ES2987358T3

ES2987358T3 - Método para preparar un alimento para animales domésticos

Info

Publication number: ES2987358T3
Application number: ES22181886T
Authority: ES
Inventors: Jong Andy De; Hermes Sanctorum; Elsa Lauwers
Original assignee: Paleo BV
Current assignee: Paleo BV
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2024-11-14
Anticipated expiration: 2042-06-29
Also published as: AU2023296611A1; EP4278900A1; WO2024003117A1; CN120152622A; CA3260590A1; EP4278900B1; EP4278900C0

Abstract

Se describe en este documento un método para preparar un alimento para mascotas, en donde el método comprende agregar una mioglobina aislada, en donde la mioglobina aislada es una mioglobina de rata, una mioglobina de conejo, una mioglobina de ratón, una mioglobina de mamut o una mioglobina de atún. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para preparar un alimento para animales domésticos

Campo

[0001] La presente invención se refiere a un método para preparar un alimento para animales domésticos, donde el método comprende añadir una mioglobina aislada, donde la mioglobina aislada es una mioglobina de rata, una mioglobina de conejo, una mioglobina de ratón, una mioglobina de mamut o una mioglobina de atún.

Antecedentes

[0002] El creciente conocimiento sobre la nutrición para animales domésticos y la tecnología de los alimentos ha permitido a la industria desarrollarse y diversificarse en cuanto al tipo, sabor, composición y forma de los alimentos para animales domésticos. Sin embargo, los alimentos comerciales para animales domésticos están altamente procesados, lo que significa que el valor nutricional junto con el sabor y la textura pueden perderse durante la producción industrial.

[0003] Frente a estos antecedentes, existe un esfuerzo continuo por desarrollar sustitutos de la carne como alimentos para animales domésticos para reducir su huella ecológica. Para estos tipos de alimentos para animales domésticos, obtener un sabor y una textura cercanos a los de la carne sin procesar es difícil, y supone un obstáculo para obtener un nivel umbral de aceptación del alimento por los animales.

[0004] Por lo tanto, existe una necesidad continua en la técnica de alimentos para animales domésticos que imiten ciertos aspectos, tales como el sabor y la textura, de la carne, siendo al mismo tiempo respetuosos con el medio ambiente.

Descripción

Método para preparar un alimento para animales domésticos

[0005] En el primer aspecto de esta invención, se proporciona un método para preparar un alimento para animales domésticos, donde el método comprende añadir una mioglobina aislada, donde dicha mioglobina aislada es una mioglobina de rata, una mioglobina de conejo, una mioglobina de ratón, una mioglobina de mamut o una mioglobina de atún.

[0006] En una forma de realización, el animal doméstico es un vertebrado. En una forma de realización, el animal doméstico es un mamífero, un ave, un pez, un anfibio o un reptil. En una forma de realización, el animal de compañía es un mamífero. Los mamíferos son un grupo de vertebrados que constituyen la clasemammalia,caracterizados por la presencia de glándulas mamarias que en las hembras producen leche para alimentar (amamantar) a sus crías, un neocórtex (una región del cerebro), pelaje o pelo, y tres huesos del oído medio. En una forma de realización, el animal doméstico es un carnívoro o un omnívoro, preferiblemente un mamífero. En una forma de realización preferida, el animal doméstico puede ser un perro, un gato, un hurón, un zorro, un oso, un lobo, un jaguar, un león, un tigre, una serpiente, una piraña o un aligátor. En una forma de realización preferida, el animal doméstico puede ser un perro o un gato.

[0007] En una forma de realización, una rata es de cualquier especie del géneroRattus.En una forma de realización más preferida, una rata es una rata negra(Rattus rattus)o una rata marrón(Rattus norvegicus).Diferentes especies del géneroRattuspueden compartir la misma secuencia de mioglobina.

