JPH0678784A - 遺伝子生産物の製造方法 - Google Patents
遺伝子生産物の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 遺伝子生産物のインビトロにおける生産方法
を提供することを目的とする。 【構成】 方法は、以下の段階：(a) 1)真核細胞の翻訳
因子(ETF) の真核細胞の翻訳阻害因子をコードする遺伝
子、2)少なくとも１つの内部リボソームエントリー部位
(IRES)、および、3)生産しようとするポリペプチドをコ
ードする少なくとも１つの遺伝子、を集合的に含む、真
核細胞のトランスフェクションを可能にする１またはそ
れより多くの組み換えヌクレオチドベクターを用意し；
(b) 上記のベクターで真核細胞の培養細胞をトランスフ
ェクションし；(c) トランスフェクションされた細胞の
培養細胞を、細胞活性を促進するのに適した条件下に保
ち；そして、(d) 上記培養細胞から所望の遺伝子生産物
を回収する；により構成される。
を提供することを目的とする。 【構成】 方法は、以下の段階：(a) 1)真核細胞の翻訳
因子(ETF) の真核細胞の翻訳阻害因子をコードする遺伝
子、2)少なくとも１つの内部リボソームエントリー部位
(IRES)、および、3)生産しようとするポリペプチドをコ
ードする少なくとも１つの遺伝子、を集合的に含む、真
核細胞のトランスフェクションを可能にする１またはそ
れより多くの組み換えヌクレオチドベクターを用意し；
(b) 上記のベクターで真核細胞の培養細胞をトランスフ
ェクションし；(c) トランスフェクションされた細胞の
培養細胞を、細胞活性を促進するのに適した条件下に保
ち；そして、(d) 上記培養細胞から所望の遺伝子生産物
を回収する；により構成される。
Description
【０００１】発明の分野 発明は、遺伝子生産物の合成に関する。もっと具体的に
は、発明は、遺伝子生産物、例えば、ポリペプチドおよ
び蛋白質を真核細胞内で高収率に生産する方法、そのた
めのベクター、それにより得られる生産物、そして、そ
れらの使用に関する。
は、発明は、遺伝子生産物、例えば、ポリペプチドおよ
び蛋白質を真核細胞内で高収率に生産する方法、そのた
めのベクター、それにより得られる生産物、そして、そ
れらの使用に関する。
【０００２】発明の背景 商業的価値をもつ様々な蛋白質およびペプチドの生産
は、遺伝子工学産業の確立および急速な成長のための基
礎である。これは、化学産業による通常の合成経路（適
用できない）よりも、洗練された組み換えDNA 技術の利
用により、容易にすることができる。これらの技術の核
心は、微生物、典型的には、標的蛋白をコードする適当
な遺伝子（適当な発現ベクター内で）を含むバクテリア
のインビボにおける発酵にある。発酵は、遺伝子を操作
された微生物の”収穫”、そして、数段の分離および精
製工程を通しての所望の生産物の単離が引き続き行われ
る。
は、遺伝子工学産業の確立および急速な成長のための基
礎である。これは、化学産業による通常の合成経路（適
用できない）よりも、洗練された組み換えDNA 技術の利
用により、容易にすることができる。これらの技術の核
心は、微生物、典型的には、標的蛋白をコードする適当
な遺伝子（適当な発現ベクター内で）を含むバクテリア
のインビボにおける発酵にある。発酵は、遺伝子を操作
された微生物の”収穫”、そして、数段の分離および精
製工程を通しての所望の生産物の単離が引き続き行われ
る。
【０００３】本法は、いくつかの欠点を持つ。(a) 微生
物内で発現した真核細胞の蛋白質は、しばしば適当に折
りたたまれていない；特にグリコシル化および複合体蛋
白の適当なコンフォメーションが正しく行われていな
い、(b) 大量に発現した蛋白は、しばしば、不溶の集合
体（顆粒画分）として沈殿し、この中から、変成剤中で
の化溶化によってのみ回収され得る。(c) 少量生産され
たとき生産細胞の細胞周辺項に別にわけられた蛋白質
は、大量に生産されたときは、しばしばそこには、別に
わけられ得ない。
物内で発現した真核細胞の蛋白質は、しばしば適当に折
りたたまれていない；特にグリコシル化および複合体蛋
白の適当なコンフォメーションが正しく行われていな
い、(b) 大量に発現した蛋白は、しばしば、不溶の集合
体（顆粒画分）として沈殿し、この中から、変成剤中で
の化溶化によってのみ回収され得る。(c) 少量生産され
たとき生産細胞の細胞周辺項に別にわけられた蛋白質
は、大量に生産されたときは、しばしばそこには、別に
わけられ得ない。
【０００４】上記のバクテリアの系と比較し、哺乳類の
発現技術は、特に高等な真核細胞の蛋白の発現にとっ
て、確かな利点をもっている。発現蛋白は、普通には、
適当に修飾されており、そして、正しい細胞区画内にほ
とんどいつも蓄積される。しかしながら、今までのとこ
ろ、哺乳類の発現技術は、小および中規模の仕事に対し
実用的であるが、工業規模で実施するには困難かつ非常
に高価なものとなる。
発現技術は、特に高等な真核細胞の蛋白の発現にとっ
て、確かな利点をもっている。発現蛋白は、普通には、
適当に修飾されており、そして、正しい細胞区画内にほ
とんどいつも蓄積される。しかしながら、今までのとこ
ろ、哺乳類の発現技術は、小および中規模の仕事に対し
実用的であるが、工業規模で実施するには困難かつ非常
に高価なものとなる。
【０００５】真核細胞生物では、蛋白質の合成は、リボ
ソームの走査モデルにより仲介される。リボソームの(4
0S) サブユニット（Met-tRNAおよび各種の開始因子を坦
持する）は、部分的にmRNAの5'末端に結合し、そして、
その後、5'-3' の方向に移動し、翻訳開始のための好ま
しい文脈中の最初のAUG コドンで停止する。
ソームの走査モデルにより仲介される。リボソームの(4
0S) サブユニット（Met-tRNAおよび各種の開始因子を坦
持する）は、部分的にmRNAの5'末端に結合し、そして、
その後、5'-3' の方向に移動し、翻訳開始のための好ま
しい文脈中の最初のAUG コドンで停止する。
【０００６】真核細胞では、全ての細胞の細胞質mRNA
は、それらの5'末端に接続している7-メチルグアニル酸
のキャップを担持する。mRNAの近くまたは5'末端でのリ
ボソームサブユニットの結合は、メチル化されたキャッ
プ構造とキャップ結合蛋白複合体（eIF-4Fを含む）との
相互作用により容易になる。
は、それらの5'末端に接続している7-メチルグアニル酸
のキャップを担持する。mRNAの近くまたは5'末端でのリ
ボソームサブユニットの結合は、メチル化されたキャッ
プ構造とキャップ結合蛋白複合体（eIF-4Fを含む）との
相互作用により容易になる。
【０００７】発明の要約 真核細胞内での遺伝子生産物の製造が工業規模でかつ経
済的なやり方で実施でき得る如き方法を提供し得ること
が、高く望まれるであろうことは、それ故に、明らかで
ある。
済的なやり方で実施でき得る如き方法を提供し得ること
が、高く望まれるであろうことは、それ故に、明らかで
ある。
【０００８】本発明の目的は、真核細胞内での遺伝子生
産物に固有の今までの限界を乗り越えるような方法を提
供することである。発明の他の目的は、方法およびこの
目的のために使用され得る組み換えヌクレオチドベクタ
ーを提供することである。発明のさらに他の目的は、製
造条件下、それにより細胞の活性が制御され得る方法を
提供することである。
産物に固有の今までの限界を乗り越えるような方法を提
供することである。発明の他の目的は、方法およびこの
目的のために使用され得る組み換えヌクレオチドベクタ
ーを提供することである。発明のさらに他の目的は、製
造条件下、それにより細胞の活性が制御され得る方法を
提供することである。
【０００９】用語”遺伝子生産物”もしくは”ポリペプ
チド”もしくは”蛋白質”が使用されたとき、必要な変
更を加えて、相互に交換できるものとして使用されるこ
とを意味すると理解されなければならない。本文中で使
用されるものとして、以下の用語は、以下に示す意味を
もつ。
チド”もしくは”蛋白質”が使用されたとき、必要な変
更を加えて、相互に交換できるものとして使用されるこ
とを意味すると理解されなければならない。本文中で使
用されるものとして、以下の用語は、以下に示す意味を
もつ。
【００１０】BiP - ヒト免疫グロブリンのＨ鎖- 結合蛋
白（GRP78 としても知られている）ETF - 真核細胞の翻訳因子、例えば、eIF-4F複合体細胞外製造 - 適当な培地中、細胞活性のまねによる、宿
主細胞外での１またはそれより多くの選択されたポリペ
プチドの製造遺伝子生産物 - ポリペプチドおよび蛋白質を含んで成る
- これに限定されないが- 翻訳生産物インビトロ製造 - 真核細胞系での１またはそれより多く
の選択されたポリペプチドの製造インビボ治療方法 - 患者の細胞の取り出し（この場合ex
vivo である）およびそれらの操作後の患者への導入、
または、患者への直接投与による、生体での組み換え技
術の使用IRES - 内部リボソームのエントリー部位組み換えヌクレオチドベクター - 組み換えヌクレオチド
配列(DNAまたはRNA)を含むベクターTIF - 真核細胞の翻訳阻害因子トランスフェクション - 発現されるべき１またはそれよ
り多くの遺伝子をコードする組み換えヌクレオチド配列
(DNAまたはRNA)を含むベクターの、宿主細胞への導入UTR - ピコルナウイルスのまたはBiP の5'未翻訳部位を
含むIRESベクター - プラスミド、ウイルス、ファージおよび同様
のものを含む（これに限定されないが）自己複製または
組み込み剤
白（GRP78 としても知られている）ETF - 真核細胞の翻訳因子、例えば、eIF-4F複合体細胞外製造 - 適当な培地中、細胞活性のまねによる、宿
主細胞外での１またはそれより多くの選択されたポリペ
プチドの製造遺伝子生産物 - ポリペプチドおよび蛋白質を含んで成る
- これに限定されないが- 翻訳生産物インビトロ製造 - 真核細胞系での１またはそれより多く
の選択されたポリペプチドの製造インビボ治療方法 - 患者の細胞の取り出し（この場合ex
vivo である）およびそれらの操作後の患者への導入、
または、患者への直接投与による、生体での組み換え技
術の使用IRES - 内部リボソームのエントリー部位組み換えヌクレオチドベクター - 組み換えヌクレオチド
配列(DNAまたはRNA)を含むベクターTIF - 真核細胞の翻訳阻害因子トランスフェクション - 発現されるべき１またはそれよ
り多くの遺伝子をコードする組み換えヌクレオチド配列
(DNAまたはRNA)を含むベクターの、宿主細胞への導入UTR - ピコルナウイルスのまたはBiP の5'未翻訳部位を
含むIRESベクター - プラスミド、ウイルス、ファージおよび同様
のものを含む（これに限定されないが）自己複製または
組み込み剤
【００１１】本発明は、特に、操作された遺伝子生産物
のキャップ構造非依存性翻訳が進行するのを許容しなが
ら、細胞蛋白質のキャップ構造依存性翻訳が阻害される
ような方法およびベクターに向けられる。
のキャップ構造非依存性翻訳が進行するのを許容しなが
ら、細胞蛋白質のキャップ構造依存性翻訳が阻害される
ような方法およびベクターに向けられる。
【００１２】一般的に言って、発明に記載の遺伝子生産
物のインビトロにおける製造方法は、以下の段階： (a) 1)真核細胞の翻訳因子(ETF) のTIF をコードする遺
伝子、2)少なくとも１つの内部リボソームエントリー部
位(IRES)、および、3)生産しようとするポリペプチドを
コードする少なくとも１つの遺伝子を集合的に含む、真
核細胞におけるトランスフェクションを可能にする１ま
たはそれより多くの組み換えヌクレオチドベクターを用
意し； (b) 上記のベクターで真核細胞の培養細胞をトランスフ
ェクションし； (c) トランスフェクションされた細胞の培養細胞を、細
胞活性を促進するのに適した条件下に保ち；そして、 (d) 上記培養細胞から所望の遺伝子生産物を回収する；
を含んで成る。
物のインビトロにおける製造方法は、以下の段階： (a) 1)真核細胞の翻訳因子(ETF) のTIF をコードする遺
伝子、2)少なくとも１つの内部リボソームエントリー部
位(IRES)、および、3)生産しようとするポリペプチドを
コードする少なくとも１つの遺伝子を集合的に含む、真
核細胞におけるトランスフェクションを可能にする１ま
たはそれより多くの組み換えヌクレオチドベクターを用
意し； (b) 上記のベクターで真核細胞の培養細胞をトランスフ
ェクションし； (c) トランスフェクションされた細胞の培養細胞を、細
胞活性を促進するのに適した条件下に保ち；そして、 (d) 上記培養細胞から所望の遺伝子生産物を回収する；
を含んで成る。
【００１３】発明の態様に従えば、ETF は、eIF-4F複合
体を含んで成るか、または、本質的にeIF-4F複合体から
成る。
体を含んで成るか、または、本質的にeIF-4F複合体から
成る。
【００１４】発明の他の態様に従えば、組み換えヌクレ
オチドベクターは、DNA またはRNAベクターであり得
る。
オチドベクターは、DNA またはRNAベクターであり得
る。
【００１５】発明の１つの態様において、組み換えヌク
レオチドベクターは、同一のベクター内に、1)真核細胞
のキャップ構造依存性プロモーターに先行されるTIF を
コードする配列、および、2)IRESに先行される所望の遺
