JP2948910B2 - 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター - Google Patents

遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター

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Description

【発明の詳細な説明】 後援 本発明に関する作業は、嚢胞性線維症財団（Cystic F
ibrosis Foundation）により、および米国国立衛生研究
所により審査して与えられた研究助成金DK42718およびD
K39690の下で米国政府により支援された。米国政府は本
発明において特定の権利を有し得る。
関連出願 本出願は、1992年９月11日に出願された「ヒト気道に
より特徴付けられる非ヒト動物」と題する米国特許出願
第943,952号の一部継続出願であり、そしてまた1993年
５月25日に出願された「嚢胞性線維症に対する遺伝子治
療」と題する米国特許出願第08/067,296号（1990年９月
18日に出願された「嚢胞性線維症に対する遺伝子治療ベ
クター」と題する米国特許出願第584,275号の分割出願
であり、米国特許出願第584,275号は、1989年８月31日
に出願された「嚢胞性線維症」と題する米国特許出願第
401,609号の一部継続出願であり、米国特許出願第401,6
09号は、1989年８月24日に出願され、現在放棄されてい
る「嚢胞性線維症遺伝子」と題する米国特許第399,945
号の一部継続出願である。米国特許第399,945号は、198
9年８月22日に出願され、現在放棄されている「嚢胞性
線維症遺伝子」と題する米国特許第396,894号の一部継
続出願である）の一部継続出願であり、上記出願のすべ
てを本明細書に参考として特に援用する。
発明の分野 本発明は一般に、アデノウイルスベクター、ならびに
そのようなベクターを作成および使用する方法に関し、
特に、E3領域の少なくとも一部分およびE1領域の少なく
とも一部分の欠失を含むアデノウイルスベクターに関
し、そしてより特定すれば、さらなる欠失または変異を
含むようなアデノウイルスベクターに関する。
発明の背景 アデノウイルスが、宿主細胞の核内で複製する二本鎖
DNAウイルスの大きなファミリーである。ウイスル遺伝
子は、「初期」または「後期」遺伝子のカテゴリーに分
けられる。これらの時間のカテゴリーは、遺伝子がウイ
スルの生活輪の間にmRNAに転写される時と基礎にする。
転写は調和して起こり、そして初期転写から後期転写へ
の移行は、DNA複製と一致して、感染後約10時間で起こ
る。ウイルス遺伝子が発現するにつれ、宿主細胞のRN
A、DNAおよびタンパク質合成が漸次減少し、その一方ウ
イルスタンパク質および核酸の量がゆっくりと上昇す
る。感染後約36時間までに、宿主細胞は崩壊し、そして
ウイルスは環境中に放出される。
アデノウイルスはそれ故遺伝子治療で有用なベクター
を生成する理想的候補である。何故なら、このウイルス
はウイルスRNA、DNAおよびタンパク質を合成するために
宿主細胞自身の機構を利用するからである。さらに、ア
デノウイルス遺伝子の転写、ゲノムの組織およびゲノム
のDNA配列は、良く決定されている。従って、目的のタ
ンパク質をコードする非ウイルスDNAを、アデノウイル
スゲノムの適切な位置に挿入し得、そしてこれらのタン
パク質を、宿主細胞中で容易に発現させ得る。
アデノウイルス複製は最終的に細胞死をもたらすの
で、以前のアデノウイルスベクターはウイルス複製を減
少させるように設計された。減少したウイルス複製は、
E1a/E1b領域のような初期遺伝子の部分の欠失または変
異により達成された。何故なら、ゲノムのこの領域は、
DNA複製に必要な種々の他のアデノウイルス遺伝子の発
現を調節するからである。Berkner,K.L.,Biotechniques
6:616−629（1988）。Horwitz,M.S.,「Virology,」第
２版、Raven Press Ltd.、1679−1720頁（1990）。
E1a/E1b欠失アデノウイルスは減少したウイルス複製
を示すけれども、これらベクターは、別の導入遺伝子
（transgene）DNAにより生成される大きなゲノムのため
にウイルスキャプシドに非効率的にパッケージ化され
る。非効率的なパッケージングは、ウイルスストックの
力価を、従来のベクターと比較して２−３対数だけ減少
させる。E1a/E1b欠失ウイルスの低力価は、それらの有
用性、特に肺のような完全器官への適用に対する有用性
を低下させる。
E3領域中にさらに欠失を有するベクターが構築されて
いる。この欠失は、ベクター中に挿入され得る非ウイル
スDNAの量を増加し、その一方この組換えウイルスの効
率的なパッケージングを維持する。Engelhardt,J.F.
ら、Nature Genet.4:27−34（1993）。しかし、E3遺伝
子の発現が、宿主の免疫応答を避けることにおいてウイ
ルス感染細胞を助けるとう考察がある。従って、E3領域
を欠失することは望ましくない。何故なら、E3タンパク
質発現の欠如は、ウイルス感染細胞が宿主の免疫系によ
り拒絶される機械を増加するからである。
E3を含む、E1a/E1b欠失アデノウイルスベクターが現
在存在し、そして臨床試験について認可されている。し
かし、これらベクターの主要な欠点は、再び、従来のベ
クターよりかなり低い力価に至る大きなゲノムサイズに
よる非効率的なパッケージングであり、それらを大規模
なヒト適用においてより有用でなくしている。アデノウ
イルスゲノムの他の領域における欠失とともに、E3領域
が保持され得、そして臨床使用のための高力価ストック
の生産のために適切なウイルスゲノムサイズが達成され
得る。
アデノウイルスベクターの特に有用な、遺伝子治療に
よる嚢胞性線維症（CF）の処置にある。種々の遺伝子治
療アプローチが、嚢胞性線維症について考慮されてきた
が十分な結果は得られていない。そのようなアプローチ
の１つは、気道中に直接送達される遺伝子導入基質を用
いて、表面上皮で嚢胞性線維症トランスメンブレン（tr
ansmembrane）調節（CFTR）遺伝子発現を選択的に再構
成することである。気道上皮細胞のトランスフェクショ
ンがカチオン性リポソームを用いてインビボで達成され
ているけれども、効率は、治療効力に必要な効率より低
い。Hazinski,T.Aら、Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.4:20
6−209（1991）;Yoshimura,K.ら、Nucleic Acids Res.2
0:3233−3240（1992）。同様に、CFTR遺伝子を保持する
組換えレトロウイルスは受容されていない。何故なら、
効率的および安定な組換え遺伝子発現は、上皮がウイル
スへの暴露の時点で未分化でかつ再生している場合にの
み、組換えレトロウイルスを用いて近位気道において達
成され得るからである。そしてこのような状況を患者に
おいてシミュレートすることは困難。Engelhardt,J.E.
ら、J.Clin.Invest.90:2598−2607（1992）である。
従って、嚢胞性線維症遺伝子治療に対して組換えアデ
ノウイルスを使用することは、アデノウイルスベクター
の天然のヒト気道に対する向性、極めて高い力価への成
長、ならびに非分裂細胞において組換え遺伝子を導入お
よび発現するそれらの能力を含むアデノウイルスベクタ
ーの重要な利点を特に考慮して特に魅力的である。Grah
am,F.L.ら、「Gene Transfer and Expression Protoco
l,」E.J.Murray編、The Human Press,Inc.,Clifton,N.
J.109−128（1992）。これらの利点のため、組換えアデ
ノウイルスは、コットンラット（cotton rat）の肺にα
−１−アンチトリプシンおよびCFTR遺伝子を導入するた
めに使用されている。Rosenfeld,M.Aら、Science 252:4
31−434（1991）;Rosenfeld,M.A.ら、Cell 68:143−155
（1992）。
従って、改良された組換えアデノウイルスベクターを
生成することが所望され得る。E1領域の少なくとも一部
分に欠失を有し、E3領域の少なくとも一部分を保持し、
そして導入遺伝子および／またはアデノウイルスタンパ
ク質の発現または過剰発現が減少するおよび／またはイ
ウルス複製が減少する結果となる他の変異に適応するさ
らなる欠失を含む組換えアデノウイルスベクターを生成
することがまた所望され得る。さらに、E1領域の少なく
とも一武運に欠失を有し、E3領域の少なくとも一部分を
保持し、そして導入遺伝子および／またはアデノウイル
スタンパク質の発現または過剰発現が減少するおよび／
またはウイルス複製が減少する結果となる他の変異に適
応するさらなる欠失を含み、そして目的の導入遺伝子、
例えば、CFTR遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクタ
ーを生成することが所望され得る。さらに、治療アプロ
ーチの試験および使用に有用な遺伝子発現系を生成する
ことが所望され得る。
発明の要旨 本発明は、改良されたアデノウイルスベクターおよび
そのようなベクターを作成および使用するための方法を
包含する。このベクターは、遺伝子導入および発現に特
に有用である。本発明のベクターはまた、遺伝子発現お
よび種々の治療アプローチを試験するための研究モデル
として有用である。本発明のアデノウイルスベクター
は、インビボのウイルス複製およびウイルスタンパク質
発現を減少または排除し、それによって、ウイルスおよ
びウイルスタンパク質に対する感染宿主の免疫応答を減
少させる。宿主免疫応答を減少させることにより、挿入
遺伝子の発現の持続が増加する。本発明のアデノウイル
スベクターは、効率的にパッケージ化され、挿入された
非ウイルス遺伝子の宿主細胞への導入をさらに促進す
る。従って、本発明のベクターは、効果的なパッケージ
ング、減少したウイルス複製、および導入遺伝子発現の
増大する持続性により特徴付けられ得る。
本発明の１つの実施態様において、アデノウイルスベ
クターは、E3領域の少なくとも一部分を保持し、そして
このE3領域の上流にあるE1領域の少なくとも一部分の欠
失、ならびにウイルスゲノムサイズを減少させるために
E1およびE3領域遺伝子以外のアデノウイルス遺伝子内の
欠失を保持する。上流および下流は、従来の５′から
３′への向きにあるヌクレオチド配列上の位置を意味
し、ここで上流とは、配列の５′末端に向けてであり、
そして下流とは配列の３′末端に向けてである。E3遺伝
子領域における欠失は、現在は、クローニングのために
利用可能な制限部位に基づく；しかし他のE3欠失がまた
本発明により予期されることが認識される。E1およびE3
遺伝子における以外の遺伝子欠失は、構造または非構造
ウイルス遺伝子において起こり得、そして初期または後
期遺伝子に影響し得、そして特にE2a領域における欠失
を含む。これらの欠失は、E3領域の少なくとも一部分を
保持すること、および導入遺伝子を含むことを可能にす
る。E3領域の部分を含むことにより導入遺伝子発現の持
続性を増大する。
本発明の別の実施態様では、アデノウイルスベクター
は、E3領域の少なくとも一部分およびE1領域の少なくと
も一部分の欠失、ならびに温度感受性（ts）ウイルスを
生成する変異を含む。これらベクターに温度感受性を与
える変異は、非構造タンパク質または構造タンパク質、
または両者をコードするアデノウイルス遺伝子で起こり
得る。ベクターのウイルスストックは、許容温度でイン
ビトロ複製し得るが、非許容温度でインビボ複製し得ず
またはインビボ複製能力が低下し、それ故導入遺伝子発
現を増加する。
本発明の別の実施態様において、温度感受性アデノウ
イルスベクターは、許容および非許容温度の両方で複製
欠陥ウイルスである。これらのベクターは、変異体ウイ
ルスタンパク質が許容および非許容温度の両方で不安定
であるように、非構造遺伝子または構造遺伝子または両
者において変異を含む。
本発明の別の実施態様において、組換えアデノウイル
スは、E3領域の少なくとも一部分およびE1領域の少なく
とも一部分の欠失、ならびにウイルスタンパク質を生成
する他の遺伝子における変異を含む。これらのベクター
は、E3を含み/E1が欠失したベクターにおいて発現また
は過剰発現されるウイルスタンパク質の発現を不安定化
し、それによって感染宿主のウイルスタンパク質に対す
る免疫応答を減少させる。E3領域の少なくとも一部分を
含み、E1領域の少なくとも一部分に欠失を保持し、そし
てE1およびE3遺伝子以外のアデノウイルス遺伝子内に欠
失、および／または導入遺伝子発現の増大する持続性、
発現または過剰発現アデノウイルスタンパク質の減少お
よび／または減少したウイルス複製を生じる変異を含む
本発明のベクターは、本明細書では以後「第２世代」ベ
クターと称される。第２世代ベクターは、好ましくは温
度感受性であり、32℃でウイルスのインビトロ増殖を、
そして37℃でインビボ成長欠陥を許容する。E3領域の少
なくとも一部分およびE1領域の少なくとも一部分の欠失
を含む本発明のベクターを、本明細書では「第１世代」
ベクターと称する。
本発明のさらなる実施態様では、アデノウイルスベク
ターは、それに作動可能に連結された導入遺伝子を保持
する。「作動可能に連結された」は、導入遺伝子の転写
を可能にする様式で、例えば、ベクター構築物中の十分
な調節要素の使用により、付着していることを意味す
る。このような構築物を作成するための種々の戦略およ
び方法論が当業者に周知であることが認識される。「導
入遺伝子」は、天然に存在するアデノウイルスに対して
外来である任意の遺伝子または遺伝領域を意味する。
「遺伝子」は、目的のポリペプチドまたはタンパク質を
コードする配列を有する任意の核酸またはその逆転写物
を意味し、構造または調節要素、もしくはその両方とし
て機能する配列を含む。この用語は、天然に存在する配
列、ならびに発現し得る合成または任意のコード化配列
を有する核酸を包含する。本発明の実施において、任意
