JP2011521663A - 高容量アデノウイルスをパッケージングするための系 - Google Patents

高容量アデノウイルスをパッケージングするための系 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヘルパーウイルスの使用を必要とせず、宿主細胞のゲノム内に、ウイルス粒子の制御、複製およびパッケージングに必要なアデノウイルス遺伝子を組み込むことを特徴とする高容量アデノウイルスベクターの新規な生産およびパッケージング（キャプシド封入）系に関し、これにより長期間生産系の安定性が改良される。

Description

発明の詳細な説明
発明の属する技術分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野、より具体的には、標的細胞における異種遺伝子の発現のためのベクターの分野に関する。特に、本発明は、遺伝子導入に有用な高容量アデノウイルスベクターの生産およびパッケージングのための系に関する。
背景
高容量アデノウイルス（ＨＣ）は、ガットレスアデノウイルスまたはヘルパー依存性アデノウイルスとしても知られ、齧歯類および霊長類の双方において、極めて低い関連免疫原性を示し、高い形質導入効率と広い向性を有することから、in vivoにおける遺伝子療法のためのベクターとして非常に魅力的である。これらのベクターは、それらの複製およびパッケージングのために必要なＤＮＡ配列のみを含んでおり、他のアデノウイルスの遺伝子を欠いているため、結果として最大３６ｋｂまでの配列を収容することができるという特徴を持つ。ウイルスＤＮＡの複製およびウイルス粒子内へのそのパッケージングのために、これらのベクターにシスで必要なアデノウイルス配列は、線状ＤＮＡの両端に位置するＩＴＲ配列（逆方向末端反復配列）、およびパッケージングシグナル（Ψ）のみである(Grable and Hearing, 1992, J. Virol, 66: 723-731; Hearing and Shenk, 1983, Cell, 33: 695-703）。
高容量アデノウイルスは総てのウイルスコード領域を欠いているため、ヘルパーまたは補助ウイルスと呼ばれる第２のウイルス、すなわち、欠陥ウイルスの複製および感染力を有するウイルス粒子へのその封入に必要な総てのタンパク質をコードし得るウイルスとともに細胞を重感染させた場合にのみ、それらの増殖が可能である。高容量アデノウイルスベクターを生産する場合、ヘルパーウイルスはＥ１アデノウイルス領域において欠失があり、また、ガットレスウイルスの後代の複製およびアセンブリに必要なウイルスタンパク質の全レパートリーをトランスで提供することを特徴とする。後者の増殖には、ヘルパーウイルスの前記Ｅ１領域の欠失を補足し得る細胞系統、例えば２９３系統(Graham, et al., 1977, J. Gene. Virol, 36: 59-74)、またはＰｅｒＣ６系統(Fallaux et al., 1998, Hum. Gene Ther., 9: 1909-1917)の使用が必要である。
しかしながら、この増殖系もまた、ヘルパーウイルスのゲノムをキャプシド封入し、高容量アデノウイルスの最終調製物を汚染する、望ましくないウイルス粒子の生成につながる。これまで、ヘルパーウイルスのパッケージングプロセスを阻止している前記の混入を排除しようとする様々な系が開発および記載されてきた。一般に、これらの系は、ヘルパーウイルスのパッケージングシグナル、そのゲノムサイズの増加、および、より詳しくは、ウイルス生産プロセス中のパッケージングシグナルの特異的排除における突然変異の組み込みに基づいている。
Parksら(1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 13565-13570)は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系によるヘルパーウイルスのΨパッケージングシグナルの排除を記載している。この系では、ΨシグナルはｌｏｘＰ部位により隣接され、ウイルスの増殖は、Ｃｒｅレコンビナーゼを発現する２９３細胞（２９３Ｃｒｅ細胞）内で行われる。ヘルパーウイルスが細胞に入ると、レコンビナーゼはΨシグナルを切り出し、パッケージングできないようにするが、その複製能は維持し、その結果、高容量アデノウイルスのパッケージングに必要なコード配列の発現が維持される。
Grothら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 5995-6000)は、特異的に認識されるａｔｔＢ／ａｔｔＰ部位がΨシグナルを隣接して配置されている、一方向性レコンビナーゼ、特に、ΦＣ３１レコンビナーゼの使用を提案している。ＰｈｉＣ３１レコンビナーゼが、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ部位に隣接された配列を切り出すと、それは認識配列を改変し、それらをａｔｔＲ／ａｔｔＬ配列へ変換して、認識が再度起こるのを防ぎ、その結果、Ψシグナルの再導入を防ぐ。
Ngら(2001, Mol. Ther., 3: 809-815)は、高容量アデノウイルスの増殖が酵母ＦＬＰレコンビナーゼ（２９３ＦＬＰおよび２９３ＣｒｅＦＬＰ系統）を発現し得る２９３細胞中で行われ、ヘルパーウイルスのΨシグナルが、該ＦＬＰレコンビナーゼにより特異的に認識されるｆｒｔ部位により隣接されている、別の組換え系ＦＬＰ／ｆｒｔを提案している。ガットレスウイルスの増幅効率（実行３回で１０８ｂｆｕ／ｍｌ）、ならびにヘルパーウイルスの混入レベル（ＣｓＣｌ勾配で精製後０．５％）は、従前のＣｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて生産されたものと極めて類似していた。
これらの系の改良を試みるために、PalmerおよびNg (2003, Mol. Ther., 8: 846 852)は、ヘルパーウイルスのパッケージングシグナルの反転を包含した、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系に由来する系を開発した。
一方、Sargentら(2004, Gene Ther., 11: 504-511)は、３５ｋｂより大きく、ＩＸタンパク質の遺伝子が欠失しているヘルパーウイルス、ならびに前記欠失を補足し得る２９３細胞系統が用いられる、サイズに基づく制限系を提案している。
しかしながら、これらの改良にもかかわらず、これまで、これらの系に、生産工程に含まれる２つのウイルスの配列間の組換えを回避し、その結果、サンプルへの複製能を有するアデノウイルスの混入を回避できるようになったものはない。Albaらは最近の総説(2005, Gene Ther, 12 Suppl 1: S18-27)で、混入レベルは、使用する系に応じて、生産された高容量アデノウイルスのウイルス粒子の数に対して０．０２％〜１％の間で変動し得ると述べている。これらの混入レベルは、遺伝子療法の臨床診断法に用いるには高すぎると考えられる。
さらに、高容量アデノウイルスを使用するためのもう１つの重要な限定要因は、それらの大規模生産が困難であることに関連している。現在、このタイプの生産法は複雑であり、効率が低く、ウイルスヘルパーを用いる重感染を何回も繰り返す必要がある。
これを行うためには、手順を改良すると同時に、臨床使用に必要とされる量とともに質（ウイルス粒子の混入のない）で高容量アデノウイルスベクターを生産するための代替系の開発が必要である。
この問題の理想的な解決方法は、高容量アデノウイルスベクターの大規模生産のための特定の細胞系統の開発であろう。しかしながら、ヘルパーウイルスの関与に依存しない生産系には、アデノウイルス遺伝子の高い発現レベルから生じる細胞傷害性の問題があり、このことは、今まで、このタイプの生産系の開発を大いに制限してきた。これに対し、本発明者らは、感染の後期においてウイルス粒子の大量生産を可能にする構造タンパク質の発現を伴うＤＮＡの複製の調整に必要な一連の事象を正確に再現することは、極めて難しいという事実を付け加えなければならない(Farley, et al., 2004, J. Virol, 78: 1782-1791)。
ＷＯ００７２８８７では、（ｉ）Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４領域ならびにｐＴＰおよびＤＢＰ遺伝子を欠失させたアデノウイルスゲノムとともに、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製エレメントに基づく、安定型の環状エピソームを少ないコピー数で含む、パッケージング細胞系統、および（ｉｉ）アデノウイルスゲノムの複製およびパッケージングに必要なエレメントを含み、エピソーム（Ｅ４領域、ｐＴＰ遺伝子およびＤＢＰ）ならびに異種遺伝子が存在しないベクター、から形成される２成分系に基づく、ヘルパーアデノウイルスには依存しない高容量アデノウイルスの生産系を開示している。この系においては、（ｉ）パッケージングシグナルを欠いており、かつ（ｉｉ）そのサイズがアデノウイルスのパッケージング容量を超えているために、エピソームはビリオン中にパッケージングされない。
他方、ＷＯ００４２２０８では、（ｉ）Ｅ１、Ｅ３領域、およびビリオンのアセンブリ工程に関与する繊維タンパク質をコードする遺伝子（Ｌ５）を欠失させたアデノウイルスベクター、ならびに（ｉｉ）前記ベクターの複製およびパッケージングを補足し得る特定の細胞系統を含んでなる、ヘルパーウイルスに依存しないアデノウイルス生産系が開示されている。ウイルス粒子の複製およびパッケージングの工程に必要な総ての遺伝子は、アデノウイルスベクターの配列の中に含められている。
最後に、Catalucci et al. (2005, J. Virol, 79: 6400-6409)により最近記載された系は、エプスタイン−バーウイルスの複製起点からなるエピソームプラスミドの使用が、核抗原ＥＢＮＡ１（２９３ＥＢＮＡ）を安定して発現するよう改変された２９３細胞系統の核内におけるその維持を可能にすることを示唆している。このエピソームは、血清型５アデノウイルスのＩＴＲ配列、アデノウイルスゲノムの、初期領域（Ｅ２）およびＥ４領域に含まれるＯＲＦ６の遺伝子を含む。これらのアデノウイルス遺伝子の転写は、誘導プロモーターの制御下にあるが、キャプシドの形成に必要な他の遺伝子は、高容量アデノウイルスの配列の中に含まれている。
一般に、これらのヘルパー非依存性アデノウイルスベクター生産系は総て、これらのアデノウイルスベクター総てがベクターの複製またはパッケージングの工程に必要な１以上のアデノウイルスの遺伝子を含むので、ベクターに挿入することができるＤＮＡ配列のサイズにより制限される。さらに、これらのアデノウイルス遺伝子の存在は、臨床応用する場合に、免疫原性作用があり得るというリスクを伴う。
従って、このことは、補助アデノウイルスベクターの使用を必要とせず、またこれまでに知られている補助ベクターの欠点を克服する、高容量アデノウイルス生産系を得る技術の必要性を証明する。
発明の概要
第１の態様において、本発明は、
（ａ）転写レギュレーターをコードするヌクレオチド配列を含んでなる第１の発現カセット；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、（ａ）で定義されたポリヌクレオチドによりコードされる転写レギュレーターにより活性化可能な転写調節配列の機能的制御下にある、第２の発現カセット
を含んでなる、ポリヌクレオチド（本発明の第１のポリヌクレオチド）または発現ベクターに関する。
第２の態様において、本発明は、
（ａ）転写レギュレーターをコードするヌクレオチド配列を含んでなる第１の発現カセット；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、転写レギュレーター（ａ）により活性化可能な転写調節配列の機能的制御下にある、第２の発現カセット、および
（ｃ）選択されたアデノウイルスＥ１Ａタンパク質、またはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、転写レギュレーター（ａ）により活性化可能な転写調節配列の機能的制御下にある、第３の発現カセット
を含んでなる、ポリヌクレオチド（本発明の第２のポリヌクレオチド）または発現ベクターに関する。
別の態様において、本発明は、少なくとも、Ψパッケージング配列とＥ１ＡまたはＥ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質をコードする配列を欠いている組換えアデノウイルスのゲノムを含んでなるヌクレオチド配列を含んでなり、組換えアデノウイルスゲノムを含んでなる該配列が、制限エンドヌクレアーゼに対する特異的認識配列により隣接されている、ポリヌクレオチド（本発明の第３のポリヌクレオチド）または発現ベクターに関する。
別の態様において、本発明は、本発明の１つまたはいくつかのポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
別の態様において、本発明は、
（ｉ）細胞を、本発明の第１のポリヌクレオチドもしくは該ポリヌクレオチドを含んでなるベクターで、または本発明の第２のポリヌクレオチドもしくは該ポリヌクレオチドを含んでなるベクターでトランスフェクトすること、および
（ｉｉ）該細胞を、本発明の第３のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含んでなるベクターでトランスフェクトすること
を含んでなり、工程（ｉ）および（ｉｉ）は任意の順序でまたは同時に行うことができ、かつ、工程（ｉ）において細胞が本発明の第１のポリヌクレオチドでトランスフェクトされる場合には、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列を含んでなる細胞が用いられる、高容量アデノウイルスの感染性粒子の生産およびパッケージングに好適な細胞の生産方法に関する。
別の態様において、本発明は、本発明による方法によって生産することができる細胞に関する。
別の態様において、本発明は、
（ａ）本発明による細胞、および
（ｂ）高容量アデノウイルス
を含んでなる高容量アデノウイルスの生産のための系に関する。
別の態様において、本発明は、
（ａ）宿主細胞を、生産したい高容量アデノウイルスのゲノムを含んでなるポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでトランスフェクトするか、または感染させる工程、
（ｂ）該トランスフェクト／感染細胞を高容量アデノウイルスの複製およびパッケージングを可能とする条件下で培養する工程、
（ｃ）高容量アデノウイルスのウイルス粒子を回収する工程、および場合により、
（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程（工程（ｃ）で生産された高容量ウイルス粒子を次のサイクルの工程（ａ）で用いる）
を含んでなり、
工程（ａ）で用いられる宿主細胞が、
（ｉ）本発明の第１のポリヌクレオチドと、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列とを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、第３のポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクション工程が行われる）、
（ｉｉ）本発明の第２のポリヌクレオチドを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、本発明の第３のポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクション工程が行われる）、
（ｉｉｉ）本発明の第３のポリヌクレオチドを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、第１のポリヌクレオチドでのトランスフェクション工程が行われ、該細胞はアデノウイルスＥ１Ａタンパク質および場合によりアデノウイルスのＥ１Ｂタンパク質をコードする配列を含んでなる）、
（ｉｖ）本発明の第３のポリヌクレオチドを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、本発明の第２のポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクション工程が行われる）、
（ｖ）本発明の第１のポリヌクレオチド、本発明の第３のポリヌクレオチド、ならびにアデノウイルスＥ１Ａタンパク質および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列を含んでなる細胞、および
（ｖｉ）本発明の第２のポリヌクレオチドおよび本発明の第３のポリヌクレオチドを含んでなる細胞
からなる群から選択される、高容量アデノウイルスベクターの生産方法に関する。
発明の詳細な説明
本発明者らは、ヘルパーウイルスの使用を必要とせず、また宿主細胞のゲノム内にウイルス粒子の制御、複製およびパッケージングに必要なアデノウイルス遺伝子を組み込むことを特徴とし、この生産系の安定性を長期にわたって向上させる、高容量アデノウイルスベクターのための、新規の生産およびパッケージング系（キャプシド封入）を設計した。同様に、用いられる高容量アデノウイルスベクターは、該ベクターのクローニング能力が他のヘルパー非依存系または他の補助ベクターにおいて示されている能力を上回るように、ビリオンの複製およびパッケージングに必要な配列（ＩＴＲ配列およびΨシグナル）のみを含む。最後に、高容量ベクターにこれらのアデノウイルス遺伝子が存在しないことで、その臨床適用の際にベクターに対する免疫応答のリスクが排除される。
本発明の第１のポリヌクレオチド（Ａ１ポリヌクレオチド）
第１の態様において、本発明は、
（ａ）転写レギュレーターをコードするヌクレオチド配列を含んでなる第１の発現カセット；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、（ａ）で定義されるポリヌクレオチドによりコードされる転写レギュレーターにより活性化可能な転写調節配列の機能的制御下にある、第２の発現カセット
を含んでなる、ポリヌクレオチド（以下、本発明のＡ１ポリヌクレオチド）または発現ベクターに関する。
本発明において「転写レギュレーター」または「トランスアクチベーター」は、該遺伝子の非コード領域内の該タンパク質に特異的な認識領域へのその結合により、決定された遺伝子の転写を活性化し得るタンパク質として等しく理解される。特定の実施形態では、該トランスアクチベーターまたは転写レギュレーターは、調節可能な転写レギュレーターである。本発明において「調節可能な転写レギュレーター」とは、該レギュレーターに特異的な結合部位を含んでなる遺伝子に応じて供給または除去することができる付加的因子によりその活性が調整され得る転写レギュレーターとして理解される。当業者ならば、調節された基底転写を最小限にして、調節された発現を可能にする限り、本発明が転写レギュレーターの発現を調節するためのいずれの方法をも含むことが分かるであろう。従って、誘導剤に応答し、誘導剤の不在下では基底発現を全く示さないか、または示してもごくわずかであり、かつ、３’位にある遺伝子の活性化を促進することができる誘導プロモーターにより転写アクチベーターを調節することができる。誘導剤の種類によって、誘導プロモーターはＴｅｔオン／オフプロモーター(Gossen and Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551; Gossen et al., 1995, Science 268:1766-1769; Rossi and Blau, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456)；Ｐｉｐオン／オフプロモーター（米国特許第６，２８７，８１３号）；抗プロゲスチン依存性プロモーター（ＵＳ２００４１３２０８６）、エクジソン依存性プロモーター（Christopherson et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6314-6318; No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351, Suhr et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:7999-8004およびＷＯ９７３８１１７）、メタロチオネイン依存性プロモーター（ＷＯ８６０４９２０）およびラパマイシン依存性プロモーター(Riv
era et al., 1996, Nat. Med. 2:1028-32)に分類される。
あるいは、本発明は、発現レベルの増大によってではなく、通常、レギュレーターの細胞質から核への移行により始められる転写活性の増大を引き起こす誘導剤によってその誘導が起こる転写レギュレーターの使用を包含する。この種の転写レギュレーターは通常、ＤＮＡ結合ドメインすなわちＤＢＤ、リガンド結合ドメインすなわちＬＢＤ、および活性化ドメインすなわちＡＤにより形成される。
