KR20080007832A

KR20080007832A - Ｃａｇ 프로모터를 포함하는 아데노바이러스용 재조합 셔틀벡터

Info

Publication number: KR20080007832A
Application number: KR1020060066992A
Authority: KR
Inventors: 박국인
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2006-07-18
Filing date: 2006-07-18
Publication date: 2008-01-23
Also published as: KR100808269B1

Abstract

본 발명은 CAG 프로모터를 포함하는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 CMV 즉시초기 인핸서(cytomegalovirus immediate early enhancer), 서열번호 2의 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter) 및 서열번호 3의 토끼 β-글로빈 종결자(rabbit β-globin terminator)를 포함하는 CAG 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 구조유전자를 포함하는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 발현벡터는 숙주세포내에서 단백질을 효과적으로 발현할 수 있다. 따라서 본 발명의 재조합 발현벡터는 아데노바이러스를 이용한 숙주세포의 형질전환에 유용하게 사용될 수 있다.

아데노바이러스, 재조합 발현벡터, CAG 프로모터

Description

ＣＡＧ 프로모터를 포함하는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터{Adenoviral recombinant expression vector comprising CAG promoter}

도 1a 내지 도 1e는 발명에서 사용한 아데노바이러스용 재조합 발현벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.

도 2a 및 도 2b는 본 발명에 따른 pShuttle-CAG 및 pShuttle-CAG-IRES-hrGFP 벡터의 제작과정을 나타낸 것이다.

도 3a 및 도 3b는 본 발명에서 사용한 구조유전자 구조물(construct)의 모식도(A) 및 본 발명의 재조합 발현벡터로 제작한 재조합 아데노바이러스의 오염여부를 조사한 PCR 결과(B)를 나타낸 것이다.

M : 사이즈 마커(size marker)

lane 1: 음성대조군

lane 2: 293A(양성대조군)

lane 3 : AdCMV-GFP

lane 4 : AdCMV-TRAIL

lane 5 : AdCAG-GFP

lane 6 : AdCAG-TRAIL-noGFP

lane 7 : AdCAG-TRAIL

lane 8 : AdCMV-GFP

lane 9 : AdCMV-TRAIL

lane 10 : AdCAG-GFP

lane 11 : AdCAG-TRAIL-noGFP

lane 12 : AdCAG-TRAIL

도 4는 TRAIL 또는 GFP 발현 재조합 아데노바이러스(AdCAG-TRAIL AdCAG-GFP, AdCMV-TRAIL 또는 AdCMV-GFP)에 감염된 인간 신경줄기세포(hNSCs)로부터 분비된 TRAIL의 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5a 내지 도 5c는 TRAIL 또는 GFP 발현 재조합 아데노바이러스(AdCAG-GFP 또는 AdCAG-TRAIL, AdCMV-GFP 또는 AdCMV-TRAIL)에 감염된 인간 신경줄기세포 배양액(conditioned media from hNSCs)과 공동배양한 인간 신경교모세포종 세포주(U87MG 및 U343MG)의 세포사멸을 현미경으로 관찰한 결과(A) 및 상기 인간 신경줄기세포의 배양액과 공동배양에 의한 인간 신경교모세포종 세포주의 생존도를 조사한 결과(B, C)이다.

본 발명은 CAG 프로모터를 포함하는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터에 관 한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 CMV 즉시초기 인핸서(cytomegalovirus immediate early enhancer), 서열번호 2의 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter) 및 서열번호 3의 토끼 β-글로빈 종결자(rabbit β-globin terminator)를 포함하는 CAG 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 구조유전자를 포함하는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

숙주세포 내에서 원하는 유전자를 발현시키기 위해서는 세포내로 상기 구조유전자를 수송하여 이를 발현시키는 발현벡터 및 유전자 전달기술이 필요하다. 이 때, 발현벡터는 벡터에 삽입된 DNA 단편을 발현시킬 수 있는 벡터로서, 일반적으로 숙주 내에서 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터 서열 등의 발현조절서열을 포함한다. 숙주세포의 종류, 발현 시기, 발현량 등은 발현벡터를 선택함에 있어서 주요한 근거가 되며, 목적에 따라 이러한 점들을 충족시키기 위해 다양한 발현벡터가 개발되어 왔으나, 보다 더 효율적인 발현벡터의 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.

한편, 유전자 전달기술은 크게 바이러스를 벡터로 사용하는 방법, 합성인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법 및 세포막에 일시적인 전기자극을 가하여 유전자를 도입하는 등의 물리적 방법으로 구분된다.

그 중 바이러스를 이용하는 방법은 비바이러스성 방법이나 물리적 방법에 비해 안정성이 낮고, 면역원성(immunogenicity)이 높아 반복투여시 부작용을 유발할 가능성은 높으나, 유전자의 발현 효율이 높고 발현 지속시간이 긴 장점이 있어서 진핵세포 등의 유전자 전달을 위하여 많이 사용되고 있다.

벡터로 이용되는 바이러스는 RNA 바이러스 벡터와 DNA 바이러스 벡터로 나눌 수 있는데, RNA 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터(Retroviral vector), 랜티바이러스 벡터(Lentiviral vector)가 많이 사용되고, DNA 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터(Adenovirus vector), 아데노관련 바이러스 벡터(Adeno-associate virus vector), 단순포진 바이러스 벡터(Herpes simplex virus vector) 등이 많이 사용된다.

그 중, 아데노바이러스 벡터는 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있어 벡터로서 많이 사용되고 있으나, 숙주의 게놈에 삽입되지 못하므로 단기적인 유전자 전달 및 발현에 국한되며, 아데노바이러스를 직접 in vivo에 적용할 시 면역거부반응이 일어날 수 있고, 아데노바이러스에서 전달할 수 있는 유전자 크기가 제한되어 보다 다양하고 효율적인 벡터의 개발이 요구되어 왔다.

이에 본 발명자들은 아데노바이러스를 이용하여 인간의 세포를 형질전환시키기 위하여 연구를 거듭하던 중, 구조유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 새로운 아데노바이러스용 재조합 발현벡터를 개발하고 이 벡터를 이용하여 TRAIL을 분비하 는 신경줄기세포를 제조한 결과 상기 세포가 TRAIL을 효율적으로 분비하여 종양의 치료에 매우 효과적임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 CAG 프로모터를 포함하는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CMV 즉시초기 인핸서(cytomegalovirus immediate early enhancer), 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter) 및 토끼 β-글로빈 종결자(rabbit β-globin terminator)를 포함하는 CAG 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 구조유전자를 포함하는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 CMV 즉시초기 인핸서(cytomegalovirus immediate early enhancer), 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter), 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 구조유전자 및 토끼 β-글로빈 종결자(rabbit β-globin terminator)가 순차적으로 연결된 아데노바이러스용 재조합 발현벡터를 제공한다는 점에 특징이 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터에서 사용되는 발현조절서열은 CAG 프로모터이다. CAG 프로모터는 변형된 CMV 프로모터의 일종으로 시토메갈로바이러스 즉시초기 인핸서(cytomegalovirus immediate-early enhancer), 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter), 키메릭 인트론(chimeric intron), 엑손 1(exon 1) 과 토끼 β-글로빈 유전자(rabbit β-globin gene)의 엑손 2(exon 2)를 포함하는 복합 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991, Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000)이나, 그 목적에 따라 다양하게 변형되어 사용된다.

본 발명의 CAG 프로모터는 아데노바이러스용 발현벡터로 적절하게 사용하기 위해서, 프로모터 내의 제한효소 부위 등 프로모터의 구성이 프로모터의 활성이 저해되지 않는 범위 내에서 변형된 것으로서, CMV 즉시초기 인핸서, 닭 β-액틴 프로모터 및 토끼 β-글로빈 종결자를 포함하며, 바람직하게는 서열번호 1의 CMV 즉시초기 인핸서, 서열번호 2의 닭 β-액틴 프로모터, 서열번호 3의 토끼 β-글로빈 종결자를 포함한다.

