JP2018515098A - メチロトローフ酵母の遺伝子操作の発現構築物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、メチロトローフ酵母(methylotrophic yeast)を遺伝子操作するための、DNA構築物およびそのようなDNA構築物を使用する方法に一般的に関する。
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などのメチロトローフ酵母は、組換えタンパク質を発現するために一般的に使用される。メチロトローフ酵母中で1種または複数のポリペプチドを効率的に発現するために使用することができる構築物が、本明細書で提供される。
本開示は、1種または複数のタンパク質の組換え産生を有意に改善するAOX1プロモーターからやはり発現される導入遺伝子の発現を増大させるために、AOX1プロモーターから転写活性化因子Mxr1を過発現するP.パストリス(P. pastoris)株の使用を記載する。それに加えて、AOX1プロモーターからのMxr1の発現は、抑制炭素源が消費し尽くされたときに、常態では真正の誘導物質であるメタノールの不在下で、AOX1プロモーターから他の導入遺伝子を発現することを可能にする正のフィードバックループを創り出す。Mxr1の発現は、産生されるタンパク質の量における有意の増大をもたらす。
ポリペプチドの組換え発現を増大させるために細胞を遺伝子操作することを可能にする核酸構築物が、本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、誘導する分子の不在下で誘導性プロモーターからのポリペプチドの組換え発現を増大させるために、細胞を遺伝子操作することを可能にする核酸構築物が、本明細書で提供される。いかなる特定の機構にも束縛されずに、本明細書に記載される方法は、転写活性化因子の低レベルの天然の発現が、転写活性化因子と作動的に連結しているプロモーターを誘導する正のフィードバックループを創り出す。このことは転写活性化因子ならびに同じ誘導性プロモーターと作動的に連結している1種または複数の目標ポリペプチドの増大した発現をもたらす。
ゲノムDNAまたはプラスミドDNAテンプレートから関心のある遺伝子を、Phusion Hi−fidelity DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用して増幅した。簡単に説明すると、各々0.6μMのフォワードおよびリバースプライマーを、1〜2UのPhusion DNAポリメラーゼの存在下で、10〜50ngのテンプレートDNAおよび400μMのヌクレオチドの混合物とインキュベートする。反応条件は以下のようであった。
50〜100ngの制限酵素で消化されたプラスミドおよび3×モル過剰のPCRで増幅された挿入物を、T4 DNAリガーゼ(New England BioLabs)の存在下でインキュベートした。連結を16℃で2時間を超える間実施した。2μlの連結反応物はDH10Bエレクトロコンピテント大腸菌(E. coli)細胞に形質転換された。
1.5〜2μlの連結混合物を、20μlのElectroMax DH10B T1ファージ耐性コンピテント細胞(Invitrogen、カタログ#12033−015)に、1.7kVに設定したMicroPulser(BioRad)を使用する電気穿孔により、1mmギャップキュベット(BioRad、カタログ#165−2089)を使用して形質転換した。パルスの後1mlのSOCを細胞に加えて、細胞を37℃で1時間200rpmで振盪しながらインキュベートした。10μlの回収混合物を、アンピシリンを100μg/mlの濃度で含有するLB寒天プレート上にプレートした。プレートを終夜37℃でインキュベートした。
プラスミドDNAを、1×CutSmart緩衝液中のPmeI制限エンドヌクレアーゼ(New England BioLabs、カタログ#R0560L)で1〜4時間37℃、または1×CutSmart緩衝液中のSfiI制限エンドヌクレアーゼ(New England BioLabs、カタログ#R0123L)で1〜4時間50℃のいずれかで消化した。線状化されたプラスミドを、0.8%アガロースゲルからZymocleanゲルDNA回収キット(Zymo Research、カタログ#D4002)を使用してゲル精製した。DNAを20μlのH2Oに溶出させた。
P.パストリス(P. pastoris)の選択された株を、25mlのYPD培地中で中期指数期の成長相(約2OD)に成長させた。細胞を930×gで15分間の遠心分離により収集した。細胞ペレットを80%YPDおよび200mM HEPESの2mlの溶液(pH6.8)中に再懸濁させた。75μlの1M DTTを加えた。再懸濁された細胞ペレットを100rpm、30℃で25分間混合した。40mlの体積の氷冷滅菌水を懸濁液に加えて、細胞を1125×gで15分間遠心分離することにより収集して氷上に置いた。細胞ペレットを、40mlの氷冷水中に再懸濁させて収集した後、2回の洗浄ステップを追加した。次に、細胞ペレットを、20mlの氷冷1Mソルビトール中に再懸濁して、前のように遠心分離により収集した。最終の細胞ペレットを、0.3mlの氷冷、滅菌ソルビトール中に懸濁させて等分し、−80℃で凍結させた。
30〜100ngの線状化されたプラスミドDNAを、30μlのエレクトロコンピテントP.パストリス(P. pastoris)細胞に、1mmギャップのGenePulserキュベット(BioRad)を使用して1.15kVに設定したGenePulser(BioRad)を用いて形質転換した。1mlのYPD/1Mソルビトールを加えて細胞と1:1比で混合した。細胞を3時間30℃、100rpmで振盪しながら回復させた。100μlの回復混合物を、適当な抗生物質を含有するYPDプレートにプレートして、細胞の残りを適当な抗生物質を含むYPDプレートにプレートした。プレートを、30℃で48時間インキュベートした。最初の形質転換プレートを、適当な抗生物質を含むYPDプレート上に画線して、プレートを48時間30℃でインキュベートした。個々のクローンを抗生物質を含むYPDプレート上にパッチ状に付けて、パッチを使用してコロニーPCRまたはゲノムDNA調製を行い、染色体への組込みを確認して、さらに分析するために該株を振盪フラスコ中で成長させた。
新鮮パッチからの株を、成長培地BMGY(0.75%グリセロールで補完されたBMY)に接種して、終夜30℃、200rpmで振盪して成長させた。翌日、LegHの発現を、ON培養物を0.1mMクエン酸アンモニウムFe(III)で補完されたBMMY培地(BMY+1%メタノール)で希釈することによりメタノールで誘導した。培養物をOD600が0.5〜0.7になるまで成長させた。消泡剤を最終の濃度が0.01%になるまで加えた。培養物を合計で72時間成長させ;培養物にメタノールを、24時間毎に振盪フラスコ体積の1/10の10×BMMY培地(BMY+10%メタノール)を加えることにより補完した。細胞を、誘導された成長の72時間後に遠心分離により収穫した。
