CN109749948A - 一种利用tef1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株为将来源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase)基因转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中得到的基因工程菌株，该重组毕赤酵母菌株是通过将pPIC9K质粒中的醇氧化酶启动子PAOX1替换成翻译延伸因子1‑α启动子PTEF1，并与谷氨酰胺转氨酶基因连接成环，构成重组表达载体的方式得到的。本重组菌株易于培养、分泌能力强，利于谷氨酰胺转氨酶的大量表达，酶活可达479mU/mL，具有安全可靠的特点，且具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其是一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法，更具体地为重组质粒pTEF9k-tgz的构建和通过启动子PTEF1调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶在巴斯德毕赤酵母中的表达。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13)是一种催化酰基转移反应的酶，它能催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基(氨基受体)和赖氨酸残基的ε-氨基或其它伯胺基(氨基供体)之间的酰基转移反应。TGase的这种催化作用改变了蛋白质的构象，实现了蛋白质分子内、分子间的交联，从而改善了蛋白质的功能性质。
TGase广泛分布于动物、植物和微生物的机体组织中。20世纪50年代，豚鼠肝脏TGase(Guinea pig transglutaminase,GTG)是商业酶的主要来源，但其来源稀少、分离纯化工艺复杂，导致酶的价格较高，使其在食品工业中的应用面临一定的困难。随后，研究者分离纯化了微生物来源的TGase(MTG)，由于该酶可以利用微生物发酵法大规模生产，所以MTG最终实现了商业化生产。
与动物和微生物来源TGase相比，研究者对植物来源TGase的研究较少。植物TGase主要分布于植物的细胞质、细胞壁、叶绿体和线粒体等亚细胞区室，可能与植物组织中的能量转移、细胞骨架形成有关。但是由于从植物组织中提取TGase的分离纯化工艺复杂，产量较低，限制了其进一步的应用和研究。目前利用基因工程技术将黏玉米来源TGase(TGZ)基因在大肠杆菌、毕赤酵母等异源宿主中表达已成为新的趋势。然而，总体来说构建的菌株产酶量低、稳定性差、生产成本较高，与商业化生产仍有一定的差距。因此，如何在表达体系中稳定、高效地直接表达活性谷氨酰胺转氨酶，是当前植物来源谷氨酰胺转氨酶研究的一个趋势，对于该酶的应用研究具有重要意义。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，该重组菌株易于培养、分泌能力强，利于谷氨酰胺转氨酶的大量表达，酶活可达479mU/mL，利用毕赤酵母为宿主发酵得到的谷氨酰胺转氨酶具有安全可靠的特点，且具有重要的应用前景。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株为将来源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase)基因转入巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中得到的基因工程菌株，该重组毕赤酵母菌株是通过将pPIC9K质粒中的醇氧化酶启动子PAOX1替换成翻译延伸因子1-α启动子PTEF1，并与谷氨酰胺转氨酶基因连接成环，构成重组表达载体的方式得到的。
而且，所述谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
而且，所述PTEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
而且，所述重组毕赤酵母菌株的宿主为P.pastoris GS115。
如上所述的重组毕赤酵母菌株的构建方法，步骤如下：
⑴获得来源于黏玉米的谷氨酰胺转氨酶基因与启动子PTEF1序列；
⑵将pPIC9K质粒载体与谷氨酰胺转氨酶基因连接，获得含有黏玉米谷氨酰胺转氨酶基因的重组质粒pAOX9k-tgz；
⑶启动子PTEF1进行Sac I和Bam HI双酶切并定向插入同样经Sac I和Bam HI双酶切的重组质粒pAOX9k-tgz中，获得重组载体pTEF9k-tgz；
⑷将步骤⑶得到的重组载体pTEF9k-tgz转化到宿主中，获得重组毕赤酵母菌株。
如上所述的重组毕赤酵母菌株生产黏玉米来源谷氨酰胺转氨酶的方法，步骤如下：
将重组毕赤酵母接种于YPD培养基中，25-30℃，210-260r/min活化培养20-27h后，得活化的培养液，再将活化的培养液转接至发酵体系中，发酵生产谷氨酰胺转氨酶。
而且，按10％的接种量将活化的培养液转接到BMGY培养基中，每24h加入甘油，使其体积终浓度为2％，发酵时间为96h，即得谷氨酰胺转氨酶。
本发明取得的优点和积极效果是：
