-78) beschrieben worden.
Das hier verwendete "Grundmedium" ist ein Medium, das die Grundbestandteile des Kulturmediums (beispielsweise die vorstehend beschriebenen) enthält. Es wird bei einem derartigen Grundmedium (und auch bei dem hier offenbarten, LAK- Zellen erzeugenden Medium) dann davon gesprochen, daß es "im wesentlichen frei von Serum" ist, wenn die Serumkonzentration weniger als 0,1% ist. Obwohl zahlreiche mögliche, als erfindungsgemäßes Grundmedium verwendbare Kulturmedien formuliert werden können, ist die Verwendung eines aus Dulbeccos-Modified-Eagle-Medium bestehendes Grundmedium besonders bevorzugt: Hams-F12-Medium in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102 (1980), 1255). Ein derartiges Medium wird hier nachstehend als Darflers-Grundmedium bezeichnet. Die Zusammensetzungen dieser Medien sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Bestandteil Dulbeccos Modifikation mg/l Hams-F12 Darflers Grundmedium Anorganische Salze Weitere Bestandteile D-Glucose Liponsäure Phenolrot Natriumpyruvat Hypoxanthin Linolsäure Putrescin Thymidin Aminosäuren L-Alanin L-Arginin L-Asparagin L-Asparaginsäure L-Cystin L-Cystein L-Glutaminsäure L-Glutamin Glycin L-Histidin L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin L-Methionin L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L-Threonin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Valin Vitamine Biotin D-Ca-Pantothenat Cholinchlorid Folsäure i-Inosit Nicotinamid Pyridoxal Riboflavin Thiamin Vitamin B&sub1;&sub2; Pyridoxin