伝子生産物をコードする配列を含んで成る。
レオチドベクターは、同一のベクター内に、1)真核細胞
のキャップ構造依存性プロモーターに先行されるTIF を
コードする配列、および、2)IRESに先行される所望の遺
伝子生産物をコードする配列を含んで成る。
【００１６】発明の異なる態様において、組み換えヌク
レオチドベクターは、同一のベクター内に、1)IRESに先
行されるTIF をコードする配列、および、2)IRESに先行
される所望の遺伝子生産物をコードする配列を含んで成
る。
レオチドベクターは、同一のベクター内に、1)IRESに先
行されるTIF をコードする配列、および、2)IRESに先行
される所望の遺伝子生産物をコードする配列を含んで成
る。
【００１７】好ましくは、しかし非限定的であるが、TI
F をコードする遺伝子はポリオウイルス 2A プロテアー
ゼの cDNA であり、そして、IRES部位はピコルナウイル
スのまたは BiP(UTR) のIRES部位である。記載するごと
く、好ましいピコルナウイルスはポリオウイルスまたは
脳心筋炎ウイルス(EMCV)である。
F をコードする遺伝子はポリオウイルス 2A プロテアー
ゼの cDNA であり、そして、IRES部位はピコルナウイル
スのまたは BiP(UTR) のIRES部位である。記載するごと
く、好ましいピコルナウイルスはポリオウイルスまたは
脳心筋炎ウイルス(EMCV)である。
【００１８】他の視点では、発明に記載の遺伝子生産物
のインビトロにおける製造方法は、以下の段階： a)真核細胞のキャップ構造依存性プロモーターに先行さ
れるTIF をコードする配列を含んで成る第１組み換えヌ
クレオチドベクターを用意し； b)IRESに先行される所望の遺伝子生産物をコードする配
列を少なくとも含んで成る第２組み換えヌクレオチドベ
クターを用意し； c)上記の第１ベクターと第２ベクターの両方で、真核細
胞の培養細胞をトランスフェクションし； d)トランスフェクションされた細胞の培養細胞を、細胞
活性を促進するのに適した条件下に保ち；そして、 e)上記培養細胞から所望の遺伝子生産物を回収する；を
含んで成る。
のインビトロにおける製造方法は、以下の段階： a)真核細胞のキャップ構造依存性プロモーターに先行さ
れるTIF をコードする配列を含んで成る第１組み換えヌ
クレオチドベクターを用意し； b)IRESに先行される所望の遺伝子生産物をコードする配
列を少なくとも含んで成る第２組み換えヌクレオチドベ
クターを用意し； c)上記の第１ベクターと第２ベクターの両方で、真核細
胞の培養細胞をトランスフェクションし； d)トランスフェクションされた細胞の培養細胞を、細胞
活性を促進するのに適した条件下に保ち；そして、 e)上記培養細胞から所望の遺伝子生産物を回収する；を
含んで成る。
【００１９】さらに他の視点では、発明に記載の遺伝子
生産物のインビトロにおける製造方法は、以下の段階： a)IRESに先行されるTIF をコードする配列を含んで成る
第１組み換えヌクレオチドベクターを用意し； b)IRESに先行される所望の遺伝子生産物をコードする配
列を少なくとも含んで成る第２組み換えヌクレオチドベ
クターを用意し； c)上記の第１ベクターと第２ベクターの両方で、真核細
胞の培養細胞をトランスフェクションし； d)トランスフェクションされた細胞の培養細胞を、細胞
活性を促進するのに適した条件下に保ち、そして； e)上記培養細胞から所望の遺伝子生産物を回収する；を
含んで成る。
生産物のインビトロにおける製造方法は、以下の段階： a)IRESに先行されるTIF をコードする配列を含んで成る
第１組み換えヌクレオチドベクターを用意し； b)IRESに先行される所望の遺伝子生産物をコードする配
列を少なくとも含んで成る第２組み換えヌクレオチドベ
クターを用意し； c)上記の第１ベクターと第２ベクターの両方で、真核細
胞の培養細胞をトランスフェクションし； d)トランスフェクションされた細胞の培養細胞を、細胞
活性を促進するのに適した条件下に保ち、そして； e)上記培養細胞から所望の遺伝子生産物を回収する；を
含んで成る。
【００２０】以下でより詳しく説明するが、発明の好ま
しい態様は、例えば、TIF 発現の外部活性化がメタロチ
オネイン活性によって仲介されることによる、TIF 発現
の外部活性化を提供することを、さらに含んで成る。記
載するごとく、遺伝子生産物は、いかなる有用な物質
に、例えば、ポリペプチドまたは蛋白質になり得る。
しい態様は、例えば、TIF 発現の外部活性化がメタロチ
オネイン活性によって仲介されることによる、TIF 発現
の外部活性化を提供することを、さらに含んで成る。記
載するごとく、遺伝子生産物は、いかなる有用な物質
に、例えば、ポリペプチドまたは蛋白質になり得る。
【００２１】したがって、１つの態様においては、発明
に記載の方法は、真核細胞の翻訳開始因子の、例えばeI
F-4FのTIF を、そして、翻訳開始と内部リボソーム結合
機構とを仲介できる内部リボソームエントリー部位(IRE
S)をコードする遺伝子（引き続き製造しようとするポリ
ペプチドをコードする遺伝子が続く）、を含む組み換え
ヌクレオチドベクターによる真核細胞の形質転換を含ん
で成る。
に記載の方法は、真核細胞の翻訳開始因子の、例えばeI
F-4FのTIF を、そして、翻訳開始と内部リボソーム結合
機構とを仲介できる内部リボソームエントリー部位(IRE
S)をコードする遺伝子（引き続き製造しようとするポリ
ペプチドをコードする遺伝子が続く）、を含む組み換え
ヌクレオチドベクターによる真核細胞の形質転換を含ん
で成る。
【００２２】このように、発明に従えば、全ての宿主細
胞のmRNAの細胞内翻訳は、このような翻訳の開始に必要
なETF 、例えばeIF-4F複合体の不活性化により、阻害ま
たは実質的に回避され、これによって、正常細胞の蛋白
の発現は、実質的に回避され、そして、mRNAの翻訳は、
IRESを介してのみ本質的に可能となる。したがって、IR
ESに続く所望ポリペプチドをコードする遺伝子は、ETF
が不活性化されている間、細胞内で発現され得る実質的
に唯一の遺伝子である。
胞のmRNAの細胞内翻訳は、このような翻訳の開始に必要
なETF 、例えばeIF-4F複合体の不活性化により、阻害ま
たは実質的に回避され、これによって、正常細胞の蛋白
の発現は、実質的に回避され、そして、mRNAの翻訳は、
IRESを介してのみ本質的に可能となる。したがって、IR
ESに続く所望ポリペプチドをコードする遺伝子は、ETF
が不活性化されている間、細胞内で発現され得る実質的
に唯一の遺伝子である。
【００２３】もちろん、以下にさらに説明するが、IRES
に先行されるTIF 活性および遺伝子発現は、いずれも細
胞に導入される２またはそれより多くの異なったベクタ
ーに分けられ得る。別々のベクター間のこのような機能
の分離は、１つのベクターへそれらを包括することと実
質的に等価であり、そして、例えば、本発明の一部も構
成する。
に先行されるTIF 活性および遺伝子発現は、いずれも細
胞に導入される２またはそれより多くの異なったベクタ
ーに分けられ得る。別々のベクター間のこのような機能
の分離は、１つのベクターへそれらを包括することと実
質的に等価であり、そして、例えば、本発明の一部も構
成する。
【００２４】本発明によれば、選択されたポリペプチド
の発現は、全ての場合に、IRESと共にそれをコードする
遺伝子の先行により得られるが、TIF の発現は、TIF の
ためにIRESを用意することにより内部機構を通して得る
ことができ、TIF の発現はキャップ機構依存性翻訳開始
を経由しても可能となる。第１の場合には、TIF は、連
続的に発現し、そして、以下に説明するように追加の介
入が行われないとき、細胞の死滅は比較的速く起こるで
あろう。第２の場合には、細胞活性の封じ込めは、TIF
の翻訳の停止も導き、これにより、細胞の寿命を延長す
る正常細胞の活性の周期的回復を可能にするであろう。
の発現は、全ての場合に、IRESと共にそれをコードする
遺伝子の先行により得られるが、TIF の発現は、TIF の
ためにIRESを用意することにより内部機構を通して得る
ことができ、TIF の発現はキャップ機構依存性翻訳開始
を経由しても可能となる。第１の場合には、TIF は、連
続的に発現し、そして、以下に説明するように追加の介
入が行われないとき、細胞の死滅は比較的速く起こるで
あろう。第２の場合には、細胞活性の封じ込めは、TIF
の翻訳の停止も導き、これにより、細胞の寿命を延長す
る正常細胞の活性の周期的回復を可能にするであろう。
【００２５】後で十分理解されるであろうが、正常な細
胞翻訳活性の封じ込めは、全ての細胞のエネルギーを、
選択された蛋白の翻訳に利用可能なものとする。したが
って、いくつかの場合は、IRES- 仲介のTIF 翻訳を経由
した不可逆的封じ込めは、選択された蛋白の劇的に改良
された発現を導き、短時間内での細胞の死滅は、このよ
うな生産水準においては、ある場合に受け入れられるで
あろう。
胞翻訳活性の封じ込めは、全ての細胞のエネルギーを、
選択された蛋白の翻訳に利用可能なものとする。したが
って、いくつかの場合は、IRES- 仲介のTIF 翻訳を経由
した不可逆的封じ込めは、選択された蛋白の劇的に改良
された発現を導き、短時間内での細胞の死滅は、このよ
うな生産水準においては、ある場合に受け入れられるで
あろう。
【００２６】発明の１つの態様にしたがえば、TIF 翻訳
の外部制御は、以下により十分に記述するが、例えば、
培養培地への金属イオンの添加による活性化によって得
るこよができる。したがって、外部活性化の封じ込め
は、キャップ構造依存性または非依存性TIF 翻訳の選択
と一緒になって、高い汎用性および融通性を与える。
の外部制御は、以下により十分に記述するが、例えば、
培養培地への金属イオンの添加による活性化によって得
るこよができる。したがって、外部活性化の封じ込め
は、キャップ構造依存性または非依存性TIF 翻訳の選択
と一緒になって、高い汎用性および融通性を与える。
【００２７】当業者にとっては明らかであるが、TIF お
よびIRESをコードする遺伝子並びに発現されるべき蛋白
質の多種類のものが、発明の範囲を超えることなく提供
され得る、そして、TIF をコードする遺伝子、IRES、お
よび製造されるべきポリペプチドをコードする遺伝子を
順次含む全ての組み換えヌクレオチドベクターは、本発
明に包含される。TIF は、本明細書で説明されるように
所望の結果に依存して、IRESまたはキャップ構造依存性
プロモーターによって、先行され得る。
よびIRESをコードする遺伝子並びに発現されるべき蛋白
質の多種類のものが、発明の範囲を超えることなく提供
され得る、そして、TIF をコードする遺伝子、IRES、お
よび製造されるべきポリペプチドをコードする遺伝子を
順次含む全ての組み換えヌクレオチドベクターは、本発
明に包含される。TIF は、本明細書で説明されるように
所望の結果に依存して、IRESまたはキャップ構造依存性
プロモーターによって、先行され得る。
【００２８】このような遺伝子および配列の代表的な、
しかし非限定的な例は、さらに十分に以下で詳しく述べ
るが、ピコルナウイルスのまたはBiP のIRES部位、並び
にポリオウイルス 2A プロテアーゼのcDNAを含む。もち
ろん、非機能的配列は、本発明に影響しないから、様々
な遺伝子間に存在することができ、そして、用語”順
次”は、機能的な配列のみに関して、理解されるべきで
ある。
しかし非限定的な例は、さらに十分に以下で詳しく述べ
るが、ピコルナウイルスのまたはBiP のIRES部位、並び
にポリオウイルス 2A プロテアーゼのcDNAを含む。もち
ろん、非機能的配列は、本発明に影響しないから、様々
な遺伝子間に存在することができ、そして、用語”順
次”は、機能的な配列のみに関して、理解されるべきで
ある。
【００２９】ピコルナウイルスは、哺乳類のプラス鎖 R
NAウイルスであり、そのゲノムは、mRNAとして役立つ。
約400 ヌクレオチドの長さの5'非翻訳部位(UTR) の大き
なセグメントは、mRNAの非キャップ構造の5'末端から独
立してリボソームの”内的”エントリーを促進する。こ
のように、ウイルスのmRNAは、リボソームが直接的にmR
NAの内部の部位に結合するという機構によって、翻訳さ
れる。
NAウイルスであり、そのゲノムは、mRNAとして役立つ。
約400 ヌクレオチドの長さの5'非翻訳部位(UTR) の大き
なセグメントは、mRNAの非キャップ構造の5'末端から独
立してリボソームの”内的”エントリーを促進する。こ
のように、ウイルスのmRNAは、リボソームが直接的にmR
NAの内部の部位に結合するという機構によって、翻訳さ
れる。
【００３０】ポリオウイルスは、(+) 鎖ピコルナウイル
スであり、ウイルスRNA のほとんどにわたるオープンリ
ーディングフレームによりコードされているそのポリ蛋
白質は、該ウイルスによりコードされているプロテアー
ゼ(TIF) によりプロセシングされる。ピコルナウイルス
は、宿主細胞のmRNAの翻訳の劇的な封じ込めを引き起こ
す（感染後数時間以内）。
スであり、ウイルスRNA のほとんどにわたるオープンリ
ーディングフレームによりコードされているそのポリ蛋
白質は、該ウイルスによりコードされているプロテアー
