BRPI1015341B1 - Alfa-1 antitripsina humana recombinante (rhaat) e método para produzir alfa-1 antitripsina humana recombinante (rhaat) - Google Patents

Abstract

ALFA-1 ANTITRIPSINA HUMANA RECOMBINANTE (RHAAT), E, MÉTODO PARA PRODUZIR ALFA-1 ANTITRIPSINA HUMANA RECOMBINANTE (RHAAT), E USO DA MESMA. A presente invenção diz respeito a (alfa)-1 antitripsina humana recombinante (rhAAT) compreendendo glicanas ligadas ao N, em que pelo menos 10% das ditas glicanas ligadas ao N são glicanas tetra-antenárias; e o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N (Z/A) é pelo menos 50%. A invenção diz respeito adicionalmente a rhAAT para uso como um medicamento, em particular para uso na prevenção e/ou tratamento de uma doença associada com deficiência de AAT e/ou uma doença envolvendo dano do tecido mediado por neutrófilo.

Description

[001] A invenção diz respeito a o campo de produtos farmacêuticos, em particular a α-1 antitripsina humana recombinante, que pode ser usada inter alia para a prevenção e/ou tratamento de enfisema relacionada a deficiência de α-1 antitripsina.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O inibidor de α-1 antitripsina (AAT) ou α1-protease (α1PI) é um inibidor natural de proteases liberadas por neutrófilos ativados. AAT é uma glicoproteína que consiste em 394 aminoácidos e com um peso molecular de 52 kD. AAT humana é expressa como um precursor de 418 aminoácidos dos quais um precursor de 24 aminoácidos é cortado para produzir o produto final de 394 aminoácidos. AAT é sintetizada basicamente no fígado, mas a expressão tem também sido demonstrada em neutrófilos, monócitos e macrófagos.

[003] Níveis de plasma baixos ou zero de AAT constituem um fator de risco para o desenvolvimento de enfisema em virtude da ação não oposta e destrutiva de proteases do neutrófilo nos pulmões. Para a prevenção e/ou tratamento de enfisema relacionada a deficiência de AAT, foi desenvolvida terapia de aumento de AAT (Mulgrew et al., 2007).

[004] Simultaneamente, pacientes com enfisema associada a deficiência de AAT são tratados com uma dose alta de (pd)AAT derivada de plasma (60 mg/kg/semana; Prolastin® da Talecris, AralastR da Baxter e ZemairaR da ZLB). Grandes quantidades e injeções frequentes de AAT são exigidas para aliviar enfisema relacionada a deficiência de AAT. A preocupação principal com o material derivado de plasma é a segurança das preparações. Como com todo material derivado de humano, o risco potencial de pdAAT é a contaminação com príons ou outros agentes adventícios. Uma segunda preocupação é a disponibilidade limitada do material plasmático.

[005] AAT derivada de plasma humano contém três glicanas ligadas ao N nos resíduos Asn 46, 83 e 247. Essas glicanas consistem basicamente em estruturas di- e tri-antenárias. Um alto grau de sialilação das glicanas nas proteínas recombinantes é de importância para farmacocinéticas ideais (PK).

[006] Até agora a produção recombinante de AAT foi prejudicada pela baixa expressão na maioria das plataformas recombinantes (Karnaukhova et al., 2006). AAT recombinante foi produzida a alto nível em sistemas transgênicos, mas seu desenvolvimento clínico foi interrompido em decorrência de farmacocinéticas subideais (PK) e problemas de segurança em virtude dos contaminantes não humanos (Spencer et al., 2005).

[007] Continua a haver assim uma necessidade de AAT humana recombinante (rhAAT) que é ativa, que pode ser obtida em quantidades suficientes e que tem propriedades farmacocinéticas convenientes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] De acordo com a presente invenção, mostrou-se que α-1 antitripsina humana recombinante (rhAAT) com um perfil de farmacocinética adequado pode ser produzida em grandes quantidades em células PER.C6.

[009] Na pesquisa que levou à invenção, linhagens celulares que expressam AAT humana e que co-expressam uma α-2,3- sialiltransferase (ST3) ou uma α-2,6-sialiltransferase (ST6) foram geradas em condições sem soro. As linhagens celulares foram capazes de expressar altos níveis de rhAAT. Assim, rendimentos de até 22 picogramas de rhAAT por célula por dia (pcd) foram atingidos. Essencialmente, o rhAAT da invenção mostrou ser ativo como um inibidor de elastase do neutrófilo. Análise dos perfis de glicana mostrou um grau de recobrimento no geral bom com ácido siálico. Interessantemente, um aumento em glicanas tetra-antenárias foi notado na rhAAT da invenção, comparado com AAT derivada de plasma (Prolastin®). Além disso, rhAAT produzida em células que co- expressam ST3 apresentou um maior tempo de permanência médio (MRT) em ratos, comparado com AAT derivada de plasma. RhAAT produzida em células que co-expressam ST6 apresentou um menor tempo de permanência médio comparado com AAT derivada de plasma.

[010] Em um aspecto, a presente invenção, portanto, diz respeito a α-1 antitripsina humana recombinante (rhAAT) compreendendo glicanas ligadas ao N, em que: (a) pelo menos 10 % das ditas glicanas ligadas ao N são glicanas tetra-antenárias; e (b) o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N (Z/A) é pelo menos 50 %.

[011] Em uma outra modalidade, pelo menos 20 % das ditas glicanas ligadas ao N são glicanas tetra-antenárias.

[012] Em uma modalidade adicional, o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N que são tetra-antenárias é pelo menos 30 %.

[013] Em uma modalidade adicional, pelo menos 50 % da sialilação total nas ditas glicanas ligadas ao N é a-2,3-sialilação. Preferivelmente, pelo menos 90 % da sialilação total nas ditas glicanas ligadas ao N são α-2, 3 -sialilação.

[014] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a preparações e composições farmacêuticas compreendendo a dita rhAAT, e opcionalmente um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[015] Em um outro aspecto, a invenção diz respeito ao uso da dita rhAAT, preparações e/ou composições farmacêuticas, compreendendo a dita rhAAT, para a prevenção e/ou tratamento inter alia de enfisema e/ou doenças inflamatórias associadas a AAT com dano do tecido mediado por neutrófilo.