구조유전자는 CAG 프로모터 중 닭 β-액틴 프로모터에 작동가능하게 연결되어 발현 벡터 내에 삽입될 수 있으며, 상기에서 '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.

구조유전자는 단일 단백질의 cDNA 염기서열, 게놈 DNA 염기서열일 수 있으 며, 둘 이상의 단백질 또는 기능적 역할을 하는 도메인이 합성된 복합 단백질일 수도 있다. 아울러, 아데노바이러스의 증식에 PacI 제한효소 부위가 필요하므로 목적 단백질의 기능이 손상되지 않는 범위내에서 PacI 제한효소 부위를 제거하여 이용될 수 있다. 또한, 구조유전자에는 단백질의 발현, 타겟팅(targeting), 폴딩(folding), 다합체화(多合體化) 등을 돕는 부가적인 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 추가로 포함할 수도 있다. 아울러, 구조유전자는 아미노산으로 번역(translation)되지 않고 염기서열로서 기능하는 뉴클레오티드 단편일 수도 있다.

한편, 본 발명에서 구조유전자는 TRAIL 및 이의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 TRAIL이란 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 단백질이거나, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 단백질에서 트랜스멤브레인 도메인을 제외한 부분인 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 TRAIL과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 TRAIL과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 생리활성'이란 종양 세포의 사멸을 유도하는 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 TRAIL의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천 연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 TRAIL의 촉매 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 TRAIL의 기능적 동등물의 범위에는 TRAIL의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다. 또한 상기 TRAIL을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다(Sambrook, Fritsch and Maniatis, 'Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992). 예컨대, 게놈으로부터 핵산을 증폭시키기 위한 PCR 증폭, 화학적 합성법 또는 cDNA 서열을 제조하는 기술이 있다.

TRAIL의 동형 삼중체 구조는 세포사멸을 일으키는데 필수적이므로 TRAIL의 삼합체화(trimerization)가 보다 용이하게 일어나도록 하기 위해서는 본 발명의 TRAIL을 암호화하는 핵산의 상류(upstream)에 류신 지퍼(leucine zipper) 또는 이소류신 지퍼(isoleucine zipper, ILZ) 도메인을 연결하는 것이 바람직하다. 상기 류신 또는 이소류신 지퍼 도메인은 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 이소류신 지퍼 도메인을 사용할 수 있다.

또한 TRAIL은 종양세포의 세포표면 수용체에 결합함으로써 활성을 나타내는 사이토카인이므로 분비 신호 서열(secretion signal sequence)을 본 발명의 TRAIL을 암호화하는 뉴클레오티드에 연결하는 것이 바람직하다. 이 때 분비 신호 서열은 상기 류신 지퍼 또는 이소류신 지퍼 도메인의 상류에 연결되는 것이 바람직하다. 상기 분비 신호 서열은 Igκ- 체인 리더(chain leader), 정액 RNase(seminal RNase)의 분비 신호 서열, SEC2 서열(N-terminal 28 amino acids of human fibrillin-1), FIB 서열(nucleotides 208-303 derived from rat fibronectin mRNA sequence) 또는 FGF-4의 시그널 펩타이드일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 Igκ- 체인 리더일 수 있다. 상기 Igκ- 체인 리더는 바람직하게는 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

세포 밖으로 분비된 TRAIL은 절단되는 경우에 보다 효과적으로 세포사멸을 유도할 수 있다고 알려져 있으므로(Kim et al ., Biochem . Biophys . Res . Commun., 321:930-935, 2004), 상기 분비 신호 서열은 그 내부에 신호 절단 부위(signal cleavage site)를 가지거나 또는 특별한 신호 절단 부위를 가지지 않아도 세포 밖으로 분비될 때 절단되는 특성을 갖는 것이 바람직하다. 상기 분비 신호 서열 중 Igκ- 체인 리더는 특별한 신호 절단 서열이 없어도 세포 밖으로 분비되면 마지막 20번 및 21번째 아미노산 사이가 잘려진다. 즉, 5'-atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act ggt gac-3' 서열(서열번호 8)에 서 마지막 ggt 와 gac-3' 사이가 잘려진다.

이와 같이 분비 신호 서열, 류신 또는 이소류신 지퍼 및 TRAIL을 암호화하는 핵산이 순차적으로 연결된 DNA 구조물은 PCR 증폭, 제한효소를 이용한 DNA의 절단, 라이게이션(ligation), 형질전환 등을 포함하는 당업계에 공지된 일반적인 클로닝 방법으로 제조할 수 있다(실시예 2). 상기 DNA 구조물의 개략적인 구성도를 도 3a에 도시하였다.

또한 본 발명에서 '발현 벡터'라 함은 구조유전자가 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 구조유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 의미한다. 따라서 본 발명의 재조합 발현벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있는 발현벡터의 구성요소, 예를 들면, 프로모터, 구조유전자, 벡터의 복제 및 분배(segregation)를 위한 구성요소들을 모두 포함하고 있다. 상기에서 벡터의 복제 및 분배를 위한 구성요소는 벡터의 증폭, 보존을 위하여 사용되는 대장균 등의 원핵세포 또는 아데노바이러스의 복제에 관여하는 단백질을 암호화하는 염기서열 및 상기 단백질 또는 숙주 단백질 등과 상호작용을 하는 염기서열 등 당업자에게 알려진 공지의 구성요소들이 포함된다. 아울러, 본 발명의 재조합 발현벡터는 선별을 위한 공지의 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터를 이용한 아데노바이러스를 제조하는 방법은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, pAdEasy-1(Stratagene)과 같은 아데노바이러스성 백본 벡터(adenoviral backbone vector)와 함께 BJ5183 대장균에 공동도입하여 상기 두 벡터 간의 동종 재조합(homologous recombination)을 유도하고, 이를 293A 세포와 같은 아데노바이러스 생산 세포주에서 증폭하여 본 발명의 재조합 발현벡터가 삽입된 아데노바이러스를 제조할 수 있다. 이와 같은 아데노바이러스를 제조하는 방법은 하기의 문헌에 잘 나타나 있다: Benihoud, K., Yeh, P. and Perricaudet, M. (1999) Curr Opin Biotechnol 10(5):440-7, Berkner, K. L. (1988) Biotechniques 6(7):616-29, He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W. et al . (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95(5):2509-14., Hanahan, D. (1983) J Mol Biol 166(4):557-80., Jerpseth, B., Callahan, M. and Greener, A. (1997) Strategies 10(2):37-38., Bullock, W. O., Fernandez, J. M. and Short, J. M. (1987) Biotechniques 5(4):376-378., Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G. et al ., (1987). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York., Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C. and Nairn, R. (1977) J Gen Virol 36(1):59-74., Tollefson, A. E., Hermiston, T. W. and Wold, W. S. M. (1998) Methods in Molecular Medicine 21:1-9.

아울러, 본 발명은 본 발명의 재조합 발현벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 형질전환된 세포는 본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 당업계에 공지된 형질전환방법, 예를 들면, 염화칼슘법, 염화루비듐법, 또는 전기영동( 일렉트로포레이션)법, 입자 총 충격 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), PEG(Polyethylenglycol) 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 형질전환된 세포는 바람직하게는 진핵세포 또는 원핵세포일 수 있으며, 더 바람직하게는 인간, 개, 닭, 쥐, 소, 돼지, 원숭이의 세포 또는 대장균이며, 가장 바람직하게는 인간의 신경줄기세포 또는 대장균이다.