[0008] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos es un alimento para animales domésticos seco, un alimento para animales domésticos semihúmedo, un alimento para animales domésticos húmedo, o cualquier combinación de estos tipos de alimentos para animales domésticos. Un alimento para animales domésticos puede formularse como un alimento para animales domésticos líquido, sólido o semisólido. Por "alimento para animales domésticos seco" se entiende aquel que tiene un contenido de humedad inferior al 15 por ciento en peso. Por "alimento para animales domésticos semihúmedo" se entiende aquel que tiene un contenido de humedad entre el 55 y el 65 por ciento en peso. Por "alimento para animales domésticos húmedo" se entiende aquel que tiene un contenido de humedad entre el 75 y 85 por ciento en peso. En lo sucesivo, se entiende que todos los porcentajes referidos son en peso, a menos que se especifique lo contrario, y se basan en el peso del producto alimenticio final para animales domésticos. Los ejemplos adecuados de alimentos sólidos para animales domésticos incluyen pienso,snacks,carnes de origen celular y sustitutos de la carne, carnes cultivadas y sustitutos de la carne, y sustitutos de la carne de origen vegetal. Los ejemplos adecuados desnacksincluyen una barrita de proteína, unsnackdental, cubitos de carne o palitos masticables. Tales carnes de origen vegetal pueden comprender proteínas vegetales tales como proteínas de soja. Los ejemplos adecuados de alimentos para animales domésticos de tipo semihúmedo incluyen trozos en salsa o en forma de gelatina o pastel de carne. Los ejemplos adecuados de alimentos para animales domésticos líquidos o de tipo húmedo incluyen sopa.

[0009] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos es un sustituto de la carne. Un sustituto de la carne por definición no es carne, no es carne natural, ni carne genuina. Un sustituto de la carne puede considerarse como un producto comestible o alimenticio que no se produce de manera natural. Significa que, dentro del contexto de esta invención, un sustituto de la carne no es carne de rata, conejo, ratón o atún ni deriva de los mismos (o de mamut, o derivada del mismo, si este animal todavía existiera, que no es el caso). Un sustituto de la carne es sinónimo de una réplica de la carne o un producto análogo de la carne o un producto similar a la carne. Por lo tanto, se entiende que las carnes de origen celular, las carnes cultivadas y las carnes de origen vegetal pueden considerarse sustitutos de la carne. La carne de origen celular se cultiva normalmente directamente a partir de células madre animales. La carne cultivada se produce normalmente mediante cultivos celulares in vitro de células animales, como una forma de agricultura celular. La carne de origen vegetal se produce normalmente usando productos vegetales y otros productos no animales.

[0010] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos es un sustituto de la carne, donde el sustituto de la carne es un sustituto de la carne de origen celular, un sustituto de la carne cultivado o un sustituto de la carne de origen vegetal. Los sustitutos de la carne pueden ser alimentos para animales domésticos secos, alimentos para animales domésticos semihúmedos, alimentos para animales domésticos húmedos o cualquier combinación de estos tipos de alimentos para animales domésticos. Los inventores descubrieron que la "experiencia cárnica" de un alimento para animales domésticos que comprende carne podría imitarse en un sustituto de la carne añadiendo una mioglobina aislada como se define en el presente documento. Dependiendo del sustituto de la carne previsto, el experto en la materia sabría qué formulaciones son las más adecuadas.

[0011] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos es un sustituto de la carne, donde el sustituto de la carne imita el aspecto (como el patrón, las letras), la forma, la estructura, la composición (como un contenido similar de grasa, proteína y/o hierro hemo), la palatabilidad, el sabor, la textura, el color, el aroma, la apariencia y/o el valor nutricional de la carne. El grado de aceptación, el gusto general o la preferencia de un alimento para animales domésticos sobre otro, o la palatabilidad de un alimento para animales domésticos puede evaluarse mediante una prueba de preferencia/aceptación. La palatabilidad de los alimentos para animales domésticos se mide normalmente usando una prueba de un solo recipiente o de dos recipientes o una prueba operante de presión de palanca. Por ejemplo, en una prueba de preferencia, se ofrece a los animales domésticos una comida de control y la comida de prueba en un entorno controlado. Los investigadores registran la velocidad a la que los animales eligen la comida de prueba sobre la comida de control. Se pueden realizar pruebas mayores en un entorno doméstico por los dueños de animales domésticos a los que se les pide registrar comportamientos de "preferencia alimentaria" tales como el tiempo transcurrido olfateando los alimentos, lamiéndose los labios o la nariz, moviendo las orejas o la cola, etc. Esto se debe principalmente a la adición de la mioglobina aislada como se describe en el presente documento. El sustituto de la carne puede no tener todos los inconvenientes de la carne. Por ejemplo, el sustituto de la carne es más sano que la carne. Además, se espera que el impacto del sustituto de la carne en el medio ambiente (efecto directo/indirecto a largo plazo sobre el cambio climático) sea menos perjudicial que el impacto conocido de la carne.