[016] Em uma modalidade adicional, a invenção diz respeito a um método para produzir α-1 antitripsina humana recombinante, compreendendo as etapas de prover um célula PER.C6 com um ácido nucléico que codifica α-1 antitripsina humana de uma tal maneira que a dita célula PER.C6 abrigue o dito ácido nucléico em um forma expressível; e cultivar a dita célula PER.C6 em condições condutivas para a produção da dita AAT humana recombinante, em que a dita célula PER.C6 é modificada para co-expressar α2,3 sialiltransferase ou α2,6-sialiltransferase.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS

[017] A figura 1 mostra a distribuição de frequência das produtividades específicas das culturas em lote, tanto para linhagens celulares que sobre-expressam α2,3 sialiltransferase (A: PER.C6-AAT- ST3) quanto células que sobre-expressam α2,6-sialiltransferase (B: PER.C6-AAT-ST6).

[018] A figura 2 mostra o gel BIS-Tris SDS-PAGE 4-12 % com cultura celular colhida de amostras de PER.C6-rAAT (não purificadas), manchadas com azul de coloidal.

[019] A figura 3 mostra a vista esquemática do ensaio para determinar o grau de sialilação das glicanas na AAT pela razão Z/A.

[020] A figura 4 mostra as produtividades específicas das linhagens celulares PER.C6 que expressam AAT não estão correlacionadas com o grau de sialilação das glicanas de PER.C6- rAAT (r de Spearman = -0,024, p = 0,893). (◊: PER.C6-AAT-ST3; o: PER.C6-AAT-ST6).

[021] A figura 5 mostra a sialilação (Figura 5A) e antenaridade (Figura 5B) das glicanas de PER.C6-rAAT provenientes das amostras negativas de ECL em comparação com as glicanas de PER.C6-rAAT provenientes das ECL amostras de FIG positivas e Prolastin®.

[022] A figura 6 mostra o grau de sialilação em todas glicanas (Figura 6A) e nas glicanas tetra-antenárias (Figura 6B) de PER.C6- rAAT-ST3 em comparação com as glicanas de PER.C6-rAAT-ST6 e Prolastin®.

[023] A figura 7 mostra os perfis do tempo de concentração de plasma para várias doses de Prolastin® em tampão (PBS/T) ou em PER.C6-CM depois de administração de bolo i.v. nos ratos. ■: Prolastin® em PER.C6-CM, 50 μg/kg; ▲: Prolastin® em PER.C6-CM, 100 μg/kg: •: Prolastin® em PER.C6-CM, 200 μg/kg; o:Prolastin® em PBS/T, 2.000 μg/kg.

[024] A figura 8 mostra os perfis do tempo de concentração de plasma para PER.C6-rAAT-ST3, PER.C6-rAAT-ST6 e Prolastin®. ▲: PER.C6-rAAT-ST3, MRT -18-23 horas; ■: PER.C6-rAAT-ST6, MRT -44 horas; •: Prolastin, MRT -11-12 horas.

[025] A figura 9 mostra os mapas de plasmídeo dos vetores de expressão AAT pAATopt-ST3 (a) e pAATopt-ST6 (B). CMV= promotor de citomegalovírus, BGHp(A) = sequência de poliadenilação do Hormônio do Crescimento Bovino, fl ori= origem fl de replicação, SV40 = promotor do Vírus Simian 40, Neo = Marcador de resistência a neomicina, SV40p(A) = sequência de poliadenilação do Vírus Simian 40, AAT = alfa1 antitripsina, COIEI = origem COIEI de replicação, Amp= marcador de resistência as ampicilina, SIAT4C =gene que codifica para ST3 = sialiltransferase de humano IV (L23767) (Figura 9A), SIATl = gene que codifica para ST6 = sialiltransferase de humano I (NM_003032).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[026] Alfa1 antitripsina (AAT) é um inibidor natural de proteases liberadas por neutrófilos ativados. AAT é secretada no plasma sanguíneo, mas seu sítio de ação basicamente é no parênquima do pulmão. Elastase do leucócito humano (HLE) (também conhecido como elastase do neutrófilo humano (HNE) é uma protease serina liberada dos grânulos azurofílicos dos neutrófilos como parte da resposta inflamatória normal. Em condições homeostáticas normais AAT serve como um importante regulador de proteólise por elastase do leucócito humano (HLE), prevenindo assim dano da matriz alveolar do pulmão. Além de HLE, AAT também inibe duas outras proteases liberadas nos pulmões por neutrófilos, a saber, catepsina G (catG) e protease 3 (Pr3).

[027] Produtos de AAT derivada de plasma foram desenvolvidos e são simultaneamente usados para o tratamento de pacientes que sofrem de enfisema relacionada a deficiência de AAT (isto é, com níveis de AAT de plasma baixos ou zero), tais como Prolastin®, (Talecris), Aralast® (Baxter) e Zemaira® (ZLB). Altas quantidades (aproximadamente 60 mg/kg/ semana) deste produto são geralmente necessárias por paciente. Além de enfisema, AAT é também uma terapia (potencial) para doenças inflamatórias com dano mediado por neutrófilo

[028] Produção recombinante de AAT, por exemplo, em E.coli foi prejudicada por baixa expressão na maioria das plataformas recombinantes (Karnaukhova et al., 2006). AAT recombinante foi produzida a alto nível em sistemas transgênicos, mas seu desenvolvimento clínico foi interrompido em decorrência de farmacocinéticas subideais (PK) e problemas de segurança em virtude de contaminantes não humanos (Spencer et al., 2005).

[029] A presente invenção diz respeito agora a uma α-1 antitripsina humana recombinante (rhAAT) com propriedades farmacocinéticas adequadas e que pode ser produzida em grandes quantidades, por exemplo, em células PER.C6. A AAT recombinante da presente invenção mostrou ser funcionalmente ativa, conforme determinado por um ensaio cromogênico baseado na inibição de elastase do neutrófilo humano, e ter propriedades farmacocinéticas promissoras, comparado com produtos de AAT derivada de plasma, tal como Prolastin®.

[030] A presente invenção assim diz respeito a rhAAT compreendendo glicanas ligadas ao N, em que a) pelo menos 10 % das ditas glicanas ligadas ao N são glicanas tetra-antenárias; e b) o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N (Z/A) é pelo menos 50 %.