한편, 본 발명은 본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여

(a) 목적 단백질(target protein)을 암호화하는 구조유전자를 본 발명의 재조합 발현벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 재조합 벡터를 이용하여 아데노바이러스를 제조하는 단계;

(c) 상기 아데노바이러스를 숙주세포에 감염시켜 형질전환체를 제조하는 단계; 및

(d) 상기 형질전환체에서 목적단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다.

재조합 벡터를 제조하는 단계 및 아데노바이러스를 제조하는 단계는 상기 기술한 바와 같으며, 아데노바이러스를 숙주세포에 감염시키기 위해서는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 인간 신경줄기세포(HFT13 세포)를 성장인자 함유 N₂ 배지에 플레이팅하고, 1시간 후에 적정 MOI(multiplicity of infection)에 해당하는 바이러스성 입자를 배지에 첨가하여 세포를 감염시킨다. 이때 바이러스는 4% 수크로즈 완충용액(10 mM Tris, 4% sucrose, 2 mM MgCl₂ in 1 x PBS)과 함께 -80℃ 냉동고에 보관된 상태이며, 줄기세포에 감염시킬 때 만들어진 바이러스의 titer 및 MOI에 따라 대략 세포배지 1 ml 당 50 ㎕ 미만의 바이러스 용액이 첨가된다. 감염 24시간 후 바이러스를 제거하기 위해 N₂ 배지로 세포를 1회 세척하고, 성장인자 함유 N₂ 배지를 첨가하여 줄기세포를 계속 배양하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

형질전환체에서 목적단백질의 발현은 CAG 프로모터에 의해서 수행되므로 숙주세포는 아데노바이러스가 감염될 수 있는 진핵세포, 예를 들면 인간, 개, 닭, 쥐, 소, 돼지, 원숭이의 세포가 될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 인간의 세포, 더 바람직하게는 인간의 신경줄기세포가 될 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 과정을 통해 상용벡터인 pShuttle 벡터에 삽입되었다. 다만, 본 발명의 범위는 이에 제한되는 것은 아니다. 상용벡터인 TriEX-1.1 Neo DNA 벡터(Novagen)로부터 시토메갈로바이러스 즉시 초기 인핸서(cytomegalovirus immediate-early enhancer), 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter) 및 토끼 β-글로빈 종결자(rabbit β-globin terminator)를 각각 클로닝하고 이를 상용벡터인 pShuttle 벡터에 각각 삽입하여 아데노바이러스 제작에 적합하도록 변형된 CAG 프로모터를 가진 벡터를 제작하였다(도 2a 참조).

여기에 상용벡터인 pShuttle-IRES-hrGFP-1 벡터(Stratagene)로부터 IRES 및 hrGFP를 추가적으로 클로닝하여 CAG 프로모터를 가지며, GFP를 발현하는 벡터를 추가로 제작하였다(도 2b 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 TRAIL을 구조유전자로 이용하고자 공지된 TRAIL 유전자를 PCR로 클로닝한 뒤, 그 중 아폽토제닉 리셉터 바인딩 모이어티(apoptogenic receptor binding moiety) 부분만을 다시 PCR로 클로닝하고, 여기에 이소류신 지퍼 도메인 및 분비 신호서열인 Igκ- 체인 리더를 삽입하여 구조유전자 구조물(construct)을 제조하였다.

본 발명의 또다른 실시예에서는 상기 구조유전자 구조물을 본 발명의 아데노바이러스용 재조합 발현벡터에 삽입하여 구조유전자인 TRAIL을 발현하는 재조합 발현벡터를 제조하였으며, 이를 이용하여 다시 재조합 아데노바이러스를 제조하였다.

본 발명의 일 시험예에서는 본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 TRAIL을 분비하는 인간의 신경줄기세포를 제작하였다. 그 결과, 본 발명의 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 숙주세포 내에서 TRAIL이 정상적으로 분비됨을 확인하였 으며, 본 발명의 재조합 발현벡터가 CMV 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터보다 더 많은 양의 TRAIL을 발현함을 알 수 있었다. 이는 본 발명의 재조합 발현벡터에 의해 숙주세포에 아데노바이러스를 매개로 한 유전자 전달이 효율적으로 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.

본 발명의 다른 시험예에서는 본 발명의 재조합 TRAIL 발현벡터 및 CMV 프로모터를 포함하는 TRAIL 발현벡터를 이용하여 제작된 인간의 신경줄기세포의 종양용적의 감소효과를 살펴보았다. 그 결과 CMV 프로모터를 이용한 경우 실험군의 종양용적이 대조군에 비해 65.4 ± 5.2%로 감소한 것에 비하여 CAG 프로모터를 이용한 경우 실험균의 종양용적이 대조군에 비해 23.43 ± 3.09%로 감소하여 현저하게 많이 감소함을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

CAG 프로모터를 포함하는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터의 제작

CAG 프로모터를 가지는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터를 제작하기 위하 여 pShuttle 벡터(Stratagene)의 MCS(multi cloning site)에 pTriEX-1.1 Neo DNA(Novagen) 벡터로부터 가져온 CMV 즉시초기 인핸서(CMV immediately early enhancer; CMV ie enhancer), 닭 β-액틴 프로모터(β-actin promoter), 토끼 β-글로빈 종결자(β-globin terminator)와 pShuttle-IRES-hrGFP-1(Stratagene) 벡터에서 가져온 IRES, hrGFP를 클로닝해서 pShuttle-CAG 또는 pShuttle-CAG-IRES-hrGFP 벡터를 각각 만들었다(도 2a 및 2b 참조). 이를 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 토끼 β-글로빈 종결자를 pShuttle 벡터의 SalⅠ과 BglⅡ 사이에 다음과 같은 방법으로 클로닝하였다: pTriEX-1.1 Neo 벡터(Novagen)로부터 토끼 β-글로빈 종결자 부분을 pfu 중합효소를 이용한 PCR을 통하여 얻었다. 이때 사용한 프라이머(forward primer : CTCGAGATCAATTCTCTAGCCAAT(서열번호 9); reverse primer : GGATCCTTACATATGGGCATATGT(서열번호 10))는 pShuttle 벡터로의 클로닝을 위하여 XhoⅠ과 BamHⅠ제한효소 서열을 포함하고 있다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 초기 변성; 94℃에서 45초간 변성, 55℃에서 45초간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 30초간 신장(extension)의 35 사이클; 및 72℃에서 7분간 최종 신장으로 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T easy 벡터(Promega, Wisconsin, USA)에 클로닝하였다. 토끼 β-글로빈 종결자가 삽입된 pGEM-T easy 벡터는 XhoⅠ과 BamHⅠ 으로 절단하고, pShuttle 벡터는 SalⅠ, BglⅡ로 절단하여 각각의 산물을 연결(ligation)하였다. 이때 SalⅠ과 XhoⅠ, BglⅡ와 BamHⅠ은 각각 상보적인 응집말단(compatible cohesive end)으로써 서로 연결(ligation)이 가능하고 연결(ligation)된 벡터는 각각의 제한효소 자리를 잃는다. 이렇게 하여 토끼 β-글로빈 종결자를 포함한 pShuttle벡터(pShuttle-rabbit β globin terminator)를 클로닝하였다.