の数の導入遺伝子が使用され得るが、好適な導入遺伝子
は、例えば、嚢胞性線維症トランスメンブレン調節因子
（CFTR）遺伝子のような、遺伝子治療に有用な遺伝子を
含む。従って、本発明の別の実施態様では、アデノウイ
ルスベクターを、非遺伝性および遺伝性の遺伝的および
後成的疾患または障害を処置するために使用される。
図面の簡単な説明 図１（Ａ−Ｂ）は、いくつかの近位気道試料における
細胞型の分布を示す棒グラフである。
図２（Ａ−Ｅ）は、異種移植浸出物における組換えウ
イルスの回収を示すグラフである。
図３は、アデノウイル複製における２つの可能な温度
感受性変異のマップである。
図４は、Xgalを用いたβ−ガラクトシダーゼについて
インサイチュで染色されたAd.CMVlacZ感染ヒヒ肺の顕微
鏡写真である。
図５（Ａ−Ｂ）は、CFB4動物のCFTRおよびlacZ注入肺
葉由来のXgal染色組織の顕微鏡写真である。
図６（Ａ−Ｂ）は、CFB4動物のCFTRおよびlacZ注入肺
葉由来のXgal染色組織の顕微鏡写真である。
図７（Ａ−Ｂ）は、CFB4動物の気管支ブラッシングに
おける導入遺伝子の局在化を示す顕微鏡写真である。
図８（Ａ−Ｃ）は、血液学的値に関する遺伝子導入の
影響を示すグラフである。
図９は、肺胞酸素圧と動脈酸素圧との差異に関する遺
伝子導入の影響を示すグラフである。
図10は、遺伝子投与前後に検出された胸部Ｘ線撮影異
常の位置と拡がりを示す概略図である。
図11は、遺伝子投与前後の気管支肺胞洗浄液鑑別細胞
計測を示すグラフである。
図12は、遺伝子投与後の動物の肺におけるリンパ球性
肺炎の位置と拡がりを示す概略図である。
好適な実施態様の詳細な説明 本発明のアデノウイルスベクターの構築は、相補的ヒ
ト胎児腎臓（HEK）293細胞株（トランスに作用するE1a
タンパク質を提供し、アデノウイルスベクターの効率的
な複製を可能にする機能的E1a遺伝子を含むヒト腎臓細
胞株）を用いる、E1a/E1b欠失アデノウイルスベクター
に対する標準のトランスフェクション技法により実施す
る。３種の一般的技法が組換えストックを生成すること
において使用される:1）１つは変異体遺伝子を含みそし
て第２番目が野生型ゲノムの残りを含むウイルスゲノム
の重複するフラグメントを、293細胞における標準のCaP
O4トランスフェクション技法を用いて同時トランスフェ
クトし、次いで寒天重層によりウイルスプラーク形勢さ
せる;2）変異領域および非変異領域を含むウイルスゲノ
ムの種々の領域を連結、続いて、標準のCaPO4トランス
フェクション技法；および３）相同組換えのための異変
株ウイルスゲノムDNA、ならびに導入遺伝子および部分
ウイルス配列を含むプラスミド配列との同時トランスフ
ェクション。
導入遺伝子を含まない変異体ウイルスストックは、先
に公開れさた研究から得、または当業者に公知かつ実施
される標準の組換え分子クローン化技法を用いて生成お
よび選択される。先に公開された研究から得られた変異
体ウイルスストックは、上記の技法による、組換えウイ
ルスの生成に必要な他の欠失と組み合わされる。欠失、
挿入、ならびに他の変異は、標準の技法および選択スキ
ームを用いて生成される。当業者が認識するように、
「変異」は、DNAの任意の改変をいい、限定されない
が、欠失、挿入、およびミスセンスおよびナンセンス変
異を包含する。当業者はまた、それが使用される文脈か
らどのタイプの変異が言及されているか認識する。
1992年９月11日に出願された「ヒト気道により特徴付
けられる非ヒト動物」と題する親出願の米国特許出願第
943,952号で記載されるような、ヒト気道のヒト気管支
異種移植モデルがまた、本発明のアデノウイルスベクタ
ーを試験するために使用されている。異種移植は、内因
性ヒト気道で見い出された多列上皮と区別出来ない十分
に分化した多列上皮に発達する。従って、このモデル
は、アデノウイルスベクターがヒト気道上皮中で複製す
る能力を評価する独特の機会を提供する。導入遺伝子の
増大する持続性を試験するために、２種のさらなる動物
モデル、イタチ（ferret）および非ヒト霊長類が使用さ
れる。
以下にさらに論議されるように、組換えアデノウイル
スを用いた感染後のヒト気管支異種移植モデル内の３種
のアデノウイルスタンパク質（ヘキソン、ファイバーお
よびDBP E2a遺伝子産物）の免疫細胞化学的検出は、２
種の後期ウイルスタンパク質であるヘキソンおよびファ
イバーが検出可能なレベルで発現されず、その一方で72
kd DPB E2a遺伝子産物が野生型レベルより高いレベルで
（即ち、野生型アデノウイルスス５型で感染した異種移
植片より高く）発現されたことを示した。これらのデー
タは、インビボで過剰発現することが知られている変異
または欠失について特定遺伝子（即ち、72kd DPB）を標
的にするための根拠である。
本発明のアデノウイルスベクターは、成人呼吸困難症
候群（ARDS）、嚢胞性線維症、および喘息のような、種
々の非遺伝性または遺伝性の遺伝的または後成的疾患ま
たは障害を処置するための遺伝子治療に対して有用であ
る。本発明のアデノウイルスベクターはまた、遺伝子治
療を含む治療アプローチを試験する研究モデルとして有
用である。当業者が実現するように、本発明の各アデノ
ウイルスベクターは、それに作動可能に連結された、種
々の疾患の処置において有用な任意の導入遺伝子を有し
て構築され得る。
治療として使用されるとき、本発明のベクターの治療
的に有効な用量は、治療的に有効な継続期間の間投与さ
れる。「治療的に有効な量」および「治療的に有効な継
続期間」は、本発明に従って、過度の有害な生理学的影
響がなく、または医療的に受容可能な生理学的影響を有
する、選択された所望の結果を達成するに十分な量およ
び継続期間を意味し、それらは医療分野の当業者により
決定され得る。本発明のベクターの治療的に有効なヒト
用量は、本発明のベクターを約１×107から１×1010pfu
/mlの濃度で含む生理食塩水溶液約20mlから約50mlの範
囲であると考えられる。好適なヒト用量は、上記濃度の
約20mlの生理食塩水である。
本発明のアデノウイルスベクターの投与に好適な製剤
は、水性または非水性等張殺菌注入溶液、ならびに水性
および非水性殺菌懸濁液を包含することが認識される。
CFTR遺伝子送達の場合には、気管支点滴注入のための好
適な溶液は、本発明のウイルスベクターを約１×107か
ら１×1010pfu/mlの範囲で、より好適には、約１×108
から１×109pfu/mlの範囲で含む殺菌生理食塩水溶液で
ある。本発明のアデノウイルスベクターの投与は、製薬
学分野で良く確立された手法、例えば、鼻腔内、静脈
内、筋肉内、皮下、皮内および経口投与の単独または組
み合わせのいずれかによる、標的器官、組織または部位
への直接送達であることがまた認識される。
具体的実施例１−導入遺伝子発現 本発明の原理により、組換えアデノウイルスへの異種
移植片の暴露は、大多数の表面上皮細胞において（即
ち、濃縮ウイルスを用いて５−20％）、導入遺伝子発現
（即ち、lacZおよびヒトCFTR）を生じ、そしてこの発現
は安定で病理に関連しない。組換え遺伝子発現は、基底
細胞を除く表面上皮のすべての細胞型で検出された。基
底細胞における低レベルの発現に対する可能な説明は、
この細胞型上のアデノウイルスレセプターの発生量（ab
undance）レベルに単純に関係し得る。
組換え遺伝子を発現する異種移植片の細胞におけるア
デノウイルスタンパク質を検出するために、免疫細胞化
学的手法を使用した。Horwitz,M.S.,「Adenoviridae an
d their Replication In:Virology,」B.N.Fields,D.M.K
nipeら編、第２版、Raven Press,Ltd.,N.Y.1679−1721
（1990）。いくつかのアデノウイルス遺伝子の発現は、
１）アデノウイルス生活環の前期フェーズおよび後期フ
ェーズで発現される、72kd DNA結合タンパク質をコード
するE2a遺伝子；および２）単一の後期転写単位から形
成され、そして構造タンパク質であるヘキソンおよびフ
ァイバーをそれぞれコードするL3およびL5転写物を含む
ことを評価された。ヒト異種移植片の細胞におけるアデ
ノウイルスタンパク質発現のプログラムは、野生形Ad5
とE1欠失組換え体との間では実質的に異なっていた。野
生型Ad5で感染した細胞は、高レベルの構造タンパク質
であるヘキソンおよびファイバーならびにより低いレベ
ルのE2a遺伝子産物を発現し、それらがAd5の全生活環を
支援し得ることを示した。E1欠失Ad5を保持する細胞
は、構造タンパク質であるヘキソンおよびファイバーを
いずれもほとんど発現しなかったが、導入遺伝子を含む
細胞のサブセットにおいては非常に高いレベルでE2a遺
伝子を発現した。このことは、組換えウイルスが、E1a
およびE1bの非存在下で転写の後期フェーズへの移行が
妨げられたことを示唆する。しかし、サブセットの細胞
は、E1aおよびE1bとは独立にE2aプロモーターから転写
を活性化し得る。ヒト気道上皮細胞におけるE2a発現の
結果は、現在のところ知られていない。lacZおよびCFTR
アデノウイルスの両方が気道に投与された非ヒト霊長類
は、lacZ発現細胞のサブセットにおいて高レベルのDBP
を発現するが、E2a遺伝子のこのタンパク質産物に対す
る免疫応答を発生しない。
異種移植片は、アデノウイルスへの暴露後３週間の間
連続的に潅注され、そして浸出液を野生型および組換え
ウイルスについて分析した。野生型ウイルスは浸出液中
で決して検出されず、そして組換えウイルスの濃度は、
最初の週の間に性急に低下し、そして実験の第２フェー
ズの間に低いが、しかし検出可能な濃度で安定し、それ
は24日まで続いた。浸出液で回収されたウイルスが初期
注入からの残存ウイルスを示すとすることは可能であ
る。代わりの説明は、遺伝的に再構成された異種移植片
が低レベルのウイルス産生を支持することである。E1a
欠失ウイルスの複製がインビトロで記載されている。Ho
rwitz,M.S.上述。浸出液中のウイルスの存在を説明する
１つの可能なメカニズムは、異種移植片中の特殊な細胞
が、アデノウイルス複製におけるブロックを克服し、そ
の死およびより多くの組換えウイルスの産生に至ること
である。十分なE1発現の状況においては、Ad2およびAd5
などのＣ群ウイルスの生活環は、非常に効率的であり、
そして感染細胞１つあたり、10,000ビリオンの産生を生
じる。Green,M.ら、Virol.13:169−176（1961）。１週
間あたり、異種移植片あたりほんの１−２細胞における
完全Ad溶解サイクルの進行は、浸出液中で検出される組
換えウイルスの定常状態レベル（すなわち100から10,00
0ウイルス／潅注）を説明し得る。別の可能なメカニズ
ムは、ウイルスが感染細胞の大集団中において低レベル
で複製し、そして細胞が通常の代謝回転を行う場合に小
量のウイルスが放出されることである。1500個の感染細
胞の試料中で野生型レベルの構造タンポク質を検出出来
ないことは、両方のメカニズムと一致する。
遺伝子治療に対する組換えアデノウイルスの有用性に
関するとき、本実施例の重要な結果は、ヒト異種移植片
において達成された組換え遺伝子発現の安定性である。
異種移植片におけるウイルスゲノムの分子状態の詳細な
特徴付けは、分析に利用可能な材料の限られた量のため
に困難である。lacZおよびCFTRウイルスで感染された培
養ヒト上皮細胞のDNA分析は、アデノウイルスゲノムが
主に非組み込みDNAとして存在することを示した（デー
タは示さず）。さらに、新生マウスにおいて、組換えA
d.RSVβgalのエピソームとしての存続が示された。Stra
tford−Perricaudet,L.D.ら、J.Clin.Invest.90:626−6
30。この知見は、異種移植片中で達成される存続が、ビ
リオン形成の非存在下で安定化するか、または複製する
染色体外ウイルスゲノムに起因し得ることを示唆する。
代わりの説明は、見かけの組換え遺伝子発現の存続がウ
イルスの継続する産生および再感染に起因することであ
る。この可能性は、しかし、浸出液中で回収されるウイ
ルスのレベルが、安定な遺伝子再構成の観察されるレベ
ルを支えるために必要なレベルより５〜６対数低いの
で、ありそうもない。
組換えアデノウイルスの調整 Ad.E1△、Ad.CMVlacZ、A
d.CB−CFTR、およびAd.RSVβgalを含む、Ad5に基づく４
種の異なる複製欠陥アデノウイルスを使用した。Ad.E1
△は、1.0〜9.2マップ単位（mu）に拡がるE1a配列欠失
および78.4〜86muに拡がるE3配列欠失を有している。サ
イトメガロウイルス（CMV）プロモーター、細胞質lacZ
遺伝子、およびSV40ポリＡを含むミニ遺伝子を、Ad.E1
△のE1欠失の部位に導入し、Ad.CMVlacZを作成した。A
d.RSVβgalの構造は先に記載されている。Stratford−P
erricaudet,L.D.ら、J.Clin.Invest.90:626−630（199
2）。このウイルスでは、1.3から9.4muまでのE1配列が
欠失しており、そしてラウス肉腫ウイルス長末端反復
（RSV LTR）、該局在化配列を有するlacZ遺伝子、およ
びSV40前期領域ポリアデニル化シグナルを含むミニ遺伝
子で置き換えられている；さらに、78.5から84.7muまで
拡がるE3配列が欠失している。Ad.CB−CFTRは、Ad.E1△
の派生株であり、そこでは次のミニ遺伝子がE1a欠失部
位中に挿入されている:CMVエンハンサー、βアクチンプ
ロモーター、ヒトCFTR cDNAおよびSV40ポリＡ。
組換えウイルスのストックは以下にように調製した。
10％ウシ胎児血清（FCS）、100U/mlペニシリン、および
100μg/mlストレプトマイシンを含むDMEM中で生育した2
93細胞の培養（30×150mmプレート）を、80％の集密度
で、細胞あたり5pfuのMOIで感染した。細胞を、感染後3
0時間で遠心分離により回収した。ペレットを18mlの最
終容量の10mM Tris pH8.0中に再懸濁し、そして３ラウ
ンドの凍結解凍にかけ、その後細胞残渣を1500×ｇで20
分間の遠心分離により分離した。粗製のウイルス上清液
をCsCl段階勾配上に重層しそして50,000×ｇで２時間遠