本发明重组毕赤酵母菌株所用的重组载体是在pPIC9K载体基础上进行改造，替换了启动子后转入毕赤酵母，高效生产谷氨酰胺转氨酶。利用本发明提供的重组毕赤酵母发酵得到的谷氨酰胺转氨酶，酶活可达479mU/mL，且为胞外酶。虽然其活性低于已在文章Heterologous expression and purification of Zea mays transglutaminase inPichia pastoris(Food Science and Biotechnology.2014,23:1507-1513)中公开的整合了pAOX9k-tgz载体的重组毕赤酵母的酶活，即586mU/mL，但是其诱导剂使用了更加安全的甘油代替易燃易爆的甲醇。重组菌株易于培养、分泌能力强，利于谷氨酰胺转氨酶的大量表达，所以本发明利用毕赤酵母为宿主发酵得到的谷氨酰胺转氨酶具有安全可靠的特点，且具有重要的应用前景。
附图说明
图1为本发明中整合表达质粒pTEF9k-tgz图谱；
图2为本发明中重组质粒pTEF9k-tgz的双酶切鉴定图；
图3本发明中阳性重组菌株的PCR鉴定图；
图4为本发明中活性表达黏玉米谷氨酰胺转氨酶重组菌株发酵上清SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
本发明中使用到的培养基可以如下：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L。
固体培养基为液体培养基中添加琼脂，添加量为20g/L。
BMGY培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，无氨基酸的酵母氮源13.4g/L，甘油10mL/L，生物素0.4mg/L，100mL 1mol/L(pH 6.0)磷酸盐缓冲液。
本发明中谷氨酰胺转氨酶活力测定如下：
采用比色法测定谷氨酰胺转氨酶酶活。1个单位酶活的定义为：37℃，pH 8.0的条件下，每分钟催化产生1μmol单羟肟酸所需的酶量(U/mL)。酶活测定条件：50μL酶液与50μL试剂A(100mg N-CBZ-Gln-Gly溶解于2mL 0.2mol/LNaOH，加入4mL 0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0),2mL 0.01mol/L还原型谷胱甘肽和2mL 0.1mol/L羟胺,并调节pH至8.0)混合，37℃反应30min后加50μL试剂B(50g/L FeCl3，120g/L三氯乙酸及3mol/L盐酸按体积比为1：1：1的比例混合)终止反应，用酶标仪于525nm波长下比色。通过L-谷氨酸-γ-单羟肟酸绘制标准曲线，根据曲线计算酶活。
一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株为将来源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase)基因转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中得到的基因工程菌株，该重组毕赤酵母菌株是通过将pPIC9K质粒中的醇氧化酶启动子PAOX1替换成翻译延伸因子1-α启动子PTEF1，并与谷氨酰胺转氨酶基因连接成环，构成重组表达载体的方式得到的。
较优地，所述谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
较优地，所述PTEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
较优地，所述重组毕赤酵母菌株的宿主为P.pastoris GS115。
如上所述的重组毕赤酵母菌株的构建方法，步骤如下：
⑴获得来源于黏玉米的谷氨酰胺转氨酶基因与启动子PTEF1序列；
⑵将pPIC9K质粒载体与谷氨酰胺转氨酶基因连接，获得含有黏玉米谷氨酰胺转氨酶基因的重组质粒pAOX9k-tgz；
⑶启动子PTEF1进行Sac I和Bam HI双酶切并定向插入同样经Sac I和Bam HI双酶切的重组质粒pAOX9k-tgz中，获得重组载体pTEF9k-tgz；
⑷将步骤⑶得到的重组载体pTEF9k-tgz转化到宿主中，获得重组毕赤酵母菌株。
如上所述的重组毕赤酵母菌株生产黏玉米来源谷氨酰胺转氨酶的方法，步骤如下：
将重组毕赤酵母接种于YPD培养基中，25-30℃，210-260r/min活化培养20-27h后，得活化的培养液，再将活化的培养液转接至发酵体系中，发酵生产谷氨酰胺转氨酶。
较优地，按10％的接种量将活化的培养液转接到BMGY培养基中，每24h加入甘油，使其体积终浓度为2％，发酵时间为96h，即得谷氨酰胺转氨酶。
更具体地，如上所述的重组毕赤酵母菌株的构建方法，步骤如下：
(1)表达载体pTEF9k-tgz的构建