그 다음으로 토끼 β-글로빈 종결자를 포함한 pShuttle벡터에 CMV 즉시초기 인핸서와 닭 β-액틴 프로모터 부분을 다음과 같은 방법으로 클로닝하였다: 닭 β-액틴 프로모터와 pTriEX-1.1 Neo 벡터의 MCS 사이에 존재하는 PacⅠ 제한효소 부위를 제거하기 위해 우선 PacⅠ으로 pTriEX-1.1 Neo 벡터를 자른 후 클레나우 조각(klenow fragment; Takara)을 이용해 블런트 엔드(blunt end)를 만들었다. 이를 SmaⅠ으로 다시 절단한 후 자가 연결(self ligation)을 수행하여 PacⅠ 제한효소 부위가 없어진 변형된 pTriEX-1.1 Neo 벡터를 얻었다. 상기의 변형된 pTriEX-1.1 Neo 벡터를 FseⅠ으로 절단 후 클레나우 조각으로 중합반응을 수행하여 블런트 엔드를 만들고 다시 XhoⅠ으로 절단하여 CMV 즉시초기 인핸서와 닭 β-액틴 프로모터 부분을 얻었다. 앞서 만들어진 토끼 β-글로빈 종결자를 포함한 pShuttle벡터를 KpnⅠ과 XhoⅠ으로 절단하여 얻은 산물과 상기 CMV 즉시초기 인핸서와 닭 β-액틴 프로모터 부분을 연결(ligation)하여, CMV 즉시초기 인핸서, 닭 β-액틴 프로모터와 토끼 β-글로빈 종결자를 포함한 아데노바이러스용 재조합 발현벡터(pShuttle-CAG; 도 1a)를 완성하였다(도 2a 참조).

한편, 상기 pShuttle-CAG 벡터에 다음의 방법으로 IRES와 hrGFP를 클로닝하였다: pShuttle-IRES-hrGFP-1 (Stratagene) 벡터에서 IRES 및 hrGFP 부분을 pfu 중 합효소를 이용한 PCR을 통하여 얻었다. 이때 사용한 프라이머 (forward primer : CTCGAGGACTACAAGGATGAC(서열번호 11); reverse primer : CTCGAGCACCCACTCGTGCAGGCTGCC(서열번호 12))는 pShuttle-CAG 벡터로의 클로닝을 위하여 IRES 앞쪽에 XhoⅠ제한효소 서열을 포함하고 있다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 초기 변성; 94℃에서 45초간 변성, 55℃에서 45초간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 1분간 신장(extension)의 35 사이클; 및 72℃에서 7분간 최종 신장으로 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T easy 벡터(Promega, Wisconsin, USA)에 클로닝하였다. pGEM-T easy 벡터를 EcoRⅠ으로 절단 후 클레나우 조각으로 중합반응을 실시하고 다시 XhoⅠ으로 절단하여, IRES와 hrGFP 부분을 얻었다. pShuttle-CAG 벡터를 XhoⅠ 및 EcoRⅤ로 절단하여 얻은 산물과 위의 IRES와 hrGFP 부분을 연결(ligation)하여, pShuttle-CAG-IRES-hrGFP(도 1b)를 완성하였다(도 2b 참조).

< 실시예 2>

구조유전자( TRAIL ) 구조물( construct )의 제작

먼저, 인간 태아 뇌 cDNA 라이브러리(Clontech, Cat. 634258)로부터 얻은 플라스미드를 주형으로 하여 TRAIL 유전자를 PCR로 증폭하였다. 수용성 TRAIL을 제조하기 위하여, 서열번호 6의 TRAIL에서 트랜스멤브레인 도메인을 제외한 아폽토제닉 리셉터 바인딩 모이어티(apoptogenic receptor binding moiety) 부분(서열번호 6의 95-281, 서열번호 4)을 PCR로 증폭하였다. 이 때 사용한 프라이머(서열번호 13 및 서열번호 14)는 pSecTag2A 벡터(Invitrogen)로의 용이한 클로닝을 위해 그 내부에 각각 KpnⅠ과 XhoⅠ 제한효소 서열을 포함하고 있다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 초기 변성; 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 45초간 신장(extension)의 35 사이클; 및 72℃에서 10분간 최종 신장으로 수행되었다. 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T easy 벡터(Promega, Wisconsin, USA)에 클로닝하였다.

TRAIL의 삼합체화를 통한 활성 향상을 위하여 이소류신 지퍼 도메인(이하, 'ILZ'라 함)을 다음과 같은 방법으로 클로닝하였다: 공지된 ILZ의 아미노산 서열을 역번역하여 얻어진 서열(서열번호 15)의 양 말단에 HindⅢ 및 KpnⅠ의 제한효소 서열을 연결하여 올리고머를 합성하였다(Bioneer, 대전). 합성된 올리고머를 pGEM-T 벡터에 삽입하였다.

이후, 단백질의 세포 밖 분비를 유도하는 Igκ-체인 리더를 포함하는 pSecTag2A 벡터에 상기 ILZ와 TRAIL 유전자를 순서대로 삽입하였다. 즉, 먼저 ILZ가 삽입된 pGEM-T 벡터를 HindⅢ와 KpnⅠ으로 절단하고, 절단된 ILZ을 pSecTag2A 벡터에 삽입하였다. 또한 TRAIL 유전자가 삽입된 pGEM-T easy 벡터의 양 말단을 KpnⅠ과 XhoⅠ으로 절단한 후, 절단된 TRAIL 유전자를 상기 ILZ가 삽입된 pSecTag2A에 삽입하였다. 상기 pSecTag2A 벡터로부터 발현된 TRAIL이 세포 밖으로 분비된 후 Igκ-체인 리더는 소멸하게 된다.

< 실시예 3>

TRAIL 을 구조유전자로 하는 아데노바이러스 재조합 발현벡터의 제작

실시예 2에서 제조된 Igk 체인 리더-ILZ-TRAIL 구조물(construct)을 아데노바이러스 셔틀 벡터로 클로닝하기 위하여 상기 구조물의 양 말단에 BglⅡ와 XhoⅠ 제한효소 서열을 PCR로 연결하였다. 이 때 프라이머로는 서열번호 16 및 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 초기 변성; 94℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 90초간 신장의 35 사이클; 및 72℃에서 10분간 최종 신장으로 이루어진다. 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T easy 벡터(Promega, Wisconsin, USA)에 클로닝하였다. 이후, 상기 벡터를 BglⅡ와 XhoⅠ 제한효소로 절단하여 아데노바이러스 셔틀 벡터인 pShuttle-CAG 및 pShuttle-CAG-IRES-hrGFP에 각각 삽입하였으며, 이를 각각 ‘pShuttle-CAG-Igκ-ILZ-TRAIL(도 1c)’ 및 ‘pShuttle-CAG-Igκ-ILZ-TRAIL-IRES-hrGFP(도 1d)’라고 명명하였다. 상기 pShuttle-CAG-Igκ-ILZ-TRAIL-IRES-hrGFP 벡터에서 TRAIL 유전자의 하류에 GFP 유전자가 IRES에 의해 연결되어 있어 TRAIL이 발현되는 경우 자연적으로 GFP도 함께 발현된다.

< 실시예 4>

TRAIL 발현 재조합 아데노바이러스(AdCAG-TRAIL)의 제작

실시예 3에서 제작한 pShuttle-CAG-Igκ-ILZ-TRAIL-IRES-hrGFP(도 1d)를 Pme Ⅰ제한효소로 절단한 후, 아데노바이러스성 백본 벡터(adenoviral backbone vector)인 pAdEasy-1(Stratagene)과 함께 BJ5183 대장균에 공동도입하여 상기 두 벡터 간의 동종 재조합(homologous recombination)을 유도하였다(pAd-CAG-Igκ-ILZ-TRAIL-IRES-hrGFP). 대장균의 형질전환은 유전자 도입기(Gene Pulser, 2.5kV, 25μF, 200Ω)(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용한 전기천공법에 의하여 수행하였다.