BMY培地は、10gの酵母抽出物および20gのソイトンを790mlの水に溶解することにより調製した。該混合物をオートクレーブにより滅菌して、室温に冷却した。100mlの1Mリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)および100mlのアミノ酸を含まない10×酵母窒素ベース(100mL当たり13.4gのYNB粉末;Sigma−Aldrich)を濾過滅菌して(0.2μm孔径のPES)該培地に加えた。pH調節の必要はない
下に示した成分を溶解して体積を水で調節した。成分はFCC食品規格であるかまたは同等であった。培地をオートクレーブにより、その場でスチーム処理することにより、または同等の手段により滅菌した。
播種振盪フラスコのプロトコル
無菌バイオセーフティフード中で、低浸透圧モル濃度培地とBMYを、9:1の低オスモ:BMY比で混合した。グリセロールを、12.5g/Lの濃度で培地に加えた。USP食品規格のグリセロール/グリセリン(50%v/v(63%w/w)グリセロール/水溶液中99.7%の純度)を使用して、オートクレーブ滅菌した。Sigma204または同等の消泡剤を培地に0.25mL/Lの濃度で加えた。グリセロール播種バイアルを取り出して、70%IPAまたはエタノールで外側に噴霧し、バイオセーフティフード内で約5分間室温で解凍した。遮壁板付き振盪フラスコにグリセロール播種バイアルで接種した;1mLの接種原バイアルを1Lの振盪フラスコ培地毎に使用した。培養物を30℃で24時間振盪(1インチの振り(1”throw)で200RPM)しながら成長させた。実際の培地体積:名目上の振盪フラスコ体積の比は1:10と1:5の間を使用した。名目上2.8Lの体積のフラスコに250から500mLの培地を入れて、定型的手順で首尾よく使用した。24時間成長させた後600nmにおけるODを測定した。ODが15以上であった場合に、培養物を発酵槽に接種するために使用した。ODが15未満であった場合には、培養物をさらに1〜2時間成長させてからODを再び決定した。15のODが15から30時間後に到達されなかった場合には、その播種フラスコは不成功であったとみなした。
発酵培地および供給材料は、本明細書に記載したように調製した。初期体積は、最大発酵槽体積の約40%、例えば、発酵槽の最大実効体積が10Lであれば4Lであるべきである。これは、プロセスが発酵の終期までに最大実効体積に近づくであろうからである。発酵槽は、振盪フラスコ播種で発酵槽に対して10%接種原の比で接種され、例えば、4Lの初期培地が発酵槽中に存在すれば、発酵槽は、約0.4Lの振盪フラスコ播種により接種される。この時点における発酵槽中の合計体積をT0体積と称し、例えばこの代表的例では4.4Lである。プロセス制御は以下の条件を含む:30℃の温度;20%飽和設定点を維持するために攪拌−給気カスケードにより導かれる溶存酸素制御;および28%NH4OHの添加により導かれるpH制御、設定点は、プロセスの相に依存するであろう。
産生株MXY0183
実施例11 ヘム生合成経路の各酵素のpGANまたはpGAZ組込み型ベクターへのクローニング
pGAN(天然の選択マーカーを有する)およびpGAZ(ゼオシン選択マーカーを有する)を、Biogrammatics、Inc(Carlsbad、CA)から購入した。各遺伝子をAOX1プロモーターの制御下に置いて、FDHターミネーターを各遺伝子の停止コドンの直後に置いた。ヘム生合成経路中の遺伝子を、野性型P.パストリス(P. pastoris)株からPCRで増幅させるかまたは前の構築物からサブクローニングした。
全カセット「プロモーター遺伝子ターミネーター」を、ピキア(Pichia)ゲノムに組み込むためのプラスミドを組み立てるために、制限エンドヌクレアーゼのための部位を含有するプライマーでPCR増幅した。
pGAN−CPGオキシダーゼ(pMx312)をUPSおよびUPDカセットをクローニングするためのベクターとして使用した。UPGIIIシンターゼカセットを、pMx310から、制限エンドヌクレアーゼに対応してNheIおよびSphI認識部位を含有するAOX1プロモーター/FDH1ターミネーターに対するプライマーを用いてPCR増幅した。
a.遺伝子カセットのPCR増幅
ALAシンターゼカセットを、pMx310から、制限エンドヌクレアーゼに対応してNheIおよびXhoI認識部位を含有するAOX1プロモーター/FDH1ターミネーターに対するプライマーを用いてPCR増幅した。
pGAZ−PBD(pMx321)と称するベクターを、1×CutSmart Buffer中でNheI−HF(New England BioLabs、カタログ#R3131S)およびXhoI(New England BioLabs、カタログ#R0146S)を用いて終夜37℃で消化した。
消化されたベクターおよびPCR生成物を、0.8%アガロースからZymoclean Gel DNA Recoveryキット(Zymo Research、カタログ#D4002)を使用してゲル精製した。DNAを20μlのH2Oに溶出させた。
産生株MXY0183を発生させるために使用されたプラスミドを、図2に示す。産生株MXY0183を導いた改変をするためにとられたステップを図3に描く。
産生株MXY0207
pGAB発現ベクター(図4A)を、pGAZベクター(BioGrammatics、Inc.、Carlsbad、CA)中のゼオシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを、抗生物質ブラスチシジンSを有するプラスミドを担持する形質転換体の選択を可能にする、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)からのブラスチシジンSデアミナーゼ(BSD)遺伝子からのオープンリーディングフレームで置き換えることにより構築した。
Mxr1発現ベクターpMx354を、Mxr1オープンリーディングフレームをpGABベクターに導入することにより構築した(図4B)。該Mxr1オープンリーディングフレームは、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)からのメタノール誘導性アルコールオキシダーゼ1(AOX1)プロモーターの直ぐ下流で翻訳開始して、P.パストリス(P. pastoris)FDH1遺伝子からの転写ターミネーター配列が直ぐ続く翻訳停止シグナルを有する、pGABに挿入された。
