KR20220139308A - 대장균을 사용한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법 - Google Patents
대장균을 사용한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220139308A KR20220139308A KR1020227026303A KR20227026303A KR20220139308A KR 20220139308 A KR20220139308 A KR 20220139308A KR 1020227026303 A KR1020227026303 A KR 1020227026303A KR 20227026303 A KR20227026303 A KR 20227026303A KR 20220139308 A KR20220139308 A KR 20220139308A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- coli
- plasmid
- heme
- seq
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 title claims abstract description 98
- 108010063653 Leghemoglobin Proteins 0.000 title claims abstract description 94
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 title claims abstract description 91
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 72
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 62
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 82
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 claims abstract description 78
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 54
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims abstract description 43
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims abstract description 13
- 101150011519 LGB2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000019264 food flavour enhancer Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 102000018146 globin Human genes 0.000 claims description 42
- 108060003196 globin Proteins 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 38
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 38
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 108010092943 Dicarboxylic Acid Transporters Proteins 0.000 claims description 19
- 102000016862 Dicarboxylic Acid Transporters Human genes 0.000 claims description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 17
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 17
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 claims description 16
- 108010057394 Ferrochelatase Proteins 0.000 claims description 15
- 102000003875 Ferrochelatase Human genes 0.000 claims description 15
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 15
- 101710082757 NADP-dependent malic enzyme Proteins 0.000 claims description 14
- 102100023175 NADP-dependent malic enzyme Human genes 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 241000191025 Rhodobacter Species 0.000 claims description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 claims description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 2
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 claims 2
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims 2
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 41
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 31
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 10
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 9
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Substances CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 8
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 6
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 5
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- 208000015710 Iron-Deficiency Anemia Diseases 0.000 description 4
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 4
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 150000004698 iron complex Chemical class 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- WWSJZGAPAVMETJ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-ethoxypyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C(=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)OCC WWSJZGAPAVMETJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HVTQDSGGHBWVTR-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-phenylmethoxypyrazol-1-yl]-1-morpholin-4-ylethanone Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)OC1=NN(C=C1C=1C=NC(=NC=1)NC1CC2=CC=CC=C2C1)CC(=O)N1CCOCC1 HVTQDSGGHBWVTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MGGVALXERJRIRO-UHFFFAOYSA-N 4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-2-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-1H-pyrazol-5-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C(=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)O MGGVALXERJRIRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 3
- VWVRASTUFJRTHW-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(azetidin-3-yloxy)-4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound O=C(CN1C=C(C(OC2CNC2)=N1)C1=CN=C(NC2CC3=C(C2)C=CC=C3)N=C1)N1CCC2=C(C1)N=NN2 VWVRASTUFJRTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KSFOVUSSGSKXFI-GAQDCDSVSA-N CC1=C/2NC(\C=C3/N=C(/C=C4\N\C(=C/C5=N/C(=C\2)/C(C=C)=C5C)C(C=C)=C4C)C(C)=C3CCC(O)=O)=C1CCC(O)=O Chemical compound CC1=C/2NC(\C=C3/N=C(/C=C4\N\C(=C/C5=N/C(=C\2)/C(C=C)=C5C)C(C=C)=C4C)C(C)=C3CCC(O)=O)=C1CCC(O)=O KSFOVUSSGSKXFI-GAQDCDSVSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 101900124658 Escherichia coli Ferrochelatase Proteins 0.000 description 2
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 2
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229950003776 protoporphyrin Drugs 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- AWAXZRDKUHOPBO-GUBZILKMSA-N Ala-Gln-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AWAXZRDKUHOPBO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WMYJZJRILUVVRG-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O WMYJZJRILUVVRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- RZZMZYZXNJRPOJ-BJDJZHNGSA-N Ala-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N RZZMZYZXNJRPOJ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- LXAARTARZJJCMB-CIQUZCHMSA-N Ala-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LXAARTARZJJCMB-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OMFMCIVBKCEMAK-CYDGBPFRSA-N Ala-Leu-Val-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OMFMCIVBKCEMAK-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- PXAFZDXYEIIUTF-LKTVYLICSA-N Ala-Trp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PXAFZDXYEIIUTF-LKTVYLICSA-N 0.000 description 1
- HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)CN=C(N)N HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N Asp-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HJZLUGQGJWXJCJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HJZLUGQGJWXJCJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N Glu-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- NCWOMXABNYEPLY-NRPADANISA-N Glu-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NCWOMXABNYEPLY-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OQXDUSZKISQQSS-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OQXDUSZKISQQSS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- MHHUEAIBJZWDBH-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN MHHUEAIBJZWDBH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FQKKPCWTZZEDIC-XPUUQOCRSA-N Gly-His-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 FQKKPCWTZZEDIC-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N Gly-Leu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N Gly-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)CN CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BATWGBRIZANGPN-ZPFDUUQYSA-N Ile-Pro-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N BATWGBRIZANGPN-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPOHDJKRBLVGCT-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N MPOHDJKRBLVGCT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N Lys-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HWMZUBUEOYAQSC-DCAQKATOSA-N Lys-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HWMZUBUEOYAQSC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XIZQPFCRXLUNMK-BZSNNMDCSA-N Lys-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N XIZQPFCRXLUNMK-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N Lys-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- IUYCGMNKIZDRQI-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IUYCGMNKIZDRQI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- GLJZDMZJHFXJQG-BZSNNMDCSA-N Phe-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O GLJZDMZJHFXJQG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- XNQMZHLAYFWSGJ-HTUGSXCWSA-N Phe-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XNQMZHLAYFWSGJ-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- APZNYJFGVAGFCF-JYJNAYRXSA-N Phe-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(C)C)C(O)=O APZNYJFGVAGFCF-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- DZZCICYRSZASNF-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DZZCICYRSZASNF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N Ser-Asn-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DKKGAAJTDKHWOD-BIIVOSGPSA-N Ser-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O DKKGAAJTDKHWOD-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- BEAFYHFQTOTVFS-VGDYDELISA-N Ser-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BEAFYHFQTOTVFS-VGDYDELISA-N 0.000 description 1
- RIAKPZVSNBBNRE-BJDJZHNGSA-N Ser-Ile-Leu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RIAKPZVSNBBNRE-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- ILZAUMFXKSIUEF-SRVKXCTJSA-N Ser-Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ILZAUMFXKSIUEF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N Thr-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- RNDWCRUOGGQDKN-UBHSHLNASA-N Trp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RNDWCRUOGGQDKN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- TYFLVOUZHQUBGM-IHRRRGAJSA-N Tyr-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 TYFLVOUZHQUBGM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FZSPNKUFROZBSG-ZKWXMUAHSA-N Val-Ala-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O FZSPNKUFROZBSG-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- LABUITCFCAABSV-BPNCWPANSA-N Val-Ala-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LABUITCFCAABSV-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- DDNIHOWRDOXXPF-NGZCFLSTSA-N Val-Asp-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DDNIHOWRDOXXPF-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 1
- IJGPOONOTBNTFS-GVXVVHGQSA-N Val-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IJGPOONOTBNTFS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- AIWLHFZYOUUJGB-UFYCRDLUSA-N Val-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AIWLHFZYOUUJGB-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013527 bean curd Nutrition 0.000 description 1
- 235000015191 beet juice Nutrition 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000012495 crackers Nutrition 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000005431 greenhouse gas Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010050343 histidyl-alanyl-glutamine Proteins 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940079865 intestinal antiinfectives imidazole derivative Drugs 0.000 description 1
- -1 iron ions Chemical class 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 235000013548 tempeh Nutrition 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
- A23J1/006—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from vegetable materials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
- A23J1/14—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds
- A23J1/148—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds by treatment involving enzymes or microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
- A23J3/14—Vegetable proteins
- A23J3/16—Vegetable proteins from soybean
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
- A23J3/22—Working-up of proteins for foodstuffs by texturising
- A23J3/225—Texturised simulated foods with high protein content
- A23J3/227—Meat-like textured foods
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
- A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
- A23L13/42—Additives other than enzymes or microorganisms in meat products or meat meals
- A23L13/428—Addition of flavours, spices, colours, amino acids or their salts, peptides, vitamins, yeast extract or autolysate, nucleic acid or derivatives, organic acidifying agents or their salts or acidogens, sweeteners, e.g. sugars or sugar alcohols; Addition of alcohol-containing products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/0104—Malate dehydrogenase (oxaloacetate-decarboxylating) (NADP+) (1.1.1.40)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01037—5-Aminolevulinate synthase (2.3.1.37)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y499/00—Other lyases (4.99)
- C12Y499/01—Other lyases (4.99.1)
- C12Y499/01001—Ferrochelatase (4.99.1.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
대두 레그헤모글로빈 (soy leghemoglobin)을 제조하는 방법은 헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 제작하는 단계; 글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 제작하는 단계; 제 1 플라스미드 및 제 2 플라스미드를 포함하는 제 1 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및 제 1 생산균주 대장균을 배양하여 대두 레그헤모글로빈을 생산하는 단계를 포함한다. 육류 풍미증진제 및/또는 철 보충제로서 유용한 조성물은 본원 발명에 따라 제조된 대두 레그헤모글로빈을 포함한다.
Description
본 출원은 2020년 1월 10일자로 제출된 미국 가특허출원 제 62/959,702호에 대한 우선권을 주장하고, 이는 모든 목적으로 본원에 전적으로 기재된 바와 같이 참고문헌으로 통합된다.
본 발명은 대장균을 사용하여 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법, 및 대두 레그헤모글로빈의 육류 풍미증진제 및/또는 철 보충제로서의 용도에 관한 것이다.
인간은 수렵생활 초기부터 육류를 먹기 시작하였으며, 육류는 주로 사냥한 동물의 살 (근육 조직)에서 얻었다. 인류가 발전하면서, 모든 산업이 발전하였지만, 해결되어야 할 여러 문제도 생겨났다. 그 중, 축산업의 발전은 환경 문제를 포함하여 다양한 문제를 야기하였다. 예를 들면, 모든 인간 관련 온실가스 배출의 약 15%가 축산업으로부터 발생하고, 이중 절반이 전세계에서 사육되는 15억 마리의 소로부터 발생한다. 또한, 동물의 육류는 동일한 양의 초목과 비교하여 4-25배의 더 많은 물과 6-17배의 더 넓은 땅을 필요로 한다. 또한, 최근 동물의 생명권에 대한 인식이 높아짐에 따라 육류를 얻기 위한 도축은 동물윤리의 문제로까지 대두되고 있다. 더욱 심각한 문제는 세계 인구가 급격하게 증가함에 따라 오늘날과 동일한 방식으로의 육류 공급은 한계를 가진다는 것이다.
대체육은 기존 육류에 관련된 제조의 비효율성, 환경 파괴 및 건강 손상의 문제를 해결할 수 있는 주요 수단으로 주목을 받고 있다. 일반적으로, 대체육은 식물성 성분으로부터 제조되고, 때로는 유제품과 같은 동물성 성분이 없는 식품을 의미한다. 많은 대체육은 대두 (예로, 두부, 템페) 또는 글루텐을 기반으로 하지만, 이제는 콩 단백질로부터도 제조될 수 있다. 대체육의 목표 시장은 채식주의자, 비건, 육류 소비를 줄이려는 비-채식주의자, 및 힌두교, 유대교, 이슬람교 및 불교의 종교적 식이법을 따르는 사람들을 포함한다. 최근 보고서에 따르면, 전세계 대체육 시장 규모는 2017년 41억 7,500만 달러에서 2025년 75억 4,900만 달러에 이를 것으로 예상된다. 대체육의 중요성에 대한 근거는 현재 77억명에서 2050년에는 98억명, 2100년에는 112억명으로 증가할 것으로 추산되는 전세계 인구를 먹여살리는 것에서부터 시작되었다. 이러한 인구 성장의 대부분은 아프리카에서 발생하고, 아시아가 그 뒤를 따를 것이다.
대체육 기술의 발전에도 불구하고, 오늘날 시장에 나와 있는 대체육 제품들은 실제 육류와 비교할 때 풍미에서 차이가 난다. 대체육은 육류와 동일한 식감을 제공하기 위해 다양한 기술들이 적용되어 식물로부터 제조된다. 대체육을 생산하는 대다수 회사는 독특한 육류 색상을 내기 위해 비트 쥬스 또는 다른 식물성 색소를 첨가하지만, 이들은 육류와 유사한 풍미를 제공할 수는 없다.
따라서, 육류 본연의 색상뿐만 아니라 풍미를 제공할 수 있는 식품 첨가제의 개발이 무엇보다 시급한 실정이다.
한편으로, 철 (Fe)은 체내 산소 운반에 필수적인 역할을 담당하는 미량 원소로서, 헤모글로빈, 미오글로빈, 시토크롬, 철/황 단백질 및 생체분자 구조의 중요한 구성 성분이다. 체내 철의 평균 총량은 약 3-4 g이고, 이 중 60-65%는 순환하는 적혈구의 헤모글로빈에 결합하고 있으며, 나머지 30-35%는 저장 철 (페리틴)로서 존재한다. 또한, 철은 조직 철 및 혈청 철 (트랜스페린)의 형태로도 존재하고, 뿐만 아니라 근육의 미오글로빈에도 소량의 철이 존재한다.
철은 체내에서 합성되지 않아 전적으로 섭취를 통해 획득되어야 하며, 헴철 및 비-헴철의 2가지 유형으로 존재한다. 헴철은 체내 헤모글로빈의 헴과 구조적으로 동일한 부분을 갖는 철 복합체이고, 비-헴철은 헤모글로빈의 헴과 구조적으로 동일한 부분을 갖지 않는 철 복합체이다. 이러한 2가지 유형의 철은 철 보충제 (철 보충 화합물)로서 사용될 수 있으며, 헴철의 생체이용률은 비-헴철의 생체이용률보다 월등히 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 체내에서 헴철의 흡수는 다른 식이 요인에 의해 영향을 받지 않는다. 더욱이, 헴철은 비-헴철에서 보고되었던 다양한 부작용 (변비, 위장 장애 등)을 유발하지 않는 장점을 갖는다.
일반적으로, 헴철은 돼지의 혈액과 같은 도축된 동물의 혈액로부터 제조된다. 헴철은 먼저 도축장 혈액에서 헤모글로빈을 분리한 다음 분리된 헤모글로빈으로부터 헴철을 분리하는 방식으로 제조된다. 헤모글로빈으로부터 헴철의 분리는 알코올 및 이미다졸 유도체를 사용하는 방법 (Lindroos, 미국 특허 제 4,431,581호), 이에 아미노산을 첨가하는 방법 (Ingberg, et. al., 미국 특허 제 5,008,388호), 고농축된 유기산을 사용하여 고온에서 분해하는 방법 (Liu, 등, J. Agric. Food Chem. 44: 2957, 1996), 및 프로테아제 등을 사용하는 방법 등이 있다.