ＤＮＡ結合ドメインは、合成、キメラまたは類似体ＤＮＡ結合ドメインを含む、既知の特異的結合エレメントが存在するいずれのドメインでもよい。本発明に好適なＤＮＡ結合ドメインとしては、（ｉ）一般に、３本のαヘリックスからなる二次構造を有するおよそ６１個のアミノ酸の鎖により形成されるホメオドメイン(Scott et al., 1989, Biochim. Biophys. Acta 989:25-48; Rosenfeld et al., 1991, Genes Dev. 5:897-907)、（ｉｉ）直列に組織された、一般式Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２のＤＮＡの２〜３ダースのジンクフィンガーにより形成されるジンクフィンガー（例えば、ＴＦＩＩＩＡ、Ｚｉｆ２６８、ＧｌｉおよびＳＲＥ−ＺＢＰ）（ここで、各モジュールは３〜５塩基対のＤＮＡ領域と接触できるαヘリックス、高親和性ＤＮＡ結合部位を生じるのに必要な少なくとも３つのジンクフィンガー、および低親和性ＤＮＡ結合部位を生じるための少なくとも２つのジンクフィンガーを含んでなる）、（ｉｉｉ）ヘリックス−ターン−ヘリックスすなわちＨＬＨと呼ばれるＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＭＡＴ１、ＭＡＴ２、ＭＡＴａ１、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ、Ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘ、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ、Ｐａｉｒｅｄ、Ｆｕｓｈｉ ｔａｒａｚｕ、ＨＯＸ、Ｕｎｃ８６、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ２およびＰｉｔ−１、（ｉｖ）ロイシンジッパー型のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＧＣＮ４、Ｃ／ＥＢＰ、ｃ−Ｆｏｓ／ｃ−ＪｕｎおよびＪｕｎＢが挙げられる。本発明において好適なＤＮＡ結合ドメインの例としては、ＤＮＡ結合ドメインＧＡＬ４、ＬｅｘＡ、転写因子、グループＨ核受容体、ステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリーの核受容体が挙げられる。当業者ならば、いくつかのＤＮＡ結合モチーフにより形成されたハイブリッドＤＮＡ結合ドメインを用いれば、それらを含んでなるエレメントのもの以外のＤＮＡ結合部位を認識し得ることが分かるであろう。従って、ジンクフィンガーおよびホメオボックスの結合により形成されたＤＮＡ結合ドメインを使用することが可能である。好ましい実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、サッカロミセス・セレビシエのＧＡＬ４タンパク質のものである。
本発明で用いるのに好適な、それらを含む転写アクチベーターの核局在を促進し得るリガンド結合配列としては、１５−デスオキシ−［デルタ］−プロスタグランジンＪ２の存在下で核に移行するＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）、９−シス−レチノイン酸のα、βまたはγ異性体の存在下で核へ移行するレチノイン酸受容体、レチノイン酸およびＴＴＮＰＢにより活性化可能なファルネソイドＸ受容体、２４−ヒドロキシコレステロールにより活性化可能な肝臓Ｘ受容体、安息香酸４−アミノブチルにより活性化可能な安息好酸Ｘ受容体、構成的アンドロスタン受容体、プレグノロン−１６カルボニトリルにより誘導可能なプレグナン受容体、リファンピシンにより誘導可能なステロイドおよび生体異物受容体、メドロキシプロゲステロンならびにミフェリプリストンアゴニストおよびアンタゴニストおよび１９−ノルエチステロン誘導体により誘導可能なプロゲステロン受容体、グルココルチコイドにより活性化可能なグルココルチコイド受容体、Ｔ３および／またはＴ４により活性化可能な甲状腺ホルモン受容体、エストロゲンおよびそれらの誘導体（１７β−エストラジオールおよびエストラジオールなど）により活性化可能なエストロゲン受容体、「ｔｅｔ−ｏｆｆ」テトラサイクリン／ドキシサイクリンにより誘導可能なｔＴＡトランスアクチベーター（Gossen and Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551)、「ｔｅｔ−ｏｎ」テトラサイクリンにより誘導可能なｒｔＴＡトランスアクチベーター(Gossen et al., 1995, Science, 268: 1766-1769)、ムリステロンＡまたはエクジソン受容体の類似体リガンドにより誘導可能なトランスアクチベーター(No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351)、ＲＳＬ１リガンドにより誘導可能なトランスアクチベーター、例えば、Palli et al. (2003, Eur. J. Biochem., 270: 1308-1315)により最初に記載されたＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ系、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体により誘導可能なトランスアクチベーター(Ho et al., 1996, Nature, 382: 822-826; Amara et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 10618-10623)、ならびにそれぞれインデューサーおよびレプレッサーとして競合的に働くクーママイシン／ノボビオシンにより誘導可能なトランスアクチベーター(Zhao et al., 2003, Hum. Gene Ther., 14: 1619-1629)由来の局在配列が挙げられる。好ましい実施形態では、該ＬＢＤは、ＲＵ４８６またはミフェプリストンなどのプロゲステロンの誘導体を含む合成抗プロゲスチンで活性化され得るが、Wang et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994, 91: 8180-4)により記載されているように患者においては効果を示さない、ヒトプロゲステロン受容体のリガンド結合ドメインである。
最後に、該活性化ドメインは、グループＨ核受容体、甲状腺またはステロイドホルモンの核受容体の活性化ドメイン、ＶＰ１６、ＧＡＬ４、ＮＦ−ｋＢ、Ｂ４２、ＢＰ６４またはｐ６５の活性化ドメインであり得る。好ましい実施形態では、該活性化ドメインはヒトＮＦ−κＢタンパク質由来である。
好ましい実施形態では、該転写アクチベーターは、サッカロミセス・セレビシエのＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン(Laughon and Gesteland, 1984, Mol. Cell Biol, 4: 260-267; Marmorstein et al., 1992, Nature, 356: 408-414)、ヒトプロゲステロン受容体のリガンド結合ドメイン(Kastner et al., 1990, Embo J., 9: 1603-1614; Wang et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8180-8184)およびヒトＮＦ−κＢタンパク質の活性化ドメイン(Burcin et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 355-360; Deloukas and van Loon, 1993, Hum. Mol. Genet, 2: 1895-1900)を含んでなる、ＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５と呼ばれる融合タンパク質である。この転写レギュレーターは、ミフェプリストンまたはその類似体ＲＵ４８７により誘導可能である。ミフェプリストンの不在下で、該レギュレーター融合タンパク質はチミジンキナーゼの最小プロモーターから構成的に発現される。このタンパク質は主として核内に局在し、不活性である。インデューサーであるミフェプリストン、またはその類似体ＲＵ４８６を加えると、これはＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５のｈＰＲ−ＬＢＤ領域に高い親和性で結合し、コンフォメーション変化を引き起こし、結果としてタンパク質の二量体化およびその活性型への変換が起こる。これらのホモ二量体は、特異的部位（ＵＡＳ：上流活性化配列）に結合することができ、該活性化配列に対して３’の配向に局在する遺伝子の転写を引き起こし、従って、目的遺伝子および実際の転写因子をコードする遺伝子の転写を活性化する（図２Ｃ）。
当業者ならば、レギュレーターの核への移行またはそれらの活性型へのコンフォメーション変化を促進する外因性化合物の添加により活性が調節される、この種の転写レギュレーターは、それらの転写が特に微細な転写制御を受けることを必要としないことが分かるであろう。一般論として、トランスアクチベーターまたは転写レギュレーターをコードする配列は、その転写および発現を命令する好適なプロモーターに、また、ポリアデニル化シグナルにも関連している。この種のレギュレーターの転写は厳密に制御する必要がないために、それらは構成プロモーターの制御下に見られる。限定されないが、該最小プロモーターは、とりわけ、ＣＭＶもしくはＲＳＶなどの構成的ウイルスプロモーター、またはＰＧＫもしくはＥＦ１などの真核細胞構成プロモーターであり得る。あるいは、転写レギュレーターをコードする遺伝子のプロモーター領域に、その発現が正のフィードバックサイクルによりその発現の増大を引き起こすように、転写レギュレーターに対する応答エレメントを含めることが可能である。一実施形態において、該転写レギュレーターは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Ｐｔｋ）の最小プロモーターと結合している、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインに対する１つまたはいくつかの結合エレメント、好ましくは、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインに対する４つの結合エレメントにより形成される領域により調節される。
Ａ１ポリヌクレオチドの第２のエレメントは、本発明の第１のポリヌクレオチド内に存在する第１の発現カセットにコードされている転写レギュレーターの機能的制御下にある制限エンドヌクレアーゼをコードする発現カセットを含んでなる。該制限エンドヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ部位の認識および断裂により２本鎖ＤＮＡを切断する酵素である。本発明においてエンドヌクレアーゼとは、ヒト細胞のＤＮＡゲノムの特異的部位を認識せず、従って、該細胞の天然ゲノムにおいて断裂を引き起こすことはないエンドヌクレアーゼである。限定されないが、該制限エンドヌクレアーゼは、とりわけ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｍｏＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩであり得る。特定の実施形態では、Ａ１ポリヌクレオチドによりコードされる制限エンドヌクレアーゼは、サッカロミセス・セレビシエのＩ−ＳｃｅＩである。制限エンドヌクレアーゼのコード配列を含むポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの第１のエレメントによりコードされる転写レギュレーターに対する結合配列の機能的制御下にある。このようにして、プロモーターはエンドヌクレアーゼの転写および発現を活性化または抑制するトランスアクチベーターの結合に応答する。しかしながら、トランスアクチベーターのプロモーターと結合して相互作用する能力は、調節因子がリガンドまたは誘導剤に結合するかどうかによって変動する。結果として、誘導剤の利用可能性を制御することで、目的遺伝子の転写を調節することができる。誘導剤は遺伝子の転写および発現を活性化および促進することにより作用する場合もあれば、誘導剤の存在はその発現を抑制する場合もある。好ましい実施形態では、転写レギュレーターはＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５であり、制限エンドヌクレアーゼをコードするこのポリヌクレオチドは、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインに対する種々の数の結合配列に対して３’位にある。さらにより好ましい実施形態では、制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ＧＡＬ４転写因子の６つの結合配列およびＥ１ｂ（ＰＥ１ｂ）アデノウイルス遺伝子のＴＡＴＡボックスの配列(Lillie and Green, 1989, Nature, 338: 39-44)からなるレギュレーターエレメントに対して３’位にある。
Ａ１ポリヌクレオチドの特定の実施形態では、転写レギュレーターはＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５であり、制限エンドヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩである。
本発明の第２のポリヌクレオチド（Ａ２ポリヌクレオチド）
第２の態様において、本発明は、
（ａ）転写レギュレーターをコードするヌクレオチド配列を含んでなる第１の発現カセット；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、転写レギュレーター（ａ）により活性化可能な転写調節配列の機能的制御下にある、第２の発現カセット、および
（ｃ）選択されたアデノウイルスＥ１Ａタンパク質またはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、転写レギュレーター（ａ）により活性化可能な転写調節配列の機能的制御下にある、第３の発現カセット
を含んでなる、ポリヌクレオチド（以下、Ａ２ポリヌクレオチド）または発現ベクターに関する。
Ａ２ポリヌクレオチドのエレメント（ａ）および（ｂ）は、本発明の第１のポリヌクレオチドの一部を形成し、従前に記載されているものに本質的に相当する。
Ａ２ポリヌクレオチドの成分（ｃ）は、選択されたアデノウイルスＥ１Ａタンパク質またはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現カセットを含んでなる。遺伝子Ｅ１Ａおよび場合によりＥ１Ｂは、任意の種類のアデノウイルスまたはヒトアデノウイルス血清型（ヒトにおいて単離された）、例えば血清型２（Ａｄ２）、５（Ａｄ５）、１１（Ａｄ１１）または３（Ａｄ３）のゲノムに由来するものであり得る。特定の実施形態では、該成分はアデノウイルス血清型５のゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣ０００００８）の５０５番〜３５１１番の範囲の配列を含む。この配列は、転写レギュレーター（ａ）により活性化可能な転写レギュレーター配列の機能的制御下にある。このようにして、プロモーターは、転写の活性化または抑制、および構造遺伝子Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの発現を行うトランスアクチベーターの結合に応答する。しかしながら、トランスアクチベーターのプロモーターと結合して相互作用する能力は、調節因子がリガンドまたは誘導剤に結合するかどうかによって変動する。結果として、誘導剤の利用可能性を制御することで、Ｅ１Ａおよび場合によりＥ１Ｂ遺伝子の転写を調節することができる。好ましい実施形態では、本発明のＡ２ポリヌクレオチドの成分（ｃ）は、ＧＡＬ４転写因子の６つの結合配列およびＥ１ｂ（ＰＥ１ｂ）アデノウイルス遺伝子のＴＡＴＡボックス配列(Lillie and Green, 1989, Nature, 338: 39-44)からなるハイブリッドプロモーターの制御下にある。
当業者ならば、転写アクチベーターに応答するＡ２ポリヌクレオチドでの遺伝子の配向はその機能のために重要ではないことが分かるであろう。従って、好ましい実施形態では、第２および第３のカセットは、反対方向に転写される。別の好ましい実施形態では、第２および第３のカセットを制御する転写調節配列は転写レギュレーター（ａ）と同じ結合部位を共有している。好ましい実施形態では、制限エンドヌクレアーゼおよびアデノウイルスタンパク質をコードする遺伝子は、ＧＡＬ４転写因子に対する６つの結合配列およびＥ１ｂ（ＰＥ１ｂ）アデノウイルス遺伝子のＴＡＴＡボックス配列(Lillie and Green, 1989, Nature, 338: 39-44)からなる、同じハイブリッドプロモーターの制御下にある。さらにより好ましい実施形態では、本発明のＡ２ポリヌクレオチドの第２および第３のカセットは反対方向に転写され、ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインに対する結合配列を共有する。
Ａ２ポリヌクレオチドの特定の実施形態では、第１の発現カセット（ａ）は転写レギュレーターＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５をコードする配列を含んでなり、第２の発現カセット（ｂ）はＧＡＬ４タンパク質の１つまたはいくつかの結合部位の制御下にＩ−ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする配列を含んでなり、第３の発現カセット（ｃ）はＧＡＬ４タンパク質の１つまたはいくつかの結合部位の制御下にＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の配列を含んでなる。さらにより好ましい実施形態では、Ｉ−ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする配列ならびにＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の配列の発現を命令する調節可能なプロモーターは、ＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５と同じ応答エレメントを共有する。
本発明の第３のポリヌクレオチド（Ｂポリヌクレオチド）
別の態様において、本発明は、組換えアデノウイルスのゲノムを含んでなり、少なくともΨパッケージング配列およびＥ１Ａタンパク質またはＥ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質をコードする配列を欠いているヌクレオチド配列を含んでなり、組換えアデノウイルスのゲノムを含んでなる該配列が、制限エンドヌクレアーゼに特異的な認識配列により隣接されている、ポリヌクレオチド（以下、Ｂポリヌクレオチド）または発現ベクターに関する。アデノウイルスゲノムの配列は、任意の種類のアデノウイルスまたはヒトアデノウイルス血清型（ヒトにおいて単離された）、例えば、血清型２（Ａｄ２）、５（Ａｄ５）、１１（Ａｄ１１）または３（Ａｄ３）のゲノムから作製することができる。
好ましくは、制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、両末端のＩＴＲ配列（ゲノムの複製および転写に好適な領域が見られる）に対して５’および３’の位置でアデノウイルスゲノムにより隣接されている。当業者ならば、このＢポリヌクレオチドに用いる制限標的は本発明のＡ１およびＡ２ポリヌクレオチドにコードされている制限エンドヌクレアーゼに依存することが分かるであろう。よって、アデノウイルスを隣接する標的配列は、Ａ１およびＡ２ポリヌクレオチドによりコードされているエンドヌクレアーゼを表す際に従前に示したものと同じ特徴および要件を有する制限エンドヌクレアーゼに対する特異的認識配列である。限定されないが、これらの配列は、とりわけ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＤｍｏＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩエンドヌクレアーゼによるそれらの認識に特異的なものであり得る。特定の実施形態では、それらはＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼによる認識に特異的なものである。
さらに、別の好ましい実施形態では、本発明によるＢポリヌクレオチドは、パッケージング細胞のゲノムへの該ポリヌクレオチドの挿入を助ける配列を含んでなる。さらにより好ましい実施形態では、ゲノムへの組込みに好都合な配列は、インテグラーゼに対する特異的認識配列である。好ましくは、インテグラーゼの標的配列は、エンドヌクレアーゼに対する第１の認識配列に対して５’位にある。
本発明の実施形態に好適なインテグラーゼの標的配列としては、限定されるものではないが、Ｐ１ファージのＣｒｅレコンビナーゼの標的配列（ＬｏｘＰ）、Ｓ．セレビシエのＦＬＰレコンビナーゼ（Ｆｒｔ）の標的配列、放線菌ΦＣ３１ファージのインテグラーゼの標的配列（ａｔｔＢ、ａｔｔＰ）、ＴＰ９０１−１レコンビナーゼの標的配列およびＲ４レコンビナーゼの標的配列またはλインテグラーゼの標的配列を含む。好ましい実施形態では、本発明の標的配列としては、２つの特異的部位またはＤＮＡ配列間の一方向組換えを媒介するファージのインテグラーゼに対する特異的配列を含む。より詳しくは、インテグラーゼはセリンインテグラーゼファミリーに属し、それらがＤＮＡ鎖の断裂に触媒的セリン残基を用いることを特徴とする(Thorpe and Smith, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5505-5510)。これらのインテグラーゼにより認識される組換え部位（ａｔｔＢおよびａｔｔＰ）は他のレコンビナーゼにより認識される組換え配列とは配列が異なり、それよりも短い。この種のインテグラーゼにより媒介される組込みは、組換え配列により厳格に制御される一方向プロセスである(Thorpe et al., 2000, Mol. Microbiol., 38: 232-241)。もう１つの重要な特徴は、宿主におけるａｔｔＰおよびａｔｔＢ間の組換えには補因子が働く必要がないということである。これらのインテグラーゼは現在、哺乳類細胞における遺伝子操作法に用いられており、外から導入されたａｔｔＰ部位または該ａｔｔＰ部位と部分的な同一性を有する天然配列（ｐｓｅｕｄｏ−ａｔｔＰ）への遺伝物質の効率的な組込みを媒介することが示されている。限定されないが、インテグラーゼの標的配列は、とりわけ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１−１またはＲ４インテグラーゼに対する特異的認識配列であり得る。特定の実施形態では、インテグラーゼの標的配列は、ＰｈｉＣ３１ファージのインテグラーゼに特異的な細菌ＤＮＡのアンカー部位に相当するａｔｔＢである。このインテグラーゼは、このａｔｔＢ配列とヒト細胞のゲノムに存在するｐｓｅｕｄｏ−ａｔｔＰ配列の間の一方向組換えを媒介し得る。
よって、別の好ましい実施形態では、Ｂポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、場合により、インテグラーゼ認識配列、第１のエンドヌクレアーゼ認識、アデノウイルスゲノム（その限界はアデノウイルスのＩＴＲにより定義される）および第２の制限エンドヌクレアーゼ配列を含む。
本発明のベクターおよび宿主細胞ならびにそれらを得るための方法