이렇게 얻은 pAd-CAG-Igκ-ILZ-TRAIL-IRES-hrGFP를 PacⅠ제한 효소로 절단한 후, 아데노바이러스 생산 세포주인 293A 세포(Invitrogen, CA)에 형질감염(transfection)하여 바이러스를 증폭시켰다. 생산된 재조합 바이러스(AdCAG-TRAIL)는 80,000 rpm으로 10℃에서 6시간 동안 염화세슘 초원심분리(cesium chloride ultracentrifugation)를 수행하여 순수분리하였다. 이후, 4% 수크로즈 완충용액(10 mM Tris, 4% sucrose, 2 mM MgCl₂ in PBS)에서 투석(Pierce, Rockford, IL, USA)한 후 0.4 ㎛ 여과기로 여과하여 사용 전까지 -70℃에 보관하였다.

< 비교예 1>

CMV 프로모터에 의한 TRAIL 발현 재조합 아데노바이러스(AdCMV-TRAIL)의 제작

실시예 2에서 제조된 Igk 체인 리더-ILZ-TRAIL 구조물(construct)을 pShuttle-CMV-hrGFP 벡터(Stratagene)에 삽입한 것(제조된 벡터를 'pShuttle-CMV-Igκ-ILZ-TRAIL-IRES-hrGFP'라 명명(도 1e))을 제외하고는 상기 실시예 3 및 실시예 4와 동일한 방법으로 재조합 아데노바이러스를 제조하였다. 이 때, pShuttle-CMV-Igκ-ILZ-TRAIL-IRES-hrGFP를 이용하여 제조한 재조합 아데노바이러스를 AdCMV-TRAIL으로 명명하였다.

< 비교예 2>

GFP 발현 재조합 아데노바이러스(AdCAG-GFP)의 제작

CAG 프로모터에 의해 GFP만을 발현하는 재조합 아데노바이러스(AdCAG-GFP, 대조군 바이러스)는 실시예 1에서 제조한 pShuttle-CAG-IRES-hrGFP 벡터를 이용하여 상기 실시예 3 및 실시예 4와 동일한 방법으로 제조하였다.

< 비교예 3>

CMV 프로모터에 의한 GFP 발현 재조합 아데노바이러스(AdCMV-GFP)의 제작

CMV 프로모터에 의해 GFP만을 발현하는 재조합 아데노바이러스(AdCMV-GFP, 대조군 바이러스)는 pShuttle-CMV-hrGFP 벡터(Stratagene)를 이용하여 상기 실시예 3 및 실시예 4와 동일한 방법으로 제조하였다.

이와 같이 본 발명에서 제조하여 명명한 아데노바이러스를 정리하면 다음과 같다. pShuttle-CMV-Igκ-ILZ-TRAIL-IRES-hrGFP 벡터를 사용하여 제조한 것을 AdCMV-TRAIL; pShuttle-CMV-hrGFP 벡터를 사용하여 제조한 것을 AdCMV-GFP; pShuttle-CAG-Igκ-ILZ-TRAIL-IRES-hrGFP 벡터를 사용하여 제조한 것을 AdCAG-TRAIL; pShuttle-CAG-Igκ-ILZ-TRAIL 벡터를 사용하여 제조한 것을 AdCAG-TRAIL-noGFP; pShuttle-CAG-IRES-hrGFP 벡터를 사용하여 제조한 것을 AdCAG-GFP라고 각각 명명하였다.

< 시험예 1>

제조된 아데노바이러스의 검사

<1-1> TCID ₅₀ 테스트

상기 실시예 3, 비교예 1, 비교예 2 및 비교예 3에서 제조된 AdCAG-TRAIL, AdCMV-TRAIL, AdCAG-GFP 및 AdCMV-GFP 재조합 바이러스들을 정량하기 위해 293A 세포를 이용하여 TCID₅₀(Tissue Culture Infectious Dose 50, QBiogene) 테스트를 하였다. 293A 세포를 96 웰 플레이트(NUNC)에 플레이팅(plating)하고, 연속 희석한 재조합 바이러스를 각각 감염시켰다. 1주일 후 감염된 웰 수를 더하여 KABER 통계법(TCID 50 reference; QBiogene, CA, USA. AdenoVator applications manual)으로 TCID₅₀ 값을 계산하였다. 그 결과, AdCAG-TRAIL, AdCMV-TRAIL, AdCAG-GFP 및 AdCMV- GFP 재조합 바이러스 모두 TCID₅₀ 값이 평균적으로 1-5× 10¹⁰PFU/㎖ 인 것으로 나타나 아데노바이러스 벡터가 잘 제작되었음을 알 수 있었다.

<1-2> 야생형 아데노바이러스의 오염 여부 확인

AdCAG-TRAIL, AdCAG-TRAIL-noGFP, AdCMV-TRAIL, AdCAG-GFP 및 AdCMV-GFP 재조합 바이러스에서 야생형 아데노바이러스의 오염여부를 확인하기 위해, 상기 두 재조합 아데노바이러스에서는 제거된 야생형 아데노바이러스의 E1 유전자의 내부 서열로부터 프라이머를 합성하여 PCR을 수행하였다. 먼저, 각 재조합 바이러스의 게놈은 바이러스 입자를 용해(lysis) 완충용액(0.1% SDS, 10mM Tris-Cl, 1mM EDTA)으로 깬 후 페놀/에탄올 침전법으로 얻었다. 이후, 얻어진 각 게놈을 주형으로 하고 야생형 아데노바이러스의 오염 여부를 확인하기 위하여 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머(야생형 아데노바이러스의 E1 유전자를 증폭함)를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 추출한 재조합 아데노바이러스의 게놈을 확인하기 위하여 목적 유전자(interest gene)인 hrGFP유전자를 검출하기 위한 프라이머 (forward primer : ATGGTGAGCAAGCAGATCCTGA(서열번호 19); reverse primer : CACCCACTCGTGCAGGCTGCCC(서열번호 20))와 TRAIL 유전자를 검출하기 위한 서열번호 16 및 서열번호 14의 프라이머를 이용하여 PCR 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 초기 변성; 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 30초간 신장의 35 사이클; 및 72℃에서 10분간 최종 신장으로 수행되었다. 이 때 293A 세포 게놈을 양성 대조 군으로 하였다. 상기 293A 세포 게놈은 다이제스쳔(digestion) 완충용액(0.5% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl, 25 mM EDTA)으로 세포를 깬 후 페놀/에탄올 침전 방법으로 얻었다. PCR 반응 결과는 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.

그 결과, 도 3b에서 보는 바와 같이, 293A 세포에서는 340 bp의 E1 유전자가 검출되었으나(lane 2), AdCMV-GFP, AdCMV-TRAIL, AdCAG-GFP, AdCAG-TRAIL-noGFP 및 AdCAG-TRAIL 재조합 바이러스 게놈에서는 검출되지 않았으며(lane 3 내지 lane 7), AdCMV-GFP, AdCMV-TRAIL, AdCAG-GFP, AdCAG-TRAIL-noGFP 및 AdCAG-TRAIL 재조합 바이러스 게놈에서 각각의 목적 유전자 (GFP: 717 bp, TRAIL: 778 bp)가 검출되어 추출한 재조합 바이러스 게놈임을 확인하였다(lane 8 내지 lane 12).

< 시험예 2>

숙주 세포내에서의 TRAIL 분비 확인

상기 실시예 3에서 제작된 AdCAG-TRAIL 재조합 아데노바이러스가 숙주 세포내에서 TRAIL을 분비하는지 확인하기 위하여 상기 AdCAG-TRAIL, AdCAG-GFP, AdCMV-TRAIL 및 AdCMV-GFP 바이러스를 인간 신경줄기세포(HFT13 세포)에 감염시킨 후, 분비된 TRAIL을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 정량하였다.