이와 같이, 통상적인 방법으로 제조된 헴철은 비-헴철에는 존재하지 않은, 동물 유래의 감염원에 의한 감염 위험성, 가축 성장호르몬의 오염 및 항생제의 잔류와 같은 많은 문제점이 있다. 따라서, 동물 혈액으로부터 유래하지 않은 헴철을 제조하는 방법의 개발이 필요하다.
따라서, 본 발명은 관련 기술분야에서 발견되는 문제점을 염두에 두고 이루어졌으며, 이러한 문제점을 해결하기 위한 것이다.
일 양태에서, 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법은 헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 제작하는 단계; 글리신 맥스 (Glycine max) 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 제작하는 단계; 제 1 플라스미드 및 제 2 플라스미드를 포함하는 제 1 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및 제 1 생산균주 대장균을 배양하여 대두 레그헤모글로빈을 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 헴 생합성 경로 효소는 ALA 합성효소, NADP-의존성 말산 효소, 디카르복실산 수송체 및 페로킬라타제 (ferrochelatase)이다.
또 다른 양태에서, 대두 레그헤모글로빈은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 갖는 글로빈 및 화학식 1로 표시되는 헴으로 구성된다.
또 다른 양태에서, 제 1 플라스미드는 서열번호 6에 제시된 염기서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, 제 2 플라스미드는 서열번호 8에 제시된 염기서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, ALA 합성효소는 서열번호 2에 제시된 염기서열을 갖는 로도박터 스패로이데스 (Rhodobacter sphaeroides) ALA 합성효소이고, NADP-의존성 말산 효소는 서열번호 3에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 (Escherichia coli) NADP-의존성 말산 효소이고, 디카르복실산 수송체는 서열번호 4에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 디카르복실산 수송체이며, 페로킬라타제 (ferrochelatase)는 서열번호 5에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 페로킬라타제이다.
또 다른 양태에서, 상기 방법은 제 1 생산균주 대장균을 배양하기 위해 숙신산을 사용하여 pH 7 내지 pH 9로 조정하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법은 헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 3 플라스미드를 제작하는 단계; 제 3 플라스미드를 포함하는 제 2 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및 제 2 생산균주 대장균을 배양하여 대두 레그헤모글로빈을 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 헴 생합성 경로 효소는 ALA 합성효소, NADP-의존성 말산 효소, 디카르복실산 수송체 및 페로킬라타제이다.
또 다른 양태에서, 대두 레그헤모글로빈은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 갖는 글로빈 및 화학식 1로 표시되는 헴으로 구성된다.
또 다른 양태에서, 제 3 플라스미드는 서열번호 9에 제시된 염기서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, ALA 합성효소는 서열번호 2에 제시된 염기서열을 갖는 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소이고, NADP-의존성 말산 효소는 서열번호 3에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 NADP-의존성 말산 효소이고, 디카르복실산 수송체는 서열번호 4에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 디카르복실산 수송체이며, 페로킬라타제는 서열번호 5에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 페로킬라타제이다.
또 다른 양태에서, 상기 방법은 제 2 생산균주 대장균을 배양하기 위해 숙신산을 사용하여 pH 7 내지 pH 9로 조정하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법은 글리신 맥스 (Glycine max) 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 제작하는 단계; 제 2 플라스미드를 포함하는 제 3 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 제 3 생산균주 대장균을 배양하여 글로빈을 생산하는 단계; 미생물 발효 또는 화학적 합성에 의해 헴을 생산하는 단계; 및 글로빈 및 헴을 커플링 하여 대두 레그헤모글로빈을 획득하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 제 2 플라스미드는 서열번호 8에 제시된 염기서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, 헴을 생산하는 단계는 헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 제작하는 단계; 제 1 플라스미드를 포함하는 제 4 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및 제 4 생산균주 대장균을 배양하여 헴을 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 제 1 플라스미드는 서열번호 6에 제시된 염기서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, 육류 풍미증진제 및/또는 철 보충제로서 유용한 조성물은 본 발명의 방법에 따라 제조된 대두 레그헤모글로빈을 포함한다.
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 예시적이고 해석적인 것이며, 청구된 바와 같은 본 발명의 추가 설명을 제공하기 위한 것으로 이해되어야 한다.
첨부된 도면은 본 발명의 추가 이해를 제공하기 위해 포함되고, 본 명세서에 통합되어 이의 일부를 구성하며, 본 발명의 구현예를 도시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하고 있다.
도 1은 pLEX_HMDH의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 2는 pBAD_LegH의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 3은 pLEX_LHMDH의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 4는 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 레인 M: 단백질 마커, 레인 1: 글로빈, 레인 2: 실시예 8, 레인 3: 실시예 9, 레인 4: 실시예 10-4, 및 레인 5: 실시예 10-5.
도 5는 고유한 PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 레인 1: 글로빈, 레인 2: 실시예 8, 레인 3: 실시예 9, 레인 4: 실시예 10-4, 및 레인 5: 실시예 10-5. 적색 화살표: 헴-글로빈 복합체.
도 6은 분광분석의 결과를 나타낸다.
도 7은 형광 분광분석의 결과를 나타낸다.
도 1은 pLEX_HMDH의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 2는 pBAD_LegH의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 3은 pLEX_LHMDH의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 4는 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 레인 M: 단백질 마커, 레인 1: 글로빈, 레인 2: 실시예 8, 레인 3: 실시예 9, 레인 4: 실시예 10-4, 및 레인 5: 실시예 10-5.
도 5는 고유한 PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 레인 1: 글로빈, 레인 2: 실시예 8, 레인 3: 실시예 9, 레인 4: 실시예 10-4, 및 레인 5: 실시예 10-5. 적색 화살표: 헴-글로빈 복합체.
도 6은 분광분석의 결과를 나타낸다.
도 7은 형광 분광분석의 결과를 나타낸다.
본 발명의 구현예가 이제 상세하게 언급될 것이고, 이의 예시는 첨부된 도면에 도시되어 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 철저한 연구의 결과로서, 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법 및 대두 레그헤모글로빈를 포함하는 조성물을 개발하였다. 상기 조성물은 육류 풍미증진제 및 철 보충제로서 활용될 수 있으며, 이에 따라 본 발명이 완성된다.
본원에 사용된 용어 "헴철"은 체내 헤모글로빈의 헴과 동일한 구조를 갖는 부분을 포함하는 철 복합체를 의미하고, 용어 "비-헴철"은 헤모글로빈의 헴과 동일한 구조를 갖는 부분을 포함하지 않는 철 복합체를 의미한다.
본원 발명의 글로빈은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 99.5%의 일치도를 갖는 이의 변이체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 본원에서의 아미노산 서열 일치도는, 동일한 리딩 프레임 내에 정렬시키고, 필요한 경우 최대의 서열 일치도 백분율을 달성하도록 갭을 도입한 이후에, 임의의 보존적 치환을 서열 일치도의 일부로서 고려하지 않는, 글로빈 서열의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.
2가지 아미노산 서열의 일치도 백분율을 결정하기 위하여, 서열은 최적의 비교를 위한 목적으로 정렬된다 (예로, 제 1 서열의 서열 내에 갭이 도입될 수 있음). 상응하는 아미노산 위치에서 다음과 같이 비교된다. 제 1 서열에서 위치가 제 2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산으로 채워질 때, 분자는 해당 위치에서 일치한다. 2가지 서열 사이의 일치도 백분율은 서열이 공유하는 일치한 위치의 수 함수이다 (즉, 일치도% = 일치한 위치 # / 총 위치 # × 100).
본원 발명의 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 당류, 염류, 보존제 및 첨가제로 예시되는 식품 등급의 구성성분을 추가적으로 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 본원 발명의 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 상기 성분 이외에 유화제, 현탁제 및 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
본원 발명의 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 육류 풍미증진제로서 대체육에 첨가될 수 있다. 대체육은 식물성 육류, 배양육 (세포 배양육) 및 합성육을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
본원 발명의 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 철 보충제로서 식품에 첨가될 수 있다. 식품은 크래커, 쿠키, 스낵류 및 음료수로 예시되나, 이들에 한정되지 않는다.
본원 발명의 대두 레그헤모글로빈의 대체육 또는 식품에 첨가된 양은 대체육 또는 식품의 유형에 따라 달라진다. 일반적으로, 대두 레그헤모글로빈은 1% (w/w) 이하의 대두 레그헤모글로빈이 포함되도록 대체육 또는 식품에 첨가될 수 있다.
대장균 발효공정에 의한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법에서, 대장균 (Escherichia coli) HMDH_LegH-d 또는 대장균 HMDH_LegH-s가 생산균주로서 사용된다.
생산균주 대장균 HMDH_LegH-d 또는 생산균주 대장균 HMDH_LegH-s를 사용한 대두 레그헤모글로빈의 생물학적 제조 방법에서, 배양공정의 pH는 pH 7 내지 9 범위, 바람직하게 pH 8 내지 9 범위로 유지된다. 본원에서 pH는 숙신산을 사용하여 조정된다. 이러한 공정에서 숙신산이 pH를 조정하는데 사용될 때, 숙신산은 대두 레그헤모글로빈의 생합성에서 기질로서 사용되는 물질로, 이는 대두 레그헤모글로빈의 고효율 생산에 유리하다.
별도로 제조된 글로빈 및 헴의 시험관내 커플링 공정을 통한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법에서, 대장균 LegH는 글로빈의 생산균주로서 사용된다.
별도로 제조된 글로빈 및 헴의 시험관내 커플링 공정을 통한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법에서, 대장균 HMDH는 헴의 생산균주로서 사용된다.
별도로 제조된 글로빈 및 헴의 시험관내 커플링 공정을 통한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법에서, 헴은 화학적 공정에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 실제적인 현재 바람직한 구현예는 다음의 실시예에 나타낸 바와 같이 설명된다.
그러나, 당업자라면 본 발명을 고려하여, 본 발명의 정신 및 범주 내에서 변형 및 개선을 만들 수 있음이 이해될 것이다.
실시예 1: 플라스미드 pLEX_HMDH의 제작
본 발명의 헴 생합성 경로의 4가지 핵심 효소를 포함하는 발현 플라스미드는 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소 (HemA), 대장균 NADP-의존성 말산 효소 (MaeB), 대장균 디카르복실산 수송체 (DctA) 및 대장균 페로킬라타제 (HemH)를 암호화하는 유전자를 pLEX 벡터 (인비트로젠사) 내로 통상적인 서브클로닝을 통해 제작하였다. 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소의 염기서열은 서열번호 2로 표시되고, 대장균 NADP-의존성 말산 효소의 염기서열은 서열번호 3으로 표시되고, 대장균 디카르복실산 수송체의 염기서열은 서열번호 4로 표시되며, 대장균 페로킬라타제의 염기서열은 서열번호 5로 표시된다.
결과로 생성된 플라스미드는 pLEX_HMDH로 명명하였다. 플라스미드 pLEX_HMDH에서, 삽입된 유전자 각각은 각 유전자의 앞과 뒤에 개별 P L 프로모터 및 aspA 전사 종결인자를 갖는다 (도 1).
pLEX_HMDH의 염기서열은 서열번호 6에 제시된다.
실시예 2: 플라스미드 pBAD_LegH의 제작
글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 코딩 서열은 대장균에서의 발현을 위해 코돈-최적화되어 화학적으로 합성되고, pBAD 벡터 (인비트로젠사) 내에 클로닝되어 플라스미드 pBAD_LegH가 생성되었다 (도 2).
플라스미드 pBAD_LegH는 대두 레그헤모글로빈의 글로빈 단백질에 대한 코딩 서열을 포함한다.
글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2의 코돈-최적화된 염기서열은 서열번호 7에 제시되었고, pBAD_LegH의 염기서열은 서열번호 8에 제시하였다.
실시예 3: 플라스미드 pLEX_LHMDH의 제작
본원 발명의 헴 생합성 경로의 4가지 핵심 효소 및 글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2를 포함하는 발현 플라스미드는 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소 (HemA), 대장균 NADP-의존성 말산 효소 (MaeB), 대장균 디카르복실산 수송체 (DctA), 대장균 페로킬라타제 (HemH) 및 글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2의 코돈-최적화된 염기서열을 암호화하는 유전자를 pLEX 벡터 (인비트로젠사) 내로 통상적인 서브클로닝을 통해 제작하였다. 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소의 염기서열은 서열번호 2로 표시되고, 대장균 NADP-의존성 말산 효소의 염기서열은 서열번호 3으로 표시되고, 대장균 디카르복실산 수송체의 염기서열은 서열번호 4로 표시되고, 대장균 페로킬라타제의 염기서열은 서열번호 5로 표시되며, 글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2의 코돈-최적화된 염기서열은 서열번호 7로 표시된다.
결과로 생성된 플라스미드는 pLEX_LHMDH로 명명하였다. 플라스미드 pLEX_LHMDH에서, 헴 합성효소를 암호화하는 삽입된 유전자 각각은 각 유전자의 앞과 뒤에 개별 P L 프로모터 및 aspA 전사 종결인자를 갖고, 글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2를 암호화하는 삽입된 유전자는 araBAD 프로모터 및 rrnB T1 전사 종결인자를 갖는다 (도 3). pLEX_LHMDH의 염기서열은 서열번호 9에 제시된다.
실시예 4: 헴 생산균주의 제작
플라스미드 pLEX_HMDH로 형질전환된 대장균 K-12 DH10B는 본원 발명의 헴 생산균주로서 사용되었다. 제작된 생산균주는 대장균 HMDH로 명명하였다.
헴 생산을 위한 원천 접종물로서 사용할 수 있도록, 생산균주 대장균 HMDH는 25% 글리세롤 (v/v)이 포함된 상태로 -80℃에서 유지되었다.
실시예 5: 글로빈 생산균주의 제작
플라스미드 pBAD_LegH로 형질전환된 대장균 K-12 DH10B는 본원 발명의 글로빈 생산균주로서 사용되었다. 제작된 생산균주는 대장균 LegH로 명명하였다.
글로빈 생산을 위한 원천 접종물로서 사용할 수 있도록, 생산균주 대장균 LegH는 25% 글리세롤 (v/v)이 포함된 상태로 -80℃에서 유지되었다.
실시예 6: 플라스미드 pLEX_HMDH 및 pBAD_LegH를 사용한 대두 레그헤모글로빈 생산균주의 제작
2가지 발현 제작물 (pLEX_HMDH 및 pBAD_LegH)로 형질전환된 대장균 K-12 DH10B 세포는 본원 발명의 대두 레그헤모글로빈 생산균주로서 사용되었다. 제작된 생산균주는 대장균 HMDH_LegH-d로 명명하였다.
대두 레그헤모글로빈 생산을 위한 원천 접종물로서, 생산균주 대장균 HMDH_LegH-d는 25% 글리세롤 (v/v)이 포함된 상태로 -80℃에서 유지되었다.