ゼ(TIF) によりプロセシングされる。ピコルナウイルス
は、宿主細胞のmRNAの翻訳の劇的な封じ込めを引き起こ
す（感染後数時間以内）。
【００３１】封じ込めの機構は、真核細胞の翻訳開始因
子eIF-4F(ETF) の不活性化に関係する。ポリオウイルス
は、翻訳開始過程の一部分としてキャップ構造をもつmR
NAの40S リボソームへの結合を助成するeIF-4F因子のP2
20成分の解裂を誘導する。P220成分の解裂は、ポリオウ
イルスプロテアーゼ 2A(TIF)により引き起こされる。こ
のように、ウイルスの戦略は、ポリオのウイルスRNA の
キャップ構造非依存性の内部翻訳を許容しながら、細胞
のmRNAにより使用されるキャップ構造依存性翻訳の開始
を妨害することにある。
子eIF-4F(ETF) の不活性化に関係する。ポリオウイルス
は、翻訳開始過程の一部分としてキャップ構造をもつmR
NAの40S リボソームへの結合を助成するeIF-4F因子のP2
20成分の解裂を誘導する。P220成分の解裂は、ポリオウ
イルスプロテアーゼ 2A(TIF)により引き起こされる。こ
のように、ウイルスの戦略は、ポリオのウイルスRNA の
キャップ構造非依存性の内部翻訳を許容しながら、細胞
のmRNAにより使用されるキャップ構造依存性翻訳の開始
を妨害することにある。
【００３２】ポリオウイルス 2A は、プロテアーゼであ
り、その成熟体は、 2A それ自体による N末端でのおよ
び他のプロテアーゼ 3C による C末端での、ポリオウイ
ルスの前駆体ポリ蛋白質の解裂により生成される[Fl.To
yoda et al.,1988, Cell 45,pp.761-770] 。
り、その成熟体は、 2A それ自体による N末端でのおよ
び他のプロテアーゼ 3C による C末端での、ポリオウイ
ルスの前駆体ポリ蛋白質の解裂により生成される[Fl.To
yoda et al.,1988, Cell 45,pp.761-770] 。
【００３３】全ての宿主細胞mRNAのキャップ構造依存性
翻訳が阻害される時点で、免疫グロブリンのＨ鎖結合蛋
白(BiP) をコードする細胞のmRNAがポリオウイルス感染
細胞内で翻訳され得ることは、知られている。BiP(UTR)
の5'リーダーは、哺乳類細胞中でのmRNAへの内部リボソ
ーム結合を直接的に提供することができる。
翻訳が阻害される時点で、免疫グロブリンのＨ鎖結合蛋
白(BiP) をコードする細胞のmRNAがポリオウイルス感染
細胞内で翻訳され得ることは、知られている。BiP(UTR)
の5'リーダーは、哺乳類細胞中でのmRNAへの内部リボソ
ーム結合を直接的に提供することができる。
【００３４】当業者にとっては理解されるであろうが、
そして上述したように、細胞蛋白質の発現の封じ込め、
および、選択された蛋白質の増強された生産は、結局
は、細胞の死滅をもたらすであろう。したがって、本発
明の１つの態様に従えば、細胞は、１回の生産サイクル
で使用され得るし、そして、細胞が死滅する前に生産さ
れたいかなるポリペプチドもそれから回収し得る。もち
ろん、安定した細胞系は、選択された蛋白質を生産する
ために操作され得る。
そして上述したように、細胞蛋白質の発現の封じ込め、
および、選択された蛋白質の増強された生産は、結局
は、細胞の死滅をもたらすであろう。したがって、本発
明の１つの態様に従えば、細胞は、１回の生産サイクル
で使用され得るし、そして、細胞が死滅する前に生産さ
れたいかなるポリペプチドもそれから回収し得る。もち
ろん、安定した細胞系は、選択された蛋白質を生産する
ために操作され得る。
【００３５】発明の他の好ましい態様に従えば、他方で
は、細胞は、適当な誘導可能なプロモーターによる、製
造される 2A プロテアーゼの量的調整により、インビト
ロにおける多数の合成サイクルにおいて利用される。
は、細胞は、適当な誘導可能なプロモーターによる、製
造される 2A プロテアーゼの量的調整により、インビト
ロにおける多数の合成サイクルにおいて利用される。
【００３６】トランスフェクションおよび続いて起こる
2A プロテアーゼの細胞内での発現の後、eIF-4F(ETF)
複合体は、不活性化されるであろう。結果として、キャ
ップ構造を有する細胞mRNAは、ポリソームと結合するこ
とはできないであろう。一方、選択された蛋白質mRNAの
内部リボソーム結合機構による翻訳開始は続くであろ
う。それは、eIF-4F(ETF) 複合体とは独立しているから
である。
2A プロテアーゼの細胞内での発現の後、eIF-4F(ETF)
複合体は、不活性化されるであろう。結果として、キャ
ップ構造を有する細胞mRNAは、ポリソームと結合するこ
とはできないであろう。一方、選択された蛋白質mRNAの
内部リボソーム結合機構による翻訳開始は続くであろ
う。それは、eIF-4F(ETF) 複合体とは独立しているから
である。
【００３７】もし 2A プロテアーゼがキャップ構造依存
の機構を経由して翻訳されれば、 2A プロテアーゼ量が
細胞内で増加すれば直ちに、その生産は、その翻訳の減
速のために低下するであろう。次に、細胞は、一時的に
正常活性に戻り、細胞の生存率を確保するために必要な
代謝プロセスを回復するであろう。そのとき、 2A プロ
テアーゼの生産も回復され、再び全サイクルが始まり、
そしてこれを繰り返すであろう。これが、いわゆる、”
オン- オフ翻訳”機構である。
の機構を経由して翻訳されれば、 2A プロテアーゼ量が
細胞内で増加すれば直ちに、その生産は、その翻訳の減
速のために低下するであろう。次に、細胞は、一時的に
正常活性に戻り、細胞の生存率を確保するために必要な
代謝プロセスを回復するであろう。そのとき、 2A プロ
テアーゼの生産も回復され、再び全サイクルが始まり、
そしてこれを繰り返すであろう。これが、いわゆる、”
オン- オフ翻訳”機構である。
【００３８】当業者にはさらに明白であろうが、本発明
は、蛋白質欠損細胞での蛋白質生産の増加を要求する治
療方法において、インビボでの遺伝子治療としても使用
される。もちろん、最終的に細胞を死に至らしめる物質
を製造することも可能である。これは、例えば、癌治療
にも有効である。生産される物質は、例えば、毒素もし
くは 2A プロテアーゼ、または最終的に細胞を死に至ら
しめるであろう他の適当な物質であろう。したがって、
IRESにより先行される、要求される蛋白質をコードする
所望の遺伝子を含み、そして、それが必要である患者の
細胞へのトランスフェクションにおける適当な医薬調製
において使用され得る、適当なベクターを構築すること
ができる。もちろん、このようなベクターおよび医薬調
製も本発明の一部を構成する。
は、蛋白質欠損細胞での蛋白質生産の増加を要求する治
療方法において、インビボでの遺伝子治療としても使用
される。もちろん、最終的に細胞を死に至らしめる物質
を製造することも可能である。これは、例えば、癌治療
にも有効である。生産される物質は、例えば、毒素もし
くは 2A プロテアーゼ、または最終的に細胞を死に至ら
しめるであろう他の適当な物質であろう。したがって、
IRESにより先行される、要求される蛋白質をコードする
所望の遺伝子を含み、そして、それが必要である患者の
細胞へのトランスフェクションにおける適当な医薬調製
において使用され得る、適当なベクターを構築すること
ができる。もちろん、このようなベクターおよび医薬調
製も本発明の一部を構成する。
【００３９】トランスフェクトされるべき特定のベクタ
ーの標的を、単独でまたは主に、細胞の特定タイプに集
中させることは、当業者にも知られている。もちろん、
これは、本発明の方法およびベクターを使用する各種の
治療方法にとっても有益である。
ーの標的を、単独でまたは主に、細胞の特定タイプに集
中させることは、当業者にも知られている。もちろん、
これは、本発明の方法およびベクターを使用する各種の
治療方法にとっても有益である。
【００４０】IRESに先行される遺伝子の翻訳に必要な細
胞の条件をまねる培地中での適当なmRNA構築物の使用に
よる、細胞外でのポリペプチド製造も、本発明に包含さ
れる。
胞の条件をまねる培地中での適当なmRNA構築物の使用に
よる、細胞外でのポリペプチド製造も、本発明に包含さ
れる。
【００４１】したがって、１つの視点では、発明は、以
下の段階： a)IRESに先行される所望の遺伝子生産物をコードする少
なくとも１つの配列を含んで成る組み換えヌクレオチド
ベクターを含む培地を用意し； b)培地の基質中に、翻訳に効果を及ぼすために要求され
るリボソームおよびプロモーターを用意し； c)遺伝子の発現を促進するために適当な条件下で培地を
保ち；そして、 d)上記培地から所望の遺伝子生産物を回収する；を含ん
で成る遺伝子生産物の細胞外での製造方法に向けられて
いる。
下の段階： a)IRESに先行される所望の遺伝子生産物をコードする少
なくとも１つの配列を含んで成る組み換えヌクレオチド
ベクターを含む培地を用意し； b)培地の基質中に、翻訳に効果を及ぼすために要求され
るリボソームおよびプロモーターを用意し； c)遺伝子の発現を促進するために適当な条件下で培地を
保ち；そして、 d)上記培地から所望の遺伝子生産物を回収する；を含ん
で成る遺伝子生産物の細胞外での製造方法に向けられて
いる。
【００４２】好ましい態様の詳細な説明 例示によって、そして、いずれの方法によっても発明を
限定することなく、発明の具体的な態様が、図を参照し
ながら以下に記載される。
限定することなく、発明の具体的な態様が、図を参照し
ながら以下に記載される。
【００４３】例１ AcChoEase の発現 Ａ．発現ベクターの構築 BiP またはポリオウイルス由来のUTR 並びにポリオウイ
ルスcDNA由来の2A領域の配列を持つ宿主蛋白合成の封じ
込めのための発現ベクターの構築のために、3'末端にpo
ly A配列（図１）を含む pSP64ベクター(Promega) が使
用された。加えて、効果的な真核細胞の発現ベクターで
あるPM2 が使用された。PM2 プラスミド（図２）は、Ha
rveyネズミ肉腫ウイルスのロングターミナルリピート(L
TR) 、G418およびアンピシリン抗生物質にそれぞれ耐性
を与えるバクテリアの遺伝子NeoおよびAmp を含んでい
る。それゆえに、PM2 は、安定したトランスフェクトさ
れた細胞系のために、効果的な選択要素として与えられ
ることができる。以下の構築物は、BamHI クローニング
部位（図３）でPM2 へ連結された。
ルスcDNA由来の2A領域の配列を持つ宿主蛋白合成の封じ
込めのための発現ベクターの構築のために、3'末端にpo
ly A配列（図１）を含む pSP64ベクター(Promega) が使
用された。加えて、効果的な真核細胞の発現ベクターで
あるPM2 が使用された。PM2 プラスミド（図２）は、Ha
rveyネズミ肉腫ウイルスのロングターミナルリピート(L
TR) 、G418およびアンピシリン抗生物質にそれぞれ耐性
を与えるバクテリアの遺伝子NeoおよびAmp を含んでい
る。それゆえに、PM2 は、安定したトランスフェクトさ
れた細胞系のために、効果的な選択要素として与えられ
ることができる。以下の構築物は、BamHI クローニング
部位（図３）でPM2 へ連結された。
【００４４】構築物 3(a) の調製 対照のキャップ構造をもつリポーター遺伝子として、ヒ
トアセチルコリンエステラーゼ(AcChoEase) 遺伝子が使
用された。BamHI およびSmaI部位は、それぞれ、AcChoE
ase のcDNAのコドン 1および2005で作られた。BamHI-Sm
aI断片は、 pSP64ベクターにクローニング部位で連結さ
れた。3'末端のEcoRI 部位は、クレノウ酵素およびBamH
I 消化に特異的な制限部位を含む合成オリゴヌクレオチ
ドのリンカーの使用により、BamHI 部位に変更された。
AcChoEase のcDNAおよびpoly Aを含むBamHI-BamHI 断片
合成物は、PM2 のBamHI クローニング部位に挿入され
た。
トアセチルコリンエステラーゼ(AcChoEase) 遺伝子が使
用された。BamHI およびSmaI部位は、それぞれ、AcChoE
ase のcDNAのコドン 1および2005で作られた。BamHI-Sm
aI断片は、 pSP64ベクターにクローニング部位で連結さ
れた。3'末端のEcoRI 部位は、クレノウ酵素およびBamH
I 消化に特異的な制限部位を含む合成オリゴヌクレオチ
ドのリンカーの使用により、BamHI 部位に変更された。
AcChoEase のcDNAおよびpoly Aを含むBamHI-BamHI 断片
合成物は、PM2 のBamHI クローニング部位に挿入され
た。
【００４５】構築物 3(b) の調製 宿主の蛋白合成の封じ込めのために、ポリオ5'UTR およ
び 2A プロテアーゼをコードする領域を含むプラスミド
が構築された。PM2 プラスミドを使用した 2Aプロテア
ーゼの発現は、キャップ構造非依存性機構によった。Ba
mHI およびSmaI部位は、それぞれ、ポリオウイルスcDNA
のコドン 1および 698で作られた。加えて、SmaIおよび
SacI部位は、それぞれ、コドン 3386 および 3832 で作
られた。それらの２つの断片、すなわちUTR を含むBamH
I-SmaIおよび 2A 領域を含むSmaI- SacIは、 pSP64ベク
ターのクローニング部位にフレーム内に連結された。3'