[031] Glicanas ligadas ao N são cadeias de açúcar que são covalentemente ligadas aos resíduos de asparagina de um polipeptídeo (Varki et al. 1999). O processo de N-glicosilação começa com a anexação de um precursor de oligossacarídeo de dolicol no precursor de asparaginas. Este precursor é subsequentemente modificado em um oligossacarídeo de alta manose, híbrido, ou tipo complexo. Em açúcares ligados ao N tipo complexo, tanto os resíduos de manose ligados a α3- quanto α6- são substituídos por resíduos N- acetil-glicosamina (GIcNAc). Glicanas N tipo complexo podem conter duas a cinco ramificações que levam GlcNAc que são referidos como antenas. A estrutura final de açúcares ligados ao N tipo complexo pode variar extensivamente e depende da proteína na qual ela é anexada, da célula hospedeira e das condições nas quais a célula hospedeira é cultivada. As ramificações que levam GlcNAc podem ser modificadas com galactose (Gal) ou N-acetil-galactosamina (GaINAc) formando as assim chamadas estruturas LacNAc ou LacdiNAc. Também, ramificações que levam GlcNAc podem conter múltiplas estruturas LacNAc formando as assim chamadas estruturas de polilactosamina. Galactoses terminais podem ser modificadas com ácido siálico ligado a um α2,3- ou um α2,6- enquanto N-acetil-galactosominas terminais podem ser modificadas somente com ácido siálico ligado a um α2,6-. A adição de ácidos siliáticos no Gal ou GaINAc terminal é mediada por sialiltransferases. Provavelmente mais que 20 diferentes sialiltransferases são codificadas pelo genoma humano (Harduin-Lepers et al., 2001). Eles diferem em especificidade de substrato, distribuição de tecido e vários parâmetros bioquímicos.

[032] AAT nativa tem três sítios de glicosilação. Assim, AAT compreende três glicanas ligadas ao N nas quais ramificações podem ocorrer. Essas glicanas podem ter 2, 3 ou 4 assim chamadas "antenas" ou ramificações. Surpreendentemente, mostrou-se que pelo menos 10 %, preferivelmente de cerca de 10 % a cerca de 50 %, das ditas glicanas ligadas ao N da rhAAT da invenção são glicanas tetra- antenárias. Em uma outra modalidade, pelo menos 20 % das ditas glicanas ligadas ao N são glicanas tetra-antenárias, preferivelmente de cerca de 20 a 40 % das ditas glicanas ligadas ao N são glicanas tetra- antenárias. De acordo com a presente invenção, mostrou-se surpreendentemente que o perfil de glicosilação, por exemplo, em termos de antenaridade, bem como as propriedades farmacocinéticas, por exemplo, o tempo de permanência médio da rhAAT da invenção difere de AAT derivada de plasma, tal como Prolastin®.

[033] Uma vez que sialilação total das glicanas nas proteínas recombinantes é de importância para propriedades farmacocinéticas ideais, a rhAAT da presente invenção é expressa nas células PER.C6 em combinação com uma sialiltransferase para obter isoformas altamente sialiladas de rhAAT. Células PER.C6 foram assim cotransfectadas tanto com um α2,3 sialiltransferase (PER.C6-ST3) quanto um α2,6 sialiltransferase (PER.C6-ST6). Em uma modalidade preferida da invenção, pelo menos 50 % da sialilação total nas ditas glicanas ligadas ao N é α-2, 3 -sialilação Por exemplo, pelo menos 50, 70 ou 80 % da sialilação total nas ditas glicanas ligadas ao N é α-2,3- sialilação. Ainda em uma outra modalidade pelo menos 90 % da sialilação total nas ditas glicanas ligadas ao N é a-2,3-sialilação. Mostrou-se surpreendentemente que nestas modalidades a rhAAT da presente invenção tem diferentes propriedades farmacocinéticas, comparadas com AAT derivada de plasma, tal como Prolastin®, em particular um tempo de permanência médio prolongado. Por sialilação deve-se entender a quantidade de resíduos siliáticos presentes nas estruturas de carboidrato de AAT: α-2, 3 -sialilação significa sialilação na posição 2,3, isto é, um ácido siálico ligado α2,3- (como é bem conhecido na tecnologia) e α-2,6 - sialilação significa sialilação na posição 2,6, isto é, um ácido siálico ligado ou um α2,6- (também conhecido na tecnologia). Com "pelo menos 50 % da sialilação total nas ditas glicanas ligadas ao N é α-2,3 -sialilação", significa assim que pelo menos 50 % do número total de resíduos de ácido siálico presentes na rhAAT é sialilada na posição 2,3.

[034] De acordo com a invenção, mostrou-se em estudos PK em rato que o tempo de permanência médio (MRT) tanto de rhAAT produzida por PER.C6-ST3 (rhAAT-ST3) quanto rhAAT produzida por PER.C6-ST6 (rhAAT-ST6) difere significativamente daquele de AAT derivada de plasma (Prolastin®). Mostrou-se assim que o MRT em ratos de rhAAT-ST3 varia de aproximadamente 18-23 horas, enquanto que o MRT em ratos de Prolastin® é aproximadamente 11-12 horas. O uso de rhAAT com um MRT prolongado pode, por exemplo, reduzir a dosagem necessária por paciente. Ao contrário, o MRT em ratos de rhAAT-ST6 é reduzido comparado com aquele de Prolastin® (aproximadamente 3-4 horas). O uso de rhAAT -ST6 da presente invenção pode ser vantajoso em virtude da ligação 2,6 "mais natural" do ácido siálico, que corresponde a ligação do ácido siálico na AAT derivada de plasma, tal como Prolastin®. O uso de rhAAT-ST6 pode, além disso, ser vantajoso em casos onde um MRT reduzido pode ser benéfico.

[035] Conforme declarado anteriormente, o grau de sialilação das glicanas nas proteínas recombinantes é de importância para propriedades farmacocinéticas ideais. Em uma modalidade preferida, o grau de recobrimento total com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N (calculado pela razão Z/A) da rhAAT da presente invenção é, portanto, pelo menos 70 %. Mais preferivelmente, o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N (ZIK) é pelo menos 80 %, ainda mais preferivelmente o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N (Z/A) é pelo menos 90 %.

[036] Em uma modalidade adicional, o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N que são tetra-antenárias é pelo menos 20 %, por exemplo, entre 20 % e 65 %. Um grau de sialilação relativamente baixo nas ditas glicanas N tetra-antenárias pode render um produto de rhAAT com um MRT reduzido, comparado com AAT derivada de plasma. Em uma outra modalidade, o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas tetra-antenárias ligadas ao N é pelo menos 50 %, por exemplo, entre 50 % e 97 %, preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente entre 70 e 95 %. O nível de sialilação mais alto nesta modalidade pode contribuir com o MRT prolongado, comparado com AAT derivada de plasma.