pAOX1プロモーターの制御下にMxr1転写制御因子遺伝子を含有するpMX354と称するプラスミドを、PCR増幅のためのテンプレートとして使用した。AOX1プロモーターの3’端部、LegHのオープンリーディングフレーム、およびAOX1ターミネーターを、pMX354から、下に示すプライマーMxO0617およびMxO0647を使用して増幅した。AOX1ターミネーター、リンカーおよびAOX1プロモーターの5’端部を、pMX382からプライマーMxO0618およびMxO0646を使用して増幅した。
pMx354Mxr1発現ベクター(図4B)を、DNA形質転換によりMXY0183株に導入した(図3)。
実施例18 株MXY0213およびMXY0260の構築
図5は、ヘム生合成経路の7種の酵素を含有し、抗生物質マーカーを含まない株MXY0213を構築するためにとられるステップを示す。各端部にpAOX1プロモーターに相同性を有するpAOX1下の変形体Mxr1(N末端に6個の余分のアミノ酸)を含有するDNAの線状部分を、共形質転換を使用して導入した(図5および図6i)。この線状Mxr1発現カセットを、pIL75プラスミドを用いて形質転換によりピキア(Pichia)株MXY213中に同時に導入した。pIL75ベクターは、形質転換された細胞のゲノム中への組込みなしに、該プラスミドベクターを維持することを可能にするpanARS自律的複製配列(Liachko & Dunham, 2014, FEMS Yeast Res., 14: 364-7)および抗生物質G418による形質転換体の選択のためのkanMXマーカーを担持する。形質転換された細胞は、G418で補完された培地で、pIL75プラスミドにおけるkanMXマーカーの存在について選択した。ピキア(Pichia)形質転換体を、pIL75プラスミドも取り込み、Mxr1発現カセットも正しく組み込んだ形質転換体を求めてコロニーPCRにより選別した。
pAOX1プロモーターの制御下の、ダイズLegH遺伝子の異なるピキア・パストリス(Pichia pastoris)−コドンが最適化された変形体(変形体3;配列番号:5)を含有するpMX399と称するプラスミドを、該遺伝子のPCR増幅のためのテンプレートの供給源として使用した。TOPOクローニングプラスミドpMX401からの骨格をPCR増幅した。挿入物およびベクターをGibsonアセンブリー(NEB Gibsonアセンブリーキット)を使用して組み立ててプラスミドpMX422を発生させた。このプラスミドを、下で示すプライマーMxO0617およびMxO0618を使用するPCR増幅の次の回のためのテンプレートとして使用した。
ダイズLegH発現カセットが、コロニーPCRにより正しくおよびqPCRにより高いコピー数で組み込まれたことが示されたクローンでは、G418で選択するために必要なpIL75プラスミドを、抗生物質に対する選択を緩和することにより排除した。形質転換体をG418抗生物質を欠く培地で単一のコロニーを画線培養した。panARSプラスミドは選択の不在下では安定に維持されないので、pIL75は、この条件下では形質転換された細胞から急速に消失した。生じたピキア(Pichia)株MXY0291は、MXY0207と同様なコピー数でLegHを発現するための配列を含有するが、選択のための異種配列を欠く。
実施例21 株MXY0306の構築
株MXY0291の遺伝子型のPCRにより、CPGオキシダーゼをコードする配列の一部が、この株の構築中に欠失されたことが明らかになった。全長CPGオキシダーゼをコードする領域は、トランケートされたコピーの置き換えにより回復された。簡単に説明すると、下に示すプライマーMxO0866およびMxO0867を使用して、pAOX1プロモーターおよび全長CPGオキシダーゼをコードする領域を含有する線状DNAフラグメントを、プラスミドpMX312からPCR増幅により発生させた。
LegH変形体3を、本明細書で示した3種の天然のピキア・パストリス(Pichia pastoris)の構成的プロモーターの各々の指示下で発現させた。線状構築物は図7に示され、プロモーターの3’側半分、それに続くLegH変形体3、それに続くFDH1転写ターミネーターを含有した。これに直ぐ、アシュビア・ゴシッピー(Ashbya gossypii)からのpTEFプロモーター、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)からのアセトアミダーゼ遺伝子(amdS)およびアシュビア・ゴシッピー(Ashbya gossypii)からのTEFターミネーターを含有する抗生物質耐性カセットが続く。最終的に、該構築物はプロモーターの5’側半分を含有した。この線状カセットを、下の表にリストを挙げたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅して、5’および3’端部に、天然のピキア(Pichia)ゲノムのそれぞれのプロモーターに相同性の数百塩基対を含有する構築物を発生させた。
Mxr1の核酸配列(下線付きのヌクレオチドは、クローニング中に導入されたN末端における6個のアミノ酸をコードする)(配列番号:1)
実施例24 株MXY0183の特性評価
株MXY0183のための最適成長条件は、3.0から6.0の目標pHおよび28〜35℃の温度を含む。LegHタンパク質を産生するために、株MXY0183は、生きていて6日間好気的に成長していなければならない。
次に、ヘムの生合成に関与する8種の酵素をコードする遺伝子の存在下に転写活性化因子Mxr1を過発現することの利益を決定するために、実験を実施した。>10コピーのLegH配列およびヘム生合成に関与する8種の酵素をコードする遺伝子を含有する株MXY0183、および>10コピーのLegH配列、ヘム生合成に関与する8種の酵素をコードする遺伝子、およびMxr1転写活性化因子を含有する姉妹株MXY0206およびMXY0207を、これらの株にとって抑制炭素源であるグリセロールの存在下に振盪フラスコ培養中で成長させた。48時間後における振盪フラスコ培養の写真を図10Aに示し、BMY培地で追加の炭素源なしで48時間成長させた細胞からのペレットの写真を図10Bに示す。これらの実験は、抑制炭素源が、Mxr1もその中でAOX1プロモーターから発現する株の成長培地中で消費し尽くされたときに、AOX1プロモーターの制御下にある導入遺伝子の有意の発現(例えばヘム酵素)が、誘導炭素源の不在下で起こることを示す。振盪フラスコ培養物が誘導剤の不在下で成長した場合のヘム搭載LegHの相対収率を、図10Cに示す。これらの実験は、Mxr1発現もその中でAOX1プロモーターによって推進されるピキア(Pichia)株中において、メタノール誘導の不在下で、組換えヘム搭載タンパク質の有意の産生が、AOX1プロモーターに推進される導入遺伝子から達成されることを示す。