末端のEcoRI 部位は、上記のようにBamHI 部位に変更さ
れた。UTR 、2AおよびpolyAを含むBamHI-BamHI 断片合
成物は、PM2 のBamHI クローニング部位に挿入された。
び 2A プロテアーゼをコードする領域を含むプラスミド
が構築された。PM2 プラスミドを使用した 2Aプロテア
ーゼの発現は、キャップ構造非依存性機構によった。Ba
mHI およびSmaI部位は、それぞれ、ポリオウイルスcDNA
のコドン 1および 698で作られた。加えて、SmaIおよび
SacI部位は、それぞれ、コドン 3386 および 3832 で作
られた。それらの２つの断片、すなわちUTR を含むBamH
I-SmaIおよび 2A 領域を含むSmaI- SacIは、 pSP64ベク
ターのクローニング部位にフレーム内に連結された。3'
末端のEcoRI 部位は、上記のようにBamHI 部位に変更さ
れた。UTR 、2AおよびpolyAを含むBamHI-BamHI 断片合
成物は、PM2 のBamHI クローニング部位に挿入された。
【００４６】構築物 3(c) の調製 2Aプロテアーゼをコードする領域は、PM2 へと構築され
た。このプラスミドを使用した2Aプロテアーゼの発現
は、キャップ構造依存性機構によった。この機構による
2Aプロテアーゼの発現は、2Aプロテアーゼを含む宿主蛋
白合成の封じ込めをもたらした。BamHI およびSacI部位
は、それぞれ、コドン 3386 および 3832で作られた。2
Aプロテアーゼをコードする配列を含むBamHI-SacI断片
は、 pSP64ベクターのクローニング部位に連結された。
3'末端のEcoRI 部位は、上記のようにBamHI 部位に変更
された。2Aプロテアーゼおよびpoly Aを含むBamHI-BamH
I 断片合成物は、PM2 のBamHI クローニング部位に挿入
された。
た。このプラスミドを使用した2Aプロテアーゼの発現
は、キャップ構造依存性機構によった。この機構による
2Aプロテアーゼの発現は、2Aプロテアーゼを含む宿主蛋
白合成の封じ込めをもたらした。BamHI およびSacI部位
は、それぞれ、コドン 3386 および 3832で作られた。2
Aプロテアーゼをコードする配列を含むBamHI-SacI断片
は、 pSP64ベクターのクローニング部位に連結された。
3'末端のEcoRI 部位は、上記のようにBamHI 部位に変更
された。2Aプロテアーゼおよびpoly Aを含むBamHI-BamH
I 断片合成物は、PM2 のBamHI クローニング部位に挿入
された。
【００４７】構築物 3(d) の調製 キャップ構造のないリポーターのために、UTR 配列はAc
ChoEase をコードする領域に連結された。BamHI-SmaI部
位は、それぞれ、ポリオウイルスのcDNAのコドン 1およ
び 698で作られた。加えて、SmaIおよびSacIは、それぞ
れ、AcChoEaseのcDNAのコドン 1および2005で作られ
た。２つの断片、すなわちUTR を含むBamHI-SmaIおよび
AcChoEase を含むSmaI- SmaIは、 pSP64ベクターのクロ
ーニング部位にフレーム内に連結された。3'末端のEcoR
I 部位は、上記のようにBamHI 部位に変更された。UTR
、AcChoEase およびpoly Aを含むBamHI-BamHI 断片合
成物は、PM2 のBamHI クローニング部位に挿入された。
２つの追加のプラスミドは、以下（図４）のように構築
された。
ChoEase をコードする領域に連結された。BamHI-SmaI部
位は、それぞれ、ポリオウイルスのcDNAのコドン 1およ
び 698で作られた。加えて、SmaIおよびSacIは、それぞ
れ、AcChoEaseのcDNAのコドン 1および2005で作られ
た。２つの断片、すなわちUTR を含むBamHI-SmaIおよび
AcChoEase を含むSmaI- SmaIは、 pSP64ベクターのクロ
ーニング部位にフレーム内に連結された。3'末端のEcoR
I 部位は、上記のようにBamHI 部位に変更された。UTR
、AcChoEase およびpoly Aを含むBamHI-BamHI 断片合
成物は、PM2 のBamHI クローニング部位に挿入された。
２つの追加のプラスミドは、以下（図４）のように構築
された。
【００４８】構築物 4(a) の調製 UTR およびBiP をコードする配列を含むプラスミドが構
築された。BamHI-SmaI部位は、それぞれ、ポリオウイル
スのcDNAのコドン 1および 698で作られた。加えて、Sm
aIおよびSacI部位は、それぞれ、BiP のcDNAのコドン 5
7 および2023で作られた。それらの２つの断片、すなわ
ちUTR を含むBamHI-SmaIおよびBiP をコードする配列を
含むSmaI- SacIは、 pSP64ベクターのクローニング部位
にフレーム内に連結された。3'末端のEcoRI 部位は、上
記のようにBamHI 部位に変更され、そして、UTR 、BiP
およびpoly Aを含むBamHI-BamHI 断片合成物は、PM2 の
BamHI クローニング部位に挿入された。
築された。BamHI-SmaI部位は、それぞれ、ポリオウイル
スのcDNAのコドン 1および 698で作られた。加えて、Sm
aIおよびSacI部位は、それぞれ、BiP のcDNAのコドン 5
7 および2023で作られた。それらの２つの断片、すなわ
ちUTR を含むBamHI-SmaIおよびBiP をコードする配列を
含むSmaI- SacIは、 pSP64ベクターのクローニング部位
にフレーム内に連結された。3'末端のEcoRI 部位は、上
記のようにBamHI 部位に変更され、そして、UTR 、BiP
およびpoly Aを含むBamHI-BamHI 断片合成物は、PM2 の
BamHI クローニング部位に挿入された。
【００４９】構築物 4(b) の調製 条件培地への金属イオンの添加による外部制御の強化の
ため、メタロチオネイン遺伝子由来のエンハンサー領域
が、ポリオ5'UTR および2Aプロテアーゼを含むPM2 の構
築物 3(b) に挿入された。EcoRI 部位は、メタロチオネ
イン遺伝子のコドン 1および 300で作られた。メタロチ
オネイン制御領域を含むEcoRI-EcoRI 断片は、PM2 のEc
oRI 部位に、第１コドンで連結された。
ため、メタロチオネイン遺伝子由来のエンハンサー領域
が、ポリオ5'UTR および2Aプロテアーゼを含むPM2 の構
築物 3(b) に挿入された。EcoRI 部位は、メタロチオネ
イン遺伝子のコドン 1および 300で作られた。メタロチ
オネイン制御領域を含むEcoRI-EcoRI 断片は、PM2 のEc
oRI 部位に、第１コドンで連結された。
【００５０】 Ｂ．トランスフェクションおよびクローンの選択 [DeFeo,D.et al.,Proc.Natl.Acad.si.U.S.A., 78,3504
(1981)]に先に記述されたリン酸カルシウム法を使用し
て、プラスミドは、チャイニーズハムスター卵巣細胞系
(CHO) にトランスフェクトされた。細胞は、培地Ｉ〔ペ
ニシリン(100 units/ml)、ストレプトマイシン(100 mg/
μl)およびグルタミン(2mM) を添加され、5 ％(v/v) の
ウシ胎児血清を含み、加湿された 5％CO2 インキュベー
ター内で 37 ℃にあるHam's F-12培地〕内で保たれた。
発現ベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を含むが、ト
ランスフェクトされた細胞は、0.25 mg/mlのネオマイシ
ン類似物 G418 を含む培養細胞培地内での成長によって
選択された。
(1981)]に先に記述されたリン酸カルシウム法を使用し
て、プラスミドは、チャイニーズハムスター卵巣細胞系
(CHO) にトランスフェクトされた。細胞は、培地Ｉ〔ペ
ニシリン(100 units/ml)、ストレプトマイシン(100 mg/
μl)およびグルタミン(2mM) を添加され、5 ％(v/v) の
ウシ胎児血清を含み、加湿された 5％CO2 インキュベー
ター内で 37 ℃にあるHam's F-12培地〕内で保たれた。
発現ベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を含むが、ト
ランスフェクトされた細胞は、0.25 mg/mlのネオマイシ
ン類似物 G418 を含む培養細胞培地内での成長によって
選択された。
【００５１】上記の構築物は、以下のトランスフェクシ
ョンのために使用された。 1) LTR プロモーター（構築物3(a)) の制御下のAcChoE
ase のトランスフェクション。このトランスフェクショ
ンでのAcChoEase の発現は、キャップ構造依存性機構に
より、そして、他のトランスフェクションのための対照
として使用された。 2) キャップ構造のない（キャップ構造非依存性）UTR-
2A（構築物3(b)) と一緒になったキャップ構造をもつAc
ChoEase （構築物3(a)) の共同トランスフェクション。
この変形は、キャップ構造依存性機構によるAcChoEase
を含む全ての細胞蛋白合成の阻害を導く。
ョンのために使用された。 1) LTR プロモーター（構築物3(a)) の制御下のAcChoE
ase のトランスフェクション。このトランスフェクショ
ンでのAcChoEase の発現は、キャップ構造依存性機構に
より、そして、他のトランスフェクションのための対照
として使用された。 2) キャップ構造のない（キャップ構造非依存性）UTR-
2A（構築物3(b)) と一緒になったキャップ構造をもつAc
ChoEase （構築物3(a)) の共同トランスフェクション。
この変形は、キャップ構造依存性機構によるAcChoEase
を含む全ての細胞蛋白合成の阻害を導く。
【００５２】3) キャップ構造をもつ 2A （構築物3
(c)) と一緒になったキャップ構造のないUTR-AcChoEase
（構築物3(d)) の共同トランスフェクション。このト
ランスフェクションによる 2A プロテアーゼのオンオフ
翻訳は、キャップ構造依存性機構によった。しかしなが
ら、AcChoEase の翻訳は、キャップ構造非依存性機構に
よった。 4) UTR-AcChoEase （構築物3(d)) と 5'UTR 2A （構築
物3(b)) との共同トランスフェクション。キャップ構造
非依存性機構による 2A プロテアーゼの発現および翻訳
は、キャップ構造非依存性機構によるAcChoEase の翻訳
を除いて、宿主細胞での蛋白合成を連続的に停止した。
(c)) と一緒になったキャップ構造のないUTR-AcChoEase
（構築物3(d)) の共同トランスフェクション。このト
ランスフェクションによる 2A プロテアーゼのオンオフ
翻訳は、キャップ構造依存性機構によった。しかしなが
ら、AcChoEase の翻訳は、キャップ構造非依存性機構に
よった。 4) UTR-AcChoEase （構築物3(d)) と 5'UTR 2A （構築
物3(b)) との共同トランスフェクション。キャップ構造
非依存性機構による 2A プロテアーゼの発現および翻訳
は、キャップ構造非依存性機構によるAcChoEase の翻訳
を除いて、宿主細胞での蛋白合成を連続的に停止した。
【００５３】5) BiP 発現と一緒になったキャップ構造
のない発現のために、UTR-BiP をコードする配列（構築
物4(a)) のトランスフェクションが、構築物3(d)および
3(b)と一緒に、全て１回のトランスフェクションで使用
された。 6) 発現の外部制御の強化のために、メタロチオネイン
遺伝子由来のエンハンサー領域を含むプラスミド（構築
物 4(b))が、構築物3(d)（キャップ構造のないリポータ
ー）と一緒に共同トランスフェクションされた。cDNAの
転写は、金属、例えば、亜鉛もしくは銅の培養細胞培地
への添加により調節された。
のない発現のために、UTR-BiP をコードする配列（構築
物4(a)) のトランスフェクションが、構築物3(d)および
3(b)と一緒に、全て１回のトランスフェクションで使用
された。 6) 発現の外部制御の強化のために、メタロチオネイン
遺伝子由来のエンハンサー領域を含むプラスミド（構築
物 4(b))が、構築物3(d)（キャップ構造のないリポータ
ー）と一緒に共同トランスフェクションされた。cDNAの
転写は、金属、例えば、亜鉛もしくは銅の培養細胞培地
への添加により調節された。
【００５４】Ｃ．代謝標識 0 日目、5 ％(v/v) のウシ胎児血清を添加された培地Ｉ
（ペニシリン 100μg/ml、ストレプトマイシン 100μg/
ml、グルタミン 2mM、 Ham's F-12 培地） 1 ml 中のト
ランスフェクトされた細胞は、12-well dish(300,000 c
ells/well)に移された。1 日目、そして、続く標識実験
のために、細胞は、システインを含まない培地II（透析
された5 ％のウシ血清を添加された培地Ｉ）で、2 回洗
われ、そして、50μCi/ml[35S]システイン(>1000 Ci/mm
ol,Amersham Corp.)を含むシステインを含まない培地II
1 ml 内で、7 時間ラベルされた。
（ペニシリン 100μg/ml、ストレプトマイシン 100μg/