心分離した。インタクトのウイルス粒子を、最終CsCl精
製アデノウイルスが、500−700μｌ中に３−６×1013ウ
イルス粒子（260nmでの0Dにより測定されたとき）を含
むような第２ラウンドのCsClバンド化にかけた。濃縮ウ
イルスストックを、HamのF12媒体中のセファデックスG5
0によるゲル濾過により脱塩し、１−２×1013ウイルス
粒子/mlの最終精製ストックを生じた。293細胞上のプラ
ーク形成により測定されたときのウイルス力価が、0.2
−２×1012pfu/mlの範囲のストックを生じた。精製の完
了後直ちに、ウイルスストックを異種移植片中への注入
に用いた。すべてのストックを、複製コンピテントアデ
ノウイルスの存在について、100のMOIでHeLa細胞上への
感染および30日間細胞を継代することにより評価した。
オリジナルのストックにおける複製コンピテントウイル
スの存在は、HeLa細胞における細胞変性効果（CPE）の
進展として現れ得る。これらの実験で使用されたストッ
クはいずれもこのような効果を生じなかった。
ヒト気管支異種移植片の生成 一次ヒト気管支上皮細胞
を、先に記載されたプロトコールの改変法を用いて移植
することになっている肺の主気管支幹から回収した（分
析される各ベクターについて少なくとも３つの試料）。
Yankaskas,J.R.ら、Lancet 1:954−956（1985）。切開
した気道を50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイ
シン、40μg/mlトブラマイシン、50μg/mlセフタジジン
（ceftazidine）、2.5μg/mlのアムホテリシンＢ、10μ
g/ml DNAアーゼ、および0.5mg/ml DTTを含むMEMを用
い、４℃で４−12時間すすいだ。次いで組織を0.1％の
プロテアーゼ−14を補充した同じ培地中に置き、そして
４℃でさらに30−34時間インキュベートした。FCSを10
％の最終濃度に添加した後、撹拌および太く短い針で掻
き取ること（blunt scraping）により細胞を回収した。
細胞をペレット化し、そして10％のFCSを含むHamのF12
中で２回洗浄し、そして１μＭのヒドロコンチゾン、10
μg/mlインスリン、30Nmチロキシン、５μg/mlトランス
フェリン、25ng/ml表皮成長因子、3.75μg/ml内皮細胞
成長添加物、10ng/mlコレラトキシン、50U/mlペニシリ
ン、50μg/mlストレプトマイシン、40μg/mlトブラマイ
シン、50μg/mlセフタジジン、および2.5μg/mlのアム
ホテリシンＢを含むHamのF12中、２×106細胞/100mm皿
で接種した。培地を36時間後に置き換えそしてその後24
時間毎に交換した。４日目に、細胞を0.1％トリプシン
で処理することにより回収した後、10％FCS/Ham F12を
添加しそして接種の準備のためにホルモン的に規定され
た培地中に25μｌあたり１×106細胞の濃度で再懸濁し
た。
開放末端（open−ended）の移植片を、200〜250gmの
雄Fisher344ラットから摘出されたラット気管から生成
し、そして先に記載されたように３ラウンドの凍結解凍
にかけた。Engelhardt,J.F.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）88:11192−11196（1991）。細胞（１×106個）
を、被覆層をはぎとったラット気管の管腔中に注入した
後、気管末端を可撓性のプラスチック管材に結紮した。
これらの接種された異種移植片を、nu/nuマウスの横腹
に、管材の末端が首の後ろを通じて出るように皮下移植
した。移植片を、アデノウイルスの注入前３〜４週間の
間再生させた。HamのF12（1ml）中のアデノウイルスの
ストックを、１時間の経過にわたり異種移植片中に注入
し、そして続いて過剰の液を管腔から空気による排除に
より除去した。
異種移植片の電子顕微鏡および外形計測分析 異種移植片を切除しそして記載されたように固定し
た。Engelhardt,J.F.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）8
8:11192−11196（1991）。固定後、組織を0.1Mカコジル
酸（cacodylate）中で繰り返し洗浄し、１％四酸化オス
ミウムで後固定し、アルコール中で脱水し、そしてエポ
キシ樹脂に包埋した。切片を観察する前に、酢酸ウラニ
ルおよびクエン酸鉛で染色し、そしてPhilips CM10電子
顕微鏡で写真撮影した。
ドナー気管支およびこの組織から生成する３つの異種
移植片内に含まれる細胞型の外形計測分析は、この異種
移植片モデル内の上皮再構成の拡がりを評価するために
実施された。細胞を形態学的基準に基づいて４つのグル
ープにカテゴリー分けした：頂上に局在化した繊毛を有
する繊毛細胞、電子で光る（electron lucent）分泌グ
ラニュールの存在による杯細胞、上皮の少なくとも1/3
の高さに拡がりそして基底細胞の基準を満たさない細胞
質と管腔接触のない中間細胞、ならびにトノフィラメン
トの存在および基底層上に存在する大部分の細胞質を有
し高い核／細胞質比による基底細胞。５ブロックからの
少なくとも30の独立の視野（field）を分析しドナー気
管支から全部で1500の細胞を得た。独立に生成した３つ
の異種移植片のそれぞれを４つのブロック中に包埋し、
そしてこれらブロックのそれぞれの１つの完全な断面を
分析し、全部で異種移植片の12の独立した領域を得た。
全部で、３つの異種移植片からの3000の細胞を分析し
た。
β−ガラクトシダーゼ、CFTR、サイトケラチン、および
アデノウイルスタンパク質について異種移植片の細胞化
学的および免疫細胞化学的分析 光学顕微鏡によるβ−
ガラクトシダーゼ活性に対する移植片の細胞化学的な位
置測定および特徴付けを、先に記載されたようにXgal中
で４時間染色され次いでGMA中に包埋されたグルタルア
ルデヒド固定組織で行った。Engelhardt,J.F.ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA）88:11192−11196（1991）。lacZ
導入遺伝子を発現する細胞の発生量は、16,000細胞のグ
ループ内にあるGMA切片由来のXgal陽性細胞のパーセン
トを計測することにより定量化した。異種移植片上皮内
の種々の細胞型（繊毛、基底、杯、および中間細胞）の
分布は、代表的基準の５つの独立領域から計測された30
00の細胞からの平均に基づいた。種々の細胞型の同定
は、以下の形態学的基準に基づいた：繊毛細胞−繊毛の
存在；核が基底細胞−上皮の最下層にある、基底層と直
接接触、および管腔接触のない、高い核／細胞質比（ra
tion）の立方体様の外見の細胞；杯細胞−Nomarski光学
系下で視覚化されるような粘液グラニュールの存在；お
よび中間細胞−基底層と接触するが上皮中に上方に伸び
る細胞質と接触し、管腔表面と接触しない。繊毛細胞、
基底細胞、杯細胞、および中間細胞の相対的感染製は、
１×1012pfu/mlのウイルスで感染した移植片のGMA切片
からの1000個のXgal陽性細胞を計測することにより定量
化した。lacZを発現する細胞の分布はまた、基底細胞に
対する細胞特異的マーカー（サイトケラチン14）、およ
び分化した円柱細胞に対する細胞特異的マーカー（サイ
トケラチン18）との免疫細胞化学的同時位置測定により
評価された。Randell,S.H.ら、Am.J.Respir.Cell.Mol.B
iol.4:544−554（1991）。Rutten,A.A.J.J.L.ら、Virch
ows Archiv.B.Cell.Pathol.56:111−117（1988）。
β−ガラクトシダーゼ、サイトケラチン14、およびサ
イトケラチン18タンパク質の免疫細胞化学的同時位置測
定は以下のように実施した。新鮮に凍結された組織（６
μｍ）の切片をメタノール中で10分間、後固定し、風乾
し、そして20％のロバ血清（DS）を含むPBS中で30分間
ブロックした。次いで切片を連続的にサイトケラチン14
に対する非希釈ハイブリドーマ上清中（Dr.Ramaekersか
ら贈与、RCK107）で90分間インキュベートした後、1.5
％DS/PBS中の３回の８分洗浄および５μg/mlのAMCA−抗
マウス（Fab′）2２次抗体中で30分間インキュベートし
た。洗浄後、これらの切片を、66μg/mlのウサギ抗β−
ガラクトシダーゼ（５′−３′inc）およびFITC−サイ
トケラチン18（Sigma）を含むPBS/1.5％DS中、1:400の
希釈で90分間インキュベートした。切片を洗浄し、そし
て５μg/mlのロバ抗−ウサギTexas Red中で30分間イン
キュベートした。1.5％DS/PBS中の３回の洗浄の後、切
片をCitiflour抗退色剤（antifadent）中にマウント
し、そしてMicrophet−FXA Nikon蛍光顕微鏡で視覚化し
た。lacZを発現する細胞型を、β−ガラクトシダーゼ、
サイトケラチン14、およびサイトケラチン18について染
色された切片から定量した；全部で1000個のlacZ陽性細
胞を計測した。CFTRの位置測定は、先に記載のようにヒ
トCFTR（α1468）の13C−末端アミノ酸に対する抗体を
用いて実施した。Engelhardt,J.F.ら、Nature Genet.2:
240−248（1992）。
β−ガラクトシダーゼの、アデノウイルスタンパク質
DBP、ファイバー、およびヘキソンとの免疫細胞化学的
同時位置測定は、次の改変法を用いてサイトケラチン同
時位置測定のように実施した。切片を、66μg/mlの抗β
−ガラクトシダーゼ（５′→３′,Inc.）、Ad5 DBPに対
するハイブリドーマ上清液の1/10の希釈液、５μg/mlの
ロバ抗ウサギAMCAおよびロバ抗マウスTexas Redの両
者、次いでマウス抗Ad3ファイバーFITC（Ab805F、Chemi
con,Inc.）の1/10希釈液と連続的にインキュベートし
た。精製アデノウイルス５型のウェスタン分析は、Ab80
5Fがファイバータンパク質と一致する62kdタンパク質を
認識することを示した。Ab805Fを、アデノウイルス５型
のヘキソンタンパク質に対するヤギ抗−Ad5−FITC抗体
（Ab1059F、Chemicon,Inc.）と置き換えることにより、
別の切片を同様に処置した。
CFTR mRNAのインサイチュ検出 凍結切片（６μｍ）
を、ゼラチンポリ（Ｌ−リジン）−被覆スライド上にマ
ウントし、そして先に記載されたように、ヒトCFTRのＲ
−ドメイン（1899bp〜2623bp）に対する35S RNAプロー
ブを用いるインサイチュハイブリダイゼーション分析の
ために、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の４％パラ
ホルムアルデヒドで固定した。Engelhardt,J.F.ら、Nat
ure Genet.2:240−248（1992）。コントロールとして、
試料をまた、アンチセンスCFTRプローブに対するハイブ
リダイゼーションについて評価した。さらに、試料を、
RNAアーゼを用いた前処理した場合およびしない場合の
両方で、センスまたはアンチセンスCFTRプローブにハイ
ブリダイズさせた。
異種移植片からのアデノウイルスの回収 組換えアデノ
ウイルススのヒト異種移植上皮内に複製能力を評価する
ために、浸出画分を感染後定期的に収集した。異種移植
片を、新たに調製されたウイルスストック（１×1011、
１×1010、および１×109pfu/ml）を用いて16時間感染
した後、緩衝化生理食塩水の２つの1mlアルコートを用
いて洗浄した。第２番目のアリコートを画分１と称し
た。3.5日間隔で、1mlの緩衝化生理食塩水のアリコート
を用いて異種移植片の管腔を潅注することにより別の画
分を収集した。すべての画分をドライアイス上で凍結
し、そして−80℃で保存した。試験の完了に際し、画分
を解凍し、そして293細胞上の限界希釈プラークアッセ
イにより組換えウイルスについて評価した。感染後９日
目に寒天上にXgal溶液の1mlを重層することにより、プ
ラークを、β−ガラストシダーゼについて染色した。す
べてのプラークは、青いXgal沈殿物の存在を示した。
異種移植片において最構成された表面上皮の特徴付け。
１×106の新たに単離されたヒト気管支上皮細胞を接
種した異種移植片は、nu/nuマウス中への移植後３週間
以内に十分に分化した上皮になった。42日目に採取され
たヒト気管支上皮細胞を接種した異種移植片由来の上皮
の透過型電子顕微鏡検査は、異種移植片中の上皮の一般
構成は、ネイティブな気道中で見い出される一般構成に
類似していることを示した。電子顕微鏡写真を外形計測
的に分析し、これら組織の近位表面上皮に見い出される
細胞形の分布を評価した。これらのデータの要約は図1A
中に含まれる。異種移植片および気管支組織中に見い出
された細胞型の分布は、霊長類の近位気道について先に
記載され、図1A中もまた示されるそれと緊密に類似して
いる。Plopper,C.G.ら、Am.J.Anat.184:31−40（198
9）;Wilson,D.W.ら、Am.J.Anat.171:25−40（1984）。
さらに、異種移植片とこの異種移植片が由来した気管支
組織との間で注目された、繊毛細胞、杯細胞、基底細胞
および中間細胞の発生量に差異はなかった（統計的分析
については図1A参照）。この知見は、異種移植モデルの
近位ヒト気道を試験するための妥当性を確認した。
ヒト気管支上皮におけるアデノウイルス介在遺伝子導入 Ad5に基づく種々の組換え体アデノウイルスを使用し
た。各ウイルスからE1およびE3配列が検出された。組換
え体のいくつかはE1の代わりにミニ遺伝子を含んでい
た。使用したウイルスは以下を含む：任意の他の配列を
付加することなく、E1およびE3が欠失された、前駆体組
換え体ウイルスであるAd.E1Δ；ラウス肉腫ウイルス（R
SV）LTRから発現される、核の標的lacZを含むAd.RSVβg
al;サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターから発現