[037] A invenção, além disso, diz respeito a preparações e composições farmacêuticas, compreendendo a dita rhAAT e opcionalmente um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Por "excipiente farmaceuticamente aceitável" deve-se entender qualquer substância inerte que é combinada com uma molécula ativa (tais como um medicamento, agente, ou proteína) para preparar uma forma de dosagem adequada ou conveniente. O "excipiente farmaceuticamente aceitável" é um excipiente que é não tóxico para recipientes nas dosagens e concentrações empregadas e é compatível com outros ingredientes da formulação compreendendo a molécula ativa.

[038] As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas em várias composições para qualquer via de administração, bem conhecida pelos versados na tecnologia. A escolha da via de administração ideal das composições farmacêuticas será influenciada por diversos fatores, incluindo, por exemplo, as propriedades fisicoquímicas das moléculas ativas nas composições, a urgência da situação clínica e o relacionamento das concentrações de plasma das moléculas ativas com o efeito terapêutico desejado. As preparações e composições farmacêuticas da presente invenção são preferivelmente formuladas para administração intravenosa ou administração em aerossol. As formulações farmaceuticamente adequadas de rhAAT podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos pelos versados na tecnologia (ver Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formution Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)).

[039] Tipicamente, composições farmacêuticas devem ser estéreis e estáveis nas condições de fabricação e armazenamento. As preparações e/ou composições farmacêuticas compreendendo a rhAAT da invenção podem ser em forma de pó para reconstituição no excipiente farmaceuticamente aceitável apropriado antes ou no momento de distribuição. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução previamente filtrada estéril deste.

[040] Alternativamente, a rhAAT da presente invenção pode ser em solução e o excipiente farmaceuticamente aceitável apropriado pode ser adicionado e/ou misturado antes ou no momento de distribuição para fornecer uma forma injetável de dosagem única.

[041] A rhAAT, as preparações ou composições farmacêuticas, compreendendo a dita rhAAT, podem ser usadas como medicamentos. A rhAAT, as preparações e composições farmacêuticas podem ser adequadamente usadas na prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou distúrbios para as quais a administração de AAT se mostrou benéfica. Elas podem inter alia ser usadas na prevenção e/ou tratamento, ou combinação destes, de enfisema associada a deficiência de AAT. A rhAAT, preparações ou composições farmacêuticas da presente invenção podem adicionalmente ser usadas na prevenção e/ou tratamento de enfisema relacionada ao fumo, fibrose cística (CF), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). Uma vez que AAT foi descrito ter efeitos anti-inflamatório e antiapoptóticos, a rhAAT, preparações ou composições farmacêuticas da presente invenção podem também ser usadas como agentes anti-inflamatórios. (Lewis et al, 2008; Koulmanda et al, 2008)

[042] Em uma modalidade adicional, a invenção diz respeito a um método para produzir α-1 antitripsina humana recombinante, compreendendo as etapas de prover uma célula PER.C6 com um ácido nucléico que codifica α-1 antitripsina humana de uma tal maneira que a dita célula PER.C6 abrigue o dito ácido nucléico em um forma expressível; e cultivar a dita célula PER.C6 em condições condutivas para a produção da dita α-1 antitripsina humana recombinante, em que a dita célula contém adicionalmente um sequência de ácido nucléico que codifica uma sialiltransferase, preferivelmente uma alfa-2,6- sialiltransferase ou uma alfa-2,3-sialiltransferase, sobre controle de um promotor heterológo. Em uma modalidade, a sialiltransferase é uma sialiltransferase de humano. A rhAAT da presente invenção pode, entretanto, também ser produzida em outras células de mamífero, opcionalmente que co-expressam uma sialiltransferase, tais como, por exemplo, 293 células.

[043] Em uma modalidade, a invenção diz respeito a um método para produzir α-1 antitripsina humana recombinante, compreendendo as etapas de prover um célula PER.C6 com um ácido nucléico que codifica α-1 antitripsina humana de uma tal maneira que a dita célula PER.C6 abrigue o dito ácido nucléico em um formato expressível, em que a dita célula contém adicionalmente uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sialiltransferase, preferivelmente uma alfa- 2,6-sialiltransferase ou uma alfa-2,3-sialiltransferase, sobre controle de um promotor heterológo; cultivar a dita célula PER.C6 em um meio sem soro e permitir expressão de dita α-1 antitripsina humana na dita célula; colhendo a α-1 antitripsina humana expressa a partir da dita célula e/ou a partir do dito meio de cultura; e opcionalmente purificar a dita αl-antitripsina humana.

[044] O uso de células PER.C6 como uma plataforma de produção para proteínas de interesse foi descrito em WO 00/63403 a revelação das quais está incorporada aqui pela referência. Conforme mostrado em WO 00/63403, PER.C6 pode ser adequadamente usada para a produção de proteínas recombinantes. A fim de obter produção em grande escala (contínua) de proteínas recombinantes através da cultura celular, prefere-se ter células capazes de crescer sem a necessidade de ancoragem. As células da presente invenção tiveram esta capacidade. Uma célula PER.C6 de acordo com esta invenção é uma célula de uma passagem à montante ou à jusante ou um descendente de uma passagem à montante ou à jusante de células conforme depositado no Center of Applied Microbiology and Research & European Collection of Cell Culture (ECACC) em 29 de fevereiro de 2006 com ECACC no. 96022940 (ver, por exemplo, patente U.S 5.994.128). O uso de células PER.C6 para processos industriais foi extensivamente descrito, por exemplo, em Nichols et al, 2002, e mais em particular para produção de proteína recombinante, por exemplo, em Yallop et al, 2005a e 2005b.

[045] As células, de acordo com o invenção, em particular células PER.C6, têm a vantagem adicional de que elas podem ser cultivadas na ausência de soro derivado de animal ou humano ou componentes de soro derivado de animal ou humano. Assim isolamento é mais fácil, embora a segurança seja aumentada em virtude da ausência de proteínas humanas ou animais adicionais na cultura, e o sistema seja muito confiável (meios sintéticos são os melhores em reprodutividade). Além disso, a presença da região Early 1A ("E1A") de adenovírus adiciona um outro nível de vantagens comparado com linhagens celulares (humanas) que não tem este gene particular. E1A como um ativador transcricional é conhecido por melhorar a transcrição do melhorador/promotor dos genes CMV Immediate Early (Olive et al., 1990, Gorman et al., 1989). Quando a proteína recombinante a ser produzida está sobre o controle do melhorador/promotor de CMV, os níveis de expressão aumentam nas células, e não nas células que não têm E1A.