ml、グルタミン 2mM、 Ham's F-12 培地） 1 ml 中のト
ランスフェクトされた細胞は、12-well dish(300,000 c
ells/well)に移された。1 日目、そして、続く標識実験
のために、細胞は、システインを含まない培地II（透析
された5 ％のウシ血清を添加された培地Ｉ）で、2 回洗
われ、そして、50μCi/ml[35S]システイン(>1000 Ci/mm
ol,Amersham Corp.)を含むシステインを含まない培地II
1 ml 内で、7 時間ラベルされた。
【００５５】Ｄ．免疫沈降およびゲル電気泳動 培地は、集められ、そして、氷の上で冷やされた。貯蔵
バッファーおよび界面活性剤溶液が加えられ、そして、
最終サンプルは、50 mM Tris-HCl(pH 7.8)、150 mM NaC
l 、 5 mM EDTA、0.5 %(vol/vol)Trion X-100 、 0.1 %
NaDodSo4 、フェニルメチル- スルホニル フルオライ
ド(0.3 mg/ml) およびヨードアセトアミド(0.3 mg/ml)
を含んだ。
バッファーおよび界面活性剤溶液が加えられ、そして、
最終サンプルは、50 mM Tris-HCl(pH 7.8)、150 mM NaC
l 、 5 mM EDTA、0.5 %(vol/vol)Trion X-100 、 0.1 %
NaDodSo4 、フェニルメチル- スルホニル フルオライ
ド(0.3 mg/ml) およびヨードアセトアミド(0.3 mg/ml)
を含んだ。
【００５６】細胞溶解産物は、リン酸バッファー生理的
食塩水(4℃) で２回洗われ、そして、0.2 mlの溶解バッ
ファー[50 mM Tris,pH 7.8,150 mM NaCl, 5 mM EDTA お
よび0.6 %(wt/vol) NaDodSo4]の追加により溶解され
た。その溶解産物は、0.8 mlの希釈バッファー〔0.6 %
Trion X-100 が NaDodSo4 の代わりに置き換えられたこ
とを除き溶解バッファーと同じ〕で希釈され、そして、
フェニルメチル- スルホニル フルオライドおよびヨー
ドアセトアミドが、最終濃度として 0.3 mg/mlとなるよ
うに添加された。
食塩水(4℃) で２回洗われ、そして、0.2 mlの溶解バッ
ファー[50 mM Tris,pH 7.8,150 mM NaCl, 5 mM EDTA お
よび0.6 %(wt/vol) NaDodSo4]の追加により溶解され
た。その溶解産物は、0.8 mlの希釈バッファー〔0.6 %
Trion X-100 が NaDodSo4 の代わりに置き換えられたこ
とを除き溶解バッファーと同じ〕で希釈され、そして、
フェニルメチル- スルホニル フルオライドおよびヨー
ドアセトアミドが、最終濃度として 0.3 mg/mlとなるよ
うに添加された。
【００５７】培地および溶解産物のサンプルは、サンプ
ルが免疫沈降される前に、正常ウサギ血清(>1 hr.)およ
びパンソルビン( 1 hr.)で前もって精製された。ポリク
ロナール抗血清が溶解産物および培地に加えられ、そし
て、4 ℃で一夜、[Laemmli,U.K.,Nature 227,680(197
0)] に記載されたようにインキュベートされた。溶解産
物および培地の免疫沈降物は、15％SDS-ポリアクリルア
ミドのゲル上で、[Bonneau,A.M.,and Sonenberg,N.,J.B
iol.Chem.,262,11136(1987)]に記載されたように溶解さ
れた。
ルが免疫沈降される前に、正常ウサギ血清(>1 hr.)およ
びパンソルビン( 1 hr.)で前もって精製された。ポリク
ロナール抗血清が溶解産物および培地に加えられ、そし
て、4 ℃で一夜、[Laemmli,U.K.,Nature 227,680(197
0)] に記載されたようにインキュベートされた。溶解産
物および培地の免疫沈降物は、15％SDS-ポリアクリルア
ミドのゲル上で、[Bonneau,A.M.,and Sonenberg,N.,J.B
iol.Chem.,262,11136(1987)]に記載されたように溶解さ
れた。
【００５８】Ｅ．ゲル電気泳動およびペプチド地図 生産物の免疫沈降電気泳動法のオートラジオグラフィー
は、AcChoEase が通常のキャップ構造をもつ翻訳（トラ
ンスフェクション 1）の下で作られること、並びに、キ
ャップ構造をもたない内部翻訳封じ込め条件がAcChoEas
e 蛋白の生産を防止する（トランスフェクション 2）こ
と、を示した。
は、AcChoEase が通常のキャップ構造をもつ翻訳（トラ
ンスフェクション 1）の下で作られること、並びに、キ
ャップ構造をもたない内部翻訳封じ込め条件がAcChoEas
e 蛋白の生産を防止する（トランスフェクション 2）こ
と、を示した。
【００５９】トランスフェクション(3) 、(4) および
(1) から得られたAcChoEase 蛋白の濃度計による定量
は、内部翻訳(3) および(4) が、通常翻訳の対照(1) の
7 倍のAcChoEase 蛋白を生産したことを、示した。トラ
ンスフェクション(5) （BiP をもちキャップ構造がな
い）は、トランスフェクション(3) および(4) と同様の
結果を与えた。トランスフェクション 6（外部制御）の
免疫沈降電気泳動法が実施され、そして、トランスフェ
クション 2（封じ込め条件）およびトランスフェクショ
ン 1（対照）と比較された。
(1) から得られたAcChoEase 蛋白の濃度計による定量
は、内部翻訳(3) および(4) が、通常翻訳の対照(1) の
7 倍のAcChoEase 蛋白を生産したことを、示した。トラ
ンスフェクション(5) （BiP をもちキャップ構造がな
い）は、トランスフェクション(3) および(4) と同様の
結果を与えた。トランスフェクション 6（外部制御）の
免疫沈降電気泳動法が実施され、そして、トランスフェ
クション 2（封じ込め条件）およびトランスフェクショ
ン 1（対照）と比較された。
【００６０】AcChoEase 蛋白の濃度計による定量は、ト
ランスフェクション 6がトランスフェクション 1（対
照）の 8倍の蛋白質を製造したことを示した。しかしな
がら、外部制御のトランスフェクション 6は、感染細胞
の寿命を延ばすことができた。
ランスフェクション 6がトランスフェクション 1（対
照）の 8倍の蛋白質を製造したことを示した。しかしな
がら、外部制御のトランスフェクション 6は、感染細胞
の寿命を延ばすことができた。
【００６１】Ｆ．分光光度計による蛋白質の同定 リポーター遺伝子の発現量および生物学的活性の研究の
ため、AcChoEase 培地が培養細胞から集められた。培地
の収集前に、細胞は、生物検定を妨害するG418およびFC
S を含まない培地で、12時間、予めインキュベートされ
た。培地は、24時間毎に集められ、遠心分離により清澄
化され、そして、活性を検定されるまで-20 ℃で保存さ
れた。
ため、AcChoEase 培地が培養細胞から集められた。培地
の収集前に、細胞は、生物検定を妨害するG418およびFC
S を含まない培地で、12時間、予めインキュベートされ
た。培地は、24時間毎に集められ、遠心分離により清澄
化され、そして、活性を検定されるまで-20 ℃で保存さ
れた。
【００６２】AcChoEase の発現は、アセチルチオコリン
の加水分解のためのEllman's法[G.L.Ellman et al.,Bio
chem.Pharm.,7,88(1961)] により分光光度計を使用して
検出された。サンプル 10 μl は、 Ellman 試薬（100
mMリン酸バッファー、pH 7.0、0.5 mM 5-5' ジチオビス
-2ニトロ安息香酸,DTNB ）と共に 96 wellマイクロ力価
プレートの個々のwellの内で、30-45 分間予めインキュ
ベートされた。反応は、10μl のブチリルチオコリン(2
0%stock ）の添加により開始された。基質の加水分解
は、遊離酸およびチオコリンを解放する。チオコリン
は、モル比 1:1でDTNBと反応し、黄色いアニオンである
5- チオ-2- ニトロ- 安息香酸を作る、この比吸光度(E
405=13600 M-1-cm-1) は、本検定に高感度（経路長約
0.5 cm)を与える。基質の加水分解の運動は、速度定数
の計算のために特別に改造されたソフトウェアーを装備
したIBM 互換コンピューターと接続されたVmax自動マイ
クロ力価プレートリーダー(Molecular Devices Corp.,
USA)により監視された。本検定は、基質につてナノモル
のレベルで、コリンエステラーゼ活性を正確に検出し
た。
の加水分解のためのEllman's法[G.L.Ellman et al.,Bio
chem.Pharm.,7,88(1961)] により分光光度計を使用して
検出された。サンプル 10 μl は、 Ellman 試薬（100
mMリン酸バッファー、pH 7.0、0.5 mM 5-5' ジチオビス
-2ニトロ安息香酸,DTNB ）と共に 96 wellマイクロ力価
プレートの個々のwellの内で、30-45 分間予めインキュ
ベートされた。反応は、10μl のブチリルチオコリン(2
0%stock ）の添加により開始された。基質の加水分解
は、遊離酸およびチオコリンを解放する。チオコリン
は、モル比 1:1でDTNBと反応し、黄色いアニオンである
5- チオ-2- ニトロ- 安息香酸を作る、この比吸光度(E
405=13600 M-1-cm-1) は、本検定に高感度（経路長約
0.5 cm)を与える。基質の加水分解の運動は、速度定数
の計算のために特別に改造されたソフトウェアーを装備
したIBM 互換コンピューターと接続されたVmax自動マイ
クロ力価プレートリーダー(Molecular Devices Corp.,
USA)により監視された。本検定は、基質につてナノモル
のレベルで、コリンエステラーゼ活性を正確に検出し
た。
【００６３】図５は、３つの実験の平均を表し、そし
て、対照のトランスフェクション 1（キャップ構造をも
つ）および封じ込め条件のトランスフェクション 2に対
しての、トランスフェクション 3および 4（宿主細胞蛋
白の封じ込められた翻訳と結び付いた内部翻訳機構）で
のAcChoEase 蛋白の増大した生産を明確に示している。
て、対照のトランスフェクション 1（キャップ構造をも
つ）および封じ込め条件のトランスフェクション 2に対
しての、トランスフェクション 3および 4（宿主細胞蛋
白の封じ込められた翻訳と結び付いた内部翻訳機構）で
のAcChoEase 蛋白の増大した生産を明確に示している。
【００６４】例２ ルシフェラーゼの発現 Ａ．発現ベクターの構築 例１と同じ方法が使用されたが、アセチルコリンエステ
ラーゼのリポーター遺伝子の代わりに、ホタルのルシフ
ェラーゼのcDNAを含むリポーター遺伝子が使用された。
ルシフェラーゼ遺伝子LC5'1811bp(J.R.Wet et al.,Mol.
Cell.Biol.(1987)7,725-737)のcDNAが、例１に記載した
クローニング部位として、BamHI を通して、各種のPM2
プラスミド構築物に挿入された。
ラーゼのリポーター遺伝子の代わりに、ホタルのルシフ
ェラーゼのcDNAを含むリポーター遺伝子が使用された。
ルシフェラーゼ遺伝子LC5'1811bp(J.R.Wet et al.,Mol.
Cell.Biol.(1987)7,725-737)のcDNAが、例１に記載した
クローニング部位として、BamHI を通して、各種のPM2
プラスミド構築物に挿入された。
【００６５】Ｂ．DNA トランスフェクション 例１に記載したようにプラスミドDNA が、CHO にトラン
スフェクトされた。プラスミドDNA(10μg)が、細胞の 1
0 cmプレートそれぞれにトランスフェクトするために使
用され、それぞれのプレートは、約 106のCHO 細胞を含
んだ。細胞は、トランスフェクションの後、48時間目に
収穫された。
スフェクトされた。プラスミドDNA(10μg)が、細胞の 1
0 cmプレートそれぞれにトランスフェクトするために使
用され、それぞれのプレートは、約 106のCHO 細胞を含
んだ。細胞は、トランスフェクションの後、48時間目に
収穫された。
【００６６】Ｃ．ルシフェラーゼの検定 トランスフェクトされた細胞のそれぞれのプレートは、
リン酸バッファーで３回洗われ、そして、細胞は、抽出
バッファー（100 mMリン酸カリウム(pH 7.8)，1 mMジチ
オトレイトール）により収穫された。それぞれのプレー
トからの細胞（1-5 x 106)は、ペレット化され、そし
て、100 mlの抽出バッファー内で再び懸濁された。
リン酸バッファーで３回洗われ、そして、細胞は、抽出
バッファー（100 mMリン酸カリウム(pH 7.8)，1 mMジチ
オトレイトール）により収穫された。それぞれのプレー
トからの細胞（1-5 x 106)は、ペレット化され、そし
て、100 mlの抽出バッファー内で再び懸濁された。
【００６７】細胞は、ドライアイス上での凍結並びに37
℃での解凍のサイクル３回によって溶解された。細胞破
壊物は、4 ℃での遠心分離によってペレット化された。
抽出のサンプル 10 mlは、小試験管に 5 mM ATP および
15 mM MgSO4を含む 25 mMのグリコールグリシン(pH 7.