実施例18〜20で上記したように、株MXY0291を構築してMXY0207のLegH産生能力を再現したが、抗生物質耐性遺伝子は含まなかった。株MXY0291は約16コピーのLegH変形体3、Mxr1および8種のヘム生合成酵素のうち7種を含有することが決定された。2Lの発酵槽で成長させた場合、この株は、MXY0207と比較して改善されたLegH収率を示した。この改善は、メタノール/グリセロールおよびメタノール/デキストロ−ス(D−グルコース)を含有する誘導培地の両方で見られた(図11)。
ダイズレグヘモグロビン(LegH)の追加のコピーが、すでにLegHの数個のコピー、全てのヘム生合成酵素、およびプロモーターpAOX1(上でMXY0291と称した)の制御下にある転写因子Mxr1を含有する株で、3種の異なる構成的プロモーター、pGAP、pGCW14およびpTEF1の下で発現された。デキストロ−ス(即ち、D−グルコース)の存在下でメタノールにより誘導される場合、構成的プロモーターおよびpAOX1が、LegHの発現を推進するが、pAOX1プロモーターのみがヘム酵素の発現を推進する。これはLegH収率において前の株MXY0291と比較してさらなる改善をもたらす(図11)。
Claims (38)
- 組換え核酸分子を含むメチロトローフ酵母細胞であって、前記組換え核酸分子が、少なくとも1種のメタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している転写活性化因子をコードする外因性核酸を含む、酵母細胞。
- 前記メチロトローフ酵母細胞が、カンジダ属(Candida)、ハンセヌラ属(Hansenula)、ピキア属(Pichia)およびトルロプシス属(Torulopsis)からなる群から選択された酵母である、請求項1に記載の酵母細胞。
- 前記メチロトローフ酵母細胞がピキア(Pichia)酵母である、請求項1または2に記載の酵母細胞。
- 前記細胞がピキア(Pichia)細胞である、請求項1または2に記載の酵母細胞。
- 前記細胞がピキア・パストリス(Pichia pastoris)細胞である、請求項1から4のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記組換え核酸分子が、前記メチロトローフ酵母細胞のゲノムに安定に組み込まれている、請求項1から5のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記組換え核酸分子が、複製コンピテントプラスミドから染色体外で発現されている、
請求項1から5のいずれかに記載の酵母細胞。 - 前記転写活性化因子をコードする外因性核酸が、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)からのMxr1配列、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)からのAdr1配列、カンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)からのTrm1配列、またはカンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)からのTrm2配列を含む、請求項1から7のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記転写活性化因子をコードする外因性核酸が、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)からのMxr1配列を含む、請求項1から8のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記転写活性化因子が、GenBank受託番号ABD57365で示される配列を含む、請求項1から9のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記転写活性化因子が、GenBank受託番号DQ395124で示される核酸配列によりコードされる、請求項10に記載の酵母細胞。
- 前記少なくとも1種のメタノール誘導性プロモーター要素が、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)からのアルコールオキシダーゼ1(AOX1)プロモーター要素、カンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)からのAOD1プロモーター要素、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)からのMOXプロモーター要素、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)からのMOD1プロモーター要素、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)からのDHASプロモーター要素、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)からのFLD1プロモーター要素、およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)からのPEX8プロモーター要素からなる群から選択される、請求項1から11のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記少なくとも1種のメタノール誘導性プロモーター要素が、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)からのアルコールオキシダーゼ1(AOX1)プロモーター要素である、請求項1から11のいずれかに記載の酵母細胞。
- 少なくとも1種のメタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも1種の異種核酸を含む核酸分子をさらに含む、請求項1から13のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記異種核酸が、鉄共同因子の生合成に関与する少なくとも1種のポリペプチドをコードする、請求項14に記載の酵母細胞。
- 前記鉄共同因子がヘムである、請求項15に記載の酵母細胞。