以黏玉米谷氨酰胺转氨酶基因为模板，参照GenBank上黏玉米谷胺酰转氨酶基因序列(序列号为AJ421525)设计引物TGZ-F(ATCGAATTCATGGCTCATCGTGGACATCTAGA，下划线为Eco RI酶切位点)和TGZ-R(ATTAGCGGCCGCATTTCACCATATTTGTCT,下划线为Not I酶切位点)，进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火30s，68℃延伸50s，反应30个循环；68℃延伸5min。PCR扩增产物经胶回收后连接到pTA2载体，构建pTA2-tgz重组载体，转化到E.coli DH5α感受态细胞，进行序列测定。将验证正确的重组载体pTA2-tgz和表达载体pPIC9K分别进行Eco RI和Not I双酶切，使用胶回收试剂盒回收后用Ligation high进行连接以构建重组表达载体pAOX9k-tgz。将重组载体转化E.coli DH5α感受态细胞，进行菌落PCR和Eco RI和Not I双酶切验证。随后，将验证正确的重组载体pAOX9k-tgz转化毕赤酵母感受态细胞，构建重组菌株GS115/pAOX9k-tgz。
根据酵母基因组提取试剂盒说明书提取毕赤酵母GS115基因组，并以其为模板，参照GenBank上TEF1基因序列(序列号为EF014948)设计引物TEF1(CTAGAGCTCATAACTGTCGCCTCTTTTATC，下划线为Sac I酶切位点)和TEF2(TCAGGATCCGTTGGCGAATAACTAAAATG，下划线为Bam HI酶切位点)，通过PCR扩增启动子PTEF1。扩增条件为94℃预变性2min；94℃变性15s，52℃退火30s，68℃延伸30s，反应30个循环；68℃延伸5min。PCR扩增产物经胶回收后连接到pTA2载体，构建重组载体pTA2-TEF，转化到E.coli DH5α感受态细胞，进行序列测定。将验证正确的pTA2-TEF和重组质粒pAOX9k-tgz分别进行Sac I和Bam HI双酶切，使用胶回收试剂盒回收后用Ligation high进行连接以构建重组表达载体pTEF9k-tgz，如图1所示。将重组载体转化E.coli DH5α感受态细胞，进行菌落PCR和Sac I和Bam HI双酶切验证，结果如图2所示。分别得到大小约为11000bp和424bp的载体片段和插入片段，与阳性对照大小一致。结果表明外源基因以正确的方向和阅读框插入，说明成功构建了表达载体pTEF9k-tgz。
(2)表达载体pTEF9k-tgz转化毕赤酵母
将步骤(1)中得到的表达载体pTEF9k-tgz进行Sal I单酶切线性化，用2倍体积无水乙醇进行质粒浓缩，离心后倒去上清，用100μL 70％(v/v)乙醇洗涤沉淀3-4次，离心去上清，风干后用20-30μL无菌ddH2O溶解。将0.5-1μg线性化质粒与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混合并迅速转入预冷的电转化杯中，冰浴5min后于电转仪上电击，立即加入600μL1mol/L冰预冷的无菌山梨醇，30℃孵育45min，取200μL涂布于RDB平板，30℃倒置培养48h，挑取阳性克隆进行PCR鉴定。结果如图3所示，在约424bp(图3a)和1600bp(图3b)的位置各有一条清晰条带，大小与预计的片段大小相符，表明线性化重组质粒成功整合到P.pastorisGS115基因组染色体上。
(3)P.pastoris转化子GS115/pTEF9k-tgz发酵产酶
将步骤(2)中构建的重组菌株GS115/pTEF9k-tgz和对照菌株GS115/pPIC9K分别接种于YPD培养基中，并在28℃以250rpm的转速震荡培养24h，获得种子液。按10％接种量转接于BMGY培养基中，在28℃，每24h加入甘油至其终浓度为2％(v/v)，250rpm培养96h。将诱导表达后的菌液离心收集上清，进行SDS-PAGE分析和酶活测定。结果如图4所示，阴性对照菌GS115/pPIC9K在74kDa处没有特异条带，而阳性重组菌GS115/pTEF9k-tgz在74kDa处出现特异条带。该结果表明启动子PTEF1成功的调控了黏玉米谷氨酰胺转氨酶在P.pastoris GS115中的表达。酶活测定结果表明，上清液的酶活为479mU/mL。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 534
<212> PRT
<213> 谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列(Unknown)
<400> 1
Met Ala His Ala Gly His Leu Ala Gly Leu Thr Gly Gly Ala Pro Ala
1 5 10 15
Leu Met Ala His Gly Ser Pro Ala Ala Gly Ser Leu Ser Ser Ala Ser
20 25 30
Pro Leu Gly Ser Ser Ser Thr Leu Gly Met Leu Gly Ala Leu Leu Ala
35 40 45
Met Gly Thr Thr Gly Val Gly Leu Leu Ile Thr Gly Ala Gly Ala Leu
50 55 60
Ala Ser Ser His Val Val Leu Ala Gly Ala Ile Val Ala Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gly Met Gly Met Ile Ala Thr His Leu Gly Gly Val Gly Thr Gly Thr
85 90 95
Ala Leu Gly Ile Ala Ala Leu Leu Gly Ala Ile Ala Leu Met Gly Val