II. Die Erzeugung von Lymphokin-aktivierten Killer-Zellen

Zelluläre Immunantworten entstehen durch komplexe Wechselwirkungen zwischen T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen. Die T-Zellen sind "weiße Blutkörperchen", die im Thymus gebildet werden. Sie produzieren und antworten auf mehrere unterschiedliche Stimulantien (beispielsweise Lymphokine und Antigene), womit die Immunantwort des Tieres kontrolliert und moduliert wird. B-Zellen, die im Gewebe des Knochenmarks gebildet werden, sind die "weißen Blutkörperchen", die unter Bildung von Antikörpern auf Infektionen antworten. Die Makrophagen sind weiße Blutkörperchen, die für die Entfernung von fremden Zellen (d. h., Bakterien, etc.) aus Tiergeweben primär verantwortlich sind. Die komplexen Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen werden durch direkten Kontakt der Zellen und durch lösliche, als "Lymphokine" bekannte Verbindungen vermittelt. Die Lymphokine sind üblicherweise Proteine oder Glycoproteine mit einem Molekulargewicht zwischen 10 und 100 kd. Beispiele von Lymphokinen sind von Stephenson beschrieben worden (In: Animal Cell Biotechnology Bd. 2, Spier, R. E. et al., Hrsg., Acad. Press, (1985), S. 41-45). Obwohl jede Verbindung, die die Aktivierung von PBL-Zellen zu LAK-Zellen steuern kann, erfindungsgemäß verwendet werden kann, wird die Verwendung eines Lymphokins vorgezogen, und das Lymphokin Interleukin-2 (IL-2) wird besonders bevorzugt verwendet. Interleukin-2 ist ein 15 kd Glycoprotein (Gillis, S. et al., J. Exper. Med. 152 (1980), 1709), das von aktivierten T-Lymphocyten sezerniert wird (Bonnard et al., J. Immunol. 123 (1979), 2704). Es wird angenommen, daß dieses Molekül mit einem auf aktivierten Lymphocyten vorkommenden Membran-Rezeptor interagiert, wodurch ein Kaskaden-Phänomen induziert wird, das eine Vermehrung der aktivierten Zellen zur Folge hat (Robb, J. R., Immunol. Today 7 (1984), 203).
Die Lymphokine können aus natürlichen Gewebequellen gereinigt (Spiess, P. J. et al., J. Immunol. Meth. 42 (1981), 213-222, oder durch DNA-Rekombinationstechniken erhalten werden (Rosenberg, S. A. et al., Science 223 (1984), 1412-1414, Nishimura, T. et al., Canc. Immunol. Immunother. 21 (1986), 12).
Wie vorstehend beschrieben, können Lymphokine eine Untergruppe von Lymphocyten des peripheren Bluts in LAK- Zellen umwandeln. Lymphocyten weisen charakteristischerweise einen runden Kern mit gut-kondensiertem Chromatin auf. Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Lymphocyten sind von R. I. Freshney (In: Culture of Animals Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., N. Y., (1983), S. 238) und Mazumber, A. et al. (Cancer 53 (1984), 896-905) beschrieben worden.
Wie erwähnt, ist eine Lymphokin-aktivierte Killer- Zelle eine Lymphocyten-Zelle von peripherem Blut, die durch Kontakt mit einem Lymphokin aktiviert worden ist. Obwohl der genaue Mechanismus, durch den LAK-Zellen produziert werden, nicht vollständig verstanden ist, ist zur Ausführung der Erfindung ein derartiges Verständnis nicht erforderlich, da die Möglichkeit bekannt ist, durch Inkubation von PBL-Zellen unter geeigneten in vitro-Gewebekulturbedingungen in Gegenwart eines Lymphokins LAK-Zellen spontan zu erzeugen. Die Menge Lymphokin, die dem Kulturmedium exogen zugesetzt wird, wird üblicherweise durch Verdünnen einer Stammlösung des Lymphokins und Ermitteln der kleinsten Menge Lymphokin bestimmt, die die Bildung der LAK-Zellen induzieren kann (Suzuki, R. et al., J. Immunol. 130 (1983), 981, Handa, K. et al., J. Immunol. 130 (1983), 988). Lediglich drei Einheiten/ml aber auch 1000 Einheiten/ml Interleukin-2 können zur Herstellung von LAK-Zellen aus PBL-Zellen verwendet werden. Eine Einheit Interleukin-2 ist als der Kehrwert der Verdünnung definiert, die 50% der maximalen [³H)TdR- Aufnahme durch NK-7-Zellen induziert. (Itoh, K. et al., J. Immunol. 134 (1985), 1345-1349).
Eine Verbindung wird als "exogen zugesetzt" bezeichnet, wenn ihre Konzentration in einer Zelle oder einem Medium durch Zusatz der Verbindung durch den die Erfindung Ausführenden erhöht worden ist. Dieser Zusatz kann entweder direkt durch Zusatz der Verbindung selber oder indirekt durch Zusatz eines Vorläufers der Verbindung erfolgen. Eine Verbindung wird nicht als exogen dem Medium zugesetzt bezeichnet, wenn sie normalerweise und natürlich entweder innerhalb einer Zelle oder in einem Kulturmedium vorkommt, und sofern ihre Konzentration nicht in einer mit der vorstehend gegebenen Definition übereinstimmenden Weise erhöht worden ist.