- 前記ヘムの生合成に関与する少なくとも1種のポリペプチドが、ALAシンターゼ、ALAデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、UPGIIIシンターゼ、UPGIIIデカルボキシラーゼ、CPGオキシダーゼ、PPGオキシダーゼ、およびフェロキラターゼからなる群から選択される、請求項16に記載の酵母細胞。
- 前記ヘムの生合成に関与する少なくとも1種のポリペプチドが、ALAシンターゼ、ALAデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、UPGIIIシンターゼ、UPGIIIデカルボキシラーゼ、CPGオキシダーゼ、PPGオキシダーゼ、およびフェロキラターゼからなる群から選択される2種以上のポリペプチドを含む、請求項16に記載の酵母細胞。
- 前記酵母細胞が選択のための異種配列を欠く、請求項1から18のいずれかに記載の酵母細胞。
- 細胞中で異種ポリペプチドを発現する方法であって、
先行する請求項のいずれかに記載の酵母細胞を提供すること;
少なくとも1種のピキア・パストリス(Pichia pastoris)のアルコールオキシダーゼ1(AOX1)プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも1種の異種核酸を含む組換え核酸分子をメチロトローフ酵母細胞に導入すること;および
前記組換え核酸分子の発現のために適当な条件下で前記細胞を培養して、それにより異種ポリペプチドを発現すること
を含む、方法。 - 前記異種ポリペプチドが、グロビンファミリーPF00042のメンバーである、請求項20に記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが植物ヘモグロビンである、請求項20に記載の方法。
- 前記植物ヘモグロビンがレグヘモグロビンである、請求項22に記載の方法。
- 前記レグヘモグロビンが、配列番号:4および配列番号:6からなる群から選択される配列を有する、請求項23に記載の方法。
- 前記導入ステップが、形質導入、電気穿孔、微粒子銃送達、および化学的形質転換からなる群から選択される技法を含む、請求項20から24のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が培養される前記条件が、鉄または薬学的にもしくは代謝的に許容されるそれらの塩の添加を含む、請求項20から25のいずれかに記載の方法。
- 前記培養ステップが、メタノールの存在下で前記細胞を培養することを含む、請求項20から26のいずれかに記載の方法。
- 前記培養ステップが、メタノールの不在下で前記細胞を培養することを含む、請求項20から26のいずれかに記載の方法。
- 前記培養ステップが、選択の不在下で前記細胞を培養することを含む、請求項20から28のいずれかに記載の方法。
- 組換え核酸分子を含むメチロトローフピキア(Pichia)酵母細胞であって、前記組換え核酸分子が、
P.パストリス(P. pastoris)からのMxr1転写活性化因子配列をコードする核酸;
グロビンファミリー(PF00042)のメンバーをコードする核酸;および
ヘムの生合成に関与する少なくとも1種のポリペプチドをコードする核酸
を含む、メチロトローフピキア(Pichia)酵母細胞。 - 前記Mxr1転写活性化因子配列をコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している、請求項30に記載の酵母細胞。
- 前記グロビンファミリーのメンバーがレグヘモグロビンである、請求項30に記載の方法。
- 前記グロビンファミリーのメンバーをコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している、請求項30から32のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記グロビンファミリーのメンバーをコードする核酸が、構成的プロモーター要素と作動的に連結している、請求項30から32のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記ヘム生合成に関与する少なくとも1種のポリペプチドをコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している、請求項30から34のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記ヘム生合成に関与する少なくとも1種のポリペプチドをコードする核酸が、構成的プロモーター要素と作動的に連結している、請求項30から34のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記メタノール誘導性プロモーター要素が、P.パストリス(P. pastoris)からのアルコールオキシダーゼI(AOX1)プロモーター要素である、請求項30、31、33、または35のいずれかに記載の酵母細胞。
- 前記構成的プロモーター要素が、P.パストリス(P. pastoris)からの転写伸長因子EF−1α遺伝子(TEF1)プロモーター要素である、請求項30、34または36のいずれかに記載の酵母細胞。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020096610A (ja) * | 2015-05-11 | 2020-06-25 | インポッシブル フーズ インコーポレイテッド | メチロトローフ酵母の遺伝子操作の発現構築物および方法 |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10988515B2 (en) * | 2017-01-13 | 2021-04-27 | Bolt Threads, Inc. | Elastomeric proteins |
WO2018140654A1 (en) * | 2017-01-25 | 2018-08-02 | Altius Institute For Biomedical Sciences | Methods and platform of designing genetic editing tools |
WO2019060759A1 (en) | 2017-09-21 | 2019-03-28 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | ISOLATION, PRESERVATION, COMPOSITIONS AND USES OF PLANT EXTRACTS JUSTICIA |
US11051532B2 (en) | 2017-09-22 | 2021-07-06 | Impossible Foods Inc. | Methods for purifying protein |