本発明のポリヌクレオチドは単離してもよいし、好適な宿主細胞において該ポリヌクレオチドの増幅を可能とするベクターの一部をなしてもよい。よって、別の態様において、本発明は、本発明のＡ１、Ａ２またはＢポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクターなどのベクターに関する。
本発明のポリヌクレオチドの挿入に好適なベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびそれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４などの原核生物における発現ベクター；ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのファージおよび「シャトル」ベクター；２ミクロン、組込みプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなどのプラスミド種ベクターなどの酵母における発現ベクター；ならびに同様にｐＡＣ系およびｐＶＬ系ベクターなどの昆虫細胞における発現ベクター；ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ系ベクターなどの植物における発現ベクター；ならびにウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルスならびにレトロウイルス、特に、レンチウイルス）ならびに非ウイルスベクター（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１−ＣＭＶ(Ambion)、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１ベクターなどの）に基づく真核細胞における同様の発現ベクターが挙げられる。該ポリヌクレオチドの挿入に特に適当なベクターは、宿主細胞で維持および／または複製および／または発現させることができる、ウイルスベクター（アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０およびαウイルスなど）に基づくか、または非ウイルスベクター（プラスミドなど）に基づく高等真核細胞における発現ベクターである。さらに詳しい実施形態では、該発現ベクターは、ex vivoで哺乳類細胞、特に、ヒト細胞をトランスフェクトまたは感染させるのに好適である。
一般に、真核生物発現ベクターは、例えば、５’および３’に位置する配列の転写制御下に１以上のクローニングされた遺伝子と選択マーカーを含む。限定されないが、これらの制御配列は、真核細胞で発現させることができるプロモーター（転写開始部位を含む）、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位および／またはポリアデニル化シグナルを含む。
好ましくは、これらのベクターは、それを発現する細胞に表現型を与え、ベクターと接触された後にそのベクターを組み込んだ細胞の識別および／または選択を助けるリポーターまたは選択遺伝子を含んでなる。選択の表現型はトランスフェクションまたは感染前にはその真核細胞で発現されないことが好ましい。本発明において有用なリポーター遺伝子としては、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ＧＦＰおよび同様のものが挙げられる。本発明において有用な選択遺伝子としては、例えば、Ｇ４１８アミノグルコシド耐性を与えるネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性を与えるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤（２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン：ＤＦＭＯ）耐性を与えるＯＤＣ遺伝子、メトトレキサート耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼ(dihiyrofolate reductase)遺伝子、ピューロマイシン耐性を与えるピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性を与えるｂｌｅ遺伝子、９−β−Ｄ−キシロフラノースアデニン耐性を与えるアデノシンデアミナーゼ遺伝子、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパルテートの存在下で細胞を増殖可能とするシトシンデアミナーゼ遺伝子、アミノプテリンの存在下で細胞を増殖可能とするチミジンキナーゼ遺伝子、キサンチンの存在下、かつ、グアニンの不在下で細胞を増殖可能とするキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、トリプトファンの代わりにインドールの存在下で細胞を増殖可能とする大腸菌(E. coli)のｔｒｐＢ遺伝子、ヒスチジンの代わりに細胞のヒスチジノール使用を可能とする大腸菌のｈｉｓＤ遺伝子が挙げられる。選択遺伝子は、真核細胞での該遺伝子の発現に好適なプロモーター（例えば、プロモーターＣＭＶまたはＳＶ４０）、翻訳の開始の最適化部位（例えば、いわゆるＫｏｚａｋ則またはＩＲＥＳ則に従う部位）、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０またはホスホグリセリン酸キナーゼのポリアデニル化部位など）、またはイントロン（例えば、β−グロブリン遺伝子のイントロンなど）をさらに含み得るプラスミドに組み込まれる。あるいは、同じベクター中で同時にリポーター遺伝子と選択遺伝子の組合せを使用することもできる。
本発明のポリヌクレオチドおよびそれらを含む発現ベクターは、当業者に公知であり、"Molecular Cloning: a Laboratory manual", J. Sambrook and D.W. Russel編, 発行者: Cold Spring Harbor Laboratory Press,第3版, 2001 (ISBN 978-0879695774)などの概論および手引き書で認知される分子生物学および遺伝子工学の従来技術により作製することができる。また、本発明のポリヌクレオチドのための発現ベクターの構築を助けることができる市販の系も存在する。よって、例えば、Ａポリヌクレオチドを含む哺乳類細胞のための発現ベクターの構築は、ミフェリプリストンによる目的遺伝子の誘導発現のためのベクターの構築を可能とするＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）誘導発現系(Invitrogen, Carlsbad CA92008 USA, カタログ番号K1060-01およびK1060-2)、リガンドＲＬＳ１による目的遺伝子の誘導発現を可能とするＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（商標）誘導発現系(New England Biolabs, Beverly, MAO1915-5599 USA)、または他の等価な市販の系などの系を用いれば容易となる。
本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、組換えアデノウイルスを生産するためにベクターの増殖ビヒクルおよびパッケージング細胞の双方として働く宿主細胞の一部を形成していると見られる場合がある。よって、別の態様では、本発明は、本発明のＡ１、Ａ２もしくはＢポリヌクレオチド、または前述のポリヌクレオチドのいずれかを含んでなる発現ベクターを含んでなる宿主細胞に関する。これらの細胞をアデノウイルスの生産のためのパッケージング細胞として用いる場合には、それらはアデノウイルスの生産および感染を支えることができる必要がある。この実施形態によれば、好適な真核細胞はアデノウイルスの感染および複製を許容するいずれの細胞であってもよい。
好ましい実施形態では、この細胞系統は安定な細胞系統である。限定されないが、宿主細胞はＨｅＬａ、Ａ５４９、ＫＢ、ＨｕＨ７細胞、またはアデノウイルスの生活環を支援することができる他の任意の真核細胞であり得る。Ｅ１ＡまたはＥ１Ａ／Ｅ１Ｂポリペプチドがこの細胞により支援される場合（本発明のＡ１ポリヌクレオチドが用いられる場合）、その発現は、Ｂポリヌクレオチドに含まれるアデノウイルス遺伝子の発現の開始をより良く制御するために誘導剤を介して調節可能なプロモーターの制御下にあってもよく、従って、過剰な発現タンパク質に由来する細胞傷害作用のリスクを最大限制限することができる。この場合、該タンパク質を構成的に発現する細胞、例えば、２９３またはＰｅｒＣ６細胞が好適であろう。
特定の実施形態では、該宿主細胞は哺乳類、好ましくは霊長類、特にはヒトに由来する。好ましい実施形態では、該細胞系統は肺癌腫系統である。いっそうより好ましい実施形態では、該宿主細胞はＡ５４９系統の細胞である。Giard et al. (1973, J. Natl. Cancer Inst, 51: 1417-1423)により誘導され、その後、Lieber et al. (1976, Int. J. Cancer., 17: 62-70)により深く特性決定されたこの細胞系統は、アデノウイルス感染に対して感受性が高く、ウイルス生産系統として高い能力を与える(Smith et al., 1986, J. Clin. Microbiol, 24: 265-268)。
好ましい実施形態では、本発明は、本発明のＡ１ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞に関する。いっそうより好ましい実施形態では、該細胞は、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードする配列および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列をさらに含んでなる。
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のＡ２ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
別の実施形態では、本発明は、本発明のＢポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
別の実施形態では、本発明は、本発明のＡ１ポリヌクレオチドとＢポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞に関する。いっそうより好ましい実施形態では、該細胞は、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードする配列および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列をさらに含んでなる。
別の実施形態では、本発明は、本発明のＡ２ポリヌクレオチドとＢポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞に関する。
本発明のＡ１およびＢポリヌクレオチドを含んでなる細胞とＡ２およびＢポリヌクレオチドを含んでなる細胞は双方とも、高容量アデノウイルスベクターの生産およびパッケージングに特に好適であり、このため、本発明のＡ１およびＢポリヌクレオチドを含んでなる細胞とＡ２およびＢポリヌクレオチドを含んでなる細胞は該ベクターの生産およびパッケージングのための手順および系に使用することができる。しかしながら、アデノウイルスの生産に特に有用なのは、Ｂポリヌクレオチド中で欠陥のあるアデノウイルスゲノムを隣接している標的部位がＡ１およびＡ２ポリヌクレオチドによりコードされている制限エンドヌクレアーゼに相当しているものであり、そうでなければ、Ａ１またはＡ２ポリヌクレオチドによりコードされている制限エンドヌクレアーゼは、ゲノムの複製および転写に不可欠なアデノウイルスゲノムを放出するＢポリヌクレオチドに作用することができないからである。
本発明の宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを一時的に導入するか、または好ましくはベクターのポリヌクレオチドを安定に導入することにより得ることができる。これを行うためには、本発明のベクターと宿主細胞とを、細胞へのＤＮＡの取り込みに好適な条件で接触させる必要がある。本発明のベクターを、当業者に公知のトランスフェクション法（Ausubel, F.M. et al, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc; 2003の第9.1節〜第9.5節を参照）のいずれかを用いて検討対象の細胞に導入する。特に、これらの細胞は、ＤＮＡのリン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレンとの共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソームにより媒介される融合、リポフェクション、レトロウイルスによる感染およびバイオリスティックトランスフェクションによりトランスフェクトすることができる。
よって、別の態様では、本発明は、
（ｉ）細胞を本発明のＡ１ポリヌクレオチドでトランスフェクトすること、および
（ｉｉ）該細胞を本発明のＢポリヌクレオチドでトランスフェクトすること
を含んでなり、
工程（ｉ）および（ｉｉ）は任意の順序でまたは同時に行うことができ、かつ、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列を含んでなる細胞が用いられる、高容量アデノウイルスの感染性粒子の生産およびパッケージングに好適な細胞の生産方法に関する。
よって、別の態様では、本発明は、
（ｉ）細胞を本発明のＡ２ポリヌクレオチドでトランスフェクトすること、および
（ｉｉ）該細胞を本発明のＢポリヌクレオチドでトランスフェクトすること
を含んでなり、
工程（ｉ）および（ｉｉ）は任意の順序でまたは同時に行うことができる、高容量アデノウイルスの感染性粒子の生産およびパッケージングに好適な細胞の生産方法に関する。
当業者ならば、上記の方法の工程（ｉ）および（ｉｉ）は、細胞内に該ポリヌクレオチドまたはベクターが一時的に存在するように行うこともできるし、あるいは、Ａ１／Ａ２および／またはＢポリヌクレオチドの安定発現が得られるように行うこともできることが分かるであろう。宿主細胞において本発明のベクターの安定発現を得たい場合には、そのＤＮＡが染色体外の位置にある細胞系統のゲノムにそのＤＮＡを組み込んだ細胞を選択することができるように、所定の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子を、トランスフェクションまたは感染工程中に含める必要がある。これらの細胞の選択を可能とする遺伝子は、本発明の目的構築物を含む同じベクターの一部として提供することもできるし、あるいは、該耐性遺伝子を含む第２のプラスミドと同時トランスフェクションを行うことにより別に提供することもできる。この後者の場合では、トランスフェクション混合物に、ＤＮＡ構築物を含むプラスミドを、耐性遺伝子の組込みの度に検討対象のプロモーターを含む遺伝子の高い組み込み率が得られるように、耐性遺伝子に対してモル過剰量で提供する。好ましくは、ＤＮＡ構築物を含むプラスミドは、リポーター耐性遺伝子を含むベクターに対して少なくとも５倍過剰量で提供する。好ましくは、耐性遺伝子は本発明のベクター内に含められる。トランスフェクションに好適な耐性遺伝子は従前に記載されている。よって、好ましい実施形態では、本発明によるＡ１およびＢまたはＡ２およびＢポリヌクレオチドを含んでなる細胞の生産方法は、工程（ｉ）および（ｉｉ）で用いられたポリヌクレオチドに存在する選択マーカーに基づき、第１および／または第２のポリヌクレオチドを安定に組み込んだ細胞が選択される付加的な選択工程を含む。
一方、Ａ２ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでトランスフェクションを行うと、該ポリヌクレオチドを安定に（細胞は培養で最大４か月維持された）組み込む細胞クローンを選択することが可能であった。有利にも、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質と制限エンドヌクレアーゼの発現は抑制され、細胞に害の無い基底発現レベルを維持すること、およびこの発現が用いる特定の構築物に好適な誘導剤の好適な量を培養物に添加することにより誘導および活性化され得ることが確認された。
さらに、インテグラーゼ認識部位を含んでなるＢポリヌクレオチドの変異体が用いられる特定の場合では、Ｂポリヌクレオチドの細胞ゲノムへの組込みを可能とするために、Ｂポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを、インテグラーゼをコードし発現し、かつ、インテグラーゼの認識配列を認識するプラスミドとともに同時にトランスフェクトすることにより工程（ｉｉ）を行う必要がある。好ましくは、インテグラーゼの認識部位がａｔｔＢ部位である場合には、工程（ｉｉ）は、ＰｈｉＣ３１ファージのインテグラーゼをコードするプラスミドとの同時トランスフェクションを含み、これにより、このａｔｔＢ配列とヒト細胞の染色体に存在するｐｓｅｕｄｏ−ａｔｔＰ配列の間の組換えによる、細胞ゲノムへのＢポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含むベクターの組込みが可能となる。この一方向組換えおよび組込みはＰｈｉＣ３１インテグラーゼにより媒介される。種々のウイルス領域の発現とそれに続くＢポリヌクレオチドに存在するウイルスゲノムの複製には、このウイルスのＩＴＲ末端がフリーである必要があり、加えて、ウイルスＥ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質が存在することも必要である。結果として、生じた細胞は欠陥アデノウイルスのゲノムを持つが、これは発現または複製することができない。組込みは無作為にＢポリヌクレオチドを生じることもできるが、ｐｓｅｕｄｏ−ａｔｔＰ配列への組込みが主要であり、遺伝物質の損失も伴わない。
前述の方法は高容量アデノウイルスベクターのパッケージングに好適な細胞系統の生産を可能とする。よって、別の態様では、本発明は、前述の方法のいずれかによって得られる細胞に関する。特に、本発明は、Ａ１およびＢポリヌクレオチドまたはＡ２およびＢポリヌクレオチドを含んでなる（該ポリヌクレオチドが細胞ゲノムに安定に組み込まれ得るか、または一時的に見られる）細胞を含む。
本発明のアデノウイルスベクターの生産およびパッケージングのための系および方法
本発明ポリヌクレオチドまたはそれらを含んでなるベクターを細胞系統に導入することにより生産されたパッケージング細胞は、そのアデノウイルスゲノムを含んでなるポリヌクレオチドによるトランスフェクションか、その遺伝子を含んでなる組換えアデノウイルスによる感染のいずれかにより、目的遺伝子を含んでなるアデノウイルスゲノムを細胞へ導入することによる高容量アデノウイルスベクターの作製に使用することができる。アデノウイルス／目的遺伝子を含んでなるアデノウイルスゲノムを含んでなるポリヌクレオチドによる感染／トランスフェクションを行い、それらの細胞とＡ１またはＡ２ポリヌクレオチドに含まれる遺伝子の発現を促進する薬剤とを接触させた後、細胞内で転写レギュレーターが生産され始め、そしてそれらは制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子の転写を活性化する。これは次に、Ｂポリヌクレオチドに含まれる欠陥アデノウイルスゲノムを隣接している標的部位において働き、細胞ゲノムからのその切り出しが起こるが、これは該ゲノムの一部をなすアデノウイルス遺伝子が次に転写されるために必要な条件である。Ｂポリヌクレオチドからのアデノウイルス遺伝子の転写にはまた、Ａ２ポリヌクレオチドにより（この場合には、それらは転写レギュレーターの活性化に応答する）、または実際のパッケージング細胞に（これもまた転写レギュレーターの制御下にコードされている）初期Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の発現も必要とされる。
よって、別の態様では、本発明は、
（ａ）本発明による細胞と、
（ｂ）高容量アデノウイルス
を含んでなる、高容量アデノウイルスの生産のための系に関する。
別の態様では、本発明は、
（ａ）宿主細胞を、生産を意図する高容量アデノウイルスのゲノムを含んでなるポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでトランスフェクトするか、または感染させる工程、
（ｂ）該トランスフェクト／感染細胞を高容量アデノウイルスの複製およびパッケージングを可能とするのに十分な条件下で培養する工程、
（ｃ）高容量アデノウイルスのウイルス粒子を回収する工程および場合により、
（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程（工程（ｃ）で生産された高容量ウイルス粒子を次のサイクルの工程（ａ）で用いる）
を含んでなり、
工程（ａ）で用いられる宿主細胞が、
（ｉ）本発明のＡ１ポリヌクレオチドと、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列とを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、本発明のＢポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクション工程が行われる）、
（ｉｉ）本発明のＡ２ポリヌクレオチドを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、本発明のＢポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクション工程が行われる）、
（ｉｉｉ）本発明のＢポリヌクレオチドを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、本発明のＡ１ポリヌクレオチドでのトランスフェクション工程が行われ、該細胞はアデノウイルスＥ１Ａタンパク質および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列を含んでなる）、