[046] Em geral, a produção de uma proteína recombinante, tal como rhAAT, em uma célula hospedeira, tal como uma célula PER.C6, compreende a introdução de ácido nucléico em formato expressível na célula hospedeira, cultura das células em condições condutivas para expressão do ácido nucléico e expressão natural do dito ácido nucléico nas ditas células. Alternativamente, uma proteína que é naturalmente expressa em células hospedeiras desejada, mas não a níveis suficientes, pode ser expressa a níveis maiores introduzindo sequências de regulação adequadas tal como um promotor forte em associação operável com o gene desejado (ver, por exemplo, WO 99/05268, onde o gene EPO endógeno é sobre-expresso pela introdução de um promotor forte à montante do gene em células humanas).

[047] Ácido nucléico que codifica AAT em formato expressível pode ser na forma de um cassete de expressão, e normalmente exige sequências capazes de realizar expressão do ácido nucléico, tais como melhorador(s), promotor, sinal de poliadenilação e similares. Diversos promotores podem ser usados para expressão de ácido nucléico recombinante, e estes podem compreender promotores virais, mamíferos, sintéticos e similares. Em certas modalidades, um promotor que aciona a expressão do ácido nucléico de interesse é o promotor CMV anterior imediata, por exemplo, compreendendo nt. - 735 a +95 do gene melhorador/promotor de CMV anterior imediato, uma vez que este promotor mostrou dar altos níveis de expressão em células que expressam E1A de um adenovírus (ver, por exemplo, WO 03/051927). O ácido nucléico de interesse pode ser um DNA genômico, um DNAc, DNA sintético, uma combinação desses, etc.

[048] Meios de cultura celular são disponíveis por vários fornecedores, e meios de cultura sem soro são hoje em dia frequentemente usados para cultura celular, em decorrência de eles serem mais definidos do que os meios contendo soro. As células da presente invenção crescem bem em meios contendo soro bem como em meios sem soro. As células da invenção em geral crescem aderentemente em meios contendo soro, mas são muito proficientes em crescimento em suspensão para altas densidades de célula (10x106 células/mL e maiores) em meios de cultura sem soro, que significa que eles não precisam de uma superfície para aderir, mas continuam relativamente livres uns dos outros e das paredes do vaso de cultura na maior parte do tempo. Processos para cultivar as células da invenção a altas densidades e/ou para obter rendimentos de produto muito alto a partir dessas células foram descritos (WO 2004/099396).

[049] O conceito de engenharia genética para alterar glicosilação de proteínas recombinantes produzidas em uma célula foi amplamente estabelecido, e é, por exemplo, discutido com detalhes, por exemplo, em US 2005/0164386. Com este propósito, ácido nucléico que codifica a enzima de glicosilação desejada em formato expressível é ou foi introduzido nas células de acordo com a invenção, e a enzima de glicosilação desejada é expressa durante o cultivo das células de acordo com a invenção quando a proteína de interesse é expressa. Isto resulta em um padrão de glicosilação alterado da proteína de interesse comparado com a situação de quando não é expressa nenhuma enzima de glicosilação recombinante nas células. Na presente invenção, a enzima de glicosilação é uma sialiltransferase, mais preferida uma alfa-2,3-sialiltransferase e/ou uma alfa-2,6- sialiltransferase. Preferivelmente, a sialiltransferase codificada é um sialiltransferase de mamífero, mais preferivelmente uma sialiltransferase de humano. O ácido nucléico que codifica a sialiltransferase preferivelmente está sobre controle de um promotor heterológo, que deveria ser ativo ou teria a possibilidade de ser regulado nas células da invenção. Preferivelmente, o ácido nucléico que codifica a sialiltransferase é integrado no genoma das células, para assegurar herança estável, e fornecer expressão estável da sialiltransferase em gerações subsequentes das células.

[050] A invenção, além disso, diz respeito a AAT humana recombinante, obtenível pelos métodos de acordo com a invenção. De acordo com a invenção, a rhAAT tem um padrão de glicosilação de humano diferente da proteína contraparte humana natural isolada. A presente invenção em particular diz respeito a rhAAT compreendendo glicanas ligadas ao N, em que pelo menos 10 % das ditas glicanas ligadas ao N são glicanas tetra-antenárias. Além do mais, a rhAAT obtenível de acordo com a presente invenção tem propriedades farmacocinéticas surpreendentes.

[051] AAT humana recombinante de acordo com a invenção inclui AAT humana de comprimento total, mas também pode englobar fragmentos polipeptídeos biologicamente ativos, tais como fragmentos de AAT humana com uma ou mais deleções de aminoácido, por exemplo, no terminal N da proteína, bem como variantes biologicamente ativas de AAT humana, tais como AAT com uma ou mais substituições de aminoácido (por exemplo, substituições conservativas), uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos, que não mudam significativamente a atividade funcional da proteína. Em uma modalidade, a rhAAT da presente invenção compreende um sequência de aminoácidos fornecida aqui como SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, sequências de aminoácidos de variantes AAT são pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % homólogas com SEQ ID NO: 1.

[052] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Geração de linhagem celular e produtividades específicas

[053] Setecentas linhagens celulares PER.C6 que expressam AAT humana e que co-expressam tanto uma α2,6-sialiltransferase (SIATl; NM_003032) quanto uma α2,3-sialiltransferase (SIAT4C; L23767) (PER.C6-AAT-ST3/ PER.C6-AAT.ST6) foram geradas em condições sem soro, conforme descrito em WO 2006/070011. Quarenta e sete linhagens celulares PER.C6 sem soro produzindo tanto AAT-ST3 (27 linhagens celulares) quanto AAT-ST6 (20 linhagens celulares) foram selecionadas com base na produção mais alta determinada por ELISA (AAT Elisa Kit, US Biologicals) a partir da geração independente de programas de linhagem celular usando nucleofecção como ferramenta de transfecção. O plasmídeo de expressão conteve a sequência de codificação para AAT humana (SEQ ID NO:2) e a sequência de codificação para ST3GalIV de humano, ambas acionadas por um promotor de citomegalovírus que foi modificado para obter altos níveis de expressão do gene em células PER.C6 (Yallop et al, 2005). Os mapas de plasmídeo dos vetores de expressão de AAT (pAATopt-ST3 e pAATopt-ST6) são mostrados na figura 9.

