KR20220139308A - 대장균을 사용한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법 - Google Patents

대장균을 사용한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법 Download PDF

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상현 강
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안성 권
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Abstract

대두 레그헤모글로빈 (soy leghemoglobin)을 제조하는 방법은 헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 제작하는 단계; 글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 제작하는 단계; 제 1 플라스미드 및 제 2 플라스미드를 포함하는 제 1 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및 제 1 생산균주 대장균을 배양하여 대두 레그헤모글로빈을 생산하는 단계를 포함한다. 육류 풍미증진제 및/또는 철 보충제로서 유용한 조성물은 본원 발명에 따라 제조된 대두 레그헤모글로빈을 포함한다.

Description

대장균을 사용한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법
본 출원은 2020년 1월 10일자로 제출된 미국 가특허출원 제 62/959,702호에 대한 우선권을 주장하고, 이는 모든 목적으로 본원에 전적으로 기재된 바와 같이 참고문헌으로 통합된다.
본 발명은 대장균을 사용하여 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법, 및 대두 레그헤모글로빈의 육류 풍미증진제 및/또는 철 보충제로서의 용도에 관한 것이다.
인간은 수렵생활 초기부터 육류를 먹기 시작하였으며, 육류는 주로 사냥한 동물의 살 (근육 조직)에서 얻었다. 인류가 발전하면서, 모든 산업이 발전하였지만, 해결되어야 할 여러 문제도 생겨났다. 그 중, 축산업의 발전은 환경 문제를 포함하여 다양한 문제를 야기하였다. 예를 들면, 모든 인간 관련 온실가스 배출의 약 15%가 축산업으로부터 발생하고, 이중 절반이 전세계에서 사육되는 15억 마리의 소로부터 발생한다. 또한, 동물의 육류는 동일한 양의 초목과 비교하여 4-25배의 더 많은 물과 6-17배의 더 넓은 땅을 필요로 한다. 또한, 최근 동물의 생명권에 대한 인식이 높아짐에 따라 육류를 얻기 위한 도축은 동물윤리의 문제로까지 대두되고 있다. 더욱 심각한 문제는 세계 인구가 급격하게 증가함에 따라 오늘날과 동일한 방식으로의 육류 공급은 한계를 가진다는 것이다.
대체육은 기존 육류에 관련된 제조의 비효율성, 환경 파괴 및 건강 손상의 문제를 해결할 수 있는 주요 수단으로 주목을 받고 있다. 일반적으로, 대체육은 식물성 성분으로부터 제조되고, 때로는 유제품과 같은 동물성 성분이 없는 식품을 의미한다. 많은 대체육은 대두 (예로, 두부, 템페) 또는 글루텐을 기반으로 하지만, 이제는 콩 단백질로부터도 제조될 수 있다. 대체육의 목표 시장은 채식주의자, 비건, 육류 소비를 줄이려는 비-채식주의자, 및 힌두교, 유대교, 이슬람교 및 불교의 종교적 식이법을 따르는 사람들을 포함한다. 최근 보고서에 따르면, 전세계 대체육 시장 규모는 2017년 41억 7,500만 달러에서 2025년 75억 4,900만 달러에 이를 것으로 예상된다. 대체육의 중요성에 대한 근거는 현재 77억명에서 2050년에는 98억명, 2100년에는 112억명으로 증가할 것으로 추산되는 전세계 인구를 먹여살리는 것에서부터 시작되었다. 이러한 인구 성장의 대부분은 아프리카에서 발생하고, 아시아가 그 뒤를 따를 것이다.
대체육 기술의 발전에도 불구하고, 오늘날 시장에 나와 있는 대체육 제품들은 실제 육류와 비교할 때 풍미에서 차이가 난다. 대체육은 육류와 동일한 식감을 제공하기 위해 다양한 기술들이 적용되어 식물로부터 제조된다. 대체육을 생산하는 대다수 회사는 독특한 육류 색상을 내기 위해 비트 쥬스 또는 다른 식물성 색소를 첨가하지만, 이들은 육류와 유사한 풍미를 제공할 수는 없다.
따라서, 육류 본연의 색상뿐만 아니라 풍미를 제공할 수 있는 식품 첨가제의 개발이 무엇보다 시급한 실정이다.
한편으로, 철 (Fe)은 체내 산소 운반에 필수적인 역할을 담당하는 미량 원소로서, 헤모글로빈, 미오글로빈, 시토크롬, 철/황 단백질 및 생체분자 구조의 중요한 구성 성분이다. 체내 철의 평균 총량은 약 3-4 g이고, 이 중 60-65%는 순환하는 적혈구의 헤모글로빈에 결합하고 있으며, 나머지 30-35%는 저장 철 (페리틴)로서 존재한다. 또한, 철은 조직 철 및 혈청 철 (트랜스페린)의 형태로도 존재하고, 뿐만 아니라 근육의 미오글로빈에도 소량의 철이 존재한다.
철은 체내에서 합성되지 않아 전적으로 섭취를 통해 획득되어야 하며, 헴철 및 비-헴철의 2가지 유형으로 존재한다. 헴철은 체내 헤모글로빈의 헴과 구조적으로 동일한 부분을 갖는 철 복합체이고, 비-헴철은 헤모글로빈의 헴과 구조적으로 동일한 부분을 갖지 않는 철 복합체이다. 이러한 2가지 유형의 철은 철 보충제 (철 보충 화합물)로서 사용될 수 있으며, 헴철의 생체이용률은 비-헴철의 생체이용률보다 월등히 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 체내에서 헴철의 흡수는 다른 식이 요인에 의해 영향을 받지 않는다. 더욱이, 헴철은 비-헴철에서 보고되었던 다양한 부작용 (변비, 위장 장애 등)을 유발하지 않는 장점을 갖는다.
일반적으로, 헴철은 돼지의 혈액과 같은 도축된 동물의 혈액로부터 제조된다. 헴철은 먼저 도축장 혈액에서 헤모글로빈을 분리한 다음 분리된 헤모글로빈으로부터 헴철을 분리하는 방식으로 제조된다. 헤모글로빈으로부터 헴철의 분리는 알코올 및 이미다졸 유도체를 사용하는 방법 (Lindroos, 미국 특허 제 4,431,581호), 이에 아미노산을 첨가하는 방법 (Ingberg, et. al., 미국 특허 제 5,008,388호), 고농축된 유기산을 사용하여 고온에서 분해하는 방법 (Liu, 등, J. Agric. Food Chem. 44: 2957, 1996), 및 프로테아제 등을 사용하는 방법 등이 있다.
이와 같이, 통상적인 방법으로 제조된 헴철은 비-헴철에는 존재하지 않은, 동물 유래의 감염원에 의한 감염 위험성, 가축 성장호르몬의 오염 및 항생제의 잔류와 같은 많은 문제점이 있다. 따라서, 동물 혈액으로부터 유래하지 않은 헴철을 제조하는 방법의 개발이 필요하다.
따라서, 본 발명은 관련 기술분야에서 발견되는 문제점을 염두에 두고 이루어졌으며, 이러한 문제점을 해결하기 위한 것이다.