8) 350 ml に添加された。試験管は、記録計を装備した
LKB ルミノメーター内に置かれ、そして、反応は、1
mMルシフェリン 1000μl 注入により開始された。この
酵素は、急激な、基質の ATP依存性酸化を触媒し、その
時、ルシフェラーゼ存在量に比例した割合で、光を放っ
た。各種構造物（例１における）と共にトランスフェク
トされたCHO 細胞の抽出により得られたルシフェラーゼ
活性は、図６に示される。２つの別の実験が示されてい
る。トランスフェクション 3および 4は、対照のトラン
スフェクション 1と比較して、7 〜 9倍のルシフェラー
ゼ蛋白を生産した。
℃での解凍のサイクル３回によって溶解された。細胞破
壊物は、4 ℃での遠心分離によってペレット化された。
抽出のサンプル 10 mlは、小試験管に 5 mM ATP および
15 mM MgSO4を含む 25 mMのグリコールグリシン(pH 7.
8) 350 ml に添加された。試験管は、記録計を装備した
LKB ルミノメーター内に置かれ、そして、反応は、1
mMルシフェリン 1000μl 注入により開始された。この
酵素は、急激な、基質の ATP依存性酸化を触媒し、その
時、ルシフェラーゼ存在量に比例した割合で、光を放っ
た。各種構造物（例１における）と共にトランスフェク
トされたCHO 細胞の抽出により得られたルシフェラーゼ
活性は、図６に示される。２つの別の実験が示されてい
る。トランスフェクション 3および 4は、対照のトラン
スフェクション 1と比較して、7 〜 9倍のルシフェラー
ゼ蛋白を生産した。
【００６８】例３ CAT の発現 Ａ．ベクターの構築 所望の構築物を得るためには、２段階のクローニングが
必要である。第１段階では、選択された遺伝子（BiP 遺
伝子の5'-UTRおよびポリオウイルス 2A プロテアーゼ）
が、増幅された。増幅された断片は、PCR 増幅されたDN
A の容易なクローニングを可能にする、Invitrogenのプ
ラスミド TA クローニングベクターにクローンニングさ
れた。クローニングの第２段階では、増幅された遺伝子
が、(Invitrogen の）商業的 pRc/CMVベクターに移され
た。このベクターは、pUC 19の主鎖に基礎を置き、そし
て、強いサイトメガロウイルス(CMV) のプロモーター、
インビトロにおけるRNA 合成のための T7 もしくは Sp6
プロモーター、SV40ポリアデニレーション シグナル、
そして、哺乳動物の(G418)細胞内のバクテリア(Amp) 内
での選択のためのネオマイシンおよびβ- ラクタマーゼ
遺伝子、を担持する。クローニングおよび再クローニン
グ段階は、べクターのポリリンカーに存在するが選択さ
れた遺伝子には存在しないオリゴヌクレオチド プライ
マーの制限酵素の添加により実行される。
必要である。第１段階では、選択された遺伝子（BiP 遺
伝子の5'-UTRおよびポリオウイルス 2A プロテアーゼ）
が、増幅された。増幅された断片は、PCR 増幅されたDN
A の容易なクローニングを可能にする、Invitrogenのプ
ラスミド TA クローニングベクターにクローンニングさ
れた。クローニングの第２段階では、増幅された遺伝子
が、(Invitrogen の）商業的 pRc/CMVベクターに移され
た。このベクターは、pUC 19の主鎖に基礎を置き、そし
て、強いサイトメガロウイルス(CMV) のプロモーター、
インビトロにおけるRNA 合成のための T7 もしくは Sp6
プロモーター、SV40ポリアデニレーション シグナル、
そして、哺乳動物の(G418)細胞内のバクテリア(Amp) 内
での選択のためのネオマイシンおよびβ- ラクタマーゼ
遺伝子、を担持する。クローニングおよび再クローニン
グ段階は、べクターのポリリンカーに存在するが選択さ
れた遺伝子には存在しないオリゴヌクレオチド プライ
マーの制限酵素の添加により実行される。
【００６９】1) BiP(UTR)の5'-UTRのクローニンング 以下のプライマーが、PCR による細胞DNA の増幅のため
に使用された。 a) 5'-AACATCGCGGCCGCAGGTCGACGCCGGCCAAGACA-3' (BiP の Nuc.372-392 + NotI 部位) b) 5'-CATACGAAGCTTCTTGCCAGCCAGTTCGGCAGC-3' (BiP の Nuc.592-572 + HindIII部位) 247 塩基対の増幅されたバンドは、Invitrogenの TA ク
ローニングキット( 図７のプラスミド 1) の使用によ
り、プラスミドにクローニングされた。
に使用された。 a) 5'-AACATCGCGGCCGCAGGTCGACGCCGGCCAAGACA-3' (BiP の Nuc.372-392 + NotI 部位) b) 5'-CATACGAAGCTTCTTGCCAGCCAGTTCGGCAGC-3' (BiP の Nuc.592-572 + HindIII部位) 247 塩基対の増幅されたバンドは、Invitrogenの TA ク
ローニングキット( 図７のプラスミド 1) の使用によ
り、プラスミドにクローニングされた。
【００７０】 2) ポリオウイルス 2A プロテアーゼのクローニング ポリオウイルス RNA由来のcDNAは、18-merプライマー： 5'-ATTTGCTGGGTGAATCCA-3' (Nuc.3890-3873[La Monica et al.,J.Virol.57:515-525
(1986)]) の使用により合成された。
(1986)]) の使用により合成された。
【００７１】2A プロテアーゼの遺伝子は、このcDNAか
ら、以下のプライマーを使用して、PCR により増幅され
た。 a) 5'-TCCAACAAGCTTATGGGTTTTGGCCACCAAAAT-3' (Nuc.3382-3399,[La Monica et al.,ibid]+ATGコドンお
よび HindIII部位) ;並びに、 b) 5'-CCTATCGCGGCCGCTTATTACTGCTCCATAGCCTCCTC-3' (Nuc.3828-3811[La Monica et al.,ibid]+2 停止コドン
および NotI 部位) 482 塩基対の増幅されたバンドは、前記のようにクロー
ニングされた( 図７のプラスミド 2) 。
ら、以下のプライマーを使用して、PCR により増幅され
た。 a) 5'-TCCAACAAGCTTATGGGTTTTGGCCACCAAAAT-3' (Nuc.3382-3399,[La Monica et al.,ibid]+ATGコドンお
よび HindIII部位) ;並びに、 b) 5'-CCTATCGCGGCCGCTTATTACTGCTCCATAGCCTCCTC-3' (Nuc.3828-3811[La Monica et al.,ibid]+2 停止コドン
および NotI 部位) 482 塩基対の増幅されたバンドは、前記のようにクロー
ニングされた( 図７のプラスミド 2) 。
【００７２】3) CAT 遺伝子の再クローニング CAT 遺伝子は、 Promega(cat.#E1041)のpCAT基本プラス
ミドから切り出され、そして、 Invitrogen の pRc/CMV
プラスミドのHindIII 部位へ再クローニングされた（図
７のプラスミド 3) 。このプラスミドは、CMV プロモー
ターおよびネオマイシン(Neo) 遺伝子を担持し、そし
て、トランスフェクトされた細胞でのCAT活性のための
対照プラスミドとして使用された。
ミドから切り出され、そして、 Invitrogen の pRc/CMV
プラスミドのHindIII 部位へ再クローニングされた（図
７のプラスミド 3) 。このプラスミドは、CMV プロモー
ターおよびネオマイシン(Neo) 遺伝子を担持し、そし
て、トランスフェクトされた細胞でのCAT活性のための
対照プラスミドとして使用された。
【００７３】4) 結合された構築物のクローニング プラスミド 1、2 および 3（図７）は、当業者に知られ
た方法で、これに続くプラスミド 4〜11の構築で使用さ
れた。例として、バクテリア中でのプラスミドの増殖
後、BiP 挿入物が、HindIII およびNotIの使用により
（プラスミド 1から）単離され、そして、CAT プラスミ
ド（プラスミド 3）が、HindIII の使用により直線状と
なった。BiP 挿入物のHindIII 部位は、CAT 遺伝子に
（HindIII-HindIII ）連結され；続いて、残った自由末
端は平滑末端であり、そして、自己連結された。これら
の操作の結果がプラスミド 7(UTR-CAT) であった。UTR
断片と 2A （プラスミド 4) とのHindIII 連結は、プラ
スミド 5を作り、そして、同じ 2つのDNA の連結は、プ
ラスミド 6を与えた。 2A とUTR 遺伝子は、HindIII お
よびNotI部位により側面に位置されるので、プラスミド
8〜11の構造物は、上記と同様の方法により生じた。
た方法で、これに続くプラスミド 4〜11の構築で使用さ
れた。例として、バクテリア中でのプラスミドの増殖
後、BiP 挿入物が、HindIII およびNotIの使用により
（プラスミド 1から）単離され、そして、CAT プラスミ
ド（プラスミド 3）が、HindIII の使用により直線状と
なった。BiP 挿入物のHindIII 部位は、CAT 遺伝子に
（HindIII-HindIII ）連結され；続いて、残った自由末
端は平滑末端であり、そして、自己連結された。これら
の操作の結果がプラスミド 7(UTR-CAT) であった。UTR
断片と 2A （プラスミド 4) とのHindIII 連結は、プラ
スミド 5を作り、そして、同じ 2つのDNA の連結は、プ
ラスミド 6を与えた。 2A とUTR 遺伝子は、HindIII お
よびNotI部位により側面に位置されるので、プラスミド
8〜11の構造物は、上記と同様の方法により生じた。
【００７４】それゆえ、プラスミド 3〜11は、以下の要
素を含んだ。 a) CMV-5'-CAT-3' (CMVプロモーター下のCAT 遺伝子；
上記のプラスミド 3)- 図７； b) CMV-5'-2A-3' (CMVプロモーター下の 2A 遺伝子；
図７のプラスミド 4。このプラスミドは、2Aプロテアー
ゼの発現にとって基本的なプラスミドである。）； c) CMV-5'-UTR-2A-3' (CMV プロモーター下の5'-UTRを
もつ 2A 遺伝子；図７のプラスミド 5、プラスミド 4の
対照）； d) CMV-5'-2A-UTR-3' (図７のプラスミド 6、2A活性の
対照のため、および、２シストロン性プラスミドの構築
のために必要である）； e) CMV-5'-UTR-CAT-3' (BiPの5'-UTRをもつCAT;図７の
プラスミド 7、これは、本実験のための基本CAT プラス
ミドである。）；
素を含んだ。 a) CMV-5'-CAT-3' (CMVプロモーター下のCAT 遺伝子；
上記のプラスミド 3)- 図７； b) CMV-5'-2A-3' (CMVプロモーター下の 2A 遺伝子；
図７のプラスミド 4。このプラスミドは、2Aプロテアー
ゼの発現にとって基本的なプラスミドである。）； c) CMV-5'-UTR-2A-3' (CMV プロモーター下の5'-UTRを
もつ 2A 遺伝子；図７のプラスミド 5、プラスミド 4の
対照）； d) CMV-5'-2A-UTR-3' (図７のプラスミド 6、2A活性の
対照のため、および、２シストロン性プラスミドの構築
のために必要である）； e) CMV-5'-UTR-CAT-3' (BiPの5'-UTRをもつCAT;図７の
プラスミド 7、これは、本実験のための基本CAT プラス
ミドである。）；
【００７５】以下の２シストロン性プラスミドが、クロ
ーニングされた。例えば： f) CMV-5'-2A-CAT(プラスミド 8)-図７； g) CMV-5'-2A-UTR-CAT-3'( プラスミド 9)-図７； h) CMV-5'-UTR-2A-CAT-3'( プラスミド10)-図７； i) CMV-5'-UTR-2A-UTR-CAT-3'( プラスミド11)-図７；
ーニングされた。例えば： f) CMV-5'-2A-CAT(プラスミド 8)-図７； g) CMV-5'-2A-UTR-CAT-3'( プラスミド 9)-図７； h) CMV-5'-UTR-2A-CAT-3'( プラスミド10)-図７； i) CMV-5'-UTR-2A-UTR-CAT-3'( プラスミド11)-図７；
【００７６】２シストロン性プラスミドは、異なった条
件下でのトランスフェクションおよび発現効率のための
積極的または消極的な対照を提供した。上記の全てのプ
ラスミドは、CMV プロモーター、ネオマイシンおよびβ
- ラクタマーゼ遺伝子（真核およびバクテリア細胞での
選択のため）、BiP の5'-UTRをもつもしくはもたないリ
ポーター遺伝子(CAT) 、ポリオウイルス 2A プロテアー
ゼ、並びに３つのDNA 部分（遺伝子）を担持する。
件下でのトランスフェクションおよび発現効率のための
積極的または消極的な対照を提供した。上記の全てのプ
ラスミドは、CMV プロモーター、ネオマイシンおよびβ
- ラクタマーゼ遺伝子（真核およびバクテリア細胞での
選択のため）、BiP の5'-UTRをもつもしくはもたないリ
ポーター遺伝子(CAT) 、ポリオウイルス 2A プロテアー
ゼ、並びに３つのDNA 部分（遺伝子）を担持する。
【００７７】Ｂ．細胞トランスフェクション Hela細胞は、電気泳動により、それぞれのプラスミド
で、並びに、リポーター遺伝子(CAT) および 2A 遺伝子
を担持するプラスミドの組合せで、トランスフェクトさ
れた。
で、並びに、リポーター遺伝子(CAT) および 2A 遺伝子
を担持するプラスミドの組合せで、トランスフェクトさ
れた。
【００７８】Ｃ．CAT 活性の検定 トランスフェクションの後、細胞溶解産物は、ノーザン
ブロット法およびハイブリット形成により、そのmRNAの
量および安定性の見積もりのために分析された。CAT 蛋
白の量および効率は、"C.N.Gorman et al.,Mol.Cell Bi
ol.,2,1044(1982)" に記載されたように測定された。細
胞抽出物は、放射性クロラムフェニコールおよびアセチ
ルCoA と共にインキュベートされた。アシル化されたク
ロラムフェニコールは、その後にオートラジオグラフィ
ーにかけられる薄膜クロマトグラフィーによりアセチル
化された形のものから分離された。CAT 活性は、アセチ
ル化されてないCAT およびモノアセチル化されたCAT 生
産物での元来の状態での強度として決定された。CAT 活
性のプラスミド(7+5) 、(7+4) 、(9) および(11)のトラ
ンスフェクションからの結果は、プラスミド(3) （正常
真核細胞翻訳対照）のトランスフェクションにて検出さ
れた活性の 500〜800 ％の間に分布した。
ブロット法およびハイブリット形成により、そのmRNAの
量および安定性の見積もりのために分析された。CAT 蛋
白の量および効率は、"C.N.Gorman et al.,Mol.Cell Bi
ol.,2,1044(1982)" に記載されたように測定された。細
胞抽出物は、放射性クロラムフェニコールおよびアセチ
ルCoA と共にインキュベートされた。アシル化されたク
ロラムフェニコールは、その後にオートラジオグラフィ
ーにかけられる薄膜クロマトグラフィーによりアセチル
化された形のものから分離された。CAT 活性は、アセチ
ル化されてないCAT およびモノアセチル化されたCAT 生
産物での元来の状態での強度として決定された。CAT 活