Die PBL-Zellen sollten mindestens einen Tag inkubiert werden (Itoh, K. et al., (1985)), der Prozentsatz PBL-Zellen, der zu LAK-Zellen aktiviert wird, steigt jedoch mit der Zeit an. Die PBL-Zellen werden vorzugsweise bei einer anfänglichen Konzentration von 10&sup6; bis 8·10&sup6; Zellen/ml gezüchtet. Normalerweise wird es vorgezogen, die Zellen nicht zu subkultivieren (d. h., die Zellkonzentration der Kultur durch Zusatz von weiteren, jedoch sterilen Medien aufzuteilen). Es ist wünschenswert, die LAK-induzierenden Bedingungen 3 bis 10 Tage beizubehalten. Nach der Produktion von LAK-Zellen können die Zellen in vitro über einen Zeitraum von mehr als zwei Monaten gezüchtet werden (Rayner, A. A. et al., Cancer 55 (1985), 1327-1333). Unter diesen Bedingungen wird ein Subkultivieren der LAK-Zellen vorgezogen, wobei eine Zellkonzentration von 10&sup4; bis 10&sup8; Zellen/ml aufrechterhalten wird. Da sich so vermehrte LAK-Zellen potentiell um mehr als das 10²&sup0;-fache vermehren können, kann die LAK-Zell-Therapie selbst bei Individuen (beispielsweise bei Krebspatienten) verwendet werden, von denen nur eine geringe Zahl von PBL-Zellen erhalten werden kann. Obwohl Interleukin-2 LAK-Zellen ohne Zusatz eines anderen Lymphokins erzeugen kann, wurde festgestellt, daß der Zusatz von weiteren Lymphokinen (beispielsweise Gamma-Interferon) die IL-2-induzierte LAK-Erzeugung erhöhen kann (Shiiba, K. et al., Cancer Immunol. Immunother. 21 (1986), 119-128).
LAK-Zellen können unterschiedliche Tumor-Gruppen angreifen (Grimm, E. A. et al., J. Exper. Med. 155 (1982), 1823-1841). Zu den Tumor-Arten, von denen angenommen wird, daß sie mit der LAK-Zell-Therapie behandelt werden können, gehören Sarcome des Weichteilgewebes, Melanome, Osteosarcome, Adenocarcinome (beispielsweise Dickdarm-, Eierstock- und Pancreas-Carcinome) Lymphome, Oesophagus-Carcinome und Nebennieren-Carcinome (Rayner, A. A. et al., Cancer 55 (1985), 1327-1333).
Ein wichtiger erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist der Befund, daß bestimmte nicht-proteinartige Verbindungen, die das endogene Enzym Kinase C aktivieren können, die Erzeugung von LAK-Zellen aus PBL-Zellen, die in einem Serum-freien Medium in Gegenwart eines Lymphokins gezüchtet worden sind, fördern können. Derartige aktivierende Verbindungen sind Acetylacylglycerine und Diacylglycerine (Ebeling, J. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 815-819, Mufson, R. A., Carcinogenesis 6 (1985), 1693-1698). Die Synthese der Diacylglycerine, die die Kinase C aktivieren, ist von Ebeling, J. G. et al., (1985), beschrieben worden.
Besonders bevorzugt sind die Diacylglycerine. Obwohl es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich ist, entweder ein racemisches Gemisch von Diacylglycerinen oder eines, das ungleiche Mengen der Diacylglycerin-Stereoisomere enthält, zu verwenden, wird es vorgezogen, die sn-1,2-Diacylglycerine zu verwenden. Besonders bevorzugt sind sn-1,2-Diacylglycerine mit kurzen gesättigten Acyl-Seitenketten (die zwischen 2 und 12, und vorzugsweise zwischen 4 oder 6 und 10 Kohlenstoffatome enthalten, z. B. sn-1,2-Dihexanoylglycerin, sn-1,2-Dioctanoylglycerin und sn-1,2-Didecanoylglycerin). Gemäß der vorliegenden Erfindung war das Diacylglycerin sn- 1,2-Dioctanoylglycerin (diC&sub8;), das eine Acyl-Seitenkette von 8 Kohlenstoffatomen aufwies, der am meisten bevorzugte Wirkstoff, um die Erzeugung und Vermehrung von LAK-Zellen zu fördern. Diese Verbindung kann eine derartige Wirkung vermitteln, wenn sie in einer Konzentration von mehr als 1 mg/l vorhanden ist, wobei dieser Wirkstoff jedoch mehr bevorzugt in einer Konzentration von 0,5 oder 1,0 bis 20 mg/l und am meisten bevorzugt in einer Konzentration von 5 bis 20 mg/l verwendet wird. Diese Verbindung ist im allgemeinen in Wasser nur wenig löslich (3 bis 5 mg/l). Die Löslichkeit der Verbindung kann jedoch durch Verwendung von solubilisierenden Wirkstoffen, beispielsweise Tween (in einer Konzentration von 1 bis 20 mg/l) oder Albumin (in einer Konzentration von 1000 bis 10 000 mg/l) auf 10 bis 20 mg/l erhöht werden.
Unterschiedliche Verfahren können verwendet werden, um festzustellen, ob eine bestimmte Verbindung Kinase C aktivieren kann. Blutplättchen beispielsweise können zuerst mit ³²P markiert und anschließend 30 Sekunden mit der Verbindung inkubiert werden. Mit den Zellen der Blutplättchen kann anschließend eine Lyse durchgeführt werden, und die aus ihnen freigesetzten Proteine können durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (beispielsweise unter Verwendung eines 11%-Polyacrylamidgels) und Autoradiographie analysiert werden. Die Gegenwart eines radiomarkierten 40 000 Dalton-Proteins zeigt, daß die potentiell aktivierende Verbindung die Kinase C tatsächlich aktivieren kann. Dieses Verfahren ist von Lapetina et al. (J. Biol. Chem. 260 (1985), 135-136) beschrieben worden. Andererseits kann die Fähigkeit einer Verbindung zur Aktivierung der Kinase C auch unter Verwendung zellfreier Kinase C enthaltender Zellextrakte getestet werden oder von gereinigter Kinase C Histon (Substrat), [Gamma - ³²P]ATP und Phosphatidylserin (in Gegenwart von Puffer, MgCl&sub2;, CaCl&sub2;, H&sub1;). Dieses Verfahren ist von Kraft, A. S. et al. (J. Biol. Chem. 757 (1982), 13193) beschrieben worden.
Ferner kann jedes Analog der Diacylglycerine (beispielsweise 1,2-Dicaprin, 1,2-Dicaproin und 1,2-Dicaprylin) oder Acetylacylglycerine (beispielsweise 1-Oleyl-2-acetylglycerin), das die Kinase C aktivieren kann, als erfindungsgemäßer aktivierender Wirkstoff verwendet werden.
Nachdem diese Erfindung zuvor allgemein beschrieben worden ist, wird sie unter Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele, die hier nur zur Veranschaulichung eingeschlossen sind und den Schutzbereich der Erfindung sofern nicht anders angegeben nicht einschränken sollen, besser zu verstehen sein.