실시예 7: 플라스미드 pLEX_LHMDH를 사용한 대두 레그헤모글로빈 생산균주의 제작
플라스미드 pLEX_LHMDH로 형질전환된 대장균 K-12 DH10B 세포는 본원 발명의 대두 레그헤모글로빈에 대한 생산균주로서 사용되었다. 제작된 생산균주는 대장균 HMDH_LegH-s로 명명하였다.
대두 레그헤모글로빈의 생산을 위한 공급원 접종물로서, 생산균주 대장균 HMDH_LegH-s는 25% 글리세롤 (v/v)이 포함된 상태로 -80℃에서 유지되었다.
실시예 8: 생산균주 대장균 HMDH_LegH-d를 사용한 대두 레그헤모글로빈의 생산
대두 레그헤모글로빈은 대장균 HMDH_LegH-d (생산균주)를 사용한 미생물 발효를 통해 생산하였다.
50 mL 원뿔형 튜브에 50 μg/mL 클로람페니콜 및 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 10 mL의 LB 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물 및 10 g/L NaCl)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음 회전 진탕 배양기를 사용하여 37℃, 200 rpm으로 밤새 배양하였다. 밤샘 배양 이후에 얻은 1 mL의 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜 및 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 60 mL의 S 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L KH2PO4, 10 g/L 숙시네이트, 2 g/L 글리신 및 10 mg/L FeCl2·4H2O)가 첨가된 250 mL 삼각 플라스크에 접종한 다음 37℃, 200 rpm으로 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 이후에, 생성된 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜 및 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 3 L의 S 배지를 포함하는 5 L 발효기에 접종하였다. 발효기의 배양액이 OD600 = 0.5에 도달할 때까지 37℃, 0.5 vvm 통기 및 200 rpm에서 배양하였다. 배양액이 OD600 = 0.5에 도달하면, L-아라비노스 (최종 농도 = 0.2%) 용액을 배양액에 첨가하였다. 발효기의 배양액은 추가 72시간 동안 (37℃, 0.5 vvm 통기, 200 rpm) 더 배양하였다. 발효공정 동안, pH는 pH 8 내지 9로 유지하고, pH 조정은 숙신산 공급을 통해 조절하였다. pH를 조절하는데 숙신산을 사용하는 것은 숙신산이 헴의 생합성에서 기질로서 사용되는 물질인 장점을 제공할 수 있으며, 이는 궁극적으로 조성물의 고효율 생산에 유리하다. 발효 후, 생성된 세포는 4℃에서 15분 동안 4,500×g의 원심분리를 통해 회수하였다.
발효액을 원심분리하여 얻은 세포 펠렛은 초음파 파쇄로 용해시켰다. 구체적으로, 세포는 50 mL의 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 재현탁하였다. 이러한 세포 현탁액의 세포는 다음과 같이 초음파 파쇄로 용해시켰다. 초음파 파쇄는 20초 동안 수행하여 세포를 파괴시키고, 5초 동안 잠시 정지시켰으며, 이를 20분 동안 반복하였다. 획득한 전체 세포 용해물은 다시 원심분리하여 (25,000×g, 10분) 침전물 및 상등액을 분리하였다.
상기 생성된 상등액에 대해 황산암모늄 침전을 수행하여 제조된 대두 레그헤모글로빈을 농축하였다. 보다 정확하게는, 생성된 상등액을 고체 황산암모늄으로 40% 포화도로 조정하고, 2시간 동안 교반하였다. 침전된 물질은 4℃에서 15분 동안 25,000×g에서 원심분리하여 제거하고, 상등액은 고체 황산암모늄으로 70% 포화 상태로 만들었다. 이 용액은 2시간 동안 교반한 다음 4℃에서 30분 동안 25,000×g에서 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 침전된 대두 레그헤모글로빈은 5 mL의 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 재현탁시켰다. 과량의 황산암모늄을 제거하기 위하여, 탈염화 수지로서 세파덱스 G-25 (GE 헬스케어사)를 사용하였다. 컬럼은 세파덱스 G-25를 사용하여 2.6 × 10 cm로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 50 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화하였다. 그런 다음 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하였다. 그런 다음 컬럼은 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 전개시키고, 단백질 피크를 갖는 분획을 수집하였다.
탈염된 분획은 0.2 μm 필터로 여과한 다음 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 하이트랩 Q FF 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스 신속 유동 음이온 교환 레진 (GE 헬스케어사)으로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 5 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 흡착 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화하였다. 다음으로 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하고, 이어서 25 mL (5 컬럼 부피)의 흡착 완충액으로 세척하였다. 대두 레그헤모글로빈은 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)을 사용하여 용출하였다. 대두 레그헤모글로빈의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하기 위하여, 아미콘 울트라-15 3K 원심분리 필터 (밀리포아사)를 사용하여 원심분리 (4,500 rpm, 10분)한 다음 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 용리액을 4℃에서 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)으로 투석하였다. 동시에, 투석된 대두 레그헤모글로빈은 농축시키고, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 9: 생산균주 대장균 HMDH_LegH-s를 사용한 대두 레그헤모글로빈의 생산
대두 레그헤모글로빈은 대장균 HMDH_LegH-s (생산균주)를 사용한 미생물 발효를 통해 생산하였다.
50 mL 원뿔형 튜브에 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 10 mL의 LB 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물 및 10 g/L NaCl)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음 회전 진탕 배양기를 사용하여 37℃, 200 rpm으로 밤새 배양하였다. 밤샘 배양 이후에 얻은 1 mL의 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 60 mL의 S 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L KH2PO4, 10 g/L 숙시네이트, 2 g/L 글리신 및 10 mg/L FeCl2·4H2O)가 첨가된 250 mL 삼각 플라스크에 접종한 다음 37℃, 200 rpm으로 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 이후에, 생성된 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 3 L의 S 배지를 포함하는 5 L 발효기에 접종하였다. 발효기의 배양액이 OD600 = 0.5에 도달할 때까지 37℃, 0.5 vvm 통기 및 200 rpm에서 배양하였다. 배양액이 OD600 = 0.5에 도달하면, L-아라비노스 (최종 농도 = 0.2%) 용액을 배양액에 첨가하였다. 발효기의 배양액은 추가 72시간 동안 (37℃, 0.5 vvm 통기, 200 rpm) 더 배양하였다. 발효공정 동안, pH는 pH 8 내지 9로 유지하고, pH 조정은 숙신산 공급을 통하여 조절하였다. pH를 조절하는데 숙신산을 사용하는 것은 숙신산이 헴의 생합성에서 기질로서 사용되는 물질인 장점을 제공할 수 있으며, 이는 궁극적으로 조성물의 고효율 생산에 유리하다. 발효 후, 생성된 세포는 4℃에서 15분 동안 4,500×g의 원심분리를 통해 회수하였다.
발효액을 원심분리하여 얻은 세포 펠렛은 초음파 파쇄로 용해시켰다. 구체적으로, 세포는 50 mL의 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 현탁하였다. 이러한 세포 현탁액의 세포는 다음과 같이 초음파 파쇄로 용해시켰다. 초음파 파쇄는 20초 동안 수행하여 세포를 파괴시키고, 5초 동안 잠시 정지시켰으며, 이를 20분 동안 반복하였다. 획득한 전체 세포 용해물은 다시 원심분리하여 (25,000×g, 10분) 침전물 및 상등액을 분리하였다.
상기 생성된 상등액에 대해 황산암모늄 침전을 수행하여 제조된 대두 레그헤모글로빈을 농축하였다. 보다 정확하게는, 생성된 상등액을 고체 황산암모늄을 사용한 40% 포화도로 조정하고, 2시간 동안 교반하였다. 침전된 물질은 4℃에서 15분 동안 25,000×g에서 원심분리하여 제거하고, 상등액은 고체 황산암모늄으로 70% 포화 상태로 만들었다. 이 용액은 2시간 동안 교반한 다음 4℃에서 30분 동안 25,000×g에서 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 침전된 대두 레그헤모글로빈은 5 mL의 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 재현탁시켰다. 과량의 황산암모늄을 제거하기 위하여, 탈염화 수지로서 세파덱스 G-25 (GE 헬스케어사)를 사용하였다. 컬럼은 세파덱스 G-25를 사용하여 2.6 × 10 cm로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 50 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화하였다. 그런 다음 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하였다. 그런 다음 컬럼은 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 전개시키고, 단백질 피크를 갖는 분획을 수집하였다.
탈염된 분획은 0.2 μm 필터로 여과한 다음 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 하이트랩 Q FF 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스 신속 유동 음이온 교환 레진 (GE 헬스케어사)으로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 5 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 흡착 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화하였다. 다음으로 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하고, 이어서 25 mL (5 컬럼 부피)의 흡착 완충액으로 세척하였다. 대두 레그헤모글로빈은 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)을 사용하여 용출하였다. 대두 레그헤모글로빈의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하기 위하여, 아미콘 울트라-15 3K 원심분리 필터 (밀리포아사)를 사용하여 원심분리 (4,500 rpm, 10분)한 다음 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 용리액을 4℃에서 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)으로 투석하였다. 동시에, 투석된 대두 레그헤모글로빈은 농축시키고, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 10: 별도로 제조된 글로빈 및 헴의
시험관내
커플링을 통한 대두 레그헤모글로빈의 생산
실시예 10-1: 글로빈의 생산
글로빈은 대장균 LegH (생산균주)를 사용한 미생물 발효를 통해 생산하였다.
50 mL 원뿔형 튜브에 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 10 mL의 LB 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물 및 10 g/L NaCl)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음 회전 진탕 배양기를 사용하여 37℃, 200 rpm으로 밤새 배양하였다. 밤샘 배양 이후에 얻은 5 mL의 배양액을 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 500 mL의 LB 배지가 첨가된 2 L 삼각 플라스크에 접종한 다음 37℃, 200 rpm으로 배양액이 OD600 = 0.5에 도달할 때까지 배양하였다. 배양물이 OD600 = 0.5에 도달할 때, L-아라비노스 (최종 농도 = 0.2%) 용액을 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 2 L 삼각 플라스크에 첨가하였다. 2 L 삼각 플라스크의 배양액을 회전 진탕 배양기를 사용하여 25℃, 150 rpm으로 밤새 배양하였다. 발효 후, 생성된 세포는 4℃에서 15분 동안 4,500×g의 원심분리를 통해 회수하였다.
발효액을 원심분리하여 얻은 세포 펠렛은 초음파 파쇄로 용해시켰다. 구체적으로, 세포는 50 mL의 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 재현탁하였다. 이러한 세포 현탁액의 세포는 다음과 같이 초음파 파쇄로 용해시켰다. 초음파 파쇄는 20초 동안 수행하여 세포를 파괴시키고, 5초 동안 잠시 정지시켰으며, 이를 20분 동안 반복하였다. 획득한 전체 세포 용해물은 다시 원심분리하여 (25,000×g, 10분) 침전물 및 상등액을 분리하였다.
상기 생성된 상등액에 대해 황산암모늄 침전을 수행하여 제조된 글로빈을 농축하였다. 보다 정확하게는, 생성된 상등액을 고체 황산암모늄으로 40% 포화도로 조정하고, 2시간 동안 교반하였다. 침전된 물질은 4℃에서 15분 동안 25,000×g에서 원심분리하여 제거하고, 상등액은 고체 황산암모늄으로 70% 포화 상태로 만들었다. 이 용액은 2시간 동안 교반한 다음 4℃에서 30분 동안 25,000×g에서 원하여 침전물을 회수하였다. 침전된 글로빈은 5 mL의 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 재현탁시켰다. 과량의 황산암모늄을 제거하기 위하여, 탈염화 수지로서 세파덱스 G-25 (GE 헬스케어사)를 사용하였다. 컬럼은 세파덱스 G-25를 사용하여 2.6 × 10 cm로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 50 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화하였다. 그런 다음 글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하였다. 그런 다음 컬럼은 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 전개시키고, 단백질 피크를 갖는 분획을 수집하였다.
탈염된 분획은 0.2 μm 필터로 여과한 다음 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 하이트랩 Q FF 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스 신속 유동 음이온 교환 레진 (GE 헬스케어사)으로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 5 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 흡착 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화하였다. 다음으로 글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하고, 이어서 25 mL (5 컬럼 부피)의 흡착 완충액으로 세척하였다. 글로빈은 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)을 사용하여 용출하였다. 글로빈의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하기 위하여, 아미콘 울트라-15 3K 원심분리 필터 (밀리포아사)를 사용하여 원심분리 (4,500 rpm, 10분)한 다음 글로빈을 포함하는 용리액을 4℃에서 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)으로 투석하였다. 동시에, 투석된 글로빈은 농축시키고, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 10-2: 생물학적 공정에 의한 헴의 생산
헴은 대장균 HMDH (생산균주)를 사용한 미생물 발효를 통해 생산하였다.
50 mL 원뿔형 튜브에 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 10 mL의 LB 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물 및 10 g/L NaCl)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음 회전 진탕 배양기를 사용하여 37℃, 200 rpm으로 밤새 배양하였다. 밤샘 배양 이후에 얻은 1 mL의 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 50 mL의 S 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L KH2PO4, 10 g/L 숙시네이트, 2 g/L 글리신 및 10 mg/L FeCl2·4H2O)가 첨가된 250 mL 삼각 플라스크에 접종한 다음 37℃, 200 rpm으로 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 이후에, 생성된 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 5 L의 S 배지를 포함하는 10 L 발효기에 접종하였다. 발효기의 배양액은 72시간 동안 (37℃, 0.5 vvm 통기, 200 rpm) 배양하였다. 발효공정 동안, pH는 pH 8 내지 9로 유지하고, pH 조정은 숙신산 공급을 통해 조절하였다. pH를 조절하는데 숙신산을 사용하는 것은 숙신산이 헴의 생합성에서 기질로서 사용되는 물질인 장점을 제공할 수 있으며, 이는 궁극적으로 헴의 고효율 생산에 유리하다. 발효 이후에, 생성된 세포는 4℃에서 15분 동안 3,000×g의 원심분리를 통해 회수하였다.