（ｉｖ）本発明のＢポリヌクレオチドを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、本発明のＡ２ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクション工程が行われる）、
（ｖ）本発明のＡ１ポリヌクレオチド、本発明のＢポリヌクレオチド、ならびにアデノウイルスＥ１Ａタンパク質および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列を含んでなる細胞、および
（ｖｉ）本発明のＡ２およびＢポリヌクレオチドを含んでなる細胞
からなる群から選択される、高容量アデノウイルスベクターの生産およびパッケージングのための方法に関する。
高容量アデノウイルスベクターの生産およびパッケージングのための方法の工程（ａ）は、パッケージング細胞と高容量アデノウイルスまたは該アデノウイルスのゲノムを含んでなるポリヌクレオチドもしくはベクターとを接触させることを含んでなる。
本発明による「高容量アデノウイルス」は、例えばAlba et al. (2005, Gene Therapy, 12:S18-S27)により記載されているように、アデノウイルスゲノムの、ＩＴＲ ５’および３’領域とΨパッケージング領域を除く総ての遺伝子を欠いていることを特徴とする、補助依存性またはガットレスと呼ばれる組換えアデノウイルスとして理解される。これらのアデノウイルスは、それらの固有のアデノウイルスゲノム配列を欠いているので、３６ｋＤａまでの異種配列を許容する。本発明の方法に従ってこのガットレスベクターに組み込むことができる異種遺伝子はとしては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、レプチン、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、プロラクチン放出ホルモン（ＰＲＨ）、メラトニン放出ホルモン（ＭＲＨ）、プロラクチン放出ホルモン（ＰＩＨ）、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ソマトトロピンまたは成長ホルモン（ＧＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、チロトロピン（ＴＳＨまたは甲状腺刺激ホルモン）、プロラクチン、オキシトシン、抗利尿ホルモン（ＡＤＨまたはバソプレシン）、メラトニン、ミュラー管阻害因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、セクレチン、ＰＢＧＤ、Ｉ型インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）、ＩＩ型インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩＩ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、レプチン、ニューロペプチドＹ、レニン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、組織因子、ＶＩＩ因子、Ｘ因子、トロンビン、Ｖ因子、ＸＩ因子、ＸＩＩＩ因子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８およびケモカイン）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１６（ＩＬ−１６）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン２４（ＩＬ−２４）、α、β、γインターフェロン、ＣＤ３、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ１α、ＭＩＰ−Ｉα、ＭＩＰ−１βを含む）、ニューロン成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦおよびＫＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦおよび関連のもの）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子、内皮成長因子、α−１抗トリプシン、腫瘍壊死因子、顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、シクロスポリン、フィブリノゲン、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、キモトリプシン、免疫グロブリン、ヒルディン、スーパーオキシドジスムターゼ、イミグルセラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、グルコシダーゼ−α、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ガルスルファーゼ、α−ヒトガラクトシダーゼＡ、プロテイナーゼ阻害剤α−１、ラクターゼ、膵臓酵素（リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ）、アデノシンデアミナーゼ、免疫グロブリン、アルブミン、Ａ型およびＢ型ボツリヌス菌毒素、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、Ｌ−アスパラギナーゼ、レピルジン、ストレプトキナーゼ、ＷＯ０３３１１５５、ＷＯ２００５１９２４４およびＷＯ０３９３２９３（その内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているものなどのトランスフォーミング成長βペプチド（ＴＧＦ−β）、干渉ＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボヌクレオプロテインＵ１の改変ＲＮＡ）の転写に好適な発現カセットをコードする遺伝子が挙げられる。該異種遺伝子の他、本発明で用いるガットレスアデノウイルスは、Parks et al. (1999, J. Virol., 73:8027-8034)により記載されているλファージゲノムに由来するｓｔｕｆｆｅｒ配列またはSandig et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:1002-7)により記載されているようなｐＳＴＫ１２０に見られるｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡなどのｓｔｕｆｆｅｒ領域を含み得る。これらの領域は通常、ヒトゲノムに存在し、かつ、該ヒトｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡの代わりにParks et al. (1999, J. Virol., 73:8027-8034)に記載されているλファージの２２ｋｂフラグメントを含んでなる対照アデノウイルスに対して異種の遺伝子の発現を増強することができる配列を含む。ヒトｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡの全長は様々であるが、２０〜３０ｋｂ、好ましくは２０〜２５ｋｂ、またはいっそうより好ましくは２１〜２３ｋｂの範囲であり、例えば２２ｋｂである。該ｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡにおいてシスで働く配列の数は、２、３、４またはそれ以上の中で様々であり、限定されるものではないが、１６．２ｋｂの反復ａｌｐｈｏｉｄドメイン（Smith et al., 1995, Mol. Cell. Biol., 15:5165-72に記載）；例えば６型アデノウイルスの左端を含む４．２ｋｂのフラグメントまたは免疫グロブリンκの２コピーのマトリックス付着領域などのマトリックス付着領域（ＭＡＲ）（Betz et al., 1994, Cell, 77:239-248に記載）；肝細胞制御領域（ＨＣＲ）、例えば、該ＨＣＲを含んでなる１．２ｋｂのフラグメント（Miao et al., 2000, Molecular Therapy, 1:522-32に記載）；またはニワトリリゾチームの２．８ｋｂ領域（Phi-Van et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:2302-2307により記載）、インターフェロンβの５’領域のマトリックス付着領域（Bode et al. 1992, Science, 10:195-197により記載）などの別のマトリックス付着領域またはテロメアもしくはセントロメア配列などの他の非コードヒト配列が挙げられる。
宿主細胞と、アデノウイルスゲノムを含んでなるポリヌクレオチドとの接触は、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレンによるＤＮＡの共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソームにより媒介される融合、レトロウイルスによる感染およびバイオリスティックトランスフェクションによる該ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなるベクターのトランスフェクションなど、当業者に公知の技術を用いて行う。あるいは、細胞と、増幅させたいアデノウイルスとを接触させることもでき、この場合には細胞を感染させるアデノウイルスの実際の能力により該ゲノムを細胞に導入することができる。
「パッケージング細胞」は、本発明で記載され、少なくとも本発明のＡ１／Ａ２ポリヌクレオチドまたはＢポリヌクレオチドを含む任意の細胞と理解される。当業者ならば、種々のパッケージング細胞を使用できることが分かるであろう。しかしながら、本発明の１以上のポリヌクレオチド中にパッケージング細胞が存在するかしないかによって、工程（ａ）に先立ち、または同時に、これらの細胞と、パッケージング細胞には見られず、アデノウイルスゲノムの複製のため、ならびにアデノウイルス細胞のアセンブリに必要なポリペプチドを細胞で生産するために不可欠なエレメントを提供するために必要とされる本発明のポリヌクレオチドとを接触させるトランスフェクション工程を行わなければならない。よって、本発明のＡ１ポリヌクレオチドとアデノウイルスＥ１Ａタンパク質および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列を含んでなる細胞をパッケージング細胞として使用することができる。しかしながら、このパッケージング細胞の使用には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、該細胞を本発明のＢポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでトランスフェクトすることからなる工程が必要である。
本発明のＡ２ポリヌクレオチドを含んでなる細胞を用いる場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、本発明のＢポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクション工程を行うことができる。
本発明のＢポリヌクレオチドを含んでなる細胞をパッケージング細胞として用いる場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、本発明のＡ１ポリヌクレオチドでのトランスフェクション工程を行うことができ、この場合、細胞は、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列をさらに含むことができる。
本発明のＢポリヌクレオチドを含んでなる細胞を用いる場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、本発明のＡ２ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクション工程を行うことができる。
また、本発明のＡ１ポリヌクレオチド、本発明のＢポリヌクレオチドならびにアデノウイルスＥ１Ａタンパク質および場合によりアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列を含んでなる細胞、あるいは、本発明のＡ２およびＢポリヌクレオチドを含んでなる細胞を使用することもできる。
本発明の方法の工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られたトランスフェクト／感染細胞を高容量アデノウイルスの複製およびパッケージングを可能とする条件で維持することを含んでなる。このためには、該条件がＡ１またはＡ２ポリヌクレオチドによりコードされている転写レギュレーターの発現を可能とし、これがＡ１およびＡ２ポリヌクレオチドに存在するエンドヌクレアーゼの遺伝子のレギュレーター領域内のそれらの結合部位に、また、Ａ２ポリヌクレオチドに存在するアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子のレギュレーター領域内のその結合部位に作用するようにする必要がある。これを行うため、Ａ１およびＡ２ポリヌクレオチドによりコードされている転写レギュレーターが活性化可能なレギュレーターである場合には、工程（ｂ）は細胞と転写レギュレーター活性化することができる薬剤とを接触させることを含む。好ましい実施形態では、Ａ１およびＡ２ポリヌクレオチドによりコードされている転写レギュレーターは、従前に記載されているようなＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５であり、この場合には、誘導剤はミフェプリストンである。
工程（ｂ）は、Shabram et al., (1997, Hum. Gene Ther., 8:453-465)により記載されているようなＨＰＬＣに基づくＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ法などの標準的手段によって、または間接的に細胞内の細胞傷害作用の視覚的検査によって決定されるような、ウイルス粒子の濃度が十分高くなるのに必要な時間行う。場合により、細胞培養は新鮮培地の添加を含んでもよい。
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で生じたアデノウイルスを細胞培養から回収する。これを行うため、当業者に公知のいずれかの方法（トリプシン処理および遠心分離または濾過）によって培養培地の細胞を分離し、これらの細胞を不活性な溶液中で溶解させ（冷凍／解凍サイクル、ホモジナイゼーション、音波処理、キャビテーション、洗剤および類似品の使用）、アデノウイルス粒子を、ＣｓＣｌ勾配での超遠心分離などの既知の方法により、またはイオンクロマトグラフィーと金属キレートアフィニティークロマトグラフィーの組合せ(Huyghe et al., 1996, Hum. Gene Ther., 6:1403-1416)、イオン交換クロマトグラフィーとゲル分画クロマトグラフィーの組合せ（ＷＯ０７０５９４７３）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースでのクロマトグラフィー(Haruna et al., 1961, Virology 13, 264-267)、ヒドロキシルアパタイトでのクロマトグラフィー（ＵＳ２００２／００６４８６０）ならびにソフトゲル（アガロース）、透過クロマトグラフィーを含む合成ポリマーに基づく多孔質ポリマー（フラクトゲル）および硬質カプセル中のソフトゲルに基づく材料（例えば、Ｃｅｒａｍｉｃａ ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）Ｆ）(Rodrigues, 1997, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl 699:47-61)などの種々のタイプのクロマトグラフィーにより精製することが必要である。
任意の工程（ｄ）は、工程（ａ）〜（ｃ）を１回または数回繰り返すことからなる。これを行うため、サイクルの各工程（ａ）では、前のサイクルの工程（ｃ）で得られたアデノウイルス粒子を出発材料として用いる。このようにして、本発明のプロセスを数回繰り返して、各サイクルでより多数のアデノウイルス粒子を得ることができる。
以下、本発明を、本発明の範囲の非限定的な例示として示される下記実施例に基づいて説明する。
実施例１：Ｅ１ａおよびＥ１ｂアデノウイルス遺伝子の、また、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素の誘導発現のためのｐＧａｌ４−２ＲＵ−Ｅ１−ＳｃｅＩプラスミドの構築
本実施形態では、本発明で定義されるようなＡ２ポリヌクレオチドを含むｐＧａｌ４−２ＲＵ−Ｅ１−ＳｃｅＩプラスミド（図１Ａ）を、アデノウイルス遺伝子Ｅ１ａおよびＥ１ｂの発現の、転写レベルでの制御のために具体的に設計した。この構築物内の、同じタイプの転写制御下に、Ｉ−ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子が含まれていた。このＡ２ポリヌクレオチド内に含まれるヌクレオチド配列から、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよびＩ−ＳｃｅＩ遺伝子の発現を制御する転写レギュレーターが構成的に発現される。
本発明に含まれる転写調節のメカニズムは抗プロゲスチン系ミフェリプリストンにより媒介される(Burcin et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 355-360)。この調節は内因性ヒトホルモンに対して感受性がないが、ヒトにおいて二次的作用を避けるのに十分な低用量の合成抗プロゲスチン（ＲＵ４８６）の存在下で活性な、融合タンパク質を介して起こる。
ｐＧａｌ４−２ＲＵ−Ｅ１−ＳｃｅＩプラスミドの構築に基づき、市販の系ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）(Invitrogen, Carlsbad CA92008 USA, カタログ番号K1060-01およびK1060-2)が用いられている。この系は、Ａ２ポリヌクレオチドを含むプラスミドの設計に必要な総ての遺伝成分を提供する。
ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）系の第１の成分は、転写アクチベーターとして働く融合ＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５タンパク質をコードするｐＳｗｉｔｃｈベクターである（図２Ａ）。このタンパク質はサッカロミセス・セレビシエのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）(Laughon and Gesteland, 1984, Mol. Cell Biol., 4: 260-267; Marmorstein, et al., 1992, Nature, 356: 408-414)、ヒトプロゲステロン受容体の末端切断型リガンド結合ドメイン（ｈＰＲ−ＬＢＤ）(Kastner, et al., 1990, Embo J., 9: 1603-1614; Wang, et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8180-8184)およびヒトＮＦ−κＢタンパク質の活性化ドメイン（ＡＤ）(Burcin, et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 355-360; Deloukas and van Loon, 1993, Hum. Mol. Genet., 2: 1895-1900)に分けられる。レギュレータータンパク質の発現は、サッカロミセス・セレビシエのＧＡＬ４の活性化配列（ＵＡＳ：上流活性化配列）(Giniger et al., 1985, Cell, 40: 767-774; Wang et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8180-8184)と単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Ｐｔｋ）の最小プロモーターの結合に由来するハイブリッドプロモーターの制御下にある。このプロモーターの活性化領域は、４コピーの配列５’−（Ｔ／Ｃ ＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’（配列番号１）を含む。それらはそれぞれ、ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメイン２分子に対して結合部位として働く(Marmorstein, et al., 1992, Nature, 356: 408-414)。
ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）の第２の成分は、目的遺伝子の発現を制御するｐＧｅｎｅ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミドである（図２Ｂ）。この場合、転写を制御するハイブリッドプロモーターは、ＧＡＬ４転写因子の６つの結合配列およびＥ１ｂ（ＰＥ１ｂ）アデノウイルス遺伝子のＴＡＴＡボックス配列(Lillie and Green, 1989, Nature, 338: 39-44)からなる。
ミフェリプリストンの不在下では、この系はチミジンキナーゼ最小プロモーターからレギュレーター融合ＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５タンパク質を構成的に発現する。このタンパク質は主として核に局在し、不活性である。インデューサーミフェリプリストンまたはその類似体ＲＵ４８６を添加した際、これはＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５のｈＰＲ−ＬＢＤ領域と高い親和性で結合し、タンパク質の二量体化およびその活性型への変換をもたらすコンフォメーション変化が起こる。これらのホモ二量体は、ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−ＨｉｓＡおよびｐＳｗｉｔｃｈプラスミドに存在するＧＡＬ４の結合配列（ＵＡＳ）と相互作用し、目的遺伝子と実際の転写因子をコードする遺伝子の転写を活性化する（図２Ｃ）。