Beispiel I

Das bevorzugte Medium zur Erzeugung von LAK-Zellen

Das vorstehend und in Tabelle 1 beschriebene Darfler- Grundmedium wurde hergestellt und die nachstehend aufgeführten Verbindungen zugesetzt: 50 E/ml Penicillin, 50 ug/ml Streptomycin, 10 ug/ml Gentamycin, 3 mg/l Ethanolamin, 2 mg/l menschliches Insulin, 5 mg/l menschliches Transferrin, 2500 mg/l menschliches Albumin (Fraktion V oder Fettsäurefreie Fraktion V), 1 mg/l Indomethacin (Fettsäure-frei), 0,003 mg/l Natriumselenit, 2600 mg/l HEPES-Puffer, (pH-Wert 7,0), 2500 mg/l Natriumbicarbonat, 3500 mg/l L-Glutamin, 55 mg/l Pyruvat (Natriumsalz), 1,5 mg/l Cholesterin, 3 mg/l Dilinoleoylphosphatidylcholin, 1 mg/l Linolsäure, 1 mg/l Palmitinsäure, 5 mg/l Tween 80 (Polyoxyethylensorbitan, Monooleat). Dem Medium wurde Wasser zugesetzt, um die Osmolalität auf 280 bis 300 mOsM einzustellen. Unmittelbar vor der Verwendung wurden dem Medium 600 E/ml rekombinantes Interleukin-2 zugesetzt. Wie nachstehend verwendet, erhält Darfler-Grundmedium dann die Bezeichnung "ergänztes Darfler- Medium", wenn alle vorstehend beschriebenen Verbindungen ausgenommen dem nicht-proteinartigen Aktivator der Kinase C zugesetzt worden sind. Wenn die aktivierende Verbindung dem ergänzten Darfler-Medium zugesetzt wird, dann wird das Medium als "komplettes Darfler-Medium" bezeichnet oder andererseits als ergänztes Darfler-Medium mit einer angegebenen Menge der aktivierenden Verbindung.