[054] A produtividade das linhagens celulares variou entre 8-22 picogramas por célula por dia (pcd) (PER.C6-AAT-ST3) e 7-19 pcd (PER.C6-AAT-ST6) (ver figura 1 e Tabelas 1 e 2). As linhagens celulares foram criopreservadas em meio ProPer-1 (Lonza) (6 tubos, 3-5x106 células/mL), meeting todos os critérios de aceitação (viabilidade > 80 %, bom crescimento de duas passagens após ressuscitação). Culturas em lote foram geradas (em meio ProPer-1), que foram usadas para análise bioquímica (ver Exemplo 2). EXEMPLO 2 Análise bioquímica Integridade de PER.C6-r AAT

[055] Os sobrenadantes das 47 culturas em lote foram analisados no SDS-PAGE manchado com azul coloidal. Colheita de cultura celular das amostras de PER.C6-rAAT (não purificada) mostrou AAT como a principal faixa de proteína em SDS-PAGE. Além disso, os géis mostraram faixas de AAT intactas (mostrado na figura 2), indicando a integridade do material. Atividade de PER.C6-rAAT

[056] Inicialmente (em vez de um ensaio de atividade cromogênica), uma indicação para atividade foi determinada analisando a formação de um complexo de PER.C6-rAAT com elastase do neutrófilo humano. Com esta finalidade, cultura celular colhida de amostras de PER.C6-rAAT foram incubadas com 0, 0,1, 0,2 e 0,4 μg de elastase por 30 minutos a 37 °C e subsequentemente aplicadas em um SDS-PAGE BIS-Tris 4-12 % e manchadas com azul de coloidal). Todas amostras de PER.C6-rAAT testadas formaram um complexo com elastase (dados não mostrados), indicando atividade das preparações. Teste de atividade adicional foi feito com um ensaio cromogênico baseado na inibição de elastase do neutrófilo humano usando Prolastin® como referência (adaptado pela Bruin et al, 2005)). Todas as amostras de PER.C6-rAAT testadas, exceto para uma (PER.C6-rAAT-ST3-234c), foram pelo menos tão ativas quanto Prolastin® (>90 %) (Tabelas 1 e 2). Análise de glicana de PER.C6-rAAT

[057] Para classificar amostras de PER.C6-rAAT de quais as glicanas tiveram um alto grau relativo de recobrimento com ácido siálico, necessário para um perfil de PK ideal, foi aplicado um ensaio de lectina, usando lectina Erythrina cristagalli (ECL) para detecção de galactoses expostas (ver figura 3 para uma vista esquemática do ensaio usado). Das 47 amostras testadas, 15 mostraram um sinal a OD405 com ECL > blank + 0,2, indicando um grau relativamente alto de exposição de galactoses terminais nas glicanas dessas amostras de AAT. Para algumas dessas amostras o baixo grau de recobrimento das glicanas por ácido siálico foi confirmado por análise de glicana adicional usando um método baseado em HPLC (Hermentin et al., 1996; Gervais et al., 2003). Portanto, as amostras de rhAAT com um sinal ECL a OD405 > blank + 0,2 não foram adicionalmente submetidas a análise de glicana prolongada e não testadas em estudos PK.

[058] O método de perfilamento de glicana prolongado está mostrado esquematicamente na figura 3 e envolve a liberação das glicanas ligadas ao N da AAT com a enzima N-glicosidase F (PNGaseF), e marcação das glicanas com ácido 2-antranílico fluorescente (2-aa). Subsequentemente, as glicanas são separadas por cromatografia de troca aniônica (AEX) nos grupos de acordo com sua carga negativa, isto é, separação de glicanas com diferentes números de ácido siálico. A partir deste perfil, um número Z, representando o grau de carga (isto é, sialilação) das glicanas ligadas ao N, é determinado. A fórmula para Z: Z = (AAsialox0)+(AMonosialox1)(ADisialox2)+(ATrisialox3)+(ATetrasialox4) (A= area, Hermentin et pelo menos, 1996).

[059] Além disso, as glicanas dessialiladas são separadas por cromatografia de fase normal (NP) nos grupos de acordo com seu tamanho, isto é, separação de glicanas com diferente grau de ramificação (antenaridade). A partir deste perfil, um número A, representando o grau de ramificação das glicanas ligadas ao N, é determinado. A fórmula para A: A= (ADiantenáriox2)+(ATriantenáriox3)+ATetra-antenáriox4)

[060] Finalmente, calculando a razão Z/A, o grau (porcentagem) de recobrimento por ácido siálico das glicanas ligadas ao N de uma glicoproteína é obtido (Gervais et al., 2003).

[061] Os perfis de glicana de PER.C6-rAAT são mostrados nas tabelas 1 e 2. Os perfis totais de amostras de PER.C6-rAAT (Tabelas 1 e 2) mostram 12-54 % de di-antenas, 13-39 % de tri-antenas e 22-48 % de tetra-antenas e 0-55 % de di-sialo, 0-30 % de tri-sialo, 0-29 % de tetra-sialo. O grau de recobrimento das glicanas por ácido siálico de PER.C6-rAAT varia de 0 a 92 %, este grau de recobrimento com ácido siálico não é correlacionado com as produtividades específicas das linhagens celulares de PER.C6-rAAT (Spearman's r=-0,024, p=0,893) (Tabelas 1 e 2 e Figura 4).

[062] Conforme esperado, as glicanas do rAAT de ECL positivo contêm um nível mais baixo de carga (sialilação) (faixa de número Z: 0-124) versus a PER.C6 -rAAT de ECL negativo (faixa de número Z: 151-253) (diferença é significante conforme testado pelo teste Mann- Whitney, p<0,001) (ver figura 5). As glicanas de PER.C6-rAAT de ECL positivo contêm um nível mais alto de antenaridade (faixa de número A: 299-322) versus a PER.C6-rAAT de ECL negativo (faixa de número A: 266-307) (diferença é significante conforme testado pelo teste Mann-Whitney, p < 0,001) (ver figura 5). Além disso, existe um grau mais baixo de sialilação nas glicanas tetra-antenárias de PER.C6- rAAT-ST6 (ECL negativo), variando de 6 a 62 % versus PER.C6-rAAT- ST3 (ECL negativo), variando de 35 a 106 % (diferença é significante conforme testado pelo teste Mann-Whitney, p<0,001), embora isto não seja o caso para o grau total de sialilação (Tabelas 1 e 2, Figura 6). A preferência mais baixa de ST6 para glicanas ramificadas superiores (Joziasse et al, 1987) pode ser a causa do grau mais baixo de sialilação nas glicanas tetra-antenárias de PER.C6-rAAT-ST6 versus PER.C6-rAAT-ST3.