<2-1> 인간 종뇌 유래 신경줄기세포( HFT13 세포)의 제조

세브란스병원 IRB(Institution Review Board)의 승낙을 받은 후, 보건복지부 의 생명윤리법안과 과학기술부 세포응용연구사업단 윤리위원회의 연구지침 및 신촌 세브란스 병원의 인체조직 연구관리 지침을 따라 임신 13주에 자연 유산되어 사망한 태아의 사체를 사전에 보호자의 동의서를 받고 획득하였다. 태아 사체를 멸균된 차가운 H-H 완충용액(Hanks' balanced salt solution, 1× [GIBCO]+HEPES, 10 mM [GIBCO] in ddH₂O, pH 7.4)으로 세척하고, 현미경 하에서 중추신경계만 해부하였다. 이후, 뇌척수막과 혈관을 모두 제거하고 종뇌 부위의 조직을 분리하였다.

분리된 뇌 조직을 패트리 디쉬(petri dish)에 담고, 약 1× 1 mm 크기로 잘랐다. 950 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 조직을 다시 H-H 완충용액으로 세척하고, 상기 원심분리를 3회 반복 수행하였다. 마지막 원심분리를 수행한 후 상층액을 모두 제거하고, 남은 조직에 0.1% 트립신(Gibco) 2 ㎖과 DNase I(Roche, 1 ㎎/㎗)을 첨가하여 잘 혼합하였다. 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 30분간 반응시켰다. 30분 후 혈청 함유 배지(DMEM+10% FBS+1× penicillin/streptomycin/fungizone)(모두 Gibco 제품)를 3 ㎖ 첨가하였다. 혈청 피펫(serologic pipette, Falcon)으로 천천히 조직을 잘게 부수기 시작하여 단일세포 수준까지 해리시켰다. 이후, 원심분리를 하여 상층액을 제거한 후, 세포 펠렛(pellet)을 H-H 완충용액으로 세척하였다. 그리고 다시 원심분리를 한 후, 상층액을 제거하였다.

상기 세포 펠렛에 N2 배지(D-MEM/F-12 [98% volume(v)/volume(v)]+N2 supplement [1% v/v]+Penicillin/Streptomycin [1% v/v]; 모두 Gibco 제품) 10 ㎖ 을 첨가하여 천천히 혼합하였다. 약 4× 10⁶-6× 10⁶개의 세포를 조직배양 처리 100 mm 플레이트(tissue culture treated 100 mm plate, Corning)에 옮겼다. 신경줄기세포 성장인자로 20 ng/㎖ bFGF(recombinant human fibroblast growth factor-basic, R & D), 10 ng/㎖ LIF(recombinant human leukemia inhibitory factor, Sigma) 및 8 ㎍/㎖ 헤파린(Sigma)을 각각 첨가하여 좌우앞뒤로 잘 흔든 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 5 ㎖의 배지를 버리고, 새로운 N2 배지 5 ㎖를 첨가하였다. 동시에 20 ng/㎖ bFGF, 10 ng/㎖ LIF 및 8 ㎍/㎖ 헤파린을 첨가하고, 계속하여 배양하였다. 배지 교환은 배지와 세포의 상태를 관찰하면서 3-4일마다 수행하였다. 이 때 약 절반 정도의 배지만을 새 배지로 교환하고 성장인자를 함께 첨가하였다. 아울러, 미분화된 신경줄기세포가 계속 증식하여 서로 뭉쳐져 세포덩어리, 즉 신경구(neurospheres)를 형성하면서 자라기 시작하면, 이후 7-8일마다 계대배양을 실시하였다.

<2-2> ELISA 분석

이를 위하여, 상기 시험예 <2-1>에서 분리된 종뇌 유래 인간 신경줄기세포(HFT13 세포) 5× 10⁵개를 성장인자 함유 N2배지 1㎖와 함께 6 웰 배양 디쉬(NUNC)에 플레이팅하였다. 1시간 후에 각각 65, 130, 195 및 260 MOI(multiplicity of infection)의 AdCAG-TRAIL, 50 MOI의 AdCAG-GFP, 각각 100, 200 및 300 MOI(multiplicity of infection)의 AdCMV-TRAIL 및 50 MOI의 AdCMV-GFP 바이러스성 입자를 배지에 첨가하여 세포를 감염시켰다. 감염 24시간 후, 바이러스를 제거하기 위해 3 ㎖ N2 배지로 각 웰을 1회 세척하였다. 이후, 성장인자 함유 N2 배지 3 ㎖를 첨가하여 세포를 배양하였다. 바이러스에 감염된 세포를 배양한 지 48시간이 지난 후 형광현미경 하에서 관찰한 결과 상기 신경줄기세포에서 GFP가 발현됨을 확인하였다(결과 미도시).

재조합 바이러스에 감염된 신경줄기세포로부터 분비된 TRAIL를 정량하기 위하여 세포 배양액을 모두 수거하여 TRAIL에 대한 ELISA (BD, San Diego, CA)를 수행하였다. 항-인간 TRAIL 단일클론 항체를 코팅 완충용액(0.1M sodium carbonate/bicarbonate, pH 9.5 in distilled water)에 1:250의 비율로 희석하고 이를 96 웰 플레이트(NUNC)의 각 웰에 100 ㎕씩 분주하였다. 그리고 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. 웰을 세척 완충용액(1× PBS with 0.05% Tween-20)으로 3회 세척하였다. 어세이 희석액(assay diluent, 1× PBS with 10% FBS, pH 7.0)을 각 웰에 첨가하고 실온에서 한 시간 방치하여 블록킹(blocking)하였다. 이후 다시 3회 세척한 후, 각각 AdCAG-TRAIL, AdCAG-GFP, AdCMV-TRAIL 또는 AdCMV-GFP 재조합 아데노바이러스의 배양액과 이의 연속 희석액을 100 ㎕씩 각 웰에 분주하여 실온에서 두 시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 각 웰을 5회 세척하였다. 어세이 희석액(assay diluent)에 바이오틴이 처리된 항-인간 TRAIL 단일 항체(biotinylated anti-human TRAIL monoclonal antibody)와 아비딘-홀스래디쉬 퍼옥시다제 시약(avidin-horseradish peroxidase conjuate reagent)을 희석하여 100 ㎕씩 분주하고 실온에서 한 시간 반응시켰다. 마지막으로 7회 세척하고, 각 웰에 기질 용액(Tetramethyl- benzidine [TMB] and hydrogen peroxide, BD, USA)을 100 ㎕씩 분주하여, 빛을 차단하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 50 ㎕의 2N 황산(sulfuric acid)을 넣어 반응을 중지시켰다. 이후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Molecular Devices)로 450-570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 측정된 TRAIL 양은 AdCAG-TRAIL를 각각 65, 130, 195 및 260 MOI로 감염시킨 경우, 48시간 후 백만 개의 신경줄기세포 배양액으로부터 각각 42.03± 2.68 (Mean± SD), 48.88± 3.13, 51.42± 6.63 및 53.76± 4.38 ng이었으며, AdCMV-TRAIL를 각각 100, 200 및 300 MOI로 감염시킨 경우, 48시간 후 백만 개의 신경줄기세포 배양액으로부터 각각 10.3± 2.29 (Mean± SD), 28.5± 1.39 및 40.7± 2.90 ng 이었다(도 4). 바이러스를 감염시키지 않은 HFT13 세포(대조군), AdCMV-GFP를 감염시킨 HFT13 세포 배양액 및 AdCAG-GFP를 감염시킨 HFT13 세포 배양액에서는 0.01 ng미만의 값이 측정되었다.

따라서 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의해서 제조된 재조합 아데노바이러스가 숙주세포 내에서 CMV 프로모터를 사용할 때보다 적은 MOI에서 더 많은 양의 TRAIL을 발현함을 알 수 있었다.