일 양태에서, 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법은 헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 제작하는 단계; 글리신 맥스 (Glycine max) 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 제작하는 단계; 제 1 플라스미드 및 제 2 플라스미드를 포함하는 제 1 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및 제 1 생산균주 대장균을 배양하여 대두 레그헤모글로빈을 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 헴 생합성 경로 효소는 ALA 합성효소, NADP-의존성 말산 효소, 디카르복실산 수송체 및 페로킬라타제 (ferrochelatase)이다.
또 다른 양태에서, 대두 레그헤모글로빈은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 갖는 글로빈 및 화학식 1로 표시되는 헴으로 구성된다.
Figure pct00001
또 다른 양태에서, 제 1 플라스미드는 서열번호 6에 제시된 염기서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, 제 2 플라스미드는 서열번호 8에 제시된 염기서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, ALA 합성효소는 서열번호 2에 제시된 염기서열을 갖는 로도박터 스패로이데스 (Rhodobacter sphaeroides) ALA 합성효소이고, NADP-의존성 말산 효소는 서열번호 3에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 (Escherichia coli) NADP-의존성 말산 효소이고, 디카르복실산 수송체는 서열번호 4에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 디카르복실산 수송체이며, 페로킬라타제 (ferrochelatase)는 서열번호 5에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 페로킬라타제이다.
또 다른 양태에서, 상기 방법은 제 1 생산균주 대장균을 배양하기 위해 숙신산을 사용하여 pH 7 내지 pH 9로 조정하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법은 헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 3 플라스미드를 제작하는 단계; 제 3 플라스미드를 포함하는 제 2 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및 제 2 생산균주 대장균을 배양하여 대두 레그헤모글로빈을 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 헴 생합성 경로 효소는 ALA 합성효소, NADP-의존성 말산 효소, 디카르복실산 수송체 및 페로킬라타제이다.
또 다른 양태에서, 대두 레그헤모글로빈은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 갖는 글로빈 및 화학식 1로 표시되는 헴으로 구성된다.
Figure pct00002
또 다른 양태에서, 제 3 플라스미드는 서열번호 9에 제시된 염기서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, ALA 합성효소는 서열번호 2에 제시된 염기서열을 갖는 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소이고, NADP-의존성 말산 효소는 서열번호 3에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 NADP-의존성 말산 효소이고, 디카르복실산 수송체는 서열번호 4에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 디카르복실산 수송체이며, 페로킬라타제는 서열번호 5에 제시된 염기서열을 갖는 대장균 페로킬라타제이다.
또 다른 양태에서, 상기 방법은 제 2 생산균주 대장균을 배양하기 위해 숙신산을 사용하여 pH 7 내지 pH 9로 조정하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법은 글리신 맥스 (Glycine max) 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 제작하는 단계; 제 2 플라스미드를 포함하는 제 3 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 제 3 생산균주 대장균을 배양하여 글로빈을 생산하는 단계; 미생물 발효 또는 화학적 합성에 의해 헴을 생산하는 단계; 및 글로빈 및 헴을 커플링 하여 대두 레그헤모글로빈을 획득하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 제 2 플라스미드는 서열번호 8에 제시된 염기서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, 헴을 생산하는 단계는 헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 제작하는 단계; 제 1 플라스미드를 포함하는 제 4 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및 제 4 생산균주 대장균을 배양하여 헴을 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 제 1 플라스미드는 서열번호 6에 제시된 염기서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, 육류 풍미증진제 및/또는 철 보충제로서 유용한 조성물은 본 발명의 방법에 따라 제조된 대두 레그헤모글로빈을 포함한다.
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 예시적이고 해석적인 것이며, 청구된 바와 같은 본 발명의 추가 설명을 제공하기 위한 것으로 이해되어야 한다.
첨부된 도면은 본 발명의 추가 이해를 제공하기 위해 포함되고, 본 명세서에 통합되어 이의 일부를 구성하며, 본 발명의 구현예를 도시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하고 있다.
도 1은 pLEX_HMDH의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 2는 pBAD_LegH의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 3은 pLEX_LHMDH의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 4는 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 레인 M: 단백질 마커, 레인 1: 글로빈, 레인 2: 실시예 8, 레인 3: 실시예 9, 레인 4: 실시예 10-4, 및 레인 5: 실시예 10-5.
도 5는 고유한 PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 레인 1: 글로빈, 레인 2: 실시예 8, 레인 3: 실시예 9, 레인 4: 실시예 10-4, 및 레인 5: 실시예 10-5. 적색 화살표: 헴-글로빈 복합체.
도 6은 분광분석의 결과를 나타낸다.
도 7은 형광 분광분석의 결과를 나타낸다.
본 발명의 구현예가 이제 상세하게 언급될 것이고, 이의 예시는 첨부된 도면에 도시되어 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 철저한 연구의 결과로서, 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법 및 대두 레그헤모글로빈를 포함하는 조성물을 개발하였다. 상기 조성물은 육류 풍미증진제 및 철 보충제로서 활용될 수 있으며, 이에 따라 본 발명이 완성된다.
본원에 사용된 용어 "헴철"은 체내 헤모글로빈의 헴과 동일한 구조를 갖는 부분을 포함하는 철 복합체를 의미하고, 용어 "비-헴철"은 헤모글로빈의 헴과 동일한 구조를 갖는 부분을 포함하지 않는 철 복합체를 의미한다.
본원 발명의 글로빈은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 99.5%의 일치도를 갖는 이의 변이체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 본원에서의 아미노산 서열 일치도는, 동일한 리딩 프레임 내에 정렬시키고, 필요한 경우 최대의 서열 일치도 백분율을 달성하도록 갭을 도입한 이후에, 임의의 보존적 치환을 서열 일치도의 일부로서 고려하지 않는, 글로빈 서열의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.
2가지 아미노산 서열의 일치도 백분율을 결정하기 위하여, 서열은 최적의 비교를 위한 목적으로 정렬된다 (예로, 제 1 서열의 서열 내에 갭이 도입될 수 있음). 상응하는 아미노산 위치에서 다음과 같이 비교된다. 제 1 서열에서 위치가 제 2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산으로 채워질 때, 분자는 해당 위치에서 일치한다. 2가지 서열 사이의 일치도 백분율은 서열이 공유하는 일치한 위치의 수 함수이다 (즉, 일치도% = 일치한 위치 # / 총 위치 # × 100).
본원 발명의 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 당류, 염류, 보존제 및 첨가제로 예시되는 식품 등급의 구성성분을 추가적으로 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 본원 발명의 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 상기 성분 이외에 유화제, 현탁제 및 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
본원 발명의 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 육류 풍미증진제로서 대체육에 첨가될 수 있다. 대체육은 식물성 육류, 배양육 (세포 배양육) 및 합성육을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
본원 발명의 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 철 보충제로서 식품에 첨가될 수 있다. 식품은 크래커, 쿠키, 스낵류 및 음료수로 예시되나, 이들에 한정되지 않는다.
본원 발명의 대두 레그헤모글로빈의 대체육 또는 식품에 첨가된 양은 대체육 또는 식품의 유형에 따라 달라진다. 일반적으로, 대두 레그헤모글로빈은 1% (w/w) 이하의 대두 레그헤모글로빈이 포함되도록 대체육 또는 식품에 첨가될 수 있다.