Beispiel II

Züchtung von Lymphocyten des peripheren Bluts in einem Serum-freien Medium

Menschliche Lymphocyten von peripherem Blut wurden nach dem Verfahren von Mazumder, A. et al. (Cancer 53 (1984), 896-905) gereinigt. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 2·10&sup6; Zellen/ml in 2 ml komplettem Darfler-Medium in 25 cm² T-Flaschen bei einem Feuchtigkeitsgehalt von 100% in einer 5% CO&sub2;-Atmosphäre bei 37ºC gezüchtet. Nach 7 Tagen wurden die Zellen mit einem Hämocytometer gezählt und unter Verwendung eines Cr-Freisetzungstests gemäß dem Verfahren von Mazumder et al. (1984) auf Cytotoxizität gegen Daudi-Zellen getestet. Durch dieses Verfahren wurde eine Kultur von PBL-Zellen etabliert.

Beispiel III

Diacylglycerin-enthaltendes Serum-freies Medium ermöglicht die Vermehrung von LAK-Zellen in Serum-freiem Medium während einer Inkubation von sieben Tagen

PBL-Zellen, die wie in Beispiel II beschrieben erhalten wurden, wurden gemäß dem Verfahren von Mazumder, A. et al. (Cancer 53 (1984), 896-905) in RPMI-1640-Medium gezüchtet, dem 2% menschliches Serum zugesetzt worden waren, oder wurden entweder in ergänztem Darfler-Medium (in Beispiel I beschrieben) oder in ergänztem Darfler-Medium, das 20 mg/l DiC&sub8; enthielt, inkubiert und sieben Tage bei 37ºC in einer 95% Luft und 5% CO&sub2; enthaltenden Atmosphäre inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die Cytotoxizität der gezüchteten Zellen ermittelt. Dieses Experiment zeigte, daß die Inkubation von PBL-Zellen in Serum-freiem Medium, das ein Diacyglycerin enthielt, LAK-Zellen mit 97% der Effizienz produzieren konnte, mit der solche Zellen nach der Inkubation in Serum-enthaltendem Medium erzeugt wurden. Im Gegensatz dazu produzierte Serum-freies Medium, dem Diacylglycerine fehlte, LAK-Zellen mit nur 1/3 der Effizienz von Serum-enthaltendem Medium. Diese Ergebnisse zeigen daher, daß ein Serum-freies Medium, das Diacylglycerine enthielt, ein Serum-enthaltendes Medium in der Erzeugung von LAK- Zellen ersetzen kann, und daß ein solches Serum-freies Medium LAK-Zellen mit einer Effizienz erzeugen kann, die der eines Serum-enthaltenden Mediums ungefähr gleich ist.

Beispiel IV

Zur Herstellung von LAK-Zellen erforderliche Interleukin-2- Mengen

PBL-Zellen wurden wie in Beispiel II beschrieben hergestellt und in vier Aliquots aufgeteilt, die anschließend entweder in 98% mit 2% Serum versetztem RPMI- 1640-Medium (Mazumder, A. et al. (1984)) oder in komplettem Darfler-Medium, das das Diacylglycerin sn-1,2-Dioctanoylglycerin zu 20 mg/l enthielt, inkubiert wurden. Das komplette Darfler-Medium enthielt entweder 100, 300 oder 1000 E/ml Interleukin-2. Nach einer Inkubation von sieben Tagen bei 37ºC in einer Atmosphäre von 95% Luft und 5% Kohlendioxid wurde die relative Effizienz der Vermehrung von LAK-Zellen ermittelt. Es wurde festgestellt, daß Serumfreies Medium, das 1000 Einheiten/ml Interleukin-2 enthielt, die LAK-Zellen, die Zielzellen lysierten, mit 52% der Effizienz produzierte, mit der solche Zellen durch Inkubation in Serum-enthaltendem Medium, das 1000 Einheiten/ml Interleukin-2 enthielt, produziert wurden. Es wurde jedoch festgestellt, daß Serum-freies Medium, das 300 oder 100 E/ml Interleukin-2 enthielt, die LAK-Zellen mit einer Effizienz von 106% bzw. 85% im Vergleich zum Serum-enthaltenden Kontrollmedium produzierte. Dieses Experiment zeigt, daß die Verwendung von Serum-freiem Medium, das Diacyglycerine enthielt, die Bildung von LAK-Zellen in Gegenwart von geringeren Mengen Interleukin-2 ermöglicht, als sie zur Bildung von LAK-Zellen in Serum-enthaltenden Medien erforderlich sind. Ein solches Ergebnis ist deswegen bedeutsam, da die Verfügbarkeit und die Kosten von Interleukin-2 ein signifikantes Hindernis zur Verwendung von therapeutischen Verabreichungsplänen mit LAK-Zellen darstellen.