性のプラスミド(7+5) 、(7+4) 、(9) および(11)のトラ
ンスフェクションからの結果は、プラスミド(3) （正常
真核細胞翻訳対照）のトランスフェクションにて検出さ
れた活性の 500〜800 ％の間に分布した。
【００７９】例４ MT-IIAプロモーターのクローニング 例３が繰り返されが、pRc/CMV ベクターのCMV プロモー
ターは、外部制御された条件下での 2A プロテアーゼの
発現を誘導され得る構築物を作るために、誘導可能なメ
タロチオネイン(MT-IIA)プロモーターによって置き換え
られた。MT-IIAプロモーターは、以下の２つのプライマ
ー： a) 5'-ACCATTCGCGACACGGCGGAGGCGCACGGC-3' (MT-IIA の Nuc.1-20 + NruI部位）および； b) 5'-CCTAGGAAGCTTGATCATGGCGAGCTGAAGAGGC-3' (MT-IIA の Nuc.377-356 + HindIII部位）；の使用によ
り増幅された。
ターは、外部制御された条件下での 2A プロテアーゼの
発現を誘導され得る構築物を作るために、誘導可能なメ
タロチオネイン(MT-IIA)プロモーターによって置き換え
られた。MT-IIAプロモーターは、以下の２つのプライマ
ー： a) 5'-ACCATTCGCGACACGGCGGAGGCGCACGGC-3' (MT-IIA の Nuc.1-20 + NruI部位）および； b) 5'-CCTAGGAAGCTTGATCATGGCGAGCTGAAGAGGC-3' (MT-IIA の Nuc.377-356 + HindIII部位）；の使用によ
り増幅された。
【００８０】この増幅は、399 塩基対の長い断片（MT-I
IAプロモーターの377 塩基対および２つの制限部位）を
産出した。そして、これは、pRc/CMV プラスミドのNruI
/HindIII部位へクローニングされた384 塩基対の長い断
片を作るために、２つの上記の酵素によって消化され
た。
IAプロモーターの377 塩基対および２つの制限部位）を
産出した。そして、これは、pRc/CMV プラスミドのNruI
/HindIII部位へクローニングされた384 塩基対の長い断
片を作るために、２つの上記の酵素によって消化され
た。
【００８１】CMV プロモーターは、NruIおよびHindIII
制限酵素をもつプラスミドの消化によって、pRc/CMV プ
ラスミドから除去された。これによって、CMV および T
7 プロモーターを含む686 塩基対の挿入物（プラスミド
上のNuc.206 から891)を除去したが、手を付けられてい
ないマルチクローニング部位を残した。クローニング
後、最終物としての直線状プラスミドへの増幅されたMT
-IIAプロモーター挿入物は、本構築物( プラスミド 12
、図７) で活性のある唯一のプロモーターである。
制限酵素をもつプラスミドの消化によって、pRc/CMV プ
ラスミドから除去された。これによって、CMV および T
7 プロモーターを含む686 塩基対の挿入物（プラスミド
上のNuc.206 から891)を除去したが、手を付けられてい
ないマルチクローニング部位を残した。クローニング
後、最終物としての直線状プラスミドへの増幅されたMT
-IIAプロモーター挿入物は、本構築物( プラスミド 12
、図７) で活性のある唯一のプロモーターである。
【００８２】プラスミド 2( 図７) からのHindIII/NotI
2A プロテアーゼ部分は、プラスミド 12 のHindIII に
クローニングされ、このようにして、MT-IIAプロモータ
ーの制御下で 2A 遺伝子を担うプラスミド 13 ( 図７)
を作った。プラスミド 14 (図７) は、２段階で、クロ
ーニングされた。第１段階では、プラスミド 1からのNo
tI/HindIII UTR挿入物は、プラスミド 12(HindIII 部位
を保存するが、NotI部位は保存しない) のHindIII 部位
へクローニングされ、そして、続いて、CAT 遺伝子が、
残存HindIII 部位にクローニングされた。
2A プロテアーゼ部分は、プラスミド 12 のHindIII に
クローニングされ、このようにして、MT-IIAプロモータ
ーの制御下で 2A 遺伝子を担うプラスミド 13 ( 図７)
を作った。プラスミド 14 (図７) は、２段階で、クロ
ーニングされた。第１段階では、プラスミド 1からのNo
tI/HindIII UTR挿入物は、プラスミド 12(HindIII 部位
を保存するが、NotI部位は保存しない) のHindIII 部位
へクローニングされ、そして、続いて、CAT 遺伝子が、
残存HindIII 部位にクローニングされた。
【００８３】細胞のトランスフェクションおよびテスト
は、例３のように行われ、そして、銅イオンが加えられ
たときに、比較可能なCAT 活性が得られた。
は、例３のように行われ、そして、銅イオンが加えられ
たときに、比較可能なCAT 活性が得られた。
【００８４】以上の記述および例は、説明を目的として
提供されており、どのような方法でも、発明を限定する
ことを意図してない。当業者には理解されるであろう
が、発明は、細胞蛋白製造の阻害の、並びに選択された
ポリペプチドのIRESに仲介された発現の、組み合わされ
た効果の全ての使用を包含する。所望の効果を得るため
には、その効果は、所望の物質の工業的生産、または、
欠陥細胞での細胞治療のため、もしくは標的細胞の破壊
のため、もしくはその他の目的のためのインビボにおけ
る各種物質の生産、でなければならない。それゆえ、本
発明は、いかなる特定の細胞、ベクター、IRESもしくは
蛋白に限定されることを意味されておらず、そして、発
明の範囲を超え、またはその本質から離れることなく、
多様な応用が、工夫され得る。
提供されており、どのような方法でも、発明を限定する
ことを意図してない。当業者には理解されるであろう
が、発明は、細胞蛋白製造の阻害の、並びに選択された
ポリペプチドのIRESに仲介された発現の、組み合わされ
た効果の全ての使用を包含する。所望の効果を得るため
には、その効果は、所望の物質の工業的生産、または、
欠陥細胞での細胞治療のため、もしくは標的細胞の破壊
のため、もしくはその他の目的のためのインビボにおけ
る各種物質の生産、でなければならない。それゆえ、本
発明は、いかなる特定の細胞、ベクター、IRESもしくは
蛋白に限定されることを意味されておらず、そして、発
明の範囲を超え、またはその本質から離れることなく、
多様な応用が、工夫され得る。
【図１】pSP64 poly(A) ベクターの制限酵素地図であ
る。
る。
【図２】PM2 プラスミドを示す。BamHI クローニング部
位は拡大してある。
位は拡大してある。
【図３】プラスミド pSP64のクローニング部位へ挿入さ
れるべき断片の設計を解説する。
れるべき断片の設計を解説する。
【図４】配列をコードしているUTR およびBiP の構築、
並びに、PM2 ベクターへの、hMT からの促進領域の挿入
を解説する。
並びに、PM2 ベクターへの、hMT からの促進領域の挿入
を解説する。
【図５】エルマン試験（例１）おけるアセチルチオコリ
ン基質の添加に従う活性を表す。
ン基質の添加に従う活性を表す。
【図６】チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)の細胞（例
２）の抽出物由来のルシフェラーゼ活性を示す。
２）の抽出物由来のルシフェラーゼ活性を示す。
【図７】例３および例４の構造を図式的に説明する。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６９】1) BiP(UTR)の5'-UTRのクローニンング 以下のプライマーが、PCR による細胞DNA の増幅のため
に使用された。 a) 5'-AACATCGCGGCCGCAGGTCGACGCCGGCCAAGACA-3'(配列
番号：1) (BiP の Nuc.372-392 + NotI 部位) b) 5'-CATACGAAGCTTCTTGCCAGCCAGTTCGGCAGC-3'(配列番
号：2) (BiP の Nuc.592-572 + HindIII部位) 247 塩基対の増幅されたバンドは、Invitrogenの TA ク
ローニングキット( 図７のプラスミド 1) の使用によ
り、プラスミドにクローニングされた。
に使用された。 a) 5'-AACATCGCGGCCGCAGGTCGACGCCGGCCAAGACA-3'(配列
番号：1) (BiP の Nuc.372-392 + NotI 部位) b) 5'-CATACGAAGCTTCTTGCCAGCCAGTTCGGCAGC-3'(配列番
号：2) (BiP の Nuc.592-572 + HindIII部位) 247 塩基対の増幅されたバンドは、Invitrogenの TA ク
ローニングキット( 図７のプラスミド 1) の使用によ
り、プラスミドにクローニングされた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７０】 2) ポリオウイルス 2A プロテアーゼのクローニング ポリオウイルス RNA由来のcDNAは、18-merプライマー： 5'-ATTTGCTGGGTGAATCCA-3'( 配列番号：3) (Nuc.3890-3873[La Monica et al.,J.Virol.57:515-525
(1986)]) の使用により合成された。
(1986)]) の使用により合成された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７１】2A プロテアーゼの遺伝子は、このcDNAか
ら、以下のプライマーを使用して、PCR により増幅され
た。 a) 5'-TCCAACAAGCTTATGGGTTTTGGCCACCAAAAT-3'(配列番
号：4) (Nuc.3382-3399,[La Monica et al.,ibid]+ATGコドンお
よび HindIII部位) ;並びに、 b) 5'-CCTATCGCGGCCGCTTATTACTGCTCCATAGCCTCCTC-3'(
配列番号：5) (Nuc.3828-3811[La Monica et al.,ibid]+2 停止コドン
および NotI 部位) 482 塩基対の増幅されたバンドは、前記のようにクロー
ニングされた( 図７のプラスミド 2) 。
ら、以下のプライマーを使用して、PCR により増幅され
た。 a) 5'-TCCAACAAGCTTATGGGTTTTGGCCACCAAAAT-3'(配列番
号：4) (Nuc.3382-3399,[La Monica et al.,ibid]+ATGコドンお
よび HindIII部位) ;並びに、 b) 5'-CCTATCGCGGCCGCTTATTACTGCTCCATAGCCTCCTC-3'(
配列番号：5) (Nuc.3828-3811[La Monica et al.,ibid]+2 停止コドン
および NotI 部位) 482 塩基対の増幅されたバンドは、前記のようにクロー
ニングされた( 図７のプラスミド 2) 。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７９】例４ MT-IIAプロモーターのクローニング 例３が繰り返されが、pRc/CMV ベクターのCMV プロモー
ターは、外部制御された条件下での 2A プロテアーゼの
発現を誘導され得る構築物を作るために、誘導可能なメ
タロチオネイン(MT-IIA)プロモーターによって置き換え
られた。MT-IIAプロモーターは、以下の２つのプライマ
ー： a) 5'-ACCATTCGCGACACGGCGGAGGCGCACGGC-3'( 配列番
号：6) (MT-IIA の Nuc.1-20 + NruI部位）および； b) 5'-CCTAGGAAGCTTGATCATGGCGAGCTGAAGAGGC-3'( 配列
番号：7) (MT-IIA の Nuc.377-356 + HindIII部位）；の使用によ
り増幅された。
ターは、外部制御された条件下での 2A プロテアーゼの
発現を誘導され得る構築物を作るために、誘導可能なメ
タロチオネイン(MT-IIA)プロモーターによって置き換え
られた。MT-IIAプロモーターは、以下の２つのプライマ
ー： a) 5'-ACCATTCGCGACACGGCGGAGGCGCACGGC-3'( 配列番
号：6) (MT-IIA の Nuc.1-20 + NruI部位）および； b) 5'-CCTAGGAAGCTTGATCATGGCGAGCTGAAGAGGC-3'( 配列
番号：7) (MT-IIA の Nuc.377-356 + HindIII部位）；の使用によ
り増幅された。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８４】以上の記述および例は、説明を目的として
提供されており、どのような方法でも、発明を限定する
ことを意図してない。当業者には理解されるであろう
が、発明は、細胞蛋白製造の阻害の、並びに選択された
ポリペプチドのIRESに仲介された発現の、組み合わされ
た効果の全ての使用を包含する。所望の効果を得るため
には、その効果は、所望の物質の工業的生産、または、
欠陥細胞での細胞治療のため、もしくは標的細胞の破壊
のため、もしくはその他の目的のためのインビボにおけ
る各種物質の生産、でなければならない。それゆえ、本
発明は、いかなる特定の細胞、ベクター、IRESもしくは
蛋白に限定されることを意味されておらず、そして、発
明の範囲を超え、またはその本質から離れることなく、
多様な応用が、工夫され得る。
提供されており、どのような方法でも、発明を限定する
ことを意図してない。当業者には理解されるであろう
が、発明は、細胞蛋白製造の阻害の、並びに選択された
ポリペプチドのIRESに仲介された発現の、組み合わされ
た効果の全ての使用を包含する。所望の効果を得るため
には、その効果は、所望の物質の工業的生産、または、
欠陥細胞での細胞治療のため、もしくは標的細胞の破壊
のため、もしくはその他の目的のためのインビボにおけ
る各種物質の生産、でなければならない。それゆえ、本
発明は、いかなる特定の細胞、ベクター、IRESもしくは
蛋白に限定されることを意味されておらず、そして、発
明の範囲を超え、またはその本質から離れることなく、
多様な応用が、工夫され得る。
【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 AACATCGCGG CCGCAGGTCG ACGCCGGCCA AGACA 35 配列番号：2 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 CATACGAAGC TTCTTGCCAG CCAGTTCGGC AGC 33 配列番号：3 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 ATTTGCTGGG TGAATCCA 18 配列番号：4 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 TCCAACAAGC TTATGGGTTT TGGCCACCAA AAT 33 配列番号：5 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 CCTATCGCGG CCGCTTATTA CTGCTCCATA GCCTCCTC 38 配列番号：6 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 ACCATTCGCG ACACGGCGGA GGCGCACGGC 30 配列番号：7 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 CCTAGGAAGC TTGATCATGG CGAGCTGAAG AGGC 34