本発明で示唆される、Ａｄ５のＥ１領域とＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼの遺伝子を誘導系ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）の制御下に置くというアイデアに基づき、まず、調節系と５０５番〜３５１１番の間のアデノウイルスゲノムの配列（Ａｄ５（５０５〜３５１１））（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣ０００００８）とおよびＩ−ＳｃｅＩのコード遺伝子の種々の組合せを設計した。これらの組合せにおいて、調節のメカニズムは１つまたは２つのプラスミドの使用に基づき、ここで、遺伝子Ｅ１および遺伝子Ｉ−ＳｃｅＩはなお、単一のプロモーターの制御下にあるか、または同じもしくは異なる配向で配置された異なるプロモーターの制御下にある（図３Ａ）。これらの組合せをそれぞれ、それらのＥ１領域および遺伝子Ｉ−ＳｃｅＩの発現調節能およびその細胞ゲノム内への安定な組込み能を決定するために試験する。これらの総てから、ｐＧａｌ４−２ＲＵ−Ｅ１−ＳｃｅＩ構築物は、ヘルパーの非依存的高容量アデノウイルス生産系の設計におけるその適用に最も好適であると考えられた。
下記の構築物の増幅に用いた細菌株は大腸菌(Escherichia coli)ＤＨ５αおよび大腸菌ＳＴＢＬ２である。増殖は、選択培地としての、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）(Sigma-Aldrich)を添加したＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）(Sigma-Aldrich, 28760 Madrid, Spain)で、ＤＨ５α株の場合は３７℃、ＳＴＢＬ２株の場合は３０℃で行った。これらの細菌を、最初にHanahan (1983, J. Mol. Biol, 166: 557-580)により記載されたＣａＣｌ２プロトコールに従って形質転換させた。これを行うため、１０〜２０ｎｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌのコンピテント細胞と混合し、これを氷中で３０分間維持した。その後、プロセスの効率を高めるために、この混合物を４２℃で１分間インキュベートし、すぐに氷に移し、これをさらに２分間インキュベートした。最後に、１ｍｌのＬＢ培地を加え、攪拌下、３７℃で１時間インキュベートした。
プラスミドの精製、およびアガロースゲルで分離した後の制限酵素による消化から生じたＤＮＡフラグメントの精製は、それぞれＦＸ ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｅｐキット系(GE Healthcare Europe, 8290 Barcelona, Spain)およびＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ抽出キット(Qiagen, Valencia CA91355, USA)を用い、製造業者の推奨に従って行った。
ＤＮＡフラグメントのクローニングでは、連結反応を、１ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ(New Englamd Biolabs, Beverly MA01915-5599, USA)および２μｌの１０倍反応バッファー(New England Biolabs)を含む最終量２０μｌとして設計した。平滑末端を有するフラグメントの場合には、反応は、１ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)、２μｌの１０倍反応バッファー(New England Biolabs)および２μｌの５０％ ＰＥＧ４０００を含む最終量２０μｌとして設計した。総ての場合で、これらの反応は総て、周囲温度で２時間インキュベートし、対応する大腸菌株に導入する前に６５℃で１０分間不活性化した。組換えクローンはベクターによりコードされている耐性マーカーに基づいて選択し、制限エンドヌクレアーゼによる消化および１％アガロースゲルでの電気泳動によって確認した。
ｐＧａｌ４−２ＲＵ−Ｅ１−ＳｃｅＩプラスミドの合成プロセスにおいて設計されたＰＣＲ反応は総て、１ＵのＴａｑポリメラーゼ酵素(BioTaq, Bioline, London NW2 6EW, UK)、ＰＣＲバッファー(Bioline)、ＭｇＣｌ２ ４ｍＭ、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌの各プライマー、ＤＮＡおよび最終量５０μｌまでの無菌脱イオン水の存在下で行った。増幅条件は次の通りとした：９５℃で４分の変性１回；９４℃で５０秒の変性、５０℃で４０秒のプライマーハイブリダイゼーションおよび７２℃で４０秒の伸長を２９回；７２℃で５分の最終伸長１回。増幅産物の分析のため、サンプルを１．５μｌのローディング溶液（蒸留水中０．２５％のブロモフェノールブルー；４０％グリセロール；１００ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合し、それらをＴＡＥ １倍バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ；２０ｍＭ氷酢酸；１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を用いたアガロースゲル（１％）での電気泳動により分析し、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）染色によりＤＮＡを表した。
ｐＧａｌ４−２ＲＵ−Ｅ１−ＳｃｅＩ調節プラスミドは下記のような５工程で設計した。
１）ｐＧｅｎｅ−リンカーＲＵ２ベクターの構築：
リンカーＲＵ２を含めるために、ｐＳｗｉｔｃｈプラスミドをＳｂｆＩ（３８番）およびＢａｍＨＩ（２４８４番）制限酵素で線状化した。これは下記のプライマーから予め合成したものである。
リンカーＲＵ−１：
5’-GGACCACCAAGGATCCTCTAGAACCGTTTAAACACCACTAGTCCAACGCGTGATATCACCGCGGCCGCA-3’（配列番号２）
リンカーＲＵ−２：
5’-GATCTGCGGCCGCGGTGATATCACGCGTTGGACTAGTGGTGTTTAAACGGTTCTAGAGGATCCTTGGTGGTCCTGCA-3’（配列番号３）
アニーリング反応では、１０μｌの各プライマーを５０ｍＭ濃度でバッファー溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ）に混合した。反応条件は次の通りとした：９５℃で２分および５２℃１０分。次に、リンカーＲＵ２プライマーを、Ｔ４酵素キナーゼポリヌクレオチドを用い、製造業者(New England Biolabs)の推奨に従ってリン酸化した。この反応物を３７℃で３０分インキュベートし、６５℃で１５分間不活性化した。その後、リンカーＲＵ２とｐＳｗｉｔｃｈベクターとの連結を行い、これを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。得られた構築物をｐＳｗｉｔｃｈ−リンカーＲＵ２と呼んだ。
次に、ｐＳｗｉｔｃｈ−リンカーＲＵ２ベクターをＦｓｐＩ酵素（ｐＳｗｉｔｃｈの６６２３番）およびＡｐａＩ（ｐＳｗｉｔｃｈの２７２１番）で消化し、ｐＳｗｉｔｃｈベクターの隣接配列のリンカーＲＵ２ドラッギング部分を遊離させた。このフラグメントを、予めこれらの同じ酵素で消化したｐＧｅｎｅＶ５−ＨｉｓＡベクターにサブクローニングした。得られたベクターはｐＧｅｎｅ−リンカーＲＵ２と呼ばれ、ｐＧａｌ４−２ＲＵ−Ｅ１−ＳｃｅＩベクターの構築の基礎となる。
２）アデノウイルスのＥ１領域のクローニング：
ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター(Groskreutz and Schenborn, 1997, Methods Mol. Biol, 63: 11-30)から、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化することにより、２６２ｐｂのフラグメントが遊離し、これはＳＶ４０のポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐＡ）を含んでいた。この配列を、予めこれらの同じ酵素で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）プラスミド(Stratagene, La Jolla CA92037, USA)にクローニングし、ＰＢＳ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを得た。
並行して、ｐＧｅｎｅＶ５−ＨｉｓＡプラスミドをＳａｌＩ（１５１番）およびＰｖｕＩＩ（８９５番）酵素で順次消化したところ、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨｐＡ）のポリアデニル化シグナルを単離することができた。この７４４ｐｂのフラグメントを、予めＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで線状化し、そして、そのＢａｍＨＩ末端を予めクレノウを用い、製造業者(ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント；New England Biolabs)の推奨に従って平滑化したｐＢＳ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドにクローニングした。このようにして、ＢａｍＨＩ制限酵素の標的配列により連結されたポリアデニル化シグナルＢＧＨおよびＳＶ４０を含んでなる挿入部が作出された。
次に、ｐＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒＲＵ２−２ｐＡプラスミドを合成した。これを行うため、ｐＢＳ−ＢＧＨｐＡ−ＳＶ４０ｐＡベクターをＸｂａＩで消化したところ、２つのポリアデニル化配列を含む６２３ｐｂのフラグメントが遊離し、これをｐＧｅｎｅ−リンカーＲＵ２プラスミドのリンカーＲＵ２に存在するユニークなＸｂａＩ部位内にクローニングした。挿入部が正しい向き（５’−ＳＶ４０ｐＡ−ＢＧＨｐＡ−３’）であることを、ＰｍｅＩで制限することにより確認した。
Ａｄ５のＥ１領域をプライマー：
ａｄ１９ 5’-GAGTGCCAGCGAGTAGAGTT-3’（配列番号４）および
ａｄ２２ 5’-GAATTCTCAATCTGTATCTTCATC-3’（配列番号５）
を用いたＰＣＲにより増幅した。
得られた３ｋｂの産物をＰＣＲ ｐＧｅｍＴ−Ｅａｓｙ産物(Promega Biotech Iberica, 28108 Madrid, Spain)用の特異的ベクターにクローニングした。ＥｃｄＲＩで消化することにより該Ｅ１領域を精製し、ｐＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒＲＵ２−２ｐＡベクターのＥｃｏＲＩ標的内にサブクローニングし、ＢＧＨｐＡポリアデニル化シグナルから「下流に」配置した。得られたプラスミドをｐＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒＲＵ２−２ｐＡ−Ｅ１と呼んだ。
３）ＧＡＬ４−ＤＢＤ／ｈＰＲ−ＬＢＤ／ｐ６５−ＡＤ遺伝子（転写レギュレーター）およびその自己調節プロモーター領域のクローニング
ｐＳｗｉｔｃｈベクターをＳｂｆＩ（３８番）およびＢａｍＨＩ（２４８５番）制限酵素で消化し、転写レギュレーターに対する結合配列（ＵＡＳ領域）、キナーゼタンパク質の最小プロモーター（Ｐｔｋ）および転写アクチベーターＧＡＬ４−ＤＢＤ／ｈＰＲ−ＬＢＤ／ｐ６５−ＡＤをコードする遺伝子を単離した。この２．４ｋｂのＳｂｆＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、予め同じ酵素で消化したｐＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒＲＵ２−２ｐＡプラスミドにクローニングしたところ、ポリアデニル化配列ＳＶ４０ｐＡの欠失が起こった。得られた構築物をｐＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒＲＵ２−Ｇａｌ４−ＢＧＨｐＡ−Ｅ１の名称とした。
この第２のポリアデニル化シグナルを回収するため、ＳＶ４０ｐＡ配列を、ＢａｍＨＩで消化することにより、最初のｐＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒＲＵ２−２ｐＡ構築物から精製した。０．２ｋｂのフラグメントをｐＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒＲＵ２−Ｇａｌ４−ＢＧＨｐＡ−Ｅ１プラスミドの単一の標的ＢａｍＨＩ内にクローニングした。
４）Ｉ−ＳｃｅＩ遺伝子のクローニング
Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子をｐＩ−ＳｃｅＩプラスミド(Choulika, et al., 1994, C. R Acad. Sci, III, 317: 1013-1019)からプライマー：
ＳｃｅＩ−ｂ１ 5’-AAACCATGGGATCAAGATCGC-3’（配列番号６）および
ＳｃｅＩ−ｂ２ 5’-CCCTCTAGATTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGA-3’（配列番号７）
を用いたＰＣＲにより得た。それをｐＧｅｍＴ−Ｅａｓｙにクローニングした後、それをＮｏｔＩ制限酵素で消化することにより遊離させた。精製したフラグメントの末端を、クレノウ断片を用い、製造業者(New England Biolabs)の推奨に従って平滑末端化した後、ＳｐｅＩ制限酵素により２回目の消化を行った。最後に、精製した０．８ｋｂのフラグメントをｐＧｅｎｅＶ５−ＨｉｓＡベクターのＳｐｅＩ（４７８番）標的とＮｏｔＩ（５２２番、クレノウで処理）標的の間にクローニングした。クレノウによる処置はＮｏｔI標的の欠失を必然的に伴った。得られたプラスミドをｐＧｅｎｅ−ＩＳｃｅＩと呼んだ。
ｐＧｅｎｅ−ＩＳｃｅＩプラスミドをＸｂａＩで消化し、Ｅ１ｂアデノウイルス遺伝子（ＰＥ１Ｂ）の最小プロモーターの転写制御下にエンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの遺伝子を含む１．２ｋｂのフラグメントを遊離させた。このフラグメントをｐＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒＲＵ２−Ｇａｌ４−２ｐＡ−Ｅ１プラスミド内のポリアデニル化配列ＢＧＨとＥ１領域の間に局在するＳｐｅＩ適合標的内にサブクローニングした。得られた構築物をｐＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒＲＵ２−Ｇａｌ４−２ｐＡ−ＩＳｃｅＩ−Ｅ１と呼んだ。
５）Ｉ−ＳｃｅＩおよびアデノウイルスＥ１領域の転写の制御のための二重誘導プロモーターのクローニング
転写アクチベーターと結合するレギュレーター配列（ＵＡＳ）と最小プロモーターＰＥ１Ｂを含むｐＧｅｎｅＶ５−ＨｉｓＡベクターの領域は、プライマー：
ＰＲＵ−１ 5’-AATACTAGTCCGAGCTCTTACGCGGGTC-3’（配列番号８）、および
ＰＲＵ−２ 5’-AATACGCGTGGTGGCCTGTGAAGAGAAAAAA-3’（配列番号９）
を用いたＰＣＲによる増幅によって得、それをｐＧｅｍＴ−Ｅａｓｙベクターにサブクローニングした。その後、ＮｏｔＩで消化することにより挿入部を遊離させ、それをＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒＲＵ２−Ｇａｌ４−２ｐＡ−ＩＳｃｅＩ−Ｅ１構築物の、Ｉ−ＳｃｅＩの最小プロモーターＰＥ１ＢとアデノウイルスＥ１領域の間にあるＮｏｔＩ標的内にサブクローニングした。得られた構築物をｐＧａｌ４ ２ＲＵ−ＳｃｅＩ−Ｅ１と呼んだ（図３Ｂ）。
実施例２：パッケージングシグナルと遺伝子Ｅ１ａおよびＥ１ｂが欠失した、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードするアデノウイルスゲノムを哺乳類細胞に組み込むためのｐＲＣＡｄ２プラスミドの構築
アデノウイルスゲノムを含む配列内で、他のウイルス遺伝子の発現をより強く制御するために、パッケージング配列と初期遺伝子Ｅ１ａおよびＥ１ｂに相当する領域を欠失させた。同様に、このアデノウイルス配列は、両末端とも、それらの標的配列（ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡ−配列番号８）の大きさおよびそれらの高い特異性のために、その細胞ゲノム内の配列をトランスフェクトのために認識しないサッカロミセス・セレビシエのＩ−ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼの認識配列(Anglana and Bacchetti, 1999, Nucleic Acids Res., 27: 4276-4281)を境界とする。これらの配列を挿入することで、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質の存在下でのみウイルスゲノムの放出が助長される。このような消化により、ウイルスＤＮＡの適切な転写および複製に必要なアデノウイルスのＩＴＲ末端が遊離状態で残る。
最後に、この構築物の５’末端は放線菌ファージのＰｈｉＣ３１レコンビナーゼにより媒介されるプロセスである細胞ゲノム内へのプラスミドの組込みを促進するａｔｔＢ配列を含んでいた。この酵素は特異的な一方向を生じ、他のレコンビナーゼで見られるものよりも高い正味の組込み頻度を有するので、哺乳類細胞における外因性ＤＮＡの組込み系として大きな可能性持つ(Thyagarajan et al., 2001, Mol. Cell. Biol., 21: 3926-3934)。ＰｈｉＣ３１インテグラーゼの認識配列はａｔｔＢおよびａｔｔＰと呼ばれ、配列が異なる。組込み反応の後、生じたａｔｔ配列は元のａｔｔＢおよびａｔｔＰ配列と異なり、二次的な組換え反応が阻止される。ヒト細胞において、ＰｈｉＣ３１は、ａｔｔＰと部分的同一性を有する配列（ｐｓｅｕｄｏ−ａｔｔＰと呼ばれる）が存在するゲノム点で組換え事象を媒介することができる（図４）。Thyagarajan et al. (2001, 前掲)によれば、ｐｓｅｕｄｏ−ａｔｔＰ配列の総数は１０２〜１０３の間であり、これにより組込み頻度は相同組換えにより媒介される組込みの場合よりも２〜３倍高くなり、さらにはＣｒｅレコンビナーゼなどの他の特異的レコンビナーゼにより媒介されるものよりも１０〜１００倍高くなる。
下記の構築物の増幅のために用いた大腸菌株はＤＨ５α、ＳＴＢＬ２およびＢＪ５１８３であった。これらの細菌を、実施例１に記載のＣａＣｌ２プロトコールに従って形質転換した。増殖は、選択培地としてアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）(Sigma-Aldrich)を添加したＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）にて、ＤＨ５αおよびＢＪ５１８３株の場合には３７℃、大腸菌ＳＴＢＬ２の場合には３０℃で行った。
ｐＲｃＡｄ２プラスミドの合成プロセスにおいて設計されたＰＣＲ反応は総て、実施例１に記載のものと同じ条件で行った。核酸の精製および操作に適用した一般法も実施例１に記載されている。
ｐＲｃＡｄ２ベクターは下記の４工程で設計した。
１）ａｔｔＢ−ＩＳｃｅＩ−Ａｄ（１〜１９０）配列のクローニング
ｐＲｃＡｄ２ベクター構築の第一工程は、ｐＴＡ−ａｔｔＢプラスミド(Groth, et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 5995-6000)を鋳型として用い、プライマー：
ａｔｔＢ−Ｐ１ 5’-AGATCTGTCGACGATGTAGGTCACGGTCTCCGAAGC-3’（配列番号１１）および
ａｔｔＢ−Ｐ２ 5’-TTAATTAATTACCCTGTTATCCCTAGTCGACATGCCCGCCGTGA-3’（配列番号１２）
を用いたＰＣＲによる増幅であった。この増幅フラグメントを、ＰＣＲ ｐＧｅｍＴ−Ｅａｓｙ産物(Promega)に対する特異的ベクターに、製造業者の推奨に従ってサブクローニングした。このａｔｔＢ−Ｐ２プライマーはサッカロミセス・セレビシエのＩ−ＳｃｅＩ制限酵素の認識配列を有するリンカーを含む。
ａｔｔＢ−Ｉ−ＳｃｅＩフラグメント（３１６ｐｂ）をｐＧｅｍＴ−Ｅａｓｙベクターから、制限酵素ＮｃｏＩおよびＰａｃＩで消化することにより遊離させ、それを予めこれらの同じ酵素で消化したｐＧｅｍＴ／Ａ６プラスミドにサブクローニングした。ｐＧｅｍＴ／Ａ６は、プライマー：
ａｄ６３： 5’-AGATCTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCTT-3’（配列番号１３）および
ａｄ６４： 5’-AGATCTCGGCGCACACCAAAAACGTC-3’（配列番号１４）
を用いた、１番〜１９０番の間に含まれるアデノウイルスゲノム血清型５の領域のＰＣＲにより増幅し、それをｐＧｅｍＴ−Ｅａｓｙベクターにクローニングすることに由来する。
得られた構築物ｐＧｅｍＴ／ａｔｔＢ−Ａ６において、Ｉ−ＳｃｅＩの制限標的はａｔｔＢ領域とアデノウイルスゲノムの１番の間に挿入されていた。
２）Ａｄ（３５２８〜４４５９）領域のクローニング
５１２ｐｂの挿入部ａｔｔＢ−ＩＳｃｅＩ−Ａｄ（１〜１９０）をＢｇｌＩＩ消化により切り出し、それをｐＲＣ／Ａ４−Ａ５ベクターにサブクローニングした。このベクターはプライマー：
ａｄ５７ 5’-AGATCTCGTGGCTTAAGGGTGGGAAA-3’（配列番号１５）および