Beispiel V

Inhibitoren des Diacylglycerin-Abbaus erhöhen die Produktion von LAK-Zellen

PBL-Zellen wurden wie in Beispiel II beschrieben hergestellt und in zwei Aliquots aufgeteilt, die anschließend in komplettem Darfler-Medium (das 5 mg/l sn-1,2-Dioctanoylglycerin, 1000 E/ml Interleukin-2, ferner 10 mg/l Tween 80 und außerdem 1,5 mg/l Cholesterin enthielt) in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mg/l 1-Monooleoyl-rac-glycerin inkubiert wurden. Nach einer Inkubation von sieben Tagen bei 37ºC in einer Atmosphäre aus 95% Luft und 5% Kohlendioxid wurde die relative Effizienz der LAK-Zellen bei der Lyse von Zielzellen ermittelt. In Abwesenheit von 1-Monooleoyl-racglycerin war die Lyse 35% bei einem Effektor:Ziel- Verhältnis von 8 : 1, 21% bei 4 : 1 und 13% bei 2 : 1. Im Gegensatz dazu war der Prozentsatz der Lyse in Gegenwart von 1-Monooleoyl-rac-glycerin 50, 33 bzw. 25. Ähnliche Ergebnisse wurden in zwei weiteren Experimenten erhalten, in denen 1-Monooleoyl-rac-glycerin-Spiegel von 5 bis 10 mg/l optimal war. Es wurde festgestellt, daß 5 mg/1 Monooleoylrac-glycerin die am meisten bevorzugte Konzentration war. Die Diacylglycerine und ihre Derivate werden aufgrund der Wirkung von Enzymen abgebaut, beispielsweise durch die Diacylglycerin-Kinase und die Diacylglycerin-Lipase. Wirkstoffe (d. h., chemische Verbindungen), die diesen Abbau hemmen, ergeben höhere interzelluläre Spiegel an Diacylglycerinen und ihrer Derivate. Da 1-Monooleoyl-rac-glycerin die Diacylglycerin-Kinase und die Diacylglycerin-Lipase hemmt (Bishop, W. R. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 12513-12519, und Bishop, W. R. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 6993-7000), weisen diese Daten darauf hin, daß die Hemmung dieser Enzyme in Zellen erhöhte intrazelluläre Spiegel an Diacylglycerin bewirkt. Durch die Aufnahme von l- Monooleoyl-rac-glycerin werden dementsprechend größere Zahlen von LAK-Zellen und eine erhöhte Killer-Aktivität oder beides bewirkt. Zu weiteren Inhibitoren des Diacylglycerin- Abbaus, die eine ähnliche Aktivität aufweisen können, gehören, jedoch ohne Beschränkung darauf, Dioctanoylethylenglycol, Dioctanoylglyceramid, Dioctanoylbutantriol und andere Analoge von Diacylglycerin und Monoacylglycerin.
Während die Erfindung im Zusammenhang mit speziellen Ausführungsformen beschrieben worden ist, versteht es sich, daß weitere Modifikationen möglich sind, und der Schutzbereich dieser Anmeldung soll sämtliche Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung einschließen, die allgemein den Lehren der Erfindung folgen und zu denen solche Abweichungen vom erfindungsgemäßen Offenbarungsgehalt gehören, deren Ausführung auf dem diese Erfindung betreffenden Fachgebiet bekannt oder üblich ist, wenn die wesentlichen, hier vorstehend beschriebenen Merkmale gelten und diese im Schutzbereich der angefügten Ansprüche liegen.