회수된 세포는 PBS (포스페이트 완충 식염수)로 현탁한 다음 원심분리하여 2회 세척하였다. 최종 회수된 세포는 약 30분 동안 자연 건조시킨 다음 무게를 측정하였다. 전형적으로, 5 L의 배양액으로부터 40 g 내지 50 g의 세포를 회수하는 것이 가능하였다. 회수된 세포에 차가운 산-아세톤을 첨가하여 헴을 추출하였다. 본원에서 사용된 차가운 산-아세톤은 -20℃에서 998 mL의 아세톤을 2 mL의 염산 (HCl)과 혼합하여 제조하였다. 차가운 산-아세톤의 첨가는 5 L의 배양액으로부터 회수된 세포에 1 L의 차가운 산-아세톤을 첨가하는 방식으로 수행하였다. 산-아세톤을 사용한 헴의 추출은 4℃에서 5일 동안 수행하였다. 5일 동안 헴 추출을 통해 획득된 용액은 셀라이트 충진된 컬럼을 통과시켜 헴을 포함하는 아세톤을 회수하였다. 여기서, 부피가 1 L에서 30 mL로 감소될 때까지 농축을 수행하였다. 이와 같이 얻은 용액에 10배 부피의 메틸렌 염화물을 첨가하고, 철저하게 혼합한 다음 층이 분리될 때까지 정치하였다. 층의 분리 이후에, 하부 층은 회수하고, 회전 증발기를 사용하여 농축하였다. 본원에서는 부피가 30 mL이 될 때까지 농축을 수행하였다. 농축 이후에, 농축물에 포함된 헴 당량을 기준으로 2.1 당량의 양으로 NaOH 수용액을 첨가하고, 철저하게 혼합한 다음 층이 분리될 때까지 정치하였다. 층의 분리 이후에, 상부 층은 회수하고, 사용 시까지 4℃에서 보관하였다. 또는 상부층을 동결건조시키고, 이를 사용할 시에는 물에 용해시킨다.
실시예 10-3: 화학적 합성에 의한 헴의 생산
헴은 철 이온 (Fe2+)을 프로토포르피린 Ⅸ 내에 배위시키는 화학적 합성에 의해 생산하였다. 프로토포르피린 Ⅸ (PPⅨ, 10 g, 17.8 mmol)은 테트라히드로퓨란 (150 mL)에 용해시키고, FeCl2·4H2O (14.4 g, 53.3 mmol)를 천천히 첨가한 다음 85℃에서 4시간 동안 재환류하였다. 반응의 종료 이후에, 유기 용매는 진공 증류를 통해 제거하였다. 다음으로, 반응 혼합물에 NaOH 수용액을 첨가하여 용해시킨 후, 생성된 용액은 셀라이트® 545가 충진된 컬럼을 통해 여과시키고, 얻어진 여과물은 중화하여 유리산 형태의 화학적으로 합성된 헴을 수득하였다 (10.8 g, 99%). 상기에서 얻은 유리산 형태의 헴 (5 g, 8.11 mmol)에 NaOH (630 mg, 15.9 mmol)를 증류수 (15 mL)에 녹인 용액을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하면서 염소화를 시행하였다. 반응의 종료 이후에, 반응 혼합물은 -80℃에서 동결시킨 다음 동결건조하고, 탈수하여 염 형태의 화학적으로 합성된 헴을 수득하였다 (5.25 g, 98%).
실시예 10-4: 별도로 제조된 글로빈 및 생물학적 헴의
시험관내
커플링
실시예 10-1로부터 획득한 글로빈 및 실시예 10-2로부터 획득한 헴의 시험관내 커플링을 수행하였다. 보다 정확하게는, 100 μM 글로빈 용액 10 mL 및 1 mM 헴 용액 (몰비 = 1 : 10) 10 mL을 50 mL 원뿔형 튜브에 첨가한 다음 실온에서 30분 동안 약하게 볼텍스 하여 반응시켰다.
반응 이후에, 헴-글로빈 복합체 용액은 0.2 μm 필터로 여과시키고, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다. 하이트랩 Q FF 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스 신속 유동 음이온 교환 레진 (GE 헬스케어사)으로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 5 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 흡착 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화하였다. 다음으로 헴-글로빈 복합체를 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하고, 이어서 25 mL (5 컬럼 부피)의 흡착 완충액으로 세척하였다. 헴-글로빈 복합체는 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)을 사용하여 용출하였다. 헴-글로빈 복합체의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하기 위하여, 아미콘 울트라-15 3K 원심분리 필터 (밀리포아사)를 사용하여 원심분리 (4,500 rpm, 10분)한 다음 헴-글로빈 복합체를 포함하는 용리액을 4℃에서 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)으로 투석하였다. 동시에, 투석된 헴-글로빈 복합체는 농축시키고, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 10-5: 별도로 제조된 글로빈 및 화학적으로 합성된 헴의
시험관내
커플링
실시예 10-1로부터 획득한 글로빈 및 실시예 10-3으로부터 획득한 헴의 시험관내 커플링을 수행하였다. 보다 정확하게는, 100 μM 글로빈 용액 10 mL 및 1 mM 헴 용액 (몰비 = 1 : 10) 10 mL을 50 mL 원뿔형 튜브에 첨가한 다음 실온에서 30분 동안 약하게 볼텍스 하여 반응시켰다.
반응 이후에, 헴-글로빈 복합체 용액은 0.2 μm 필터로 여과시키고, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다. 하이트랩 Q FF 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스 신속 유동 음이온 교환 레진 (GE 헬스케어사)으로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 5 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 흡착 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화하였다. 다음으로 헴-글로빈 복합체를 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하고, 이어서 25 mL (5 컬럼 부피)의 흡착 완충액으로 세척하였다. 헴-글로빈 복합체는 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)을 사용하여 용출하였다. 헴-글로빈 복합체의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하기 위하여, 아미콘 울트라-15 3K 원심분리 필터 (밀리포아사)를 사용하여 원심분리 (4,500 rpm, 10분)한 다음 헴-글로빈 복합체를 포함하는 용리액을 4℃에서 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)으로 투석하였다. 동시에, 투석된 헴-글로빈 복합체는 농축시키고, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 11: 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 액상 제형의 조성물의 제조
실시예 8 내지 10에 개시된 공정을 통해 획득된 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 용액은 염화나트륨 및 아스코르브산 나트륨 완충액을 사용한 완충액 교환을 수행한 다음, 최종 농도가 1 mg/mL 또는 10 mg/mL이 되도록 조정하였다. 농도 조정된 용액은 0.2 μm 필터를 사용하여 여과시켜 액상 제형의 조성물을 제조하였다. 이와 같이 제조한 액상 제형의 조성물은 동결 상태로 보관하였다.
실시예 12: 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 동결건조 제형의 조성물의 제조
단백질은 수용성 상태에서 비교적 불안정하고, 화학적 및 물리적 분해를 거쳐, 처리 및 보관 동안 생물학적 활성의 손실을 초래하는 것으로 알려져 있다. 동결건조 (라이오필리제이션으로도 알려져 있음)는 단백질의 보존을 위해 개발된 방법이다.
실시예 11에서 제조된 농도 조정된 용액은 동결건조하여 동결건조 제형의 조성물을 제조하였다.
동결건조 공정에 대한 설명은 다음과 같다:
(A) 농도 조정된 용액을 0.2 μm 필터를 사용하여 여과시킨다.
(B) 여과된 용액을 포함하는 병을 스테인리스강 트레이 위에 배치한다.
(C) 트레이를 동결건조기 내에 로딩하고, 하기 동결건조 사이클을 사용하여 용액을 동결건조시킨다:
(C-1) 4℃에서 약 20분 동안 평형화한다.
(C-2) 선반 온도를 -40℃로 맞추고 12시간 동안 유지시킨다.
(C-2) 농축기 온도를 -50℃로 맞춘다.
(C-4) 체임버에 진공을 적용한다.
(C-5) 진공이 1,500 mtorr 값에 도달하면, 선반 온도를 -20℃까지 올리고 16시간 동안 유지시킨다.
(C-6) 선반 온도를 1시간 당 10℃씩 증가시키는 방식으로 20℃까지 올리고, 16시간 동안 유지시킨다.
(C-7) 진공을 제거한다.
(D) 적절한 플립-오프 캡으로 마개를 막고, 바이알을 밀봉시킨다.
동결건조된 제형은 4℃에서 보관하였다.
실시예 13: 대두 레그헤모글로빈의 확인
실시예 8, 실시예 9, 실시예 10-4 및 실시예 10-5로부터 획득한 대두 레그헤모글로빈을 확인하기 위하여, 전기영동 분석 (SDS-PAGE 분석 및 고유한 PAGE 분석), 분광분석 및 형광 분광분석을 수행하였다. 동결건조 조성물의 경우, 분석 전에 증류수를 사용하여 재용해시켰다. 전기영동에서, 글로빈의 크기를 검증하기 위한 SDS-PAGE는 15% 젤을 사용하여 수행하였고, 헴-글로빈 복합체의 이동 변위에 대한 고유한 PAGE는 비-변성 및 비-환원 조건 하에 10% 젤을 사용하여 수행하였다. 분광분석은 마이크로플레이트 판독기 (테칸사, 인피니트 M200 프로)를 사용하여 수행하였으며, 형광 분광분석은 형광 소광화 방법을 사용하여 수행하였다. 분광분석을 위한 흡광도 측정을 간략하게 설명하면, 100 μL의 각 시료는 투명한 96웰 플레이트의 웰 내에 첨가한다. 그런 다음 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 280 nm 내지 500 nm에서 측정하였다. 형광 소광화는 분자 상호작용을 연구하는데 사용되는 기법이고, 헴-글로빈 복합체와 같은 리간드-단백질 결합을 관찰하기에 용이한 방법이다 (Principles of Fluorescence Spectroscopy, 277-330). 여기 파장은 280 nm이고, 방출 파장은 300 nm 및 500 nm 사이에서 측정되었다.
글로빈 및 헴-글로빈 복합체의 Mr은 SDS-PAGE에 의해 대략 13 kDa으로서 추정되었다 (도 4). 한편, 고유한 조건 하에서 고유한 PAGE 분석을 통하여, 전하 대 질량 비율, 물리적 형태 및 단백질의 크기의 차이로 인해 글로빈 및 헴-글로빈 복합체 사이에서 밴드 이동 변위가 관찰되었다 (도 5). 또한, 밴드는 젤 염색 이전에 갈색 밴드로서 검출되었다 (도 5). 분광분석은 헴-글로빈 복합체가 대략 350 nm 내지 400 nm에서 넓은 피크를 갖는 반면, 글로빈의 최대 흡수 파장은 280 nm에서 나타났다 (도 6). 형광 분광분석 결과, 글로빈의 최대 방출 파장은 320 nm이었고, 헴-글로빈 복합체의 모든 시료에서 형광 소광화가 발생하는 것을 보여주었으며, 이는 대두 레그헤모글로빈의 특징이 된다 (도 7).
상기 결과를 근거로 하여, 본 발명자들은 대두 레그헤모글로빈이 성공적으로 제조된 것으로 결론을 내렸다.
실시예 14: 대체육에 대한 풍미증진제로서 대두 레그헤모글로빈의 적용
대체육은 다음과 같이 제조하였다. 식물성 단백질의 건조 혼합물은 호퍼를 통해 압출기 배럴에 첨가하고, 물은 실온에서 별도로 주입하였다. 압출기 배럴은 80℃ 내지 150℃의 온도로 가열된다. 전면 플레이트 상의 압력은 10 바 (bar) 내지 20 바이다. 또한, 이러한 온도 범위 내에서 오일이 주입된다. 냉각 다이 (die)는 제품을 70℃의 출구 온도로 냉각시킨다. 제품은 다음의 재료로부터 트윈 나사 압출기로 제조되었다.
제조된 대체육 1 및 대체육 2는 육류의 외관 및 질감을 갖는다. 한편으로, 100명의 무작위로 선택된 소비자는 2가지 대체육의 맛 (풍미)을 비교하였다. 그 결과로, 대체육 1이 대체육 2보다 맛이 더 좋은 것으로 나타났다 (78명/100명 = 78%).
실시예 15: 철 보충제로서 대두 레그헤모글로빈의 적용
본원 발명에 따라 제조된 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 철 결핍성 빈혈 유발 동물에게 투여하여, 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물의 빈혈 개선 효과를 평가하였다.
구체적으로, 2주의 순화 기간 이후에, 30마리의 9주령 스프라그 달리 랫트 (암컷)를 실험군 당 10마리 랫트의 3가지 실험군으로 나누고, 이들 중 하나의 실험군에는 체중의 10%의 양으로 정상 사료를 1개월 동안 매일 공급하고, 나머지 2가지 실험군에는 체중의 10%의 양으로 철 결핍 사료를 6주 동안 매일 공급하여 철 결핍성 빈혈을 유발시켰다 (실험군 2 및 실험군 3). 6주의 사료 공급 이후에, 실험군 2 및 실험군 3에 속하는 개별 랫트에서 철 결핍성 빈형이 유발된 것을 확인하였다. 다음으로, 빈혈이 유발된 실험군 중 하나는 매일 1회 식염수만이 경구 투여되었고 (실험군 2), 나머지의 빈혈이 유발된 실험군은 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 용액이 매일 1회 경구 투여되었다 (0.1 mg Fe/500 μL 용액, 실험군 3). 투여는 5주 동안 계속되었다. 실험군 2 및 실험군 3에 대한 5주 투여 기간 동안, 실험군 1에는 정상 사료가 계속적으로 공급되었고, 실험군 2 및 실험군 3에는 철 결핍 사료가 공급되었다. 이상 증상의 발생이 투여 기간 동안 모니터링되었으며, 5주의 투여 기간 동안 모든 동물에서 이상 증상은 전혀 없었다. 5주의 투여 이후에, 혈액을 채취하여 빈혈의 완화 여부를 평가하였다. 채혈 분석 결과는 다음과 같다.
이상의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 철 결핍성 빈혈을 완화하는데 효과적인 것으로 결론을 내릴 수 있으며, 따라서 철 보충 공급원으로서 효율적인 물질이다.
당업자라면 전술한 상세한 설명에 개시된 개념 및 구체적인 구현예가 본 발명과 동일한 목적을 수행하기 위한 다른 구현예를 변형하거나 설계하는 근거로서 쉽게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 당업자라면 이러한 동등한 구현예가 첨부된 청구범위에 기재된 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않음도 이해할 것이다.
당업자에게 본 발명에서 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 정신 또는 범주를 벗어나지 않고도 이루어질 수 있음이 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 단 첨부된 청구범위 및 이들의 동등물의 범주 내에 속하면 본 발명의 변형 및 변경을 포괄하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> iNtRON Biotechnology, Inc.