[063] Os perfis de glicana indicam uma tendência para um grau mais alto de ramificação nas glicanas de PER.C6-rAAT em comparação com AAT derivada de plasma (Prolastin®), uma vez que o perfil para Prolastin® é: 80 % di-antenas, 18 % tri-antenas e 2 % tetra- antenas (Tabelas 1 e 2). Este fenômeno é também claro a partir da comparação dos números A (Figura 5 e Tabelas 1 e 2). O grau de recobrimento das glicanas por ácido siálico de Prolastin® é 96 % (Tabelas 1 e 2). EXEMPLO 3 Farmacocinéticas de PER.C6-rAAT em um modelo de rato

[064] Um modelo de rato foi estabelecido para determinar a farmacocinética (PK) de PER.C6-rAAT. O modelo deveria ser apto para detectar AAT presente em meio condicionado de PER.C6 não purificada (CM) a concentrações de cerca de 40-100 μg/mL (a 2 mL/kg resultando em doses de cerca de 80-200 μg/kg).

[065] Quatro experimentos foram realizados: os dois primeiros para estabelecer o modelo e o segundo, terceiro e quarto experimentos para selecionar as linhagens celulares de PER.C6-rAAT produzindo rAAT com características PK mais ideais. Nesses estudos, pdAAT de humano (Prolastin®) foi usada para estabelecer o modelo e a referência. O procedimento experimental foi com a seguir: ratos (Wistar machos, 8 semanas de idade) foram dosados i.v. na veia da cauda com as amostras do teste de AAT (volume de dose 2 mL/kg, faixa de dose 50-200 μg/kg, n=3 ratos por grupo). Sangue foi amostrado da pré-dose da ponta da cauda e em vários pontos de tempo após a administração da dose. O sangue foi coletado em microvettes K2EDTA e plasma foi preparado. A concentração de AAT residual nas amostras de plasma foi subsequentemente determinada por ELISA (AAT Elisa Kit, Affinity Biologicals). Os dados obtidos foram modelados por rato com um modelo de 2 compartimentos e parâmetros PK foram subsequentemente determinados.

[066] Conforme mostrado pelos dados a partir de experimento 1 (ver figura 7) observou-se que o modelo foi adequado para determinar o perfil de PK em amostras não purificadas em decorrência da concentração de plasma versus curvas de tempo de Prolastin® com pico no controle de PER.C6-CM e tampão (PBS, Tween-80 0,01 % em peso/volume (PT) (doses de 200 μg/kg) são similares. Observou-se um resultado similar com doses de Prolastin® de 100 μg/kg (dados não mostrados). Na figura 7 mostrou-se também que uma maior resposta é observada com doses de Prolastin® com pico em CM de 50-200 μg/kg. A partir dos dados calculou-se que Prolastin® tem um tempo de permanência médio (MRT) de 11-12 horas. Também as amostras de PER.C6-rAAT foram detectadas, com PER.C6-rAAT-ST3- 202c mostrando uma liberação mais lenta (MRT ~ 20,5 horas) comparada com Prolastin® e PER.C6-rAAT-ST6-530 mostrando uma liberação mais rápida (MRT -3,6 horas) comparado com Prolastin® (Tabela 1 e 2). Baseado nessas observações, concluiu-se portanto que o modelo deveria ser usado para as amostras não purificadas de PER.C6-rAAT, que foram testadas em 2-4 experimentos a um nível de dose de 100 μg/kg para todas as amostras. Na figura 8 são mostrados perfis de PK representativos para PER.C6-rAAT-ST3 e PER.C6-rAAT- ST6 em comparação com Prolastin®.

[067] A última coluna nas tabelas 1 e 2 mostra os valores de MRT obtidos nos experimentos PK. Teste estatístico nas diferenças entre amostras e grupos de amostras com relação ao MRT foi feito por ANOVA nos valores log transformados. Os MRTs tanto das preparações de PER.C6-rAAT-ST3 quanto de PER.C6-rAAT-ST6 testadas foram significativamente diferentes daqueles de Prolastin®. O MRT para 8 das 10 preparações de PER.C6-rAAT-ST3 testadas foi significativamente maior que aquele de Prolastin® e variou de 18-23 horas. Entre essas 8 preparações de PER.C6-rAAT-ST3 as diferenças em MRT não foram significantes.

[068] Os MRTs de PER.C6-rAAT-ST3-053b e -539 foram significativamente menores que aqueles de Prolastin®. Para PER.C6- rAAT-ST3-0539 isto é em virtude do grau de sialilação relativamente baixo (49 %) conforme confirmado pelo resgate do perfil de PK desta preparação na primeira hora durante bloqueio do receptor de asialoglicoproteína por coinjeção com asialofetuína (dados não mostrados). O perfil de glicana para PER.C6-rAAT-ST3-053b foi inconclusivo (nenhuma indicação de pico claro possível), entretanto, também neste caso sobresialilação é mais provavelmente a causa do MRT baixo.

[069] Para todas preparações de PER.C6-rAAT-ST6 testadas, o MRT foi significativamente menor que o de Prolastin® variando de 3,43,9 horas. Isto pode ser explicado pelo baixo grau relativo de sialilação das glicanas tetra-antenárias nas PER.C6-rAAT-ST6 (variando de 6 a 62 %) e/ou por um diferente mecanismo potencial de liberação para α2,3 sialilada AAT versus α 2,6 sialilada AAT. Conclusões

[070] De acordo com a presente invenção, foram geradas linhagens celulares PER.C6 que produzem AAT humana com um alto rendimento (até 22 pcd) e com uma qualidade aceitável, isto é, as preparações foram ativas em um ensaio in vitro. Surpreendentemente, e de forma interessante, perfis de PK promissores foram demonstrados em um modelo de rato. Células PER.C6 formam assim uma plataforma adequada para a produção de AAT humana recombinante para uso inter alia em enfisema relacionada com deficiência de AAT ou para uso em outras doenças inflamatórias com dano do tecido mediado por neutrófilo. A rhAAT da presente invenção pode entretanto também ser adequadamente produzida em outros tipos de célula de mamífero que co-expressam uma 2,3- ou 2,6- sialiltransferases.