される細胞質lacZを含むAd.CMVlacZ、ならびにCMVエン
ハンサーおよびβアクチンプロモーターから発現される
ヒトCFTRを含むAd.CB−CFTR。
Ad.RSVβgal（１×1012、１×109、および１×108pfu
/ml）、またはAd.E1Δ（１×1012pfu/ml）の精製ストッ
クを用い、ウイルスを放出させた後、異種移植片に１時
間感染させた。感染の全体的な効率を評価するために、
移植片を回収、固定、Xgal中で染色し、そして解剖顕微
鏡により正面を視覚化した。感染後３日目に全ての異種
移植片を回収したが、例外として１×109pfu/mlを感染
させた異種移植片はウイルス感染後21日目に回収した。
Ad.E1Δを感染させた異種移植片は、Xgal陽性の細胞を
示さなかったが、lacZ発現の大きな領域がAd.RSVβgal
（１×1012pfu/ml）に暴露され、そして３日後の回収さ
れた移植片に示された。この異種移植片のGMA切片の形
態分析により、11＋／−6.3％の上皮細胞に遺伝子発現
が示された。同様に高レベルの感染が10〜100倍に希釈
したウイルスストックで得られた;1×1010〜1011pfu/ml
のAd.RSVβgalでの４つの独立した組織試料から作成さ
れた12の異種移植片の感染により、５〜20％の細胞にla
cZの発現が起こった。１×1010pfu/mlを超えるウイルス
の力価では遺伝子導入の増加が達成し得なかったことか
ら、アデノウイルスレセプターが飽和に達したことが示
唆される。１×109、および１×108pfu/mlでAd.RSVβga
lを感染させ、そして３日後に調べた異種移植片では、
上皮の全細胞のうちそれぞれ1.9＋／−0.2％、および＜
0.1％に遺伝子発現が示された。気管支上皮内でlacZ発
現が安定かどうか測定するために、異種移植片をまた、
１×109pfu/mlのAd.RSVβgalアデノウイルスでの感染21
日後に回収した。感染後３日目と21日目との間には、Xg
al陽性細胞のパーセントに変化は認められなかった。感
染後５週までに回収した異種移植片では、導入遺伝子の
発現が減少していない。
異種移植片における導入遺伝子発現の分布を測定する
ために、一連の分析を実施した。導入遺伝子を発現した
各細胞型のパーセントを決定するために、１×1012pfu/
mlのAd.RSVβgalを感染させた異種移植片のXgal染色切
片を光学顕微鏡によって分析した。これらの結果は図1B
にまとめられている。光学顕微鏡によって測定された異
種移植片の全ての細胞型の分布は、超微細構造の基準を
用いて確立されたものと同一であった。Xgal沈殿物を含
む細胞の割合は、移植片における細胞型の分布に匹敵
し、例外的に導入遺伝子を発現した基底細胞が極少数認
められただけであった。基底細胞においてlacZ発現が相
対的に存在しないことが、Ad.RSVβgalまたAd.CMVlacZ
のいずれかで感染された移植片で示されたことから、導
入遺伝子発現を駆動するウイルスポロモーターの変化
が、基底細胞に見られるβ−ガラクトシダーゼ活性の排
除の原因ではないことが示唆される。
Xgal沈殿物の拡散は、大きな、高度に発現するクラス
ターの細胞型の定量を困難にした。導入遺伝子を発現す
る細胞型のより正確な定義を、レセプター遺伝子産物の
β−ガラクトシダーゼに対する抗体、および基底細胞
（サイトケラチン14）または分化円柱細胞（サイトケラ
チン18）のいずれかに特異的な産物に対する抗体を用い
る免疫細胞化学を行うことにより達成した。１×1011pf
u/ml Ad.CMVlacZを感染させ、そして感染３日後に回収
した異種移植片からの凍結切片（６μｍ）を、（Texas
Red結合）β−ガラクトシダーゼ；（AMCA結合）サイト
ケラチン14;および（FITC結合）サイトケラシン18に対
する抗体を用い、三重の免疫蛍光測定法（Nomarski）に
よって分析した。lacZは、Ad.CMVlacZおよびAd.RSVβga
l感染の両方の移植片からの、＞99.9％の導入遺伝子発
現細胞（計数されたＮ＝1500の細胞）内で分化細胞のマ
ーカーであるサイトケラチン18と共存し、これによって
Xgal染色移植片によりなされた観察を確認した。
嚢胞性維症の遺伝子治療を開発するためのこのモデル
の有効性を確立するために、ヒトCFTRを発現する組換え
体アデノウイルスで、別の実験を実施した。１×1011pf
u/mlのAd.CB−CFTRまたはAd.CMVlacZのいずれかを感染
させ、そして感染３日後に回収した異種移植片からの凍
結切片（６μｍ）を、ヒトCFTR Rドメインプローブを用
いたインサイチュハイブリダイゼーション、およびポリ
クローナルCFTR抗体を用いるCFTRタンパク質に対する免
疫細胞化学によって分析した。Engelhardt,J.F.ら、Nat
ure Genet.2:240−248（1992）。Ad.CB−CFTR感染移植
片中の約２〜10％の細胞において、アンチセンスCFTRプ
ローブでバックグランドを超えるハイブリダイゼーショ
ンを検出した。これらの移植片において同様の割合の細
胞が、CFTR特異抗体を用いた免疫細胞化学に基づくCFTR
タンパク質の過剰発現を示した。Ad.CMVlacZ感染移植片
は、CFTRプローブへのハイブリダイゼーション、または
内因性レベルを超えたCFTR抗体への結合は示さなかっ
た。Ad.CB−CFTR感染移植片においてCFTRタンパク質の
過剰発現が、線毛細胞、杯状細胞、および中間細胞を含
む全ての分化細胞の型において検出された。組換え体タ
ンパク質は、大部分の線毛および杯状細胞における尖端
表面、および中間細胞の細胞質ゾルに局在化した。感染
後、少なくとも５週間、移植片において組換え体CFTRタ
ンパク質の発現が検出された。
遺伝子的に再構築した異種移植片の上皮細胞におけるア
デノウイルスタンパク質の発現 免疫細胞化学技術を用
いて、アデノウイルスタンパク質の発現について異種移
植片を分析した。ヘキソン、ファイバー、および72kd E
2a遺伝子産物、すなわちDNA結合タンパク質（DBP）を認
識する抗体を用いて、Ad.CMVlacZ、Ad.RSVβgal、また
は野生型Ad5を感染させた異種移植片におけるアデノウ
イルスタンパク質の発現を検出した。１×1011pfu/ml A
d.CMVlacZを感染させ、そして感染３日後に回収した異
種移植片からの凍結切片（６μｍ）を、（AMCA結合）β
−ガラクトシダーゼ；（Texas Red結合）DBP;および（F
ITC結合）ファイバーに対する抗体を用い、三重の免疫
蛍光測定法（Nomarski）によって分析した。野生型Ad5
を感染させ、感染20時間後に回収し、そして抗体を用い
た二重の免疫蛍光測定法（Nomarski）によって分析した
異種移植片は、高レベルのヘキソン、およびファイバー
タンパク質を発現した細胞のサブ集団を示した。二重の
免疫蛍光測定試験によって、後期の遺伝子産物であるヘ
キソンおよびファイバーを発現する細胞もまた、遺伝子
産物DBP（アデノウイルス感染の初期フェーズにおいて
発現される）を低レベルで発現することを示した。１×
1010、１×1011、および１×1012pfu/mlのAd.RSVβgal
またはAd.CMVlacZを感染させた異種移植片の同様の分析
は、実質的なレベルのβ−ガラクトシターゼ発現にも関
わらず、ファイバータンパク質およびヘキソンタンパク
質のいずれも検出可能なレベルを示さなかった。しか
し、より長期のインキュベーション時間、およびより高
濃度の一時抗体を用いて、低レベルのファイバーの発現
が、少量のlacZ発現細胞の核内に見られ得た。対象的
に、高レベルのDBPが、または検出可能なβ−ガラクト
シダーゼの不在下でDBPを発現する細胞と伴って、β−
ガラクトシダーゼ陽性細胞の３〜５％に見出された。DB
Pを発現する細胞は、より低レベルのβ−ガラクトシダ
ーゼを発現する傾向があり、そしてクラスター内に優勢
に見出された。DPBを発現するβ−ガラクトシダーゼ陽
性細胞のパーセントは、１×1010、１×1011、および１
×1012pfu/mlのMOIに関しても同一であった。
異種移植片からのアデノウイルスの回収 異種移植片
を、感染後24日間までの期間、連続潅注した。3.5日の
間隔でAd.CMVlacZを感染させた異種移植片から流出物
（1ml）を集め、そして293細胞上でXgal染色pfuアッセ
イにより力価を求めた。293細胞上で生成したプラーク
は全て、青色沈殿物の形成により明らかなように、β−
ガラクトシダーゼを含んでいた。回収したウイルスを、
日単位で測定して、logスケール対ウイルス注入後の時
間上にプロットした。図２（Ａ−Ｅ）は代表的な実験を
示す。流出物中のウイルス濃度は、全ての移植片中にお
いて感染後の最初の週に著しく低下したが、例外的に図
2Bに示した移植片では、ウイルスが、指数的に減少する
前に一時的に増加した。全てではないがほとんどの移植
片において、残りの観察期間（14〜24日目）の間に、流
出物中で回収されるのウイルスの量は、低レベルではあ
ったが、検出可能なレベルで安定した。
実験終了後、異種移植片を回収し、Xgal染色し、そし
て表面上皮細胞における遺伝子再構築のパーセントにつ
いては評価した。実験終了時の溶出物で回収されたウイ
ルスの量は、実質的に、移植片間で変動し、そして導入
遺伝子を発現する上皮のパーセントに比例した：図２
（Ａ−Ｅ）では、パネルＡ〜Ｃは５〜20％のlacZ陽性細
胞；パネルＤは１％のlacZ陽性細胞；およびパネルＥは
0.01％より少ないlacZ陽性細胞を示す。最大レベルの遺
伝子再構築を有する異種移植片からの流出物において、
最も高い濃度のウイルスが検出された（図2A）が、24日
目にウイルスが検出不能であった流出物を生産した移植
片は、その上皮中でほとんど導入遺伝子を発現しないこ
とが見出された（図2E）。流出物中で回収された全ての
ウイルスは、lacZを発現することが見出された、異種移
植片はそれほど野生型アデノウイルスを発散しないこと
が示された。
組織試料または組換え体ストックにおいて野生型のア
デノウイルススの汚染の可能性をさらに調べるために、
100μｌの選択された1ml流出物を用いて、HeLa細胞の集
密層の80％に感染させた。図２では、HeLa細胞上で細胞
変性影響（CPE）引き起こす能力によって野生型のアデ
ノウイルスについてアッセイされた流出物にアスタリス
クを付した。感染後、最初の４日間は48時間毎に培地を
変換し、そして次の17日間は毎日変換した。どの流出物
でもCPEの証拠は見られなかった。最後に、流出物のポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）分析では、1mlの流出物当た
り100分子の感度で、E1a配列は検出されなかった。
具体的実施例２−温度感受性ベクター sub360およびdl7001骨格のE1欠失領域中に挿入された
CFTRミニ遺伝子を有し、またウイルスの複製に必要な遺
伝子中に付加的な変異を含むベクターを生産した。さら
に以下に論議されるように、62.5muでH5ts125株で見出
されたミスセンス温度感受性変異の取り込みを、sub360
またはdl7001、H5ts125を含む３つの独立のDNA構築物か
らのフラグメントと、ミニ遺伝子カセットの５′側に置
かれたE1a配列を有するCFTR cDNAプラスミドとを結合す
ることによって達成した。これらのベクターをAd.CB−C
FTRts125sub360およびAd.CB−CFTRts125dl7001とする。
これらのベクターはE3中の欠失した領域のサイズを除け
ば同一である。図３は、他のアデノウイルス遺伝子に関
してE1欠失領域、E3欠失、およびH5ts125変異内の、CFT
Rの問題の導入遺伝子の位置を示す。これらのベクター
中の変異により、ウイルス複製の減少、発現されたタン
パク質の減少、および導入遺伝子発現持続の増加があ
る。下記に本発明のベクター生産についてさらに詳細に
述べる。
温度感受性ベクター 本発明の温度感受性ベクターの構
築において、本発明のベクターの「親」ストックとして
用いられる温度感受性（ts）アデノウイルススストック
を作成した。これらのベクターは（DBP）E2a領域内にts
変異を有する。特に、先に単離されたアデノウイルスス
５型株の温度感受性変異体Hst125が得られている。Vand
er Vliet,Pら、J.Virol.15:348−354（1975）。Hst125
はE2a遺伝子から生産される72kdタンパク質のカルボキ
シ末端で単一のアミノ酸置換（62.5mu）を有する。この
タンパク質産物は一本鎖DNA結合タンパク質であり、そ
してアデノウイルスゲノムDNAの複製に関与する。許容
温度（約32℃）で、この株は、HeLa細胞上で全生活環の
生育能を有するが、非許容温度（約38℃）では、アデノ
ウイルスDNAの複製は見られない。さらに、非許容温度
では、HeLa細胞において免疫反応性の72kdタンパク質の
減少が見られる。
Hst125変異およびE3欠失を含む２つの二重変異体スト
ックも作成した。E3変異は先の述べた変異体アデノウイ
ルス５型株、sub360、およびdl7001に特徴的である。
（sub360はLogan,J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）8
1:3655−3659（1984）にて報告された;dl7001（William
Wold、Washington大学、St Louisより供与され
た））。両変異体ウイルスは、アデノウイルススゲノム
のE3領域に欠失を含む;sub360では78.5から84.3mu、そ
してdl7001では78.4〜86mu。E3はアデノウイルスの複製
に要求されないため、sub360およびdl7001の両方の生活
環は野生型の特徴を示す。
結果として生じた新たなアデノウイルス変異体Hst125
sub360およびHst126dl7001を用いて、Hts125変異および
E3欠失を保持するCFTR組換え体アデノウイルスベクター
を作成する。ここでCFTRはE1a/E1b欠失領域内に挿入さ
れる。CFTR遺伝子カセットは、CMVエンハンサーおよび
βアクチンプロモーターによって駆動される。上記の通
り、得られた組換え体アデノウイルスベクターを、Ad5.