<120> A METHOD FOR PREPARING SOY LEGHEMOGLOBIN USING ESCHERICHIA COLI
<130> 20001.0049WO
<150> 62/959,702
<151> 2020-01-10
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Soy leghmoglobin
<400> 1
Met Gly Ala Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Ser Ser Ser Phe
1 5 10 15
Glu Ala Phe Lys Ala Asn Ile Pro Gln Tyr Ser Val Val Phe Tyr Thr
20 25 30
Ser Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Asp Leu Phe Ser Phe Leu
35 40 45
Ser Asn Gly Val Asp Pro Ser Asn Pro Lys Leu Thr Gly His Ala Glu
50 55 60
Lys Leu Phe Gly Leu Val Arg Asp Ser Ala Gly Gln Leu Lys Ala Asn
65 70 75 80
Gly Thr Val Val Ala Asp Ala Ala Leu Gly Ser Ile His Ala Gln Lys
85 90 95
Ala Ile Thr Asp Pro Gln Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Lys
100 105 110
Thr Ile Lys Glu Ala Val Gly Asp Lys Trp Ser Asp Glu Leu Ser Ser
115 120 125
Ala Trp Glu Val Ala Tyr Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ile Lys Lys Ala
130 135 140
Phe
145
<210> 2
<211> 1224
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rhodobacter sphaeroides ALA synthase
<400> 2
atggactaca atctggcact cgataccgct ctgaaccggc tccataccga gggccggtac 60
cggaccttca tcgacatcga gcggcgcaag ggtgccttcc cgaaagccat gtggcgcaag 120
cccgacggga gcgagaagga aatcaccgtc tggtgcggca acgactatct cggcatgggc 180
cagcatccgg tggtgctggg ggccatgcac gaggcgctgg attcgaccgg cgccgggtcg 240
ggcggcacgc gcaacatctc gggcaccacg ctctatcaca agcgcctcga ggccgagctc 300
gccgacctgc acggcaagga agcggcgctg gtcttctcgt cggcctatat cgccaacgac 360
gcgaccctct cgacgctgcc gcagctgatc ccgggcctcg tcatcgtctc ggacaagttg 420
aaccacgctt cgatgatcga gggcatccgc cgctcgggca ccgagaagca catcttcaag 480
cacaatgacc tcgacgacct gcgccggatc ctgacctcga tcggcaagga ccgtccgatc 540
ctcgtggcct tcgaatccgt ctattcgatg gatggcgact tcggccgcat cgaggagatc 600
tgcgacatcg ccgacgagtt cggcgcgctg aaatacatcg acgaggtcca tgccgtcggc 660
atgtacggcc cccgcggcgg cggcgtggcc gagcgggacg ggctgatgga ccggatcgac 720
atcatcaacg ggacgctggg caaggcctat ggcgtgttcg gcggctatat cgcggcctcg 780
tcaaagatgt gcgacgcggt gcgctcctac gcgccgggct tcatcttctc gacctcgctg 840
ccgcccgtcg tggcggccgg tgcggcggcc tcggtgcgcc acctcaaggg cgatgtggag 900
ctgcgcgaga agcaccagac ccaggcccgc atcctgaaga tgcgcctcaa ggggctcggc 960
ctgccgatca tcgaccacgg ctcgcacatc gtgccggtcc atgtgggcga ccccgtgcac 1020
tgcaagatga tctcggacat gctgctcgag catttcggca tctatgtcca gccgatcaac 1080
ttcccgaccg tgccgcgcgg gaccgagcgg ctgcgcttca ccccgtcgcc cgtgcatgat 1140
tccggcatga tcgatcacct cgtgaaggcc atggacgtgc tctggcagca ctgtgcgctg 1200
aatcgcgccg aggtcgttgc ctga 1224
<210> 3
<211> 2280
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Escherichia coli NADP-dependent malic enzyme
<400> 3
atggatgacc agttaaaaca aagtgcactt gatttccatg aatttccagt tccagggaaa 60
atccaggttt ctccaaccaa gcctctggca acacagcgcg atctggcgct ggcctactca 120
ccaggcgttg ccgcaccttg tcttgaaatc gaaaaagacc cgttaaaagc ctacaaatat 180
accgcccgag gtaacctggt ggcggtgatc tctaacggta cggcggtgct ggggttaggc 240
aacattggcg cgctggcagg caaaccggtg atggaaggca agggcgttct gtttaagaaa 300
ttcgccggga ttgatgtatt tgacattgaa gttgacgaac tcgacccgga caaatttatt 360
gaagttgtcg ccgcgctcga accaaccttc ggcggcatca acctcgaaga cattaaagcg 420
ccagaatgtt tctatattga acagaaactg cgcgagcgga tgaatattcc ggtattccac 480
gacgatcagc acggcacggc aattatcagc actgccgcca tcctcaacgg cttgcgcgtg 540
gtggagaaaa acatctccga cgtgcggatg gtggtttccg gcgcgggtgc cgcagcaatc 600
gcctgtatga acctgctggt agcgctgggt ctgcaaaaac ataacatcgt ggtttgcgat 660
tcaaaaggcg ttatctatca gggccgtgag ccaaacatgg cggaaaccaa agccgcatat 720
gcggtggtgg atgacggcaa acgtaccctc gatgatgtga ttgaaggcgc ggatattttc 780
ctgggctgtt ccggcccgaa agtgctgacc caggaaatgg tgaagaaaat ggctcgtgcg 840
ccaatgatcc tggcgctggc gaacccggaa ccggaaattc tgccgccgct ggcgaaagaa 900
gtgcgtccgg atgccatcat ttgcaccggt cgttctgact atccgaacca ggtgaacaac 960
gtcctgtgct tcccgttcat cttccgtggc gcgctggacg ttggcgcaac cgccatcaac 1020
gaagagatga aactggcggc ggtacgtgcg attgcagaac tcgcccatgc ggaacagagc 1080
gaagtggtgg cttcagcgta tggcgatcag gatctgagct ttggtccgga atacatcatt 1140
ccaaaaccgt ttgatccgcg cttgatcgtt aagatcgctc ctgcggtcgc taaagccgcg 1200
atggagtcgg gcgtggcgac tcgtccgatt gctgatttcg acgtctacat cgacaagctg 1260
actgagttcg tttacaaaac caacctgttt atgaagccga ttttctccca ggctcgcaaa 1320
gcgccgaagc gcgttgttct gccggaaggg gaagaggcgc gcgttctgca tgccactcag 1380
gaactggtaa cgctgggact ggcgaaaccg atccttatcg gtcgtccgaa cgtgatcgaa 1440
atgcgcattc agaaactggg cttgcagatc aaagcgggcg ttgattttga gatcgtcaat 1500
aacgaatccg atccgcgctt taaagagtac tggaccgaat acttccagat catgaagcgt 1560
cgcggcgtca ctcaggaaca ggcgcagcgg gcgctgatca gtaacccgac agtgatcggc 1620
gcgatcatgg ttcagcgtgg ggaagccgat gcaatgattt gcggtacggt gggtgattat 1680
catgaacatt ttagcgtggt gaaaaatgtc tttggttatc gcgatggcgt tcacaccgca 1740
ggtgccatga acgcgctgct gctgccgagt ggtaacacct ttattgccga tacatatgtt 1800
aatgatgaac cggatgcaga agagctggcg gagatcacct tgatggcggc agaaactgtc 1860
cgtcgttttg gtattgagcc gcgcgttgct ttgttgtcgc actccaactt tggttcttct 1920
gactgcccgt cgtcgagcaa aatgcgtcag gcgctggaac tggtcaggga acgtgcacca 1980
gaactgatga ttgatggtga aatgcacggc gatgcagcgc tggtggaagc gattcgcaac 2040
gaccgtatgc cggacagctc tttgaaaggt tccgccaata ttctggtgat gccgaacatg 2100
gaagctgccc gcattagtta caacttactg cgtgtttcca gctcggaagg tgtgactgtc 2160
ggcccggtgc tgatgggtgt ggcgaaaccg gttcacgtgt taacgccgat cgcatcggtg 2220
cgtcgtatcg tcaacatggt ggcgctggcc gtggtagaag cgcaaaccca accgctgtaa 2280
<210> 4
<211> 1287
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Escherichia coli dicarboxylic acid transporter
<400> 4
atgaaaacct ctctgtttaa aagcctttac tttcaggtcc tgacagcgat agccattggt 60
attctccttg gccatttcta tcctgaaata ggcgagcaaa tgaaaccgct tggcgacggc 120
ttcgttaagc tcattaagat gatcatcgct cctgtcatct tttgtaccgt cgtaacgggc 180
attgcgggca tggaaagcat gaaggcggtc ggtcgtaccg gcgcagtcgc actgctttac 240
tttgaaattg tcagtaccat cgcgctgatt attggtctta tcatcgttaa cgtcgtgcag 300
cctggtgccg gaatgaacgt cgatccggca acgcttgatg cgaaagcggt agcggtttac 360
gccgatcagg cgaaagacca gggcattgtc gccttcatta tggatgtcat cccggcgagc 420
gtcattggcg catttgccag cggtaacatt ctgcaggtgc tgctgtttgc cgtactgttt 480
ggttttgcgc tccaccgtct gggcagcaaa ggccaactga tttttaacgt catcgaaagt 540
ttctcgcagg tcatcttcgg catcatcaat atgatcatgc gtctggcacc tattggtgcg 600
ttcggggcaa tggcgtttac catcggtaaa tacggcgtcg gcacactggt gcaactgggg 660
cagctgatta tctgtttcta cattacctgt atcctgtttg tggtgctggt attgggttca 720
atcgctaaag cgactggttt cagtatcttc aaatttatcc gctacatccg tgaagaactg 780
ctgattgtac tggggacttc atcttccgag tcggcgctgc cgcgtatgct cgacaagatg 840
gagaaactcg gctgccgtaa atcggtggtg gggctggtca tcccgacagg ctactcgttt 900
aaccttgatg gcacatcgat atacctgaca atggcggcgg tgtttatcgc ccaggccact 960
aacagtcaga tggatatcgt ccaccaaatc acgctgttaa tcgtgttgct gctttcttct 1020
aaaggggcgg caggggtaac gggtagtggc tttatcgtgc tggcggcgac gctctctgcg 1080
gtgggccatt tgccggtagc gggtctggcg ctgatcctcg gtatcgaccg ctttatgtca 1140
gaagctcgtg cgctgactaa cctggtcggt aacggcgtag cgaccattgt cgttgctaag 1200
tgggtgaaag aactggacca caaaaaactg gacgatgtgc tgaataatcg tgcgccggat 1260
ggcaaaacgc acgaattatc ctcttaa 1287
<210> 5
<211> 963
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Escherichia coli ferrochelatase
<400> 5
atgcgtcaga ctaaaaccgg tatcctgctg gcaaacctgg gtacgcccga tgcccccaca 60
cctgaagcgg taaaacgcta tctgaaacaa tttttaagcg acagacgcgt ggttgatacc 120
tcacggttgt tatggtggcc attgctgcgc ggcgtgattt tgccgctgcg ctcgccgcgt 180
gtggcgaagc tgtatgcctc tgtctggatg gaaggtggct cgccgctgat ggtttacagc 240
cgccagcaac agcaggcgct ggcacaacgt ttaccggaga tgcccgtagc gctgggaatg 300
agctacggct cgccatcact ggaaagcgcc gtagatgaac tcctggcaga gcatgtagat 360
catattgtgg tgctgccgct ttatccgcaa ttctcctgtt ctacggtcgg tgcggtatgg 420
gatgaactgg cacgcattct ggcgcgcaaa cgtagcattc cggggatatc gtttatacgt 480
gattacgccg ataaccacga ttacattaat gcactggcga acagcgtacg cgcttctttt 540
gccaaacatg gcgaaccgga tctgctactg ctctcttatc atggcattcc ccagcgttat 600
gcagatgaag gcgatgatta cccgcaacgt tgccgcacaa cgactcgtga actggcttcc 660
gcattgggga tggcaccgga aaaagtgatg atgacctttc agtcgcgctt tggtcgggaa 720
ccctggctga tgccttatac cgacgaaacg ctgaaaatgc tcggagaaaa aggcgtaggt 780
catattcagg tgatgtgccc gggctttgct gcggattgtc tggagacgct ggaagagatt 840
gccgagcaaa accgtgaggt cttcctcggt gccggcggga aaaaatatga atatattccg 900
gcgcttaatg ccacgccgga acatatcgaa atgatggcta atcttgttgc cgcgtatcgc 960
taa 963
<210> 6
<211> 9912
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid pLEX_HMDH
<400> 6
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt cgctgccgcg ccggtagtac gtaagaggtt ccaactttca 240
ccataatgaa ataagatcac taccgggcgt attttttgag ttatcgagat tttcaggagc 300
taaggaagct aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg 360
gcatcgtaaa gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac 420
cgttcagctg gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta 480
tccggccttt attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct catccggaat tccgtatggc 540
aatgaaagac ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca 600
tgagcaaact gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt 660
tctacacata tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa 720
agggtttatt gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt 780
tgatttaaac gtggccaata tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata 840
ttatacgcaa ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg 900
tgatggcttc catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca 960
gggcggggcg taaacgcgtg gatccccctc aagtcaaaag cctccggtcg gaggcttttg 1020
actttctgct atggaggtca ggtatgattt ttatgacaac ttgacggcta catcattcac 1080
tttttcttca caaccggcac ggaactcgct cgggctggcc ccgctgtcag accaagttta 1140
ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 1200
gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 1260
gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 1320
ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 1380
gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 1440
ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 1500
cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 1560
cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 1620
ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 1680
tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 1740
cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 1800
ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 1860
aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 1920
ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 1980
tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 2040
gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 2100
gccgattcat taatgcagaa ttgatctctc acctaccaaa caatgccccc ctgcaaaaaa 2160
taaattcata taaaaaacat acagataacc atctgcggtg ataaattatc tctggcggtg 2220
ttgacataaa taccactggc ggtgatactg agcacatcag caggacgcac tgaccaccat 2280
gaaggtgacg ctcttaaaaa ttaagccctg aagaagggct ttatttgcat acattcaatc 2340
aattgttatc taaggaaata cttacatatg gactacaatc tggcactcga taccgctctg 2400
aaccggctcc ataccgaggg ccggtaccgg accttcatcg acatcgagcg gcgcaagggt 2460
gccttcccga aagccatgtg gcgcaagccc gacgggagcg agaaggaaat caccgtctgg 2520
tgcggcaacg actatctcgg catgggccag catccggtgg tgctgggggc catgcacgag 2580
gcgctggatt cgaccggcgc cgggtcgggc ggcacgcgca acatctcggg caccacgctc 2640
tatcacaagc gcctcgaggc cgagctcgcc gacctgcacg gcaaggaagc ggcgctggtc 2700
ttctcgtcgg cctatatcgc caacgacgcg accctctcga cgctgccgca gctgatcccg 2760
ggcctcgtca tcgtctcgga caagttgaac cacgcttcga tgatcgaggg catccgccgc 2820
tcgggcaccg agaagcacat cttcaagcac aatgacctcg acgacctgcg ccggatcctg 2880
acctcgatcg gcaaggaccg tccgatcctc gtggccttcg aatccgtcta ttcgatggat 2940
ggcgacttcg gccgcatcga ggagatctgc gacatcgccg acgagttcgg cgcgctgaaa 3000
tacatcgacg aggtccatgc cgtcggcatg tacggccccc gcggcggcgg cgtggccgag 3060
cgggacgggc tgatggaccg gatcgacatc atcaacggga cgctgggcaa ggcctatggc 3120