상기 결과들로부터 TRAIL 발현 재조합 아데노바이러스에 감염된 인간 신경줄기세포에서 TRAIL이 정상적으로 분비됨을 확인하였으며, 이는 본 발명의 재조합 발현벡터에 의해 숙주세포에 아데노바이러스를 매개로 한 유전자 전달이 효율적으로 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.

< 시험예 3>

재조합 아데노바이러스에 감염된 인간 신경줄기세포에 의한 인간 신경교모세 포종의 세포사멸 분석

<3-1> 인간 신경교모세포종 배양

ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입한 인간 다형성 신경교모세포종의 일종인 U87MG 세포주를 10% FBS와 1× P/S(penicillin/streptomycin; Gibco)가 첨가된 RPMI 1640 배지(Gibco)에서 배양하였다. 또 다른 인간 신경교모세포종의 일종인 U343MG 세포주(ATCC)는 10% FBS와 1× P/S가 첨가된 DMEM 배지(Gibco)에서 배양하였다. 이들 세포는 매 3-4일마다 0.05% 트립신/EDTA를 2분 30초간 처리하여 계대배양하였다. 마지막 계대배양 후, U87MG 또는 U343MG 세포에 트립신/EDTA를 처리하여 단일세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 950 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세포 펠렛에 20 ㎍/㎖ CM-DiI(Cell Tracker, Molecular Probes)를 함유하는 1× PBS 5 ㎖를 첨가하여 세포를 재부유시켰다. 이후 37℃에서 3분, 그리고 얼음 위에서 10분간 반응시켜 세포를 CM-DiI로 염색시켰다. 원심분리를 하여 얻은 세포 펠렛을 1× PBS 10 ㎖로 다시 재부유시키고 다시 3회 원심분리하여 남아있는 CM-DiI를 제거하였다. 이후, 세포수를 5×10⁵ cells/4 ㎕로 조정하여 세포를 1× PBS로 재부유시켰다. 이와 같이 제조된 세포 현탁액은 생체 내 이식 전까지 얼음에 보관하였다.

<3-2> 인간 신경교모세포종의 세포사멸 분석

본 발명의 재조합 TRAIL 발현벡터를 이용하여 제작된 AdCAG-TRAIL 재조합 바이러스에 감염된 인간 신경줄기세포에서 분비되는 TRAIL이 인간 신경교모세포종 세포의 사멸을 유도하는지 확인하기 위해, 바이러스에 감염된 신경줄기세포 배양액과 신경교모세포종 세포주의 공동 배양을 실시하였다.

먼저, HFT13 세포 5× 10⁵개를 6 웰 플레이트 디쉬의 각 웰에 배지와 함께 플레이팅하였다. 1시간 후, 50 MOI의 AdCAG-GFP 바이러스, 65, 130, 195 및 260 MOI의 AdCAG-TRAIL 바이러스, 50 MOI의 AdCMV-GFP 바이러스 및 100, 200 및 300 MOI의 AdCMV-TRAIL 바이러스를 각각 세포에 감염시켰다. 24시간 후, 세포를 N2 배지 3 ㎖로 세척하고, 성장인자 함유 N2 배지 5 ㎖에서 3일간 계속 배양하였다. 세포 배양액을 1000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 한편, U87MG 또는 U343MG 세포 2× 10⁵개를 12 웰 플레이트 디쉬의 각 웰에 배지와 함께 플레이팅하였다. 24시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 상기 준비된 신경줄기세포 배양액을 각 웰 당 1.5 ㎖씩 첨가하고 종양세포의 사멸여부를 관찰하였다. 그 결과, AdCAG-TRAIL에 감염된 HFT13 세포의 배지와 공동 배양된 U87MG 및 U343MG 세포는 rhTRAIL을 직접 처리했을 때와 유사하게 매우 빠르게 세포사멸을 보였다(도 5a). 반면, AdCMV-TRAIL에 감염된 HFT13세포의 배지와 공동 배양된 U87MG 및 U343MG 세포도 세포사멸을 보였으나, 그 정도는 AdCAG-TRAIL의 경우에 비해서 약하였다. 또한, 바이러스에 감염되지 않은 HFT13 세포의 배지, AdCMV-GFP에 감염된 HFT13 세포의 배지 또는 AdCAG-GFP에 감염된 HFT13 세포의 배지와 공동 배양된 신경교모세포주 세포들은 사멸을 보이지 않았다(도 5a).

이러한 세포사멸 정도를 정량화하기 위해, 미토콘드리아 디하이드로게나제 활성 어세이(mitochondrial dehydrogenase activity assay)(Cell Counting Kit-8 [CCK-8 assay], Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan)를 수행하였다. HFT13 세포 5× 10⁴개를 성장인자가 포함된 N2 배지 100㎕와 함께 96 웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 24 시간 후 50 MOI의 AdCAG-GFP 바이러스, 65, 130, 195 및 260 MOI의 AdCAG-TRAIL 바이러스, 50 MOI의 AdCMV-GFP 바이러스 및 100, 200 및 300 MOI의 AdCMV-TRAIL 바이러스를 각각 세포에 감염시켰다. 6일 후 각 웰에 10 ㎕의 수용성 테트라졸리움 염(water-soluble tetrazolium salt)과 전자 캐리어(electron carrier)인 1-메톡시 PMS가 희석되어 있는 CCK-8 용액을 첨가하였다. 2시간 후 마이크로 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 블랭크 대조군은 세포 배지에 CCK-8 용액만 처리한 웰로 하였고, 처리하지 않은 HFT13 세포 배양군을 100% 생존으로 표현하였다. 모든 실험을 동일한 조건에서 3회 반복하여 평균값을 얻었다. 그 결과, 260 MOI의 AdCAG-TRAIL 재조합 바이러스에 감염된 HFT13 세포 배지와 U87MG 세포를 24시간 공동배양 시에는 종양세포의 63% 이상, U343MG 세 포와 공동배양 시에는 종양세포의 91% 이상이 사멸하였다. 이해 비하여, 300 MOI의 AdCMV-TRAIL 재조합 바이러스에 감염된 HFT13 세포 배지와 U87MG 세포를 24시간 공동배양 시에는 종양세포의 54% 이상, U343MG 세포와 공동배양 시에는 종양세포의 85% 이상이 사멸하여, CAG 프로모터에 의한 발현에서 낮은 MOI로 더 많은 세포사멸을 관찰하였다. AdCMV-GFP 또는 AdCAG-GFP에 감염된 HFT13 세포 배지와 공동배양 시에는 7% 미만의 종양세포만 사멸을 보였다(도 5b 및 5c).

< 시험예 4>

신경교모세포종 동물모델에 TRAIL 발현 인간 신경줄기세포의 이식 후 종양 크기의 감소

CAG프로모터에 의해 TRAIL을 발현하는 인간 신경줄기세포의 이식 후 종양크기의 감소 정도를 정량적으로 알아보기 위하여, U87MG 세포 뇌종양모델을 확립하고 실험군에는 100 MOI의 AdCAG-TRAIL 감염 인간 신경줄기세포를 이식하였으며(n=7), 대조군에는 세포 배지만을 이식하였다(n=7). 이와 비교하기 위한 실험으로 CMV프로모터를 이용하는 경우에 있어서는 뇌종양 동물모델에 AdCMV-TRAIL 감염 인간 신경줄기세포를 이식하였으며(n=8), 대조군에는 세포 배지만을 이식하였다(n=7).