CB−CFTRst125sub360およびAd5.CB−CFTRst125dl7001と
する。
温度感受性CFTRベクター 以下は本発明のCFTR組換え体
アデノウイルスの生成のより詳細な記載である。Mhe I
切断によって、プラスミドPad.CB−CFTRを直鎖状にし
た。相同的組換えが起こるように、293細胞を、Ad.CB−
CFTR、およびClaI切断Hst125dl7001DNAまたはHst125sub
360DNAの大フラグメントで同時トランスフェクトした。
組換え体アデノウイルスDNAを複製させ、そしてプラー
ク形成によって証明されるように感染性ビリオンにキャ
プシド化した。32℃でインキュベーションした後、個々
のプラークからウイルスを単離し、そして293細胞内で
増幅させた。予想通り、38℃の非許容温度ではウイルス
プラークは見られなかった。ヒトCFTR cDNAを含む組換
え体アデノウイルスを、制限切断、およびサザンブロッ
ト分析によって同定した。CFTRに陽性の２つの組換え体
ウイルスを、２回目にプラーク精製を行い、そしてAd.C
B−CFTRts125dl7001、およびAd.CB−CFTRts125sub360と
した。これらのウイルスを32℃での感染により、293細
胞内で増殖させた。56時間後、３サイクルの凍結解凍に
よってウイルスを回収した。全ウイルス調製物をCsCl密
度遠心分離によって精製し、そして直ちに使用するため
にゲル濾過してCsClを除去するか、またはグリセロール
/BSA溶液に1:5で希釈した後に−20℃で保存した。ウイ
ルスストックの力価を、293細胞を用いるプラークアッ
セイによって測定した。
当業者は、アデノウイルス２型のような関連するアデ
ノウイルス血清型、ならびに41のアデノウイルス血清型
のいずれにも、本発明に記載のアデノウイルス５型ベク
ターに置換し得ることを理解する。従って、具体的なア
デノウイルス型によって拘束されることは、出願人の意
図ではない。
具体的実施例３−霊長類試験 霊長類試験では、第一世代ベクターに伴う毒性および
生物学的効果を評価するために、臨床治験をシミュレー
トすることを試みた。結果を表Ｉ−Ｘにまとめ、本具体
的実施例の最後に示す。導入遺伝子（CFTR）発現を行っ
たが、第一世代ベクターの副作用には、肺組織炎症が含
まれていた。本発明の好ましい第二世代ベクターの性状
の一つは、このような炎症を改善することである。
A.試験Ｉ−可能性 本試験の目的は、依存肺葉の単一区域に組換え体アデ
ノウイルスを選択的に送達する可能性を評価することで
ある。本実験では、臨床治験で提唱されている最大用量
のウイルスを使用した。感受性および特異性組織学的染
色を用いて、肺全域における遺伝子発現の分布を正確に
評価できるように、Ad.CB−CFTRに対して類似構造のlac
Zウイルスを使用した。さらに具体的には、lacZ導入遺
伝子カセットをCFTR導入遺伝子に対して置換する。即
ち、全てのアデノウイルス配列は同一である。特定の目
的は、短期的毒性を評価することであり、および標的肺
切片内外の組換え遺伝子発現の分布を評価することであ
る。
材料および方法 動物 12歳、32.5Kgのヒヒ（Papio anubis）を試験（CF
Bl）に使用した。トランスフェクション前の評価中に、
動物は低酸素症（PaO2 54mmHg）および高炭素ガス症（P
aCO2 55mmHg）であることが見出された。胸部Ｘ線撮影
により、右上肺葉および右中肺葉に虚脱が認められた。
長期用の動物としては不適切であり、従って短期可能性
試験に使用することに決定された。その後の経験から、
ガス交換時の異常の大多数は、内因性の肺疾患によるも
のではなく、麻酔中に発症する無気肺によるものである
と結論した。
麻酔 動物をチレタミン／ゾラゼパム（テラゾール）
（2.2mg/kg）の筋肉内投与で鎮静した。反復注入を使用
して充分な鎮静作用を維持した。静脈用カテーテルを伏
在静脈に挿入し、操作中はリンゲル乳酸を注入した。操
作中動物は室内空気を呼吸した。
ウイルス投与 動物に9mmカフ付き気管内チューブを口
腔より挿管した。ベンゾカイン（20％）を気管内チュー
ブに噴霧した。オリンパスBF lT20フレキシブルファイ
バーオプティック気管支内視鏡を気道内に導入した。気
道内の検査では、胸部Ｘ線撮影上に見られた右上肺葉お
よび右中肺葉の虚脱の根拠となる近位の閉塞病変は認め
られなかった。気管支粘膜は、気管気管支分岐内では僅
かに崩壊性があった。5Fr二重腔バルーンカテーテル
を、気管支内視鏡チャンネルに通して左肺に挿入した。
先端を左上肺葉の背部区域の管腔に導入し、0.8mlの空
気でバルーンを膨張させた。標準生理食塩水中Ad.CMV−
lacZウイルスの25ml（１×1011pfu/ml）をカテーテルを
通して、カニューレを挿入した区域に注入した。5mlの
空気を注入してカテーテルからウイルス含有液を除い
た。動物から咳は認められず、また注入中に気管管腔か
らの液漏れも認められなかった。カテーテルはバルーン
を膨張させた状態で、定位置に８分間固定した。固定時
間終了時には、動物の脈拍は触診により数回の期外収縮
が検出された。カテーテルおよび内視鏡を除去した。動
物をさらに10分間、仰向けに固定した。この時間中、４
〜５回の期外収縮／分が認められたため、動物をアンブ
蘇生器で換気した。この期間中動物から咳は認められな
かった。10分以内には、期外収縮は以後検出されず、動
物をケージに戻したところ、動物は正常に回復した。
追跡：検死 動物をチレタミン／ゾラゼパム（テラゾー
ル）（2.2mg/kg）で鎮静させ、ペントバルビタール／フ
ェニトインにて屠殺した。検死を実施した。肺の膨張を
固定し、全体をXgal中で染色した。
結果 動物は本操作に良好な耐性を示し、毒性に対する臨床
症状は認められなかった。充分な目診および組織病理学
に基づいた検死を実施した。
感染３日後にヒヒを安楽死させ、左肺に通じる主幹気
管支を管に結紮した。ヒヒの左右２つの肺を0.5％グル
タルアルデヒド/PBS中で２時間膨張固定した後、1mM Mg
Cl2/PBS中でそれぞれ15分ずつ２回洗浄した。次に肺を
同緩衝液に浸すことに加えて、肺を反応混合物で満たす
ことにより、肺全体をXgal溶液中で30分間37℃に染色し
た。次にXgal溶液を除去し、そして肺を緩衝化ホルマリ
ン中で後固定した。この反応を２時間進行させた。左肺
を目診したところ、強発色のXgal反応生成物が明らかに
左上肺葉の背部区域に限定していることが明らかになっ
た。図４に示す通り、小さな病巣の反応生成物が左下肺
葉に見られた。図４中、実線の矢印はウイルスを注入し
た区域中でXgal反応生成物を示し、白ヌキの矢印は、ウ
イルスが隣接している肺葉の隣の区域に漏出している領
域を表す。組織学的切片では、組換え遺伝子の発現が主
に肺胞細胞内に認められ、また気道を処置した場合には
まだらに散在した発現が認められ、これは、図５および
６に示したCFB4動物のCFTRおよびlacZ注入肺葉由来のXg
al染色組織で観察されたものと同様であった。（CFB4動
物に対する手順は次の通りである:CFB4動物の右上およ
び左上肺葉の殆どの近位区域に7mlのAd.CB−CFTRおよび
Ad.CMVlacZを１×1010pfu/mlの濃度で注入した。四分円
（quadrant）1D由来の試料を0.5％グルタルアルデヒド/
PBS中で固定し、ブロック上でβ−ガラクトシダーゼに
対してXgalを用いて30分間染色した。組織をパラフィン
中に埋包し、５μｍの切片を作製してヘマトキシリンで
簡単に染色した。）図５の顕微鏡写真はAd.CB−CFTR感
染肺葉（図5A）およびAd.CMVlacZ感染肺葉（図5B）の解
剖顕微鏡からのオンフォス（on fos）図を示している。
黒色の矢印は気管支内のXgal陽性細胞を示し、白色の矢
印は肺胞内のXgal陽性領域を示す。図６の顕微鏡写真
は、Ad.CB−CFTR感染肺葉（図6A）およびAd.CMVlacZ感
染肺葉（図6B）由来の切片を示している。目診では、肺
は正常であった。無気肺は組織学的切片の解釈を複雑に
する。しかし、非化膿性の脈管周囲の単核細胞の浸潤物
を伴う肺胞炎の病巣が、遺伝子が入り込んだ肺の領域に
限定して認められた（詳細については後述参照）。
B.試験II−毒性 本試験の目的は、肺区域に送達された組換え体アデノ
ウイルスの長期毒性をを評価することである。さらに組
換え遺伝子発現およびアデノウイルス感染を検出するた
めの気管支内視鏡技術の感受性および特異性の評価を試
みた。大型のヒヒ対して、最大用量（１×1010pfu/ml）
のAd.CMV−lacZおよびAd.CB−CFTRを個々の肺区域に投
与した。動物を、数回の気管支内視鏡検査により、気管
支肺胞洗浄法およびブラッシングより、病理学ならびに
lacZおよびCFTRを発現する細胞について分析した標本を
用いて試験した。
材料および方法 動物 12歳、32.5Kgの雄性ヒヒ（Papio cynocephalus/a
nubis）をこれらの試験（CFB2）に使用した。ヒヒは他
の動物とは別のケージに収容し、標準的な食餌を与え
た。
麻酔 動物をチレタミン／ゾラゼパム（テラゾール）
（2.2mg/kg）の筋肉内投与で鎮静した。同薬剤および筋
肉内へのブトルファノールの補助注入（0.02mg/kg）に
より、鎮静作用を維持した。静脈用カテーテルを伏在静
脈に挿入し、操作中はリンゲル乳酸を注入した。追跡試
験の日では、動物を最初にチレタミン／ゾラゼパムの筋
肉内投与で鎮静したが、必要に応じてチアミラール（2.
5mg/kg）の静脈投与により補助的な鎮静を行った。
胸部Ｘ線撮影および標本の回収 腹側−背側および左側
部横臥位胸部Ｘ撮影を行った。大腿動脈より採血し、血
液ガス、化学的検査、血液学的検査、凝集パラメータお
よびウイルス培養について分析した（下記記載）。尿管
カテーテルを膀胱に挿入し、一般検査およびウイルス培
養のため尿を採取した。ウイルス培養のため、綿棒を用
いて直腸および咽頭の試料を採取した。
気管支内視鏡による試料の回収 9mmカフ付き気管内チ
ューブを口腔より気管中に挿管した。FB−18Xペンタッ
クスファイバーオプティック気管支内視鏡を気道内に通
し、右中肺葉の楔形位置（wedged position）まで押し
進めた。25mlの滅菌生理食塩水を滴下し、分析のため直
ちに吸引して12mlを回収した。次に、３つの気管支ブラ
シを用いて、右中肺葉気管支より上皮細胞を採取した。
各ブラシを約3cm肺葉管腔に進め、前後にこすった。ブ
ラシの4cm末端を切断して、ハムF12培地に滴下した。
ウイルス投与 ファイバーオプティック気管支内視鏡を
気道内に挿入して、左上肺葉の背部区域の管腔に押し進
めた。5Fr二重腔バルーンカテーテルを、気管支内視鏡
チャンネルに通して、バルーンが区域の気管支の管腔内
に位置するように押し進めた。バルーンをゆっくりと膨
張させて気管支を閉塞した。カテーテル管腔を通して、
20mlの標準生理食塩水中Ad.CMV−lacZウイルスを１×10
10pfuで区域の気管支内に注入した。カテーテルをその
場に10分間維持し、その後除去した。次に、気管支内視
鏡を右上肺葉の背部区域の区域管腔に向けた。左側と同
様に、バルーンカテーテルを用いて20mlのAd.CMB−CFTR
を区域の気管支に滴下するために用いた。ウイルス注入
の前後に、動物に無呼吸状態が認められたが、おそら
く、鎮静剤の筋肉内への反復投与の蓄積効果によるもの
と思われる。注入中および注入後は、自発呼吸が安定す
るまで、断続的に動物をアンプ蘇生器で換気した。ナロ
キソンおよびドキセプラム（doxepram）も投与した。動
物をケージに戻したところ、正常に回復した。
追跡試験 ３、14、21、73、77、79、93、102、116およ
び152日目に、動物を麻酔した。胸部Ｘ線撮影を行い、
血液、尿、糞便、および咽頭標本を採取した。３日目お
よび21日目に、気管内に挿管し、そして概ね上記の通り
気管支内視鏡を用いて左右上肺葉の背部区域より、気管
支肺胞洗浄液および気管支ブラシ標本を採取した。
結果 動物は本操作に良好な耐性を示し、そして毒性に対す
る臨床症状は認められなかった。動物は継続的に体重が
増加し、生命徴候（vital sign）は正常値内に保たれて
いた。複数の試験から得られた検査結果は、試験IIIの
結果とともに表II−Ｘおよび図８−12に記載した。CFB2
に関する結果をまとめると、血液学的数値（表II）、凝
集プロフィール（表II）、化学的数値（表III）および
尿検査（表IV）は、肝酵素レベル（表III）を除いて正
常値内に保たれていた。遺伝子導入前に、トランスアミ
ナーゼの穏やかな上昇が見られた。上昇したレベルは、
追跡期間中に持続するか、または改善された。動脈血ガ
ス（表Ｖ）は、ベースラインの低酸素症および高炭素ガ
ス症を示した（後述）。追跡期間中のガス交換の変化を
モニターするために、Ｐ（Ａ−ａ）O2を用いた。Ｐ（Ａ
−ａ）O2の上昇は、遺伝子投与後21日目にピークに達
し、116日目にはベースラインを下回った。胸部Ｘ線撮
影（表VI）では、遺伝子投与前に上肺葉のくもり（hazi