대장균 발효공정에 의한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법에서, 대장균 (Escherichia coli) HMDH_LegH-d 또는 대장균 HMDH_LegH-s가 생산균주로서 사용된다.
생산균주 대장균 HMDH_LegH-d 또는 생산균주 대장균 HMDH_LegH-s를 사용한 대두 레그헤모글로빈의 생물학적 제조 방법에서, 배양공정의 pH는 pH 7 내지 9 범위, 바람직하게 pH 8 내지 9 범위로 유지된다. 본원에서 pH는 숙신산을 사용하여 조정된다. 이러한 공정에서 숙신산이 pH를 조정하는데 사용될 때, 숙신산은 대두 레그헤모글로빈의 생합성에서 기질로서 사용되는 물질로, 이는 대두 레그헤모글로빈의 고효율 생산에 유리하다.
별도로 제조된 글로빈 및 헴의 시험관내 커플링 공정을 통한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법에서, 대장균 LegH는 글로빈의 생산균주로서 사용된다.
별도로 제조된 글로빈 및 헴의 시험관내 커플링 공정을 통한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법에서, 대장균 HMDH는 헴의 생산균주로서 사용된다.
별도로 제조된 글로빈 및 헴의 시험관내 커플링 공정을 통한 대두 레그헤모글로빈의 제조 방법에서, 헴은 화학적 공정에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 실제적인 현재 바람직한 구현예는 다음의 실시예에 나타낸 바와 같이 설명된다.
그러나, 당업자라면 본 발명을 고려하여, 본 발명의 정신 및 범주 내에서 변형 및 개선을 만들 수 있음이 이해될 것이다.
실시예 1: 플라스미드 pLEX_HMDH의 제작
본 발명의 헴 생합성 경로의 4가지 핵심 효소를 포함하는 발현 플라스미드는 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소 (HemA), 대장균 NADP-의존성 말산 효소 (MaeB), 대장균 디카르복실산 수송체 (DctA) 및 대장균 페로킬라타제 (HemH)를 암호화하는 유전자를 pLEX 벡터 (인비트로젠사) 내로 통상적인 서브클로닝을 통해 제작하였다. 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소의 염기서열은 서열번호 2로 표시되고, 대장균 NADP-의존성 말산 효소의 염기서열은 서열번호 3으로 표시되고, 대장균 디카르복실산 수송체의 염기서열은 서열번호 4로 표시되며, 대장균 페로킬라타제의 염기서열은 서열번호 5로 표시된다.
결과로 생성된 플라스미드는 pLEX_HMDH로 명명하였다. 플라스미드 pLEX_HMDH에서, 삽입된 유전자 각각은 각 유전자의 앞과 뒤에 개별 P L 프로모터 및 aspA 전사 종결인자를 갖는다 (도 1).
pLEX_HMDH의 염기서열은 서열번호 6에 제시된다.
실시예 2: 플라스미드 pBAD_LegH의 제작
글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 코딩 서열은 대장균에서의 발현을 위해 코돈-최적화되어 화학적으로 합성되고, pBAD 벡터 (인비트로젠사) 내에 클로닝되어 플라스미드 pBAD_LegH가 생성되었다 (도 2).
플라스미드 pBAD_LegH는 대두 레그헤모글로빈의 글로빈 단백질에 대한 코딩 서열을 포함한다.
글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2의 코돈-최적화된 염기서열은 서열번호 7에 제시되었고, pBAD_LegH의 염기서열은 서열번호 8에 제시하였다.
실시예 3: 플라스미드 pLEX_LHMDH의 제작
본원 발명의 헴 생합성 경로의 4가지 핵심 효소 및 글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2를 포함하는 발현 플라스미드는 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소 (HemA), 대장균 NADP-의존성 말산 효소 (MaeB), 대장균 디카르복실산 수송체 (DctA), 대장균 페로킬라타제 (HemH) 및 글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2의 코돈-최적화된 염기서열을 암호화하는 유전자를 pLEX 벡터 (인비트로젠사) 내로 통상적인 서브클로닝을 통해 제작하였다. 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소의 염기서열은 서열번호 2로 표시되고, 대장균 NADP-의존성 말산 효소의 염기서열은 서열번호 3으로 표시되고, 대장균 디카르복실산 수송체의 염기서열은 서열번호 4로 표시되고, 대장균 페로킬라타제의 염기서열은 서열번호 5로 표시되며, 글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2의 코돈-최적화된 염기서열은 서열번호 7로 표시된다.
결과로 생성된 플라스미드는 pLEX_LHMDH로 명명하였다. 플라스미드 pLEX_LHMDH에서, 헴 합성효소를 암호화하는 삽입된 유전자 각각은 각 유전자의 앞과 뒤에 개별 P L 프로모터 및 aspA 전사 종결인자를 갖고, 글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2를 암호화하는 삽입된 유전자는 araBAD 프로모터 및 rrnB T1 전사 종결인자를 갖는다 (도 3). pLEX_LHMDH의 염기서열은 서열번호 9에 제시된다.
실시예 4: 헴 생산균주의 제작
플라스미드 pLEX_HMDH로 형질전환된 대장균 K-12 DH10B는 본원 발명의 헴 생산균주로서 사용되었다. 제작된 생산균주는 대장균 HMDH로 명명하였다.
헴 생산을 위한 원천 접종물로서 사용할 수 있도록, 생산균주 대장균 HMDH는 25% 글리세롤 (v/v)이 포함된 상태로 -80℃에서 유지되었다.
실시예 5: 글로빈 생산균주의 제작
플라스미드 pBAD_LegH로 형질전환된 대장균 K-12 DH10B는 본원 발명의 글로빈 생산균주로서 사용되었다. 제작된 생산균주는 대장균 LegH로 명명하였다.
글로빈 생산을 위한 원천 접종물로서 사용할 수 있도록, 생산균주 대장균 LegH는 25% 글리세롤 (v/v)이 포함된 상태로 -80℃에서 유지되었다.
실시예 6: 플라스미드 pLEX_HMDH 및 pBAD_LegH를 사용한 대두 레그헤모글로빈 생산균주의 제작
2가지 발현 제작물 (pLEX_HMDH 및 pBAD_LegH)로 형질전환된 대장균 K-12 DH10B 세포는 본원 발명의 대두 레그헤모글로빈 생산균주로서 사용되었다. 제작된 생산균주는 대장균 HMDH_LegH-d로 명명하였다.
대두 레그헤모글로빈 생산을 위한 원천 접종물로서, 생산균주 대장균 HMDH_LegH-d는 25% 글리세롤 (v/v)이 포함된 상태로 -80℃에서 유지되었다.
실시예 7: 플라스미드 pLEX_LHMDH를 사용한 대두 레그헤모글로빈 생산균주의 제작
플라스미드 pLEX_LHMDH로 형질전환된 대장균 K-12 DH10B 세포는 본원 발명의 대두 레그헤모글로빈에 대한 생산균주로서 사용되었다. 제작된 생산균주는 대장균 HMDH_LegH-s로 명명하였다.
대두 레그헤모글로빈의 생산을 위한 공급원 접종물로서, 생산균주 대장균 HMDH_LegH-s는 25% 글리세롤 (v/v)이 포함된 상태로 -80℃에서 유지되었다.
실시예 8: 생산균주 대장균 HMDH_LegH-d를 사용한 대두 레그헤모글로빈의 생산
대두 레그헤모글로빈은 대장균 HMDH_LegH-d (생산균주)를 사용한 미생물 발효를 통해 생산하였다.
50 mL 원뿔형 튜브에 50 μg/mL 클로람페니콜 및 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 10 mL의 LB 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물 및 10 g/L NaCl)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음 회전 진탕 배양기를 사용하여 37℃, 200 rpm으로 밤새 배양하였다. 밤샘 배양 이후에 얻은 1 mL의 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜 및 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 60 mL의 S 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L KH2PO4, 10 g/L 숙시네이트, 2 g/L 글리신 및 10 mg/L FeCl2·4H2O)가 첨가된 250 mL 삼각 플라스크에 접종한 다음 37℃, 200 rpm으로 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 이후에, 생성된 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜 및 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 3 L의 S 배지를 포함하는 5 L 발효기에 접종하였다. 발효기의 배양액이 OD600 = 0.5에 도달할 때까지 37℃, 0.5 vvm 통기 및 200 rpm에서 배양하였다. 배양액이 OD600 = 0.5에 도달하면, L-아라비노스 (최종 농도 = 0.2%) 용액을 배양액에 첨가하였다. 발효기의 배양액은 추가 72시간 동안 (37℃, 0.5 vvm 통기, 200 rpm) 더 배양하였다. 발효공정 동안, pH는 pH 8 내지 9로 유지하고, pH 조정은 숙신산 공급을 통해 조절하였다. pH를 조절하는데 숙신산을 사용하는 것은 숙신산이 헴의 생합성에서 기질로서 사용되는 물질인 장점을 제공할 수 있으며, 이는 궁극적으로 조성물의 고효율 생산에 유리하다. 발효 후, 생성된 세포는 4℃에서 15분 동안 4,500×g의 원심분리를 통해 회수하였다.
발효액을 원심분리하여 얻은 세포 펠렛은 초음파 파쇄로 용해시켰다. 구체적으로, 세포는 50 mL의 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 재현탁하였다. 이러한 세포 현탁액의 세포는 다음과 같이 초음파 파쇄로 용해시켰다. 초음파 파쇄는 20초 동안 수행하여 세포를 파괴시키고, 5초 동안 잠시 정지시켰으며, 이를 20분 동안 반복하였다. 획득한 전체 세포 용해물은 다시 원심분리하여 (25,000×g, 10분) 침전물 및 상등액을 분리하였다.
상기 생성된 상등액에 대해 황산암모늄 침전을 수행하여 제조된 대두 레그헤모글로빈을 농축하였다. 보다 정확하게는, 생성된 상등액을 고체 황산암모늄으로 40% 포화도로 조정하고, 2시간 동안 교반하였다. 침전된 물질은 4℃에서 15분 동안 25,000×g에서 원심분리하여 제거하고, 상등액은 고체 황산암모늄으로 70% 포화 상태로 만들었다. 이 용액은 2시간 동안 교반한 다음 4℃에서 30분 동안 25,000×g에서 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 침전된 대두 레그헤모글로빈은 5 mL의 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 재현탁시켰다. 과량의 황산암모늄을 제거하기 위하여, 탈염화 수지로서 세파덱스 G-25 (GE 헬스케어사)를 사용하였다. 컬럼은 세파덱스 G-25를 사용하여 2.6 × 10 cm로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 50 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화하였다. 그런 다음 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하였다. 그런 다음 컬럼은 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 전개시키고, 단백질 피크를 갖는 분획을 수집하였다.
탈염된 분획은 0.2 μm 필터로 여과한 다음 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 하이트랩 Q FF 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스 신속 유동 음이온 교환 레진 (GE 헬스케어사)으로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 5 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 흡착 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화하였다. 다음으로 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하고, 이어서 25 mL (5 컬럼 부피)의 흡착 완충액으로 세척하였다. 대두 레그헤모글로빈은 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)을 사용하여 용출하였다. 대두 레그헤모글로빈의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하기 위하여, 아미콘 울트라-15 3K 원심분리 필터 (밀리포아사)를 사용하여 원심분리 (4,500 rpm, 10분)한 다음 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 용리액을 4℃에서 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)으로 투석하였다. 동시에, 투석된 대두 레그헤모글로빈은 농축시키고, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 9: 생산균주 대장균 HMDH_LegH-s를 사용한 대두 레그헤모글로빈의 생산
대두 레그헤모글로빈은 대장균 HMDH_LegH-s (생산균주)를 사용한 미생물 발효를 통해 생산하였다.
50 mL 원뿔형 튜브에 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 10 mL의 LB 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물 및 10 g/L NaCl)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음 회전 진탕 배양기를 사용하여 37℃, 200 rpm으로 밤새 배양하였다. 밤샘 배양 이후에 얻은 1 mL의 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 60 mL의 S 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L KH2PO4, 10 g/L 숙시네이트, 2 g/L 글리신 및 10 mg/L FeCl2·4H2O)가 첨가된 250 mL 삼각 플라스크에 접종한 다음 37℃, 200 rpm으로 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 이후에, 생성된 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 3 L의 S 배지를 포함하는 5 L 발효기에 접종하였다. 발효기의 배양액이 OD600 = 0.5에 도달할 때까지 37℃, 0.5 vvm 통기 및 200 rpm에서 배양하였다. 배양액이 OD600 = 0.5에 도달하면, L-아라비노스 (최종 농도 = 0.2%) 용액을 배양액에 첨가하였다. 발효기의 배양액은 추가 72시간 동안 (37℃, 0.5 vvm 통기, 200 rpm) 더 배양하였다. 발효공정 동안, pH는 pH 8 내지 9로 유지하고, pH 조정은 숙신산 공급을 통하여 조절하였다. pH를 조절하는데 숙신산을 사용하는 것은 숙신산이 헴의 생합성에서 기질로서 사용되는 물질인 장점을 제공할 수 있으며, 이는 궁극적으로 조성물의 고효율 생산에 유리하다. 발효 후, 생성된 세포는 4℃에서 15분 동안 4,500×g의 원심분리를 통해 회수하였다.
발효액을 원심분리하여 얻은 세포 펠렛은 초음파 파쇄로 용해시켰다. 구체적으로, 세포는 50 mL의 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 현탁하였다. 이러한 세포 현탁액의 세포는 다음과 같이 초음파 파쇄로 용해시켰다. 초음파 파쇄는 20초 동안 수행하여 세포를 파괴시키고, 5초 동안 잠시 정지시켰으며, 이를 20분 동안 반복하였다. 획득한 전체 세포 용해물은 다시 원심분리하여 (25,000×g, 10분) 침전물 및 상등액을 분리하였다.
상기 생성된 상등액에 대해 황산암모늄 침전을 수행하여 제조된 대두 레그헤모글로빈을 농축하였다. 보다 정확하게는, 생성된 상등액을 고체 황산암모늄을 사용한 40% 포화도로 조정하고, 2시간 동안 교반하였다. 침전된 물질은 4℃에서 15분 동안 25,000×g에서 원심분리하여 제거하고, 상등액은 고체 황산암모늄으로 70% 포화 상태로 만들었다. 이 용액은 2시간 동안 교반한 다음 4℃에서 30분 동안 25,000×g에서 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 침전된 대두 레그헤모글로빈은 5 mL의 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 재현탁시켰다. 과량의 황산암모늄을 제거하기 위하여, 탈염화 수지로서 세파덱스 G-25 (GE 헬스케어사)를 사용하였다. 컬럼은 세파덱스 G-25를 사용하여 2.6 × 10 cm로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 50 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화하였다. 그런 다음 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하였다. 그런 다음 컬럼은 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 전개시키고, 단백질 피크를 갖는 분획을 수집하였다.
탈염된 분획은 0.2 μm 필터로 여과한 다음 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 하이트랩 Q FF 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스 신속 유동 음이온 교환 레진 (GE 헬스케어사)으로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 5 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 흡착 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화하였다. 다음으로 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하고, 이어서 25 mL (5 컬럼 부피)의 흡착 완충액으로 세척하였다. 대두 레그헤모글로빈은 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)을 사용하여 용출하였다. 대두 레그헤모글로빈의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하기 위하여, 아미콘 울트라-15 3K 원심분리 필터 (밀리포아사)를 사용하여 원심분리 (4,500 rpm, 10분)한 다음 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 용리액을 4℃에서 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)으로 투석하였다. 동시에, 투석된 대두 레그헤모글로빈은 농축시키고, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 10: 별도로 제조된 글로빈 및 헴의 시험관내 커플링을 통한 대두 레그헤모글로빈의 생산
실시예 10-1: 글로빈의 생산
글로빈은 대장균 LegH (생산균주)를 사용한 미생물 발효를 통해 생산하였다.
50 mL 원뿔형 튜브에 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 10 mL의 LB 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물 및 10 g/L NaCl)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음 회전 진탕 배양기를 사용하여 37℃, 200 rpm으로 밤새 배양하였다. 밤샘 배양 이후에 얻은 5 mL의 배양액을 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 500 mL의 LB 배지가 첨가된 2 L 삼각 플라스크에 접종한 다음 37℃, 200 rpm으로 배양액이 OD600 = 0.5에 도달할 때까지 배양하였다. 배양물이 OD600 = 0.5에 도달할 때, L-아라비노스 (최종 농도 = 0.2%) 용액을 50 μg/mL 카나마이신을 포함하는 2 L 삼각 플라스크에 첨가하였다. 2 L 삼각 플라스크의 배양액을 회전 진탕 배양기를 사용하여 25℃, 150 rpm으로 밤새 배양하였다. 발효 후, 생성된 세포는 4℃에서 15분 동안 4,500×g의 원심분리를 통해 회수하였다.
발효액을 원심분리하여 얻은 세포 펠렛은 초음파 파쇄로 용해시켰다. 구체적으로, 세포는 50 mL의 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 재현탁하였다. 이러한 세포 현탁액의 세포는 다음과 같이 초음파 파쇄로 용해시켰다. 초음파 파쇄는 20초 동안 수행하여 세포를 파괴시키고, 5초 동안 잠시 정지시켰으며, 이를 20분 동안 반복하였다. 획득한 전체 세포 용해물은 다시 원심분리하여 (25,000×g, 10분) 침전물 및 상등액을 분리하였다.
상기 생성된 상등액에 대해 황산암모늄 침전을 수행하여 제조된 글로빈을 농축하였다. 보다 정확하게는, 생성된 상등액을 고체 황산암모늄으로 40% 포화도로 조정하고, 2시간 동안 교반하였다. 침전된 물질은 4℃에서 15분 동안 25,000×g에서 원심분리하여 제거하고, 상등액은 고체 황산암모늄으로 70% 포화 상태로 만들었다. 이 용액은 2시간 동안 교반한 다음 4℃에서 30분 동안 25,000×g에서 원하여 침전물을 회수하였다. 침전된 글로빈은 5 mL의 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 재현탁시켰다. 과량의 황산암모늄을 제거하기 위하여, 탈염화 수지로서 세파덱스 G-25 (GE 헬스케어사)를 사용하였다. 컬럼은 세파덱스 G-25를 사용하여 2.6 × 10 cm로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 50 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화하였다. 그런 다음 글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하였다. 그런 다음 컬럼은 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 전개시키고, 단백질 피크를 갖는 분획을 수집하였다.
탈염된 분획은 0.2 μm 필터로 여과한 다음 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 하이트랩 Q FF 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스 신속 유동 음이온 교환 레진 (GE 헬스케어사)으로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 5 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 흡착 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화하였다. 다음으로 글로빈을 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하고, 이어서 25 mL (5 컬럼 부피)의 흡착 완충액으로 세척하였다. 글로빈은 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)을 사용하여 용출하였다. 글로빈의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하기 위하여, 아미콘 울트라-15 3K 원심분리 필터 (밀리포아사)를 사용하여 원심분리 (4,500 rpm, 10분)한 다음 글로빈을 포함하는 용리액을 4℃에서 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)으로 투석하였다. 동시에, 투석된 글로빈은 농축시키고, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 10-2: 생물학적 공정에 의한 헴의 생산
헴은 대장균 HMDH (생산균주)를 사용한 미생물 발효를 통해 생산하였다.
50 mL 원뿔형 튜브에 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 10 mL의 LB 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물 및 10 g/L NaCl)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음 회전 진탕 배양기를 사용하여 37℃, 200 rpm으로 밤새 배양하였다. 밤샘 배양 이후에 얻은 1 mL의 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 50 mL의 S 배지 (10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L KH2PO4, 10 g/L 숙시네이트, 2 g/L 글리신 및 10 mg/L FeCl2·4H2O)가 첨가된 250 mL 삼각 플라스크에 접종한 다음 37℃, 200 rpm으로 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 이후에, 생성된 배양액을 50 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 5 L의 S 배지를 포함하는 10 L 발효기에 접종하였다. 발효기의 배양액은 72시간 동안 (37℃, 0.5 vvm 통기, 200 rpm) 배양하였다. 발효공정 동안, pH는 pH 8 내지 9로 유지하고, pH 조정은 숙신산 공급을 통해 조절하였다. pH를 조절하는데 숙신산을 사용하는 것은 숙신산이 헴의 생합성에서 기질로서 사용되는 물질인 장점을 제공할 수 있으며, 이는 궁극적으로 헴의 고효율 생산에 유리하다. 발효 이후에, 생성된 세포는 4℃에서 15분 동안 3,000×g의 원심분리를 통해 회수하였다.
회수된 세포는 PBS (포스페이트 완충 식염수)로 현탁한 다음 원심분리하여 2회 세척하였다. 최종 회수된 세포는 약 30분 동안 자연 건조시킨 다음 무게를 측정하였다. 전형적으로, 5 L의 배양액으로부터 40 g 내지 50 g의 세포를 회수하는 것이 가능하였다. 회수된 세포에 차가운 산-아세톤을 첨가하여 헴을 추출하였다. 본원에서 사용된 차가운 산-아세톤은 -20℃에서 998 mL의 아세톤을 2 mL의 염산 (HCl)과 혼합하여 제조하였다. 차가운 산-아세톤의 첨가는 5 L의 배양액으로부터 회수된 세포에 1 L의 차가운 산-아세톤을 첨가하는 방식으로 수행하였다. 산-아세톤을 사용한 헴의 추출은 4℃에서 5일 동안 수행하였다. 5일 동안 헴 추출을 통해 획득된 용액은 셀라이트 충진된 컬럼을 통과시켜 헴을 포함하는 아세톤을 회수하였다. 여기서, 부피가 1 L에서 30 mL로 감소될 때까지 농축을 수행하였다. 이와 같이 얻은 용액에 10배 부피의 메틸렌 염화물을 첨가하고, 철저하게 혼합한 다음 층이 분리될 때까지 정치하였다. 층의 분리 이후에, 하부 층은 회수하고, 회전 증발기를 사용하여 농축하였다. 본원에서는 부피가 30 mL이 될 때까지 농축을 수행하였다. 농축 이후에, 농축물에 포함된 헴 당량을 기준으로 2.1 당량의 양으로 NaOH 수용액을 첨가하고, 철저하게 혼합한 다음 층이 분리될 때까지 정치하였다. 층의 분리 이후에, 상부 층은 회수하고, 사용 시까지 4℃에서 보관하였다. 또는 상부층을 동결건조시키고, 이를 사용할 시에는 물에 용해시킨다.
실시예 10-3: 화학적 합성에 의한 헴의 생산
헴은 철 이온 (Fe2+)을 프로토포르피린 Ⅸ 내에 배위시키는 화학적 합성에 의해 생산하였다. 프로토포르피린 Ⅸ (PPⅨ, 10 g, 17.8 mmol)은 테트라히드로퓨란 (150 mL)에 용해시키고, FeCl2·4H2O (14.4 g, 53.3 mmol)를 천천히 첨가한 다음 85℃에서 4시간 동안 재환류하였다. 반응의 종료 이후에, 유기 용매는 진공 증류를 통해 제거하였다. 다음으로, 반응 혼합물에 NaOH 수용액을 첨가하여 용해시킨 후, 생성된 용액은 셀라이트® 545가 충진된 컬럼을 통해 여과시키고, 얻어진 여과물은 중화하여 유리산 형태의 화학적으로 합성된 헴을 수득하였다 (10.8 g, 99%). 상기에서 얻은 유리산 형태의 헴 (5 g, 8.11 mmol)에 NaOH (630 mg, 15.9 mmol)를 증류수 (15 mL)에 녹인 용액을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하면서 염소화를 시행하였다. 반응의 종료 이후에, 반응 혼합물은 -80℃에서 동결시킨 다음 동결건조하고, 탈수하여 염 형태의 화학적으로 합성된 헴을 수득하였다 (5.25 g, 98%).
실시예 10-4: 별도로 제조된 글로빈 및 생물학적 헴의 시험관내 커플링
실시예 10-1로부터 획득한 글로빈 및 실시예 10-2로부터 획득한 헴의 시험관내 커플링을 수행하였다. 보다 정확하게는, 100 μM 글로빈 용액 10 mL 및 1 mM 헴 용액 (몰비 = 1 : 10) 10 mL을 50 mL 원뿔형 튜브에 첨가한 다음 실온에서 30분 동안 약하게 볼텍스 하여 반응시켰다.
반응 이후에, 헴-글로빈 복합체 용액은 0.2 μm 필터로 여과시키고, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다. 하이트랩 Q FF 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스 신속 유동 음이온 교환 레진 (GE 헬스케어사)으로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 5 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 흡착 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화하였다. 다음으로 헴-글로빈 복합체를 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하고, 이어서 25 mL (5 컬럼 부피)의 흡착 완충액으로 세척하였다. 헴-글로빈 복합체는 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)을 사용하여 용출하였다. 헴-글로빈 복합체의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하기 위하여, 아미콘 울트라-15 3K 원심분리 필터 (밀리포아사)를 사용하여 원심분리 (4,500 rpm, 10분)한 다음 헴-글로빈 복합체를 포함하는 용리액을 4℃에서 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)으로 투석하였다. 동시에, 투석된 헴-글로빈 복합체는 농축시키고, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 10-5: 별도로 제조된 글로빈 및 화학적으로 합성된 헴의 시험관내 커플링
실시예 10-1로부터 획득한 글로빈 및 실시예 10-3으로부터 획득한 헴의 시험관내 커플링을 수행하였다. 보다 정확하게는, 100 μM 글로빈 용액 10 mL 및 1 mM 헴 용액 (몰비 = 1 : 10) 10 mL을 50 mL 원뿔형 튜브에 첨가한 다음 실온에서 30분 동안 약하게 볼텍스 하여 반응시켰다.
반응 이후에, 헴-글로빈 복합체 용액은 0.2 μm 필터로 여과시키고, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다. 하이트랩 Q FF 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스 신속 유동 음이온 교환 레진 (GE 헬스케어사)으로 충진시키고, 이 때 충진된 총 베드 부피는 대략 5 mL이었다. 컬럼은 시료 로딩 이전에 흡착 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화하였다. 다음으로 헴-글로빈 복합체를 포함하는 시료를 컬럼에 로딩하고, 이어서 25 mL (5 컬럼 부피)의 흡착 완충액으로 세척하였다. 헴-글로빈 복합체는 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)을 사용하여 용출하였다. 헴-글로빈 복합체의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하기 위하여, 아미콘 울트라-15 3K 원심분리 필터 (밀리포아사)를 사용하여 원심분리 (4,500 rpm, 10분)한 다음 헴-글로빈 복합체를 포함하는 용리액을 4℃에서 50 mM의 Tris-HCl 용액 (pH 8.0)으로 투석하였다. 동시에, 투석된 헴-글로빈 복합체는 농축시키고, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 11: 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 액상 제형의 조성물의 제조
실시예 8 내지 10에 개시된 공정을 통해 획득된 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 용액은 염화나트륨 및 아스코르브산 나트륨 완충액을 사용한 완충액 교환을 수행한 다음, 최종 농도가 1 mg/mL 또는 10 mg/mL이 되도록 조정하였다. 농도 조정된 용액은 0.2 μm 필터를 사용하여 여과시켜 액상 제형의 조성물을 제조하였다. 이와 같이 제조한 액상 제형의 조성물은 동결 상태로 보관하였다.
실시예 12: 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 동결건조 제형의 조성물의 제조
단백질은 수용성 상태에서 비교적 불안정하고, 화학적 및 물리적 분해를 거쳐, 처리 및 보관 동안 생물학적 활성의 손실을 초래하는 것으로 알려져 있다. 동결건조 (라이오필리제이션으로도 알려져 있음)는 단백질의 보존을 위해 개발된 방법이다.
실시예 11에서 제조된 농도 조정된 용액은 동결건조하여 동결건조 제형의 조성물을 제조하였다.
동결건조 공정에 대한 설명은 다음과 같다:
(A) 농도 조정된 용액을 0.2 μm 필터를 사용하여 여과시킨다.
(B) 여과된 용액을 포함하는 병을 스테인리스강 트레이 위에 배치한다.
(C) 트레이를 동결건조기 내에 로딩하고, 하기 동결건조 사이클을 사용하여 용액을 동결건조시킨다:
(C-1) 4℃에서 약 20분 동안 평형화한다.
(C-2) 선반 온도를 -40℃로 맞추고 12시간 동안 유지시킨다.
(C-2) 농축기 온도를 -50℃로 맞춘다.
(C-4) 체임버에 진공을 적용한다.
(C-5) 진공이 1,500 mtorr 값에 도달하면, 선반 온도를 -20℃까지 올리고 16시간 동안 유지시킨다.
(C-6) 선반 온도를 1시간 당 10℃씩 증가시키는 방식으로 20℃까지 올리고, 16시간 동안 유지시킨다.
(C-7) 진공을 제거한다.
(D) 적절한 플립-오프 캡으로 마개를 막고, 바이알을 밀봉시킨다.
동결건조된 제형은 4℃에서 보관하였다.
실시예 13: 대두 레그헤모글로빈의 확인
실시예 8, 실시예 9, 실시예 10-4 및 실시예 10-5로부터 획득한 대두 레그헤모글로빈을 확인하기 위하여, 전기영동 분석 (SDS-PAGE 분석 및 고유한 PAGE 분석), 분광분석 및 형광 분광분석을 수행하였다. 동결건조 조성물의 경우, 분석 전에 증류수를 사용하여 재용해시켰다. 전기영동에서, 글로빈의 크기를 검증하기 위한 SDS-PAGE는 15% 젤을 사용하여 수행하였고, 헴-글로빈 복합체의 이동 변위에 대한 고유한 PAGE는 비-변성 및 비-환원 조건 하에 10% 젤을 사용하여 수행하였다. 분광분석은 마이크로플레이트 판독기 (테칸사, 인피니트 M200 프로)를 사용하여 수행하였으며, 형광 분광분석은 형광 소광화 방법을 사용하여 수행하였다. 분광분석을 위한 흡광도 측정을 간략하게 설명하면, 100 μL의 각 시료는 투명한 96웰 플레이트의 웰 내에 첨가한다. 그런 다음 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 280 nm 내지 500 nm에서 측정하였다. 형광 소광화는 분자 상호작용을 연구하는데 사용되는 기법이고, 헴-글로빈 복합체와 같은 리간드-단백질 결합을 관찰하기에 용이한 방법이다 (Principles of Fluorescence Spectroscopy, 277-330). 여기 파장은 280 nm이고, 방출 파장은 300 nm 및 500 nm 사이에서 측정되었다.
글로빈 및 헴-글로빈 복합체의 Mr은 SDS-PAGE에 의해 대략 13 kDa으로서 추정되었다 (도 4). 한편, 고유한 조건 하에서 고유한 PAGE 분석을 통하여, 전하 대 질량 비율, 물리적 형태 및 단백질의 크기의 차이로 인해 글로빈 및 헴-글로빈 복합체 사이에서 밴드 이동 변위가 관찰되었다 (도 5). 또한, 밴드는 젤 염색 이전에 갈색 밴드로서 검출되었다 (도 5). 분광분석은 헴-글로빈 복합체가 대략 350 nm 내지 400 nm에서 넓은 피크를 갖는 반면, 글로빈의 최대 흡수 파장은 280 nm에서 나타났다 (도 6). 형광 분광분석 결과, 글로빈의 최대 방출 파장은 320 nm이었고, 헴-글로빈 복합체의 모든 시료에서 형광 소광화가 발생하는 것을 보여주었으며, 이는 대두 레그헤모글로빈의 특징이 된다 (도 7).
상기 결과를 근거로 하여, 본 발명자들은 대두 레그헤모글로빈이 성공적으로 제조된 것으로 결론을 내렸다.
실시예 14: 대체육에 대한 풍미증진제로서 대두 레그헤모글로빈의 적용
대체육은 다음과 같이 제조하였다. 식물성 단백질의 건조 혼합물은 호퍼를 통해 압출기 배럴에 첨가하고, 물은 실온에서 별도로 주입하였다. 압출기 배럴은 80℃ 내지 150℃의 온도로 가열된다. 전면 플레이트 상의 압력은 10 바 (bar) 내지 20 바이다. 또한, 이러한 온도 범위 내에서 오일이 주입된다. 냉각 다이 (die)는 제품을 70℃의 출구 온도로 냉각시킨다. 제품은 다음의 재료로부터 트윈 나사 압출기로 제조되었다.
Figure pct00003
Figure pct00004
제조된 대체육 1 및 대체육 2는 육류의 외관 및 질감을 갖는다. 한편으로, 100명의 무작위로 선택된 소비자는 2가지 대체육의 맛 (풍미)을 비교하였다. 그 결과로, 대체육 1이 대체육 2보다 맛이 더 좋은 것으로 나타났다 (78명/100명 = 78%).
실시예 15: 철 보충제로서 대두 레그헤모글로빈의 적용
본원 발명에 따라 제조된 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 철 결핍성 빈혈 유발 동물에게 투여하여, 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물의 빈혈 개선 효과를 평가하였다.
구체적으로, 2주의 순화 기간 이후에, 30마리의 9주령 스프라그 달리 랫트 (암컷)를 실험군 당 10마리 랫트의 3가지 실험군으로 나누고, 이들 중 하나의 실험군에는 체중의 10%의 양으로 정상 사료를 1개월 동안 매일 공급하고, 나머지 2가지 실험군에는 체중의 10%의 양으로 철 결핍 사료를 6주 동안 매일 공급하여 철 결핍성 빈혈을 유발시켰다 (실험군 2 및 실험군 3). 6주의 사료 공급 이후에, 실험군 2 및 실험군 3에 속하는 개별 랫트에서 철 결핍성 빈형이 유발된 것을 확인하였다. 다음으로, 빈혈이 유발된 실험군 중 하나는 매일 1회 식염수만이 경구 투여되었고 (실험군 2), 나머지의 빈혈이 유발된 실험군은 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 용액이 매일 1회 경구 투여되었다 (0.1 mg Fe/500 μL 용액, 실험군 3). 투여는 5주 동안 계속되었다. 실험군 2 및 실험군 3에 대한 5주 투여 기간 동안, 실험군 1에는 정상 사료가 계속적으로 공급되었고, 실험군 2 및 실험군 3에는 철 결핍 사료가 공급되었다. 이상 증상의 발생이 투여 기간 동안 모니터링되었으며, 5주의 투여 기간 동안 모든 동물에서 이상 증상은 전혀 없었다. 5주의 투여 이후에, 혈액을 채취하여 빈혈의 완화 여부를 평가하였다. 채혈 분석 결과는 다음과 같다.
Figure pct00005
이상의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물은 철 결핍성 빈혈을 완화하는데 효과적인 것으로 결론을 내릴 수 있으며, 따라서 철 보충 공급원으로서 효율적인 물질이다.
당업자라면 전술한 상세한 설명에 개시된 개념 및 구체적인 구현예가 본 발명과 동일한 목적을 수행하기 위한 다른 구현예를 변형하거나 설계하는 근거로서 쉽게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 당업자라면 이러한 동등한 구현예가 첨부된 청구범위에 기재된 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않음도 이해할 것이다.
당업자에게 본 발명에서 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 정신 또는 범주를 벗어나지 않고도 이루어질 수 있음이 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 단 첨부된 청구범위 및 이들의 동등물의 범주 내에 속하면 본 발명의 변형 및 변경을 포괄하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> iNtRON Biotechnology, Inc. <120> A METHOD FOR PREPARING SOY LEGHEMOGLOBIN USING ESCHERICHIA COLI <130> 20001.0049WO <150> 62/959,702 <151> 2020-01-10 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Soy leghmoglobin <400> 1 Met Gly Ala Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Ser Ser Ser Phe 1 5 10 15 Glu Ala Phe Lys Ala Asn Ile Pro Gln Tyr Ser Val Val Phe Tyr Thr 20 25 30 Ser Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Asp Leu Phe Ser Phe Leu 35 40 45 Ser Asn Gly Val Asp Pro Ser Asn Pro Lys Leu Thr Gly His Ala Glu 50 55 60 Lys Leu Phe Gly Leu Val Arg Asp Ser Ala Gly Gln Leu Lys Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Val Val Ala Asp Ala Ala Leu Gly Ser Ile His Ala Gln Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Asp Pro Gln Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Lys 100 105 110 Thr Ile Lys Glu Ala Val Gly Asp Lys Trp Ser Asp Glu Leu Ser Ser 115 120 125 Ala Trp Glu Val Ala Tyr Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ile Lys Lys Ala 130 135 140 Phe 145 <210> 2 <211> 1224 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caggtcatct tcggcatcat caatatgatc atgcgtctgg 8340 cacctattgg tgcgttcggg gcaatggcgt ttaccatcgg taaatacggc gtcggcacac 8400 tggtgcaact ggggcagctg attatctgtt tctacattac ctgtatcctg tttgtggtgc 8460 tggtattggg ttcaatcgct aaagcgactg gtttcagtat cttcaaattt atccgctaca 8520 tccgtgaaga actgctgatt gtactgggga cttcatcttc cgagtcggcg ctgccgcgta 8580 tgctcgacaa gatggagaaa ctcggctgcc gtaaatcggt ggtggggctg gtcatcccga 8640 caggctactc gtttaacctt gatggcacat cgatatacct gacaatggcg gcggtgttta 8700 tcgcccaggc cactaacagt cagatggata tcgtccacca aatcacgctg ttaatcgtgt 8760 tgctgctttc ttctaaaggg gcggcagggg taacgggtag tggctttatc gtgctggcgg 8820 cgacgctctc tgcggtgggc catttgccgg tagcgggtct ggcgctgatc ctcggtatcg 8880 accgctttat gtcagaagct cgtgcgctga ctaacctggt cggtaacggc gtagcgacca 8940 ttgtcgttgc taagtgggtg aaagaactgg accacaaaaa actggacgat gtgctgaata 9000 atcgtgcgcc ggatggcaaa acgcacgaat tatcctctta agtcgacctg cagtaatcgt 9060 acagggtagt acaaataaaa aaggcacgtc agatgacgtg ccttttttct tgtgagcagt 9120 aagcttgcgg ccgccggtga 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Claims (18)

  1. 대두 레그헤모글로빈 (soy leghemoglobin)을 제조하는 방법으로서,
    헴 (heme) 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 제작하는 단계;
    글리신 맥스 (Glycine max) 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 제작하는 단계;
    상기 제 1 플라스미드 및 상기 제 2 플라스미드를 포함하는 제 1 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및
    상기 제 1 생산균주 대장균을 배양하여 상기 대두 레그헤모글로빈을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 헴 생합성 경로 효소는 ALA 합성효소, NADP-의존성 말산 효소, 디카르복실산 수송체 및 페로킬라타제인 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 대두 레그헤모글로빈은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 갖는 글로빈 및 화학식 1로 표시되는 헴으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
    Figure pct00006
  4. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 플라스미드는 서열번호 6으로 표시된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 제 2 플라스미드는 서열번호 8로 표시된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 ALA 합성효소는 서열번호 2로 표시된 염기서열을 갖는 로도박터 스패로이데스 (Rhodobacter sphaeroides) ALA 합성효소이고, 상기 NADP-의존성 말산 효소는 서열번호 3으로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 NADP-의존성 말산 효소이고, 상기 디카르복실산 수송체는 서열번호 4로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 디카르복실산 수송체이며, 상기 페로킬라타제는 서열번호 5로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 페로킬라타제인 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 생산균주 대장균을 배양하기 위해 숙신산을 사용하여 pH 7 내지 pH 9로 조정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법으로서,
    헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 3 플라스미드를 제작하는 단계;
    상기 제 3 플라스미드를 포함하는 제 2 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및
    상기 제 2 생산균주 대장균을 배양하여 상기 대두 레그헤모글로빈을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 헴 생합성 경로 효소는 ALA 합성효소, NADP-의존성 말산 효소, 디카르복실산 수송체 및 페로킬라타제인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 대두 레그헤모글로빈은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 갖는 글로빈 및 화학식 1로 표시되는 헴으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
    Figure pct00007
  11. 제 8항에 있어서, 상기 제 3 플라스미드는 서열번호 9로 표시된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제 8항에 있어서, 상기 ALA 합성효소는 서열번호 2로 표시된 염기서열을 갖는 로도박터 스패로이데스 ALA 합성효소이고, 상기 NADP-의존성 말산 효소는 서열번호 3으로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 NADP-의존성 말산 효소이고, 상기 디카르복실산 수송체는 서열번호 4로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 디카르복실산 수송체이며, 상기 페로킬라타제는 서열번호 5로 표시된 염기서열을 갖는 대장균 페로킬라타제인 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 제 2 생산균주 대장균을 배양하기 위해 숙신산을 사용하여 pH 7 내지 pH 9로 조정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 대두 레그헤모글로빈을 제조하는 방법으로서,
    글리신 맥스 레그헤모글로빈 LGB2에 대한 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 제작하는 단계;
    상기 제 2 플라스미드를 포함하는 제 3 생산균주 대장균을 제작하는 단계;
    상기 제 3 생산균주 대장균을 배양하여 글로빈을 생산하는 단계;
    미생물 발효 또는 화학적 합성에 의해 헴을 생산하는 단계; 및
    상기 글로빈 및 상기 헴을 커플링하여 상기 대두 레그헤모글로빈을 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 제 2 플라스미드는 서열번호 8로 표시된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 헴을 생산하는 단계는
    헴 생합성 경로 효소에 대한 유전자를 포함하는 제 1 플라스미드를 제작하는 단계;
    상기 제 1 플라스미드를 포함하는 제 4 생산균주 대장균을 제작하는 단계; 및
    상기 제 4 생산균주 대장균을 배양하여 상기 헴을 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 제 1 플라스미드는 서열번호 6으로 표시된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따라 제조된 대두 레그헤모글로빈을 포함하는 육류 풍미증진제 및/또는 철 보충제로서 유용한 조성물.
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