SEQ ID NO: 1 Sequência de aminoácidos de AAT MpssvswgilllaglGclvpvslaedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafs lyrqlahqsnstniffspvsiatafamisIgtkadthdeiíeglnfniteipeaqihegf qellrtlnqpdsqlqlttg.nglf Iseg.lklvdkf ledvkklyhseaf tvnfgdteeakkq indyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttv kvpmmkrlgmf niqh'ckklsswvllmkylgnataif flpdegklqhlenelthdiitkf 1 • ene.drrsaslhlpklslitgtydlksvlgqlgitkvfsngadls.gvteeaplklskavhka vltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvf Imieqnt.ksplfmgkvvnptqk*; SEQ ID NO: 2 CDS otimizado de AAT (baseado em NM_000295) atgGccagcagcgtgagctggggcatcctgctgctggccggcctgtgctgcctggtg'ccc gtgagcctggccgaggacccccagggcgacgccgcccagaaaaccgacaccagccaçcac gaccaggaccaccccaccttcaacaagatcacccccaacctggccgagttcgccttcagc .ctgtaccggcagctggcccaGcagagcaacagcaccaacatcttttt'cagδccpgtgagc atcgccaccgccttcgccatgctgtccctgggcaccaaggccgacacccacgacgagatc ctggaaggcctgaacttcaacctgaccgagatccccgaggcccagatccacgagggct-tc caggaactgctgcggaccctgaaccagcccgacagGcagctccagctcaccaccggcaac ggcctgtttctgagcgagggcαtgaaactggtggacaagtttctcgaagatgtgaagaag ctgtaccacagcgaggccttcaccgtgaacttcggcgacaccgaggaagccaagaagcag atcaacgactacgtggagaagggcacccagggcaagatcgtggacctggtgaaagagctg gaccgggacaccgtgttcgccctggtgaactaçatcttcttcaágggcaagtgggagcgg- cctttcgaggtgaaggataccgaggaagaggacttccacgtggaccaggtgaccaccgtg aaggtgcccatgatgaagcggctgggcatgttcaacatcGagcactgcaagaagctgtcc agctgggtcctgqtgatgaagtacctgggcaacgccaccgGcatcttttttαtgcccgac gagggcaagctgc.ageacctggaaaacgágctgacccácgaçatcatcaccaagt ttctg gaaaatgaggaccggcggagcgccagcctgcacctgcccaag.ctgtccatcaccggcacc tacgacctgaagagcgtgctgggccagGtgggGatcaccaaggtgttcagcaac-ggcgcc gacctgãgcggcgtgaccgaagaggcGcccctgaagctgtctaaggccgtgcacaaggcc gtgctgaccatcgacgagaaggggaccgaagccgccggagdcatgtttctggaagccatc cccatgagcatcccccccgaggtgaagtt-caacaagccçttcgtgttcctgatgatcgag cagaacaGcaagagccccctgttcatgggcaaggtggtgaaccccacccaaaagtga REFERÊNCIAS A Gervais, YA Hammel, S Pelloux, P Lepage, G Baer, N Carte, O Sorokine, JM Strub, R Koerner, E Leize and A Van Dorsselaer. 2003. 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Claims (12)

1. Alfa-1 antitripsina humana recombinante (rhAAT) da SEQ ID NO: 1 compreendendo glicanas ligadas ao N, caracterizada pelo fato de que: (a) pelo menos 10% das ditas glicanas ligadas ao N são glicanas tetra-antenárias; e (b) o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N (Z/A) é pelo menos 50%, em que pelo menos 50% da sialilação total nas ditas glicanas ligadas ao N é a-2,3-sialilação.

2. Alfa-1 antitripsina humana recombinante (rhAAT), de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos 20% das ditas glicanas ligadas ao N são glicanas tetra- antenárias.

3. Alfa-1 antitripsina humana recombinante (rhAAT), de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que de cerca de 10% a 50% das ditas glicanas ligadas ao N são glicanas tetra-antenárias.

4. Alfa-1 antitripsina humana recombinante (rhAAT), de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que de cerca de 20% a 40% das ditas glicanas ligadas ao N são glicanas tetra-antenárias.

5. Alfa-1 antitripsina humana recombinante rhAAT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que pelo menos 90% da sialilação total nas ditas glicanas ligadas ao N é a-2,3-sialilação.

6. Alfa-1 antitripsina humana recombinante (rhAAT), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N (calculado pela razão Z/A) é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%.

7. Alfa-1 antitripsina humana recombinante rhAAT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N que são tetra-antenárias é pelo menos 20%.

8. Alfa-1 antitripsina humana recombinante rhAAT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N que são tetra-antenárias é pelo menos 50%.

9. Alfa-1 antitripsina humana recombinante rhAAT, de acordo com reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N que são tetra-antenárias é de cerca de 50% a cerca de 97%.

10. Alfa-1 antitripsina humana recombinante rhAAT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o grau de recobrimento com ácido siálico nas ditas glicanas ligadas ao N que são tetra-antenárias é de cerca de 70% a cerca de 95%.

11. Método para produzir ALFA-1 antitripsina humana recombinante (rhAAT) como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de prover uma célula PER.C6 com um ácido nucléico que codifica α-1 antitripsina humana de uma tal maneira que a dita célula PER.C6 abrigue o dito ácido nucléico em uma forma expressível; e cultivar a dita célula PER.C6 em condições condutivas para a produção de dita α-1 antitripsina humana recombinante, em que a dita célula PER.C6 é modificada para co- expressar α2,3 sialiltransferase, e em que a célula PER.C6 é uma célula de uma passagem à montante ou à jusante ou um descendente de uma passagem à montante ou à jusante de células conforme depositado no Center of Applied Microbiology and Research & European Collection of Cell Culture (ECACC) em 29 de fevereiro de 2006 com ECACC no. 96022940.

12. Alfa-1 antitripsina humana recombinante (rhAAT) de acordo com a reivinidcação 1, caracterizada pelo fato de que é obtenível por um método como definido na reivindicação 11.

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