ａｄ５８： 5’-TCTAGATTATATGGCTGGGAACATAGCC-3’（配列番号１６）を用いた、３５２８番〜４４５９番の間に含まれるアデノウイルス配列を増幅し、それを、哺乳類細胞での選択のためのアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子をさらに含む真核生物発現ｐＲＣ／ＲＳＶ(Invitrogen)を用いてクローニングした産物である。ｐＲＣ／ＲＳＶにＡｄ（３５２８〜４４５９）配列を挿入するために、プライマーａｄ５７およびａｄ５８の５’末端にそれぞれＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩ標的配列に含めた。この挿入部をベクターの１３番〜７０１番の間に組み込まれていた。
ベクターｐＲＣ／Ａ４−Ａ５にａｔｔＢ−ＳｃｅＩ−Ａｄ（１〜１９０）フラグメントを連結することから得られた構築物をｐＲＣ／Ａ６−Ａ５と呼んだ。このようにして、アデノウイルスのＥ１領域は欠失され、１９０番〜３５２８番の間に存在すると思われた。
３）Ａｄ（３４９０１〜３５９３８）領域のクローニング
アデノウイルスゲノムの３’末端（３４９０１番〜３５９３８番）をプライマー：
ａｄ５９： ５’−ＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＡＣＣＡＧＣＧＴＡＧ−３’（配列番号１７）および
ａｄ６５：5’-GGTACCTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCTT-3’（配列番号１８）
を用いて増幅した。
Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素の標的配列（下線）をａｄ６５プライマーの５’末端に含めた。両プライマーはそれらの５’にＸｂａＩ（ａｄ５９）およびＫｐｎＩ（ａｄ６５）の制限標的を含む。この増幅産物である１０６０ｐｂのフラグメントを、ｐＲＣ／Ａ６−Ａ５ベクターに挿入されたＡｄ（３５２８〜４４５９）領域の「下流」サブクローニングを容易にするためにこれらの酵素で切断した。得られた構築物をｐＲＣ／Ａ６−Ａ７と呼んだ。
４）ｐＲｃＡｄ２プラスミドの取得
ｐＲＣ／Ａ６−Ａ７プラスミドをＸｂａＩで線状化し、製造業者の推奨に従い、アルカリ性ホスファターゼ（アルカリ性ホスファターゼ、ウシ腸管（ＣＩＰ）；New England Biolabs）で脱リン酸化した。
同様に、ｐＴＧ３６０２プラスミド(Chartier, et al., 1996, J. Virol, 70: 4805-4810)をＰａｃＩで消化し、アデノウイルス血清型５ゲノムの完全コピーを遊離させた。その末端をアルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化することにより、その再循環を回避した。
線状化ベクターｐＲＣ／Ａ６−Ａ７とｐＴＧ３６０２プラスミドの遊離した挿入部の双方を同時に用い、大腸菌ＢＪ５１８３（ＢＪ５１８３エレクトロポレーションコンピテント細胞；Stratagene）のエレクトロコンピテント細菌株に導入を行った。これらの細胞は特に、目的遺伝子を含む導入ベクター（このベクターはアデノウイルスゲノムを含む）の相同配列間の組換えプロセスを促進するように設計される。この場合、両ＤＮＡフラグメント（Ａｄ（３５２８〜４４５９）およびＡｄ（３４９０１〜３５９３８領域）に含まれる相同領域が、その分析にｐＲＣ／Ａ６−Ａ７ベクター内およびウイルスの４４５９番の後へのアデノウイルスゲノムの挿入を必要とする該組換えプロセスに好都合である（図５）。
エレクトロポレーションプロセスは製造業者の推奨に従い、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ(Biorad)エレクトロポレーション系にて、以下のパラメーター：電圧２．５ｋＶ、抵抗２００Ω、容量２５μＦ、パルス持続時間５分に設定して行った。最後に、１ｍｌのＬＢ培地を加え、この懸濁液を３７℃で１時間インキュベートした。次に、形質転換細胞の連続希釈液を作製した。それらをｐＲＣ／Ａ６−Ａ７プラスミドの選択抗生物質としてアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した培養培地のプレートに播種した。インキュベーションを３７℃で耐性クローンが現れるまで継続した。
ＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限分析により、得られたクローンの１つだけでアデノウイルスゲノムの適切な挿入部が確認され、これをｐＲｃＡｄ２と呼んだ。
このｐＲｃＡｄ２プラスミドは、Ｅ１領域に相当する１９０番〜３５２８番の間に位置する領域を除き、完全なアデノウイルスゲノムを含む。この配列はＩ−ＳｃｅＩの制限標的を境界とし、その５’末端にａｔｔＢ配列を有する（図５）。
実施例３：高容量アデノウイルスベクターの生産およびパッケージングのための安定な細胞系統の構築および特性決定
本発明は、高容量アデノウイルスベクターの生産およびパッケージングのために設計された安定な細胞系統の生産を提案する。これらの細胞はウイルスの複製、アセンブリおよび機能に必要な成分の総てを産生することができるであろう。
高レベルのウイルスタンパク質により行う細胞傷害性のため、ミフェリプリストンのより誘導可能な転写調節系は遺伝子Ｅ１ａおよびＥ１ｂの発現を制御し、また、残りのアデノウイルスゲノムの発現および複製の命令も行う。この同じ系が、真核細胞のゲノムに組み込まれたアデノウイルスゲノムの遊離に必要なＩ−ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼの生産も制御し、これは第２のレベルの転写制御を提供する。この誘導（従って、ウイルス粒子の生産）は、培養培地にミフェリプリストンまたはその類似体ＲＵ４８６を添加した際に始まる。
生産プロセス中にヘルパーウイルスを使用する必要がないので、本発明者らにより開発された系によれば、ヘルパーウイルスのゲノムコピーを含むウイルス粒子の望ましくない残留混入のないウイルス抽出液を生産することができる。
本実施形態では、肺癌腫Ａ５４９のヒト細胞系統を、非依存性高容量ヘルパーベクターの生産系の設計に用いた。Giard et al (1973, J. Natl. Cancer Inst., 51: 1417-1423)により誘導され、その後、Lieber et al. (1976, Int. J. Cancer, 17: 62-70)により深く特性決定されたこの細胞系統は、アデノウイルス感染に対して感受性が高く、ウイルス生産系統として高い能力を与える(Smith et al., 1986, J. Clin. Microbiol, 24: 265-268)。これらの細胞はそれらの形態に変動なく容易に培養することができ、重要な分化シグナルを示さずに１０〜１４日の間生存を維持する。
実施例３．１：アデノウイルスゲノム（Ｂポリヌクレオチド）の安定な組込みのための、ｐＲｃＡｄ２プラスミドのトランスフェクションによる細胞系統の作出
高容量アデノウイルスの複製、キャプシド形成およびパッケージングに含まれるウイルスタンパク質の合成を実施可能なパッケージング細胞系統を生産するため、Ａ５４９細胞を１０ｃｍ２プレートにて３７℃、５％ＣＯ２で、集密度８０％に達するまでインキュベートした。これらの細胞をリポフェクタミンにより、３μｇのｐＲｃＡｄ２構築物（ネオマイシン耐性を与える（ｎｅｏｒ））と、放線菌ＰｈｉＣ３１ファージのインテグラーゼをコードし、細胞ゲノムへのプラスミドの安定な組込みを促進する１μｇのｐＣＭＶ−Ｉｎｔプラスミド(Groth et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 5995-6000)とで同時にトランスフェクトした（図６Ａ）。
両プラスミドのＤＮＡを予めＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清を含まない培地(Ｇｉｂｃｏ（登録商標）: Invitrogen, Carlsbad CA92008, USA)５００μｌで希釈した。ＤＮＡと陽イオン脂質の間の複合体の形成を促進するために、試薬Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ(Invitrogen)を１：０．７５比（ＤＮＡ： Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）で加えた。周囲温度で５分インキュベートした後、６μｌのリポフェクタミンＬＴＸ(Invitrogen)を加え、この混合物を再び周囲温度で２５分インキュベートした。次に、この希釈液を細胞培養培地：ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））；１％Ｌ−グルタミン（０．８５％ＮａＣｌ中２００ｍＭ；Lonza Iberica, 08006 Barcelona, Spain）；および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（０．８５％ＮａＣｌ中１０ｍｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を添加したＤＭＥＭに滴下した。３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、培地を新鮮なＤＭＥＭ培地に置き換え、インキュベーションをさらに２４時間継続した。最後に、培地を除去し、１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で洗浄した後に、トランスフェクト細胞をトリプシン（トリプシン−ＥＤＴＡ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標））ですすぎ、それらを周囲温度にて１２５０ｒｐｍで５分遠心分離した。細胞沈殿を６ｍｌの培養培地に再懸濁させ、それらを３枚の６０ｃｍ２プレートに分注した。新鮮培地（この場合、ネオマイシンの類似体である選択抗生物質Ｇ４１８を６００μｇ／ｍｌで添加）を加えた。抗生物質耐性の単離クローンが現れるまで（２〜３週間）、２日おきに培養培地を交換した。クローンを、トリプシンを用いて浮上させ、それらを選択培地の入った０．３ｃｍ２ウェルに移した。８０％の集密度に達するまでインキュベーションを続けた後、それらをより表面積の大きなウェルに移した。一連の工程の後、Ｇ４１８耐性クローンが単離され、これをｐＲｃ−１と呼んだ。クローンの安定性を証明するため、これらの細胞を４か月培養下で維持したところ、それらの形態または生存率に変化は見られなかった。
単離されたクローンにおけるｐＲｃＡｄ２プラスミドの組込みを確認するために、ｐＲｃ−１クローンのゲノムＤＮＡをＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット(Qiagen)系で製造業者の推奨に従って抽出した。このＤＮＡをネステッドＰＣＲアッセイで用い、アデノウイルス遺伝子ＩＩＩａ、ＩＶ、プロテアーゼをコードする遺伝子およびウイルスポリメラーゼをコードする遺伝子の存在を検出した。この検出に用いたプライマーは次のものであった。
Figure 2011521663
ネステッドＰＣＲの外部プライマー（プライマー１および２）を用いたＰＣＲ反応は、１Ｕの酵素Ｔａｑポリメラーゼ(BioTaq, Bioline)、ＰＣＲバッファー(Bioline)、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌの各プライマー、ＤＮＡおよび最終量５０μｌまでの無菌脱イオン水の存在下で行った。増幅条件は次の通りとした：９４℃ｄで２分、９４℃で５０秒の変性、５０秒のプライマーとのハイブリダイゼーション（Ｔｍは増幅する遺伝子に応じる、表参照）および７２℃で５０秒の伸長を１回；９４℃で５０秒の変性、５０秒のプライマーとのハイブリダイゼーション（Ｔｍは増幅する遺伝子に応じる、表参照）および７２℃で５０秒の伸長を３５回；７２℃で７分の最終伸長１回。ネステッドＰＣＲの内部プライマー（プライマー３および４）を用いた増幅反応は、２μ前ＰＣＲ反応物から、１Ｕの酵素Ｔａｑポリメラーゼ(BioTaq, Bioline)、ＰＣＲバッファー(Bioline)、ＭｇＣｌ２ ２．５ｍＭ、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌの各プライマー、ＤＮＡおよび最終量５０μｌまでの無菌脱イオン水の存在下で行った。この場合の増幅条件は、９４℃で５０秒の変性、５０秒のプライマーとのハイブリダイゼーション（Ｔｍは増幅する遺伝子に応じる、表参照）および７２℃で５０秒の伸長を３５回；７２℃で７分の最終伸長１回。
また、ａｔｔＢ領域の欠損も、プライマーａｔｔＢ−Ｐ１、ａｔｔＢ−Ｐ２を用いたＰＣＲ反応により確認した（実施例２）。ＰＣＲ反応は、１Ｕの酵素Ｔａｑポリメラーゼ(BioTaq, Bioline)、ＰＣＲバッファー(Bioline)、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌの各プライマー、ＤＮＡおよび最終量５０μｌまでの無菌脱イオン水の存在下で行った。増幅条件は次の通りとした：９５℃で４分の変性１回；９４℃で５０秒の変性、５０℃で４０秒の第一鎖とのハイブリダイゼーションおよび７２℃で４０秒の伸長を２９回；７２℃で５分の最終伸長１回。
増幅産物を分析するために、これらのサンプルを１．５μｌのローディング溶液（蒸留水中０．２５％のブロモフェノールブルー；４０％グリセロール；１００ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合し、それらを、ＴＡＥ １倍バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ；２０ｍＭ氷酢酸；ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ８．０）を用いたアガロースゲル（１％）での電気泳動により分析し、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）染色によりＤＮＡを表した。
得られた結果（図６Ｂ）により、真核細胞Ａ５４９のゲノムにＢポリヌクレオチドが適切に組み込まれていることが確認される。さらに、ａｔｔＢ領域の欠損から、この組込みがＰｈｉＣ３１インテグラーゼにより特異的かつ一方向で媒介されたことが確認される。
次に、アデノウイルス遺伝子の発現を調べるために、ｐＲｃ−１クローンを２０ｃｍ２プレートにて３７℃、５％ＣＯ２で８０％の集密度に達するまでインキュベートした。この時、これらの細胞を、前述の手順に従い、構築物ｐＧａｌ４−２ＲＵ−ＳｃｅＩ−Ｅ１の希釈液５μｇ、Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（１：０．７５）および１２μｌのリポフェクタミンＬＴＸでトランスフェクトした。トランスフェクションは、１０−８Ｍ濃度のＲＵ４８６インデューサーの存在下でプレートの１つを２回インキュベートすることにより行った。インキュベーション４８時間、１ｍｌのＴＲＩＺＯＬ(Invitrogen)を用い、総て製造業者の推奨に従って細胞を溶解させ、全ＲＮＡの抽出を行った。このＲＮＡをアデノウイルス遺伝子に対して特異的なプライマーを用いた逆転写アッセイ（ＲＴ）−ＰＣＲに用いた。
Figure 2011521663
これらのアッセイでは、１μｇのＲＮＡを予め、反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４；２ｍＭ ＭｇＣｌ２；５０ｍＭ ＫＣｌ）中、最終量１０μｌで、１ユニットのＤＮアーゼ(DNasaI amplification grade; Invitrogen)で処理した。この反応物を周囲温度で１５分インキュベートし、１μｌの２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加え、６５℃で１０分インキュベートすることによりＤＮアーゼを不活性化した。ｃＤＮＡ合成反応では、このＤＮＡ不含ＲＮＡ６２５ｎｇを用いた。逆転写反応は、サンプルを１０ｐｍｏｌの特異的プライマー、１μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）および最終量１３μｌまでの水と混合して開始した。６５℃で５分インキュベートした後、この混合物を氷中で冷却し、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴおよび４μｌの反応バッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；３７５ｍＭ ＫＣｌ；１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を用いた。最後に、３７℃で２分新たにインキュベートした後、２００ＵのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素(Invitrogen)を加え、インキュベーションを３７℃で５０分続けた。次に、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として用いて検討下の遺伝子の転写産物を増幅した。陰性対照として、また、ゲノムＤＮＡの混入が無いことを確認するために、いずれの場合にも、ＤＮアーゼで処理したＲＮＡを鋳型として用いる増幅反応を含めた。得られた逆転写反応のｃＤＮＡを用いたＰＣＲ反応に用いた増幅条件は、ゲノムＤＮＡの増幅反応で用いたものと同じであった。
図７に示すこれらのアッセイの結果から、真核細胞の染色体に安定に組み込まれたアデノウイルス遺伝子の転写能力が確認される。
最後に、ウイルスｍＲＮＡからウイルスタンパク質を産生する細胞の能力を確認するために、ウイルスキャプシドのタンパク質検出を免疫組織化学アッセイによりアッセイした。タンパク質合成を誘導するために、ｐＲｃ−１クローンを予め構築物ｐＧａｌ４−２ＲＵ−ＳｃｅＩ−Ｅ１でトランスフェクトした。トランスフェクションは２回行った。これらの細胞をＲＵ４８６インデューサーの存在下および不在下でインキュベートした。インキュベーション２４時間後、細胞をトリプシンで剥離し、８×１０４細胞を４セルカルチャースライド(four-cell cultureslide)(BD Falcon Cultureslide; BD Biosciences, Erembodegem 9320, Belgium)に移し、インデューサーＲＵ４８６を含む、および含まない培養培地を加えた。翌日、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。次に、それらを予め−２０℃に冷却したアセトン：メタノール（１：１）溶液で固定した。固定液を周囲温度で蒸発させ（３０分）、これらのスライドを１倍ＰＢＳに浸漬した。３分間ＰＢＳで３回洗浄した後、予めＰＢＳで希釈した（１：７５）一次抗体（マウス抗アデノウイルスモノクローナル抗体ブレンド；Millipore Iberica, 28050 Madrid, Spain）とハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーションは、暗所、加湿チャンバーにて、４℃で一晩行った。
翌日、余分な抗体をＰＢＳで洗浄し（３分で３回洗浄）、これを、この場合にもＰＢＳで希釈した（１：４００）二次抗体（イムノピュアヤギ抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ；Pierce Biotechnology, Rockford IL61105, USA）とハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーションを周囲温度、暗所で４５分インキュベートした。これらのサンプルを再び１倍ＰＢＳで３回洗浄し、それらを、ＤＡＢ色素原(DakoCytomation Liquid DAB Substrate Chromogen System; Dako Diagnosticos, Sant Just Desvern E-08960, Barcelona, Spain)を用い、製造業者の推奨に従って現像した。核を特異的に染色するためにこれらのサンプルをマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し（５秒）、１５分後に水洗し、サンプルを７０％、９６％および１００％アルコールに１分、そしてキシレンに１０分浸漬することで脱水した。
サンプルにおいて検出された茶色により、ウイルスキャプシドのタンパク質合成が確認される。インデューサー無しではこれらのタンパク質のわずかな基底生産が検出されるに過ぎないが、免疫細胞化学の結果はＲＵ４８６インデューサーの存在下でのウイルスタンパク質の発現レベルに対して明瞭な差を明らかにし、クローンｐＲｃ−１のゲノムに組み込まれたウイルス遺伝子発現の制御においてミフェリプリストン調節系が機能していることが確認される。
実施例３．２：Ｅ１領域とＩ−ＳｃｅＩ遺伝子を双方ともミフェリプリストンにより誘導可能な転写調節の制御下で組み込んだ安定な細胞系統を作出するための、ｐＧａｌ４−２ＲＵＳｃｅＩ−Ｅ１プラスミド（ポリヌクレオチドＡ）によるＡ５４９細胞のトランスフェクション
第２の実施形態では、本発明で定義されるようにＡ２ポリヌクレオチドが組み込まれた安定な細胞系統を設計した（図１Ａ）。よって、このようにして得られた細胞系統は、Ｂポリヌクレオチドに含まれるアデノウイルス遺伝子の発現の開始および制御に必要な遺伝子を有する。従って、これらの遺伝子、例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子とＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質をコードするＥ１アデノウイルス領域は、ミフェリプリストンにより調節されるプロモーターの制御下にある。調節因子ＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５はＡ２ポリヌクレオチドに含まれ、従って、それは細胞ゲノムに同時に組み込まれる。該トランスアクチベーターは改変された細胞により構成的に発現されることになる。
この細胞系統を得るために、Ａ５４９細胞を１０ｃｍ２プレートにて、３７℃、５％ＣＯ２で８０％の集密度に達するまでインキュベートした。これらの細胞を、リポフェクタミン法により、第３．１節に記載されている手順に従い、ｐＧａｌ４−２ＲＵＳｃｅＩ−Ｅ１構築物（ゼオマイシン耐性遺伝子（ｚｅｏｒ））でトランスフェクトし、ｐＲｃ−１クローンを得た。これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−Ｇｌｕおよび１％Ｐ／Ｓおよび４００μｇ／ｍｌ濃度の抗生物質ゼオマイシンを添加したＤＭＥＭ培地でインキュベートした。一連の増幅を行った後、抗生物質耐性クローンが単離され、これをＧａｌ−１３と呼んだ。ｐＲｃ−１クローンの場合と同様に、Ｇａｌ−１３クローンの安定性を、４か月を超える期間、連続３５回を超えて培養維持できるかどうかを試験した。