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/53 15/57 15/86 //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (32)
- 【請求項１】 遺伝子生産物のインビトロにおける製造
方法において、以下の段階： (a) 1)真核細胞の翻訳因子(ETF) のTIF をコードする遺
伝子、2)少なくとも１つの内部リボソームエントリー部
位(IRES)、および、3)生産しようとするポリペプチドを
コードする少なくとも１つの遺伝子を集合的に含む、真
核細胞におけるトランスフェクションを可能にする１ま
たはそれより多くの組み換えヌクレオチドベクターを用
意し； (b) 上記のベクターで真核細胞の培養細胞をトランスフ
ェクションし； (c) トランスフェクションされた細胞の培養細胞を、細
胞活性を促進するのに適した条件下に保ち；そして、 (d) 上記培養細胞から所望の遺伝子生産物を回収する；
を含んで成る方法。 - 【請求項２】 ETF がeIF-4F複合体を含んで成る請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】 組み換えヌクレオチドベクターが、DNA
またはRNA ベクターから選択される請求項１または２に
記載の方法。 - 【請求項４】 組み換えヌクレオチドベクターが、同一
のベクター内に、1)真核細胞のキャップ構造依存性プロ
モーターに先行されているTIF をコードする配列、およ
び、2)IRESに先行されている所望の遺伝子生産物をコー
ドする配列を含んで成る請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 組み換えヌクレオチドベクターが、同一
のベクター内に、1)IRESに先行されているTIF をコード
する配列、および、2)IRESに先行されている所望の遺伝
子生産物をコードする配列を含んで成る請求項１に記載
の方法。 - 【請求項６】 TIF をコードする遺伝子が、ポリオウイ
ルス 2A プロテアーゼの cDNA である請求項１から５ま
でのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 IRES部位が、ピコルナウイルスのまたは
BiPのIRES部位である請求項１から６までのいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項８】 ピコルナウイルスがポリオウイルスまた
はEMCVである請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 遺伝子生産物のインビトロにおける製造
方法において、以下の段階： a)真核細胞のキャップ構造依存性プロモーターに先行さ
れているTIF をコードする配列を含んで成る第１組み換
えヌクレオチドベクターを用意し； b)IRESに先行される所望の遺伝子生産物をコードする配
列を少なくとも含んで成る第２組み換えヌクレオチドベ
クターを用意し； c)上記の第１ベクターと第２ベクターの両方で、真核細
胞の培養細胞をトランスフェクションし； d)トランスフェクションされた細胞の培養細胞を、細胞
活性を促進するのに適した条件下に保ち；そして、 e)上記培養細胞から所望の遺伝子生産物を回収する；を
含んで成る方法。 - 【請求項１０】 遺伝子生産物のインビトロにおける製
造方法において、以下の段階： a)IRESに先行されるTIF をコードする配列を含んで成る
第１組み換えヌクレオチドベクターを用意し； b)IRESに先行される所望の遺伝子生産物をコードする配
列を少なくとも含んで成る第２組み換えヌクレオチドベ
クターを用意し； c)上記の第１ベクターと第２ベクターの両方で、真核細
胞の培養細胞をトランスフェクションし； d)トランスフェクションされた細胞の培養細胞を、細胞
活性を促進するのに適した条件下に保ち；そして、 e)上記培養細胞から所望の遺伝子生産物を回収する；を
含んで成る方法。 - 【請求項１１】 TIF 発現の外部活性化の提供をさらに
含んで成る請求項１から１０までのいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項１２】 TIF 発現の外部活性化が、メタロチオ
ネイン活性によって仲介される請求項１１に記載の方
法。 - 【請求項１３】 組み換えヌクレオチドベクターが、DN
A またはRNA ベクターから選択されている請求項４から
１２までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】 組み換えヌクレオチドベクターが、2A
プロテアーゼのDNA配列を含んで成る組み換えDNA ベク
ターである請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 遺伝子生産物が、ポリペプチドである
請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 遺伝子生産物が、蛋白質である請求項
１から１４までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１７】 真核細胞のキャップ構造依存性プロモ
ーターに先行されるTIF をコードする遺伝子を含んで成
る組み換えヌクレオチドベクター。 - 【請求項１８】 IRESに先行されるTIF をコードする遺
伝子を含んで成る組み換えヌクレオチドベクター。 - 【請求項１９】 IRESに先行される有用な遺伝子生産物
をコードする配列を含んで成る組み換えヌクレオチドベ
クター。 - 【請求項２０】 配列に、遺伝子物質の部分として、TI
F 、IRESおよび有用な遺伝子生産物をコードする少なく
とも１つの遺伝子を含んで成る組み換えヌクレオチドベ
クター。 - 【請求項２１】 TIF が真核細胞のキャップ構造依存性
プロモーターに先行される請求項２０のベクター。 - 【請求項２２】 TIF がIRESに先行される請求項２０の
ベクター。 - 【請求項２３】 TIF をコードする遺伝子が、ポリオウ
イルス 2A プロテアーゼの cDNA である請求項１７から
２２までのいずれか１項に記載のベクター。 - 【請求項２４】 IRES部位が、ピコルナウイルスのまた
は BiPのIRES部位である請求項１７から２３までのいず
れか１項に記載のベクター。 - 【請求項２５】 ピコルナウイルスがポリオウイルスま
たはEMCVである請求項２４に記載のベクター。 - 【請求項２６】 さらにメタロチオネインプロモーター
を含んで成る請求項１７から２５までのいずれか１項に
記載のベクター。 - 【請求項２７】 DNA またはRNA ベクターである請求項
１７から２６までのいずれか１項に記載のベクター。 - 【請求項２８】 請求項１７から２７までのいずれか１
項に記載のベクターを含んで成る医薬調製物。 - 【請求項２９】 請求項２８に記載の医薬調製物で、イ
ンビボにおける遺伝子療法が必要な患者を治療するこ
と、を含んで成るインビボにおける遺伝子療法に効能の
ある方法。 - 【請求項３０】 遺伝子生産物の細胞外の製造方法にお
いて、以下の段階： a)IRESに先行される所望の遺伝子生産物をコードする少
なくとも１つの配列を含んで成る組み換えヌクレオチド
ベクターを含む培地を用意し； b)培地の基質中に、翻訳に効果を及ぼすために要求され
るリボソームおよびプロモーターを用意し； c)遺伝子の発現を促進するために適当な条件下で培地を
保ち；そして、 d)上記培地から所望の遺伝子生産物を回収する；を含ん
で成る方法。 - 【請求項３１】 請求項３０のベクター(b) と同じかま
たはこれから分離されるかもしれない組み換えヌクレオ
チドベクターをさらに含んで成り、IRESに先行されるTI
F をコードしている配列を含んで成り、さらに、このよ
うなベクターを上記培地に添加する請求項３０に記載の
方法。 - 【請求項３２】 請求項１〜１６または請求項３０〜３
１のいずれか１項に記載の方法により調製されたときの
遺伝子生産物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL102404A IL102404A0 (en) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | Method and means for the production of gene products |
| IL102404 | 1992-07-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0678784A true JPH0678784A (ja) | 1994-03-22 |
Family
ID=11063793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5163461A Pending JPH0678784A (ja) | 1992-07-03 | 1993-07-01 | 遺伝子生産物の製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0585983A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0678784A (ja) |
| IL (1) | IL102404A0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009505657A (ja) * | 2005-08-24 | 2009-02-12 | ザ スクリプス リサーチ インスティチュート | 翻訳エンハンサーエレメント依存性のベクター系 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5648235A (en) * | 1992-07-03 | 1997-07-15 | Q.B.I. Enterprises Ltd. | Method and means for the production of gene products, novel recombinant DNA vectors therefor and kits employing them |
| WO1994024870A1 (en) * | 1993-01-20 | 1994-11-10 | Biotransplant, Inc. | Retroviral vectors capable of expressing multimeric proteins from multiple translational initiation sites |
| US6995008B1 (en) | 1994-03-07 | 2006-02-07 | Merck & Co., Inc. | Coordinate in vivo gene expression |
| DE19503082A1 (de) * | 1995-02-01 | 1996-08-08 | Univ Ludwigs Albert | Gegenstand und Verfahren zur bevorzugt transienten Expression und möglichen Translation spezifischer RNA im cytoplasmatischen Bereich höherer eukaryontischer Zellen |
| IL112872A0 (en) * | 1995-03-03 | 1995-06-29 | Q B I Enterprises Ltd | Novel recombinant dna vectors and kits employing them |
| DE19514310A1 (de) * | 1995-04-18 | 1996-10-24 | Univ Ludwigs Albert | Vektoren zur Transfektion von eukaryotischen Zellen, deren Verwendung und damit transfizierte Zielzellen |
| US20190284582A1 (en) | 2016-11-03 | 2019-09-19 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | DNA Plasmids for the Fast Generation of Homologous Recombination Vectors for Cell Line Development |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5135855A (en) * | 1986-09-03 | 1992-08-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Rapid, versatile and simple system for expressing genes in eukaryotic cells |
| US5358856A (en) * | 1988-01-14 | 1994-10-25 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Gene expression in mammalian cells using a cap independent 5' noncoding region |
| GB9125896D0 (en) * | 1991-12-05 | 1992-02-05 | Almond Jeffrey W | Bicistronic viruses |
| DE4206769A1 (de) * | 1992-03-04 | 1993-09-09 | Boehringer Ingelheim Int | Testsystem zur analyse des "host cell shut-offs" nach viraler infektion |
-
1992
- 1992-07-03 IL IL102404A patent/IL102404A0/xx unknown
-
1993
- 1993-07-01 EP EP93201932A patent/EP0585983A3/en not_active Withdrawn
- 1993-07-01 JP JP5163461A patent/JPH0678784A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009505657A (ja) * | 2005-08-24 | 2009-02-12 | ザ スクリプス リサーチ インスティチュート | 翻訳エンハンサーエレメント依存性のベクター系 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0585983A2 (en) | 1994-03-09 |
| EP0585983A3 (en) | 1996-01-10 |
| IL102404A0 (en) | 1993-01-14 |
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