US10221403B1 (en) * | 2018-04-25 | 2019-03-05 | Life Rainbow Biotech Co., Ltd. | Method of preparing zearalenone hydrolase |
CN108913732B (zh) * | 2018-07-31 | 2022-02-08 | 华东理工大学 | 一种莫纳可林j异源生产的方法及应用 |
CN111286520B (zh) * | 2018-12-10 | 2021-05-07 | 上海凯赛生物技术股份有限公司 | 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用 |
CN109929769B (zh) * | 2019-03-05 | 2021-07-23 | 天津科技大学 | 一种利用fld1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法 |
CN109749948A (zh) * | 2019-03-05 | 2019-05-14 | 天津科技大学 | 一种利用tef1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法 |
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EP4090746A4 (en) * | 2020-01-10 | 2024-01-24 | Intron Biotechnology Inc | METHOD FOR PRODUCING SOY LEGHHEMOGLOBIN USING ESCHERICHIA COLI |
US10894812B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-01-19 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant milk proteins |
US10947552B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-03-16 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants |
CA3191387A1 (en) | 2020-09-30 | 2022-04-07 | Nobell Foods, Inc. | Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same |
WO2022072846A2 (en) | 2020-10-02 | 2022-04-07 | Impossible Foods Inc. | Transgenic plants with altered fatty acid profiles and upregulated heme biosynthesis |
WO2022072833A2 (en) | 2020-10-02 | 2022-04-07 | Impossible Foods Inc. | Expression constructs and methods of genetically engineering cells |
EP4256060A1 (en) * | 2020-12-02 | 2023-10-11 | Planeat Foods Pte. Ltd. | Method of producing globin polypeptide recombinantly and meat substitute food product |
WO2022251166A2 (en) | 2021-05-25 | 2022-12-01 | Evelo Biosciences, Inc. | Bacterial compositions comprising soy hemoglobin |
CA3231125A1 (en) | 2021-10-19 | 2023-04-27 | Joshua MARCH | Plant base/animal cell hybrid meat substitute |
US20230193338A1 (en) * | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Impossible Foods Inc. | Genetic factor to increase expression of recombinant proteins |
US11931687B2 (en) | 2022-02-15 | 2024-03-19 | Streamline Innovations, Inc. | Gas purification apparatus and method |
KR20230164436A (ko) | 2022-05-25 | 2023-12-04 | 한화솔루션 주식회사 | 야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008017774A (ja) * | 2006-07-13 | 2008-01-31 | Nipro Corp | ピキア酵母を用いた組換えヒトヘモグロビンの製造 |
JP2010516268A (ja) * | 2007-01-26 | 2010-05-20 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ピキアにおけるメタノール誘導性プロモーターからのメタノール非依存的誘導の方法 |
WO2014008729A1 (zh) * | 2012-07-12 | 2014-01-16 | 华东理工大学 | 消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性的方法 |
WO2014110532A2 (en) * | 2013-01-11 | 2014-07-17 | Maraxi, Inc. | Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables |
Family Cites Families (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
DK162399C (da) | 1986-01-28 | 1992-03-23 | Danisco | Fremgangsmaade til ekspression af gener i baelgplanteceller, dna-fragment, rekombineret dna-fragment samt plasmid til brug ved udoevelsen af fremgangsmaaden |