Claims

1. Verfahren zur Produktion einer Lymphokin-aktivierten Killerzelle, umfassend:

(a) Inkontaktbringen einer Lymphocyten-Zelle von peripherem Blut (PBL) mit einer Menge eines Kulturmediums, die ausreicht, um die in vitro-Züchtung der Lymphocytenzelle von peripherem Blut zu ermöglichen, wobei das Medium im wesentlichen frei von Serum ist und enthält:

(i) ein Lymphokin; und

(ii) eine nicht-proteinartige Verbindung, die zur Aktivierung des Enzyms Kinase C fähig ist, welche ein Diacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Diacylglycerins, oder ein Vorläufer eines Diacylglycerins, ein Acetylacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Acetylacylglycerins oder ein Vorläufer eines Acetylacylglycerins ist; und

(b) Halten der PBL-Zelle im Kulturmedium unter Bedingungen, die ausreichen, um die Produktion von Lymphokin-aktivierten Killerzellen zu ermöglichen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung ein Diacylglycerin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindung ein sn-1,2-Diacylglycerin ist.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Verbindung ein sn-1,2-Di(C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;)acylglycerin ist.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Verbindung sn-1,2-Dihexanoylglycerin, sn-1,2-Dioctanoylglycerin oder sn-1,2-Didecanoylglycerin ist.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Verbindung in einer Menge von 1,0 bis 20 mg/Liter vorliegt.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Verbindung in einer Menge von 5 bis 20 mg/Liter vorliegt.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Medium ein Mittel enthält, das zur Hemmung des Abbaus der nicht-proteinartigen Verbindung fähig ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Mittel ein Inhibitor des Enzyms Diacylglycerinkinase oder Diacylglycerinlipase ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Mittel 1-Monooleoyl-rac-glycerin, Dioctanoylethylenglykol, Dioctanoylglyceramid oder Dioctanoylbutantriol ist.

11. Lymphokin-aktivierte Killerzelle, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung in der Medizin.

12. Verwendung einer Lymphokin-aktivierten Killerzelle, die gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 hergestellt wurde, für die Herstellung eines Mittels zur Unterdrückung des Wachstums oder der Entwicklung einer Krebszelle.

13. Mittel enthaltend:

(a) eine in vitro gezüchtete Lymphocytenzelle von peripherem Blut oder eine Lymphokin-aktivierte Killerzelle;

(b) eine exogen zugefügte nicht-proteinartige Verbindung, die zur Aktivierung des Enzyms Kinase C fähig ist, die ein Diacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Diacylglycerins oder ein Vorläufer eines Diacylglycerins, ein Acetylacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Acetylacylglycerins oder ein Vorläufer eines Acetylacylglycerins ist; und

(c) ein Lymphokin; wobei das Mittel im wesentlichen frei von Serum ist.

14. Mittel nach Anspruch 13, wobei die Verbindung ein Diacylglycerin ist.

15. Mittel nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Verbindung ein sn-1,2-Di (C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;)acylglycerin ist.

16. Mittel nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei die Verbindung sn-1,2-Dihexanoylglycerin, sn-1,2-Dioctanoylglycerin oder sn-1,2-Didecanoylglycerin.

17. Kulturmedium, enthaltend ein Lymphokin und eine exogen zugesetzte nicht-proteinartige Verbindung, die zur Aktivierung des Enzyms Kinase C fähig ist, die ein Diacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Diacylglycerins, oder ein Vorläufer eines Diacylglycerins, ein Acetylacylglycerin, ein funktionelles Analog eines Acetylacylglycerins oder ein Vorläufer eines Acetylacylglycerins ist, das im wesentlichen frei von Serum ist.

18. Mittel nach Anspruch 17, wobei die Verbindung ein Diacylglycerin ist.

19. Mittel nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Verbindung ein sn-1,2-Di (C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;) acylglycerin ist.

20. Mittel nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Verbindung sn-1,2-Dihexanoylglycerin, sn-1,2-Dioctanoylglycerin oder sn-1,2-Didecanoylglycerin ist.