100 105 110
Ala Ile His Ser Gly Ala Val Val Ala Leu Gly Leu His Gly Met His
115 120 125
Met Gly Ala Leu Ala Leu Ile Thr Gly Ala Gly Met Leu Thr Leu Gly
130 135 140
Ile Gly Ala Val Thr Leu Gly Leu Gly Leu Leu Ser Ala Ser Gly Ala
145 150 155 160
Ala Leu Ser Leu Pro Gly Leu Leu Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ala Leu
165 170 175
Gly His His Ala Leu Ala Ser Gly Pro Gly Pro Gly Leu Ala Thr Ala
180 185 190
Val Leu Gly Val Gly Gly Met Ala Thr Met Gly Met Ala Leu Ile Thr
195 200 205
Met Thr Leu Gly Ala Gly Leu Leu Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Gly
210 215 220
Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala His Ala Ala Gly
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Ala Ser Gly Pro Gly Gly Leu Leu Leu Pro Ala Pro
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Pro Gly Thr His Met Gly Val His Ile Pro Ala Thr
260 265 270
Pro Leu His Ile Ser Ala Gly Pro Ala Leu Gly His Ile Ser Ala Val
275 280 285
Leu Ala Leu Gly Thr Ile Ser Ala Gly Pro Ala Leu Gly His Ile Ser
290 295 300
Ala Gly Pro Ala Leu Gly His Ile Ser Ala Gly Ala Ala Met Gly His
305 310 315 320
Ile Ser Ala Gly Leu Ala Leu Gly His Ile Ser Ala Gly Pro Ala Leu
325 330 335
Gly His Ile Ser Ala Gly Pro Ala Leu Gly His Ile Ser Ala Val Leu
340 345 350
Ala Leu Gly His Ile Ser Ala Gly Pro Ala Leu Gly His Ile Ser Ala
355 360 365
Gly Pro Ser Leu Gly His Ile Ser Ala Gly Pro Ala Leu Gly His Ile
370 375 380
Ser Ala Gly Pro Ala Met Gly His Ile Ser Ala Gly Pro Ala Met Gly
385 390 395 400
His Ile Ser Ala Val Leu Ala Leu Gly His Thr Thr Met Leu Met Met
405 410 415
Leu Ala Ala Leu Met His Met Gly Val Thr Leu Ala Ile Gly Leu Gly
420 425 430
Ala Thr Ala Leu Val Gly Cys Pro Thr Ile Pro Met Leu His Leu Ala
435 440 445
Ser Gly Gly Ala Ala Val Gly Leu Ala Thr Pro Gly Gly Ala Ser Met
450 455 460
Gly Gly Leu Val Val Leu Ala Ile Leu Leu Gly Leu Pro Ser Ala Ala
465 470 475 480
Val Ala Leu Gly Met Gly Ala Leu His Leu Leu Leu His His His Ala
485 490 495
Gly His His Ile Pro Pro Ala His Met Thr Leu Pro Gly Gly Pro Ala
500 505 510
Ala Leu Ile Thr Ala Val Ala Gly Met Ala Val Cys His Ala His Leu
515 520 525
Leu Ser Ala Gly Ile Thr
530
<210> 2
<211> 424
<212> DNA/RNA
<213> PTEF1的核苷酸序列(Unknown)
<400> 2
ataactgtcg cctcttttat ctgccgcact gcatgaggtg tccccttagt gggaaagagt 60