US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US6946587B1 (en) | 1990-01-22 | 2005-09-20 | Dekalb Genetics Corporation | Method for preparing fertile transgenic corn plants |
US5204253A (en) | 1990-05-29 | 1993-04-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method and apparatus for introducing biological substances into living cells |
US5753465A (en) | 1994-08-30 | 1998-05-19 | Carnegie Mellon University | Unmodified recombinant human adult hemoglobin production |
US5538800A (en) | 1994-09-29 | 1996-07-23 | At&T Corp. | Magnetoresistive oxide material and articles comprising the material |
FR2736930B1 (fr) | 1995-07-17 | 1997-09-19 | Biocem | Procede de production, par des cellules vegetales, de proteines heminiques, proteines ainsi obtenues et produits contenant ces proteines |
US5824511A (en) | 1995-08-01 | 1998-10-20 | University Technology Corporation | Method for enhancing the production of hemoproteins |
CN1267556C (zh) | 1996-06-10 | 2006-08-02 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 提高丝状真菌中血红素蛋白产量的方法 |
JP3794760B2 (ja) | 1996-07-30 | 2006-07-12 | 三井化学株式会社 | フィターゼ生産酵母 |
US5959187A (en) | 1996-09-26 | 1999-09-28 | Bailey; James E. | Expression of oxygen-binding proteins in plants |
JPH10117776A (ja) | 1996-10-22 | 1998-05-12 | Japan Tobacco Inc | インディカイネの形質転換方法 |
US7803765B2 (en) | 1999-05-05 | 2010-09-28 | Phylogica Limited | Methods of constructing biodiverse gene fragment libraries and biological modulators isolated therefrom |
AU2001292749A1 (en) | 2000-09-18 | 2002-03-26 | Genencor International, Inc. | Twin-arginine translocation in bacillus |
US8021695B2 (en) | 2002-02-15 | 2011-09-20 | Arch Personal Care Products, L.P. | Personal care composition containing leghemoglobin |
US7807870B2 (en) | 2002-12-23 | 2010-10-05 | Max-Planck-Gesellschaft | Method for altering the content of reserve substances in plants |
JP2006522585A (ja) | 2003-04-11 | 2006-10-05 | ベントリア バイオサイエンス | 単子葉植物種子の中で発現させたヒト血中蛋白質 |
KR100660539B1 (ko) | 2004-07-29 | 2006-12-22 | 삼성전자주식회사 | 자기 기억 소자 및 그 형성 방법 |
US9068197B2 (en) | 2005-08-24 | 2015-06-30 | The Scripps Research Institute | Translation enhancer-element dependent vector systems |
JP2008017733A (ja) | 2006-07-11 | 2008-01-31 | Tokyo Univ Of Agriculture | 異種タンパク質の発現方法及び異種タンパク質の発現方法により得られたタンパク質 |
WO2009009142A2 (en) | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Monsanto Technology, Llc | Transgenic plants with enhanced agronomic traits |
EP2058398A1 (en) * | 2007-11-09 | 2009-05-13 | Nipro Corporation | Production of recombinant human hemoglobin using pichia yeast |
US9085766B2 (en) | 2010-05-21 | 2015-07-21 | Cornell University | Methods of producing recombinant heme-binding proteins and uses thereof |
WO2012017329A2 (en) | 2010-08-02 | 2012-02-09 | Cellectis S.A. | Method for targeted genomic events in algae |