gtgttcggcg gctatatcgc ggcctcgtca aagatgtgcg acgcggtgcg ctcctacgcg 3180
ccgggcttca tcttctcgac ctcgctgccg cccgtcgtgg cggccggtgc ggcggcctcg 3240
gtgcgccacc tcaagggcga tgtggagctg cgcgagaagc accagaccca ggcccgcatc 3300
ctgaagatgc gcctcaaggg gctcggcctg ccgatcatcg accacggctc gcacatcgtg 3360
ccggtccatg tgggcgaccc cgtgcactgc aagatgatct cggacatgct gctcgagcat 3420
ttcggcatct atgtccagcc gatcaacttc ccgaccgtgc cgcgcgggac cgagcggctg 3480
cgcttcaccc cgtcgcccgt gcatgattcc ggcatgatcg atcacctcgt gaaggccatg 3540
gacgtgctct ggcagcactg tgcgctgaat cgcgccgagg tcgttgcctg acagcttctg 3600
cggatgcaaa ggcccctgcc ctgtgctact tctttcggga cagggcaccc ctgagtcgga 3660
agcaaccggc cggggtaaat cggggcagga cgggcacacg catgatctgg cggaggacac 3720
aaccttcgac ggccgaagtc gataaaccca aagggttcga cgatttcgag ttgcggttgg 3780
gcgacctgat gcgcggtgag cgggcgacgc tcggcaagtc gctgctcgat gtccagcgcg 3840
agctgaagat caaggccacc tatatcgccg ccatcgagaa tgccgacgtg tcggccttcg 3900
agacgcaggg cttcgtggcg ggatatgtgc gctcctatgc gcgctatctc ggcatggacc 3960
cggacgaggc cttcgcgcgc ttctgccacg aggcgaactt caccacgatg cacggcatgg 4020
ccgtttcggt gaccggcgcg cgccgcgata ccggtccgcg gtcccgaccg cagggcgagg 4080
ggcgcgatcc gctggcggat ccgtcgacct gcagtaatcg tacagggtag tacaaataaa 4140
aaaggcacgt cagatgacgt gccttttttc ttgtgagcag taagcttact agtcggtgat 4200
aaattatctc tggcggtgtt gacataaata ccactggcgg tgatactgag cacatcagca 4260
ggacgcactg accaccatga aggtgacgct cttaaaaatt aagccctgaa gaagggcttt 4320
atttgcatac attcaatcaa ttgttatcta aggaaatact tacatatgga tgaccagtta 4380
aaacaaagtg cacttgattt ccatgaattt ccagttccag ggaaaatcca ggtttctcca 4440
accaagcctc tggcaacaca gcgcgatctg gcgctggcct actcaccagg cgttgccgca 4500
ccttgtcttg aaatcgaaaa agacccgtta aaagcctaca aatataccgc ccgaggtaac 4560
ctggtggcgg tgatctctaa cggtacggcg gtgctggggt taggcaacat tggcgcgctg 4620
gcaggcaaac cggtgatgga aggcaagggc gttctgttta agaaattcgc cgggattgat 4680
gtatttgaca ttgaagttga cgaactcgac ccggacaaat ttattgaagt tgtcgccgcg 4740
ctcgaaccaa ccttcggcgg catcaacctc gaagacatta aagcgccaga atgtttctat 4800
attgaacaga aactgcgcga gcggatgaat attccggtat tccacgacga tcagcacggc 4860
acggcaatta tcagcactgc cgccatcctc aacggcttgc gcgtggtgga gaaaaacatc 4920
tccgacgtgc ggatggtggt ttccggcgcg ggtgccgcag caatcgcctg tatgaacctg 4980
ctggtagcgc tgggtctgca aaaacataac atcgtggttt gcgattcaaa aggcgttatc 5040
tatcagggcc gtgagccaaa catggcggaa accaaagccg catatgcggt ggtggatgac 5100
ggcaaacgta ccctcgatga tgtgattgaa ggcgcggata ttttcctggg ctgttccggc 5160
ccgaaagtgc tgacccagga aatggtgaag aaaatggctc gtgcgccaat gatcctggcg 5220
ctggcgaacc cggaaccgga aattctgccg ccgctggcga aagaagtgcg tccggatgcc 5280
atcatttgca ccggtcgttc tgactatccg aaccaggtga acaacgtcct gtgcttcccg 5340
ttcatcttcc gtggcgcgct ggacgttggc gcaaccgcca tcaacgaaga gatgaaactg 5400
gcggcggtac gtgcgattgc agaactcgcc catgcggaac agagcgaagt ggtggcttca 5460
gcgtatggcg atcaggatct gagctttggt ccggaataca tcattccaaa accgtttgat 5520
ccgcgcttga tcgttaagat cgctcctgcg gtcgctaaag ccgcgatgga gtcgggcgtg 5580
gcgactcgtc cgattgctga tttcgacgtc tacatcgaca agctgactga gttcgtttac 5640
aaaaccaacc tgtttatgaa gccgattttc tcccaggctc gcaaagcgcc gaagcgcgtt 5700
gttctgccgg aaggggaaga ggcgcgcgtt ctgcatgcca ctcaggaact ggtaacgctg 5760
ggactggcga aaccgatcct tatcggtcgt ccgaacgtga tcgaaatgcg cattcagaaa 5820
ctgggcttgc agatcaaagc gggcgttgat tttgagatcg tcaataacga atccgatccg 5880
cgctttaaag agtactggac cgaatacttc cagatcatga agcgtcgcgg cgtcactcag 5940
gaacaggcgc agcgggcgct gatcagtaac ccgacagtga tcggcgcgat catggttcag 6000
cgtggggaag ccgatgcaat gatttgcggt acggtgggtg attatcatga acattttagc 6060
gtggtgaaaa atgtctttgg ttatcgcgat ggcgttcaca ccgcaggtgc catgaacgcg 6120
ctgctgctgc cgagtggtaa cacctttatt gccgatacat atgttaatga tgaaccggat 6180
gcagaagagc tggcggagat caccttgatg gcggcagaaa ctgtccgtcg ttttggtatt 6240
gagccgcgcg ttgctttgtt gtcgcactcc aactttggtt cttctgactg cccgtcgtcg 6300
agcaaaatgc gtcaggcgct ggaactggtc agggaacgtg caccagaact gatgattgat 6360
ggtgaaatgc acggcgatgc agcgctggtg gaagcgattc gcaacgaccg tatgccggac 6420
agctctttga aaggttccgc caatattctg gtgatgccga acatggaagc tgcccgcatt 6480
agttacaact tactgcgtgt ttccagctcg gaaggtgtga ctgtcggccc ggtgctgatg 6540
ggtgtggcga aaccggttca cgtgttaacg ccgatcgcat cggtgcgtcg tatcgtcaac 6600
atggtggcgc tggccgtggt agaagcgcaa acccaaccgc tgtaagtcga cctgcagtaa 6660
tcgtacaggg tagtacaaat aaaaaaggca cgtcagatga cgtgcctttt ttcttgtgag 6720
cagtaagctt gaattccggt gataaattat ctctggcggt gttgacataa ataccactgg 6780
cggtgatact gagcacatca gcaggacgca ctgaccacca tgaaggtgac gctcttaaaa 6840
attaagccct gaagaagggc tttatttgca tacattcaat caattgttat ctaaggaaat 6900
acttacatat gaaaacctct ctgtttaaaa gcctttactt tcaggtcctg acagcgatag 6960
ccattggtat tctccttggc catttctatc ctgaaatagg cgagcaaatg aaaccgcttg 7020
gcgacggctt cgttaagctc attaagatga tcatcgctcc tgtcatcttt tgtaccgtcg 7080
taacgggcat tgcgggcatg gaaagcatga aggcggtcgg tcgtaccggc gcagtcgcac 7140
tgctttactt tgaaattgtc agtaccatcg cgctgattat tggtcttatc atcgttaacg 7200
tcgtgcagcc tggtgccgga atgaacgtcg atccggcaac gcttgatgcg aaagcggtag 7260
cggtttacgc cgatcaggcg aaagaccagg gcattgtcgc cttcattatg gatgtcatcc 7320
cggcgagcgt cattggcgca tttgccagcg gtaacattct gcaggtgctg ctgtttgccg 7380
tactgtttgg ttttgcgctc caccgtctgg gcagcaaagg ccaactgatt tttaacgtca 7440
tcgaaagttt ctcgcaggtc atcttcggca tcatcaatat gatcatgcgt ctggcaccta 7500
ttggtgcgtt cggggcaatg gcgtttacca tcggtaaata cggcgtcggc acactggtgc 7560
aactggggca gctgattatc tgtttctaca ttacctgtat cctgtttgtg gtgctggtat 7620
tgggttcaat cgctaaagcg actggtttca gtatcttcaa atttatccgc tacatccgtg 7680
aagaactgct gattgtactg gggacttcat cttccgagtc ggcgctgccg cgtatgctcg 7740
acaagatgga gaaactcggc tgccgtaaat cggtggtggg gctggtcatc ccgacaggct 7800
actcgtttaa ccttgatggc acatcgatat acctgacaat ggcggcggtg tttatcgccc 7860
aggccactaa cagtcagatg gatatcgtcc accaaatcac gctgttaatc gtgttgctgc 7920
tttcttctaa aggggcggca ggggtaacgg gtagtggctt tatcgtgctg gcggcgacgc 7980
tctctgcggt gggccatttg ccggtagcgg gtctggcgct gatcctcggt atcgaccgct 8040
ttatgtcaga agctcgtgcg ctgactaacc tggtcggtaa cggcgtagcg accattgtcg 8100
ttgctaagtg ggtgaaagaa ctggaccaca aaaaactgga cgatgtgctg aataatcgtg 8160
cgccggatgg caaaacgcac gaattatcct cttaagtcga cctgcagtaa tcgtacaggg 8220
tagtacaaat aaaaaaggca cgtcagatga cgtgcctttt ttcttgtgag cagtaagctt 8280
gcggccgccg gtgataaatt atctctggcg gtgttgacat aaataccact ggcggtgata 8340
ctgagcacat cagcaggacg cactgaccac catgaaggtg acgctcttaa aaattaagcc 8400
ctgaagaagg gctttatttg catacattca atcaattgtt atctaaggaa atacttacat 8460
atgcgtcaga ctaaaaccgg tatcctgctg gcaaacctgg gtacgcccga tgcccccaca 8520
cctgaagcgg taaaacgcta tctgaaacaa tttttaagcg acagacgcgt ggttgatacc 8580
tcacggttgt tatggtggcc attgctgcgc ggcgtgattt tgccgctgcg ctcgccgcgt 8640
gtggcgaagc tgtatgcctc tgtctggatg gaaggtggct cgccgctgat ggtttacagc 8700
cgccagcaac agcaggcgct ggcacaacgt ttaccggaga tgcccgtagc gctgggaatg 8760
agctacggct cgccatcact ggaaagcgcc gtagatgaac tcctggcaga gcatgtagat 8820
catattgtgg tgctgccgct ttatccgcaa ttctcctgtt ctacggtcgg tgcggtatgg 8880
gatgaactgg cacgcattct ggcgcgcaaa cgtagcattc cggggatatc gtttatacgt 8940
gattacgccg ataaccacga ttacattaat gcactggcga acagcgtacg cgcttctttt 9000
gccaaacatg gcgaaccgga tctgctactg ctctcttatc atggcattcc ccagcgttat 9060
gcagatgaag gcgatgatta cccgcaacgt tgccgcacaa cgactcgtga actggcttcc 9120
gcattgggga tggcaccgga aaaagtgatg atgacctttc agtcgcgctt tggtcgggaa 9180
ccctggctga tgccttatac cgacgaaacg ctgaaaatgc tcggagaaaa aggcgtaggt 9240
catattcagg tgatgtgccc gggctttgct gcggattgtc tggagacgct ggaagagatt 9300
gccgagcaaa accgtgaggt cttcctcggt gccggcggga aaaaatatga atatattccg 9360
gcgcttaatg ccacgccgga acatatcgaa atgatggcta atcttgttgc cgcgtatcgc 9420
taaactagtg tcgacctgca gtaatcgtac agggtagtac aaataaaaaa ggcacgtcag 9480
atgacgtgcc ttttttcttg tgagcagtaa gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 9540
gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 9600
ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 9660
tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 9720
accgcatata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc 9780
ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc 9840
ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc 9900
accgaaacgc gc 9912
<210> 7
<211> 438
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glycine max leghemoglobin LGB2
<400> 7
atgggcgcgt ttacagagaa acaagaagcc ttggtgagca gttcgttcga ggctttcaag 60
gccaacatac ctcaatattc tgtagtattt tatacctcta tattggaaaa agctccagca 120
gcaaaagact tgttttcatt tttaagcaac ggggttgacc ccagcaaccc taaacttacc 180
ggccatgctg aaaaattgtt tggccttgtc cgcgactcag ctggccaact gaaagccaac 240
ggcacggtag ttgcagacgc cgcccttggt tcgattcatg cccaaaaggc gattacagat 300
cctcaattcg tcgtcgtaaa ggaggcgctg cttaaaacga taaaggaggc ggtaggtgat 360
aaatggagtg acgagttgtc cagcgcatgg gaagtagctt atgatgagtt ggcagcggcc 420
atcaagaagg cgttctaa 438
<210> 8
<211> 4418
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid pBAD_LegH
<400> 8
aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60
tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120
aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180
attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240
atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg 300
ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tccatgggcg cgtttacaga 360
gaaacaagaa gccttggtga gcagttcgtt cgaggctttc aaggccaaca tacctcaata 420
ttctgtagta ttttatacct ctatattgga aaaagctcca gcagcaaaag acttgttttc 480
atttttaagc aacggggttg accccagcaa ccctaaactt accggccatg ctgaaaaatt 540
gtttggcctt gtccgcgact cagctggcca actgaaagcc aacggcacgg tagttgcaga 600
cgccgccctt ggttcgattc atgcccaaaa ggcgattaca gatcctcaat tcgtcgtcgt 660
aaaggaggcg ctgcttaaaa cgataaagga ggcggtaggt gataaatgga gtgacgagtt 720
gtccagcgca tgggaagtag cttatgatga gttggcagcg gccatcaaga aggcgttcta 780
agcggccgcg tttaaacggt ctccagcttg gctgttttgg cggatgagag aagattttca 840
gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat ttgcctggcg 900
gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg 960
ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa 1020
cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct 1080
ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga 1140
gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc 1200
ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actcttttgt ttatttttct aaatacattc 1260
aaatatgtat ccgctcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 1320
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttaggc 1380
gtcgcttggt cggtcatttc gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc 1440
gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt 1500
cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat 1560
agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca 1620
ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gtgtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca 1680
tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca 1740
gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt 1800
tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat 1860
cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg 1920
gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg 1980
cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat 2040
tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc 2100
ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tcagttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc 2160
tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atactcttcc 2220
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgaccaaa atcccttaac 2280
gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 2340
atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 2400
tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 2460
gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 2520
actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 2580
gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 2640
agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 2700
ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 2760
aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 2820
cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 2880
gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 2940
cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 3000
cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 3060
gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt 3120
attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa 3180
tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt atacactccg ctatcgctac gtgactgggt 3240
catggctgcg ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct 3300
cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt 3360
ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgaggca gcagatcaat tcgcgcgcga aggcgaagcg 3420
gcatgcataa tgtgcctgtc aaatggacga agcagggatt ctgcaaaccc tatgctactc 3480
cgtcaagccg tcaattgtct gattcgttac caattatgac aacttgacgg ctacatcatt 3540
cactttttct tcacaaccgg cacggaactc gctcgggctg gccccggtgc attttttaaa 3600
tacccgcgag aaatagagtt gatcgtcaaa accaacattg cgaccgacgg tggcgatagg 3660
catccgggtg gtgctcaaaa gcagcttcgc ctggctgata cgttggtcct cgcgccagct 3720
taagacgcta atccctaact gctggcggaa aagatgtgac agacgcgacg gcgacaagca 3780
aacatgctgt gcgacgctgg cgatatcaaa attgctgtct gccaggtgat cgctgatgta 3840
ctgacaagcc tcgcgtaccc gattatccat cggtggatgg agcgactcgt taatcgcttc 3900
catgcgccgc agtaacaatt gctcaagcag atttatcgcc agcagctccg aatagcgccc 3960
ttccccttgc ccggcgttaa tgatttgccc aaacaggtcg ctgaaatgcg gctggtgcgc 4020
ttcatccggg cgaaagaacc ccgtattggc aaatattgac ggccagttaa gccattcatg 4080
ccagtaggcg cgcggacgaa agtaaaccca ctggtgatac cattcgcgag cctccggatg 4140
acgaccgtag tgatgaatct ctcctggcgg gaacagcaaa atatcacccg gtcggcaaac 4200
aaattctcgt ccctgatttt tcaccacccc ctgaccgcga atggtgagat tgagaatata 4260
acctttcatt cccagcggtc ggtcgataaa aaaatcgaga taaccgttgg cctcaatcgg 4320
cgttaaaccc gccaccagat gggcattaaa cgagtatccc ggcagcaggg gatcattttg 4380
cgcttcagcc atacttttca tactcccgcc attcagag 4418
<210> 9
<211> 10758
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid pLEX_LHMDH
<400> 9
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt cgctgccgcg ccggtagtac gtaagaggtt ccaactttca 240
ccataatgaa ataagatcac taccgggcgt attttttgag ttatcgagat tttcaggagc 300
taaggaagct aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg 360
gcatcgtaaa gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac 420
cgttcagctg gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta 480
tccggccttt attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct catccggaat tccgtatggc 540
aatgaaagac ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca 600
tgagcaaact gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt 660
tctacacata tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa 720
agggtttatt gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt 780
tgatttaaac gtggccaata tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata 840
ttatacgcaa ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg 900
tgatggcttc catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca 960
gggcggggcg taaacgcgtg gatccccctc aagtcaaaag cctccggtcg gaggcttttg 1020
actttctgct atggaggtca ggtatgattt ttatgacaac ttgacggcta catcattcac 1080
tttttcttca caaccggcac ggaactcgct cgggctggcc ccgctgtcag accaagttta 1140
ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 1200
gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 1260
gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 1320
ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 1380
gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 1440
ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 1500
cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 1560
cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 1620
ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 1680
tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 1740
cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 1800
ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 1860
aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 1920
ttgctggcct tttgctcaca tgttttatcc ataagattag cggatcctac ctgacgcttt 1980
ttatcgcaac tctctactgt ttctccatac ccgttttttt gggctagaaa taattttgtt 2040
taactttaag aaggagatat acatccatgg gcgcgtttac agagaaacaa gaagccttgg 2100
tgagcagttc gttcgaggct ttcaaggcca acatacctca atattctgta gtattttata 2160
cctctatatt ggaaaaagct ccagcagcaa aagacttgtt ttcattttta agcaacgggg 2220
ttgaccccag caaccctaaa cttaccggcc atgctgaaaa attgtttggc cttgtccgcg 2280
actcagctgg ccaactgaaa gccaacggca cggtagttgc agacgccgcc cttggttcga 2340
ttcatgccca aaaggcgatt acagatcctc aattcgtcgt cgtaaaggag gcgctgctta 2400
aaacgataaa ggaggcggta ggtgataaat ggagtgacga gttgtccagc gcatgggaag 2460
tagcttatga tgagttggca gcggccatca agaaggcgtt ctaagcggcc gcgtttaaac 2520
ggtctccagc ttggctgttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat acagattaaa 2580
tcagaacgca gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg gcggcagtag cgcggtggtc 2640
ccacctgacc ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta gcgccgatgg tagtgtgggg 2700
tctccccatg cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa 2760
agactgggcc tttcgtttta tctacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 2820
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 2880
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 2940
gcgttggccg attcattaat gcagaattga tctctcacct accaaacaat gcccccctgc 3000
aaaaaataaa ttcatataaa aaacatacag ataaccatct gcggtgataa attatctctg 3060
gcggtgttga cataaatacc actggcggtg atactgagca catcagcagg acgcactgac 3120
caccatgaag gtgacgctct taaaaattaa gccctgaaga agggctttat ttgcatacat 3180
tcaatcaatt gttatctaag gaaatactta catatggact acaatctggc actcgatacc 3240
gctctgaacc ggctccatac cgagggccgg taccggacct tcatcgacat cgagcggcgc 3300
aagggtgcct tcccgaaagc catgtggcgc aagcccgacg ggagcgagaa ggaaatcacc 3360
gtctggtgcg gcaacgacta tctcggcatg ggccagcatc cggtggtgct gggggccatg 3420
cacgaggcgc tggattcgac cggcgccggg tcgggcggca cgcgcaacat ctcgggcacc 3480
acgctctatc acaagcgcct cgaggccgag ctcgccgacc tgcacggcaa ggaagcggcg 3540
ctggtcttct cgtcggccta tatcgccaac gacgcgaccc tctcgacgct gccgcagctg 3600
atcccgggcc tcgtcatcgt ctcggacaag ttgaaccacg cttcgatgat cgagggcatc 3660
cgccgctcgg gcaccgagaa gcacatcttc aagcacaatg acctcgacga cctgcgccgg 3720
atcctgacct cgatcggcaa ggaccgtccg atcctcgtgg ccttcgaatc cgtctattcg 3780
atggatggcg acttcggccg catcgaggag atctgcgaca tcgccgacga gttcggcgcg 3840
ctgaaataca tcgacgaggt ccatgccgtc ggcatgtacg gcccccgcgg cggcggcgtg 3900
gccgagcggg acgggctgat ggaccggatc gacatcatca acgggacgct gggcaaggcc 3960
tatggcgtgt tcggcggcta tatcgcggcc tcgtcaaaga tgtgcgacgc ggtgcgctcc 4020
tacgcgccgg gcttcatctt ctcgacctcg ctgccgcccg tcgtggcggc cggtgcggcg 4080
gcctcggtgc gccacctcaa gggcgatgtg gagctgcgcg agaagcacca gacccaggcc 4140
cgcatcctga agatgcgcct caaggggctc ggcctgccga tcatcgacca cggctcgcac 4200
atcgtgccgg tccatgtggg cgaccccgtg cactgcaaga tgatctcgga catgctgctc 4260
gagcatttcg gcatctatgt ccagccgatc aacttcccga ccgtgccgcg cgggaccgag 4320
cggctgcgct tcaccccgtc gcccgtgcat gattccggca tgatcgatca cctcgtgaag 4380
gccatggacg tgctctggca gcactgtgcg ctgaatcgcg ccgaggtcgt tgcctgacag 4440
cttctgcgga tgcaaaggcc cctgccctgt gctacttctt tcgggacagg gcacccctga 4500
gtcggaagca accggccggg gtaaatcggg gcaggacggg cacacgcatg atctggcgga 4560
ggacacaacc ttcgacggcc gaagtcgata aacccaaagg gttcgacgat ttcgagttgc 4620
ggttgggcga cctgatgcgc ggtgagcggg cgacgctcgg caagtcgctg ctcgatgtcc 4680
agcgcgagct gaagatcaag gccacctata tcgccgccat cgagaatgcc gacgtgtcgg 4740
ccttcgagac gcagggcttc gtggcgggat atgtgcgctc ctatgcgcgc tatctcggca 4800
tggacccgga cgaggccttc gcgcgcttct gccacgaggc gaacttcacc acgatgcacg 4860
gcatggccgt ttcggtgacc ggcgcgcgcc gcgataccgg tccgcggtcc cgaccgcagg 4920
gcgaggggcg cgatccgctg gcggatccgt cgacctgcag taatcgtaca gggtagtaca 4980
aataaaaaag gcacgtcaga tgacgtgcct tttttcttgt gagcagtaag cttactagtc 5040
ggtgataaat tatctctggc ggtgttgaca taaataccac tggcggtgat actgagcaca 5100
tcagcaggac gcactgacca ccatgaaggt gacgctctta aaaattaagc cctgaagaag 5160
ggctttattt gcatacattc aatcaattgt tatctaagga aatacttaca tatggatgac 5220
cagttaaaac aaagtgcact tgatttccat gaatttccag ttccagggaa aatccaggtt 5280
tctccaacca agcctctggc aacacagcgc gatctggcgc tggcctactc accaggcgtt 5340
gccgcacctt gtcttgaaat cgaaaaagac ccgttaaaag cctacaaata taccgcccga 5400
ggtaacctgg tggcggtgat ctctaacggt acggcggtgc tggggttagg caacattggc 5460
gcgctggcag gcaaaccggt gatggaaggc aagggcgttc tgtttaagaa attcgccggg 5520
attgatgtat ttgacattga agttgacgaa ctcgacccgg acaaatttat tgaagttgtc 5580
gccgcgctcg aaccaacctt cggcggcatc aacctcgaag acattaaagc gccagaatgt 5640
ttctatattg aacagaaact gcgcgagcgg atgaatattc cggtattcca cgacgatcag 5700
cacggcacgg caattatcag cactgccgcc atcctcaacg gcttgcgcgt ggtggagaaa 5760
aacatctccg acgtgcggat ggtggtttcc ggcgcgggtg ccgcagcaat cgcctgtatg 5820
aacctgctgg tagcgctggg tctgcaaaaa cataacatcg tggtttgcga ttcaaaaggc 5880
gttatctatc agggccgtga gccaaacatg gcggaaacca aagccgcata tgcggtggtg 5940
gatgacggca aacgtaccct cgatgatgtg attgaaggcg cggatatttt cctgggctgt 6000
tccggcccga aagtgctgac ccaggaaatg gtgaagaaaa tggctcgtgc gccaatgatc 6060
ctggcgctgg cgaacccgga accggaaatt ctgccgccgc tggcgaaaga agtgcgtccg 6120
gatgccatca tttgcaccgg tcgttctgac tatccgaacc aggtgaacaa cgtcctgtgc 6180
ttcccgttca tcttccgtgg cgcgctggac gttggcgcaa ccgccatcaa cgaagagatg 6240
aaactggcgg cggtacgtgc gattgcagaa ctcgcccatg cggaacagag cgaagtggtg 6300
gcttcagcgt atggcgatca ggatctgagc tttggtccgg aatacatcat tccaaaaccg 6360
tttgatccgc gcttgatcgt taagatcgct cctgcggtcg ctaaagccgc gatggagtcg 6420
ggcgtggcga ctcgtccgat tgctgatttc gacgtctaca tcgacaagct gactgagttc 6480
gtttacaaaa ccaacctgtt tatgaagccg attttctccc aggctcgcaa agcgccgaag 6540
cgcgttgttc tgccggaagg ggaagaggcg cgcgttctgc atgccactca ggaactggta 6600
acgctgggac tggcgaaacc gatccttatc ggtcgtccga acgtgatcga aatgcgcatt 6660
cagaaactgg gcttgcagat caaagcgggc gttgattttg agatcgtcaa taacgaatcc 6720
gatccgcgct ttaaagagta ctggaccgaa tacttccaga tcatgaagcg tcgcggcgtc 6780
actcaggaac aggcgcagcg ggcgctgatc agtaacccga cagtgatcgg cgcgatcatg 6840
gttcagcgtg gggaagccga tgcaatgatt tgcggtacgg tgggtgatta tcatgaacat 6900
tttagcgtgg tgaaaaatgt ctttggttat cgcgatggcg ttcacaccgc aggtgccatg 6960
aacgcgctgc tgctgccgag tggtaacacc tttattgccg atacatatgt taatgatgaa 7020
ccggatgcag aagagctggc ggagatcacc ttgatggcgg cagaaactgt ccgtcgtttt 7080
ggtattgagc cgcgcgttgc tttgttgtcg cactccaact ttggttcttc tgactgcccg 7140
tcgtcgagca aaatgcgtca ggcgctggaa ctggtcaggg aacgtgcacc agaactgatg 7200
attgatggtg aaatgcacgg cgatgcagcg ctggtggaag cgattcgcaa cgaccgtatg 7260
ccggacagct ctttgaaagg ttccgccaat attctggtga tgccgaacat ggaagctgcc 7320
cgcattagtt acaacttact gcgtgtttcc agctcggaag gtgtgactgt cggcccggtg 7380
ctgatgggtg tggcgaaacc ggttcacgtg ttaacgccga tcgcatcggt gcgtcgtatc 7440
gtcaacatgg tggcgctggc cgtggtagaa gcgcaaaccc aaccgctgta agtcgacctg 7500
cagtaatcgt acagggtagt acaaataaaa aaggcacgtc agatgacgtg ccttttttct 7560
tgtgagcagt aagcttgaat tccggtgata aattatctct ggcggtgttg acataaatac 7620
cactggcggt gatactgagc acatcagcag gacgcactga ccaccatgaa ggtgacgctc 7680
ttaaaaatta agccctgaag aagggcttta tttgcataca ttcaatcaat tgttatctaa 7740
ggaaatactt acatatgaaa acctctctgt ttaaaagcct ttactttcag gtcctgacag 7800
cgatagccat tggtattctc cttggccatt tctatcctga aataggcgag caaatgaaac 7860
cgcttggcga cggcttcgtt aagctcatta agatgatcat cgctcctgtc atcttttgta 7920
ccgtcgtaac gggcattgcg ggcatggaaa gcatgaaggc ggtcggtcgt accggcgcag 7980
tcgcactgct ttactttgaa attgtcagta ccatcgcgct gattattggt cttatcatcg 8040
ttaacgtcgt gcagcctggt gccggaatga acgtcgatcc ggcaacgctt gatgcgaaag 8100
cggtagcggt ttacgccgat caggcgaaag accagggcat tgtcgccttc attatggatg 8160
tcatcccggc gagcgtcatt ggcgcatttg ccagcggtaa cattctgcag gtgctgctgt 8220