actgagccaa ccctggagga cagcaaggga aaaataccta caacttgctt cataatggtc 120
gtaaaaacaa tccttgtcgg atataagtgt tgtagactgt cccttatcct ctgcgatgtt 180
cttcctctca aagtttgcga tttctctcta tcagaattgc catcaagaga ctcaggacta 240
atttcgcagt cccacacgca ctcgtacatg attggctgaa atttccctaa agaatttttt 300
tttcacgaaa attttttttt tacacaagat tttcagcaga tataaaatgg agagcaggac 360
ctccgctgtg actcttcttt tttttctttt attctcacta catacatttt agttattcgc 420
caac 424
<210> 3
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> 引物TGZ-F(Unknown)
<400> 3
atcgaattca tggctcatcg tggacatcta ga 32
<210> 4
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 引物TGZ-R(Unknown)
<400> 4
attagcggcc gcatttcacc atatttgtct 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 引物TEF1(Unknown)
<400> 5
ctagagctca taactgtcgc ctcttttatc 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> 引物TEF2(Unknown)
<400> 6
tcaggatccg ttggcgaata actaaaatg 29
Claims (7)
1.一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，其特征在于：所述重组毕赤酵母菌株为将来源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase)基因转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中得到的基因工程菌株，该重组毕赤酵母菌株是通过将pPIC9K质粒中的醇氧化酶启动子PAOX1替换成翻译延伸因子1-α启动子PTEF1，并与谷氨酰胺转氨酶基因连接成环，构成重组表达载体的方式得到的。
2.根据权利要求1所述的利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，其特征在于：所述谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，其特征在于：所述PTEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1至3任一项所述的利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，其特征在于：所述重组毕赤酵母菌株的宿主为P.pastoris GS115。
5.如权利要求1至4任一项所述的重组毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴获得来源于黏玉米的谷氨酰胺转氨酶基因与启动子PTEF1序列；
⑵将pPIC9K质粒载体与谷氨酰胺转氨酶基因连接，获得含有黏玉米谷氨酰胺转氨酶基因的重组质粒pAOX9k-tgz；
⑶启动子PTEF1进行Sac I和Bam HI双酶切并定向插入同样经Sac I和Bam HI双酶切的重组质粒pAOX9k-tgz中，获得重组载体pTEF9k-tgz；
⑷将步骤⑶得到的重组载体pTEF9k-tgz转化到宿主中，获得重组毕赤酵母菌株。
6.如权利要求1至4任一项所述的重组毕赤酵母菌株生产黏玉米来源谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于：步骤如下：
将重组毕赤酵母接种于YPD培养基中，25-30℃，210-260r/min活化培养20-27h后，得活化的培养液，再将活化的培养液转接至发酵体系中，发酵生产谷氨酰胺转氨酶。
7.根据权利要求6所述的重组毕赤酵母菌株生产黏玉米来源谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于：按10％的接种量将活化的培养液转接到BMGY培养基中，每24h加入甘油，使其体积终浓度为2％，发酵时间为96h，即得谷氨酰胺转氨酶。
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2019
- 2019-03-05 CN CN201910162451.8A patent/CN109749948A/zh active Pending
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