ness）が認められた。左側では21日目に異常がさらに悪
化した。その後胸部放射線撮影は正常に回復した。
BAL溶液細胞数および鑑別の分析（表VII）について
は、用量／毒性試験IIIと組み合わせて、後述、で述べ
る。図7Aの顕微鏡写真に示された通り、CFB4動物のAd.C
MVlacZ注入左上葉由来の気管支ブラッシングの細胞遠心
調製物の組織化学的Xgal染色では、４日目のlacZ区域よ
り回収したBAL溶液中の5.2％の細胞でlacZ発現が認めら
れた。単一のlacZ細胞が反対側で回収された。CFTR発現
は、CFTR区域由来のBAL溶液中の3.4％の細胞中で検出さ
れた（図7B）。図7Bの顕微鏡写真中に示された通り、CF
B4動物のAd.CB−CFTR注入右上葉由来の気管支ブラッシ
ングの細胞遠心調製物の免疫細胞化学CFTR染色では、A
d.CB−CFTRを投与した細胞の2.1％がCFTRを示した（表V
III）。注入後４日目より以後のブラッシングまたはBAL
より回収した細胞では、導入遺伝子の発現は検出されな
かった。
ウイルス注入（shedding）および回収に対する培養の
結果を、後述の用量／毒性試験IIIの結果とともに示す
（表IXおよびＸ）。
C.試験III−用量／毒性試験 本試験では、12匹のヒヒを用いて、アデノウイルス介
在遺伝子導入の効果および毒性（表Ｉ）を測定した。12
匹の動物それぞれについて、左上葉の背部区域にAd.CMV
−lacZ、および右上葉の背部区域にAd.CB−CFTRの気管
支内点滴注入を行った。動物は３匹ずつ４つのグループ
に分け、濃度の異なるウイルス溶液、１×107、108、10
9または1010pfu/mlを気管支に点滴注入した。４グルー
プのそれぞれから１匹のメンバーを遺伝子注入後４日目
に、21日目にさらに別の１匹の検死を行い、そして残り
の動物は長期評価のため生存させた。
材料および方法 動物 主な用量反応試験に用いた12匹のヒヒ（Papio）
は年齢２歳〜５歳、体重７〜14kgであった（表Ｉ）。動
物は全て別々のケージに収容し、標準的な食餌を与え
た。
鎮静 12時間絶食させた後、動物を2.2mg/kgのチレタミ
ン／ゾラゼパム（テラゾール）の筋肉内注入で鎮静し
た。同薬剤の繰り返し筋肉内用量または静脈内チアミラ
ール（2.5mg/kg）を用いて、適切な鎮静を維持した。
標本の回収および胸部放射線撮影 沈静後、血液ガス測
定のため、動脈血を大腿動脈からヘパリン処理シリンジ
に採り、さらにそのアリコートを血球測定のためEDTAナ
トリウム中に、血清化学検査および抗体測定のためにガ
ラスチューブ中に、ウイルス培養のためにヘパリン処理
チューブ中に、そしてプロトロンビンおよび部分トロン
ボプラスチン時間測定のためにクエン酸ナトリウム中に
置いた。尿道カテーテルを膀胱に挿入し、一般分析およ
びウイルス培養のために尿を採取した。University Hos
pital、Ann Arbor、MIの臨床検査室を利用して、細胞
数、鑑別計測、凝結検査および動脈血ガスについては血
液を、電解質、血中尿素窒素およびクレアチニン、カル
シウム、リン酸、総タンパク質、アルブミン、アスパラ
ギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナー
ゼ、アルカリホスファターゼ、乳酸デヒトロゲナーゼお
よびビリルビンについては血清を、そして一般尿検査に
ついては尿標本を分析した。鼻咽頭分泌物および直腸糞
便試料は綿棒により回収した。これら試料を、血液、
尿、および気管支肺胞洗浄液とともにアデノウイルスに
ついて培養した。腹側−背側および左側部横臥位胸部Ｘ
線撮影を行った。
気管支内視鏡検査 FB−10Xペンタックスファイバーオ
プティック気管支内視鏡を5.5mmカフ無し気管内チュー
ブを通じて挿入した。単回量として楔形気管支内視鏡を
通して、標準生理食塩水を滴下注入する（動物が小型の
場合には10ml）ことにより、気管支肺胞洗浄を実施し
た。溶液を直ちに吸引し氷上に置いた。試料とした各区
域に対して３−４の細胞学ブラシ（オリンパスBC−12
C）を用いて、気管支ブラッシングを実施した。ブラシ
を約２〜3cm肺葉孔内に進め、前後に摩擦し、そして次
いで取り出した。ブラシの4cm末端を切断して、ハムF12
培地に滴下した。
試験プロトコール 沈静および気管内挿入後、気管支肺
胞洗浄液および気管支ブラシを右中葉より得た。１％グ
リセロール／標準生理食塩水中Ad.CMV−lacZを左上葉の
背部区域に注入し、そして１％グリセロール／標準生理
食塩水中Ad.CB−CFTRを右上葉の背部区域に注入した。
より小型の気管支内視鏡におけるチャンネルのサイズに
は制限があるため、２匹のより大型のパイロット動物に
用いた手順とは異なり、バルーンカテーテルは、より小
型の12匹の動物には使用できなかった。その代わり、気
管支口に押し込んだ気管支内視鏡で、気管支内視鏡の内
部チャンネルを通じてウイルスを注入した（7mlの１×1
07、１×108、１×109、および１×1010pfu/ml）。ウイ
ルス点滴注入後、気管支内視鏡を10分間押し込んだまま
にした。気管支内視鏡を取り出し、そして動物を最低10
分間を超えて肺臥位に維持した。ウイルス注入中および
ウイルス注入後の気道の完全な閉塞維持することは困難
であったため、この技法は、より大型の動物で行ったバ
ルーンカテーテルを用いることよりも満足のいくものと
は思われなかった。
追跡：検死 各グループから１匹の動物を４日目に屠殺
し、別の１匹を21日目に屠殺した。屠殺の直前に、概ね
上記の通り動物を麻酔し、胸部Ｘ線撮影を実施し、そし
て血液、尿、糞便、および咽頭分泌物などの臨床標本を
採取した。次に動物をペントバルビタール／フェニトイ
ン（Beuthanasia）により屠殺し、検死を実施した。
追跡試験：長期動物 反復評価のため、各グループから
１匹の動物を生存させた。４、15、および21日目に、動
物を麻酔し、胸部Ｘ線撮影を実施し、そして血液、尿、
糞便、および咽頭標本を採取した。４および21日目に、
概ね上記の通り気管内に挿管し、そして気管支内視鏡を
用いて、左右上葉の背部区域より気管支肺胞洗浄液およ
び気管支ブラシ標本を得た。長期動物については、この
他に血液試料および胸部放射線写真を少なくとも月１回
得た。
並行試験 動物CFB3、CFB4およびCFB6も鼻粘膜へのアデ
ノウイルス介在遺伝子導入の試験を加えた。概ね上述同
様のアデノウイルスの気管内点滴注入の直前に、動物を
右側横臥位に固定した。ポリエチレンカテーテルを各鼻
に４〜5cm挿入し、そして0.8mlのウイルスを15分間にわ
たり右鼻孔に注入し、0.8mlの賦形剤（3.3％グリセロー
ル/33％PBS/63.7％標準生理食塩水）単独を左鼻腔に注
入した。CFB3およびCFB4にAd.CB−CFTRをそれぞれ濃度
１×107および1010pfu/ml投与し、CFB6にはAd.CMV−Lac
Zを１×1010pfu/ml投与した。
動物の全身反応 動物は、３匹の動物で気管支内挿管直
後、遺伝子注入前に嘔吐したことを除くと、Ad.CB−CFT
RおよびAd.CMV−LacZの気管支点滴注入に耐性であっ
た。これらの動物の内２匹は、追跡の気管支内視鏡検査
の間の挿管時にも嘔吐した。こられの症状が認められな
い場合に、気管内吸引を気管支内視鏡を用いて観察し
た。トランスフェクション後の期間中、動物の動作は正
常であった。動物は正常に食餌を摂取し、体重変化はト
ランスフェクション後期間で３％を下回っていた。試験
のために動物が鎮静される間の測定時の直腸温度は、決
して上昇しなかった。
血液計測および凝集測定 気管支内遺伝子投与（０日
目）直前、そしてさらに４、15、および21日目に、大腿
動脈より、クエン酸ナトリウムを含むチューブに血液を
採取した。図8Aに示すとおり血中ヘモグロビン濃度は、
トランスフェクション後、３週間の間、全動物において
正常範囲内を保っていた。図8Bに示す通り、これらの動
物を単一のグループとして分析すると、白血球数が０日
目および４日目の間で減少した（ｐ＜0.01）が、正常範
囲を保っていた。減少の程度は、ウイルス用量とは直接
関連していなかった。４日後、細胞数は増加して15日目
までには、ベースラインと異ならなかった（ｐ＞0.
1）。白血球鑑別数は、正常であったが、例外として試
験中しばらく、６匹の動物に単球のパーセントが穏やか
に上昇（最大11％）した。これらの動物のうち３匹は、
遺伝子投与前の０日目に単球が上昇した。他の３匹は１
×107、１×108、および１×109pfu/mlを投与されたグ
ループに属する。図8Cに示す通り、血中血小板数（試験
した全動物の平均値±SEMで表す）は、全測定値で正常
範囲内に保たれており、そして試験中変化しなかった。
プロトロビン時間および部分トロンボプラスチン時間は
試験中正常範囲内に保たれていた。また、表IIを参照。
血清電解質、タンパク質、酵素および尿検査 Na+、
K+、およびCl-の血清中の濃度は正常で、そして試験中
を通して変化しなかった。表III参照。遺伝子投与前の
０日目に２匹の動物で低い血清HCO3 -レベル（15および1
7mEq/L）が認められた。これらの試料では、動脈血pHも
また低かった（以下に記載）。追跡期間中、HCO3 -は正
常範囲に増加した。カルシウム、リン、総タンパク質お
よびアルブミンは正常に保たれていた。６匹の動物で
は、試験中１つまたはそれ以上の尿試料についてタンパ
ク尿のレベルが低かった。表IV参照。カテーテル挿入標
本にひどい血尿があったが、当日にその後動物が自然排
泄したときには認められなかったことから、これらのい
くつかはカテーテル法による外傷と思われる。タンパク
尿はウイルス用量とも、またトランスフェクション後の
日数とも関連していなかった。血清クレアチニンおよび
血中尿窒素は試験中を通して全動物で正常であった。肝
機能試験（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（AS
T）、アラニントランスアミナーゼ（ALT）、乳酸デヒド
ロゲナーゼ、アルカリフォスファターゼ、およびビリル
ビンは、１匹の動物がベースラインで穏やかな酵素上昇
（例えばAST 561U/L、ALT 85IU/L）が認められた（試験
中に安定に保たれていたか、または改善された）以外は
正常であった。プロトロンビン時間および部分トロンボ
ウラスチン時間は常に正常であった。
動脈血ガス 遺伝子投与前に動物を鎮静している間に採
取した動脈血試料は、ある程度幅広いPaCO2レベルを示
し、平均値±SDで44.8±4.3mmHg（36.7〜54.7mmHgの範
囲）であった。表Ｖ参照。PaCO2レベルの上昇は、ヒヒ
鎮静時に先に報告した呼吸低下および無気肺に起因する
ようである。測定したPaCO2のレベルは試験中を通じて
増加したままで、ウイルス用量またはトランスフェクシ
ョン後の日数に直接関連した変化は認められなかった。
上記の通り、動脈血pHレベルは、遺伝子トランスフェ
クション前のベースラインで２匹の動物では低かった
（pH7.15および7.28）。PaCO2レベルはこれら２匹の動
物ではより高くなく、そのため急性呼吸低下のみが原因
ではない。アニオンギャップ（Na+−［K+＋HCO3 -］）が
増加したことから、代謝性アシドーシスであることを示
す。未測定のアニオンは同定されなかったが、尿中には
何も検出されなかったことから、ケトン体であるようで
はない。試験中、これらの動物では低pHレベルが改善し
た；一匹の動物のpHは４日目の検死までに7.15から7.32
に増加し、また他の動物では15日目までに7.28〜7.39に
増加した。
ベースラインのPaO2は78.1±11.0mmHg（平均値±SE、
範囲54.0〜98.0mmHg）であった。換気の変化によって引
き起こされたPaO2の変化を補償するために、測定した動
脈PaO2およびPaCO2を用いて計算された肺胞−動脈酸素
勾配（Ｐ（Ａ−ａ）O2）を用いて、PaO2データを分析し
た。気管支内遺伝子投与（０日目）直前、そして再び
４、15、および21日目に、大腿動脈より血液を採取し
た。後日、１×1010pfu/mlウイルス用量を投与された長
期動物からさらに試料を得た。遺伝子投与前０日目の平
均Ｐ（Ａ−ａ）O2は、0.0〜26.6の範囲で12.5±7.0（S
D）であった。ベースラインのＰ（Ａ−ａ）O2レベルが
広範囲であると、処置によって誘導されたガス交換の変
化が曖昧であるため、０日目のレベルからのＰ（Ａ−
ａ）O2の変化、（ΔＰ（Ａ−ａ）O2）を用いてデータを
分析した。この方法で分析した場合、ウイルス用量また
はトランスフェクション後の時間間隔に対してΔＰ（Ａ
−ａ）O2に関する統計的に有意な効果は見出されなかっ
た。しかし、ΔＰ（Ａ−ａ）O2とトランスフェクション
後の日数との間の関係を調べると、ある傾向が示唆され
た。図９に、ウイルスの各用量を投与された動物のグル
ープについて、０日目のレベルからのmmHgで表じたＰ
（Ａ−ａ）O2の変化、（ΔＰ（Ａ−ａ）O2）を示す。よ
り高い方の投与用量の動物（１×109および１×1010pfu
/ml）は、Ｐ（Ａ−ａ）O2における増加をより有しやす
いようであったが、その一方より低い用量の動物（１×
107および１×108pfu/ml）は、遺伝子投与後、Ｐ（Ａ−
ａ）O2の増加と減少との間でより等しく分布していた。
胸部放射線写真 背臥の腹側−背側胸部放射線写真を全
動物で撮影した。表VI参照。動物を鎮静した際に生じた
と思われる一過性の無気肺により、浸潤の検出は複雑で
あった。無気肺を生じた動物の側は、しばしばＸ線を受
ける前に動物が横たわっていた側であった。動物を１分
間反対の臥床姿勢位置に変え、そして次に背位置に回転
させると、無気肺領域は拡張し得る。これらのアーチフ
ァクトを補償した後、異常の出現について胸部放射線写
真の分析が可能であった。浸潤は１×107、１×108、ま
たは１×109pfu/ml用量を投与されたいずれの動物にも
出現しなかった。１×1010pfu/ml用量を投与された４匹
の動物のうち３匹にのみ、新しい肺胞浸潤が生じた。浸
潤の範囲を位置決めし、および定量するために、等級シ
ステムを用いた。各肺の上部、中間部、下部肺視野を、
肺胞浸潤について等級付けた：「軽度」−最小限で検出
可能な浸潤；「中度」−浸潤が肺視野の４分の１を占め
る；「重度」−浸潤が肺視野の２分の１以上を占める。
図10に、１×1010pfu/ml用量を投与された動物において
遺伝子投与前後に検出された胸部放射線写真上の異常の
位置と範囲を示す。図10に示されたとおり、浸潤は一般
にトランスフェクション後15日目および21日目に最初に
出現した。長期動物のうち１匹には、トランスフェクシ
ョン前０日目に両上葉に線条の浸潤が存在した。この浸
潤は21日目に悪化したが、73日目に撮った放射線写真で
は完全に消散していた。他の長期の、１×1010pfu/ml投
与動物で出現した浸潤は、39日目に行ったＸ線では完全
に消散していた。
結果 気管支内視鏡の結果 試験中の間に長期動物で３回気管
支肺胞洗浄を行ない、そしてその結果を図11および表VI
Iに示す。０日目に、右中葉を洗浄し（図11中黒ヌリシ
ンボル）、そして４日目および21日目に右上葉（図11の
黒ヌリシンボル）および左上葉（図11の白ヌケシンボ
ル）の背部区域を洗浄した。細胞遠心分離調製物を作成
し、そしてWright染色法の変法で細胞を染色した。図11
では、１×107（■，□）、１×108（△、▲）、１×10
9（▽，▼）または１×1010（○，●）pfu/mlを投入さ
れた動物からのデータを別々に表示する。滴下注入した
容量の約50％は、遺伝子授与後、ウイルス用量または時
間に依存する変動なしに回収された。遺伝子滴下注入の
日に右中葉から得た気管支肺胞洗浄液の細胞濃度は2.32
×106±1.08×106（SD）細胞/mlであった。追跡気管支
内視鏡検査由来の洗浄液中で測定された細胞数は、日
数、用量、または洗浄が実施された側と関係はなかっ
た。細胞鑑別計測の分析は、０日目に、１匹の動物が好
中球％が著しく上昇し、そして別の動物ではリンパ球％
が上昇したという所見により複雑であった。これらの疑
わしい異常値でも、全動物について分析した時の好中球
％が時間とともに有意に変化し（ｐ＜0.03）、４日目に
ピークに達し、そして21日目にベースラインにもどっ
た。（図11参照）。このパターンは投与されたウイルス
の用量とは独立して起こった。リンパ球％もまた時間と
ともに有意に変化し（ｐ＜0.04）、好中球よりも遅れて
４日目と21日目との間に増加した。この増加は投与され
たウイルスの用量に影響されず、そして洗浄さした側に
依存しなかった。好酸球％では散発性の増加が見られ
た；しばしば好酸球は、洗浄された２つの区域のうちの
１つのみに存在し（左側か右側かは一貫していない）、
そして一時期にのみ存在した。
細胞遠心分離塗沫標本（smear）をXgalで染色して、
β−ガラクトシダーゼ活性を検出した（表VII）。青色
に染色する細胞が、３日目または４日目の時点で１×10
10pfu/mlを投与された動物から得た細胞集団内に存在し
た。他の時点で得られた溶液、またはより低い濃度のウ
イルスを投与された動物からはβ−ガラクトシダーゼに
対して陽性に染色された細胞は認められなかった。１匹
の１×1010pfu/ml用量を投与された動物から得られた細
胞を、免疫細胞化学を用いて、CFTRについて染色した。
遺伝子投与後３日目に少数の細胞（3.4％）が陽性に染
色された。
気管支ブラッシング 気管支ブラッシングにより得られ
た細胞の細胞遠心分離塗沫標本を、Xgalを用いたβ−ガ
ラクトシダーゼに対する染色、および免疫細胞化学によ
るCFTRに対する染色により、導入遺伝子を発現について
分析した。表VIII、および図7Aおよび7B参照。１×1010
pfu/ml用量投与後３日目または４日目の動物から得た試
料中では、少数の細胞が陽性に染色された。
ウイルス培養 血液、尿、鼻咽頭、糞便および気管支肺
胞洗浄液由来の標本を培養し、Ad.CMV−lacZ（293細胞
単層のXgal染色による）の存在、およびアデノウイルス
について細胞変性影響について293単層を調べた。表IX
およびＸ参照。陽性コントロールのデータも示す。遺伝
子投与後３日目に１×1010pfu/ml用量を投与された動物
から得られた気管支肺胞洗浄液の１つの培養を除き、全
ての培養は増殖しなかった。
検死 外見上、全動物の肺は、２つの例外を除き正常に
見えた。１×1010pfu/mlのウイルスの投与後21日目に屠
殺した動物は、主に右上葉、左上葉および右下葉の背部
表面に優勢に位置する出血性および灰色がかった斑点を
有した。また、１匹の動物は、両肺の全表面に散在する
班点状の緑−黒色の1mmのスポットを有した。
Xgalで一括（en bloc）染色した肺区域を用いてβ−
ガラクトシダーゼ活性の発現を調べた。１×1010pfu/ml
用量を投与された動物の左上葉の背部区域由来の肺胞組
織は、３日目または４日目に紺青に染色された（図５参
照）。１×109pfu/mlを投与された動物も同様であった
が、４日目の染色度は弱かった。３日目または４日目に
１×1010pfu/mlを投与された動物からは、解剖顕微鏡下
で、陽性に染色された気道細胞が散在する２〜３の領域
を見ることができた。21日目では、またはより低いウイ
ルス用量のどの動物にも染色は見られなかった。肺組織
の凍結切片のXgal染色により、解剖顕微鏡レベルで得ら
れた結論が確認された（図６参照）。
サザン分析を実施して、ウイルスDNAの解剖学的位
置、コピー数および残存を調べた。肺の隣接する四分円
から全DNAを調製し、組織化学および免疫組織化学的手
法により、導入遺伝子の発現について分析した。図12で
は、１×107〜１×1010pfu/mlのウイルス用量を投与さ
れ、そして４日目および21日目に検死を行った動物につ
いて、右および左肺の各視野（上部、中間部および下
部）を概略的に示した。各視野について示された炎症の
程度は、各葉からの複数（２〜４）の切片上に見られる
炎症のレベルの平均を示す。図12に示したとおり、CFTR
組換え体アデノウイルスDNAは、上部右葉の背部区域に
おいてのみ検出可能で、そしてAd.CB−CFTRを点滴注入
した領域に限定されていた。肺のDNA試料において検出
されたシグナルを、既知量の精製Ad.CB−CFTR DNAの標
準と比較することにより、感染４日後の下記のように細
胞ゲノムあたりのウイルスDNAの推定分子数を得た:1×1
010pfu/ml−細胞ゲノム当たり10ウイルスDNA分子;1×10
9pfu/ml−細胞ゲノム当たり２ウイルスDNA分子;1×108p
fu/ml−細胞ゲノム当たり0.2ウイルスDNA分子；および
１×107pfu/ml−ウイルスDNAの検出不能レベル。長期暴
露で痕跡量のDNAが可視化される（細胞ゲノム当たり0.1
コピー以下）１×109pfu/mlの用量は例外として、21日
目に検死された動物においては、いずれの用量でも、肺
試料においてアデノウイルスDNAは検出可能ではなかっ
た。さらに、４日目に検死された動物から回収された精
巣DNAにおけるサザンブロット（全ての用量を分析し
た）分析によってもウイルスDNAは検出されなかった。
変化する程度で、かつウイルス用量と相関して、動物
はリンパ球性脈管周囲浸潤を発症した。その最も軽度の
ものとして、肺実質組織内に小から中サイズの脈管の周
辺に、小リンパ球の蓄積が見られた。増加した数の肺胞
マクロファージがまた存在した。異常の重篤度の増加に
伴い、リンパ球性浸潤が隣接の脈管周囲領域を超え、そ
して肺胞の組織間腔の空間に広がった。肺胞内リンパ球
は時々マクロファージ数の増加を伴った。より進行した
肺炎を有する肺領域内においては、肺胞組織が単核細胞
で密に浸潤され、そしてその悪化時に肺胞内水腫が認め
られた。図12は、詳細に検死を実施した８匹の動物にお
ける肺炎の位置と重篤度を示す。炎症の重篤度に関する
等級分類法を用いて、炎症の程度および位置を伝えた:1
＋、肺胞内マクロファージの増加を伴う小脈管の極近傍
にリンパ級の局所的蓄積;2＋、肺胞隔膜付近にまで拡張
する炎症;3＋、集密炎症領域；および４＋、肺胞内水腫
を伴う拡散肺胞損傷。４日目に屠殺した全動物の肺、お
よび21日目に１×107および１×108pfu/ml用量を投与し
た動物の肺においては、炎症が存在しないか、またはか
なり軽度であった。１×1010pfu/mlを投与した動物にお
ける肺のいくつかの領域で、および１×109pfu/ml用量
を投与した動物における肺の１つの領域において、中度
〜重度の炎症が見られた。ウイルスを直接注入した肺の
領域においては、炎症がより多く存在するようであっ
た。しかし、これらの領域の外側でも炎症がまた存在し
た。このことは、ウイルス点滴注入の間の漏出を示し得
る。なぜなら、直接感染した肺領域以外の肺領域から得
られた肺組織の凍結切片において、時々Xgal陽性細胞が
見られたからである。Ad.CMV−lacZを投与された側とA
d.CB−CFGTRを投与された側との間の炎症の程度の差
は、あるとしてもほとんどないようであった。散在する
領域において、好酸球、および希に好中球が見られた。
これらの細胞が、炎症細胞の優勢型であることは決して
なかった。
大部分の炎症は遠位の肺実質内に位置した。リンパ球
性浸潤（１）は小脈管の周囲に生じたようであったが、
脈管壁壊死の証拠はなかった。稀に、良好に分界された
気管支関連リンパ球凝集物が拡散して気管支壁を浸潤し
た。ほとんど全ての例において、上皮は、豊富な線毛を
持つ細胞でその偽柱状（pseudocolumnar）パターンが保
存された無傷状態を保っていた。
３匹の動物は全て野生で捕獲したものであって、マク
ロファージの散在した凝集物が肺実質組織全体に拡散し
て見出された。このマクロファージは、その内部に珪酸
塩と思われる屈折性物質を有する濃緑−黒色素を含んで
いた。３匹の動物のうちの１匹においては、小数のリン
パ球がマクロファージ凝集物を採り囲んでいた。この物
質の供給源については未知である。
非肺器官 肉眼的および顕微鏡的に、残りの器官は遺伝
子処置に帰せられる異常は含まれていなかった。野生捕
獲動物のうちの１匹において、骨格筋、骨髄、および肝
臓内の２箇所の領域に寄生性嚢胞がみられた（表Ｉ−
Ｘ）。
本明細書中に記載の非ヒト霊長類試験は、本発明の第
２世代アデノウイルスベクターを含む現在のヒト試験の
代表であることが認識される。
具体的実施例４−ヒトプロトコール 下記は挿入CFTR遺伝子を含む本発明のベクターを用い
る遺伝子治療のためのヒトの臨床治験についてのプロト
コールである。このプロトコールはまた嚢胞性維症以外
の遺伝的疾患および後成的疾患の遺伝子治療に使用し得
ることが認識される。
患者の選択 本発明のアデノウイルスベクターを用いる
遺伝子治療については、嚢胞性維症の患者を評価するこ
とにおいて種々の基準を用いる。本治験を受ける患者は
以下の基準を一般に満たすべきである：（１）嚢胞性維
症の立証された診断。立証は、プロカルピンイオン導入
法による60mEq/lを超える汗中のナトリウムまたは塩化
物または嚢胞性維症遺伝子型、および嚢胞性維症の臨床
徴候の両者の証拠文書からなる。（２）年齢。18歳より
大きいかまたは等しい。（３）性。男性でも女性でも使
用し得る。生殖の機会を有さない患者のみを本試験に参
加させる。従って、試験への参加が、患者の生殖細胞系
に変異を誘導する事象はあるそうもなく、これらの変化
は、将来の世代に進まない。男性で無精子症が立証され
ていれば適格である。嚢胞線維症を有する男性の95％以
上が、輸精管の先天性無栄養症を有し、そしてそれ故こ
の基準を満たす。女性で両側の卵管結紮、または子宮摘
出が立証されていれば適格である。（４）疾患の重篤
度。適格であるために、患者は、計画された手順、すな
わち気管支内視鏡検査を安全に受けるために、適切な臨
床状態になければならない。受容可能な条件は、推定さ
れる２年生存が50％を超えるような臨床状態を有すると
して規定される。Keremらの試験（Kerem,Eら、N.Engl.
J.Med.326:1187−1191（1992））を用い、患者が以下の
全てを満たせば、50％を超える２年生存率を有すると考
えられる:a）予測される、30％より大きいまたは等しい
FEV1;b）室内空気呼吸時に55mmHgを超えるPaO2；および
ｃ）室内空気呼吸時に50mmHgより少ないPaCO2。疾病の
重篤度基準を選択して、末期に近い肺疾患を有する患者
を参加させることを避けたが、やはり意図は、少なくと
も中度〜重度の肺疾患、および実質的に短縮された予測
生存の患者を試験することにある。５年生存が50％を下
回るかまたは50％に等しい予測見込みの患者のみを選択
するためには、患者は以下の基準を満たさなければなら
ない。（Shwachman、Am.J.Dis.Child 96:6−15（195
8）:d）Shwachman−Kulczycki臨床スコアが50より小さ
いかまたは等しい。
患者が以下を示す場合は臨床治験から除外される。
（１）合併症の危険性。試験に参加することにより患者
の合併症に対する危険性が増加する状態。これらの状態
は、ａ）最近12ヶ月以内の気胸症;b）インスリン依存性
糖尿病;c）最近２ヶ月以内の、グルココルチコイド治療
を要する喘息またはアレルギー性気管支肺アスペルギル
ス症;d）患者に投与され得る少なくとも２つのタイプの
抗生物質に対してインビトロで感受性を有さない病原体
を生育させる喀痰培養;e）重篤な喀血の病歴：前年の間
に、24時間内に咳で250mlを超える血液を吐くこと；お
よびｆ）研究者の見解により、合併症の危険が上昇する
と思われる任意のの医学的状態または検査上の異常値、
が含まれる。
（２）活性なアデノウイルス感染の証拠。患者は、活性
なアデノウイルス感染の証拠に関して注意深く評価され
る。病歴および身体的検査を用いて、鼻カタル、咽頭
炎、扁桃炎、気管支炎、肺炎、結膜炎、または下痢のよ
うなアデノウイルス症候群に関する臨床的証拠を同定す
る。培養技術、ならびに標本に直接実施される免疫蛍光
測定法および固相酵素免疫測定法を用いて、アデノウイ
ルスに関して種々の標本を評価する。治療時における活
性なアデノウイルス感染の証拠は、排除の基礎である。
別の関連する疑問は、遺伝子治療レシピエントのAd5に
対する既往の暴露、およびアデノウイルス特異性中和抗
体に基づく類似の血清型に関する。実質的に全ての成人
患者は、Ad5に対する体液性免疫を与えるアデノウイル
スに暴露されていると予測される。この予測は、より低
い番号付けのアデノウイルスAd1、Ad2、Ad5、およびAd6
が、大部分の国で風土病であることを示す多数の文献に
基づいている。米国では、アデノウイルス特異性中和抗
体は、３才までに80％の個体に存在すると推測されてい
る（Sterner、Acta Paediatr.Scand.Suppl.142−１（19
62）;Hallら、Am.J.Epichemiol.94:367（1971）;Foy
ら、「ヒトにおけるウイルス感染症」p.5310 Ed.Evans
AS Raven Press,NY（1975））。プロトコールに登録さ
れる患者は全て、種々の血清学的アッセイを用いてAd5
および関連する型に対する既往の暴露について評価す
る。本質的に全ての候補者が血清反応陽性であることが
予測される。事実、血清反応陽性でない任意の患者はプ
ロトコールから除外されている。ウイルスに対して存在
している体液性免疫は、組換え体ウイルスに暴露された
肺の局在化領域を超える組換え体ウイルスの伝播を予防
する安全な特徴と考えられる。
（３）薬物治療。試験開始２ヶ月以内に患者が全身性グ
ルココルチコイドを用いて処置されていた場合には、除
外する。
（４）プロトコールに応諾不能。研究者の見解により、
患者が、例えば薬物の濫用、アルコール中毒、精神的不
安定、不適切な動機付けのようなプロトコールに応諾し
難い特徴を有している場合は、除外する。
（５）他の試験への参加。先の90日以内に患者が別の研
究治療に参加していた場合は、除外する。
患者の評価 試験を通じて種々の時点で以下の評価を実
施する：（１）病歴および身体的検査。嚢胞性維症およ
び非関連性の疾患の両者の症状発現に、関係ある病歴を
記録する。全身状態、薬物使用、および薬物アレルギー
歴に関する充分な調査を得る。
（２）臨床検査の評価.a）血液：ヘモグロビン、ヘマト
クリット、白血球細胞計数、白血球細胞鑑別計数、血小
板計数、ウエスターグレン沈降速度、血清電解質（ナト
リウム、カリウム、塩化物、重炭酸塩）、BUN、クレア
チニン、グルコース、尿酸、総タンパク質、アルブミ
ン、カルシウム、リン酸塩、総ビリルビン、抱合ビリル
ビン、AST、ALT、アルカリ性ホソファターゼ、LDH;b）
尿分析：定性タンパク質、血液、グルコース、ケトン
類、pH、および顕微鏡検査。
（３）肺機能試験．試験は、米国胸部学会により定めら
れた基準（1987a、1987b）に適合すべきである:a）Crap
oらの正常予測値（1981）を用いた肺活量測定;b）絶対
肺容量（全肺受容量、胸郭ガス容量、残余量）；および
ｃ）拡散受容量、１回呼吸。
（４）動脈血ガス、およびパルス酸素測定法−室内空気
呼吸時． （５）心電図（12電極導子）． （６）背腹側および側方胸部Ｘ線撮影． （７）薄切断−胸部コンピュータ化断層撮影． （８）抗生物質感受性による痰の好気性細菌の培養． （９）Shwachman−Kulczyckiスコア計算 （10）男性の精子数．記録された結果で精子計数が先に
なされていない場合、予め示された結果と一致していな
かった場合、精液分析をミシガン大学センターの泌尿器
科で実施した。
（11）気管支内視鏡検査。手順に先立って６時間の間患
者を絶食させる。患者に0.2mgグリコピロレートおよび5
0mgメペリジンを、気管支内視鏡検査30分前に静注によ
り前投与した。心電図、脈拍数、およびパルス酸素測定
を継続的にモニターする。血圧を、自動非侵襲系により
５分毎にモニターする。粘性リドカイン２％（30ml）で
うがいをさせ、そして吐き出させる。リドカイン４％
を、ハンドヘルド噴霧器により背部咽頭および喉頭に噴
霧した。鼻孔閉塞またはポリープのない患者の鼻を通し
て気管支内視鏡を導入する。鼻孔アプローチが用い得な
い場合は、気管支内視鏡を経口より導入する。鼻孔経路
により気管支内視鏡検査を受ける患者においては、塩酸
オキシメタゾリン0.05％を局部的に一つの鼻通路の粘膜
に綿棒で塗布する。リドカインゼリー２％を同じ鼻通路
内に滴下注入する。カニューレにより補充酸素を６リッ
トル／分で口腔に投与する。患者が弛緩するが言葉の刺
激によってなお覚醒するまで、ミダゾラムを５分毎に15
秒間1mg単回量で静注投与する。このレベルの鎮静を維
持するために、別のミダゾラムを15分毎に1mg単回量で
投与する。フレキシブルファイバーオプティック気管支
内視鏡を鼻孔内に導入する。必要に応じて咽頭および気
道を麻酔するために、リドカイン２％を気管支内視鏡を
通して注入する。
（12）気管支肺胞洗浄．標準生理食塩水の50mlのアリコ
ートを、区域気管支に穏やかに押し込めた気管支内視鏡
を通して注入する。洗浄物を吸入トラップに吸引する。
３つのアリコートを投与および回収するまでこの手順を
繰り返す。
（13）粘膜上皮細胞ブラッシング．内部ブラシを有する
袖付きカテーテルを気管支に導入する（Kelson、Am.J.R
espir.Cell Mol.Bio.17:66−72（1992）。ブラシを上皮
粘膜に対して摩擦させ、そしてブラシを滅菌培地内で撹
拌することによって、粘着細胞を除去する。
（14）トランス気管支（transbronchial）生検。生検用
鉗子を気管支内に導入し、そしてＸ線透視（fluoroscop
ic）ガイダンスの下で６片の組織を採取した。
臨床プロトコール 以下は患者の評価をスクリーリング
するためのプロトコールである：スクリーニングの評価
は遺伝子治療の４週間以内に実施されなければならな
い。書面により通知された同意を、スクリーニング評価
の参加前に得るべきである。スクリーニング中に得られ
る情報は、病歴および身体的検査；臨床検査血液；男性
についての精子計数；肺機能試験；パルス酸素測定、お
よび動脈血ガス；心電図（12電極導子）;PAおよび側方
胸部Ｘ線撮影；薄切断CTスキャン；抗生物質感受性によ
る痰培養；およびShwachman−Kulczyckiスコア計算。
以下はトランスフェクション前の患者の処置に対する
プロトコールである：トランスフェクション２週間前に
始まり、患者は、呼吸器感染を減少するために、および
全体的な状態を最大にするため強化された処置プロトコ
ールを開始する。２週間の間、患者に、それに対し培養
生物が感受性である２種類の抗シュードモナス属抗性物
質を投与する。１日２回体位変換喀痰排出、および打診
を実施する。患者は、残りの慢性処置養生法を継続す
る。このフェーズは、入院患者もしくは外来患者のいず
れかに行われる。次の試験の間、患者は予め処方された
医療プログラムを継続する。これには、任意の経口用抗
生物質、膵臓酵素、テオフィリン、およびビタミン補充
物が含まれる。エアゾール化気管支拡張剤、および抗生
物質を継続する。
以下はトランスフェクションに対する肺区域を選択に
関するプロトコールである：胸部Ｘ線撮影、および薄切
断CTスキャンを用い、ａ）その患者にとって平均的な疾
患影響の程度を有し；およびｂ）気管支内視鏡検査で患
者が位置決めされ得、その結果区域気管支が重力に依存
するような位置に存在する、解剖学的肺区域を選択す
る。
以下はトランスフェクションの手順である：患者を上
に示したような気管支内視鏡検査に対して準備する。気
管支内視鏡を挿入し、そしてトランスフェクション用に
選択された区域の管腔に進める。区域気管支内に存在す
る分泌物を気管支内視鏡を通じて吸引する。トランスフ
ェクション用に選択された区域内、および反対の肺での
同位置に位置する区域気管支内においてトランス上皮電
位差（transepithelial electrical potential differe
nce）を測定する。バルーンカテーテルを気管支内視鏡
チャンネルを通して導入し、そしてトランスフェクトす
る肺区域の孔の中に１センチメートル進める。孔が最小
限に閉塞されるまで、直視下でバルーンを膨張させる。
標準生理食塩水中、37℃で、濃度１×1010pfu/ml濃度の
ウイルス50mlをバルーンカテーテルを通じて滴下注入す
る。バルーンを膨張させたカテーテルを30分間その場合
に固定し、その後残余液を残らず吸引する。バルーンを
しぼませて、そしてカテーテルおよび気管支内視鏡を取
り出す。
単回用量のウイルス、全容積50ml中に１×1010pfu/ml
を使用する。この特定の用量は、ヒトCF異種移植片での
経験に基づいて選択された。Englehardtら、Nature Gen
etics 4:27−34（1993）。約１×1010pfu/ml用量より上
に増加するウイルスの濃度は、遺伝子導入の効率を感知
し得る程度増加させないことが見出されている。遺伝子
導入の効率が有意でないというかなり現実的な可能性の
ため、より低い濃度はこのプロトコールでは使用されな
い。
以下は、気管支内視鏡モニタリング後のプロトコール
である：血圧、脈、体温、および呼吸速度を含む生命徴
候を測定し、そして最初の１時間は５分毎に、次の２時
間は15分毎に、次の６時間は１時間毎に、そして次の15
時間は２時間毎に、そしてトランスフェクション後の１
週間の残りについては４時間毎に測定した。連続的心電
図およびパルス酸素測定法を、最初の24時間測定する。
上に掲載された臨床検査血液試験、パルス酸素測定、な
らびにPAおよび側法胸部Ｘ線撮影を第１週には毎日、第
２週には１週間に２回、そしてその後６週間は週に１回
実施される。薄切断CTスキャンを、追跡気管支内視鏡検
査の前日に実施する。
ウイルスの投与後、患者を、充分に呼吸に注意して隔
離室に収容する。隔離室は陰圧の部屋で、ここでは空気
は濾過され、そして外に放出される。入室する者は外
套、マスク、保護眼鏡、および手袋を着用する。患者は
治療開始後少なくとも10日間隔離される。病院内にいる
間、患者は、彼または彼女の痰、鼻綿棒、尿、および糞
便を、標準アデノウイルスアッセイを用いて、任意の血
清型の複製コンピテントアデノウイルスについて分析さ
れた。これらの試料はまた、当該分野で公知のPCRアッ
セイを用いてCFTR組換え体ウイルスについて評価され
た。患者が気道内に組換え体CFTRアデノウイルスを流出
し続けるような不慮の事態においては、彼または彼女を
より長期間入院させた。
以下は、感染後気管支検査のスケジュールである;4日
目（０日目にトランスファクション）;42日目；および9
0日目。
以下の試料および測定値は、トランスフェクション後
の気管支内視鏡検査の間に得られる:a）トランスフェク
トされた区域内および反対の肺の鏡像画像の区域気管支
内での４ヶ所におけるトランス上皮電位差;b）トランス
フェクトされた区域、および反対の肺のその鏡像画像の
気管支の肺胞洗浄液;c）トランスフェクトされた区域か
らの肺胞表面の６つの細胞学的ブラッシング；および
ｄ）トランスフェクトされた区域からの６つのトランス
気管支生検。
治療の評価 毒性、CFTRタンパク質またはアデノウイル
スタンパク質に対する免疫応答、ならびに遺伝子導入の
効率および安定性について、患者を注意深くモニターす
る。以下のプロトコールに従う：（１）毒性.PFT、血液
化学、血液学、およびアデノウイルスの培養を含む一連
の検査を実施した。野生型、および組換え体ウイルスに
ついて、各追跡気管支内視鏡検査の間に得られた気管支
肺胞洗浄液を注意深く分析する。
（２）免疫学的応答．このプロトコールの主要な局面
は、患者の血清学的応答を評価することである。野生型
CFTR、およびアデノウイルスタンパク質に対する血清学
的応答について、患者の血清、および気管支肺胞洗浄液
を評価する。（３）遺伝子導入の効率および安定性．遺
伝子導入後実施された気管支内視鏡検査により、遺伝子
導入、およびCFTR発現について評価する機会が提供され
る。トランスフェクトされた区域内の４つの部位で、ト
ランス上皮電位差を実施する。表面気道上皮細胞をブラ
ッシングによって回収し、そして培養中にプレート化し
た。これらの細胞を、免疫細胞化学を用いてCFTRタンパ
ク質およびアデノウイルスタンパク質発現について分析
する。記載した機能的アッセイを用いて、培養細胞にお
ける機能矯正を評価する。気道、および気室組織（airs
pace tissue）含むトランス気管支生検材料を、免疫細
胞化学およびインサイチュハイブリダイゼーションによ
りCFTR発現について分析する。
具体的実施例５−変異および選択のスキーム 公表されている温度感受性（ts）変異体の利用に加え
て、アデノウイルス遺伝子E2、E4、L1、L2、L3、L4、お
よびL5内にts変異を保持する、新規の組換え体ベクター
を作成する。先に記載されたように、新規のts変異体ア
デノウイルスストック（潜在的に、Ad2〜Ad41を含む全
てのアデノウイルス血清型に適用する）を単離する。En
singerら、J.Virol.10:328−339（1972）参照。野生型
アデノウイルスDNAおよび／またはウイルスのストック
を３つの異なる方法で変異誘発させる:1）亜硝酸、２）
ヒドロキシルアミン、および３）ニトロソグアニジン。
293細胞を、変異DNAまたはウイルスでトランスフェクト
または感染させる。変異誘発させたストックが、32℃で
寒天重層によりプラークを形成するプラーク拡張技術
（plaque enlargement technique）によって、温度感受
性変異ストックを単離する。感染後14日目のプラーク
は、32℃（許容温度）でNeutral Redで24〜48時間で染
色され、プラークの輪郭が描かれる。次にプラークを3
9.5℃（非許容温度）に48時間移し、そして拡張しない
プラークのみを、HeLa細胞上で完全な温度感受性のCPE
を生じるそれらの能力についてのスクリーニングのため
に釣り上げる。このように誘導されたts変異は、既知の
変異を保持するウイルス株の機能的相補性によって分類
される。潜在的に有用なts変異が同定されると、組換え
体ベクターへの相同的組換えによりそれらはクローン化
され（上述の通り）、新たなts組換え体アデノウイルス
のストックが与えられる。さらに、多数のts変異を有す
る組換え体アデノウイルスを作成し得る。
当業者は、今や、先行する記載により、本発明の広い
教示が種々の形態において実行され得ることを認識し得
る。従って、本発明は、その詳細な実施例に関連して記
載されているが、明細書および次の請求の範囲の調査に
基づいて、他の変更も当業者にとって明らかになること
から、本発明の真の範囲は制限されるものではない。
本明細書中に引用される全ての出版物および出願は、
参考として援用されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 エンゲルハルト，ジョン アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19083，ハーバータウン，ローソン ア ベニュー 805 (56)参考文献 Ｃｅｌｌ，68（１）（1992），ｐ. 143−155 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６ （７）（1988），ｐ．616−629 Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．，15（２) （1975），ｐ．348−354 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】温度感受性変異を有するE2領域を含み、か
    つE1領域の欠失を含む、アデノウイルスベクター。
  2. 【請求項２】前記温度感受性変異を有するE2領域がE2a
    領域である、請求項１に記載のベクター。
  3. 【請求項３】前記変異がts125である、請求項１に記載
    のベクター。
  4. 【請求項４】作動可能に連結された導入遺伝子をさらに
    含む、請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
  5. 【請求項５】前記導入遺伝子が、嚢包性線維症トランス
    メンブレン調節因子の遺伝子を含む、請求項４に記載の
    ベクター。
  6. 【請求項６】標的細胞中の遺伝子内の欠損の治療に用い
    るための組成物であって、作動可能に連結された導入遺
    伝子を有するアデノウイルスベクターの有効量を含有
    し、該アデノウイルスベクターが、温度感受性変異を有
    するE2領域を含み、かつE1領域の欠失を含む、組成物。
  7. 【請求項７】前記E2領域がE2a領域である、請求項６に
    記載の組成物。
  8. 【請求項８】前記変異がts125である、請求項６に記載
    の組成物。
  9. 【請求項９】前記導入遺伝子が、嚢包性線維症トランス
    メンブレン調節因子の遺伝子を含む、請求項６〜８のい
    ずれかに記載の組成物。
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