ttgccgtact gtttggtttt gcgctccacc gtctgggcag caaaggccaa ctgattttta 8280
acgtcatcga aagtttctcg caggtcatct tcggcatcat caatatgatc atgcgtctgg 8340
cacctattgg tgcgttcggg gcaatggcgt ttaccatcgg taaatacggc gtcggcacac 8400
tggtgcaact ggggcagctg attatctgtt tctacattac ctgtatcctg tttgtggtgc 8460
tggtattggg ttcaatcgct aaagcgactg gtttcagtat cttcaaattt atccgctaca 8520
tccgtgaaga actgctgatt gtactgggga cttcatcttc cgagtcggcg ctgccgcgta 8580
tgctcgacaa gatggagaaa ctcggctgcc gtaaatcggt ggtggggctg gtcatcccga 8640
caggctactc gtttaacctt gatggcacat cgatatacct gacaatggcg gcggtgttta 8700
tcgcccaggc cactaacagt cagatggata tcgtccacca aatcacgctg ttaatcgtgt 8760
tgctgctttc ttctaaaggg gcggcagggg taacgggtag tggctttatc gtgctggcgg 8820
cgacgctctc tgcggtgggc catttgccgg tagcgggtct ggcgctgatc ctcggtatcg 8880
accgctttat gtcagaagct cgtgcgctga ctaacctggt cggtaacggc gtagcgacca 8940
ttgtcgttgc taagtgggtg aaagaactgg accacaaaaa actggacgat gtgctgaata 9000
atcgtgcgcc ggatggcaaa acgcacgaat tatcctctta agtcgacctg cagtaatcgt 9060
acagggtagt acaaataaaa aaggcacgtc agatgacgtg ccttttttct tgtgagcagt 9120
aagcttgcgg ccgccggtga taaattatct ctggcggtgt tgacataaat accactggcg 9180
gtgatactga gcacatcagc aggacgcact gaccaccatg aaggtgacgc tcttaaaaat 9240
taagccctga agaagggctt tatttgcata cattcaatca attgttatct aaggaaatac 9300
ttacatatgc gtcagactaa aaccggtatc ctgctggcaa acctgggtac gcccgatgcc 9360
cccacacctg aagcggtaaa acgctatctg aaacaatttt taagcgacag acgcgtggtt 9420
gatacctcac ggttgttatg gtggccattg ctgcgcggcg tgattttgcc gctgcgctcg 9480
ccgcgtgtgg cgaagctgta tgcctctgtc tggatggaag gtggctcgcc gctgatggtt 9540
tacagccgcc agcaacagca ggcgctggca caacgtttac cggagatgcc cgtagcgctg 9600
ggaatgagct acggctcgcc atcactggaa agcgccgtag atgaactcct ggcagagcat 9660
gtagatcata ttgtggtgct gccgctttat ccgcaattct cctgttctac ggtcggtgcg 9720
gtatgggatg aactggcacg cattctggcg cgcaaacgta gcattccggg gatatcgttt 9780
atacgtgatt acgccgataa ccacgattac attaatgcac tggcgaacag cgtacgcgct 9840
tcttttgcca aacatggcga accggatctg ctactgctct cttatcatgg cattccccag 9900
cgttatgcag atgaaggcga tgattacccg caacgttgcc gcacaacgac tcgtgaactg 9960
gcttccgcat tggggatggc accggaaaaa gtgatgatga cctttcagtc gcgctttggt 10020
cgggaaccct ggctgatgcc ttataccgac gaaacgctga aaatgctcgg agaaaaaggc 10080
gtaggtcata ttcaggtgat gtgcccgggc tttgctgcgg attgtctgga gacgctggaa 10140
gagattgccg agcaaaaccg tgaggtcttc ctcggtgccg gcgggaaaaa atatgaatat 10200
attccggcgc ttaatgccac gccggaacat atcgaaatga tggctaatct tgttgccgcg 10260
tatcgctaaa ctagtgtcga cctgcagtaa tcgtacaggg tagtacaaat aaaaaaggca 10320
cgtcagatga cgtgcctttt ttcttgtgag cagtaagctt ggcactggcc gtcgttttac 10380
aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 10440
ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 10500
gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 10560
tttcacaccg catatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 10620
ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 10680
atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 10740
gtcatcaccg aaacgcgc 10758
Claims (18)
- 대두 레그헤모글로빈 (soy leghemoglobin)을 제조하는 방법으로서,
헴 (heme) 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 제작하는 단계;
글리신 맥스 (Glycine max) 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 제작하는 단계;
상기 제 1 플라스미드 및 상기 제 2 플라스미드를 포함하는 제 1 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및
상기 제 1 생산균주 대장균을 배양하여 상기 대두 레그헤모글로빈을 생산하는 단계를 포함하는, 방법. - 제 1항에 있어서, 상기 헴 생합성 경로 효소는 ALA 합성효소, NADP-의존성 말산 효소, 디카르복실산 수송체 및 페로킬라타제인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1 플라스미드는 서열번호 6으로 표시된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 2 플라스미드는 서열번호 8로 표시된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 ALA 합성효소는 서열번호 2로 표시된 염기서열을 갖는 로도박터 스패로이데스 (Rhodobacter sphaeroides) ALA 합성효소이고, 상기 NADP-의존성 말산 효소는 서열번호 3으로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 NADP-의존성 말산 효소이고, 상기 디카르복실산 수송체는 서열번호 4로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 디카르복실산 수송체이며, 상기 페로킬라타제는 서열번호 5로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 페로킬라타제인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1 생산균주 대장균을 배양하기 위해 숙신산을 사용하여 pH 7 내지 pH 9로 조정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법으로서,
헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 3 플라스미드를 제작하는 단계;
상기 제 3 플라스미드를 포함하는 제 2 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및
상기 제 2 생산균주 대장균을 배양하여 상기 대두 레그헤모글로빈을 생산하는 단계를 포함하는, 방법. - 제 8항에 있어서, 상기 헴 생합성 경로 효소는 ALA 합성효소, NADP-의존성 말산 효소, 디카르복실산 수송체 및 페로킬라타제인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 제 3 플라스미드는 서열번호 9로 표시된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 ALA 합성효소는 서열번호 2로 표시된 염기서열을 갖는 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소이고, 상기 NADP-의존성 말산 효소는 서열번호 3으로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 NADP-의존성 말산 효소이고, 상기 디카르복실산 수송체는 서열번호 4로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 디카르복실산 수송체이며, 상기 페로킬라타제는 서열번호 5로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 페로킬라타제인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 제 2 생산균주 대장균을 배양하기 위해 숙신산을 사용하여 pH 7 내지 pH 9로 조정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법으로서,
글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 제작하는 단계;
상기 제 2 플라스미드를 포함하는 제 3 생산균주 대장균을 제작하는 단계;
상기 제 3 생산균주 대장균을 배양하여 글로빈을 생산하는 단계;
미생물 발효 또는 화학적 합성에 의해 헴을 생산하는 단계; 및
상기 글로빈 및 상기 헴을 커플링하여 상기 대두 레그헤모글로빈을 획득하는 단계를 포함하는, 방법. - 제 14항에 있어서, 상기 제 2 플라스미드는 서열번호 8로 표시된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 헴을 생산하는 단계는
헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 제작하는 단계;
상기 제 1 플라스미드를 포함하는 제 4 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및
상기 제 4 생산균주 대장균을 배양하여 상기 헴을 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 16항에 있어서, 상기 제 1 플라스미드는 서열번호 6으로 표시된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따라 제조된 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 육류 풍미증진제 및/또는 철 보충제로서 유용한 조성물.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202062959702P | 2020-01-10 | 2020-01-10 | |
US62/959,702 | 2020-01-10 | ||
PCT/IB2021/050137 WO2021140487A1 (en) | 2020-01-10 | 2021-01-09 | A method for preparing soy leghemoglobin using escherichia coli |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20220139308A true KR20220139308A (ko) | 2022-10-14 |
Family
ID=76787860
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020227026303A KR20220139308A (ko) | 2020-01-10 | 2021-01-09 | 대장균을 사용한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230074134A1 (ko) |
EP (1) | EP4090746A4 (ko) |
KR (1) | KR20220139308A (ko) |
CN (1) | CN114929879A (ko) |
WO (1) | WO2021140487A1 (ko) |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2799466A1 (fr) * | 1999-10-11 | 2001-04-13 | Inst Nat Sante Rech Med | Transporteurs artificiels d'oxygene a base d'hemoglobine ou de myoglobine |
US9334513B2 (en) * | 2008-09-12 | 2016-05-10 | Catholic University Industry Academic Cooperation Foundation | Method for producing biological heme iron, and iron supplementing composition containing the heme iron produced by same |
US9085766B2 (en) * | 2010-05-21 | 2015-07-21 | Cornell University | Methods of producing recombinant heme-binding proteins and uses thereof |
DK2943072T3 (en) * | 2013-01-11 | 2018-03-05 | Impossible Foods Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR INFLUENCING THE TASTE AND AROMA PROFILE OF CONSUMER PRODUCTS |
KR101511361B1 (ko) * | 2013-02-27 | 2015-04-10 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 헴 생산성이 증가된 재조합 대장균 및 이를 이용한 헴 생산 방법 |
DK3044320T3 (da) * | 2013-09-11 | 2020-03-16 | Impossible Foods Inc | Sekretion af hæmholdige polypeptider |
CA3185690A1 (en) * | 2014-03-31 | 2015-10-08 | Impossible Foods Inc. | Ground meat replicas |
NZ737094A (en) * | 2015-05-11 | 2019-06-28 | Impossible Foods Inc | Expression constructs and methods of genetically engineering methylotrophic yeast |
CN107287143A (zh) * | 2016-04-05 | 2017-10-24 | 中国科学院微生物研究所 | 高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用 |
US20190292217A1 (en) * | 2016-12-02 | 2019-09-26 | Impossible Foods Inc. | Transgenic plants with upregulated heme biosynthesis |
KR20180079846A (ko) * | 2017-01-03 | 2018-07-11 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철을 제조할 수 있는 생물학적 방법 |
CN109321590B (zh) * | 2018-10-19 | 2022-06-21 | 北京化工大学 | 利用乙酸生产l-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用 |
KR20200117246A (ko) * | 2019-04-03 | 2020-10-14 | 고려대학교 산학협력단 | 레그헤모글로빈과 헴 조효소가 결합된 홀로단백질 제조용 벡터, 형질전환 세포, 및 상기 홀로단백질의 제조방법 |
US20230073947A1 (en) * | 2020-01-10 | 2023-03-09 | Intron Biotechnology, Inc. | A method for preparing bovine myoglobin using escherichia coli |
EP4090678A4 (en) * | 2020-01-10 | 2024-01-10 | Intron Biotechnology Inc | METHOD FOR PREPARING PORCINE MYOGLOBIN USING ESCHERICHIA COLI |
CA3173313A1 (en) * | 2020-02-28 | 2021-09-02 | Impossible Foods Inc. | Materials and methods for protein production |
WO2022144434A1 (en) * | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Paleo B.V. | Meat substitute comprising animal myoglobin |
CN115725634A (zh) * | 2021-08-31 | 2023-03-03 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种豆血红蛋白的表达盒、含其的表达载体、基因工程菌及其应用 |
CN114316031B (zh) * | 2022-01-17 | 2024-04-19 | 杭州瑞丰生物科技有限公司 | 一种生产血红素结合蛋白的方法 |
-
2021
- 2021-01-09 EP EP21738002.1A patent/EP4090746A4/en active Pending
- 2021-01-09 WO PCT/IB2021/050137 patent/WO2021140487A1/en unknown
- 2021-01-09 KR KR1020227026303A patent/KR20220139308A/ko not_active Application Discontinuation
- 2021-01-09 US US17/791,566 patent/US20230074134A1/en active Pending
- 2021-01-09 CN CN202180008679.7A patent/CN114929879A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2021140487A1 (en) | 2021-07-15 |
EP4090746A1 (en) | 2022-11-23 |
US20230074134A1 (en) | 2023-03-09 |
EP4090746A4 (en) | 2024-01-24 |
CN114929879A (zh) | 2022-08-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5611822B2 (ja) | ヘモフィルス・インフルエンザb型菌用の培養培地 | |
KR20220137895A (ko) | 대장균을 사용한 돼지 미오글로빈의 제조 방법 | |
KR20220137894A (ko) | 대장균을 사용한 소 미오글로빈의 제조 방법 | |
CN101605905B (zh) | 类黄酮类的糖苷化方法 | |
WO2017150304A1 (ja) | エルゴチオネインの発酵生産 | |
Bogorad et al. | The enzymatic synthesis of porphyrins from porphobilinogen | |
Botsford | Osmoregulation in Rhizobium meliloti: inhibition of growth by salts | |
FR2934943A1 (fr) | Utilisation d'apiogalacturonanes et de ses derives pour la stimulation des reactions de defense et de resistance des plantes contre le stress biotiques et abiotiques | |
KR102074841B1 (ko) | 피드백-내성 알파-이소프로필말레이트 신타제 | |
KR20220003035A (ko) | 에르고티오네인의 생산 방법 | |
Gmeiner | The isolation of two different lipopolysaccharide fractions from various Proteus mirabilis strains | |
JP2024037919A (ja) | モルフィナンアルカロイドおよび誘導体を生成する方法 | |
CN110004182B (zh) | 一种微生物胞内大颗粒内含物的制备方法及其应用 | |
US7901912B1 (en) | Method of producing uridine 5′-diphospho-N-acetylgalactosamine | |
EP1877538B1 (fr) | Procédé de production de souches de staphylococcus aureus surproductrices | |
KR20220139308A (ko) | 대장균을 사용한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법 | |
CN101165172B (zh) | 一种重组甲基营养杆菌及其应用 | |
HUE028023T2 (en) | Removal of arsenic by the use of dissimilation arsenic reductase | |
Seshadri et al. | The characterization and secretion pattern of the lysosomal trehalases ofDictyostelium discoideum | |
KR20080049094A (ko) | L-세린, 유전자 서열, 벡터, 및 미생물의 생산 방법 | |
Echemendia-Blanco et al. | Stability, subunit interactions and carbohydrate-binding of the seed lectin from Pterocarpus angolensis | |
JP3399595B2 (ja) | εーポリーLーリジンの製造方法 | |
Robert et al. | On the immunogenicity of ribosomes and ribosomal proteins isolated from Klebsiella pneumoniae and Streptococcus pneumoniae | |
JPH11178577A (ja) | ノルコクラウリン6−o−メチルトランスフェラーゼおよび該酵素遺伝子 | |
Dagley et al. | Studies on an induced enzyme system by means of ultracentrifugal analysis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal |