KR20230128512A - 동물 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 - Google Patents

Abstract

동물 미오글로빈 단백질을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분, 상기 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 작제물, 상기 유전자 작제물을 포함하는 숙주 세포 및 상기 미오글로빈 또는 상기 육류 대체물을 생산하는 방법이 본원에 기재되어 있다.

Description

동물 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물

본원에 기재된 양태 및 구현예는 미오글로빈 단백질을 포함하는 육류 대체물, 상기 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 작제물, 상기 유전자 작제물을 포함하는 숙주 세포 및 상기 미오글로빈 또는 상기 육류 대체물을 생산하는 방법 분야에 관한 것이다.

여러 육류 대체물이 이미 개발되어 상용화되었다. 이러한 제품의 풍미, 색상, 질감 및 영양적 품질은 "육류"를 적절하게 모방하지 않는다는 점에서 항상 최적인 것은 아니다. 게다가, 이러한 제품은 또한 육류와 동일한 영양적 품질을 가지고 있지 않을 수 있다.

따라서 육류 대체를 목표로 하는 기존 식료품의 단점을 모두 제거한 새로운 발명품이 여전히 필요하다.

따라서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 양태 및 구현예는 본원에 논의된 바와 같은 문제 및 요구 중 적어도 일부를 해결한다.

육류 대체물

제1 양태에서, 동물 미오글로빈, 바람직하게는 포유동물 미오글로빈, 더 바람직하게는 매머드, 돼지, 양 또는 소(더 바람직하게는 상기 매머드는 털 매머드(woolly mammoth)(Mammuthus primigenius, 맘무투스 프리미게니우스) 또는 대초원 매머드(steppe mammoth)(Mammuthus trogontherii, 맘무투스 트로곤테리)이고, 가장 바람직하게는 상기 매머드는 대초원 매머드임)로부터의 미오글로빈, 또는 조류(바람직하게는 닭) 미오글로빈, 또는 어류(바람직하게는 참치) 미오글로빈, 또는 이들로부터 유래된 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분이 제공된다.

일 구현예에서, 육류 대체물 또는 식품 성분은 매머드, 돼지, 양, 소, 닭 또는 참치로부터의 또는 이들로부터 유래된 동물 미오글로빈을 포함하고, 바람직하게는 상기 매머드는 털 매머드(Mammuthus primigenius) 또는 대초원 매머드(Mammuthus trogontherii)이고, 더 바람직하게는 상기 매머드는 대초원 매머드이다.

동물 미오글로빈은, 이의 아미노산 서열이 각각 적어도 하나의 아미노산의 첨가, 결실 및/또는 치환에 의해 매머드(바람직하게는 털 매머드, 또는 대초원 매머드), 돼지, 양, 소, 닭 또는 참치 중 하나로부터 유래될 때, 매머드(바람직하게는 털 매머드 또는 대초원 매머드, 더 바람직하게는 대초원 매머드임), 돼지, 양, 소, 닭 또는 참치 미오글로빈으로부터 유래되었다고 말할 수 있다. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산의 첨가, 결실 및/또는 치환도 또한 본 발명에 의해 고려된다. 털 매머드, 대초원 매머드, 돼지, 양, 소, 닭 또는 참치로부터의 미오글로빈 아미노산 서열의 예는 주어진 서열번호에 의해 이후에 개시되었다. 매머드, 털 매머드, 대초원 매머드, 돼지, 양, 소, 닭 또는 참치 미오글로빈에서 유래된 이러한 동물 미오글로빈은 또한 본원에서 이후에 설명되는 바와 같이 적어도 검출가능한 수준의 동물 미오글로빈 활성을 발휘할 수 있다. 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 매머드는 본 출원의 맥락에서 털 매머드(Mammuthus primigenius) 또는 대초원 매머드(Mammuthus trogontherii)와 같은 매머드(Mammuthus) 속의 임의의 종일 수 있다.

일 구현예에서, 육류 대체물 또는 식품 성분 내의 미오글로빈은 매머드의 것이거나 이로부터 유래된 것이다.

바람직한 구현예에서, 육류 대체물 또는 식품 성분 내의 미오글로빈은 털 매머드의 것이거나 이로부터 유래된 것이다.

바람직한 구현예에서, 육류 대체물 또는 식품 성분 내의 미오글로빈은 대초원 매머드의 것이거나 이로부터 유래된 것이다.

일 구현예에서, 육류 대체물 또는 식품 성분 내의 미오글로빈은 다음 아미노산 서열 중 하나로 표시된다:

- a) 서열번호 3과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고 다음 아미노산 조합 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열:

o 위치 30에서 F, 및/또는

o 위치 65에서 Q, 및/또는

o 위치 92에서 H, 및/또는

o 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

o 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H;

- b) 서열번호 2 또는 3과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 2 또는 3 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I, 위치 123에서 E 및/또는 위치 143에서 I;

- c) 서열번호 1과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 1 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I 및/또는 위치 123에서 E;

- d) 서열번호 4, 5 또는 6과 적어도 70%의 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 4, 5 또는 6 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 13에서 N, 위치 27에서 Q, 위치 31에서 I, 위치 67에서 N, 위치 128에서 A, 위치 133에서 S, 위치 145에서 A 및/또는 위치 150에서 L;

- e) 서열번호 7과 적어도 70%의 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 7 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 6에서 Q, 위치 10에서 Q, 위치 13에서 T, 위치 14에서 I, 위치 27에서 H, 위치 31에서 M, 위치 35에서 H, 위치 36에서 D, 위치 42에서 D, 위치 43에서 R, 위치 49에서 G, 위치 53에서 P, 위치 55에서 Q, 위치 58에서 G, 위치 67에서 A, 위치 72에서 Q, 위치 75에서 K, 위치 79에서 Q, 위치 82에서 N, 위치 85에서 S, 위치 93에서 T, 위치 111에서 V, 위치 116에서 I, 위치 117에서 A, 위치 118에서 E, 위치 121에서 A, 위치 128에서 S, 위치 133에서 K, 위치 145에서 S 및/또는 위치 150에서 F; 또는

- f) 서열번호 8과 적어도 70%의 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하는 아미노산 서열.

서열번호 1은 털 매머드 미오글로빈의 아미노산 서열의 일부를 나타내고, 서열번호 2는 털 매머드의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 3은 대초원 매머드 미오글로빈의 아미노산 서열을 나타내고, 서열번호 4는 양 미오글로빈의 아미노산 서열을 나타내고, 서열번호 5는 소(암소) 미오글로빈의 아미노산 서열을 나타내고, 서열번호 6은 돼지 미오글로빈의 아미노산 서열을 나타내고, 서열번호 7은 닭 미오글로빈의 아미노산 서열을 나타내고, 서열번호 8은 참치 미오글로빈의 아미노산 서열을 나타낸다. 털 매머드 미오글로빈의 아미노산 서열의 일부(즉, 부분 서열)를 나타내는 서열번호 1이 털 매머드의 미오글로빈의 (전체) 아미노산 서열을 나타내는 서열번호 2에 포함된다는 것은 명백하다. 서열번호 9는 서열번호 1을 코딩하는 핵산 서열이다. 서열번호 10은 서열번호 2를 코딩하는 핵산 서열이고, 서열번호 11은 서열번호 3을 코딩하는 핵산 서열이다. 서열번호 12는 서열번호 4를 코딩하는 핵산 서열이다. 서열번호 13은 서열번호 5를 코딩하는 핵산 서열이다. 서열번호 14는 서열번호 6을 코딩하는 핵산 서열이다. 서열번호 15는 서열번호 7을 코딩하는 핵산 서열이다. 서열번호 16은 서열번호 8을 코딩하는 핵산 서열이다.

육류 대체물은 정의에 따라 육류가 아니고 천연 육류가 아니며 진짜 육류가 아니다. 육류 대체물은 비-자연 발생 식품 또는 식용 제품으로 간주될 수 있다. 이는 본 발명의 맥락에서 육류 대체물이 돼지, 양, 소, 닭 또는 참치(또는 매머드가 여전히 존재하는 경우 매머드의 것이거나 이로부터 유래된 것(현실은 아님))의 육류이거나 이로부터 유래된 육류가 아님을 의미한다. 육류 대체물은 육류 모조품 또는 육류 유사 제품 또는 육류 같은 제품과 동의어이다.

육류 대체물은 육류와 동일한 양태(예를 들어, 패턴, 레터링), 형태, 구조, 조성(예를 들어, 유사한 지방, 단백질 및/또는 헴 철 함량), 질감, 색상, 풍미, 향 및/또는 외관을 가질 수 있다.

대안적으로, 이는 육류의 것과 구별되는 양태, 형태, 구조, 질감, 색상, 풍미, 향 및/또는 외관을 가질 수 있다.

육류 대체물은 액체, 고체, 반-고체 식료품으로 제형화될 수 있다.

액체 식료품의 적합한 예는 수프를 포함한다.

고체 식료품의 적합한 예는 세포-기반 육류 또는 배양 육류 또는 식물-기반 육류를 포함한다. 이러한 식물-기반 육류는 대두 단백질과 같은 식물 단백질을 포함할 수 있다. 또한 이들은 본원에 정의된 동물 미오글로빈을 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 동물 미오글로빈은 헴-함유 단백질의 유일한 공급원이다.

스낵의 적합한 예는 단백질 바 또는 단백질 쉐이크를 포함한다.

식품 성분은 구별되는 식용 제품을 얻기 위해 식용 제품에 첨가할 수 있는 임의의 식용 성분일 수 있다. 대안적으로, 식품 성분은 그 자체로 소비될 수 있다. "식품 성분"이라는 용어는 "식품 보충제"라는 용어로 대체될 수 있다.

상기에서 확인된 미오글로빈을 포함하는 식품 성분의 적합한 예는 고객에게 판매할 수 있는 고체(예를 들어, 분말, 향신료 혼합) 또는 액체(예를 들어, 추출물) 또는 반-액체 또는 반-고체(예를 들어, 페이스트 또는 젤 또는 소스 또는 국물 또는 크림) 식품 성분일 수 있다. 고객은 이러한 식품 성분을 자신의 식품에 첨가하여 여기에 포함된 미오글로빈으로 식품을 보충하여 자체 육류 대체물을 만들 수 있다.

고체 식품 보충제의 적합한 예는 상기에서 확인된 동물 미오글로빈을 포함하는 정제 또는 알약 또는 분말을 포함한다. 정제 또는 알약 또는 분말은 비타민 또는 미네랄과 같은 다른 화합물과 함께 제형화될 수 있다.

본 발명자들은 본원에 정의된 바와 같은 동물 미오글로빈을 사용하여 본 발명의 육류 대체물에서 "육류 경험"이 모방될 수 있음을 발견하였다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물은 육류의 양태(예를 들어, 패턴, 레터링), 형태, 구조, 조성(예를 들어, 유사한 지방, 단백질 및/또는 헴 철 함량), 풍미, 질감, 색상, 향, 외관 및/또는 영양가를 모방할 것으로 예상된다. 이는 육류 대체물이 세포-기반 육류 또는 배양 육류 또는 식물-기반 육류인 경우에 통상적이다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다. 육류 대체물은 육류의 모든 결점을 가지고 있지 않을 수 있다. 예를 들어, 육류 대체물은 육류보다 더 건강에 좋다. 게다가 육류 대체물이 환경에 미치는 영향(기후 변화에 대한 장기적 직접/간접적 영향)은 육류의 알려진 영향보다 덜 해로울 것으로 예상된다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물은 육류의 양태(예를 들어, 패턴, 레터링), 형태, 구조, 조성(예를 들어, 유사한 지방, 단백질 및/또는 헴 철 함량), 풍미, 질감, 색상, 향 및/또는 외관을 모방할 것으로 예상된다. 이는 육류 대체물이 세포-기반 육류 또는 배양 육류 또는 식물-기반 육류인 경우에 통상적이다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다. 육류 대체물은 육류의 모든 결점을 가지고 있지 않을 수 있다. 예를 들어, 육류 대체물은 육류보다 더 건강에 좋다. 게다가 육류 대체물이 환경에 미치는 영향(기후 변화에 대한 장기적 직접/간접적 영향)은 육류의 알려진 영향보다 덜 해로울 것으로 예상된다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물은 모든 결점 없이 육류의 조성(예를 들어, 유사한 지방, 단백질 및/또는 헴 철 함량), 풍미, 색상 및/또는 향을 모방할 것으로 예상된다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물은 모든 결점 없이 육류의 풍미 및/또는 향을 모방할 것으로 예상된다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물은 모든 결점 없이 육류의 풍미를 모방할 것으로 예상된다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물은 모든 결점 없이 육류의 향을 모방할 것으로 예상된다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다.

본 발명자들은 "육류 경험"이 본원에 기재된 바와 같은 식품 성분으로 모방될 수 있음을 추가로 발견하였다.

일 구현예에서, 본 발명의 식품 성분은 모든 결점없이 육류의 결점 풍미를 가지지 않으면서 육류의 조성(예를 들어, 유사한 지방, 단백질 및/또는 헴 철 함량), 풍미, 색상, 향 및/또는 영양가를 모방할 것으로 예상된다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다.

일 구현예에서, 본 발명의 식품 성분은 모든 결점없이 육류의 결점 풍미를 가지지 않으면서 육류의 조성(예를 들어, 유사한 지방, 단백질 및/또는 헴 철 함량), 풍미, 색상 및/또는 향을 모방할 것으로 예상된다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다.

일 구현예에서, 본 발명의 식품 성분은 모든 결점없이 육류의 결점 풍미를 가지지 않으면서 육류의 풍미, 색상 및/또는 향을 모방할 것으로 예상된다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다.

일 구현예에서, 본 발명의 식품 성분은 모든 결점없이 육류의 결점 풍미를 가지지 않으면서 육류의 조성(예를 들어, 유사한 지방, 단백질 및/또는 헴 철 함량), 풍미 및/또는 향을 모방할 것으로 예상된다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다.

일 구현예에서, 본 발명의 식품 성분은 모든 결점없이 육류의 결점 풍미를 가지지 않으면서 육류의 조성(예를 들어, 유사한 지방, 단백질 및/또는 헴 철 함량), 풍미를 모방할 것으로 예상된다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다.

일 구현예에서, 본 발명의 식품 성분은 모든 결점없이 육류의 결점 풍미를 가지지 않으면서 육류의 조성(예를 들어, 유사한 지방, 단백질 및/또는 헴 철 함량), 향을 모방할 것으로 예상된다. 이것은 주로 본원에 기재된 바와 같은 동물 미오글로빈의 존재 때문이다.

본 발명의 맥락 내에서, 육류 경험은 육류 대체물 및/또는 식품 성분이 인간이 인식할 수 있는 향 및/또는 풍미 화합물을 발생시키고 육류가 조리될 때 방출되는 일부 냄새 물질 및/또는 풍미 화합물의 특징을 생성할 때 모방될 수 있다. 예를 들어, 이러한 냄새 물질 중 일부의 형성은 미오글로빈에 존재하는 헴의 철에 의해 촉매화될 수 있다. 이 이론에 얽매이지 않고, 형성은 지질 산화 및/또는 마이야르 반응(Maillard reaction)으로 인한 것일 수 있다. 이러한 상황은 본 발명의 육류 대체물 및/또는 식품 성분의 미오글로빈으로 모방될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분, 바람직하게는 본 발명의 생 육류 대체물은 육류, 바람직하게는 생 육류의 피 및/또는 금속성 향을 모방할 것으로 예상된다. 바람직하게는, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분은 다른 육류 대체물 또는 식품 성분(즉, 본 발명에 따르지 않는 것)보다 더 높은 정도로 육류의 피 및/또는 금속성 향을 모방할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 생은 열처리되지 않은, 바람직하게는 조리되지 않고 굽지 않은 것을 의미한다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분, 바람직하게는 본 발명의 구운 육류 대체물은 육류, 특히 구운(grilled) 육류의 로스팅된(roasted) 향을 모방할 것으로 예상된다. 바람직하게는, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분은 다른 육류 대체물 또는 식품 성분(즉, 본 발명에 따르지 않는 것)보다 더 높은 정도로 육류의 로스팅된 향을 모방할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 구체적으로 이 섹션의 구현예에서, "다른 육류 대체물" 또는 "본 발명에 따르지 않는 육류 대체물"은 바람직하게는 재조합 대두 레그헤모글로빈(LegH)을 포함하는 식물-기반 버거, 더 바람직하게는 상업적으로 이용가능한 임파서블 버거(Impossible Burger)이다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분, 바람직하게는 본 발명의 구운 육류 대체물은 다른 육류 대체물 또는 식품 성분(즉, 본 발명에 따르지 않는 것)에 비해 (구운) 육류 대체물 또는 식품 성분으로부터 수득된 휘발성 화합물에서 더 높은 농도의 산화된 지질, 지질 산화 생성물, 피라진 및/또는 피롤을 특징으로 하는 향을 갖는다. 더 높다는 것은 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 300%를 의미한다. 바람직한 피라진은 메틸피라진, 2,5-디메틸피라진, 2-에틸-6-메틸피라진이다. 바람직한 피롤은 피롤이다. 바람직한 지질 산화 생성물은 2-메틸부탄알 및 3-메틸부탄알이다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분, 바람직하게는 본 발명의 구운 육류 대체물은 다른 육류 대체물 또는 식품 성분(즉, 본 발명에 따르지 않는 것)에 비해 (구운) 육류 대체물 또는 식품 성분으로부터 수득된 휘발성 화합물에서 더 높은 농도의 2,5-디메틸피라진을 특징으로 하는 향을 갖는다. 더 높다는 것은 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 300%를 의미한다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분, 바람직하게는 본 발명의 구운 육류 대체물은 다른 육류 대체물 또는 식품 성분(즉, 본 발명에 따르지 않는 것)에 비해 (구운) 육류 대체물 또는 식품 성분으로부터 수득된 휘발성 화합물에서 더 높은 농도의 2-에틸-6-메틸피라진을 특징으로 하는 향을 갖는다. 더 높다는 것은 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 300%를 의미한다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분, 바람직하게는 본 발명의 구운 육류 대체물은 다른 육류 대체물 또는 식품 성분(즉, 본 발명에 따르지 않는 것)에 비해 (구운) 육류 대체물 또는 식품 성분으로부터 수득된 휘발성 화합물에서 더 높은 농도의 피롤을 특징으로 하는 향을 갖는다. 더 높다는 것은 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 300%를 의미한다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분, 바람직하게는 본 발명의 구운 육류 대체물은 다른 육류 대체물 또는 식품 성분(즉, 본 발명에 따르지 않는 것)에 비해 (구운) 육류 대체물 또는 식품 성분으로부터 수득된 휘발성 화합물에서 더 높은 농도의 2-메틸부탄알을 특징으로 하는 향을 갖는다. 더 높다는 것은 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 300%를 의미한다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분, 바람직하게는 본 발명의 구운 육류 대체물은 다른 육류 대체물 또는 식품 성분(즉, 본 발명에 따르지 않는 것)에 비해 (구운) 육류 대체물 또는 식품 성분으로부터 수득된 휘발성 화합물에서 더 높은 농도의 3-메틸부탄알을 특징으로 하는 향을 갖는다. 더 높다는 것은 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 300%를 의미한다.

실시예 2.5에서, 본 발명에 따른 육류 대체물의 향 분석이 제공된다. 육류 및 육류 대체물의 향 및 휘발성 화합물의 농도는 이 실시예에 기재된 방법, 즉 휘발성 화합물의 질량 분석법과 커플링된 기체 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 맥락 내에서, 육류 대체물의 색상이 육류의 색상과 유사할 때 육류 경험을 모방할 수 있다. 육류의 색상은 헴-함유 단백질의 농도 및/또는 육류의 산화 상태에 따라 결정된다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같은 미오글로빈은 육류 대체물의 색상을 정의할 것이다. 본원에서 발명된 식품 성분에 대해서도 마찬가지이다.

일 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분, 바람직하게는 본 발명의 생 육류 대체물은 육류, 바람직하게는 생 육류의 색상을 모방할 것으로 예상된다. 이 이론에 얽매이지 않고, 육류 대체물의 색상은 주로 동물 미오글로빈의 존재 때문이다. 바람직하게는, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분은 다른 육류 대체물 또는 식품 성분(즉, 본 발명에 따르지 않는 것)보다 더 높은 정도로 육류의 색상을 모방할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분, 바람직하게는 본 발명의 생 육류 대체물의 색상은 본질적으로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 동안, 바람직하게는 4℃에서 일정한 빛 하에 보관시, 더 바람직하게는 실시예 2.4의 기법을 통해 측정되는 조건 하에서 안정하다. 바람직하게는, 본 발명의 육류 대체물 또는 식품 성분의 색상은 육류 또는 다른 육류 대체물 또는 식품 성분(즉, 본 발명에 따르지 않는 것)의 색상이 안정한 시간보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 더 장기간 안정하고, 더 바람직하게는 0%에서 10%까지의 ΔE 변화가 안정한 것으로 정의된다(추가 참조). 적어도 X일 동안 본질적으로 안정하다는 것은 바람직하게는 0일과 X일 사이에 0% 내지 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 10.5%, 11%, 11.5%, 12%, 12.5%, 13%, 13.5%, 14%, 14.5%, 15%, 15.5%, 16%, 16.5%, 17%, 17.5%, 18%, 18.5%, 19%, 19.5%, 또는 20% 사이의 육류 대체물 또는 식품 성분의 ΔE 변화를 의미하고, 여기서 ΔE는 실시예 2.4에서 결정된 바와 같다. 가장 바람직하게는, 육류 대체물 또는 식품 성분의 ΔE는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 동안 저장시 10%를 넘게 변하지 않는다.

실시예 2.4는 본 발명에 따른 육류 대체물의 색상 안정성 분석을 제공한다. 육류 및 육류 대체물의 색상 및 색상 안정성은 이 실시예에 기재된 방법으로 결정될 수 있다.

본 발명의 맥락 내에서, 육류 대체물의 조성이 육류 조성과 유사할 때 육류 경험이 모방될 수 있다. 육류 대체물의 조성은 동일하거나 유사한 성분이 존재할 때 및 선택적으로 이들이 존재하는 양이 육류에 존재하는 양과 동일하거나 유사할 때 육류 조성과 유사한 것으로 보일 수 있다. 예를 들어 유사한 지방, 단백질 및/또는 헴 철 함량이 육류와 마찬가지로 육류 대체물에도 존재할 수 있다.

이러한 동물 미오글로빈은 또한, 육류 대체물이나 식품 성분으로 제형화될 때 육류와 거의 동일한 양의 총 이용가능한 철분 또는 헴 철을 제공할 것으로 예상된다. 이 문맥에서 "대략"은 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 이상을 의미한다. 일반적으로 본 발명의 육류 대체물에서 총 생체이용가능한 철 또는 헴 철의 양은 실제 육류에서 총 생체이용가능한 철 또는 헴 철의 120% 이하이다. 이는 이러한 동물 미오글로빈이 인구의 철분 상태를 개선하기 위한 독특한 대체 강화제로 간주될 수 있음을 의미한다. 이러한 동물 미오글로빈은 또한 식물-기반 육류 유사 제품에서 제공되는 총 생체이용가능한 철 또는 헴 철의 양보다 대략 더 높은 양의 총 생체이용가능한 철 또는 헴 철을 제공할 것으로 예상된다. 이 맥락에서 "더 높은"은 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% 이상을 의미한다.

바람직한 정의에서 영양가는 총 이용가능한 철 또는 헴 철의 양을 의미한다. 이러한 바람직한 정의에 따르면, "육류의 영양가를 모방하는 것"은 위에서 개괄한 바와 같이 "육류와 거의 동일한 양의 총 이용가능한 철분 또는 헴 철을 제공하는 것"으로 해석되어야 한다.

실시예 2.6은 철의 생체이용률을 평가하는 본 발명에 따른 육류 대체물의 영양 분석을 제공한다.

본 발명의 맥락에서, 총 철분은 육류 대체물에서 생체이용가능한 철분의 총량이다. 헴 철은 헴 도메인을 포함하는 단백질에 의해 운반되는 철의 일부이다. 헴 철은 인체에 의해 흡수가 가능하다. 이러한 단백질은 본원에 정의된 바와 같은 미오글로빈이다. 철의 가용성은 문헌[Proulx A.K., et al (2006)., J. Agric. Food. Chem., (54), 1518-1522]에 기재된 바와 같이 및/또는 실시예 2.6의 방법에 따라 평가될 수 있다. 간단히 말해서, 제제의 페리틴 농도는 먼저 세포 단백질 농도로 정규화된다. 이어서, 정규화된 페리틴의 백분율을 FeSO₄의 백분율과 비교하고 상대 생물학적 값(RBV)으로 표시한다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 대두 식물의 뿌리 혹에서 공생하는 박테리아에 의해 생산된 레그헤모글로빈을 포함하지 않고/않거나 유일한 헴-함유 단백질로서 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 동물 미오글로빈을 포함한다.

일 구현예에서, 본원에 개시된 동물 미오글로빈은 본 발명의 육류 대체물에 존재하는 헴-함유 단백질의 유일한 공급원일 수 있다. 이는 본 발명의 육류 대체물이 본원에 개시된 바와 같은 동물 미오글로빈 이외의 다른 단백질을 포함할 수 있음을 의미한다. 존재할 수 있는 단백질의 예는 대두 단백질을 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 정의된 바와 같은 헴-함유 단백질은 헴 모이어티에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합할 수 있는 모든 단백질 또는 단백질 서브유닛을 지칭할 수 있다. 헴-함유 폴리펩티드는 산소를 운반하거나 저장할 수 있다. 헴-함유 단백질의 일부 예는 글로빈, 헤모글로빈, 레그헤모글로빈을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 육류 대체물은 대두 식물의 뿌리 혹에서 공생하는 박테리아에 의해 생성된 레그헤모글로빈을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 육류 대체물은 공생 헤모글로빈을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 육류 대체물은 레그헤모글로빈을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 육류 대체물은 대두 식물의 뿌리 혹에서 공생하는 박테리아에 의해 생산된 단백질을 포함하지 않는다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 대두 식물의 뿌리 혹에서 공생하는 박테리아에 의해 생성된 레그헤모글로빈을 포함하지 않고 유일한 헴-함유 단백질로서 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 동물 미오글로빈을 포함한다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 상대 진짜 육류와 유사한 양의 동물 미오글로빈을 포함한다. 일 구현예에서 이러한 양은 0.1 내지 5 중량%의 동물 미오글로빈 범위이다. 일 구현예에서, 양은 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 중량% 또는 그 이상의 동물 미오글로빈이다. 제품의 최종 중량의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%의 양을 갖는 것도 또한 본 발명에 포함된다. 당업자는 육류 대체물에 따라 그 양이 달라질 수 있음을 알고 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 육류 대체물에서 미오글로빈의 중량 백분율은 0.1%에서 최대 5%, 4.9%, 4.8%, 4.7%, 4.6%, 4.5%, 4.4%, 4.3%, 4.2%, 4.1%, 4%, 3.9%, 3.8%, 3.7%, 3.6%, 3.5%, 3.4%, 3.3%, 3.2%, 3.1%, 3%, 2.95%, 2.9%, 2.85%, 2.8%, 2.75%, 2.7%, 2.65%, 2.6%, 2.55%, 2.5%, 2.45%, 2.4%, 2.35%, 2.3%, 2.25%, 2.2%, 2.15%, 2.1%, 2.05%, 2%, 1.95%, 1.9%, 1.85%, 1.8%, 1.75%, 1.7%, 1.65%, 1.6%, 1.55%, 1.5%, 1.45%, 1.4%, 1.35%, 1.3%, 1.25%, 1.2%, 1.15%, 1.1%, 1.05%, 1%, 0.95%, 0.9%, 0.85%, 0.8%, 0.75%, 0.7%, 0.65%, 0.6%, 0.55%, 또는 0.5%이다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 육류 대체물에서 미오글로빈의 중량 백분율은 0.5%에서 최대 5%, 4.9%, 4.8%, 4.7%, 4.6%, 4.5%, 4.4%, 4.3%, 4.2%, 4.1%, 4%, 3.9%, 3.8%, 3.7%, 3.6%, 3.5%, 3.4%, 3.3%, 3.2%, 3.1%, 3%, 2.95%, 2.9%, 2.85%, 2.8%, 2.75%, 2.7%, 2.65%, 2.6%, 2.55%, 2.5%, 2.45%, 2.4%, 2.35%, 2.3%, 2.25%, 2.2%, 2.15%, 2.1%, 2.05%, 2%, 1.95%, 1.9%, 1.85%, 1.8%, 1.75%, 1.7%, 1.65%, 1.6%, 1.55%, 1.5%, 1.45%, 1.4%, 1.35%, 1.3%, 1.25%, 1.2%, 1.15%, 1.1%, 1.05%, 1%, 0.95%, 0.9%, 0.85%, 0.8%, 0.75%, 0.7%, 0.65%, 또는 0.6%이다.

일 구현예에서, 식품 성분은 0.1 내지 100 중량% 동물 미오글로빈 범위일 수 있는 양의 동물 미오글로빈을 포함한다. 구현예에서, 양은 제품 최종 중량의 적어도 0.1%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%이다. 당업자는 식품 성분에 따라 그 양이 달라질 수 있음을 알고 있다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 10%에서 40%까지의 단백질 공급원, 5%에서 30%까지의 지질 공급원, 0.1%에서 5%까지의 NaCl, 0.1%에서 5%까지의 섬유 공급원, 및 0.1%에서 5%까지의 본 발명에 따른 미오글로빈을 포함하거나 이들을 혼합함으로써 제조된다. 더 바람직한 구현예에서, 육류 대체물은 20%에서 30%까지의 단백질 공급원, 10%에서 20%까지의 지질 공급원, 0.5%에서 2%까지의 NaCl, 0.5%에서 1.5%까지의 섬유 공급원, 및 0.1%에서 3%까지의 본 발명에 따른 미오글로빈을 포함하거나 이들을 혼합함으로써 제조된다.

바람직하게는, 단백질 공급원은 조직화된 대두 단백질, 완두콩 단백질 분리물, 녹두 단백질, 조직화된 밀 단백질, 쌀 단백질 또는 감자 단백질이다. 이와 관련하여, 조직화된 대두 단백질은 당업자에게 명백한 바와 같이 조직화된 식물성 단백질(TVP) 또는 대두 육류로도 알려진 탈지된 대두 가루 제품이다.

바람직하게는, 지질 공급원은 해바라기유, 코코넛유, 카놀라유 또는 코코아 버터이다.

바람직하게는, 섬유 공급원은 메틸셀룰로오스 또는 감자 전분이다.

더 바람직한 구현예에서, 육류 대체물은 20%에서 30%까지의 조직화된 대두 단백질, 10%에서 20%까지의 해바라기유, 0.5%에서 2%까지의 NaCl, 0.5에서 1.5%까지의 메틸셀룰로스 및 0.1%에서 10%까지의 본 발명에 따른 미오글로빈을 포함하거나 이들을 혼합함으로써 제조된다. 훨씬 더 바람직하게는, 더 바람직한 구현예에 따른 육류 대체물에서 미오글로빈의 중량 백분율은 0.1%에서 5%, 4.9%, 4.8%, 4.7%, 4.6%, 4.5%, 4.4%, 4.3%, 4.2%, 4.1%, 4%, 3.9%, 3.8%, 3.7%, 3.6%, 3.5%, 3.4%, 3.3%, 3.2%, 3.1%, 3%, 2.95%, 2.9%, 2.85%, 2.8%, 2.75%, 2.7%, 2.65%, 2.6%, 2.55%, 2.5%, 2.45%, 2.4%, 2.35%, 2.3%, 2.25%, 2.2%, 2.15%, 2.1%, 2.05%, 2%, 1.95%, 1.9%, 1.85%, 1.8%, 1.75%, 1.7%, 1.65%, 1.6%, 1.55%, 1.5%, 1.45%, 1.4%, 1.35%, 1.3%, 1.25%, 1.2%, 1.15%, 1.1%, 1.05%, 1%, 0.95%, 0.9%, 0.85%, 0.8%, 0.75%, 0.7%, 0.65%, 0.6%, 0.55%, 또는 0.5%까지이다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 20%에서 30%까지의 조직화된 대두 단백질, 10%에서 20%까지의 해바라기유, 1%에서 2%까지의 NaCl, 0.5%에서 1.5%까지의 메틸셀룰로오스, 50%에서 70%까지의 물 및 0.2%에서 0.8%까지의 미오글로빈을 포함하거나 이들을 혼합함으로써 제조된다.

바람직한 구현예에서, 육류 대체물은 23%에서 27%까지의 조직화된 대두 단백질, 13%에서 17%까지의 해바라기유, 1.25%에서 1.75%까지의 NaCl, 0.75%에서 1.25%까지의 메틸셀룰로오스, 55%에서 60%까지의 물 및 0.45%에서 0.55%까지의 미오글로빈을 포함하거나 이들을 혼합함으로써 제조된다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 25% 조직화된 대두 단백질, 15% 해바라기유, 1.5% NaCl, 1.0% 메틸셀룰로오스, 57% 물 및 0.5% 미오글로빈을 포함하거나 이들을 혼합하여 제조되며, 여기서 이러한 중량 백분율은 두 자리 유효 숫자로 반올림된다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 15%에서 35%까지의 조직화된 대두 단백질, 10%에서 20%까지의 해바라기유, 0.5%에서 2.5%까지의 NaCl, 0.5%에서 1.5%까지의 메틸셀룰로오스, 50%에서 70%까지의 물 및 0.5%에서 1.5%까지의 미오글로빈을 포함하거나 이들을 혼합함으로써 제조된다.

바람직한 구현예에서, 육류 대체물은 22%에서 27%까지의 조직화된 대두 단백질, 13%에서 17%까지의 해바라기유, 1.25%에서 1.75%까지의 NaCl, 0.75%에서 1.25%까지의 메틸셀룰로오스, 50%에서 60%까지의 물 및 0.75%에서 1.25%까지의 미오글로빈을 포함하거나 이들을 혼합함으로써 제조된다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 25% 조직화된 대두 단백질, 15% 해바라기유, 1.5% NaCl, 1.0% 메틸셀룰로스, 57% 물 및 1.0% 미오글로빈을 포함하거나 이들을 혼합하여 제조되며, 여기서 이러한 중량 백분율은 두 자리 유효 숫자로 반올림된다.

상기 육류 대체물에서 %는 중량 백분율을 지칭한다. 육류 대체물의 조성을 기재하는 중량 백분율의 합이 100%가 되지 않는 한 해당 백분율에 물을 첨가하는 것으로 가정한다.

실시예 1.4는 본 발명에 따른 육류 대체물의 제조 실시예를 제공한다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 상대 진짜 육류와 유사한 양의 생체이용가능한 철 또는 헴 철을 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 양은 100 g 육류 대체물 당 0.3 내지 20 mg 생체이용가능한 철 또는 헴 철의 범위이다. 일 구현예에서 이러한 양은 육류 대체물 100 g 당 0.1 mg 내지 16.5 mg, 16.17 mg, 15.84 mg, 15.51 mg, 15.18 mg, 14.85 mg, 14.52 mg, 14.19 mg, 13.86 mg, 13.53 mg, 13.2 mg, 12.87 mg, 12.54 mg, 12.21 mg, 11.88 mg, 11.55 mg, 11.22 mg, 10.89 mg, 10.56 mg, 10.23 mg, 9.9 mg, 9.735 mg, 9.57 mg, 9.405 mg, 9.24 mg, 9.075 mg, 8.91 mg, 8.745 mg, 8.58 mg, 8.415 mg, 8.25 mg, 8.085 mg, 7.92 mg, 7.755 mg, 7.59 mg, 7.425 mg, 7.26 mg, 7.095 mg, 6.93 mg, 6.765 mg, 6.6 mg, 6.435 mg, 6.27 mg, 6.105 mg, 5.94 mg, 5.775 mg, 5.61 mg, 5.445 mg, 5.28 mg, 5.115 mg, 4.95 mg, 4.785 mg, 4.62 mg, 4.455 mg, 4.29 mg, 4.125 mg, 3.96 mg, 3.795 mg, 3.63 mg, 3.465 mg, 3.3 mg, 3.135 mg, 2.97 mg, 2.805 mg, 2.64 mg, 2.475 mg, 2.31 mg, 2.145 mg, 1.98 mg, 1.815 mg 또는 1.65 mg의 생체이용가능한 철 또는 헴 철의 범위이다. 또 다른 구현예에서 이러한 양은 육류 대체물 100 g 당 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11.8, 11.9, 12, 12.1, 12.2, 12.3, 12.4, 12.5, 12.6, 12.7, 12.8, 12.9, 13, 13.1, 13.2, 13.3, 13.4, 13.5, 13.6, 13.7, 13.8, 13.9, 14, 14.1, 14.2, 14.3, 14.4, 14.5, 14.6, 14.7, 14.8, 14.9, 15, 15.1, 15.2, 15.3, 15.4, 15.5, 15.6, 15.7, 15.8, 15.9, 16, 16.1, 16.2, 16.3, 16.4, 16.5, 16.6, 16.7, 16.8, 16.9, 17, 17.1, 17.2, 17.3, 17.4, 17.5, 17.6, 17.7, 17.8, 17.9, 18, 18.1, 18.2, 18.3, 18.4, 18.5, 18.6, 18.7, 18.8, 18.9, 19, 19.1, 19.2, 19.3, 19.4, 19.5, 19.6, 19.7, 19.8, 19.9, 또는 20 mg 생체이용가능한 철 또는 헴 철이다.

일 구현예에서, 본원에서 앞서 확인된 동물 미오글로빈의 아미노산 서열은 하기 아미노산 조합 중 적어도 하나와 조합하여 본원에서 앞서 확인된 각 서열과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다:

- 위치 30에서 F, 및/또는

- 위치 65에서 Q, 및/또는

- 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F, 위치 65에서 Q, 위치 92에서 H, 위치 94에서 H.

일 구현예에서, 본원에서 앞서 확인된 동물 미오글로빈의 아미노산 서열은 확인된 각 서열에 대해 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여, 바람직하게는 추가로 위치 143에서 I와 조합하여 본원에서 앞서 확인된 서열과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 본원에서 앞서 확인된 동물 미오글로빈의 아미노산 서열은 확인된 각 서열에 대해 위치 65에서 Q 또는 H, 위치 92에서 Q 및 위치 94에서 H와 조합하여, 바람직하게는 추가로 위치 143에서 I와 조합하여 본원에서 앞서 확인된 서열과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 본원에서 앞서 확인된 동물 미오글로빈의 아미노산 서열은 확인된 각 서열에 대해 위치 65에서 Q 또는 H, 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H와 조합하여, 바람직하게는 추가로 위치 143에서 I와 조합하여 본원에서 앞서 확인된 서열과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 본원에서 앞서 확인된 동물 미오글로빈의 아미노산 서열은 확인된 각 서열에 대해 위치 92에서 H, 바람직하게는 추가로 위치 143에서 I와 조합하여 본원에서 앞서 확인된 서열과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 1과 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 1 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I 및/또는 위치 123에서 E. 일 구현예에서, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 2 또는 3과 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 2 또는 3 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I, 위치 123에서 E 및/또는 위치 143에서 I. 바람직하게는, 확인된 동물 미오글로빈의 아미노산 서열은 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 1, 2 또는 3과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다. 서열번호 1은 매머드로부터의 미오블로빈의 일부이다. 서열번호 2 및 3은 매머드로부터의 미오글로빈이다. 일 구현예에서, 육류 대체물은 아미노산 서열 서열번호 1을 포함하는 미오글로빈을 포함한다. 일 구현예에서, 육류 대체물은 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열로 표시되는 매머드 미오글로빈을 포함한다. 이 미오글로빈이 특히 낮은 pH에서 산화에 대해 안정하기 때문에 이러한 미오글로빈은 매력적인 특성을 가질 것으로 예상된다. 매머드 미오글로빈이 산화에 저항하기 때문에, 본 발명의 육류 대체물의 색상은 안정할 것으로 예상된다. 산화에 대한 이러한 안정성은 또한 진짜 육류보다 발암성 생성물로 전환될 가능성이 적기 때문에 본 발명의 육류 대체물에 추가적인 건강 특성을 제공한다.

일 구현예에서, 위치 65에서 Q 또는 H, 위치 92에서 Q 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 2와 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 2 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I 및/또는 위치 123에서 E. 바람직하게는, 확인된 동물 미오글로빈의 아미노산 서열은 위치 65에서 Q 또는 H, 위치 92에서 Q 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 2와 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다. 서열번호 2는 털 매머드로부터의 미오블로빈이다. 일 구현예에서, 육류 대체물은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 털 매머드 미오글로빈을 포함한다. 이 미오글로빈이 특히 낮은 pH에서 산화에 대해 안정하기 때문에, 이러한 미오글로빈은 매력적인 특성을 가질 것으로 예상된다. 털 매머드 미오글로빈이 산화에 저항하기 때문에, 본 발명의 육류 대체물의 색상은 안정할 것으로 예상된다. 산화에 대한 이러한 안정성은 또한 진짜 육류보다 발암성 생성물로 전환될 가능성이 적기 때문에 본 발명의 육류 대체물에 추가적인 건강 특성을 제공한다.

일 구현예에서, 위치 65에서 Q 또는 H, 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 3 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I 및/또는 위치 123에서 E. 바람직하게는, 확인된 동물 미오글로빈의 아미노산 서열은 위치 65에서 Q 또는 H, 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다. 서열번호 3은 대초원 매머드로부터의 미오블로빈이다. 일 구현예에서, 육류 대체물은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 대초원 매머드 미오글로빈을 포함한다. 이 미오글로빈이 특히 낮은 pH에서 산화에 대해 안정하기 때문에, 이러한 미오글로빈은 매력적인 특성을 가질 것으로 예상된다. 대초원 매머드 미오글로빈이 산화에 저항하기 때문에, 본 발명의 육류 대체물의 색상은 안정할 것으로 예상된다. 산화에 대한 이러한 안정성은 또한 진짜 육류보다 발암성 생성물로 전환될 가능성이 적기 때문에, 본 발명의 육류 대체물에 추가적인 건강 특성을 제공한다.

일 구현예에서, 위치 30에서 F와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 65에서 Q와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 92에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 30에서 F 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.

일 구현예에서, 육류 대체물은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 대초원 매머드 미오글로빈을 포함한다. 이러한 미오글로빈은 특히 낮은 pH에서 산화에 대해 안정하기 때문에 매력적인 특성을 가질 것으로 예상된다. 매머드 미오글로빈이 산화에 저항하기 때문에 본 발명의 육류 대체물의 색상은 안정할 것으로 예상된다. 진짜 육류 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 대초원 매머드 미오글로빈을 포함하지 않는 대체 육류보다 발암성 제품으로 전환될 가능성이 적기 때문에, 산화에 대한 이러한 안정성은 또한 본 발명의 육류 대체물에 추가적인 건강 특성을 제공한다. 실시예 2.4는 본 발명에 따른 대초원 매머드 미오글로빈 및 대초원 매머드 미오글로빈을 포함하는 본 발명에 따른 육류 대체물의 색상 분석을 제공한다. 게다가, 실시예 2.5는 육류 대체물의 향 분석을 제공하는 반면, 실시예 2.6은 철의 생체이용률을 평가하는 미오글로빈의 영양 분석을 제공한다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 β-카세인, κ-카세인, α-S1-카세인, α-S2-카세인, α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토페린 및 트랜스페린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 우유 단백질을 포함하지 않으며, 여기서 상기 우유 단백질은 털 매머드의 것이다. 또 다른 구현예에서, 육류 대체물은 β-카세인, κ-카세인, α-S1-카세인, α-S2-카세인, α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토페린 및 트랜스페린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 우유 단백질을 포함하지 않으며, 여기서 상기 우유 단백질은 매머드의 것이다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 β-카세인, κ-카세인, α-S1-카세인, α-S2-카세인, α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토페린 및 트랜스페린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 우유 단백질을 포함하지 않으며, 여기서 상기 우유 단백질은 포유동물 또는 포유동물 세포에 의해 생성되지 않았다.

더 바람직한 구현예에서, 육류 대체물은 β-카세인, κ-카세인, α-S1-카세인, α-S2-카세인, α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토페린 또는 트랜스페린과 같은 우유 단백질을 포함하지 않으며, 여기서 우유 단백질은 털 매머드의 것이다. 또 다른 더 바람직한 구현예에서, 육류 대체물은 β-카세인, κ-카세인, α-S1-카세인, α-S2-카세인, α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토페린 또는 트랜스페린과 같은 우유 단백질을 포함하지 않으며, 여기서 상기 우유 단백질은 매머드의 것이다.

또 다른 더 바람직한 구현예에서, β-카세인, κ-카세인, α-S1-카세인, α-S2-카세인, α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토페린 또는 트랜스페린과 같은 우유 단백질을 포함하지 않으며, 여기서 상기 우유 단백질은 단백질은 포유동물 또는 포유동물 세포에 의해 생성되지 않았다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 털 매머드로부터의 κ-카제인을 포함하지 않는다. 추가 구현예에서, 육류 대체물은 서열번호 17과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열로 표시되는 단백질을 포함하지 않는다. 추가 구현예에서, 육류 대체물은 서열번호 17로 표시되는 단백질을 포함하지 않는다.

일 구현예에서, 육류 대체물은 털 매머드로부터의 β-카제인을 포함하지 않는다. 추가 구현예에서, 육류 대체물은 서열번호 18과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열로 표시되는 단백질을 포함하지 않는다. 추가 구현예에서, 육류 대체물은 서열번호 18로 표시되는 단백질을 포함하지 않는다.

육류

제2 양태에서, 동물 미오글로빈, 바람직하게는 포유동물 미오글로빈, 더 바람직하게는 매머드, 돼지, 양 또는 소(더 바람직하게는 상기 매머드는 털 매머드(Mammuthus primigenius) 또는 대초원 매머드(Mammuthus trogontherii)이고, 바람직하게는 대초원 매머드임)로부터의 미오글로빈, 또는 조류(바람직하게는 닭) 미오글로빈, 또는 어류(바람직하게는 참치) 미오글로빈, 또는 이들로부터 유래된 미오글로빈을 포함하는 육류 제품이 제공되며; 여기서 상기 동물 미오글로빈은 상기 육류 제품이 유래된 동물 또는 그 안에 포함된 임의의 세포에 의해 생성되지 않았다. 즉, 육류 제품은 동물에서 유래하지만 해당 동물에서 생성되지 않은 미오글로빈을 포함한다.

일 구현예에서, 외인성 미오글로빈, 바람직하게는 외인성 동물 미오글로빈, 더 바람직하게는 매머드, 돼지, 양 또는 소(더 바람직하게는 상기 매머드는 털 매머드(Mammuthus primigenius) 또는 대초원 매머드(Mammuthus trogontherii)이고, 바람직하게는 대초원 매머드임)로부터의 미오글로빈, 또는 조류(바람직하게는 닭) 미오글로빈, 또는 어류(바람직하게는 참치) 미오글로빈을 포함하는 육류 제품이 제공된다. 본원에서, 외인성 미오글로빈은 상기 육류에 내인성으로 존재하지 않는 미오글로빈으로 정의된다.

일 구현예에서, 상기 구현예에서 육류 제품 내의 미오글로빈은 다음 아미노산 서열 중 하나로 표시된다:

- a) 서열번호 3과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고 다음 아미노산 조합 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열:

o 위치 30에서 F, 및/또는

o 위치 65에서 Q, 및/또는

o 위치 92에서 H, 및/또는

o 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

o 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H;

- b) 서열번호 2 또는 3과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 2 또는 3 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I, 위치 123에서 E 및/또는 위치 143에서 I;

- c) 서열번호 1과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 1 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I 및/또는 위치 123에서 E;

- d) 서열번호 4, 5 또는 6과 적어도 70%의 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 4, 5 또는 6 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 13에서 N, 위치 27에서 Q, 위치 31에서 I, 위치 67에서 N, 위치 128에서 A, 위치 133에서 S, 위치 145에서 A 및/또는 위치 150에서 L;

- e) 서열번호 7과 적어도 70%의 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 7 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 6에서 Q, 위치 10에서 Q, 위치 13에서 T, 위치 14에서 I, 위치 27에서 H, 위치 31에서 M, 위치 35에서 H, 위치 36에서 D, 위치 42에서 D, 위치 43에서 R, 위치 49에서 G, 위치 53에서 P, 위치 55에서 Q, 위치 58에서 G, 위치 67에서 A, 위치 72에서 Q, 위치 75에서 K, 위치 79에서 Q, 위치 82에서 N, 위치 85에서 S, 위치 93에서 T, 위치 111에서 V, 위치 116에서 I, 위치 117에서 A, 위치 118에서 E, 위치 121에서 A, 위치 128에서 S, 위치 133에서 K, 위치 145에서 S 및/또는 위치 150에서 F; 또는

- f) 서열번호 8과 적어도 70%의 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하는 아미노산 서열.

일 구현예에서 미오글로빈을 포함하는 육류 제품이 제공되며, 여기서 상기 육류 제품 내의 미오글로빈 농도는 상기 육류 제품이 유래된 육류의 평균 미오글로빈 농도보다 높다. 본원에서, 미오글로빈 농도는 모든 미오글로빈 변이체의 총 농도로 해석되어야 한다. 상기 육류 제품이 유래된 육류의 미오글로빈의 평균 농도는 수확 후 외인성 미오글로빈이 첨가되지 않은 상기 육류의 미오글로빈의 평균 농도를 여러 상응하는 동물에 대해 결정한 것을 의미한다.

미오글로빈

제3 양태에서, 본 발명은 서열번호 3을 포함하는 서열로 표시될 수 있는 단백질을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 서열번호 3을 포함하는 서열로 표시될 수 있는 단백질이 제공되며, 상기 서열은 길이가 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 또는 300개 아미노산 잔기이다.

바람직한 구현예에서, 서열번호 3으로 이루어진 서열 및 서열번호 3의 N-말단에 있는 말단 서열로 표시될 수 있는 단백질이 제공된다. 바람직하게는, 상기 말단 서열은 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개 아미노산 잔기이다.

대안적인 구현예에서, 서열번호 3으로 이루어진 서열 및 서열번호 3의 C-말단에 있는 말단 서열로 표시될 수 있는 단백질이 제공된다. 바람직하게는, 상기 말단 서열은 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개 아미노산 잔기이다.

바람직한 구현예에서, 서열번호 3 및 태그를 포함하거나 이로 이루어진 서열로 표시될 수 있는 단백질이 제공되며, 바람직하게는 상기 태그는 폴리-히스티딘 태그이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 미오글로빈을 제공하며, 여기서 상기 미오글로빈은 대초원 매머드의 것이고, 바람직하게는 상기 미오글로빈은 서열번호 3으로 표시될 수 있다. 미오글로빈은 상기 기재된 바와 같이 육류 대체물, 식품 성분 또는 육류 제품에 사용하기 위한 것일 수 있다.

실시예 2.2에서는 서열번호 3으로 표시되는 미오글로빈의 구조적 특성을 조사한다. 구체적으로, 서열번호 3은 놀랍게도 다른 미오글로빈과 비교하여 더 높은 양의 표면 전하에 해당하는 것으로 나타난다. 따라서 이 이론에 얽매이지 않고, 서열번호 3으로 표시되는 미오글로빈은 증가된 안정성 및 감소된 응집 경향을 특징으로 할 수 있다. 이는 상기 기재된 바와 같이 육류 대체물, 식품 성분 또는 육류 제품에서 이러한 미오글로빈을 사용하는 데 유리할 것이다.

본 발명은 상기 기재된 바와 같은 제3 양태에 따른 단백질을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.

핵산

제4 양태에서, 본 발명은 핵산을 제공하며, 여기서 상기 핵산은 서열번호 3으로 표시될 수 있는 단백질을 인코딩하는 하위서열을 포함하는 서열로 표시될 수 있으며, 바람직하게는 상기 하위서열은 서열번호 11로 표시될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 서열번호 3으로 표시될 수 있는 단백질을 인코딩하는 하위서열을 포함하는 서열로 표시될 수 있는 핵산이 제공되며, 바람직하게는 상기 하위서열은 서열번호 11로 표시될 수 있으며, 여기서 상기 핵산은 길이가 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 또는 600개 염기이다.

바람직한 구현예에서, 서열번호 3으로 표시될 수 있는 단백질을 인코딩하는 하위서열을 포함하는 서열로 표시될 수 있는 핵산이 제공되며, 바람직하게는 상기 하위서열은 서열번호 11 및 상기 하위서열의 5' 단부에 있는 말단 서열로 표시될 수 있다. 바람직하게는, 상기 하위서열은 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개 염기이다.

바람직한 구현예에서, 서열번호 3으로 표시될 수 있는 단백질을 인코딩하는 하위서열을 포함하는 서열로 표시될 수 있는 핵산이 제공되며, 바람직하게는 상기 하위서열은 서열번호 11 및 상기 하위서열의 3' 단부에 있는 말단 서열로 표시될 수 있다. 바람직하게는, 상기 하위서열은 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개 염기이다.

바람직한 실시예에서, 핵산이 제공되며, 여기서 상기 핵산은 대초원 매머드로부터의 미오글로빈을 인코딩하며, 바람직하게는 상기 미오글로빈은 서열번호 3으로 표시될 수 있고, 가장 바람직하게는 상기 핵산은 서열번호 11로 표시될 수 있다.

본 발명은 상기 기재된 바와 같은 제4 양태에 따른 핵산을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.

유전자 작제물

제5 양태에서, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 미오글로빈을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 작제물이 제공된다.

본원에 기재된 바와 같은 "유전자 작제물"은 본 개시 내용을 고려하여 당업자가 이해하는 바와 같은 통상적이고 보통의 의미를 갖는다. "유전자 작제물"은 또한 "발현 카세트" 또는 "발현 작제물"로 불릴 수 있으며, 이의 발현을 제어하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 또는 유전자 군을 지칭한다. 본 출원의 "일반 정보"라는 제목의 부분은 "유전자 작제물"에 대한 더 상세한 내용을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "작동 가능하게 연결된"은 본 출원의 "일반 정보"라는 제목의 부분에서 추가로 기재된다.

동물 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 임의의 동물 미오글로빈 유전자 또는 동물 미오글로빈 코딩 서열, 바람직하게는 매머드, 돼지, 양, 소, 닭 또는 참치로부터의 동물 미오글로빈 유전자 또는 동물 미오글로빈 코딩 서열로부터 유래될 수 있거나; 또는 돌연변이된 동물 미오글로빈 유전자 또는 동물 미오글로빈 코딩 서열, 바람직하게는 매머드, 돼지, 양, 소, 닭 또는 참치로부터의 돌연변이된 동물 미오글로빈 유전자 또는 동물 미오글로빈 코딩 서열로부터 유래된다.

따라서, 일부 구현예에서, 동물 미오글로빈을 인코딩하는 바람직한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고 본원에서 앞서 확인된 위치에서(즉, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여) 각각의 아미노산을 갖는 아미노산 서열에 의해 표시되는 폴리펩티드를 인코딩한다. 선택적인 아미노산 위치도 또한 고려될 수 있다.

일부 구현예에서, 동물 미오글로빈을 인코딩하는 바람직한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성 또는 유사성을 갖고 다음 아미노산 조합 중 적어도 하나를 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열에 의해 표시되는 폴리펩티드를 인코딩한다:

- 위치 30에서 F, 및/또는

- 위치 65에서 Q, 및/또는

- 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 유전자 작제물에 존재하는 동물 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는다.

"동일성" 또는 "서열 동일성" 및 "유사성" 또는 "서열 유사성"에 대한 설명은 "일반 정보"라는 제목의 섹션에서 제공되었다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 작제물이 제공되며, 여기서 동물 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(a) 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열에 의해 표시되는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열. 선택적인 아미노산 위치가 또한 고려될 수 있다.

(b) 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열.

(c) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 (b)의 뉴클레오티드 서열의 서열과 다른 뉴클레오티드 서열.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 작제물이 제공되며, 여기서 동물 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(a) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고 다음 아미노산 조합 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열에 의해 표시되는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열:

- 위치 30에서 F, 및/또는

- 위치 65에서 Q, 및/또는

- 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H.

(b) 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열.

(c) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 (b)의 뉴클레오티드 서열의 서열과 다른 뉴클레오티드 서열.

본원에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되거나 본원에 기재된 동물 미오글로빈으로부터 유래된 동물 미오글로빈은 당업자에게 알려진 바와 같이 적어도 검출가능한 수준의 동물 미오글로빈 활성을 발휘한다.

동물 미오글로빈의 활성은 헴 도메인을 통해 철분을 운반하는 것일 수 있다. 이 활성은, 예를 들어 본원에서 앞서 정의된 바와 같이 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 작제물이 제공되며, 여기서 동물 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 19, 20, 21, 22, 23 및 24로부터 선택된다.

본원에서, 서열번호 19는 서열번호 3으로 표시되는 대초원 매머드 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 서열번호 20은 서열번호 4로 표시되는 양 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 서열번호 21은 서열번호 5로 표시되는 소 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드서열을 나타내고, 서열번호 22는 서열번호 6으로 표시되는 돼지 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 서열번호 23은 서열번호 7로 표시되는 닭 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 서열번호 24는 서열번호 8로 표시되는 참치 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내며, 여기서 이들 뉴클레오티드 서열은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(Komagataella phaffii, 코마가타엘라 파피이)에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 코돈 최적화는 실시예 2.1에 상세히 설명되어 있다.

일부 구현예에서, 유전자 작제물은 조절 영역을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 유전자 작제물은 프로모터를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 유전자 작제물은 프로모터, 종결자 및 선택적으로 신호 펩티드를 포함한다. 유전자 작제물은 또한 마커를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 신호 펩티드는 바람직하게는 발현된 미오글로빈의 배설을 촉진한다. 당업자는 사용되는 숙주 세포에 따라 조절 영역 및 마커의 동일성이 최적화되어야 할 것이라는 것을 알고 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 작제물이 제공되며, 여기서 유전자 작제물은 서열번호 25, 26, 27, 28, 29 또는 30으로 표시된다.

본 명세서에서, 서열번호 25 내지 30은 각각 서열번호 19 내지 24로 표시되는 대초원 매머드 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 메이팅 인자 알파의 신호 펩티드를 포함하는 피치아 파스토리스(Komagataella phaffii)에서 발현을 위해 코돈 최적화된 유전자 작제물을 나타낸다. 즉, 서열번호 25 내지 30은 각각의 대초원 매머드, 양, 소, 돼지, 닭 및 참치 미오글로빈 발현을 위한 유전자 작제물에 상응한다. 코돈 최적화는 실시예 2.1에 상세히 설명되어 있다.

예를 들어, 박테리아(바람직하게는 이. 콜라이(E. coli))가 숙주 세포로 사용되는 경우, 다음 조절 영역이 사용될 수 있다. 박테리아에서 사용하기에 적합한 프로모터는 rrnB 리보솜 RNA 오페론으로부터의 lac, trp, tac, T7(실시예에서 사용됨), phoA, ara, xapA, cad, recA, spc, bla, P1 및 P2이고, 파지 λ로부터의 P^L 프로모터이다. 박테리아에서 사용하기에 적합한 종결자는 rrnB 리보솜 RNA 오페론으로부터의 lac, trp, tac, T7(실시예에서 사용됨), phoA, ara, xapA, cad, recA, spc, bla, P1 및 P2이고, 파지λ로부터의 P^L 종결자이다. 사용되는 바람직한 프로모터는 T7 프로모터이고/이거나 바람직한 종결자는 T7 종결자이다. 배설을 위한 바람직한 신호 펩티드는 이. 콜라이 Sec-인식 펩티드(SecA), 이. 콜라이 Tet-인식 펩티드, 이. 콜라이 dsbA, 이. 콜라이 phoA, 이. 콜라이 pelB, 이. 콜라이 MBP(말토스 결합 단백질)이다. 이. 콜라이에 적합한 마커는 암피실린이다. 대안적으로 원래의 전사 조절 요소를 포함하여 이. 콜라이 균주 K12로부터의 proBA 오페론을 사용하여 항생제 없이 선택을 용이하게 할 수 있다.

또 다른 예에서, 효모가 숙주 세포로 사용되는 경우, 다음 조절 영역이 사용될 수 있다. 효모에 사용하기에 적합한 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 적합한 구성적 프로모터의 예는 FBA1, TPI1, PGK1, PYK1, TDH3, ENO2, HXK2, PGI1, PFK1, PFK2, GPM1 유전자로부터 선택되는 당분해 프로모터 또는 TEF2 유전자의 비-당분해 프로모터를 포함한다.

효모에 사용되는 적합한 프로모터는 유도성일 수 있다. 효모가 피치아인 경우, 메탄올 유도성 프로모터 AOX1이 바람직하다. 그렇지 않으면 효모가 에스. 세레비시애인 경우 GAL1 프로모터(갈락토스-유도성)가 사용될 수 있다. 프로모터가 숙주 세포로서 효모에 대해 유도될 수 있는 언급된 유전자는 또한 동일한 효모에 대한 종결자를 유도하는 데 사용될 수 있다. 피치아(및 사카로미세스)의 배설을 위한 바람직한 신호 펩티드는 에스. 세레비시애 알파 메이팅 인자 분비전(pre-secretion), 분비후(pro-secretion) 신호 펩티드, S. 세레비시애 Ost1 신호 펩티드, S. 세레비시애 Aga2 신호 펩티드 및 이들의 융합체를 포함한다.

실시예 2.1은 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 미오글로빈을 인코딩하는 유전자 작제물의 합성을 기재한다. 이 실시예에서 AOX1은 피치아 파스토리스 균주 GS115의 발현에 사용된다.

또 다른 실시예에서 사상균을 숙주세포로 사용하는 경우, 다음과 같은 조절영역이 사용될 수 있다. 다음 프로모터가 사용될 수 있다: 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 글루코아밀라아제 프로모터(glaA), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 알코올 탈수소효소 프로모터(alcA) 또는 아스페르길루스 오리제 타카-아밀라아제(Aspergillus oryzae taka-amylase) A 프로모터(amyB), 아스페르길루스 니거 알코올 탈수소효소 프로모터(adhA), 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei) 피루베이트 키나아제 프로모터(pki) 또는 아스페르길루스 니둘라스(Aspergillus nidulas) 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 프로모터(gpdA). 프로모터가 숙주 세포로서 사상균에 대해 유래될 수 있는 언급된 유전자는 또한 동일한 사상균에 대한 종결자를 유도하는 데 사용될 수 있다. 사상균, 바람직하게는 아스페르길루스에 대한 배설을 위한 바람직한 신호 펩티드는 아스페르길루스 니거 글루코아밀라아제 신호 펩티드(glaA), 아스페르길루스 니거 α-갈락토시다아제 신호 펩티드(AglB) 및 트리코데르마 레세이 셀로바이오하이드롤라아제 I(CbhI)를 포함한다.

아스페르길루스(더 바람직하게는 아스페르길루스 니거)에 대한 바람직한 프로모터 및 종결자는 아스페르길루스 니거의 글루코아밀라아제 프로모터 및 글루코아밀라아제 종결자이다.

발현 벡터

본원에 기재된 유전자 작제물은 발현 벡터에 배치될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서 임의의 이전 구현예에 기재된 바와 같은 유전자 작제물을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.

"발현 벡터"에 대한 설명은 "일반 정보"라는 제목의 섹션에서 제공되었다.

조성물

추가 양태에서, 선택적으로 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 유전자 작제물 및/또는 상기 기재된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.

숙주 세포

추가 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 유전자 작제물을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다.

원핵생물은 박테리아일 수 있다. 박테리아는 다음 목록으로부터 선택되는 그람 양성/그람 음성 박테리아일 수 있다: 압시디아(Absidia), 아크로모박터(Achromobacter), 아시네토박터(Acinetobacter), 에어리바실러스(Aeribacillus), 아뉴리니바실러스(Aneurinibacillus), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아에로모나스(Aeromonas), 알칼리게네스(Alcaligenes), 아트로박터(Arthrobacter), 아르조아쿠스(Arzoarcus), 아조모마스(Azomonas), 아조스피릴룸(Azospirillum), 아조박터(Azotobacter), 바실러스(Bacillus), 베이제린키아(Beijerinckia), 브라디리조비움(Bradyrhizobium), 브레비바실스(Brevibacills), 부르크홀데리아(Burkholderia), 비소클라미스(Byssochlamys), 시트로박터(Citrobacter), 클로스트리듐(Clostridium), 코마모나스(Comamonas), 큐프리아비두스(Cupriavidus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 데이노코쿠스(Deinococcus), 에스케리치아( Escherichia ), 엔테로박터(Enterobacter), 플라보박테리움(Flavobacterium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 고시피움(Gossypium), 클레브시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 리스테리아(Listeria), 메가스파에라(Megasphaera), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 마이코박테리움(Mycobacterium), 노르카디아(Norcadia), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 랄스토니아(Ralstonia), 리조비움(Rhizobium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로도코쿠스(Rodococcus), 로즈부리아(Roseburia), 쉬와넬라(Shewanella), 스트렙토마이세테스(Streptomycetes), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia), 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 락토코쿠스(Lactococcus), 지모모나스(Zymomonas), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 살모넬라(Salmonella), 스핑고모나스(Sphingomonas), 스핑고비움(Sphingobium), 노보스핑고비움(Novosphingobium), 브루셀라(Brucella) 및 마이크로실라(Microscilla).

바람직한 박테리아는 에어리바실러스 팔리더스(Aeribacillus pallidus), 아뉴리니바실러스 테라노벤시스(Aneurinibacillus terranovensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아규란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus), 브레비바실러스 테르모루버(Brevibacillus thermoruber), 브레비바실러스 파나시후미(Brevibacillus panacihumi), 큐프리아비두스 바실렌시스(Cupriavidus basilensis), 지. 이라우스토필루스(G. lraustophilus), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus) CB 15, 메틸로박테리움 엑스토르퀴앤스(Methylobacterium extorquens), 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 슈도모나스 제아잔티니파시엔스(Pseudomonas zeaxanthinifaciens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 파라코쿠스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans), 에스케리치아 콜라이( Escherichia coli ), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 스타필로코쿠스 카르노서스(Staphylococcus carnosus), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 시노리조비움 멜리오티(Sinorhizobium melioti), 스핑고비움(Sphingobium) 종, 노바스핑고비움(Novosphingobium) 종, 스핑고모나스 헨수이엔시스(Sphingomonas henshuiensis), 및 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter)를 포함한다. 바람직한 박테리아는 에스케리치아 콜라이이다.

바람직한 에스케리치아 콜라이 균주는 58, 679, WG1, DH5α, TG1, TOP10, K12(실시예에서 사용됨), BL21, BL21 DE3, XL1-블루, XL10-골드, TB1, REG-12, W945, HB101, DH1, DP50, AB284, JC9387, AG1, C600, 카발리(Cavalli) Hfr, Y10을 포함한다.

진핵생물은 효모 또는 사상균일 수 있다.

바람직한 효모는 사카로마이세스( Saccharomyces ), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 피치아( Pichia ), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 클로에케라(Kloeckera), 슈반니오마이세스(Schwanniomyces), 야로위아(Yarrowia), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 데바로마이세스(Debaromyces), 사카로마이세콥시스(Saccharomycecopsis), 사카로마이코데스(Saccharomycodes), 위커하미아(Wickerhamia), 데바요미세스(Debayomyces), 한세니아스포라(Hanseniaspora), 오가테아(Ogataea), 쿠라이시아(Kuraishia), 코마가타엘라(Komagataella), 메치니코비아(Metschnikowia), 윌리옵시스(Williopsis), 나카자와에아(Nakazawaea), 토룰라스포라(Torulaspora), 불레라(Bullera), 로도토룰라(Rhodotorula), 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces)를 포함한다. 효모 내에서, 종 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 세레비시애( Saccharomyces cerevisiae ), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)(Ogataea henricii(오가테아 헨리키이)로도 공지됨), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 및 피치아 파스토리스(Komagataella phaffii(코마가타엘라 파피이)로도 공지됨)가 바람직하다.

바람직한 피치아 균주는 다음 목록으로부터 선택된다: Bg09, Bg10, Bg11, Bg12(예시됨), Bg20, Bg21, Bg22, Bg23, Bg24, Bg25, Bg26, Bg40, Bg43, Bg44, Bg45, Y-11430, X-33, GS115, KM71, SMD1168, SMD1165, MC100-3, 가장 바람직한 Bg10 및 유도체.

실시예 2.3에서, 피치아 파스토리스 균주 GS115(his4)가 숙주 세포로 사용된다.

바람직한 사카로마이세스 균주는 다음 목록으로부터 선택된다: S288C, CEN.PK 계열, CBS 2354, ATCC 2360, ATCC 4098, ATCC 4124, ATCC 4126, ATCC 4127, ATCC 4921, ATCC 7754, ATCC 9763, ATCC 20598, ATCC 24855, ATCC 24858, ATCC 24860, ATCC 26422, ATCC 46523, ATCC 56069, ATCC 60222, ATCC 60223, ATCC 60493, ATCC 66348, ATCC 66349, ATCC 96581.

바람직한 효모는 피치아 균주, 더 바람직하게는 피치아 파스토리스이다.

사상균은 다음 목록으로부터 선택된다: 아크레모늄(Acremonium), 아가리쿠스(Agaricus), 아스페르길루스( Aspergillus ), 오레오바시디움(Aureobasidium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코프리누스(Coprinus), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 필리바시디움(Filibasidium), 푸사리움(Fusarium), 후미콜라(Humicola), 마그나포르테(Magnaporthe), 무코르(Mucor), 마이셀리오프소라(Myceliophthora), 네오칼리나스틱스(Neocallinastix), 뉴로스포라(Neurospora), 패실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 피로마이세스(Piromyces), 파네로캐테(Panerochaete), 플루로투스(Pleurotus), 스키조필룸(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 우스틸라고(Ustilago) 및 트리코더마(Trichoderma).

바람직한 사상균은 다음 목록으로부터 선택된다: 아스페르길루스 니거( Aspergillus niger ), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 바덴시스(Aspergillus vadensis), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum), 페니실리움 루벤스(Penicillium rubens), 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum), 페니실리움 서브루베센스(Penicillium subrubescens), 라삼소니아 에머소니이(Rasamsonia emersonii), 탈라로마이세스 에머소니이(Talaromyces emersonii), 아크레모니움 크리소게눔(Acremonium chrysogenum), 트리코더마 리세이, 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae) 및 크리소스포라움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense).

사상균의 바람직한 균주는 다음 목록으로부터 선택된다: 아스페르길루스 니거 CBS 513.88, N593, CBS 120.49(실시예에서 사용됨), N402, ATCC 1015 아스페르길루스 오라자에 ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC 14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, 아스페르길루스 바덴시스 CBS 113365, CBS 102787, IMI 142717, IBT 24658, CBS 113226, 페니실리움 크리소게눔 CBS 455.95, 페니실리움 시트리눔 ATCC 38065, 페니실리움 크리소게눔 P2, 위스콘신 54-1255, 페니실리움 서브루베센스 CBS 132785, FBCC 1632, 탈라로마이세스 에머소니이 CBS 393.64, 아크레모니움 크리소게눔 ATCC 36225 또는 ATCC 48272, 트리코더마 리세이 ATCC 26921 또는 ATCC56765 또는 ATCC 26921, 아스페르길루스 소재 ATCC11906, 크리소스포라움 루크노웬스 ATCC44006.

바람직한 구현예에서, 아스페르길루스는 사상균으로 사용된다. 더 바람직하게는 아스페르길루스 니거 균주를 사용한다.

방법

본 발명의 숙주 세포는 미오글로빈의 생산에 유용하다. 일부 구현예에서, 미오글로빈은 매머드, 바람직하게는 털 매머드 또는 대초원 매머드의 것이다. 일부 구현예에서, 미오글로빈은 돼지의 것이다. 일부 구현예에서, 미오글로빈은 양의 것이다. 일부 구현예에서, 미오글로빈은 소의 것이다. 일부 구현예에서, 미오글로빈은 닭의 것이다. 일부 구현예에서, 미오글로빈은 참치의 것이다. 따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 미오글로빈의 생산 방법을 제공한다. 선택적으로, 생성된 미오글로빈은 본원의 다른 곳에서 정의된 바와 같은 신호 펩티드를 포함하지 않는다.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 매머드로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 1과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 1과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고, 선택적으로 서열번호 1 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산 방법을 제공한다: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I 및/또는 위치 123에서 E.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 털 매머드로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 2와 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H, 위치 92에서 Q 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 2와 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 2 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산 방법을 제공한다: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I, 위치 123에서 E 및/또는 위치 143에서 I.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 대초원 매머드로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 3과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H, 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 3 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산 방법을 제공한다: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I, 위치 123에서 E 및/또는 위치 143에서 I.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 대초원 매머드로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 3과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 다음 아미노산 조합 중 적어도 하나와 조합된 서열번호 3과 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈의 생산 방법을 제공한다:

- 위치 30에서 F, 및/또는

- 위치 65에서 Q, 및/또는

- 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 양으로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 4와 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 4와 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 4 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산 방법을 제공한다: 위치 13에서 N, 위치 27에서 Q, 위치 31에서 I, 위치 67에서 N, 위치 128에서 A, 위치 133에서 S, 위치 145에서 A 및/또는 위치 150에서 L.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 소로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 5와 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 5와 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 5 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산 방법을 제공한다: 위치 13에서 N, 위치 27에서 Q, 위치 31에서 I, 위치 67에서 N, 위치 128에서 A, 위치 133에서 S, 위치 145에서 A 및/또는 위치 150에서 L.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 돼지로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 6과 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 6과 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 6 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산 방법을 제공한다: 위치 13에서 N, 위치 27에서 Q, 위치 31에서 I, 위치 67에서 N, 위치 128에서 A, 위치 133에서 S, 위치 145에서 A 및/또는 위치 150에서 L.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 닭으로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 7과 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 7과 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 7 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산 방법을 제공한다: 위치 6에서 Q, 위치 10에서 Q, 위치 13에서 T, 위치 14에서 I, 위치 27에서 H, 위치 31에서 M, 위치 35에서 H, 위치 36에서 D, 위치 42에서 D, 위치 43에서 R, 위치 49에서 G, 위치 53에서 P, 위치 55에서 Q, 위치 58에서 G, 위치 67에서 A, 위치 72에서 Q, 위치 75에서 K, 위치 79에서 Q, 위치 82에서 N, 위치 85에서 S, 위치 93에서 T, 위치 111에서 V, 위치 116에서 I, 위치 117에서 A, 위치 118에서 E, 위치 121에서 A, 위치 128에서 S, 위치 133에서 K, 위치 145에서 S 및/또는 위치 150에서 F.

일 구현예에서, 본 발명은 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 참치로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 8과 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 8과 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈의 생산 방법을 제공한다.

이 양태의 특징은 바람직하게는 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같다. 이 방법은 이하 대안적으로 본 발명에 따른 방법으로 지칭될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 사용하기에 적합한 세포 배양 방법은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 문헌[van't Riet, K. and Tramper, J., 1st edition, Basic Bioreactor Design, CRC Press, NY, 1991]에 논의되어 있다. 이러한 방법은 액체 배지에서의 액중 발효, 액체 배지 상에서의 표면 발효 및 고체-상태 발효를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포 배양은, 예를 들어 실험실 및/또는 산업 환경에서 미세-역가 플레이트, 진탕-플라스크, 소규모 벤치탑 생물반응기, 중규모 생물반응기 및/또는 대규모 생물 반응기에서의 배양에 의해 수행될 수 있다. 적합한 세포 배양 모드는 연속식, 회분식 및/또는 유가식 발효 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 세포 배양은 연속 발효를 사용하여 수행된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양은 회분식 발효를 사용하여 수행된다. 더 바람직한 구현예에서, 세포 배양은 유가식 발효를 사용하여 수행된다.

본 발명과 관련하여, 이하 "성장 배지"로 대안적으로 지칭되는 "배양 배지"는 배양된 세포가 존재하지 않는 경우 뿐만 아니라 배양된 세포가 배양 배지에 존재하는 경우를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. "배양액"은 배양된 세포가 존재하는 배양 배지를 지칭한다. "배양 상청액"은 배양된 세포가 없는 배양 배지를 지칭한다. "무세포 추출물"은 세포 파편을 포함하지 않는 세포 용해물을 지칭한다. 본 발명의 방법의 일부로서 세포 배양은 당업자에게 알려진 도입된 미오글로빈의 생산에 도움이 되는 조건 하에서 수행될 수 있다. 이러한 조건은 배양 배지의 화학적 조성 뿐만 아니라 배양 기간, 온도, 배양액 및/또는 헤드스페이스의 O₂ 수준, 배양액 및/또는 헤드스페이스의 CO₂ 수준, pH, 이온 강도, 교반 속도, 정수압 등을 포함한 다른 방법 매개변수에 의존한다. 세포 배양은 당업계에 알려진 절차를 사용하여 탄소 및 질소 공급원과 같은 적합한 영양소 및 무기염 및 비타민과 같은 추가 화합물을 포함하는 배양 배지를 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bennett, W. and Lasure, L., 1^st edition, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991] 참조). 적합한 성장 배지는 상업적 공급업체로부터 입수가능하거나 각각의 숙주에 적합한 공개된 조성물을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들어, Centraalbureau Voor Schimmelcultures collection(CBS) 또는 American Type Culture Collection(ATCC)의 카탈로그).

성장 배지의 정확한 조성 및 배양 방법 매개변수의 값은 본 발명의 중요한 특징이 아니다. 숙주 세포의 성장 및 도입된 미오글로빈의 생성을 가능하게 하는 한, 임의의 성장 배지 조성물이 고려될 수 있다. 성장 배지는 통상적으로 배양 세포의 성장에 사용되는 탄소 공급원을 포함할 것이다. 당업자는 적합한 탄소 공급원이 성장 배지에 외부적으로 첨가될 수 있거나 상기 배지에 이미 존재할 수 있음을 이해한다. 탄소 공급원은 개별적으로 또는 여러 탄소 공급원의 혼합물로 존재하거나 첨가될 수 있다. 당업계에 알려진 적합한 탄소 공급원의 예는 글루코스, 말토스, 수크로스, 자일로스, 아라비노스와 같은 단순당, 말토덱스트린과 같은 복합당, 가수분해 전분, 전분, 당밀 및 2세대 공급원료를 포함한다. 2세대 공급 원료는 탄소 배설량이 적기 때문에 특히 매력적일 수 있다. 2세대 공급원료는 통상적으로 리그노셀룰로스 물질을 포함할 것이다. 이러한 물질은 임의의 리그노셀룰로오스 및/또는 헤미셀룰로오스-기반 물질을 포함한다. 이러한 물질은 농업, 산업 또는 도시, 바람직하게는 농업 폐기물 스트림에서 공급될 수 있다. 적합한 물질의 예는 (농업) 바이오매스, 상업용 유기물, 도시 고형 폐기물, 폐지 및 정원 폐기물과 같은 버진 바이오매스, 또는 비-버진 바이오매스를 포함한다. 바이오매스의 일반적인 형태는 나무, 관목 및 목초지, 밀, 밀짚, 사탕수수 버개스, 스위치그래스, 참억새, 옥수수, 옥수숫대, 옥수수 속대, 유채 줄기, 대두 줄기, 단 옥수수, 옥수수 알갱이, 곡물 제분(습식 제분 및 건식 제분 포함), 예를 들어 옥수수, 밀, 보리의 생성물 및 부산물(종종 "겨 또는 섬유질"로 지칭됨), 및 도시 고형물을 포함한다. 바이오매스는 또한 잔디, 농업 잔류물, 임업 잔류물, 도시 고형 폐기물, 폐지, 펄프 및 제지 공장 잔류물일 수 있다. 농업 바이오매스는 가지, 관목, 토우, 옥수수 및 옥수수 짚, 에너지 작물, 숲, 과일, 꽃, 곡물, 목초지, 초본 작물, 잎, 나무껍질, 침엽수잎, 통나무, 뿌리, 어린 나무, 단기 회전 목본 작물, 관목, 스위치 허브, 나무, 채소, 과일, 덩굴, 사탕무 펄프, 밀 심지, 귀리 껍질, 단단하고 부드러운 목재(독성 목재 제외), 농업 및 임업 활동을 포함한 농업 과정에서 발생하는 유기 폐기물, 특히 임업 목재 폐기물을 포함한다. 농업용 바이오매스는 전술한 것 중 임의의 단독, 또는 이들의 조합 또는 혼합물일 수 있다. 유기산, 알데하이드, 케톤, 에스테르 및 알코올과 같은 탄소 공급원도 또한 고려될 수 있다. 다수의 상이한 탄소 공급원의 조합을 포함하는 성장 배지의 사용이 또한 본 발명의 방법에서 고려될 수 있다. 이러한 배지는 비제한적인 예로서 유기산과 같은 보다 산화된 탄소 공급원을 알코올과 같은 보다 환원된 탄소 공급원과 배합할 수 있다. 당업계에 알려진 적합한 질소 공급원의 예는 대두박, 옥수수 침지액, 효모 추출물, 유장 단백질, 계란 단백질, 카제인 가수분해물, 우레아, 암모니아, 암모늄염 및 질산염을 포함한다. 당업계에 알려진 추가적인 적합한 화합물의 예는 인산염, 황산염, 마그네슘과 같은 금속, 미량 원소 및 비타민을 포함한다. 정확한 성장 배지 요구 사항은 숙주 세포, 예를 들어 효모, 박테리아 및 사상균 사이에서 다양하며, 상기 요건은 당업자에게 알려져 있을 것이다. 따라서, 성장 배지는 완전(풍부) 배지 또는 최소 배지, 즉 배양되는 숙주 세포에 따라 성장에 절대적으로 필요한 성분만을 포함하는 배지일 수 있다.

성장 배지의 조성과 유사하게, 방법 매개변수에는 숙주 세포의 성장과 도입된 미오글로빈의 생산을 허용하는 한 임의의 값이 할당될 수 있다. 통성적으로, 상기 값은 배양되고 있는 숙주 세포에 기초하여 상이할 것이고 당업자에게 알려져 있을 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 산소-제한 또는 호기성 방법이며, 이는 세포 배양이 산소-제한 또는 호기성 조건 하에서 수행됨을 의미하고, 더 바람직하게는 방법은 산소-제한적이다. 마이크로-호기성 조건으로도 알려진 산소-제한 조건은 산소 소비가 산소의 가용성에 의해 제한되는 배양 조건이다. 산소 제한 정도는 사용되는 발효 장비의 실제 혼합/물질 전달 특성뿐만 아니라 유입되는 가스 흐름의 양과 조성에 의해 결정된다. 바람직하게는, 액체 배양에서 산소-제한 조건 하에서, 산소 소모율은 적어도 약 5.5 mmol/L/h, 더 바람직하게는 적어도 약 6 mmol/L/h, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 7 mmol/L/h이다. 호기성 조건은 산소 소비가 산소의 가용성에 의해 제한되지 않는 배양 조건이다.

세포 배양은 세포에 최적인 온도 값, 통상적으로 16 내지 42℃의 온도 범위에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 온도는 20 내지 40℃, 더 바람직하게는 25 내지 38℃, 가장 바람직하게는 28 내지 36℃의 범위이다. 일부 가장 바람직한 구현예에서, 약 30 또는 36℃의 온도 값이 사용된다.

세포 배양은 세포에 최적인 pH 값에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 pH 값은 약 pH 2.5, 약 pH 3.0, 약 pH 3.5, 약 pH 4.0, 약 pH 4.5, 약 pH 5, 약 pH 5.5, 약 pH 6, 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 약 pH 8.5, 약 pH 9이다. 바람직한 구현예에서, pH는 약 pH 3.0 내지 약 pH 9, 더 바람직하게는 약 pH 3.5 내지 pH 7의 범위이다. 일부 가장 바람직한 구현예에서, 약 6의 pH 값이 사용된다.

세포 배양은 세포에 최적인 배양 배지의 이온 강도 값, 통상적으로 50 mM 내지 2 M의 범위에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지의 이온 강도는 75 mM 내지 1 M, 더 바람직하게는 100 mM 내지 750 mM의 범위이다. 일부 가장 바람직한 구현예에서, 약 100 mM의 이온 강도 값이 사용된다.

세포 배양은 14, 13.5, 13, 12.5, 12, 11.5, 11, 10.5, 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5 또는 1일의 기간 동안 수행될 수 있으며, 여기서 상기 기간은 20%만큼 편차가 있을 수 있다. 바람직하게는 세포 배양은 14, 13.5, 13, 12.5, 12, 11.5, 11, 10.5, 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5 또는 1일의 기간 동안 수행되고, 여기서 상기 기간은 10%만큼 편차가 있을 수 있다. 더 바람직하게는 세포 배양은 5일 동안 수행되며, 상기 기간은 20%만큼, 가장 바람직하게는 10%만큼 편차가 있을 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 통상적으로 적어도 100 mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L, 400 mg/L, 500 mg/L, 600 mg/L, 700 mg/L, 800 mg/L, 900 mg/L, 1 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 11 g/L, 12 g/L, 13 g/L, 14 g/L, 15 g/L, 16 g/L, 17 g/L,18 g/L, 19 g/L, 20 g/L, 21 g/L, 22 g/L, 23 g/L, 24 g/L, 25 g/L, 50 g/L, 75 g/L, 100 g/L, 200 g/L 또는 300 g/L의 미오글로빈 생산을 초래할 것이다.

본 발명에 따른 방법에서, 통상적으로 성장 배지에서 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%, 바람직하게는 적어도 20%, 더 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 60%의 탄소 공급원이 미오글로빈으로 전환될 것이다.

세포 배양은 또한 다단계, 바람직하게는 2단계 배양 방법의 구현에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미오글로빈의 생산 단계 이전에 세포 바이오매스 성장 단계가 선행할 수 있으며, 여기서는 제한된 생산만 발생하거나 생산이 일어나지 않는다. 상이한 단계는 각 단계의 목표 및/또는 배양된 세포에 따라 상이한 배양 모드 및/또는 상이한 성장 배지 및/또는 상이한 배양 방법 매개변수 값을 사용하여 수행될 수 있다. 생산 단계 동안 바이오매스는 활발하게 성장할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.

본 발명의 방법과 관련하여, 숙주 세포 및/또는 미오글로빈은 선택적으로 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 세포 내에 존재하는 경우, 미오글로빈은 선택적으로 회수된 세포 바이오매스로부터 회수될 수 있다. 선택적으로, 회수된 미오글로빈은 정제된다. 바람직하게는, 미오글로빈의 정제는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 순도, 가장 바람직하게는 실질적으로 순수한 미오글로빈을 생성할 것이다.

일 구현예에서, 숙주 세포는 본 발명에 따른 방법에서 세포외적으로 미오글로빈을 생산한다. 본 구현예에 따른 방법에서, 미오글로빈은 숙주 세포에서 합성된 후 숙주 세포 밖으로 운반된다. 본 실시예에 따른 방법은 본 발명에 따른 세포외 공정으로 불릴 수 있다. 이러한 맥락에서 분비 및 세포외 발효는 모두 세포외 생산으로 간주된다.

이 이론에 얽매이지 않고, 본 발명에 따른 세포외 공정은 생성된 미오글로빈을 회수하기 위한 하류 방법이 더 편리하고/하거나, 효율적이고/이거나 효과적이라는 이점을 갖는다. 또한, 이 생성물에 따른 방법은 미오글로빈이 합성 후 숙주 세포 밖으로 운반되지 않는 세포내 방법과 비교하여 최소한의 하류 공정으로 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%와 같은 고순도 미오글로빈을 포함하는 조성물을 생성할 수 있다.

이 이론에 얽매이지 않고, 본 발명에 따른 세포외 공정은 미오글로빈을 회수하는 선택적인 단계가 숙주 세포의 용해를 포함하지 않는다는 이점을 갖는다. 그 결과, 본 발명에 따른 세포외 공정은 하기 구현예에 기재된 바와 같이 숙주 세포로부터 유래하는 낮은 농도의 핵산을 갖는 조성물을 생성할 수 있다.

따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하는, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 미오글로빈의 생산 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 세포외 공정은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 순도, 가장 바람직하게는 실질적으로 순수한 미오글로빈의 조성물을 초래한다.

바람직하게는, 순도는 본 발명에 따른 공정 또는 세포외 공정의 종료시 수득된 무세포 상청액 중 총 단백질 분획의 중량 백분율로 측정된다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 세포외 공정은 숙주 세포에서 유래된 핵산의 5%, 4.9%, 4.8%, 4.7%, 4.6%, 4.5%, 4.4%, 4.3%, 4.2%, 4.1%, 4%, 3.9%, 3.8%, 3.7%, 3.6%, 3.5%, 3.4%, 3.3%, 3.2%, 3.1%, 3%, 2.9%, 2.8%, 2.7%, 2.6%, 2.5%, 2.4%, 2.3%, 2.2%, 2.1%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 또는 0.1% 이하를 포함하는 조성물을 생성한다.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 털 매머드로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 2와 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H, 위치 92에서 Q 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 2와 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 2 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산을 위한 본 발명에 따른 세포외 공정을 제공한다: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I, 위치 123에서 E 및/또는 위치 143에서 I.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 대초원 매머드로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 3과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 다음 아미노산 조합 중 적어도 하나와 조합하여 서열번호 3과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈의 생산을 위한 본 발명에 따른 세포외 공정을 제공한다:

- 위치 30에서 F, 및/또는

- 위치 65에서 Q, 및/또는

- 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는

- 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H.

실시예 2.3은 대초원 매머드 미오글로빈의 세포외 생산을 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 양으로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 4와 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 4와 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 4 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산을 위한 본 발명에 따른 세포외 공정을 제공한다: 위치 13에서 N, 위치 27에서 Q, 위치 31에서 I, 위치 67에서 N, 위치 128에서 A, 위치 133에서 S, 위치 145에서 A 및/또는 위치 150에서 L.

일 구현예에서, 본 발명의 적합한 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 소로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 5와 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 5와 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 5 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산을 위한 본 발명에 따른 세포외 공정: 위치 13에서 N, 위치 27에서 Q, 위치 31에서 I, 위치 67에서 N, 위치 128에서 A, 위치 133에서 S, 위치 145에서 A 및/또는 위치 150에서 L.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 돼지로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 6과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 6과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 6 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산을 위한 본 발명에 따른 세포외 공정을 제공한다: 위치 13에서 N, 위치 27에서 Q, 위치 31에서 I, 위치 67에서 N, 위치 128에서 A, 위치 133에서 S, 위치 145에서 A 및/또는 위치 150에서 L.

일 구현예에서, 본 발명은 적합한 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하여, 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 닭으로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 7과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 7과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고 선택적으로 서열번호 7 내의 다음 위치에 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 미오글로빈의 생산을 위한 본 발명에 따른 세포외 공정을 제공한다: 위치 6에서 Q, 위치 10에서 Q, 위치 13에서 T, 위치 14에서 I, 위치 27에서 H, 위치 31에서 M, 위치 35에서 H, 위치 36에서 D, 위치 42에서 D, 위치 43에서 R, 위치 49에서 G, 위치 53에서 P, 위치 55에서 Q, 위치 58에서 G, 위치 67에서 A, 위치 72에서 Q, 위치 75에서 K, 위치 79에서 Q, 위치 82에서 N, 위치 85에서 S, 위치 93에서 T, 위치 111에서 V, 위치 116에서 I, 위치 117에서 A, 위치 118에서 E, 위치 121에서 A, 위치 128에서 S, 위치 133에서 K, 위치 145에서 S 및/또는 위치 150에서 F.

일 구현예에서, 본 발명은 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 참치로부터 미오글로빈, 바람직하게는 서열번호 8과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈, 더 바람직하게는 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H와 조합하여 서열번호 8과 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 미오글로빈의 생산을 위한 본 발명에 따른 세포외 공정을 제공한다.

회수 및/또는 정제에 적합할 수 있는 관련 하류 가공처리 기술은 본 발명의 중요한 특징이 아니며 미오글로빈이 배양 세포 내에 축적되는지 또는 배설되는지에 따라 좌우될 것이다. 상기 가공처리 기술 및 연관 선택은 당업자에게 알려져 있을 것이며, 예를 들어 문헌[Wesselingh, J.A and Krijgsman, J., 1st edition, Downstream Processing in Biotechnology, Delft Academic Press, NL, 2013]에 논의되어 있다. 회수 공정의 제한적인 예에서, 바이오매스는, 예를 들어 원심분리 또는 여과를 사용하여 배양 배지에서 회수된다. 생성된 미오글로빈이 세포 내에 축적되면, 바이오매스로부터 회수 및/또는 정제될 수 있다. 배설되는 경우, 무세포 배지에서 회수하거나, 바이오매스 분리 단계를 건너뛴 경우 배양액에서 직접 회수될 수 있다. 회수 및/또는 정제는 당업계에 알려진 임의의 통상적인 회수 또는 정제 방법론에 따라 수행될 수 있다. 단백질의 회수 및/또는 정제 방법은 당업자에게 알려져 있고 표준 핸드북, 예컨대 문헌[Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001] 또는 [Ausubel F. et al, eds., Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, NY, 2003]에 논의되어 있다. 널리 사용되는 회수 및/또는 정제 방법의 예는 겔-여과 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 금속 친화성 크로마토그래피, 겔-여과 크로마토그래피, 황산암모늄 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 침전제를 사용한 분별, 겔 전기영동 및 염석 및 투석을 포함한다. 바람직하게는 금속 친화성 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피가 사용된다. 회수 및/또는 정제는 선택적으로 잘 알려진 분자 툴박스 기법을 사용하여 GST 도메인과 같이 정제를 촉진하는 서열에 효소 폴리펩티드를 연결함으로써 향상될 수 있다. 선택적으로, 정제를 촉진하는 서열 및/또는 미오글로빈의 배설을 촉진하는 신호 펩티드는 당업계에 알려진 기법, 예를 들어 정제를 촉진하는 서열 및/또는 신호 펩티드와 미오글로빈 사이의 링커를 표적화하는 엔도펩티다제에 의한 단백질분해를 사용하여 최종 생성물로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 효소 폴리펩티드는 특히 pET23a(+) 벡터(Genescript Biotech, 네덜란드 라이덴 소재)에 제공된 태그와 같은 헥사-히스티딘 펩티드에 연결(융합)되며, 이들 중 다수는 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 문헌[Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘 펩티드는 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다.

바람직한 구현예에서, 생성된 미오글로빈은 배양 배지로부터 회수 및/또는 정제된다. 이는 생산 공정과 함께 지속적으로 또는 그 이후에 실현될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 생성된 미오글로빈은 배양된 세포로부터 회수 및/또는 정제된다. 이것은 성장하는 세포의 분획을 수확하거나 그 이후에 생산 공정과 함께 지속적으로 실현될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 배양된 숙주 세포는 고정화된다. 세포의 고정화는 문헌[Guisan, J.M., Bolivar, J.M., Lopez-Gallego, F., Rocha-Martin, J. (Eds.), Immobilization of Enzymes and Cells: Methods and Protocols, Springer US, USA, 2020]과 같은 표준 핸드북에서 논의된 바와 같이 당업자에게 알려진 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 통상적으로 숙주 세포는 세 가지 다른 방법으로 반-고체 또는 고체 지지체에 고정될 수 있다. 첫 번째 방법은 포자- 또는 세포-함유 용액을 중합하거나 응고시키는 것을 포함한다. 중합성 또는 고형화 가능한 용액의 예는 알기네이트, λ-카라기난, 키토산, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴아미드-히드라지드, 아가로스, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 글리콜, 디메틸 아크릴레이트, 폴리스티렌 디비닐 벤젠, 폴리비닐 벤젠, 폴리비닐 알코올, 에폭시 캐리어, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 광가교성 수지, 전중합체, 우레탄 및 젤라틴을 포함한다. 두 번째 방법은 지지체 상에의 세포 흡착을 포함한다. 이러한 지지체의 예는 골탄, 코르크, 점토, 수지, 모래 다공성 알루미나 비드, 다공성 벽돌, 다공성 실리카, 셀라이트 또는 나무 조각을 포함한다. 숙주 세포는 지지체를 군집화하고 생물막을 형성할 수 있다. 세 번째 방법은 글루타르알데하이드, o-디아니시딘(미국 특허 번호 3,983,000), 중합체성 이소시아네이트(미국 특허 번호 4,071,409), 실란(미국 특허 번호 3,519,538 및 3,652,761), 히드록시에틸 아크릴레이트, 전이 금속-활성화 지지체, 시아누르 클로라이드, 과요오드산나트륨, 톨루엔 등과 같은 화학 물질을 사용하여 지지체에 숙주 세포를 공유 커플링시키는 것을 포함한다. 배양된 숙주 세포는, 예를 들어 배양에서 원하는 세포 밀도에 도달한 후 성장의 모든 단계에서 고정될 수 있다. 적합한 배양 방식 및/또는 상이한 배양 공정 매개변수 값은 당업자에게 알려질 것이며 표준 핸드북, 예컨대 문헌[Colin R. Phillips C.R., Poon Y. C., Immobilization of Cells: In Biotechnology Monographs book series (Biotechnology, volume 5), Springer, Berlin, Germany, 1988]; [Tampion J., Tampion M. D., Immobilized Cells: Principles and Applications, Cambridge University Press, UK, 1987]에 논의되어 있다. 바람직하게는, 고정화 세포는 플러그-흐름 생물반응기로도 알려진 충전층 생물반응기 또는 확장(유동)층 생물반응기에서 배양된다. 적합한 성장 배지 및 회수 및/또는 정제 방법은 본원의 다른 곳에서 추가로 논의된다.

추가 양태에서, 본 명세서에서 앞서 정의된 방법으로부터 얻을 수 있는 미오글로빈을 육류 대체물로 제형화하는 단계를 포함하여, 앞서 정의된 바와 같은 육류 대체물의 제조 방법이 제공된다. 육류 대체물 및/또는 예상되는 식품 성분에 따라, 당업자는 어떤 제형이 가장 적합한지 알 것이다.

일반 정보

달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 그리고 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖고, 본 개시 내용을 고려하여 읽는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터" 또는 "조절 서열"은 하나 이상의 코딩 서열의 전사를 제어하는 기능을 하는 핵산 단편을 지칭하며, 코딩 서열의 전사 개시 부위의 전사 방향에 대해 상류에 위치하며, DNA-의존성 RNA 중합효소에 대한 결합 부위, 전사 개시 부위, 및 전사 인자 결합 부위, 억제자 및 활성화 인자 단백질 결합 부위, 및 상기 프로모터로부터의 전사량을 조절하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 것으로 당업자에게 알려진 임의의 다른 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다른 DNA 서열의 존재에 의해 구조적으로 확인된다. "구성적" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발생 조건 하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 및/또는 "억제성" 프로모터는 예를 들어 화학적 유도제 또는 억제 신호의 적용에 의해 생리학적으로 또는 발생적으로 유도 및/또는 억제되도록 조절되는 프로모터이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 기능적 관계에서 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 의미한다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 코딩 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된다는 것은 연결되는 DNA 서열이 통상적으로 연속적이며, 필요한 경우 2개의 단백질 인코딩 영역을 연결하기 위해 연속적이고 해독틀 내에 있음을 의미한다.

본원에서 사용되는 "조절자" 또는 "전사 조절자"는 특정 DNA 서열에 결합함으로써 DNA에서 메신저 RNA로의 유전 정보의 전사 속도를 제어하는 단백질이다.

"단백질" 또는 "폴리펩티드"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며 특정 작용 방식, 크기, 3차원 구조 또는 기원에 대한 언급 없이 아미노산 사슬로 이루어진 분자를 지칭한다.

용어 "유전자"는 적합한 조절 영역(예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된, 세포에서 RNA 분자(예를 들어, mRNA)로 전사되는 영역(전사 영역)을 포함하는 DNA 단편을 의미한다. 유전자는 일반적으로 프로모터, 5' 리더 서열, 코딩 영역 및 3'-비번역 서열(3'-단부), 예를 들어 폴리아데닐화- 및/또는 전사 종결 부위와 같은, 작동가능하게 연결된 여러 단편을 포함할 것이다.

"유전자의 발현"은 적절한 조절 영역, 특히 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 영역이, 생물학적으로 활성인, 즉 생물학적 활성 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 있는 RNA로 전사되는 과정을 지칭한다.

본원에 기재된 아미노산 서열에서, 아미노산 또는 "잔기"는 3문자 기호로 표시된다. 이들 3문자 기호 및 상응하는 1문자 기호는 당업자에게 잘 알려져 있고 다음의 의미를 갖는다: A(Ala)는 알라닌이고, C(Cys)는 시스테인이고, D(Asp)는 아스파르트산이고, E(Glu)는 글루탐산이고, F(Phe)는 페닐알라닌이고, G(Gly)는 글리신이고, H(His)는 히스티딘이고, I(Ile)는 이소류신이고, K(Lys)는 라이신이고, L(Leu)는 류신이고, M(Met)은 메티오닌이고, N(Asn)은 아스파라긴이고, P(Pro)는 프롤린이고, Q(Gln)는 글루타민이고, R(Arg)은 아르기닌이고, S(Ser)는 세린이고, T(Thr)는 트레오닌이고, V(Val)은 발린이고, W(Trp)는 트립토판이고, Y(Tyr)는 티로신이다. 잔기는 임의의 단백질생성 아미노산일 수 있지만, D-아미노산 및 번역후 변형에 의해 형성된 변형 아미노산과 같은 임의의 비-단백질생성 아미노산일 수 있고, 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 비-천연 아미노산일 수도 있다.

본 출원의 맥락에서, 농도 또는 조성의 맥락에서 모든 백분율은 달리 정의되지 않는 한 중량 백분율을 의미한다.

본 출원의 맥락에서, "적어도 X, Y 또는 Z의 값을 갖는 매개변수"와 같은 표현은 적어도 X, 적어도 Y 또는 적어도 Z의 값을 갖는 상기 매개변수로 해석되어야 한다.

서열 동일성

본 발명의 맥락에서, 동물 미오글로빈을 인코딩하는 핵산 분자와 같은 핵산 분자는 단백질 단편 또는 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 유래된 펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열로 표현된다.

주어진 서열 식별자 번호(서열번호)에 의해 본원에서 확인되는 각각의 핵산 분자 또는 단백질 단편 또는 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 유래된 펩티드 또는 작제물은 개시된 바와 같은 이 특정 서열에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 확인된 각각의 코딩 서열은 주어진 단백질 단편 또는 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 유래된 펩티드 또는 작제물을 인코딩하거나 그 자체가 단백질 단편 또는 폴리펩티드 또는 작제물 또는 펩티드 또는 유래된 펩티드이다.

본 출원 전반에 걸쳐, 주어진 단백질 단편 또는 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 유래된 펩티드를 인코딩하는 서열번호(예로서 서열번호 X)의 특정 뉴클레오티드 서열을 언급할 때마다, 이를 다음으로 대체할 수 있다:

i. 서열번호 X와 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열;

ii. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 (i)의 핵산 분자의 서열과 상이한 서열의 뉴클레오티드 서열; 또는

iii. 서열번호 X의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 60% 아미노산 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열.

서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 70%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 80%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 90%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 95%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 99%이다.

본 출원 전체에서 서열번호(예로서 서열번호 Y)의 특정 아미노산 서열을 언급할 때마다, 서열번호 Y의 아미노산 서열과의 적어도 60% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열에 의해 표시되는 폴리펩티드로 대체할 수 있다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 70%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 80%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 90%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 95%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 99%이다.

본원에 기재된 각각의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 주어진 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열과의 동일성 또는 유사성 백분율에 의해 각각 추가의 바람직한 구현예에서 주어진 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성 또는 유사성을 갖는다.

"상동성", "서열 동일성" 등의 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 서열 동일성은 서열을 비교함으로써 결정되는 바와 같이 2개 이상의 아미노산(폴리펩티드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산(폴리뉴클레오티드) 서열 사이의 관계로서 본원에 기재된다. 바람직한 구현예에서, 서열 동일성은 2개의 주어진 서열번호의 전체 길이 또는 이의 일부에 기초하여 계산된다. 이들의 일부는 바람직하게는 두 서열번호의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%를 의미한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성 정도를 지칭하며, 경우에 따라 이러한 서열의 문자열 사이의 일치에 의해 결정된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환체를 두 번째 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은 각각 본원에 참조로 포함되는 문헌[Bioinformatics and the Cell: Modern Computational Approaches in Genomics, Proteomics and transcriptomics, Xia X., Springer International Publishing, New York, 2018; and Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Mount D., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2004]에 기재된 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 알려진 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다.

"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 2개의 서열의 길이에 따라 글로벌 또는 로컬 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 펩티드 또는 2개의 뉴클레오티드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는 글로벌 정렬 알고리즘(예를 들어, (니들맨-분쉬)Needleman-Wunsch)을 사용하여 정렬되는 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 로컬 정렬 알고리즘(예를 들어, 스미스-워터맨(Smith-Waterman))을 사용하여 정렬된다. 그런 다음 서열이 (예를 들어 디폴트 매개변수를 사용하여 프로그램 EMBOSS 니들 또는 EMBOSS 워터에 의해 최적으로 정렬될 때) 서열 동일성의 최소한 특정 백분율을 공유할 때(아래에 기재된 바와 같이) "실질적으로 동일한" 또는 "본질적으로 유사한" 것으로 지칭될 수 있다.

글로벌 정렬은 2개의 서열이 유사한 길이를 가질 때 서열 동일성을 결정하는데 적합하게 사용된다. 서열의 전체 길이가 실질적으로 다른 경우 스미스-워터맨 알고리즘을 사용하는 것과 같은 로컬 정렬이 선호된다. EMBOSS 니들은 니들맨-분쉬 글로벌 정렬 알고리즘을 사용하여 전체 길이(전장)에 걸쳐 두 개의 서열을 정렬하여 일치 수를 최대화하고 갭 수를 최소화한다. EMBOSS 워터는 스미스-워터맨 로컬 정렬 알고리즘을 사용한다. 일반적으로 EMBOSS 니들 및 EMBOSS 워터 디폴트 매개변수가 사용되며, 갭 개방 페널티 = 10(뉴클레오티드 서열)/10(단백질) 및 갭 확장 패널티 = 0.5(뉴클레오티드 서열)/0.5(단백질)와 함께 사용된다. 뉴클레오티드 서열의 경우 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스는 DNAfull이고 단백질의 경우 디폴트 스코어링 매트릭스는 Blosum62이다(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919, 본원에 참조로 포함된다).

대안적으로, 백분율 유사성 또는 동일성은 FASTA, BLAST 등과 같은 알고리즘을 사용하여 공용 데이터베이스에 대해 검색하여 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예의 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어 다른 계열 구성원이나 관련 서열을 식별하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "쿼리 서열"로 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10](본원에 참조로 포함됨)의 BLASTn 및 BLASTx 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행되어 본 발명의 산화환원효소 핵산 분자에 상동인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 BLASTx 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행되어 본 발명의 단백질 분자에 상동인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST가 사용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램(예를 들어, BLASTx 및 BLASTn)의 디폴트 매개변수가 사용될 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov/에서 월드 와이드 웹으로 접근할 수 있는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)의 홈페이지를 참조한다.

선택적으로, 아미노산 유사성 정도를 결정함에 있어서, 당업자는 또한 소위 보존적 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 본원에서 사용되는 "보존적" 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 지칭한다. 보존적 치환을 위한 아미노산 잔기 부류의 예는 아래 표에 제시되어 있다.

대안적인 보존적 아미노산 잔기 치환 부류:

아미노산 잔기의 대안적 물리적 및 기능적 분류:

예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 군은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는 개시된 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 것이다. 바람직하게는 아미노산 변화는 보존적이다. 각각의 자연 발생 아미노산에 대한 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 Ser; Arg에서 Lys; Asn에서 Gln 또는 His; Asp에서 Glu; Cys에서 Ser 또는 Ala; Gln에서 Asn; Glu에서 Asp; Gly에서 Pro; His에서 Asn 또는 Gln; Ile에서 Leu 또는 Val; Leu에서 Ile 또는 Val; Lys에서 Arg; Gln 또는 Glu; Met에서 Leu 또는 Ile; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr; Ser에서 Thr; Thr에서 Ser; Trp에서 Tyr; Tyr에서 Trp 또는 Phe; 및 Val에서 Ile 또는 Leu.

유전자 또는 코딩 서열

용어 "유전자"는 적합한 조절 영역(예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된, 세포에서 RNA 분자(예를 들어, mRNA)로 전사되는 영역(전사 영역)을 포함하는 DNA 단편을 의미한다. 유전자는 일반적으로 프로모터, 5' 리더 서열, 코딩 영역 및 3'-비번역 서열(3'-단부), 예를 들어 폴리아데닐화- 및/또는 전사 종결 부위를 포함하는 작동가능하게 연결된 여러 단편을 포함할 것이다. "유전자의 발현"은 적절한 조절 영역, 특히 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 영역이, 생물학적으로 활성인, 즉 생물학적 활성 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 있는 RNA로 전사되는 과정을 지칭한다.

프로모터

본원에서 사용되는 용어 "프로모터" 또는 "전사 조절 서열"은 하나 이상의 코딩 서열의 전사를 제어하는 기능을 하는 핵산 단편을 지칭하며, 코딩 서열의 전사 개시 부위의 전사 방향에 대해 상류에 위치하며, DNA-의존성 RNA 중합효소에 대한 결합 부위, 전사 개시 부위, 및 전사 인자 결합 부위, 억제인자 및 활성인자 단백질 결합 부위를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다른 DNA 서열, 및 프로모터로부터의 전사량을 조절하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 것으로 당업자에게 알려진 임의의 다른 뉴클레오티드 서열의 존재에 의해 구조적으로 확인된다. "구성적" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발생 조건 하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는, 예를 들어 화학 유도제의 적용에 의해, 생리학적으로 또는 발생적으로 조절되는 프로모터이다.

작동가능하게 연결된

본원에서 사용되는 바와 같이, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 기능적 관계에서 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 지칭한다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 전사 조절 서열은 코딩 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결된다는 것은 연결되는 DNA 서열이 통상적으로 연속적이며, 필요한 경우 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 연속적이고 해독틀 내에 있음을 의미한다. 연결은 편리한 제한 부위 또는 그 대신에 삽입된 어댑터 또는 링커에서의 결찰에 의해, 또는 유전자 합성에 의해 달성될 수 있다.

단백질 및 아미노산

용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드" 또는 "아미노산 서열"은 상호교환적으로 사용되며 특정 작용 방식, 크기, 3차원 구조 또는 기원에 대한 언급 없이 아미노산 사슬로 이루어진 분자를 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열에서, 아미노산 또는 "잔기"는 3문자 기호로 표시된다. 이들 3문자 기호 및 상응하는 1문자 기호는 당업자에게 잘 알려져 있고 다음의 의미를 갖는다: A(Ala)는 알라닌이고, C(Cys)는 시스테인이고, D(Asp)는 아스파르트산이고, E(Glu)는 글루탐산이고, F(Phe)는 페닐알라닌이고, G(Gly)는 글리신이고, H(His)는 히스티딘이고, I(Ile)는 이소류신이고, K(Lys)는 라이신이고, L(Leu) 류신이고, M(Met)은 메티오닌이고, N(Asn)은 아스파라긴이고, P(Pro)는 프롤린이고, Q(Gln)는 글루타민이고, R(Arg)은 아르기닌이고, S(Ser)는 세린이고, T(Thr)는 트레오닌이고, V(Val)은 발린이고, W(Trp)는 트립토판이고, Y(Tyr)는 티로신이다. 잔기는 임의의 단백질생성 아미노산일 수 있지만, D-아미노산 및 번역후 변형에 의해 형성된 변형 아미노산과 같은 임의의 비-단백질생성 아미노산 및 임의의 비천연 아미노산일 수 있다.

유전자 작제물

본원에 기재된 바와 같은 유전자 작제물은 당업자에게 알려진 바와 같은 임의의 클로닝 및/또는 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 상기 미오글로빈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 적합한 세포, 예를 들어 문헌[Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)] 및 [Sambrook and Russell (2001, 상기함)](둘 다 본원에 그 전체가 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 다세포 유기체의 배양 세포 또는 세포에서 발현된다. 또한, 문헌[Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488](부위 지정 돌연변이유발을 기재함) 및 [Roberts et al. (1987) Nature 328:731-734] 또는 [Wells, J.A., et al. (1985) Gene 34: 315](카세트 돌연변이유발을 기재함)을 참조한다.

발현 벡터

"발현 벡터" 또는 "벡터"라는 어구는 일반적으로, 예를 들어 이러한 서열과 호환되는 숙주에서 유전자 또는 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 뉴클레오티드 서열을 도입함으로써, 세포에서 유전자 발현을 얻기 위해 사용되는 분자 생물학의 도구를 지칭한다. 발현 벡터는 세포에서 안정화되고 에피솜으로 남을 수 있는 게놈을 운반한다. 본 발명의 맥락에서, 세포는 작제물을 만드는 데 사용되는 세포 또는 작제물이 투여될 세포를 포함하는 것을 의미할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 예를 들어 동종 재조합 등을 통해 세포의 게놈으로 통합될 수 있다.

이들 발현 벡터는 통상적으로 적어도 적합한 프로모터 서열 및 선택적으로 전사 종결 신호를 포함한다. 발현에 영향을 미치는 데 필요하거나 도움이 되는 추가 요소도 또한 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 미오글로빈을 코딩하는 핵산 또는 DNA 또는 뉴클레오티드 서열은 시험관내 세포 배양으로 도입 및 발현될 수 있는 DNA 작제물에 통합된다. 구체적으로, DNA 작제물은 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이와 같은 원핵 숙주에서 복제에 적합하거나, 배양된 포유동물, 식물, 곤충(예를 들어 Sf9), 효모, 진균 또는 다른 진핵 세포주에 도입될 수 있다.

특정 숙주에 도입하기 위해 제조된 DNA 작제물은 숙주에 의해 인식되는 복제 시스템, 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 의도된 DNA 절편, 및 폴리펩티드-인코딩 단편에 작동가능하게 연결된 전사 및 번역 개시 및 종결 조절 서열을 포함할 수 있다. "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 본원에서 이미 기재되었다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사를 자극한다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 신호 서열에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현된다면 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 신호 서열의 경우에는 연속적이며 해독틀 내에 있다. 그러나 인핸서는 전사를 제어하는 코딩 서열과 연속적일 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위 또는 그 대신에 삽입된 어댑터 또는 링커에서의 결찰, 또는 유전자 합성에 의해 달성된다.

적절한 프로모터 서열의 선택은 일반적으로 DNA 절편의 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 따라 달라진다. 적합한 프로모터 서열의 예는 당업계에 잘 알려진 원핵 및 진핵 프로모터를 포함한다(예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell, 2001, 상기함] 참조). 전사 조절 서열은 통상적으로 숙주에 의해 인식되는 이종 인핸서 또는 프로모터를 포함한다. 적절한 프로모터의 선택은 숙주에 따라 다르지만, trp, lac 및 파지 프로모터, tRNA 프로모터 및 당분해 효소 프로모터와 같은 프로모터가 알려져 있고 이용가능하다(예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell, 2001, 상기함] 참조). 발현 벡터는 폴리펩티드 인코딩 절편의 삽입 부위와 함께 복제 시스템, 및 전사 및 번역 조절 서열을 포함한다. 대부분의 경우 복제 시스템은 벡터를 만드는 데 사용되는 세포(이. 콜라이와 같은 박테리아 세포)에서만 기능한다. 대부분의 플라스미드와 벡터는 벡터에 감염된 세포에서 복제되지 않는다. 세포주와 발현 벡터의 실행가능한 조합의 예는 문헌[Sambrook and Russell (2001, 상기함)] 및 [Metzger et al. (1988) Nature 334: 31-36]에 기재되어 있다. 예를 들어, 적합한 발현 벡터는 효모, 예를 들어, 에스. 세레비시애, 예를 들어 곤충 세포, 예를 들어 Sf9 세포, 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포 및 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이에서 발현될 수 있다. 따라서 세포는 원핵 또는 진핵 숙주 세포일 수 있다. 세포는 액체 또는 고체 배지에서 배양하기에 적합한 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 유전자이식 식물 또는 동물과 같은 다세포 유기체의 일부인 세포이다.

적절한 프로모터 서열의 선택은 일반적으로 DNA 절편의 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 따라 달라진다. 적합한 프로모터 서열의 예는 당업계에 잘 알려진 원핵 및 진핵 프로모터를 포함한다(예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell, 2001, 상기함] 참조). 전사 조절 서열은 통상적으로 숙주에 의해 인식되는 이종 인핸서 또는 프로모터를 포함한다. 적절한 프로모터의 선택은 숙주에 따라 다르지만, trp, lac 및 파지 프로모터, tRNA 프로모터 및 당분해 효소 프로모터와 같은 프로모터가 알려져 있고 이용가능하다(예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell, 2001, 상기함] 참조). 발현 벡터는 폴리펩티드 인코딩 절편의 삽입 부위와 함께 복제 시스템과 전사 및 번역 조절 서열을 포함한다. 대부분의 경우 복제 시스템은 벡터를 만드는 데 사용되는 세포(이. 콜라이와 같은 박테리아 세포)에서만 기능한다. 대부분의 플라스미드와 벡터는 벡터에 감염된 세포에서 복제되지 않는다. 세포주와 발현 벡터의 실행가능한 조합의 예는 문헌[Sambrook and Russell (2001, 상기함)] 및 [Metzger et al. (1988) Nature 334: 31-36]에 기재되어 있다. 예를 들어, 적합한 발현 벡터는 효모, 예를 들어, S. 세레비시애, 및 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이에서 발현될 수 있다. 따라서 세포는 원핵 또는 진핵 숙주 세포일 수 있다. 세포는 액체 또는 고체 배지에서 배양하기에 적합한 세포일 수 있다.

발현

발현은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 발현은 qPCR, RNA 시퀀싱, 노던 블롯 분석, 웨스턴 블롯 분석, 단백질-유래 펩티드의 질량 분석법 분석 또는 ELISA와 같은 당업자에게 알려진 표준 분석에 의해 mRNA 또는 단백질의 수준에서 형질도입된 조직에서의 이식유전자 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다.

발현은 본원에 기재된 바와 같은 유전자 작제물, 발현 벡터 또는 조성물의 투여 후 언제든지 평가될 수 있다. 본원의 일부 구현예에서, 발현은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 14주, 16주, 18주, 20주, 22주, 24주, 28주, 32주, 36주, 40주 이상 후에 평가될 수 있다.

본 출원 및 그 청구범위에서, "포함하다"라는 동사 및 그 활용형은 비제한적 의미로 단어 앞에 오는 항목이 포함되지만 구체적으로 언급되지 않은 항목이 제외되지 않는다는 의미로 사용된다. 또한, "이루어지다"라는 동사는 본원에 기재된 바와 같은 육류 대체물, 유전자 작제물, 숙주 세포(또는 방법)가 구체적으로 확인된 것보다 추가 구성요소(들)(또는 추가 단계)를 포함할 수 있음을 의미하는 "본질적으로 이루어지다"로 대체될 수 있으며, 상기 추가 구성요소(들)는 본 발명의 고유한 특성을 변경하지 않는다. 또한, "이루어지다"라는 동사는 본원에 기재된 바와 같은 방법이 구체적으로 확인된 것보다 추가 단계(들)를 포함할 수 있음을 의미하는 "본질적으로 이루어지다"로 대체될 수 있으며, 상기 추가 단계(들)는 발명의 고유한 특성을 변경하지 않는다.

"하나"에 의한 요소에 대한 언급은 문맥상 요소 중 하나 및 단지 하나만 존재하도록 명확하게 요구하지 않는 한 하나 초과의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 "하나"는 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.

본원에서 사용되는 "적어도" 특정 값은 특정 값 이상을 의미한다. 예를 들어, "적어도 2"는 "2 이상", 즉 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ..., 등과 동일한 것으로 이해된다.

또한, 상세한 설명 및 청구범위에서 제1, 제2, 제3 등의 용어는 유사한 요소를 구별하기 위해 사용된 것이며 반드시 순차적 또는 연대기적 순서를 설명하기 위해 사용된 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어는 적절한 상황에서 상호교환 가능하며 본원에 기재된 본 발명의 구현예는 본원에 기재되거나 예시된 것과 다른 순서로 작동할 수 있음을 이해해야 한다.

수치(예를 들어, 약 10)와 관련하여 사용될 때 단어 "약" 또는 "대략"은 바람직하게는 그 값이 주어진 값(10)보다 0.1% 더 많거나 적은 값일 수 있음을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "및/또는"이라는 용어는 언급된 경우 중 하나 이상이 단독으로 또는 언급된 경우 중 적어도 하나와 조합하여 최대 언급된 모든 경우까지 발생할 수 있음을 나타낸다.

다양한 구현예가 본원에 기재되어 있다. 본원에서 확인된 바와 같은 각각의 구현예는 달리 나타내지 않는 한 함께 결합될 수 있다.

모든 정의, 주제 면책 조항 또는 부인을 제외하고, 포함된 자료가 본원에 명시된 개시 내용과 일치하지 않는 범위를 제외하고 본원에 인용된 모든 특허 출원, 특허 및 인쇄 간행물은 전체 내용이 참조로 본원에 포함되며, 여기서 본 개시내용의 용어가 우선한다.

당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 많은 방법 및 재료를 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 기재된 방법 및 물질에 결코 제한되지 않는다.

본 발명은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 기술된다.

도 1. 소 미오글로빈의 3차원 구조. 해상도 1.8 Å의 X-선 회절로 해상된 야생형 돼지 Mb의 구조(Krzywda et al. 1998). 헴, 근위 히스티딘(His94) 및 원위 히스티딘(His65)이 나타나 있다.
도 2. 6가지 동물 종으로부터의 미오글로빈 단백질 서열 비교. 서열 정렬은 참치(Thunnus orientalis, 터너스 오리엔탈리스), 닭(Gallus gallus, 갈루스 갈루스), 대초원 매머드(Mammuthus trogontherii), 돼지(Sus scrofa, 수스 스크로파), 소(Bos taurus, 보스 토러스) 및 양(Ovis aries, 오비스 아리스)로부터의 서열을 나타낸다. 아미노산 보존 수준은 BLOSUM62 점수를 사용하여 파란색 음영으로 표시된다. 근위 히스티딘(His94, 박스형)은 6종 모두에 존재한다. 대초원 매머드는 일반적으로 원위 히스티딘(His65, 박스)이 차지하는 위치에 글루타민(Gln65, 박스), 위치 30에 페닐알라닌(Phe30, 박스), 위치 92에 히스티딘(His92, 박스)을 가지고 있다.
도 3. 아시아 코끼리(왼쪽)와 대초원 매머드(오른쪽)로부터의 미오글로빈 3차원 구조 모델. 리본(상단) 및 표면(하단)도가 나타나 있다. 헴 분자가 도시되어 있으며, 위치 92의 잔기(코끼리의 글루타민, 매머드의 히스티딘)도 마찬가지이다. 표면도에서, 양전하는 어두운 회색으로 나타나 있다.
도 4. 피치아 파스토리스에서 세포외 동물 Mb의 생산. 무세포 상청액을 메탄올 유도와 함께(+) 또는 유도 없이(-) 발효 후 수집하고 한외여과로 10배 농축했다. 메탄올 유도 후 수득한 농축 샘플은 암적색(a)을 나타냈고 SDS-PAGE로 분석한 후 Mb에 대한 예상 분자량의 단백질(b)을 나타냈다.
도 5. 발효에 의해 수득한 미오글로빈 제제에서 재조합 DNA의 부재. 동일한 젤이 두 개의 상이한 노출 시간(상단 및 하단 패널)으로 나타나 있다. 별표는 PCR 반응 후 남아있는 프라이머를 나타낸다.
도 6. 질량 분석법에 의해 확인된 매머드 미오글로빈 서열 범위. 막대 그래프(하단 패널)는 상이한 펩티드의 강도를 로그 스케일로 나타낸다. 그래프 하단의 펩티드 서열은 서열번호 31 내지 80에 상응한다.
도 7. 매머드 및 소 미오글로빈 용액의 흡수 스펙트럼. (a) 말 근육(삼각형)에서 정제된 재조합 대초원 매머드 Mb(검은색 원), 소 Mb(흰색 원) 및 상업적으로 이용가능한 Mb의 흡광도 스펙트럼을 실온에서 기록했다. (b) pH 5.6 및 25℃에서 24시간 인큐베이션하는 동안 말 Mb의 흡광도 스펙트럼. 삽도는 재조합 매머드 Mb(검은색 막대), 소 Mb(회색 막대) 및 상업적으로 이용가능한 말 Mb(흰색 막대)에 대한 580 nm(MbO₂)와 505 nm(MetMb)에서의 흡광도 사이의 비율을 나타낸다. 별표는 재조합 Mb와 말 Mb 간의 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다: (*) = p<0.05, (**) = p<0.01.
도 8. 미오글로빈을 함유한 실험실-제조된 육류 유사체의 색상. 미오글로빈 첨가가 식물-기반 버거의 색상에 미치는 영향을 나타내는 사진(a) 및 정량화(b).
도 9. 미오글로빈을 함유한 육류 유사체의 색상 안정성. 4℃에서 일정한 빛에 노출된 다양한 농도의 정제된 말 Mb를 함유한 식물-기반 버거에서 시간 경과에 따라 관찰된 색상 변화를 나타내는 사진(a) 및 정량화(b). 대두 레그헤모글로빈을 함유하는 상업용 버거를 비교를 위해 포함하였다.
도 10. 재조합 헴 단백질을 함유하는 실험실-제조된 육류 유사체에서 추출한 휘발성 화합물. (a) HS-SPME GC-MS에 의해 식물-기반 버거에서 회수된 휘발성 화합물 수의 정량화. 동일한 첨자를 공유하지 않는 값은 터키(Tukey)의 HSD 테스트에 따라 p < 0.05에서 서로 상당히 다른 것으로 나타났다. (b) 생(녹색으로 나타냄) 또는 구운(파란색으로 나타냄) 실험실-제조된 식물-기반 버거의 휘발성 물질에 대한 주성분 분석(PCA). 재조합 대두 레그헤모글로빈(LegH)을 함유하는 상업적으로 이용가능한 식물-기반 버거를 참조로 사용했다.
도 11. 실험실-제조된 육류 유사체에 재조합 미오글로빈의 첨가와 연관된 휘발성 화합물. (a) Mb가 없는 식물-기반 버거에서 관찰된 수준으로 정규화된, 구운 식물-기반 버거에서 검출된 휘발성 풍미 활성-화합물의 상대적 양. 별표는 Mb가 없는 버거와 Mb가 있는 버거 간의 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다: (*) = p<0.5, (**) = p<0.01, (***) = p<0.001. $는 매머드와 소 Mb 간의 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다: ($) = p<0.05, ($$) = p<0.05. (b) 조리된 육류에서도 발견되는 휘발성 화합물의 향 설명(van Ba et al. 2021, The Good Scent Company 정보 시스템).
도 12. 미오글로빈으로부터의 철 생체이용률. 대조군 배지 단독(CM)과 비교하여 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml 또는 2.0 mg/ml에서 정제된 소 Mb에 노출된 인간 Caco-2 장 세포에 의한 철 흡수(ng 단위 페리틴 함량, mg 단위 총 단백질 함량으로 정규화). 별표는 CM과 처리 간의 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다: (****) = p<0.0001.
도 13. 분화된 Caco-2 단층에 대한 재조합 미오글로빈의 효과. 세포독성을 재조합 매머드 또는 소 Mb, 또는 대조군으로 완전 배지(CM)의 존재 하에 24시간 인큐베이션 후에 측정하였다. 별표는 CM과 처리 간의 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다: (*) = p<0.05; (**) = p<0.01.

실시예

실시예 1: 제조 방법 A

실시예 1.1: 유전자 작제물 및 벡터의 일반적인 구축

일부 예에서, 피치아 파스토리스, 에스케리치아 콜라이 및 아스페르길루스 니거에서 발현에 적합한 완전한 벡터 및/또는 게놈 통합 카세트를 상업적 공급업체에 의해 합성적으로 제조한다. 일부 예에서, 벡터 단편 및/또는 게놈 통합 카세트의 구축은 제조업체의 프로토콜에 따라 단편과 상업적으로 이용가능한 중합효소 사이의 호환가능한 오버행의 도입을 위해 설계된 프라이머로 PCR을 사용하여 수행한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하여 시험관내에서 완전한 벡터 및/또는 게놈 통합 카세트 어셈블리를 수행한다. 일부 경우에, 완전한 벡터 어셈블리를 당업계에 이전에 기재된 바와 같이(Kuijpers et al. 2013) 벡터 단편을 효모 세포로 형질전환시킨 후 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하여 완전한 벡터를 분리함으로써 생체내에서 수행한다.

완전한 벡터는 각각의 유기체에서 상기 벡터의 유지를 위해 복제 서열의 공지된 필수 기원, 발현될 뉴클레오티드 서열(서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16으로부터 선택됨), 각각의 유기체에서 발현을 위한 적절한 조절 요소(적어도 프로모터 및 종결자) 및 올바른 형질전환체의 스크리닝 및 형질전환된 균주에서 벡터의 유지를 가능하게 하는 선택 마커를 포함한다. 게놈 통합 카세트는 발현될 뉴클레오티드 서열(서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16으로부터 선택됨), 각각의 유기체에서의 발현에 적합한 조절 요소(적어도 프로모터 및 종결자), 및 선택적으로 30 내지 3000 bp와 같은 적합한 길이를 갖는 5' 및 3' 영역을 포함하며, 이는 상동성 재조합을 촉진하기 위해 각각의 게놈 통합 부위에 대해 상동성이다. 일부 경우에, 스크리닝을 촉진하기 위해 게놈 통합 카세트를 적합한 선택 마커와 융합 및/또는 공동-형질전환시킨다. 일부 예에서, 게놈 통합 카세트와 융합된 적합한 선택 마커를 적합한 배지에서의 역선택, Cre-Lox 재조합효소 시스템의 사용 또는 마커가 없는 균주를 생성하기 위한 CRISPR/Cas 방법과 같은 당업계에 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 형질전환 후 최종 생산 균주로부터 제거한다. 일부 예에서, 벡터 및/또는 게놈 통합 카세트로부터 발현될 뉴클레오티드 서열은 발현된 융합 단백질의 배설을 촉진하기 위해 적합한 신호 펩티드를 인코딩하는 서열 및/또는 배설 후 발현된 융합 단백질의 정제를 촉진하는 서열 태그에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 경우에, 작동가능하게 연결된 서열은 발현된 펩티드가 융합 단백질의 N-말단에 융합되도록 하는 것이다. 일부 예에서, 융합된 서열은 세포에 의한 발현된 융합 단백질의 배설 시 또는 배설 후에 융합 단백질로부터 신호 펩티드 및/또는 태그의 절단을 촉진하는 천연 또는 합성 펩티다아제에 대한 인식 부위를 포함한다.

실시예 1.2: 일반 균주 구축

피치아 파스토리스, 에스케리치아 콜라이 및 아스페르길루스 니거 균주를 당업계에 알려진 분자 툴박스 기법을 사용하여 형질전환시킨다. 관찰해야 할 콜로니 성장에 충분한 시간을 허용한 후, 선택 마커의 사용 여부 및 그 유형(우성/영양요구성)에 따라 항생제를 포함하는 것과 같은 적합한 알려진 선택적 성장 배지에서 각 유기체에 대한 알려진 적합한 성장 조건 하에서 올바른 형질전환체의 선택을 수행한다. 각각의 경우에 올바른 형질전환체를 진단 PCR 또는 서던 블롯팅과 같은 다른 적합한 알려진 분자 툴박스 방법에 의해 확인한다. 게놈 통합 카세트가 형질전환에 사용되는 일부 경우에, 형질전환될 균주는 상동성 재조합을 촉진하기 위한 비-상동성 단부-결합 수선 기구가 부족하다. 선택 마커가 형질전환에 사용된 일부 경우에, 예를 들어 마커가 없는 균주를 생성하기 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 선택 마커를 제거한다. 올바르게 형질전환된 균주를 추가 사용을 위해 -80℃에서 글리세롤 스톡에 보존한다.

실시예 1.3: 형질전환 균주에 의한 미오글로빈 생산

실시예 2에서 수득한 형질전환된 균주를 세포외 미오글로빈 생산에 대해 테스트한다. 온도, pH, 성장배지의 이온강도, 및 교반속도와 같은 일반적으로 알려져 있는 각 숙주에 적합한 단백질을 생산할 수 있는 조건에서 진탕-플라스크에서 배양하여 세포배양을 수행한다. 일부 경우에는 온도 값 범위가 16 내지 40℃이고 pH 값 범위가 3 내지 7이고 이온 강도 값 범위가 100 내지 1000 mM이고 교반 속도 범위가 100 내지 300 rpm이다. 각 숙주의 배양에 적합한 성장 배지는 일반적으로 알려져 있으며 탄소 및 질소 공급원 뿐만 아니라 무기염 및 비타민과 같은 추가 영양소를 포함한다. 형질전환된 균주의 동결된 스톡으로부터 배양물을 접종한다. 배양 12 내지 24시간 후, 배양액을 수집하고 원심분리를 통해 바이오매스를 제거한다. 이어서, 정확한 크기 밴드의 확인에 의한 SDS-PAGE 전기영동 또는 시판되는 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅과 같은 알려진 기법을 사용하여 생성된 미오글로빈의 존재에 대해 배양 상청액을 테스트한다. 결과는 세포외 미오글로빈의 생성을 확인한다. 생성된 미오글로빈은 이후 배양 상청액에서 정제되고 표준 프로토콜에 따라 크로마토그래피 기법으로 정제된다. 배설 펩티드의 부재(배설 동안 절단된)를 표준 단백질 시퀀싱 프로토콜에 따른 질량 분석법을 통해 확인한다. 정제된 미오글로빈을 나중에 사용하기 위해 -20℃에 보관한다.

실시예 1.4: 육류 대체물의 생산

실시예 3에서 생성된 정제된 미오글로빈을 알려진 절차에 따라 근육 조직 및 지방(fat, adipose) 조직의 생성을 위해 사용된다. 근육 조직 대체물을 생산하기 위해, 정제된 미오글로빈을 트랜스글루타미나제를 통해 완두콩 비실린 단백질과 가교시킨다. 완두콩 비실린 단백질의 가열된 젤을 형성하여 근육 조직 대체물을 또한 생산하며, 여기에 정제된 미오글로빈을 첨가하고 가열된 젤을 실온까지 냉각하는 동안 완전히 혼합한다. 근육 조직 대체물을 또한 완두 비실린 단백질과 함께 정제된 미오글로빈의 공압출에 의해 생산한다. 고압 균질화 후 완두콩 알부민 단백질, 오일 및 레시틴의 가열된 겔을 형성하고 여기에 정제된 미오글로빈을 첨가하고 가열된 겔을 실온까지 냉각시키는 동안 완전히 혼합함으로써 지방 조직 대체물을 생성한다. 알려진 절차에 따라 압출에 의해 제인 단백질 공급원을 사용하여 결합 조직 대체물을 생산한다. 근육, 지방 및 결합 조직 대체물을 육류 분쇄기에서 원하는 비율로 배합하여 육류 대체물을 생성한다. 일부 경우에는 육류 대체물을 이어서 조리한다.

실시예 1.5: 에스케리치아 콜라이에 의한 정제된 미오글로빈의 생산

털 매머드, 대초원 매머드, 양, 소, 돼지, 닭 및 참치(서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16)로부터의 전장 미오글로빈 유전자를 합성하고 T7 프로모터 및 종결자 및 C-말단 헥사 히스-태그(Genscript Biotech, 네덜란드 라이덴 소재)를 포함하는 변형된 pET-23a(+) 벡터에서 클로닝한다. 본원에서, 서열번호 9는 미오글로빈의 일부만을 코딩하지만, 그럼에도 불구하고 상기 벡터에서 합성 및 클로닝될 수 있음이 이해된다. 상기 벡터에 원래 존재하는 ampR 마커 유전자를 원래의 전사 조절 요소를 포함하여 이. 콜라이 균주 K12로부터의 proBA 오페론으로 대체하여 항생제 없이 선택을 촉진한다. 올바르게 조립된 플라스미드를 PCR에 의해 확인하고 프롤린 영양요구성 이. 콜라이 단백질 생산 균주(이. 콜라이 K12 ΔproBA)를 형질전환하는 데 사용된다. 형질전환된 균주를 최소 배지(10.5 g/L K₂HPO₄, 4.5 g/L KH₂PO₄, 1.0 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.12 g/L MgSO₄, 0.5 g/l Na 시트레이트, 2 g/L 글루코스 및 5.0 mg/L 티아민·HCl, 37℃ 및 150 rpm(pH 6)에서)를 함유하는 진탕-플라스크에서 밤새 인큐베이션한다. 500 μl의 밤새 배양물을 500 mL 최소 배지를 함유하는 1 L 진탕-플라스크로 옮기고 37℃ 및 150 rpm에서 0.4 내지 1의 OD600에 도달할 때까지 인큐베이션한다. 100 μM 농도의 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 배양액에 첨가한 후 배양액을 16℃ 및 150 rpm에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 배양물을 수확하고 3500 × g(4℃)에서 15분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 펠렛을 1 KU 리소자임/ml(Sigma-Aldrich), 25 U Benzonase^® 뉴클레아제 및 cOmplete^™, EDTA-무함유 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)을 함유하는 50 mL BugBuster 단백질 추출 시약(Novagen)에 용해한다. 용해된 펠렛을 진탕기에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 원심분리 단계를 반복하고 무세포 추출물(상청액)을 수집하고 미오글로빈의 생산을 확인하기 위해 SDS-PAGE에 의해 분석한다. 각각의 형질전환된 균주에 의한 털 매머드, 대초원 매머드, 양, 소, 돼지, 닭 및 참치 미오글로빈의 생산을 정확한 크기의 단백질 밴드의 존재에 의해 확인한다.

정제를 위해 단백질의 가용성 부분을 함유하는 무세포 추출물을 AKTA 시작 시스템과 커플링된 HisTrap FF 1 mL 컬럼(Cytiva, MA, USA)에 로딩한다. 컬럼을 20 mM HEPES, 0.4 M NaCl 및 20 mM 이미다졸, pH 7.5, 1 mL/분 유속으로 평형화한다. 단백질을 20 mM HEPES, 0.4 M NaCl 및 400 mM 이미다졸, pH 7.5로 용리한다. 미오글로빈을 포함하는 분획을 풀링하고, 농축하고, SDS-PAGE 및 항-히스티딘 태그 항체(Bio-Rad)를 사용하는 웨스턴 블로팅으로 확인하며, 이는 모든 미오글로빈의 성공적인 정제를 확인한다. 정제된 미오글로빈을 나중에 사용하기 위해 -20℃에 보관한다.

실시예 1.6: 아스페르길루스 니거에 의한 정제된 미오글로빈의 생산

미오글로빈 배설을 촉진하기 위해 에이. 니거(A. niger)의 펙틴메틸에스테라아제의 배설 신호 서열에 작동가능하게 연결된 A. 니거 glaA 프로모터 및 종결자의 제어 하에 털 매머드, 대초원 매머드, 양, 소, 돼지, 닭 및 참치(서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16)로부터의 유전자를 포함하는 전장 미오글로빈 발현 카세트를 합성한다. 본원에서, 서열번호 9는 미오글로빈의 일부만을 코딩하지만, 그럼에도 불구하고 상기 발현 카세트에 포함될 수 있음이 이해된다. 에이. 니거 pyrG 유전자의 천연 상류 및 하류 서열과 상동인 5' 및 3' 단부에서 1000 bp 뿐만 아니라 미오글로빈 발현 카세트와 아스페르길루스 오리자에로부터의 오로티딘 5'-포스페이트 데카복실라제 유전자 서열(pyrG)의 융합 PCR에 의해 게놈 통합 카세트를 조립한다.

게놈 통합 카세트를 에이. 니거 CBS 120.49 ΔkusA ΔpyrG의 원형질체로 형질전환시킨다. 형질전환 전에, 30℃ 및 250 rpm에서 완전 배지(2%(질량/부피) 글루코스, 6 g/L NaNO₃, 1.5 g g/L KH₂PO₄, 0.5 g/L KCl, 0.5 g/L MgSO₄* 7H₂O, 0.2%(질량/부피) 트립톤, 0.1%(질량/부피) 효모 추출물, 0.1%(질량/부피) 카사미노산, 0.05%(질량/부피) 효모 RNA 및 비슈니악(Vishniac)(1957)에 따른 미량 원소) 중에서 밤새 진탕-플라스크 배양에 의해 원형질체를 제조한다. 균사체를 여과하여 수확하고 PS 완충액(0.2 M 인산나트륨 완충액, 0.8 M L-소르비톨, pH 6)에 용해하고, 여기에 균사체 g당 0.5 g VinoTaste^® 프로 라이징(Pro lysing) 효소를 첨가한 다음, 30℃ 및100 rpm에서 인큐베이션한다. 소화되지 않은 균사체를 여과를 통해 제거하고 원형질체를 온화한 원심분리(1500 × g, 3℃)로 수집하고 SC 용액(182.2 g L^-1 소르비톨, 7.35 g L^-1 CaCl₂* 2H₂O)으로 세척하고 동일한 용액에 10⁸ 원형질체/mL의 농도로 재현탁한다. 200 μL의 원형질체 현탁액을 20 μL의 0.4 M ATA(아우린트리카복실산 암모늄 염) 및 100 μL의 20% PEG-4000을 추가로 함유하는 혼합물에서 5 μg의 게놈 통합 카세트와 혼합하여 신선한 원형질체를 형질전환시킨 후, 10분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 1.2 M 소르비톨 용액 5 mL를 첨가하고 혼합물을 10분 더 인큐베이션한다. 형질전환된 원형질체를 온화한 원심분리에 의해 수집하고 동일한 소르비톨 용액 1 mL에 재현탁한다. 형질전환된 원형질체를 최소 배지 한천 플레이트(1.5%(질량/부피) 한천, 2%(질량/부피) 글루코스, 6 g/L NaNO₃, 1.5 g/L KH₂PO₄, 0.5 g/L KCl, 0.5 g/L MgSO₄*7H₂O, 및 비슈니악(Vishniac)(1957)에 따른 미량 원소)에 플레이팅한 후 30℃에서 4일 동안 인큐베이션한다(pH 5). 선택된 형질전환체로부터의 DNA는 표준 페놀/클로로포름 추출을 사용하여 추출된다. 털 매머드, 대초원 매머드, 양, 소, 돼지, 닭 및 참치로부터의 미오글로빈 유전자를 포함하는 게놈 통합 카세트의 정확한 통합을 서던 블롯팅에 의해 확인한다.

올바른 형질전환체의 포자를 30℃에서 4일 동안 완전 배지 한천 플레이트에서 인큐베이션하여 수득하고 10 mL N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄설폰산(ACES) 완충액으로 수확한다. 2 × 10⁸ 포자를 사용하여 400 mL 최소 배지가 함유된 진탕 플라스크 배양액을 접종하고 30℃, 250 rpm에서 밤새 인큐베이션한다. 균사체를 400 mL 최소 배지를 함유한 신선한 진탕-플라스크 배양액으로 옮기고 30℃, 250 rpm에서 24시간 동안 유지한다. 세포를 4℃에서 3200 × g로 10분 동안 원심분리한 후 배양 수확에 의해 제거된다. 미오글로빈 생산을 확인하기 위해 상청액을 SDS-PAGE로 분석한다. 각각의 형질전환된 균주에 의한 털 매머드, 대초원 매머드, 양, 소, 돼지, 닭 및 참치 미오글로빈의 발현을 정확한 크기의 단백질 밴드의 존재에 의해 확인한다.

정제를 위해 단백질의 가용성 분획을 함유하는 배양 상청액을 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 컬럼(10 mm × 300 mm)(Cytiva, MA, USA)에 로딩한다. 컬럼을 0.15 M 암모늄 아세테이트, pH 6.0, 0.75 mL/분 유속으로 평형화한다. 미오글로빈을 포함하는 분획을 풀링하고 농축하며 표준 프로토콜에 따라 SDS-PAGE 및 LC-MS에 의해 확인한다. 결과로 배설 신호 펩티드 없이 정제된 미오글로빈의 존재를 확인한다.

실시예 1.7. 피치아 파스토리스에 의한 정제된 미오글로빈 생산

피. 파스토리스(P. pastoris) 천연 pgk1 프로모터 및 종결자의 제어 하에 털 매머드, 대초원 매머드, 양, 소, 돼지, 닭 및 참치(서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16)로부터의 유전자를 포함하는 전장 미오글로빈 발현 카세트를 합성한다. 피. 파스토리스 his4 유전자좌의 천연 상류 및 하류 서열에 상동인 5' 및 3' 단부에서 1000 bp 뿐만 아니라 자체 프로모터 및 종결자의 제어 하에 천연 피. 파스토리스 히스티딘 생합성 삼중기능성 단백질 유전자(his4)를 인코딩하는 유전자와 미오글로빈 발현 카세트의 융합 PCR에 의해 게놈 통합 카세트를 조립한다. 게놈 통합 카세트는 이전에 문헌[Gietz RD et al., (2002), Methods Enzymol., 350: 87-96]에 기술된 리튬-아세테이트 형질전환 프로토콜을 사용하여 항생제-내성 마커가 없는 히스티딘 영양요구성 피. 파스토리스 균주 Bg12(BioGrammatics Inc. 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)로 형질전환시킨다. 이전에 문헌[Verduyn C., et al (1992), Yeast, 8: 501-517]에 기재된 합성 배지(선택을 촉진하기 위한 히스티딘 없음)를 함유하는 2% w/v 한천 플레이트에서 인큐베이션하여 올바른 형질전환체를 수득한다: 5 g/L (NH₄)₂SO₄, 3 g/L KH₂PO₄, 0.5 g/L MgSO₄.7H₂O, 4.5 mg/L ZnSO₄.7H₂0, 0.3 mg/L CoCl₂.6H₂O, 1 mg/L MnCl₂.4H₂O, 0.3 mg/L CuSO₄.5H₂O, 4.5 mg/L CaCl₂.H₂O, 3 mg/L FeSO₄.7H₂O, 0.4 mg/L NaMoO₄.2H₂O, 1 mg/L H₃BO₃, 0.1 mg/L KI, 0.05 g/L 비오틴, 1 mg/L 칼슘 판토테네이트, 1 mg/L 니코틴산, 25 mg/L 이노시톨, 1 mg/L 티아민.HCl, 1 mg /L 피리독신·HCl, 0.2 mg/L 파라-아미노벤조산 및 탄소 공급원(pH 5)으로서 2% w/v 글루코스. 플레이트를 30℃에서 4일 동안 인큐베이션한다. 털 매머드, 대초원 매머드, 양, 소, 돼지, 닭 및 참치로부터의 미오글로빈 유전자를 포함하는 게놈 통합 카세트의 올바른 통합을 제조업체의 프로토콜에 따라 효모 단백질 키트(ZymoResearch, 미국 캘리포니아주 어바인 소재)를 사용한 DNA 제조 후 콜로니 PCR로 확인한다. 올바른 형질전환체의 글리세롤 스톡을 제조하고 -80℃에서 보관한다.

미오글로빈 생산을 위해, 냉동 글리세롤 스톡을 사용하여 500 mL의 합성 배지를 함유하는 1 L-배양 전 진탕-플라스크를 접종하고 30℃ 및 250 rpm에서 밤새 인큐베이션한다. 사전 배양을 사용하여 0.2의 시작 OD660으로 후속 진탕-플라스크 배양을 접종한다. 배양액은 30℃, 250 rpm에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 배양물을 수확하고 3500 × g(4℃)에서 15분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 빙냉 탈염수에 재현탁하고 원심분리 단계를 반복한다. 상청액을 버리고 제조업체의 프로토콜에 따라 효모 단백질 키트(ZymoResearch, 미국 캘리포니아주 어바인 소재)를 사용하여 기계적 파쇄와 함께 세포를 용해한다. 세포 파편과 가용성 단백질을 함유하는 혼합물을 3500 × g(4℃)에서 15분 동안 원심분리한다. 가용성 단백질을 함유하는 상청액(무세포 추출물)을 수집하고 SDS-PAGE로 분석하여 미오글로빈 생성을 확인한다. 각각의 형질전환된 균주에 의한 털 매머드, 대초원 매머드, 양, 소, 돼지, 닭 및 참치 미오글로빈의 생산을 정확한 크기의 단백질 밴드의 존재에 의해 확인한다.

정제를 위해 단백질의 가용성 분획을 함유하는 무세포 추출물을 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 컬럼(10 mm × 300 mm)(Cytiva, MA, USA)에 로딩한다. 컬럼을 0.15 M 암모늄 아세테이트, pH 6.0, 0.75 mL/분 유속으로 평형화한다. 미오글로빈을 포함하는 분획을 풀링하고 농축하며 표준 프로토콜에 따라 SDS-PAGE 및 LC-MS에 의해 확인한다. 결과로 정제된 미오글로빈의 존재를 확인한다.

실시예 2: 제조 방법 B

달리 명시적으로 언급되지 않는 한, "매머드" 및 "매머드 미오글로빈"은 실시예 2에서 "대초원 매머드" 및 "대초원 매머드 미오글로빈"을 지칭한다.

실시예 2.1. 재료 및 방법

서열 분석

보스 토러스, 갈루스 갈루스, 터너스 오리엔탈리스, 오비스 아리에스 및 수스 스크로파로부터의 미오글로빈을 코딩하는 서열은 Uniprot에서 입수했다(수탁 번호: 각각 P02192, P02197, P68190, P02190, P02189). 본 출원이 출원된 시점에 알려지지 않았던 대초원 매머드(Mammuthus Trogontherii)로부터 미오글로빈을 코딩하는 서열은 소위 아디차(Adycha) 표본으로부터의 어금니 샘플로부터 DNA 추출, 일루미나(Illumina) DNA 시퀀싱, 아프리카 사바나 코끼리(Loxodonta africana, 록소돈타 아프리카나) 게놈에 대해 판독을 병합하고 매핑한 후 본 발명자들에 의해 얻어졌다(van der Valk et al. 2021).

다중 서열 정렬을 Clustal Omega(Sievers et al. 2011)로 수행했고 Jalview 2.11.1.4(Waterhouse et al. 2009)를 사용하여 가시화하였다.

단백질 모델링

수스 스크로파의 야생형 데옥시미오글로빈 구조를 RCSB 단백질 데이터 뱅크(PDB 수탁 번호: 1MWD, 사슬 A)에서 검색하였다. 대초원 매머드 미오글로빈의 구조는 엘레파스 막시무스(Elephas maximus)(아시아 코끼리)로부터의 미오글로빈 결정 구조를 주형(PDB 수탁 번호: 1EMY)으로 사용하여 자동 단백질 구조 상동성-모델링 서버 SWISS-MODEL(Waterhouse et al. 2018)을 사용하여 모델링하였다. 순 표면 전하(Z_Mb)를 공개된 부위-특이적 이온화 상수를 사용하여 pH 6.5에서 모든 이온화 가능한 기의 전하 합계로 계산했다(Mirceta et al. 2013). 모든 단백질 구조를 DeepView v4.1(Guex and Peitsch 1997)을 사용하여 시각화하고 도면을 생성하였다.

발현 플라스미드의 구축

미오글로빈 코딩 서열을 피치아 파스토리스(Komagataella phaffii)(Love et al. 2016)(서열번호 19 내지 24)에서의 발현을 위해 코돈 최적화하였다. 사카로마이세스 세레비시애 메이팅 인자 알파의 코딩 서열이 선행하는 최적화된 서열(서열번호 25 내지 30)을 GenScript에 의해 화학적으로 합성하였다. 유전자 단편을 pBDIPp5 벡터, AOX1 프로모터의 하류 및 AOX1 종결자의 상류, HIS4 선택 마커 및 AOX1 3' 단편으로 클로닝하였다. 벡터를 이. 콜라이(DH10B)에서 증폭하였고 플라스미드 키트(Quiagen)로 정제하였으며 생어(Sanger) 시퀀싱으로 확인하였다. AOX1 프로모터의 상류와 AOX1 3' 단편의 하류를 절단하고 QIAquick 젤 추출 키트(QUiagen)로 정제하는 BglII(New England Biolabs)로 플라스미드를 제한하여 생성된 벡터로부터 발현 카세트를 생성했다.

균주 조작

피치아 파스토리스(Komagataella phaffii) 균주 GS115(his4)를 Life Technologies에서 구입했다. 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이(Cregg 2007) 전기천공 방법을 사용하여 세포 형질전환을 수행했다. 간략하게, GS115 균주의 세포를 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 2% D-글루코스) 배지에서 성장시켰다. 기하급수적으로 성장하는 단계의 세포를 200 mM HEPES 완충액(pH 8.0) 및 25 mM 디티오트레이톨을 함유하는 YPD 배지에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 컴피턴트 세포(competent cell)를 빙냉 1 M 소르비톨로 세척하고 멸균 전기천공 큐벳(Bio-Rad)으로 옮겼다. 그런 다음 Gene-Pulser(Bio-Rad) 전기천공기를 사용하여 선형 발현 카세트(3.3 참조) 1 내지 5 μg으로 세포를 전기천공하고 멸균된 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮기기 전에 1 M 소르비톨을 함유하는 1 mL의 YPD 배지에 재현탁했다. 세포를 고체 MGY 배지(최소 글리세롤 배지: 아미노산 없는 황산암모늄을 갖는 1.34% 효모 질소 베이스, 2% D-글루코스, 2% 한천이 함유된 4 10^-5% 비오틴)를 함유하는 한천 플레이트 상에 플레이팅하기 전에, 세포를 3시간 동안 교반 없이 28℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 28℃에서 최대 4일 동안 인큐베이션했다.

히스티딘의 부재 하에 성장할 수 있는 형질전환체를 Mb를 발현하는 능력에 대해 스크리닝하였다. 세포를 BMGY 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100 mm 인산칼륨 완충액(pH6), 아미노산 없는 황산암모늄을 갖는 1.34% 효모 질소 베이스, 4 10^-5 % 비오틴, 1% 글리세롤)의 50 mL 팔콘 튜브에서 성장시켰다. 기하급수적으로 성장하는 세포에 1% 메탄올을 첨가하여 Mb 발현을 유도하였다. 메탄올 유도 시작 후 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 후에 샘플을 수집하고 SDS-PAGE로 분석하여 Mb 수준을 평가했다(아래 참조).

추가 실험을 위해 최고의 생산 균주를 선택하고 사용하기 전에 마스터 세포 은행으로 -80℃에서 동결 보존했다. 본원에 나타낸 결과는 PAL-02-02(매머드 Mb) 및 PAL-02-03(소 Mb) 균주를 사용하여 수득하였다.

재조합 단백질 생산 및 정제

마스터 세포 은행의 세포를 YPD 한천(1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 2% D-글루코스, 2% 한천) 플레이트에 플레이팅하고 28℃에서 2일 동안 배양했다. 100 mL의 BMGY 배지를 함유하는 배플 플라스크에서 시드 배양물을 제조하고 오비탈 진탕기 인큐베이터에서 28℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 시드 배양액을 사용하여 0.03% FoamAway^™조사된 AOF(ThermoFisher)가 포함된 BMGY 배지 900 ml를 함유하는 3L 구형 유리 플라스크 또는 유리 용기 발효기(Sartorius)에 접종하였다. 모든 글리세롤이 소비될 때까지 약 24시간 동안 증식 단계를 수행했다. 이후 온도를 26℃까지 낮추고 Mb 발현을 유도하기 위해 12시간마다 1% 메탄올을 첨가하였다. 용존 산소를 전체 발효 동안 20% 초과로 유지하였으며, pH를 증식 단계 동안 6, 유도 단계 동안 5에서 유지하였다.

96시간의 메탄올 유도 후, 세포를 4℃에서 4,000 rpm으로 원심분리하여 제거하였다. 공극 직경이 0.45 μm(Millipore)인 니트로셀룰로오스 필터를 사용하여 정밀여과로 남은 세포를 제거했다. 무세포 상청액을 -20℃에서 냉동 보관하였다. 분석에 필요한 경우, 무세포 상청액을 10 kD의 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르설폰 막(Thermo Scientific Pierce Protein Concentrators)이 있는 일회용 한외여과 원심분리기 장치를 사용하여 추가로 농축하였다.

무세포 상청액에서 재조합 DNA의 존재를 신호 펩티드를 인코딩하는 서열에 상보적이도록 설계된 올리고뉴클레오티드(Sigma)를 사용하여 PCR에 의해 테스트하였다. PAL-02-02 균주(매머드 Mb)의 게놈 DNA에서 증폭된 DNA 단편을 매머드 또는 소 Mb를 함유하는 1 μl의 농축 무세포 상청액 다음에 양성 대조군으로 사용했다. 제조업체의 지침에 따라 표준 완충액이 포함된 OneTaq^® Quick-Load^® 2X 마스터 믹스(New England Biolabs)를 사용하여 PCR 반응을 수행했다. PCR 생성물을 에티디움 브로마이드를 포함하는 2% 아가로스 TAE 겔에서 60분 동안 60 V에서 이동한 후에 시각화하였다. Quick-Load^® Purple 1 kb 플러스 DNA 래더(New England Biolabs)를 사용하여 증폭된 조각의 크기를 제어했다.

나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)

단백질 전기영동을 위해, 20 μl의 농축 무세포 상청액을 같은 부피의 2X 단백질 로딩 완충액(100 mM 트리스(pH6,8); 4 mM EDTA, 4% SDS, 20% 글리세롤; 0.02% 브로모페놀 블루, 4% β-메르캅토에탄올)과 혼합하였다. 샘플을 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하고 적절한 부피를 200 V에서 40분 동안 수직 미니-PROTEAN 겔 장치(Bio-Rad)의 15% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다. 분자량 마커(PageRuler™ Prestained Protein Ladder)를 Thermofisher에서 구입했다. 전기영동 후, 젤 내 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) G-250(Bio-Rad)으로 염색하였다.

질량 분석법

MS 분석을 위해, Mb에 상응하는 SDS-PAGE 젤 밴드를 메스 나이프를 사용하여 쿠마시 염색 젤에서 잘라냈다. 샘플을 멸균수로 헹구고 VIB Proteomics Core(벨기에 겐트 소재)에서 MS 분석을 위해 처리될 때까지 -20℃에서 보관했다. 37℃에서 밤새 1 μg 트립신(Promega)으로 분해하여 펩티드를 생성하고 LC-MS/MS 분석 전까지 -20℃에서 보관했다. 펩티드를 로딩 용매에 재용해하고 Q Exactive HF 질량 분석기(Thermo Fisher)를 사용하여 LC-MS/MS 분석을 위해 주입했다. 펩티드-스펙트럼 일치(PSM), 펩티드 및 단백질 수준에서 1%로 설정된 잘못된 발견률을 포함하는 디폴트 검색 설정으로 MaxQuant 알고리즘(버전 2.0.1.0)으로 데이터 분석을 수행했다. 모든 원시 스펙트럼 데이터 파일을 매머드 Mb의 이론적 단백질 서열과 Uniprot 데이터베이스의 다음 참조 프로테옴에 대해 함께 검색하였다: 코마가타엘라 파피이(2021_11의 데이터베이스 릴리스 버전, 5,073개의 단백질 서열 함유), 보스 토러스(taxid 9913, 2021_11의 데이터베이스 릴리스 버전, 37,513개의 단백질 서열 함유), 및 수스 스크로파(taxid 9823, 2021_11의 데이터베이스 릴리스 버전, 49,792개의 단백질 서열 함유).

식물-기반 육류 유사체

식물-기반 버거를 25% 조직화된 대두 단백질, 15% 해바라기유, 1.5% NaCl, 1% 메틸셀룰로오스 및 57.5% 물을 혼합하여 제조했다. 재조합 미오글로빈 또는 상업적으로 이용가능한 미오글로빈(말 근육에서 정제, Sigma)을 각각 흰색 육류와 붉은 육류의 미오글로빈 함량과 유사한 0.5% 또는 1% 최종 농도로 첨가하였다. 무세포 상청액을 동결건조하여 재조합 미오글로빈 제제를 수득하였다. 1% Mb를 함유한 버거의 경우, 버거 100 g당 추가 물 13.8g을 첨가했다. 대두 레그헤모글로빈(Impossible Food)을 함유하는 상업적으로 이용가능한 식물-기반 버거를 일부 분석에서 비교를 위해 포함하였다.

분광법 및 색상 분석

Synergy 마이크로플레이트 판독기(BioTek)로 흡광도 스펙트럼을 기록했다. 미오글로빈 자동-산화 속도 측정을 위한 흡광도 측정을 Ultrospec III 분광광도계(Pharmacia)를 사용하여 석영 큐벳에서 수행했다. L*, a* 및 b* 값(CIELAB 색상 공간에 기반함)을 등록하기 위해 8 mm 가시 영역 크기, 광원 D65 및 10° 표준 관찰자가 있는 휴대용 Miniscan EZ 4500L 45°/0°(Hunterlab, 독일 무르나우 소재)를 사용하여 색상 측정을 수행했다. CIE76 공식에 따라 시간 경과에 따른 색상 차이(ΔE)를 계산했다.

ΔE-값(-)

방향족 분석

상이한 농도의 재조합 Mb를 함유하는 식물-기반 육류 대체물의 향을 헤드스페이스 고체-상 미세추출(HS-SPME)을 이용한 기체 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)을 사용하여 분석하였다. 샘플을 생으로 또는 굽고 나서 분석하였다. 헤드스페이스 휘발성 물질은 디비닐벤젠-카복센-폴리디메틸실록산(DVB/CAR/PDMS) 코팅된 섬유로 추출하고 HP-1ms 컬럼으로 분리한 후 질량 분석법으로 확인했다. 데이터 분석을 위해, 서로 다른 방향족 화합물의 피크 아래 영역을 일원 ANOVA(분산 분석)으로 평가한 후 통계적으로 유의미한 차이가 발견되면 터키의 HSD(Honestly Significant Difference, 정직한 유의차) 사후 테스트를 수행했다. PCA(Principle Component Analysis, 주요 구성요소 분석)를 사용하여 다변량 통계 분석을 수행했다.

철 생체이용률 및 생체접근성

ProDigest(벨기에 겐트 소재)에 의해 분석을 수행했다. Caco-2 세포(HTB-37; American Type Culture Collection)를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 12-웰에 5 × 10⁵ 세포로 시딩했다. 세포를 14일 동안 완전 배지(20% 열-불활성화 태아 소 혈청(FBS), 10 mM HEPES 및 1x 항생제-항진균제가 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM))에서 14일 동안 3회 배지 교환/주로 성장시켰다. 자극 24시간 전에, 세포를 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1x 항생제-항진균제, 11 μM 하이드로코르티손, 0.87 μM 인슐린, 0.02 μM 나트륨 셀레나이트, 0.05 μM 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨염, 20 μg/L 표피 성장 인자로 보충된 최소 필수 배지(MEM)로 1회 세척하고 이 배지에서 24시간 더 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 세 가지 농도(0.5, 1 및 2 mg/mL)의 소 Mb(Tebu-bio N.V.) 또는 음성 대조군(CM으로 표시)으로 보충된 MEM과 함께 인큐베이션했다. 37℃에서 24시간 인큐베이션한 후, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고 CelLytic^™(Sigma Aldrich)로 용해시켰다. 인간 페리틴 수준을 제조업체의 지침에 따라 인간 페리틴 ELISA 키트(ThermoScientific)를 사용하여 결정하였다. 마지막으로, 마이크로플레이트 절차 지침에 따라 Pierce^™ BCA 단백질 분석 키트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 단백질 농도를 측정했다. 모든 분석을 3중으로 수행했다.

시험관내 독성 분석

ProDigest(벨기에 겐트 소재)에 의해 분석을 수행했다. Caco-2 세포를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 24-웰 플레이트에 시딩하고 페리틴 분석에서와 같이 배양하였다. 독성 테스트 당일, 세포를 0.5, 1.0 또는 2.0 mg/ml의 재조합 매머드 또는 소 Mb와 함께 인큐베이션하였다. 세포독성 분석을 37℃에서 Mb와 함께 24시간 인큐베이션한 후에 수행했다. Caco-2 세포에서 생성물에 의해 유발될 수 있는 독성을 평가하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 락테이트 탈수소효소(LDH) 세포독성 분석(Merck Life Science B.V.)을 상청액에서 수행했다. 모든 분석을 3중으로 수행했다. 완전한 배지 대조군(CM)과 생성물 간의 차이를 평가하기 위해, 더넷(Dunnett)의 다중 비교 테스트를 사용한 일반 일원 ANOVA를 각 시점에 대해 개별적으로 수행했다. (*)는 CM과 생성물 간의 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다. (*) = p<0.05; (**) = p<0.01; (***) = p<0.001 및 (****) = p<0.0001. 모든 통계를 윈도우용 GraphPad Prism 버전 9.1.2(GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 사용하여 수행했다.

박테리아 역 돌연변이 분석(AMES 테스트)

유전독성 분석을 화학 테스팅 n°471에 대한 OECD 가이드라인에 따라 수행했다. AMES FT 변이원성 테스트 키트(Mutagenicity Test Kit)(Moltox, Trinova)를 제조업체의 지침에 따라 사용했다. 모든 분석을 3중으로 수행했다. 비히클로 처리된 각 균주에 대한 평균 복귀(revertant) 횟수는 제조업체가 제공한 데이터를 기반으로 예상 범위 내에 있었다. 돌연변이 비율을 테스트 화합물과 비히클 단독으로 관찰된 복귀의 수 사이의 비율로 계산했다.

실시예 2.2. 미오글로빈의 구조적 특성

미오글로빈(Mb)은 심장과 골격근에서 발견되는 약 17 kD의 비교적 작은 구형 단백질이다. 그것은 가역적 산소 결합이 가능한 단일 헴 기를 운반하여(도 1), 미오글로빈이 세포 표면에서 미토콘드리아로 산소를 운반할 수 있도록 한다. Mb는 육류 색을 담당하는 주요 색소이기도 하다. 산화된 Mb(옥시미오글로빈)에서 헴 기의 철 원자는 포르피린 고리의 4개 질소 원자, Mb 사슬에서 소위 "근위" 히스티딘(His94) 및 산소 분자에 의해 배위된다. 이것은 "원위" 히스티딘(His65)인 Mb의 헴 결합 포켓에 있는 다른 히스티딘과 산소 분자 사이의 수소 결합에 의해 더 안정화될 수 있다. 이 형태에서 Mb는 통상적인 밝은 빨간색을 띤다. 산소가 없으면 Mb는 더 짙은 붉은색(데옥시미오글로빈)을 띤다. 헴 철이 2가 철(Fe(II))에서 3가 철(Fe(III)) 상태로 산화되면 산소와 결합할 수 없으며 Mb는 익힌 육류에서 볼 수 있는 갈색(메트미오글로빈)을 나타낸다. 헴 철 산화는 또한 헴에 대한 Mb의 친화도를 감소시켜 헴 손실을 증가시키고 이후 단백질의 풀림을 유발한다.

Mb의 아미노산 서열은 진화 과정에서 강력하게 보존되어 왔으며 종 간에는 상대적으로 작은 변이를 나타낸다(도 2). 장비목(Proboscidans)에서 Mb는 위치 30(Phe30)에 비정형 페닐알라닌을 나타낸다. 놀랍게도, 본 발명자가 1.2 내지 1.0 Ma 사이의 소위 아디차(Adycha) 표본에서 생성한 대초원 매머드(Mammuthus trongotherii)로부터의 Mb 서열도 도 2에 포함되어 있다.

특징적인 Phe30 치환(도 2) 외에도, 대초원 매머드의 Mb가, 예를 들어 아시아 코끼리(pH 6.5에서 Z_Mb = 2.11)로부터의 Mb보다 더 높은 양의 표면 전하(pH 6.5에서 순 표면 전하(Z_Mb) = 2.67)를 나타냄을 발견했고, 이는 위치 92에 글루타민 대신 히스티딘 잔기(His92)가 존재하기 때문이다(도 2, 3). 이것은 고래목의 심해 잠수에 대한 Mb의 적응을 연상시키며, 표면 양전하가 증가하면 접촉 거리에서 Mb 분자 간의 매력적인 상호작용이 감소하여 Mb 안정성이 증가하고 응집이 방지된다. 전반적으로 대초원 매머드의 Mb는 이것을 특히 매력적으로 만드는 몇 가지 특성을 현저하게 나타낸다. 본원에서, 본 발명자들은 현존하는 다른 종에 이어 대초원 매머드에서 재조합 Mb의 생산과 특성을 평가한다.

실시예 2.3. 피치아 파스토리스에서 미오글로빈의 세포외 생산

대초원 매머드, 돼지, 닭, 소, 돼지고기 및 참치로부터 Mb를 코딩하는 서열을 피치아 파스토리스의 메탄올-유도성 AOX1 프로모터의 하류와 AOX1 종결자의 상류, 히스티딘 프로토트로피(prototropy) 선택 마커 및 소위 AOX1 유전자의 3' 단편에서 클로닝하였다. 미오글로빈은 근육 세포의 세포질에서 자연적으로 발견된다. 재조합 단백질 정제를 용이하게 하기 위해, 본 발명자들은 초기 Mb 단백질을 세포 외부로 배설하기 위한 분비 경로로 표적화하기 위해 프레임에서 미오글로빈 코딩 서열과 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 융합했다. 이들 작제물을 사용하여 히스티딘-영양요구균 피치아 파스토리스 세포를 형질전환시키고, 형질전환체를 히스티딘의 부재 하에 성장할 수 있는 능력에 대해 선택하였다. 각각의 작제물에 대해, 마이크로플레이트에서 메탄올 유도 후 세포외 동물 미오글로빈을 생성하는 능력에 대해 최대 10개의 형질전환체를 테스트하였다. 최고의 생산 클론을 플라스크에서 추가로 테스트했다. 메탄올 유도는 헴 단백질을 함유하는 샘플에 대해 예상되는 바와 같이, 특히 한외여과에 의한 10배 농축 후에 암적색을 나타내는 무세포 상청액을 야기하였다(도 4a). 예상 분자량 약 17 kD의 메탄올-유도성 단백질의 존재를 또한 단백질 전기영동 및 쿠마시 블루로 염색한 후에 확인하였다(도 4b). 재조합 Mb는 농축 무세포 상청액에서 총 단백질의 75 내지 82%를 차지했으며, Mb 생산 수율은 상청액 1 리터당 0.420 mg 내지 1.93 g으로 다양했다.

미오글로빈은 세포외에서 생성되기 때문에, 효모 세포는 정제 공정에서 용해될 필요가 없다. 이러한 세포를 원심분리 후 미세여과(0.45 μm 공극)에 의해 발효액에서 제거한다. 따라서 최종 생성물에는 임의의 재조합 유전 물질이 포함되지 않을 것으로 예상된다. 이를 확인하기 위해, 본 발명자들은 신호 펩티드를 인코딩하는 서열에 상응하는 재조합 유전자의 짧은 단편(130 bp)을 1 pg 정도의 DNA에서 증폭하는 PCR 테스트를 설계했다(도 5). 이 테스트를 사용하여 본 발명자들은 농축된 무세포 상청액에서 임의의 재조합 DNA를 검출하지 못했다(도 5).

재조합 Mb의 정체를 확인하고 단백질 분비 중에 신호 펩티드가 올바르게 처리되고 제거되었는지 확인하기 위해, 본 발명자들은 질량 분석법(LC-MS/MS) 샷건 측정과 커플링된 액체 크로마토그래피로 매머드 Mb 겔 밴드를 분석했다. 예상대로 본 발명자들은 전체 단백질 서열의 90.3%를 차지하는 펩티드를 회수하고 신호 펩티드와 첫 번째 메티오닌이 완전히 제거되는 것을 관찰했다(도 6).

실시예 2.4. 재조합 미오글로빈의 색상 및 색상 안정성

위에서 논의한 바와 같이, Mb는 육류 색상에서 중심적인 역할을 한다. 따라서 질량 분석법 분석과 병행하여, 본 발명자들은 UV 및 가시광선 범위에서 농축된 무세포 상층액의 흡광도를 측정하고 이를 말 근육에서 정제된 상업용 미오글로빈의 흡광도와 비교했다. 모든 경우에, 헴의 존재 특징인 흡광도 피크(Soret 밴드)가 관찰되었다(Tang et al. 2004). 소렛(Soret) 밴드는 소와 말 Mb의 경우 410 nm에서 검출된 한편, 매머드 Mb의 경우 415 nm로 약간 적색-편이되었다(도 7a). 각각 메트미오글로빈, 데옥시미오글로빈 및 옥시미오글로빈을 대표하는 파장 최대에서의 흡광도 비율에 기초하여(Tang et al. 2004), 본 발명자들은 농축된 무세포 상청액에서 재조합 미오글로빈이 주로 환원된 형태로 발견됨을 관찰했다: 매머드 Mb의 경우 47.3% 옥시미오글로빈 및 10.0% 데옥시미오글로빈, 소 Mb의 경우 48.3% 옥시미오글로빈 및 9.9% 데옥시미오글로빈. 주목할 점은 매머드 Mb의 소렛(Soret) 피크가 소와 말 Mb(각각 415 nm 대 410 nm)보다 약간 더 높은 파장에서 일관되게 관찰되었다는 것이다. 이것은 코끼리 Mb에 대한 이전 관찰과 일치한다(Tada et al. 1998). Mb의 자동-산화 거동을 평가하기 위해, 본 발명자들은 pH 5.6 및 25℃에서 24시간 인큐베이션하는 동안 2시간마다 흡광도 스펙트럼을 기록했다(도 7b). 그런 다음 580 nm(Fe(II)를 운반하는 옥시미오글로빈의 피크 값)와 505 nm(Fe(III)를 운반하는 메트미오글로빈의 피크 값)에서의 흡광도 사이의 비율을 조사했다. 인큐베이션 초기에 본 발명자들은 이 비율이 말 근육에서 정제된 상업적으로 이용가능한 Mb보다 재조합 매머드와 소 Mb에 대해 상당히 더 높다는 것을 관찰했고(도 7b, 삽도), 이는 재조합 Mb의 더 많은 부분이 환원된 형태로 존재함을 나타낸다. 말 Mb와의 이러한 차이는 산성 pH에서 시간이 지남에 따라 유지되었다(도 7b, 삽도). 24시간 동안 흡광도 비율은 매머드 Mb의 경우 26.0%, 소 Mb의 경우 38.3% 감소하여 전자가 자가-산화에 대한 저항성이 더 큰 것으로 나타났다.

육류 색상은 Mb 농도, 수분 및 지방 함량을 포함하는 여러 매개변수의 영향을 받는다. 통상적으로 생으로 구매하는 전통 육류의 경우, 옥시미오글로빈이 부여하는 붉은색이 소비자의 구매 결정에 중요한 역할을 한다. 따라서 본 발명자들은 색상 측면에서 육류 유사체에 대한 재조합 Mb의 효과를 테스트했다. 식물-기반 버거에 소 또는 매머드 Mb를 추가하면(도 8a-a') 밝기(L*-값)가 감소하고 적색도(a*-값) 및 황색도(b*-값)가 증가했다(도 8b).

다음으로 본 발명자들은 다양한 양의 미오글로빈을 함유한 육류 유사체를 5일 동안 냉장실에 보관하고 일정한 빛에 노출시켜 색상 안정성을 평가했다. 비교를 위해 대두 헴 단백질을 함유한 상업용 식물-기반 버거를 포함하였다. 본 발명자들은 Mb 없이 제조된 버거에 대해 상당한 색상 변화를 관찰했지만, Mb의 첨가는 더 큰 색상 안정성과 연관이 있었다(도 9a 내지 b).

실시예 2.5. 향 분석

미오글로빈은 육류 색상에서의 역할 외에도, 일반적으로 생육류의 "피 냄새" 또는 "금속성" 냄새에 기여하는 것으로 추정된다. 육류를 조리하는 동안, 향 형성은 본질적으로 지질 산화와 마이야르 반응에 의해 발생한다. 후자는 단백질의 아미노 기와 환원당으로부터의 카보닐 기 및/또는 지질 산화의 반응 생성물의 사이에서 발생한다. 헴 철은 이러한 반응 및/또는 동역학에 영향을 미칠 수 있다(van Ba et al. 2012). 그러나 본 발명자들이 아는 한, 미오글로빈이 육류의 향 형성에 미치는 영향에 대한 결정적인 데이터는 문헌에 없다. 상기 기재된 바와 같은 실험실-제조된 버거를 사용하여 본 발명자들은 재조합 Mb를 함유하는 생 및 조리된 식물-기반 버거의 휘발성 화합물을 질량 분석법과 결합된 기체 크로마토그래피로 분석했다.

본 발명자들은 식물-기반 버거에 Mb를 추가하면 생 상태와 굽고 난 후에 모두 휘발성 화합물의 수가 크게 증가한다는 것을 발견했다(도 10a). 눈에 띄게, 생성된 휘발성 물질의 수는 대두 레그헤모글로빈을 함유하는 상업적 식물-기반 버거(도 10a), 즉 Impossible Burger보다 두 경우 모두에서 더 높았다. CG-MS 데이터에 대한 주성분 분석(PCA)을 사용하여, 본 발명자들은 실험실-기반 버거와 대두 레그헤모글로빈을 함유하는 상업적으로 이용가능한 식물-기반 버거 사이, 그리고 다른 한편으로는 생 것과 구운 제품 사이에 명확한 구분을 관찰했다(도 10b).

구운 실험실-제조된 식물 기반 버거의 휘발성 화합물을 분석할 때 본 발명자들은 Mb의 첨가가 산화된 지질, 지질 산화 생성물 및 피라진의 존재와 연관이 있음을 발견했다. 구체적으로, 대초원 매머드나 소 Mb의 존재로 인해 구운 육류에 "로스팅된" 맛을 부여하는 것으로 알려진 화합물의 양이 증가했다(van Ba et al. 2012)(도 12). 매머드 Mb의 첨가는 소 Mb에서 관찰된 것보다 더 많은 양의 이러한 화합물과 일관되게 연관되었다. 이것은 이 이론에 얽매이지 않고 식물-기반 육류 유사체의 성분으로 사용될 때, 소 Mb를 사용할 때보다 더 적은 양의 매머드 Mb를 첨가하여 동일한 향 특성을 얻을 수 있음을 시사한다. 또한 매머드 Mb와 소 Mb는 다른 감각적 경험을 제공할 수 있다.

실시예 2.6. 영양 분석

Mb에서 철의 생체이용률을 평가하기 위해, 인간 장내 철 흡수 연구에 일반적으로 사용되는 상피-유사 장 세포주 Caco-2에 의존하였다. 본 발명자들은 살아 있는 Caco-2 세포 단층에 의한 철 흡수의 판독값으로서의 세포내 페리틴의 형성, 즉 철 생체이용률의 지표를 측정하였다(Glahn et al. 1998). 본 발명자들은 Mb의 용량을 증가시키면 철 흡수가 증가한다는 것을 관찰했고(도 12), 이는 Mb에 의해 운반되는 헴-철이 인간 장 세포에 생체이용가능하다는 것을 나타낸다.

실시예 2.7. 안전성 테스트

세포독성

재조합 Mb의 잠재적인 독성을 평가하기 위해, 분화된 Caco-2 세포를 매머드 또는 소 Mb, 정제된 소 Mb 또는 대조군으로 완전 배지(CM)로 처리했다. 잠재적인 세포독성 효과를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 배양 상청액에서 락테이트 탈수소효소(LDH)의 수준을 조사했다. LDH는 모든 세포에 존재하는 산화환원효소로, 피루베이트에서 락테이트로의 상호전환과 동시에 NADH에서 NAD+로의 상호전환을 촉매한다. 아폽토시스 또는 괴사에 따른 세포막 손상 시, LDH는 상청액으로 방출되고 그 농도는 LDH에 의한 NAD+의 NADH로의 환원에 기초한 비색 분석에 의해 결정될 수 있다(Decker and Lohmann-Matthes 1988). 본 발명자들은 테스트된 어떤 농도에서도 매머드 Mb와 인큐베이션시 세포독성의 증가를 관찰하지 못했다(도 13). 대조적으로, 소 Mb는 배지 단독과 비교하여 현저하게 증가된 독성을 나타냈다(도 13). 따라서 본원에서 테스트한 고농도에서 매머드 Mb는 소 Mb보다 더 나은 안전성 프로파일을 갖는 것으로 보인다.

유전독성

재조합 미오글로빈의 돌연변이유발 가능성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 박테리아 역돌연변이 테스트(AMES 테스트) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 4가지 히스티딘-요구 균주(TA98, TA100, TA1535, TA1537) 및 에스케리치아 콜라이의 하나의 트립토판-요구 균주(WP2 uvrA)를 사용했다(Ames et al. 1975). 박테리아를 외인성 대사 활성화(S9 믹스)와 함께 또는 없이 0.8, 2.5, 8.0, 25.0, 80.0 또는 250 μg/ml 수준의 매머드 또는 소 미오글로빈에 노출시켰다(표 1). 양성 대조군 물질은 S9의 부재 및 존재 둘 다에서 복귀체의 수에서 예상되는 증가를 유발하여 테스트의 민감도 및 S9 믹스의 활성을 확인했다. 본 발명자들은 테스트한 모든 농도에서 소나 매머드 Mb에 대한 유의한 돌연변이유발 활동을 관찰하지 않았다.

표 1. 매머드 미오글로빈에 노출된 후 복귀체 및 돌연변이 인자의 수. 조건당 총 48개의 웰에 대해 관찰된 복귀체의 평균 수는 검은색으로 표시된다. 상응하는 돌연변이 인자(비히클 단독 대비, 화합물 존재 시 복귀 계수의 비율)는 회색으로 표시된다. 모든 분석을 삼중으로 수행하였다. 상당한 돌연변이 유발이 관찰된 조건은 굵게 강조표시된다. 양성 대조군으로 사용된 화합물은 ^a2-니트로플루오렌 2 μg/ml, ^b아미노안트라센 4 μg/ml, ^cN4-아미노시티딘 100 μg/ml이었다.

	AMES 테스트
균주	TA98		TA100		TA1535
테스트 화합물	-S9	+S9	-S9	+S9	-S9	+S9
비히클	1.33±1.53	1.67±2.08	8.00±2.00	6.00±5.20	2.33±1.53	3.00±1.0
Mb 0.003 μg/μl	0.00±0.00	1.00±0.00	10.0±2.65	7.00±2.65	2.33±0.58	2.33±0.58
	0.00±0.00	0.60±0.00	1.25±0.33	1.17±0.44	1.0±0.25	0.78±0.19
Mb 0.003 μg/μl	2.33±2.52	1.33±1.58	9.33±2.52	4.67±2.08	1.00±1.00	2.67±0.58
	1.75±1.89	0.80±0.35	1.17±0.31	0.78±0.69	0.43±0.43	0.89±0.19
Mb 0.003 μg/μl	1.33±1.53	1.33±2.31	12.33±7.77	9.00±1.73	2.37±1.15	2.33±1.15
	1.00±1.15	0.80±1.39	1.54±0.97	1.50±0.58	1.14±0.49	0.78±0.38
Mb 0.003 μg/μl	0.33±0.58	1.00±1.00	14.67±5.51	7.00±2.00	1.00±1.00	3.00±1.00
	0.25±0.43	0.60±0.60	1.83±0.69	1.17±0.67	0.43±0.43	1.00±0.33
양성 대조군	37.33±2.08 a	48.00±0.00 b	47.67±0.58 c	44.00±5.20 b	48.00±0.00 c	21.33±1.50 b
	28.0±1.56	28.80±0.00	5.96±0.07	7.33±1.73	20.57±0.00	7.11±0.51

<110> Paleo B.V. <120> Meat substitute <130> P6099254PCT <150> EP 20218000.6 <151> 2020-12-31 <150> EP 21174597.1 <151> 2021-05-19 <160> 80 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 127 <212> PRT <213> Mammuthus primigenius <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(127) <223> partial sequence of mammoth myoglobin <400> 1 Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Glu Leu Val Leu Lys Thr Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Glu Ala Asp Ile Pro Gly His Gly Leu Glu Val Phe Val Arg 20 25 30 Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys 35 40 45 His Leu Lys Thr Glu Gly Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys 50 55 60 Gln Gly Val Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr 85 90 95 Lys His Lys Ile Pro Ile Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile 100 105 110 Ile His Val Leu Gln Ser Lys His Pro Ala Glu Phe Gly Ala Asp 115 120 125 <210> 2 <211> 154 <212> PRT <213> Mammuthus primigenius <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(154) <223> mammoth myoglobin <400> 2 Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Glu Leu Val Leu Lys Thr Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Glu Ala Asp Ile Pro Gly His Gly Leu Glu Val Phe Val Arg 20 25 30 Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys 35 40 45 His Leu Lys Thr Glu Gly Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys 50 55 60 Gln Gly Val Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr 85 90 95 Lys His Lys Ile Pro Ile Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile 100 105 110 Ile His Val Leu Gln Ser Lys His Pro Ala Glu Phe Gly Ala Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Ala Met Lys Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Ile Ala 130 135 140 Ala Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Phe Gln Gly 145 150 <210> 3 <211> 154 <212> PRT <213> Mammuthus trogontherii <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(154) <223> steppe mammoth myoglobin <400> 3 Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Glu Leu Val Leu Lys Thr Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Glu Ala Asp Ile Pro Gly His Gly Leu Glu Val Phe Val Arg 20 25 30 Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys 35 40 45 His Leu Lys Thr Glu Gly Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys 50 55 60 Gln Gly Val Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala His Ser His Ala Thr 85 90 95 Lys His Lys Ile Pro Ile Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile 100 105 110 Ile His Val Leu Gln Ser Lys His Pro Ala Glu Phe Gly Ala Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Ala Met Lys Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Ile Ala 130 135 140 Ala Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Phe Gln Gly 145 150 <210> 4 <211> 154 <212> PRT <213> Ovis aries <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(154) <223> sheep myoglobin <400> 4 Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Ala Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Glu Ala Asp Val Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg 20 25 30 Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys 35 40 45 His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys 50 55 60 His Gly Asn Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly His His Glu Ala Glu Val Lys His Leu Ala Glu Ser His Ala Asn 85 90 95 Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile 100 105 110 Ile His Val Leu His Ala Lys His Pro Ser Asp Phe Gly Ala Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Ala Met Ser Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Met Ala 130 135 140 Ala Gln Tyr Lys Val Leu Gly Phe Gln Gly 145 150 <210> 5 <211> 154 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(154) <223> cow myoglobin <400> 5 Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Ala Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Glu Ala Asp Val Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg 20 25 30 Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys 35 40 45 His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys 50 55 60 His Gly Asn Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly His His Glu Ala Glu Val Lys His Leu Ala Glu Ser His Ala Asn 85 90 95 Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile 100 105 110 Ile His Val Leu His Ala Lys His Pro Ser Asp Phe Gly Ala Asp Ala 115 120 125 Gln Ala Ala Met Ser Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Met Ala 130 135 140 Ala Gln Tyr Lys Val Leu Gly Phe His Gly 145 150 <210> 6 <211> 154 <212> PRT <213> Sus scrofa <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(154) <223> pig myoglobin <400> 6 Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Val Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Glu Ala Asp Val Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg 20 25 30 Leu Phe Lys Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys 35 40 45 His Leu Lys Ser Glu Asp Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys 50 55 60 His Gly Asn Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly His His Glu Ala Glu Leu Thr Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr 85 90 95 Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Glu Ala Ile 100 105 110 Ile Gln Val Leu Gln Ser Lys His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Ala Met Ser Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Met Ala 130 135 140 Ala Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Phe Gln Gly 145 150 <210> 7 <211> 154 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(154) <223> chicken myoglobin <400> 7 Met Gly Leu Ser Asp Gln Glu Trp Gln Gln Val Leu Thr Ile Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Glu Ala Asp Ile Ala Gly His Gly His Glu Val Leu Met Arg 20 25 30 Leu Phe His Asp His Pro Glu Thr Leu Asp Arg Phe Asp Lys Phe Lys 35 40 45 Gly Leu Lys Thr Pro Asp Gln Met Lys Gly Ser Glu Asp Leu Lys Lys 50 55 60 His Gly Ala Thr Val Leu Thr Gln Leu Gly Lys Ile Leu Lys Gln Lys 65 70 75 80 Gly Asn His Glu Ser Glu Leu Lys Pro Leu Ala Gln Thr His Ala Thr 85 90 95 Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Glu Val Ile 100 105 110 Ile Lys Val Ile Ala Glu Lys His Ala Ala Asp Phe Gly Ala Asp Ser 115 120 125 Gln Ala Ala Met Lys Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Met Ala 130 135 140 Ser Lys Tyr Lys Glu Phe Gly Phe Gln Gly 145 150 <210> 8 <211> 147 <212> PRT <213> Thunnus orientalis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(147) <223> tuna myoglobin <400> 8 Met Ala Asp Phe Asp Ala Val Leu Lys Cys Trp Gly Pro Val Glu Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Thr Thr Met Gly Gly Leu Val Leu Thr Arg Leu Phe Lys Glu 20 25 30 His Pro Glu Thr Gln Lys Leu Phe Pro Lys Phe Ala Gly Ile Ala Gln 35 40 45 Ala Asp Ile Ala Gly Asn Ala Ala Ile Ser Ala His Gly Ala Thr Val 50 55 60 Leu Lys Lys Leu Gly Glu Leu Leu Lys Ala Lys Gly Ser His Ala Ala 65 70 75 80 Ile Leu Lys Pro Leu Ala Asn Ser His Ala Thr Lys His Lys Ile Pro 85 90 95 Ile Asn Asn Phe Lys Leu Ile Ser Glu Val Leu Val Lys Val Met His 100 105 110 Glu Lys Ala Gly Leu Asp Ala Gly Gln Gln Thr Ala Leu Arg Asn Val 115 120 125 Met Gly Ile Ile Ile Ala Asp Leu Glu Ala Asn Tyr Lys Glu Leu Gly 130 135 140 Phe Ser Gly 145 <210> 9 <211> 382 <212> DNA <213> Mammuthus primigenius <220> <221> misc_feature <222> (1)..(382) <223> DNA sequence coding for partial sequence of mammoth myoglobin <400> 9 atgggactca gcgacgggga atgggagttg gtgttgaaaa cctgggggaa agtggaggct 60 gacatcccgg gccatgggct ggaagtcttc gtcaggctct tcacaggtca tcccgagacc 120 ctggagaagt tcgacaagtt taagcacctg aagacagagg gcgagatgaa ggcctctgag 180 gacctgaaga agcaaggtgt tactgtgctc actgccctgg ggggcatcct caagaagaaa 240 gggcatcacc aggcggagat tcagcccctg gcccagtctc atgccaccaa gcacaagatc 300 cccatcaagt atctggagtt catctcggac gccatcatcc acgttctgca aagcaagcat 360 cctgcggaat ttggcgctga tg 382 <210> 10 <211> 465 <212> DNA <213> Mammuthus primigenius <220> <221> misc_feature <222> (1)..(465) <223> DNA sequence coding for mammoth myoglobin <400> 10 atgggactca gcgacgggga atgggagttg gtgttgaaaa cctgggggaa agtggaggct 60 gacatcccgg gccatgggct ggaagtcttc gtcaggctct tcacaggtca tcccgagacc 120 ctggagaagt tcgacaagtt taagcacctg aagacagagg gcgagatgaa ggcctccgag 180 gacctgaaga agcaaggtgt tactgtgctc actgccctgg ggggcatcct caagaagaaa 240 gggcatcacc aggcggagat tcagcccctg gcccagtctc atgccaccaa gcacaagatc 300 cccatcaagt atctggagtt catctcggac gccatcatcc acgttctgca aagcaagcat 360 cctgcggaat ttggcgctga tgcccaggga gccatgaaaa aggccttgga gctgttccgg 420 aatgacattg cggccaagta taaggagctg gggttccagg gctag 465 <210> 11 <211> 465 <212> DNA <213> Mammuthus trogontherii <220> <221> misc_feature <222> (1)..(465) <223> DNA sequence coding for steppe mammoth myoglobin <400> 11 atgggactca gcgacgggga atgggagttg gtgttgaaaa cctgggggaa agtggaggct 60 gacatcccgg gccatgggct ggaagtcttc gtcaggctct tcacaggtca tcccgagacc 120 ctggagaagt tcgacaagtt taagcacctg aagacagagg gcgagatgaa ggcctccgag 180 gacctgaaga agcaaggtgt tactgtgctc actgccctgg ggggcatcct caagaagaaa 240 gggcatcacc aggcggagat tcagcccctg gcccattctc atgccaccaa gcacaagatc 300 cccatcaagt atctggagtt catctcggac gccatcatcc acgttctgca aagcaagcat 360 cctgcggaat ttggcgctga tgcccaggga gccatgaaaa aggccttgga gctgttccgg 420 aatgacattg cggccaagta taaggagctg gggttccagg gctag 465 <210> 12 <211> 465 <212> DNA <213> Ovis aries <220> <221> misc_feature <222> (1)..(465) <223> DNA sequence coding for sheep myoglobin <400> 12 atggggctca gcgacgggga atggcagttg gtgctgaatg cctgggggaa ggtggaggct 60 gatgtcgcag gccatgggca ggaggtcctc atcaggctct tcacaggtca tcccgagacc 120 ctggagaaat ttgacaagtt caagcacctg aagacagagg ctgagatgaa ggcctccgag 180 gacctgaaga agcatggcaa caccgtgctc acggccctag ggggtatcct gaaaaagaag 240 ggtcaccacg aggcggaggt gaagcacctg gccgagtcac acgccaacaa gcacaagatc 300 cctgtcaagt acctggagtt catctcggac gccatcatcc atgttctgca tgccaagcat 360 ccttcagact tcggtgctga tgcacaggga gccatgagca aggccctgga actgttccgg 420 aacgacatgg ctgcccagta caaggtgctg ggcttccagg gctaa 465 <210> 13 <211> 465 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(465) <223> DNA sequence coding for cow myoglobin <400> 13 atggggctca gcgacgggga atggcagttg gtgctgaatg cctgggggaa ggtggaggct 60 gatgtcgcag gccatgggca ggaggtcctc atcaggctct tcacaggtca tcccgagacc 120 ctggagaaat ttgacaagtt caagcacctg aagacagagg ctgagatgaa ggcctccgag 180 gacctgaaga agcatggcaa cacggtgctc acggccctgg ggggtatcct gaagaaaaag 240 ggtcaccatg aggcagaggt gaagcacctg gccgagtcac atgccaacaa gcacaagatc 300 cctgtcaagt acctggagtt catctcggac gccatcatcc atgttctaca tgccaagcat 360 ccttcagact tcggtgctga tgcccaggct gccatgagca aggccctgga actgttccgg 420 aatgacatgg ctgcccagta caaggtgctg ggcttccatg gctaa 465 <210> 14 <211> 465 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(465) <223> DNA sequence coding for pig myoglobin <400> 14 atggggctca gcgacgggga atggcagctg gtgctgaacg tctgggggaa ggtggaggct 60 gatgtcgcag gccatgggca ggaggtcctc atcaggctct ttaagggtca ccccgagacc 120 ctggagaaat ttgataagtt taagcacctg aagtcagagg atgagatgaa ggcctctgag 180 gacctgaaga agcacggcaa cacggtgctg actgccctgg ggggcatcct taagaagaag 240 gggcatcatg aggcagagct gacgcccctg gcccaatcgc atgccaccaa gcacaagatc 300 cctgtcaagt acctggagtt catctcagaa gccatcatcc aggttctgca gagcaagcat 360 cctggggact ttggtgctga cgcccaggga gccatgagca aggccctgga actcttccgg 420 aacgacatgg cggccaagta caaggagctg ggcttccagg gctaa 465 <210> 15 <211> 465 <212> DNA <213> Gallus gallus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(465) <223> DNA sequence coding for chicken myoglobin <400> 15 atggggctca gcgaccagga gtggcaacaa gtcctcacca tctggggaaa agtggaggcc 60 gacattgctg gccatggaca cgaggttctg atgagacttt tccatgacca ccctgagact 120 ttggatcgct ttgataagtt caaaggcctg aagacccctg atcagatgaa gggctctgaa 180 gatctgaaga aacatggagc tactgtcctc acccagcttg gcaaaatcct gaagcagaag 240 ggtaatcatg agtcagagct gaagcccctg gctcaaaccc atgccacgaa gcacaaaatc 300 ccagtcaaat atctggagtt catttctgaa gtcattatca aggtcattgc tgaaaaacat 360 gccgcagact ttggggccga ttcccaggct gccatgaaga aggctctgga gttgttccga 420 aatgacatgg ccagcaagta caaggagttt ggtttccagg gttag 465 <210> 16 <211> 444 <212> DNA <213> Thunnus orientalis <220> <221> misc_feature <222> (1)..(444) <223> DNA sequence coding for tuna myoglobin <400> 16 atggctgact ttgatgcagt tctgaagtgt tggggtccag tggaggcgga ctacaccacc 60 attggaggcc tggttctgac ccgtttattc aaagagcacc ctgagaccca gaagctgttc 120 cccaaattcg ctggcatcgc ccaggctgac atagccggta acgcagctgt ttctgctcat 180 ggtgccactg tgctgaagaa acttggagag ctgctgaagg ccaaaggcag tcacgctgcc 240 atcctaaaac cactggcaaa cagccatgcc actaagcaca agattcccat taataacttc 300 aagctgattt ctgaggtcct tgtgaaggtc atgcatgaga aggcaggact cgatgccggt 360 gggcagacag ccctgaggaa cgtgatgggt atcatcatcg ccgaccttga ggccaactac 420 aaagagctgg gcttctctgg ctga 444 <210> 17 <211> 175 <212> PRT <213> Mammuthus primigenius <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(175) <223> mammoth casein k <400> 17 Met Lys Gly Phe Leu Leu Val Val Asn Ile Leu Leu Leu Pro Leu Phe 1 5 10 15 Leu Ala Ala Glu Val Gln Asn Gln Glu Glu Ser Arg Cys Leu Glu Lys 20 25 30 Asp Glu Arg Trp Phe Cys Gln Lys Ala Val Lys Tyr Ile Pro Asn Asp 35 40 45 Tyr Val Leu Lys Ser Tyr Tyr Arg Tyr Glu Pro Asn Tyr Asn Gln Phe 50 55 60 Arg Ala Ala Val Pro Ile Asn Asn Pro Tyr Leu Ile Tyr Leu Tyr Pro 65 70 75 80 Ala Lys Gln Val Ala Val Arg Pro His Thr Gln Ile Gln Trp Gln Val 85 90 95 Pro Ser Asn Ile Tyr Pro Ser Pro Ser Val Pro His Thr Tyr Leu Lys 100 105 110 Pro Pro Phe Ile Ile Pro Pro Lys Lys Thr Gln Asp Lys Pro Ile Ile 115 120 125 Pro Pro Thr Gly Thr Val Ala Ser Ile Glu Ala Thr Val Glu Pro Lys 130 135 140 Val Asn Thr Val Val Asn Ala Glu Ala Ser Ser Glu Phe Ile Ala Thr 145 150 155 160 Asn Thr Pro Glu Ala Thr Thr Val Pro Val Ile Ser Pro Gln Ile 165 170 175 <210> 18 <211> 260 <212> PRT <213> Mammuthus primigenius <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(260) <223> mammoth casein beta <400> 18 Met Lys Val Phe Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Phe Ala Leu Gly Arg 1 5 10 15 Glu Thr Val Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Ile Arg Gln Phe Tyr Ser 20 25 30 Glu Gln Lys Pro Glu Gly Val Lys His Glu Glu Gln Gln Arg Glu Asp 35 40 45 Glu His Gln Asn Lys Ile Gln Pro Leu Phe Gln Pro Gln Pro Leu Val 50 55 60 Tyr Pro Phe Ala Glu Pro Ile Pro Tyr Thr Val Phe Pro Pro Asn Ala 65 70 75 80 Ile Pro Leu Ala Gln Pro Ile Val Val Leu Pro Phe Pro Gln Pro Glu 85 90 95 Val Gln Leu Pro Glu Ala Lys Glu Ile Thr Phe Pro Arg Gln Lys Leu 100 105 110 Met Ser Phe Leu Lys Ser Pro Val Met Pro Phe Phe Asp Pro Gln Pro 115 120 125 Asn Leu Gly Thr Asp Leu Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu 130 135 140 Gln Pro Leu Arg His Gln Leu His Gln Pro Leu Ala Gln Thr Pro Val 145 150 155 160 Leu Pro Leu Pro Leu Ser Leu Pro Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Gln 165 170 175 Val Ile Pro Tyr Pro Gln Arg Gly Arg Pro Ile Gln Asn Leu Leu Tyr 180 185 190 Glu Glu Pro Leu Leu Asp Pro Thr Arg Lys Ile Tyr Pro Val Ala Gln 195 200 205 Pro Leu Ala Pro Val Tyr Asn Pro Val Ala Tyr Met Ile Gly Ile Pro 210 215 220 Cys Cys Ser Thr Leu Leu Thr Tyr Leu His Gln Ser Ser Arg Ser Gln 225 230 235 240 Tyr Pro Ile Gln Asn Lys Leu Gly Tyr Leu Ile Ala Met Pro Lys Lys 245 250 255 Val Arg Pro Thr 260 <210> 19 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized nucleotide sequence encoding for a steppe mammoth myoglobin <400> 19 ggtttgtctg atggtgaatg ggagttggtt ttgaagactt ggggtaaagt tgaggctgat 60 attcctggtc atggtttgga ggtttttgtt agattgttca ctggtcatcc agaaactttg 120 gagaagttcg ataagttcaa acatttgaag actgagggtg aaatgaaggc ttctgaggat 180 ttgaaaaagc aaggtgttac tgttttgact gctttgggtg gtattttgaa gaagaaaggt 240 caccatcaag ctgaaattca accattggct cactctcatg ctactaaaca caagattcca 300 attaagtact tggagttcat ttctgatgct attattcacg ttttgcaatc taagcatcca 360 gctgaatttg gtgctgatgc tcaaggtgct atgaaaaagg ctttggagtt gttcagaaac 420 gatattgctg ctaaatacaa ggagttgggt ttccaaggtt aa 462 <210> 20 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized nucleotide sequence encoding for a sheep myoglobin <400> 20 ggtttgtctg atggtgaatg gcaattggtt ttgaacgctt ggggtaaagt tgaggctgat 60 gttgctggtc atggtcaaga agttttgatt agattgttca ctggtcaccc tgaaactttg 120 gagaagtttg ataagttcaa acacttgaag actgaggctg aaatgaaggc ttctgaggat 180 ttgaaaaagc atggtaacac tgttttgact gctttgggtg gtattttgaa gaagaaaggt 240 caccatgaag ctgaggttaa gcacttggct gaatctcacg ctaacaagca caaaattcct 300 gttaagtact tggagttcat ttctgatgct attattcatg ttttgcacgc taagcatcca 360 tctgatttcg gtgctgatgc tcaaggtgct atgtctaagg ctttggaatt gttcagaaac 420 gatatggctg ctcaatacaa ggttttgggt ttccaaggtt aa 462 <210> 21 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized nucleotide sequence encoding for a cattle myoglobin <400> 21 ggtttgtctg atggtgaatg gcaattggtt ttgaacgctt ggggtaaagt tgaggctgat 60 gttgctggtc atggtcaaga ggttttgatt agattgttca ctggtcatcc agaaactttg 120 gagaagtttg ataaattcaa gcacttgaag actgaagctg agatgaaggc ttctgaggat 180 ttgaaaaagc acggtaacac tgttttgact gctttgggtg gtattttgaa gaaaaagggt 240 caccatgagg ctgaagttaa gcacttggct gaatctcatg ctaacaagca caaaattcct 300 gttaagtact tggagttcat ttctgatgct attattcacg ttttgcatgc taagcaccca 360 tctgatttcg gtgctgatgc tcaagctgct atgtctaagg ctttggagtt gtttagaaac 420 gatatggctg ctcaatacaa ggttttgggt ttccacggtt aa 462 <210> 22 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized nucleotide sequence encoding for a pig myoglobin <400> 22 ggtttgtctg atggtgaatg gcaattggtt ttgaacgttt ggggtaaagt tgaggctgat 60 gttgctggtc atggtcaaga ggttttgatt agattgttca agggtcatcc agaaactttg 120 gagaaatttg ataagttcaa gcacttgaag tctgaagatg agatgaaggc ttctgaggat 180 ttgaagaaac acggtaacac tgttttgact gctttgggtg gtattttgaa aaagaaaggt 240 caccatgaag ctgagttgac tccattggct caatctcatg ctactaagca caagattcca 300 gttaaatact tggagtttat ttctgaggct attattcaag ttttgcaatc taagcatcct 360 ggtgacttcg gtgctgatgc tcaaggtgct atgtctaagg ctttggagtt gttcagaaac 420 gatatggctg ctaagtacaa ggagttgggt ttccaaggtt aa 462 <210> 23 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized nucleotide sequence encoding for a chicken myoglobin <400> 23 ggtttgtctg atcaagaatg gcaacaagtt ttgactattt ggggtaaagt tgaggctgat 60 attgctggtc atggtcacga ggttttgatg agattgttcc atgatcaccc agaaactttg 120 gatagattcg ataagttcaa gggtttgaaa actccagatc aaatgaaggg ttctgaggat 180 ttgaagaaac acggtgctac tgttttgact caattgggta aaattttgaa gcaaaaaggt 240 aaccatgagt ctgaattgaa gccattggct caaactcacg ctactaagca caagattcct 300 gttaagtact tggagttcat ttctgaggtt attattaagg ttattgctga aaagcatgct 360 gctgatttcg gtgctgattc tcaagctgct atgaaaaagg ctttggaatt gttcagaaac 420 gatatggctt ctaaatacaa ggagttcggt tttcaaggtt aa 462 <210> 24 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized nucleotide sequence encoding for a tuna myoglobin <400> 24 gctgatttcg atgctgtttt gaagtgttgg ggtccagttg aagctgatta cactactatt 60 ggtggtttgg ttttgactag attgttcaag gagcatccag aaactcaaaa gttgtttcca 120 aagttcgctg gtattgctca agctgatatt gctggtaacg ctgctgtttc tgctcatggt 180 gctactgttt tgaagaaatt gggtgaattg ttgaaggcta aaggttctca tgctgctatt 240 ttgaagccat tggctaactc tcacgctact aaacacaaga ttccaattaa caatttcaag 300 ttgatttctg aggttttggt taaggttatg cacgaaaagg ctggtttgga tgctggtggt 360 caaactgctt tgagaaacgt tatgggtatt attattgctg atttggaagc taactacaag 420 gaattgggtt tttctggtta a 441 <210> 25 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene construct for expressing a steppe mammoth myoglobin <400> 25 atgagattcc catctatttt cactgctgtt ttgttcgctg cttcttctgc tttggctgct 60 ccagttaata ctactactga ggatgaaact gctcaaattc cagctgaagc tgttattggt 120 tactctgatt tggagggtga cttcgatgtt gctgttttgc cattctctaa ctctactaat 180 aacggtttgt tgtttattaa cactactatt gcttctattg ctgctaagga agagggtgtt 240 tctttggaga agagagaagc tgaagctggt ttgtctgatg gtgaatggga gttggttttg 300 aagacttggg gtaaagttga ggctgatatt cctggtcatg gtttggaggt ttttgttaga 360 ttgttcactg gtcatccaga aactttggag aagttcgata agttcaaaca tttgaagact 420 gagggtgaaa tgaaggcttc tgaggatttg aaaaagcaag gtgttactgt tttgactgct 480 ttgggtggta ttttgaagaa gaaaggtcac catcaagctg aaattcaacc attggctcac 540 tctcatgcta ctaaacacaa gattccaatt aagtacttgg agttcatttc tgatgctatt 600 attcacgttt tgcaatctaa gcatccagct gaatttggtg ctgatgctca aggtgctatg 660 aaaaaggctt tggagttgtt cagaaacgat attgctgcta aatacaagga gttgggtttc 720 caaggttaa 729 <210> 26 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene construct for expressing a sheep myoglobin <400> 26 atgagattcc catctatttt cactgctgtt ttgttcgctg cttcttctgc tttggctgct 60 cctgttaata ctactactga ggatgaaact gctcaaattc ctgctgaagc tgttattggt 120 tattctgatt tggagggtga cttcgatgtt gctgttttgc ctttctctaa ctctactaat 180 aacggtttgt tgttcattaa cactactatt gcttctattg ctgctaagga agagggtgtt 240 tctttggaaa agagagaggc tgaagctggt ttgtctgatg gtgaatggca attggttttg 300 aacgcttggg gtaaagttga ggctgatgtt gctggtcatg gtcaagaagt tttgattaga 360 ttgttcactg gtcaccctga aactttggag aagtttgata agttcaaaca cttgaagact 420 gaggctgaaa tgaaggcttc tgaggatttg aaaaagcatg gtaacactgt tttgactgct 480 ttgggtggta ttttgaagaa gaaaggtcac catgaagctg aggttaagca cttggctgaa 540 tctcacgcta acaagcacaa aattcctgtt aagtacttgg agttcatttc tgatgctatt 600 attcatgttt tgcacgctaa gcatccatct gatttcggtg ctgatgctca aggtgctatg 660 tctaaggctt tggaattgtt cagaaacgat atggctgctc aatacaaggt tttgggtttc 720 caaggttaa 729 <210> 27 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene construct for expressing a cattle myoglobin <400> 27 atgagattcc cttctatttt cactgctgtt ttgttcgctg cttcttctgc tttggctgct 60 ccagttaaca ctactactga ggatgaaact gctcaaattc cagctgaagc tgttattggt 120 tactctgatt tggagggtga cttcgatgtt gctgttttgc cattctctaa ctctactaac 180 aatggtttgt tgttcattaa cactactatt gcttctattg ctgctaagga ggaaggtgtt 240 tctttggaga agagagaagc tgaggctggt ttgtctgatg gtgaatggca attggttttg 300 aacgcttggg gtaaagttga ggctgatgtt gctggtcatg gtcaagaggt tttgattaga 360 ttgttcactg gtcatccaga aactttggag aagtttgata aattcaagca cttgaagact 420 gaagctgaga tgaaggcttc tgaggatttg aaaaagcacg gtaacactgt tttgactgct 480 ttgggtggta ttttgaagaa aaagggtcac catgaggctg aagttaagca cttggctgaa 540 tctcatgcta acaagcacaa aattcctgtt aagtacttgg agttcatttc tgatgctatt 600 attcacgttt tgcatgctaa gcacccatct gatttcggtg ctgatgctca agctgctatg 660 tctaaggctt tggagttgtt tagaaacgat atggctgctc aatacaaggt tttgggtttc 720 cacggttaa 729 <210> 28 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene construct for expressing a pig myoglobin <400> 28 atgagattcc catctatttt cactgctgtt ttgttcgctg cttcttctgc tttggctgct 60 ccagttaaca ctactactga ggatgaaact gctcaaattc cagctgaagc tgttattggt 120 tactctgatt tggagggtga cttcgatgtt gctgttttgc cattctctaa ttctactaac 180 aatggtttgt tgttcattaa cactactatt gcttctattg ctgctaagga agagggtgtt 240 tctttggaga agagagaagc tgaggctggt ttgtctgatg gtgaatggca attggttttg 300 aacgtttggg gtaaagttga ggctgatgtt gctggtcatg gtcaagaggt tttgattaga 360 ttgttcaagg gtcatccaga aactttggag aaatttgata agttcaagca cttgaagtct 420 gaagatgaga tgaaggcttc tgaggatttg aagaaacacg gtaacactgt tttgactgct 480 ttgggtggta ttttgaaaaa gaaaggtcac catgaagctg agttgactcc attggctcaa 540 tctcatgcta ctaagcacaa gattccagtt aaatacttgg agtttatttc tgaggctatt 600 attcaagttt tgcaatctaa gcatcctggt gacttcggtg ctgatgctca aggtgctatg 660 tctaaggctt tggagttgtt cagaaacgat atggctgcta agtacaagga gttgggtttc 720 caaggttaa 729 <210> 29 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene construct for expressing a chicken myoglobin <400> 29 atgagattcc catctatttt cactgctgtt ttgttcgctg cttcttctgc tttggctgct 60 ccagttaaca ctactactga agatgagact gctcaaattc ctgctgaagc tgttattggt 120 tactctgatt tggagggtga cttcgatgtt gctgttttgc ctttttctaa ctctactaac 180 aatggtttgt tgttcattaa cactactatt gcttctattg ctgctaagga agagggtgtt 240 tctttggaga aaagagaggc tgaagctggt ttgtctgatc aagaatggca acaagttttg 300 actatttggg gtaaagttga ggctgatatt gctggtcatg gtcacgaggt tttgatgaga 360 ttgttccatg atcacccaga aactttggat agattcgata agttcaaggg tttgaaaact 420 ccagatcaaa tgaagggttc tgaggatttg aagaaacacg gtgctactgt tttgactcaa 480 ttgggtaaaa ttttgaagca aaaaggtaac catgagtctg aattgaagcc attggctcaa 540 actcacgcta ctaagcacaa gattcctgtt aagtacttgg agttcatttc tgaggttatt 600 attaaggtta ttgctgaaaa gcatgctgct gatttcggtg ctgattctca agctgctatg 660 aaaaaggctt tggaattgtt cagaaacgat atggcttcta aatacaagga gttcggtttt 720 caaggttaa 729 <210> 30 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene construct for expressing a tuna myoglobin <400> 30 atgagattcc cttctatttt cactgctgtt ttgtttgctg cttcttctgc tttggctgct 60 ccagttaaca ctactactga agatgagact gctcaaattc cagctgaagc tgttattggt 120 tactctgatt tggagggtga cttcgatgtt gctgttttgc cattctctaa ctctactaat 180 aacggtttgt tgtttattaa cactactatt gcttctattg ctgctaagga ggaaggtgtt 240 tctttggaga aaagagaagc tgaggctgct gatttcgatg ctgttttgaa gtgttggggt 300 ccagttgaag ctgattacac tactattggt ggtttggttt tgactagatt gttcaaggag 360 catccagaaa ctcaaaagtt gtttccaaag ttcgctggta ttgctcaagc tgatattgct 420 ggtaacgctg ctgtttctgc tcatggtgct actgttttga agaaattggg tgaattgttg 480 aaggctaaag gttctcatgc tgctattttg aagccattgg ctaactctca cgctactaaa 540 cacaagattc caattaacaa tttcaagttg atttctgagg ttttggttaa ggttatgcac 600 gaaaaggctg gtttggatgc tggtggtcaa actgctttga gaaacgttat gggtattatt 660 attgctgatt tggaagctaa ctacaaggaa ttgggttttt ctggttaa 708 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 31 Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Glu Leu Val Leu Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 32 Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Glu Leu Val Leu Lys 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 33 Leu Ser Asp Gly Glu Trp Glu Leu Val Leu Lys 1 5 10 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 34 Lys Thr Trp Gly Lys Val Glu Ala Asp Ile Pro Gly His Gly Leu Glu 1 5 10 15 Val Phe Val Arg 20 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 35 Lys Val Glu Ala Asp Ile Pro Gly His Gly Leu Glu Val Phe 1 5 10 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 36 Lys Val Glu Ala Asp Ile Pro Gly His Gly Leu Glu Val Phe Val Arg 1 5 10 15 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 37 Ala Asp Ile Pro Gly His Gly Leu Glu Val Phe Val Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 38 Asp Ile Pro Gly His Gly Leu Glu Val Phe Val Arg 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 39 Arg Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 40 Arg Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys 1 5 10 <210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 41 Arg Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp 1 5 10 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 42 Arg Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys 1 5 10 15 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 43 Arg Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe 1 5 10 15 Lys <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 44 Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys 1 5 10 <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 45 Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 46 Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 47 Lys His Leu Lys Thr Glu Gly Glu Met Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 48 Lys Thr Glu Gly Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 49 Lys Lys Gln Gly Val Thr Val Leu Thr Ala Leu 1 5 10 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 50 Lys Lys Gln Gly Val Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys 1 5 10 15 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 51 Lys Gln Gly Val Thr Val Leu Thr Ala Leu 1 5 10 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 52 Lys Gln Gly Val Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys 1 5 10 15 <210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 53 Lys Gln Gly Val Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys 1 5 10 15 <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 54 Gln Gly Val Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys 1 5 10 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 55 Gly Val Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys 1 5 10 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 56 Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 57 Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 58 Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys 1 5 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 59 Lys Lys Lys Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu 1 5 10 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 60 Lys Lys Lys Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala His 1 5 10 15 <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 61 Lys Lys Lys Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala His Ser 1 5 10 15 His Ala Thr Lys 20 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 62 Lys Lys Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu 1 5 10 <210> 63 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 63 Lys Lys Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala His 1 5 10 <210> 64 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 64 Lys Lys Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala His Ser His 1 5 10 15 Ala Thr Lys <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 65 Lys Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu 1 5 10 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 66 Lys Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala His 1 5 10 <210> 67 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 67 Lys Gly His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala His Ser His Ala 1 5 10 15 Thr Lys <210> 68 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 68 His His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala His Ser His Ala Thr Lys 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 69 His Gln Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala His Ser His Ala Thr Lys 1 5 10 15 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 70 Ala Glu Ile Gln Pro Leu Ala His Ser His Ala Thr Lys 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 71 Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile Ile His 1 5 10 <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 72 Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile Ile His Val Leu Gln Ser 1 5 10 15 Lys <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 73 Phe Ile Ser Asp Ala Ile Ile His Val Leu Gln Ser Lys 1 5 10 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 74 Asp Ala Ile Ile His Val Leu Gln Ser Lys 1 5 10 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 75 Lys His Pro Ala Glu Phe Gly Ala Asp Ala Gln 1 5 10 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 76 Lys His Pro Ala Glu Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gly Ala Met Lys 1 5 10 15 <210> 77 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 77 Lys His Pro Ala Glu Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gly Ala Met Lys Lys 1 5 10 15 <210> 78 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 78 Pro Ala Glu Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gly Ala Met Lys 1 5 10 <210> 79 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 79 Pro Ala Glu Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gly Ala Met Lys Lys 1 5 10 <210> 80 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide in MS analysis <400> 80 Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Ile Ala Ala Lys 1 5 10

Claims (21)

1. 매머드, 돼지, 양, 소, 닭 또는 참치의 동물 미오글로빈 또는 이들로부터 유래된 동물 미오글로빈을 포함하는 육류 대체물 또는 식품 성분.
2. 제1항에 있어서, 상기 미오글로빈은 대초원 매머드, 털 매머드의 것 또는 이들로부터 유래된 것인, 육류 대체물 또는 식품 성분.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 동물 미오글로빈은 하기 아미노산 서열 중 하나로 나타내어지는, 육류 대체물 또는 식품 성분:
   - a) 서열번호 3과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고 다음 아미노산 조합 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열:
   o 위치 30에서 F, 및/또는
   o 위치 65에서 Q, 및/또는
   o 위치 92에서 H, 및/또는
   o 위치 94에서 H, 및/또는
   o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q, 및/또는
   o 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H, 및/또는
   o 위치 30에서 F 및 위치 94에서 H, 및/또는
   o 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는
   o 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는
   o 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는
   o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H, 및/또는
   o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 94에서 H, 및/또는
   o 위치 30에서 F 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는
   o 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H, 및/또는
   o 위치 30에서 F 및 위치 65에서 Q 및 위치 92에서 H 및 위치 94에서 H;
   - b) 서열번호 2 또는 3과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 2 또는 3 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I, 위치 123에서 E 및/또는 위치 143에서 I;
   - c) 서열번호 1과 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 1 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 9에서 E, 위치 13에서 K, 위치 14에서 T, 위치 23에서 P, 위치 27에서 L, 위치 31에서 V, 위치 54에서 G, 위치 65에서 Q, 위치 67에서 V, 위치 84에서 Q, 위치 88에서 Q, 위치 102에서 I 및/또는 위치 123에서 E;
   - d) 서열번호 4, 5 또는 6과 적어도 70%의 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 4, 5 또는 6 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 13에서 N, 위치 27에서 Q, 위치 31에서 I, 위치 67에서 N, 위치 128에서 A, 위치 133에서 S, 위치 145에서 A 및/또는 위치 150에서 L;
   - e) 서열번호 7과 적어도 70%의 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하고 선택적으로 서열번호 7 내의 다음 위치에서 다음 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열: 위치 6에서 Q, 위치 10에서 Q, 위치 13에서 T, 위치 14에서 I, 위치 27에서 H, 위치 31에서 M, 위치 35에서 H, 위치 36에서 D, 위치 42에서 D, 위치 43에서 R, 위치 49에서 G, 위치 53에서 P, 위치 55에서 Q, 위치 58에서 G, 위치 67에서 A, 위치 72에서 Q, 위치 75에서 K, 위치 79에서 Q, 위치 82에서 N, 위치 85에서 S, 위치 93에서 T, 위치 111에서 V, 위치 116에서 I, 위치 117에서 A, 위치 118에서 E, 위치 121에서 A, 위치 128에서 S, 위치 133에서 K, 위치 145에서 S 및/또는 위치 150에서 F; 또는
   - f) 서열번호 8과 적어도 70%의 동일성을 포함하고, 위치 65에서 Q 또는 H 및 위치 94에서 H를 포함하는 아미노산 서열.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대두 식물의 뿌리 혹에서 공생하는 박테리아에 의해 생성된 레그헤모글로빈을 포함하지 않고/않거나 유일한 헴-함유 단백질로서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 미오글로빈을 포함하는, 육류 대체물 또는 식품 성분.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 육류 대체물은 육류의 양태, 형태, 구조, 조성, 풍미, 질감, 색, 향, 외관 및/또는 영양가를 모방하는, 육류 대체물.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식품 성분은 육류의 조성, 풍미, 색상, 향 및/또는 영양가를 모방하는, 식품 성분.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 미오글로빈을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 작제물.
8. 제7항에 있어서, 상기 핵산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 작제물:
   (a) 제3항 a), b), c), 또는 d)에서 정의된 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
   (b) 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
   (c) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 (b)의 뉴클레오티드 서열의 서열과 다른 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는, 유전자 작제물.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드, 바람직하게는 발현된 미오글로빈의 배설을 촉진하는 신호 펩티드를 추가로 포함하는, 유전자 작제물.
11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 19, 20, 21, 22, 23 또는 24로 표시되는, 유전자 작제물.
12. 제11항에 있어서, 상기 유전자 작제물은 서열번호 25, 26, 27, 28, 29 또는 30으로 표시되는, 유전자 작제물.
13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 유전자 작제물을 포함하는 벡터.
14. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 유전자 작제물을 포함하는 숙주 세포.
15. 제14항에 있어서, 원핵생물 또는 진핵생물인, 숙주 세포.
16. 제14항 또는 제15항의 숙주 세포를 적합한 배지에서 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 미오글로빈을 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 미오글로빈을 생산하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 생산된 미오글로빈은 신호 펩티드를 포함하지 않는, 방법.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 회수된 미오글로빈은 정제되는, 바람직하게는 실질적으로 정제되는, 방법.
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 미오글로빈을 세포외로 생산하는, 방법.
20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법으로부터 수득할 수 있는 미오글로빈을 육류 대체물 또는 식품 성분으로 제형화하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 육류 대체물 또는 식품 성분을 제조하는 방법.
21. 서열번호 3을 포함하는 서열로 표시될 수 있는 단백질.