WO2012083424A1 (en) | 2010-12-21 | 2012-06-28 | The University Of Western Ontario | Novel amino acid linker sequences for ligand immobilization |
JP6073138B2 (ja) | 2011-01-27 | 2017-02-01 | 株式会社カネカ | 形質転換用酵母およびタンパク質の製造方法 |
KR102024952B1 (ko) | 2011-07-12 | 2019-09-26 | 임파서블 푸즈 인크. | 소비재를 위한 방법 및 조성물 |
CN109289045A (zh) | 2012-09-19 | 2019-02-01 | 国立大学法人大阪大学 | 含有肺炎球菌表面蛋白a的肺炎球菌疫苗 |
SI3044320T1 (sl) | 2013-09-11 | 2020-07-31 | Impossible Foods Inc. | Sekrecija polipeptidov, ki vsebujejo hem |
JP6759103B2 (ja) * | 2014-03-31 | 2020-09-23 | インポッシブル フーズ インコーポレイテッド | ひき肉レプリカ |
ES2908463T3 (es) | 2015-05-11 | 2022-04-29 | Impossible Foods Inc | Constructos de expresión y métodos de modificación por ingeniería genética de levaduras metilotróficas |
US20190292217A1 (en) | 2016-12-02 | 2019-09-26 | Impossible Foods Inc. | Transgenic plants with upregulated heme biosynthesis |
WO2018102656A1 (en) | 2016-12-02 | 2018-06-07 | City Of Hope | Producing recombinant products in contained systems |
SG11202111693YA (en) | 2019-04-25 | 2021-11-29 | Impossible Foods Inc | Strains and methods for production of heme-containing proteins |
-
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2020
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2022
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008017774A (ja) * | 2006-07-13 | 2008-01-31 | Nipro Corp | ピキア酵母を用いた組換えヒトヘモグロビンの製造 |
JP2010516268A (ja) * | 2007-01-26 | 2010-05-20 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ピキアにおけるメタノール誘導性プロモーターからのメタノール非依存的誘導の方法 |
WO2014008729A1 (zh) * | 2012-07-12 | 2014-01-16 | 华东理工大学 | 消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性的方法 |
WO2014110532A2 (en) * | 2013-01-11 | 2014-07-17 | Maraxi, Inc. | Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
KRAINER, F. W. ET AL.: ""Optimizing cofactor availability for the production of recombinant heme peroxidase in Pichia pastor", MICROB. CELL FACT., vol. Vol. 14: 4, JPN6018046051, 13 January 2015 (2015-01-13), pages 1 - 9, ISSN: 0004337012 * |
LIN-CEREGHINO, G. P. ET AL.: ""Mxr1p, a key regulator of the methanol utilization pathway and peroxisomal genes in Pichia pastoris", MOL. CELL. BIOL., vol. 26, JPN6018046055, 2006, pages 883 - 897, XP002438945, ISSN: 0003925598, DOI: 10.1128/MCB.26.3.883-897.2006 * |
LIU, L. ET AL.: ""Balanced globin protein expression and heme biosynthesis improve production of human hemoglobin in", METAB. ENG., vol. 21, JPN6018046053, 2014, pages 9 - 16, XP055502731, ISSN: 0004337013, DOI: 10.1016/j.ymben.2013.10.010 * |
SASANO, Y. ET AL.: ""Trm2p-dependent derepression is essential for methanol-specific gene activation in the methylotroph", FEMS YEAST RES., vol. 10, JPN6018046057, 2010, pages 535 - 544, ISSN: 0004337014 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020096610A (ja) * | 2015-05-11 | 2020-06-25 | インポッシブル フーズ インコーポレイテッド | メチロトローフ酵母の遺伝子操作の発現構築物および方法 |
JP7308160B2 (ja) | 2015-05-11 | 2023-07-13 | インポッシブル フーズ インコーポレイテッド | メチロトローフ酵母の遺伝子操作の発現構築物および方法 |
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