細胞のゲノムＤＮＡからのＰＣＲアッセイにより、アデノウイルス遺伝子Ｅ１ａおよびＥ１ｂの存在、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子の存在および転写を調節し、ミフェリプリストンにより誘導可能なＧＡＬ４タンパク質−ｈＰＲ−ｐ６５融合物をコードする遺伝子の存在が確認された。用いたプライマーは、
Figure 2011521663
細胞のゲノムＤＮＡを、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット系(Qiagen)を用い、製造業者の推奨に従って抽出し、ＰＣＲ反応は、１Ｕの酵素Ｔａｑポリメラーゼ(BioTaq, Bioline)、ＰＣＲバッファー(Bioline)、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌの各プライマー、ＤＮＡおよび最終量５０μｌまでの無菌脱イオン水の存在下で行った。増幅は次の通りとした：９５℃で４分の変性１回；９４℃で５０秒の変性、５０℃で４０秒の第一鎖とのハイブリダイゼーションおよび７２℃で４０秒の伸長を２９回；７２℃で５分の最終伸長１回。増幅産物の分析のため、これらのサンプルを１．５μｌのローディング溶液（蒸留水中０．２５％ブロモフェノールブルー；４０％グリセロール；１００ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合し、それらをＴＡＥ １倍バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ；２０ｍＭ氷酢酸；１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を用い、アガロースゲル（１％）での電気泳動により分析し、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）染色によりＤＮＡを表した。増幅結果により、Ａ５４９系統のゲノム内にＡ２ポリヌクレオチドに含まれる遺伝子が適切に組込まれていることが確認された（図８）。
次に、ミフェリプリストンにより誘導可能な系の遺伝子発現の調節能を確認するために、ウエスタンブロットを行い、１０−８Ｍ濃度のＲＵ４８６インデューサーの存在下および不在下でインキュベートした培養物から得られたタンパク質サンプルに由来するＥ１ＡおよびＩ−ＳｃｅＩタンパク質の合成を分析した。これらのタンパク質抽出液を５００μｌのＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓバッファー１倍(Promega)で精製し、総タンパク質レベルをタンパク質定量のためのブラッドフォード法(Bradford, 1976, Anal. Biochem., 72: 248-254)を用いて測定した。これらのサンプルを不連続ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルおよびＬａｅｍｌｉ電気泳動バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ；１９２ｍＭグリシン；０．１％ｗ／ｖ ＳＤＳ）での電気泳動により分析した。分解ゲルは０．１％ＳＤＳとともに、０．３９Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．８）中１２％のポリアクリルアミドからなった。触媒として０．１％ＰＳＡおよび０．９４％ＴＥＭＥＤを用いた。その一部として、スタッキングゲルは０．１％ＳＤＳ、０．１％ＰＳＡおよび０．０１％ＴＥＭＥＤとともに、０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）中５％のポリアクリルアミドからなった。これらのサンプルを４℃で２時間、トランスファーバッファー（０．３％Ｔｒｉｓ−Ｂａｓｅ；１８６ｍＭグリシン；２０％メタノール）中のＨｙｂｏｎｄ−Ｆメンブラン(GE Healthcare Europe)に移した。次に、このメンブランを４℃で一晩、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中、５％ミルク溶液でブロッキングした。一次抗体とのハイブリダイゼーションは、周囲温度で１．５時間、１％ミルク＋ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液中で行った。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０分間３回洗浄して余分な抗体を除去した。二次抗体とのハイブリダイゼーションは、周囲温度で３０分、１％ミルク＋ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で行った。Ｅ１Ａタンパク質の検出において、抗アデノウイルス２ Ｅ１Ａ抗体（マウス）（１：５００）(Calbiochem（登録商標）: EMD, La Jolla CA92039-2087, USA)を、そして、二次抗体としてイムノピュアヤギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ（１：５０００）(Pierce Biotechnology)を用いた。Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質の場合には、ただ１つの抗体、抗ＨＡ−ペルオキシダーゼ高親和性（１：５００）(Roche Diagnostics, 08174 Barcelona, Spain)を用いた。このメンブランをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０分間３回洗浄した後、それを現像した。これを行うため、Western lightning化学発光試薬系(Perkin-Elmer, 28760 Madrid, Spain)を製造業者の推奨に従って用いた。得られた結果を図９に示し、これらは分析したタンパク質の適正な生産ならびにインデューサーの存在下でのこれらのタンパク質の発現レベルの増大を実証する。しかしながら、インデューサーの不在下でも、調節を受けたタンパク質の基底発現が存在することを考慮する必要がある。
実施例３．３：Ｇａｌ４−２ＲＵＳｃｅＩ−Ｅ１（ポリヌクレオチドＡ）およびｐＲｃＡｄ２（Ｂポリヌクレオチド）プラスミドでのＡ５４９細胞の二重トランスフェクションによる安定な細胞系統の作出
ウイルス粒子の生産に必要な遺伝子を総て備えたユニークな細胞系統を得るために、ゼオマイシン耐性クローンＧａｌ−１３（実施例３．２）を、残りのアデノウイルス遺伝子を含んだｐＲｃＡｄ２（ｎｅｏｒ）構築物およびＰｈｉＣ３１インテグラーゼをコードするｐＣＭＶ−Ｉｎｔプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション条件はＧａｌ−１３クローンを得るのに用いたものと同じであり、選択は抗生物質Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ）およびゼオマイシン（４００μｇ／ｍｌ）の存在下で行った。この選択により、２つの二重耐性クローン（ｚｅｏｒ＋ｎｅｏｒ）が得られ、これらをそれぞれＧＡｄ−１およびＧＡｄ−６と呼んだ。両クローンの形態的特徴は親系統(parenteral line)Ａ５４９およびその誘導体Ｇａｌ−１３と大きく異なる。これらの新規なトランスフェクトクローンは球形で、小さい傾向がある。この形態変化はおそらくＧａｌ−１３クローンで事前に検出されたＥ１遺伝子の基底転写のためであり、ｐＲｃＡｄ２プラスミドにクローニングされ、細胞ゲノムに挿入されたアデノウイルス遺伝子の残りの部分の転写を必然的に伴う。しかしながら、ウイルスタンパク質レベルは、それらを４か月を超える期間培養維持した後に確認されたように、細胞の安定性および生存力に有意な影響を及ぼさない。
ＧＡｄ−１およびＧＡｄ−６クローンにｐＲｃＡｄ２プラスミドが組み込まれていることを確認するため、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット系(Qiagen)を用い、製造業者の推奨に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをネステッドＰＣＲアッセイに用い、アデノウイルス遺伝子ＩＩＩａ、ＩＶ、プロテアーゼをコードする遺伝子およびウイルスポリメラーゼをコードする遺伝子の存在を検出した。この検出の用いたプライマーは第３．１節で用いたものと同じであった。同様に、増幅反応も第３．１節の記載と同様に行った。
増幅産物は、ＴＡＥ１倍バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ；２０ｍＭ氷酢酸；１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）用いたアガロースゲル（１％）での電気泳動により分析し、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）染色によりＤＮＡを可視化した（図１０）。
ウイルスタンパク質の合成を確認するために、ウイルスキャプシドに対する免疫組織化学アッセイを設計した。この場合、ＧＡｄ１およびＧＡｄ６クローンを１０−８Ｍ濃度のＲＵ４８６インデューサーの存在下および不在下の双方で４８時間インキュベートした。次に、６×１０４細胞を４ウェル培養プレート(BD Falcon Cultureslide; BD)に移し、ｐＲＣ−１クローン(pRc-1 cline)の場合（実施例３．１）と同様に行った。一次抗体として、ＰＢＳで希釈した（１：７５）マウス抗アデノウイルスモノクローナル抗体ブレンド(Millipore)抗体を用い、二次抗体として、これもまたＰＢＳで希釈した（１：４００）抗体イムノピュアヤギ抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ(Pierce Biotechnology)を用いた。
このサンプルにおいて検出される茶色によりウイルスキャプシドのタンパク質合成が確認される。しかしながら、ＲＵ４８６インデューサーの存在下でインキュベートしたサンプルとその不在下でインキュベートしたサンプルの間に明らかな違いは検出されなかった。よって、細胞ゲノムに組み込まれたアデノウイルス遺伝子の残りの部分の発現を開始させるには、転写レギュレーターＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５の制御を逃れたＥ１タンパク質の基本発現で十分である。
実施例４：ＫＣＺガットレスウイルスの感染性粒子の生産およびパッケージング
実施例４．１：２つのプラスミドでのコトランスフェクション系によるｐＲｃ−１パッケージン系統におけるＫＣＺウイルスの生産およびパッケージング
本実施例では、実施例３．１で作出された細胞系統から選択されたクローンを、高容量アデノウイルスまたはガットレスアデノウイルスの生産およびパッケージングに用いた。この生産系により、ｐＲｃＡｄ２プラスミドに欠失している遺伝子の補足としてのヘルパーウイルスを使用する必要なく、真核細胞の染色体に安定に組み込まれる高容量アデノウイルスの抽出液を得ることができる。
Ｅ１領域の欠損を補うために、この系は、生産工程のそれぞれで細胞系統をｐＧａｌ４−２ＲＵ−ＳｃｅＩ−Ｅ１プラスミドでトランスフェクトすることを必要とする。この補足プラスミドは、ミフェリプリストンにより調節される誘導プロモーターから遺伝子Ｅ１ａおよびＥ１ｂを発現し（図１Ａ）、これにより残りのアデノウイルス遺伝子の発現が始まる。さらに、組み込まれたウイルスゲノムの複製は、ｐＧａｌ４−２ＲＵ−ＳｃｅＩ−Ｅ１プラスミドに含まれ、また、ＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５レギュレーターにより転写レベルで制御されるＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼの発現時にのみ可能である。ウイルスゲノムの放出およびその複製の開始によってその複数のコピー、従って、高容量アデノウイルスのキャプシド封入およびその高力価での精製に十分なレベルのウイルスタンパク質が取得可能となる。
この系が感染性粒子を生産することができるかどうかを調べるために、８×１０５細胞のｐＲｃ−１クローンを２０ｃｍ２のディッシュにて３７℃、５％ＣＯ２で、８０％の集密度に達するまでインキュベートした。次に。これらの細胞を、５μｇのｐＧａｌ４−２ＲＵ−ＳｃｅＩ−Ｅ１プラスミド、および制限酵素Ｐｍｅ１で消化して複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子を除去し、ベクターのＩＴＲ末端をフリーとした１２μｇのＫＣＺガットレスベクターでコトランスフェクトした。リポーター遺伝子として、ＫＣＺベクターは細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を有する。
このコトランスフェクションでは、真核細胞でのＤＮＡインターナリゼーションのための系としてリポフェクタミンを用いた。よって、両プラスミドのＤＮＡを予め、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））血清を含まない１ｍｌの培地で希釈した。ＤＮＡと陽イオン脂質の間の複合体の形成を促進するために、Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ(Invitrogen)試薬を１：０．７５比で加えた。周囲温度で５分インキュベートした後、１２μｌのリポフェクタミンＬＴＸ(Invitrogen)を加え、この混合物を再び周囲温度で２５分インキュベートした。次に、この希釈液を細胞培養培地（１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ）に滴下した。
３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、培地を２％ウシ胎児血清および１０−８Ｍ濃度のＲＵ４８６インデューサーを添加した新鮮なＤＭＥＭ培地に置き換えた。
明瞭な細胞変性作用が見られなかったので、これらの細胞を４８〜１２０時間の間でインキュベートし、その後、種々の時点でそれらの固有の培地に採取した。１２５０ｒｐｍで５分遠心分離を行った後、沈殿を２００μｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁させ、これらの細胞を冷凍／解凍を３回繰り返すことにより溶解させた。
細胞残渣を遠心分離し、上清の力価を、ＫＣＺベクターの調製物に感染させた２９３Ｓ細胞のＸ−ｇａｌ染色により測定した。これを行うため、２９３Ｓ細胞を２ｃｍウェルにて２％ウシ胎児血清および１％ピルビン酸Ｎａを添加したＤＭＥＭ培地で８０％の集密度に達するまで増殖させた。次に、培養培地を除去し、細胞を２％ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ＋１％ピルビン酸Ｎａ中、ウイルス抽出液の連続希釈液で感染させた。３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、新鮮培地を加え、さらに４８時間インキュベーションを続けた。最後に、細胞をＰＢＳ中０．５％のグルタルアルデヒド溶液中、周囲温度で１０分固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、３７℃にて４時間、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ６）および５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ６）を添加したＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド）で染色した。
得られた結果によれば、ｐＲｃ−１クローンを生産およびパッケージング系統として用いた場合、継代０代までの生産は４８〜７２時間後にその最大レベルに達し、７×１０５感染単位（ｕｉ）／ｍｌ前後である（図１１）。連続的増幅の実施では、これらの抽出液を、予めｐＧａｌ４−２ＲＵ−ＳｃｅＩ−Ｅ１プラスミドでトランスフェクトした新たなｐＲｃ−１細胞の感染に用いた。従って、記載の系は、ヘルパーウイルスに由来する感染性粒子を含まない高容量アデノウイルスの抽出液の回収ならびに高い生産レベルでのそれらの取得を可能とする。
実施例４．２：ＧＡｄ−１およびＧＡｄ−６クローンの細胞におけるＫＣＺウイルスの生産およびパッケージング。高容量ベクターを用いたユニークなトランスフェクション系
下記の生産系は、本発明で記載したＡ２およびＢポリヌクレオチドが安定に組み込まれている改良系統をパッケージング細胞として用いる（図１Ａ、１Ｂ）。高容量アデノウイルスベクターに相当するポリヌクレオチドを除き、この細胞系統は感染力を有するウイルス粒子の生産のために付加的な要素（プラスミドまたはウイルスヘルパー）を何も必要としない。
この系は、キャプシド封入および高容量アデノウイルスの複製に必要なアデノウイルス遺伝子（Ｂポリヌクレオチド）ならびに従来のウイルスタンパク質の高レベルでの制御発現に必要なＥ１領域およびＩ−ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼの遺伝子（Ａ２ポリヌクレオチド）を単一の細胞に組み込む。最後に、この生産プロセスの開始は、その対応する誘導プロモーターおよび転写アクチベーターＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５からのＥ１領域および制限エンドヌクレアーゼの遺伝子の発現により調節される。
この感染性粒子生産の例では、ＧＡｄ−６およびＧＡｄ−１パッケージング系統を、実施例４．１に示されるように、β−ガラクトシダーゼのリポーター遺伝子をコードし、予めＰｍｅ１制限酵素で線状化した１２μｇのＫＣＺガットレスベクターでトランスフェクトした。高容量ベクターでのトランスフェクションは、ｐＲｃ−１パッケージング系統を用いた生産系に記載されている手順（実施例４．１）に従って行った。
これらの細胞を、２％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地中、１０−８Ｍ濃度のＲＵ４８６インデューサーの存在下で４８〜１２０時間の間インキュベートした。種々の時点で細胞を採取し、１２５０ｒｐｍで５分遠心分離し、最後に、２００μｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁させた。冷凍／解凍を３回繰り返すことでそれを溶解させた後、細胞残渣を遠心分離し、上清を２９３Ｓ細胞系統にて、従前の実施例に記載されているプロトコールに従って滴定した。
ＧＡｄ−１クローンを生産およびパッケージング系統として用いた場合、継代０代の生産レベルは最大１．７×１０６感染単位（ｕｉ／ｍｌ）であったが、ＧＡｄ−６クローンでは滴定値３×１０６ｕｉ／ｍｌ（図１２）が得られた。
従前の実施例と同様に、これらの抽出液を、連続増幅実施中の新たなパッケージング細胞の感染に用いた。本実施形態に記載されている系は、２つのプラスミドでコトランスフェクトするこれまでの系（実施例４．１）またはウイルス増幅実施中の各段階でパッケージング細胞のトランスフェクション／感染プロセスを排除することによる他のヘルパー依存系とは異なる。この特徴は生産時間を十分短縮し、その収量を増大する。他の大きな利点は、ヘルパーウイルスの混入が無いことであり、これにより、ウイルス精製プロセスが簡単になり、ヒトにおける遺伝子療法手順に用いるのに十分な量の生産が可能となる。
Ａ．本発明によるＡ２ポリヌクレオチドを含んでなるｐＧａｌ４−２ＲＵ−Ｅ１−ＳｃｅＩプラスミドの模式図。ＡＩ：転写レギュレーター（この場合、ＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５）をコードするヌクレオチド配列。ＡＩＩ：アデノウイルスＥ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列。ＡＩＩＩ：制限エンドヌクレアーゼ（この場合、サッカロミセス・セレビシエ(Sacharomyces cerevisiae)のＩ−ＳｃｅＩ）をコードするヌクレオチド配列。ｒＰＩＩおよびｒＰＩＩＩ：転写レギュレーターＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５により調節することができ、それぞれＥ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質およびＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼの転写および発現を命令するプロモーター。この実施形態では、各プロモーター領域は、ＧＡＬ４のＵＡＳ（上流活性化配列）配列と連結されているアデノウイルスＥ１ｂ（ＰＥ１ｂ）遺伝子のＴＡＴＡボックスの配列を含んでなり、ここで、両プロモーターは同じＵＡＳ結合配列を共有する。この場合、転写レギュレーターＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５の転写および発現を命令するプロモーター領域は、これもまたＧＡＬ４のＵＡＳ（上流活性化配列）に連結されているチミジンキナーゼの最小プロモーター（Ｐｔｋ）を含んでなる。３つの転写ユニット（ＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５、Ｅ１Ａ／Ｅ１ＢおよびＩ−ＳｃｅＩ）はそれぞれポリアデニル化シグナル（ｐＡ）を完備している。ｐＵＣｏｒｉ：ｐＧａｌ４−２ＲＵ−Ｅ１−ＳｃｅＩプラスミドの構築の基礎として用いるｐＧｅｎｅＶ５−ＨｉｓＡ プラスミドの複製起点。Ａｍｐ：Ｚｅｏ耐性細菌の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子。Ｚｅｏ：真核細胞において耐性クローンを選択するためのゼオシン(Zeocyn)抗生物質耐性遺伝子。ＳＶ４０：Ｚｅｏｒ耐性遺伝子の発現を命令するＳＶ４０プロモーター。 Ｂ．本発明によるＢポリヌクレオチドを含んでなるｐＲｃ／Ａｄ２プラスミドの模式図。ＢＩ：Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質およびパッケージングシグナルΨをコードする領域を除く、アデノウイルス（この場合、血清型５）のゲノムをコードするヌクレオチド配列。このヌクレオチド配列はＩＴＲ（逆方向末端反復）配列を境界としている。ＢＩＩ：制限エンドヌクレアーゼ（この場合、Ｉ−ＳｃｅＩ）の特異的標的配列。ＢＩＩＩ：真核細胞のゲノムへのプラスミドの組込みを助けるヌクレオチド配列ａｔｔＢ。このプロセスは特異的、かつ、一方向性のＰｈｉＣ３１レコンビナーゼにより媒介される。ｃｏｌＥ１：ｐＲｃＡｄ２プラスミドの構築の基礎として用いるＰＲＣ／ＲＳＶプラスミドの複製起点。Ａｍｐ：細菌耐性クローンの選択のためのアンピシリン耐性遺伝子。Ｎｅｏ：真核細胞における耐性クローンの選択のためのネオマイシン抗生物質耐性遺伝子。ＳＶ４０：Ｎｅｏｒ耐性遺伝子の発現を命令するＳＶ４０プロモーター。ｐＡ：ポリアデニル化シグナル。 ミフェプリストンにより誘導される遺伝子発現の転写制御のための市販の系ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）(Invitrogen)。 Ａ．酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４−ＤＢＤ）、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ−ＬＢＤ）のリガンド結合ドメインおよびヒトＮＦ−κＢタンパク質の活性化ドメイン（ｐ６５−ＡＤからなる融合タンパク質の発現のためのｐＳｗｉｔｃｈプラスミド。転写アクチベーターＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５の発現はチミジンキナーゼの最小プロモーター（Ｐｔｋ）の制御下にある。活性型タンパク質がこのプロモーターに連結されているＧＡＬ４−ＵＡＳ配列に結合することで、その固有の発現が調節される。 Ｂ．目的遺伝子のクローニングのために結成されたｐＧｅｎｅＶ５−ＨｉｓＡプラスミド。クローニングされた遺伝子の発現は、Ｅ１ｂのＴＡＴＡボックスと転写アクチベーターに対する結合配列（ＧＡＬ４−ＵＡＳ）により構成されるプロモーター（ＰＥ１ｂ）の制御下にある。 Ｃ．ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）系活性化のメカニズム。インデューサーが存在すると、転写アクチベーターとして働き、かつ、ｐＳｗｉｔｃｈプラスミドにより構成的に発現される融合タンパク質の構造変化がもたらされる。このコンフォメーション変化は、不活性な状態からその活性な状態になる分子の二量体化からなる。このホモ二量体は、その発現を活性化する目的遺伝子のプロモーター領域（プラスミドｐＧｅｎｅＶ５−ＨｉｓＡ）およびこの場合、正のフィードバック反応を開始する転写レギュレーターの発現を制御するプロモーター領域（ｐＳｗｉｔｃｈプラスミド）に存在する特異的配列（ＧＡＬ４−ＵＡＳ）と結合する能力を有する。 ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）系由来のＥ１ａ、Ｅ１ｂおよびＩ−ＳｃｅＩの転写制御のために設計された調節系のスキーム。ｐＧｅｎｅ−Ｅ１−ＳｃｅＩおよびｐ２ＲＵ−Ｅ１−ＳｃｅＩ構築物は転写レギュレーターＧＡＬ４−ｈＰＲ−ｐ６５の発現のためのｐＳｗｉｔｃｈプラスミドの存在を必要とする。他方、構築物ＰＲＵ−Ｅ１−ＳｃｅＩおよびｐＧａｌ４−２ＲＵ−ＳｃｅＩ−Ｅ１は、単一の構築物中に、Ｅ１領域の遺伝子（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ）、Ｉ−ＳｃｅＩ遺伝子、およびその特異的プロモーター領域とともにレギュレーター融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。これらの遺伝子は総て、転写アクチベーター結合配列（ＵＡＳ）を有するプロモーター（白い矢印）の制御下にある。転写ユニットはそれぞれポリアデニル化シグナル（ＰＡ）を完備している。 放線菌(streptomyces)ファージのＰｈｉＣ３１インテグラーゼにより媒介される外因性ＤＮＡの特異的組込み。哺乳類細胞では、このインテグラーゼは、目的遺伝子とともにベクターに挿入されたａｔｔＢ配列と細胞の染色体に存在するｐｓｅｕｄｏ−ａｔｔＰ配列の間の組換えを促進するために用いられる。結果として、元の組換え配列は失われ、この組み込まれたベクターはａｔｔＲ領域とａｔｔＬ領域に隣接される。 ＰａｃＩ（Ｐ）での消化によりｐＴＧ３６０２プラスミドから精製された血清型５アデノウイルスのゲノムの相同配列と、ＸｂａＩ（Ｘ）で線状化されたｐＲＣ／Ａ６−Ａ７構築物の間の組換えプロセス。数字は各相同領域のアデノウイルスゲノム内の位置を示す。ｐＲＣ／Ａ６−Ａ７プラスミド内で、アデノウイルス配列はＩ−ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼの標的配列（Ｓ）により隣接され、５’末端では、哺乳類細胞ゲノムへのプラスミドの組込みのためにａｔｔＢ配列が挿入されている。組換えプロセスから生じたｐＲｃＡｄ２プラスミドは、１９０と３５２８の間（Ｅ１ａおよびＥ１ｂのコード配列に相当する領域）が欠失したアデノウイルスゲノムを含む。ＩＴＲ：逆方向末端反復配列。ｃｏｌＥ１：ｐＲｃＡｄ２プラスミドの構築の基礎として用いるｐＲＣ／ＲＳＶプラスミドの複製起点。Ａｍｐ：細菌耐性クローンの選択のためのアンピシリン耐性遺伝子。Ｎｅｏ：真核細胞における耐性クローンの選択のためのネオマイシン抗生物質耐性遺伝子。ＳＶ４０：ＳＶ４０プロモーター。ｐＡ：ポリアデニル化シグナル。 Ａ．Ｐｈｉ３１レコンビナーゼにより媒介される真核細胞系統におけるｐＲｃＡｄ２プラスミドの安定な組込み。この挿入部は配列ａｔｔＬとａｔｔＲに隣接されており、プラスミドのａｔｔＢ領域と細胞ゲノムのｐｓｅｕｄｏ−ａｆｆＰ配列の間の組換えの産物である。Ｓ：Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼの標的。Ｚｅｏ：ゼオマイシン耐性遺伝子。 Ｂ．アデノウイルス遺伝子ＩＩＩａ、ＩＶ、プロテアーゼ（Ｐｒ）および安定なクローンｐＲｃ−１の精製ゲノムＤＮＡに由来するウイルスポリメラーゼ（Ｐｏｌ）をコードする遺伝子のネステッドＰＣＲによる検出。電気泳動の結果は、各遺伝子に関して第１の内部に特異的に設計された増幅反応の分析に相当する。このｐＲｃ−１クローンをａｔｔＢ配列の検出に関しても試験した。この増幅の陰性結果により、Ｐｈｉ３１レコンビナーゼにより媒介される特異的組込みが確認される。（−）：ＰＣＲの陰性対照。（＋）：ＰＣＲの陽性対照。Ｍ：分子量マーカー(1Kb Plus DNA Ladder, Invitrogen)。 アデノウイルス遺伝子ＩＶａ２、ＩＩＩおよびＥ４領域の３４ＫｄのＯＲＦのＲＴ−ＰＣＲ。このｃＤＮＡは、ＲＵ４８６インデューサーの不在下（１）および存在下（２）でインキュベートした細胞から抽出した全ＲＮＡのサンプルから得られたものである。（＋）：ＰＣＲの陽性対照。Ｍ：分子量マーカー(1Kb Plus DNA Ladder, Invitrogen)。 転写レギュレーターＧＡＬ４、Ｉ ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよびアデノウイルスのＥ１領域の遺伝子（Ｅ１ａおよびＥ１ｂ）をコードする遺伝子の、安定なクローンＧａｌ−１３のゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅による検出。（−）：ＰＣＲの陰性対照。（＋）：ＰＣＲの陽性対照。Ｍ：分子量マーカー(1Kb Plus DNA Ladder, Invitrogen)。 Ｅ１Ａタンパク質（Ａ）およびＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ（Ｂ）を検出するためのウエスタンブロットアッセイ。ＲＵ４８６インデューサー不在下（１）および存在下（２）でインキュベートした細胞からタンパク質抽出液を回収した。Ｅ１Ａタンパク質ＧＡＤＰＨの陽性対照、すなわち、ウエスタンブロット試験の陽性対照として２９３Ｓ細胞系統を試験した。 アデノウイルスＩＩＩａ、ＩＶ、プロテアーゼ（Ｐｒ）遺伝子ならびに安定なクローンＧＡｄ−１およびＧＡｄ−６の精製ゲノムＤＮＡに由来するウイルスポリメラーゼ（Ｐｏｌ）をコードする遺伝子のネステッドＰＣＲによる検出。電気泳動の結果は、各遺伝子に関して特異的に設計された内部プライマーを用いた増幅反応の分析に相当する。（−）：ＰＣＲの陰性対照。（＋）：ＰＣＲの陽性対照。Ｍ：分子量マーカー(1Kb Plus DNA Ladder, Invitrogen)。 パッケージング系統として安定なクローンｐＲｃ−１を用いた場合の、０代目におけるＫＣＺガットレスアデノウイルスの生産。トランスフェクションから４８時間、７２時間、９６時間および１２０時間後にウイルス抽出液を回収し、それらを２９３Ｓ細胞系統で滴定した。得られたウイルスのレベルは３回の独立した実験の平均であり、感染単位（ＩＵ）／ｍｌで表す。 パッケージング系統として安定なクローンＧＡｄ−１およびＧＡｄ−６を用いた場合の、継代０代目におけるＫＣＺガットレスアデノウイルスの生産。トランスフェクションから４８時間、７２時間、９６時間および１２０時間後にウイルス抽出液を回収し、それらを２９３Ｓ細胞系統で滴定した。得られたウイルスのレベルは３回の独立した実験の平均であり、感染単位（ＩＵ）／ｍｌで表す。

Claims (28)

  1. （ａ）転写レギュレーターをコードするヌクレオチド配列を含んでなる第１の発現カセット；
    （ｂ）制限エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、（ａ）で定義されたポリヌクレオチドによりコードされる転写レギュレーターにより活性化可能な転写調節配列の機能的制御下にある、第２の発現カセット
    を含んでなる、ポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  2. カセット（ａ）によりコードされている転写レギュレーターが、活性化可能な転写レギュレーターである、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  3. 活性化可能な転写レギュレーター（ａ）が、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、ヒトプロゲステロン受容体のリガンド結合ドメインおよびＮＦ−κＢ ｐ６５の活性化ドメインにより形成される、請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  4. カセット（ｂ）によりコードされている制限エンドヌクレアーゼが、Ｉ−ＳｃｅＩである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  5. （ａ）転写レギュレーターをコードするヌクレオチド配列を含んでなる第１の発現カセット；
    （ｂ）制限エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、転写レギュレーター（ａ）により活性化可能な転写調節配列の機能的制御下にある、第２の発現カセット、および
    （ｃ）選択されたアデノウイルスＥ１Ａタンパク質、またはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、転写レギュレーター（ａ）により活性化可能な転写調節配列の機能的制御下にある、第３の発現カセット
    を含んでなる、ポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  6. 第２および第３のカセットが反対方向に転写される、請求項５に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  7. 第２および第３のカセットを制御する転写のレギュレーター配列が、転写レギュレーター（ａ）と同じ結合部位を共有する、請求項６に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  8. カセット（ａ）によりコードされている転写レギュレーターが、活性化可能な転写レギュレーターである、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  9. 活性化可能な転写レギュレーター（ａ）が、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、ヒトプロゲステロン受容体のリガンド結合ドメインおよびＮＦ−κＢ ｐ６５の活性化ドメインにより形成される、請求項８に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  10. 第２カセット（ｂ）によりコードされている制限エンドヌクレアーゼがＩ−ＳｃｅＩである、請求項５〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  11. 少なくとも、Ψパッケージング配列とＥ１Ａタンパク質またはＥ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質をコードする配列を欠いている組換えアデノウイルスのゲノムを含んでなるヌクレオチド配列を含んでなり、組換えアデノウイルスゲノムを含んでなる該配列が、制限エンドヌクレアーゼに対する特異的認識配列により隣接されている、ポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  12. インテグラーゼによる特異的認識のためのヌクレオチド配列をさらに含んでなり、該インテグラーゼ認識配列が、制限エンドヌクレアーゼの第１の認識配列に対して５’位にある、請求項１１に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  13. インテグラーゼによる認識のためのヌクレオチド配列が、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼに特異的なａｔｔＢである、請求項１２に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  14. エンドヌクレアーゼの認識配列が、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼに特異的である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
  15. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含んでなる、宿主細胞。
  16. アデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードする配列および、場合により、アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列をさらに含んでなる、宿主細胞。
  17. 請求項５〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含んでなる、宿主細胞。
  18. 請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の、または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞への請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの組込みにより得ることができるポリヌクレオチドまたは発現ベクターをさらに含んでなる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  19. 請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクターに由来するウイルスゲノムを隣接する制限標的が、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに由来する転写レギュレーター（ａ）により活性化可能な転写レギュレーター配列の機能的制御下にあるエンドヌクレアーゼ制限により特異的に認識される、請求項１８に記載の細胞。
  20. 高容量アデノウイルスの感染性粒子の生産およびパッケージングに好適な細胞の生産方法であって、
    （ｉ）細胞を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の第１のポリヌクレオチドもしくは該ポリヌクレオチドを含んでなるベクターで、または請求項５〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドもしくは該ポリヌクレオチドを含んでなるベクターでトランスフェクトすること、および
    （ｉｉ）該細胞を、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含んでなるベクターでトランスフェクトすること
    を含んでなり、工程（ｉ）および（ｉｉ）は任意の順序でまたは同時に行うことができ、かつ、工程（ｉ）において細胞が請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドでトランスフェクトされる場合には、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質および、場合により、アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列を含んでなる細胞が用いられる、方法。
  21. 工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、工程（ｉ）および（ｉｉ）で用いられたポリヌクレオチドに存在する選択マーカーに基づいて、第１および／または第２のポリヌクレオチドを安定に組み込んだ細胞が選択される付加的な選択工程を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが、インテグラーゼによる特異的認識のためのヌクレオチド配列をさらに含んでなり、工程（ｉｉ）で実施されるトランスフェクションが、該認識配列に特異的なインテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 特異的インテグラーゼが放線菌ＰｈｉＣ３１ファージのインテグラーゼであり、特異的認識部位がａｔｔＢ部位である、請求項２２に記載の方法。
  24. 請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法によって生産することができる、細胞。
  25. （ａ）請求項１５〜１９および２４のいずれか一項に記載の細胞、および
    （ｂ）高容量アデノウイルス
    を含んでなる、高容量アデノウイルスの生産のための系。
  26. 高容量アデノウイルスベクターの生産方法であって、
    （ａ）宿主細胞を、生産を意図する高容量アデノウイルスのゲノムを含んでなるポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでトランスフェクトするか、または感染させる工程、
    （ｂ）該トランスフェクト／感染細胞を高容量アデノウイルスの複製およびパッケージングを可能とするのに十分な条件下で培養する工程、
    （ｃ）高容量アデノウイルスのウイルス粒子を回収する工程、および、場合により、
    （ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程（工程（ｃ）で生産された高容量ウイルス粒子を次のサイクルの工程（ａ）で用いる）
    を含んでなり、
    工程（ａ）で用いられる宿主細胞が、
    （ｉ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質および、場合により、アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列とを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクション工程が行われる）、
    （ｉｉ）請求項５〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクション工程が行われる）、
    （ｉｉｉ）請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドでのトランスフェクション工程が行われ、該細胞はアデノウイルスＥ１Ａタンパク質および、場合により、アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列を含んでなる）、
    （ｉｖ）請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる細胞（この場合には、工程（ａ）に先立ち、または同時に、請求項５〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクション工程が行われる）、
    （ｖ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、ならびにアデノウイルスＥ１Ａタンパク質および、場合により、アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする配列を含んでなる細胞、および
    （ｖｉ）請求項５〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる細胞
    からなる群から選択される、方法。
  27. 工程（ｂ）の培養が、請求項１〜４および５〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド配列によりコードされる転写レギュレーターの特異的誘導剤の存在下で行われる、請求項２６に記載の方法。
  28. 転写レギュレーターが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、ヒトプロゲステロン受容体のリガンド結合ドメインおよびＮＦ−κＢ ｐ６５の活性化ドメインにより形成され、誘導剤が、合成抗プロゲスチン、好ましくは、ミフェプリストンである、請求項２７に記載の方法。
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