이식 10일 후, 종양크기의 감소 정도를 정량적으로 평가하기 위하여 각각의 실험군과 대조군에서 종양을 포함하는 모든 슬라이드를 헤마톡실린으로 염색한 후, 종양크기를 메타모르프 이미징 시스템(MetaMorph Imaging System, Universal Imaging Corporation, PA, USA)을 통해 측정하였다. 즉, 각 동물의 뇌를 4% 파라포름알데하이드(in 0.1M Pipes buffer)로 고정한 후, 뇌를 적출하였다. 적출된 뇌를 30 % 수크로스(in PBS)에 침지시켰다. 4℃에서 1-2일간 보관하여 동결보호(cryoprotection)하고, 16 ㎛ 두께로 동결절단하였다. 슬라이드에 놓인 각 뇌 조직 절편 간격은 각각 96 ㎛이었다. 슬라이드를 1× PBS에서 20분간 침수시키고 헤마톡실린 용액에서 4분간 염색하였다. 이후, 흐르는 물에 슬라이드를 세척하고, 글리세롤 마운팅 배지로 마운팅하였다. 염색한 후 종괴 부위를 포함하는 슬라이드를 명시야 현미경 하에서 100× 배율로 사진을 찍었다. 메타모르프 이미징 시스템을 이용하여 종괴 부위 영역을 지정하고, 지정된 영역의 픽셀(pixel) 수를 면적으로 환산하였으며, 조직 절편의 두께(96 ㎛)를 곱하여 최종 종괴의 부피를 측정하였다. 모든 실험군 및 대조군에서 이를 수행하여 평균값을 비교 분석하였다.

그 결과, CAG 프로모터를 이용하는 경우, U87MG 신경교모세포종 동물모델에서 대조군의 평균 종양용적은 2.80 mm³ 인 반면, 실험군의 평균 종양용적은 0.66 mm³ 이었다. 대조군의 종양용적을 100% 로 환산한 결과, 실험군의 종양용적이 23.43 ± 3.09% (mean ± SEM)로 나타났다. 이에 비해 CMV 프로모터를 이용하는 경우 U87MG 신경교모세포종 동물모델에서 대조군의 평균 종양용적은 2.40 mm³ 인 반면, 실험군의 평균 종양용적은 1.57 mm³ 이었다. 대조군의 종양용적을 100% 로 환산한 결과, 실험군의 종양용적이 65.4 ± 5.2% (mean ± SEM)로 나타났다.

요약하면, CMV 프로모터를 이용한 경우 실험군의 종양용적이 대조군에 비해 65.4 ± 5.2%로 감소한 것에 비하여 CAG 프로모터를 이용한 경우 실험균의 종양용적이 대조군에 비해 23.43 ± 3.09%로 감소하여 현저하게 많이 감소함을 확인하였다(p < 0.01, non-paired t test).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 재조합 발현벡터는 숙주세포내에서 단백질을 효과적으로 발현할 수 있다. 따라서 본 발명의 재조합 발현벡터는 아데노바이러스를 이용한 숙주세포의 형질전환에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Adenoviral recombinant expression vector comprising CAG promoter <130> NP06-1041 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV ie enhancer region <400> 1 ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 60 gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 120 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 180 aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 240 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 300 acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 360 ccatg 365 <210> 2 <211> 278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chicken actin promoter region <400> 2 tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60 ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120 ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180 cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240 ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcg 278 <210> 3 <211> 243 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rabbit globin terminator region <400> 3 ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag atcgatcttt ttccctctgc caaaaattat 60 ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct aataaaggaa atttattttc 120 attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg gaaggacata tgggagggca 180 aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt tggcaacata tgcccatatg 240 taa 243 <210> 4 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile 1 5 10 15 Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile 20 25 30 Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys 35 40 45 Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg 50 55 60 Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu 65 70 75 80 Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe 85 90 95 Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met 100 105 110 Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu 115 120 125 Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly 130 135 140 Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp 145 150 155 160 Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His 165 170 175 Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 180 185 <210> 5 <211> 561 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 acctctgagg aaaccatttc tacagttcaa gaaaagcaac aaaatatttc tcccctagtg 60 agagaaagag gtcctcagag agtagcagct cacataactg ggaccagagg aagaagcaac 120 acattgtctt ctccaaactc caagaatgaa aaggctctgg gccgcaaaat aaactcctgg 180 gaatcatcaa ggagtgggca ttcattcctg agcaacttgc acttgaggaa tggtgaactg 240 gtcatccatg aaaaagggtt ttactacatc tattcccaaa catactttcg atttcaggag 300 gaaataaaag aaaacacaaa gaacgacaaa caaatggtcc aatatattta caaatacaca 360 agttatcctg accctatatt gttgatgaaa agtgctagaa atagttgttg gtctaaagat 420 gcagaatatg gactctattc catctatcaa gggggaatat ttgagcttaa ggaaaatgac 480 agaatttttg tttctgtaac aaatgagcac ttgatagaca tggaccatga agccagtttt 540 ttcggggcct ttttagttgg c 561 <210> 6 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser 85 90 95 Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 100 105 110 Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 135 140 Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 145 150 155 160 His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 165 170 175 His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190 Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 195 200 205 Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys 210 215 220 Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 245 250 255 Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala 260 265 270 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280 <210> 7 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isoleucine zipper domain <400> 7 Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile 1 5 10 15 Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu 20 25 30 Arg <210> 8 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig kappa chain leader <400> 8 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gac 63 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 9 ctcgagatca attctctagc caat 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 10 ggatccttac atatgggcat atgt 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 11 ctcgaggact acaaggatga c 21 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 12 ctcgagcacc cactcgtgca ggctgcc 27 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 13 ggtaccacct ctgaggaaac catttc 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 14 ctcgaggcca actaaaaagg ccccga 26 <210> 15 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Isoleucine zipper domain <400> 15 ggcatgaagc agatcgagga caaaattgag gaaatcctgt ccaagattta ccacatcgag 60 aacgagatcg cccggattaa gaaactcatt ggcgagggc 99 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 16 agatctatgg agacagacac actcct 26 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 17 tttgtgttac tcatagcgcg t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 18 attctttccc acccttaagc c 21 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 19 atggtgagca agcagatcct ga 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 20 cacccactcg tgcaggctgc cc 22

Claims

아데노바이러스용 재조합 발현벡터에 있어서, CMV 즉시초기 인핸서(cytomegalovirus immediate early enhancer), 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter), 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 구조유전자 및 토끼 β-글로빈 종결자(rabbit β-globin terminator)가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 CMV 즉시초기 인핸서는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며, 닭 β-액틴 프로모터는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지며, 상기 토끼 β-글로빈 종결자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스용 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 구조유전자는 서열번호 8의 Igκ- 체인 리더, 서열번호 15의 이소류신 지퍼 도메인(zipper domain) 및 서열번호 4의 TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)의 아폽토제닉 리셉터 바인딩 모이어티(apoptogenic receptor binding moiety)가 순차적으로 연결된 염기서열인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제3항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 도 1c 에 개시된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터를 이용하여 제조된 재조합 아데노바이러스.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포
(a) 목적 단백질(target protein)을 암호화하는 구조유전자를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 재조합 벡터를 이용하여 아데노바이러스를 제조하는 단계;

(c) 상기 아데노바이러스를 숙주세포에 감염시켜 형질전환체를 제조하는 단계; 및

(d) 상기 형질전환체에서 목적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 목적 단백질을 발현시키는 방법.
제7항에 있어서, 상기 구조유전자는 서열번호 8의 Igκ- 체인 리더, 서열번호 15의 이소류신 지퍼 도메인(zipper domain) 및 서열번호 4의 TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)의 아폽토제닉 리셉터 바인딩 모이어티(apoptogenic receptor binding moiety)가 순차적으로 연결된 염기서열인 것을 특징으로 하는 목적 단백질을 발현시키는 방법.
제7항에 있어서, 상기 숙주세포는 인간의 신경줄기세포인 것을 특징으로 하는 목적 단백질을 발현시키는 방법.