[0012] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos es un sustituto de la carne, donde se espera que el sustituto de la carne imite la composición (como un contenido similar de grasa, proteína y/o hierro hemo), la palatabilidad, el sabor, el color y/o el aroma de la carne sin tener todos sus inconvenientes. En una forma de realización, se espera que el sustituto de la carne imite el sabor y/o el aroma de la carne sin tener todos sus inconvenientes. En una forma de realización, se espera que el sustituto de la carne imite la palatabilidad de la carne sin tener todos sus inconvenientes. En una forma de realización, se espera que el sustituto de la carne imite el sabor de la carne sin tener todos sus inconvenientes. En una forma de realización, se espera que el sustituto de la carne imite el aroma de la carne sin tener todos sus inconvenientes. En las formas de realización de este contexto, esto se debe principalmente a la presencia de la mioglobina aislada como se describe en el presente documento. Alternativamente, podría tener un aspecto, forma, estructura, textura, color, palatabilidad, sabor, aroma y/o apariencia que sea distinto del de la carne.

[0013] En el contexto de la invención, la experiencia de la carne puede imitarse cuando el sustituto de la carne genera un aroma y/o un compuesto de sabor reconocible por animales domésticos y característico de algunos odorantes y/o compuestos de sabor liberados cuando se cocina la carne. Por ejemplo, la formación de algunos de estos odorantes puede estar catalizada por el hierro del hemo presente en la mioglobina aislada. Sin estar ligados a esta teoría, la formación puede deberse a la oxidación de lípidos y/o a reacciones de Maillard. Esta situación puede imitarse con la mioglobina aislada dentro del sustituto cárnico de la invención.

[0014] En una forma de realización de la invención, donde el alimento para animales domésticos es un sustituto de la carne, preferiblemente un sustituto de la carne cruda, donde se espera que dicho sustituto de la carne cruda imite el aroma a sangre y/o metálico de la carne. Preferiblemente, el sustituto de la carne es capaz de imitar el aroma a sangre y/o metálico de la carne en mayor medida que otros sustitutos de la carne (es decir, no conforme a la invención). En el contexto de esta invención, "cruda" significa no sometida a un tratamiento térmico, preferiblemente sin cocer y sin asar.

[0015] En una forma de realización de la invención, donde el alimento para animales domésticos es un sustituto de la carne, preferiblemente un sustituto de la carne cocida, donde se espera que dicho sustituto de la carne cocida imite el aroma tostado de la carne, particularmente de la carne asada. Preferiblemente, el sustituto de carne es capaz de imitar el aroma tostado de carne en mayor medida que otros sustitutos de la carne (es decir, no conforme a la invención). En el contexto de esta invención, "cocida" significa sometida a un tratamiento térmico, preferiblemente a la parrilla o asada.

[0016] En el contexto de esta invención, y específicamente en las formas de realización en esta sección, un "otro sustituto de la carne" o "un sustituto de la carne no conforme a la invención" es preferiblemente un sustituto de la carne de origen vegetal que comprende una leghemoglobina de soja recombinante (LegH).

[0017] En una forma de realización, el sustituto de la carne, preferiblemente un sustituto de la carne asada de la invención, tiene un aroma caracterizado por una mayor concentración de lípidos oxidados, productos de oxidación lipídica, pirazinas y/o pirroles en los compuestos volátiles obtenidos del sustituto de la carne (asada) en relación con otros sustitutos de la carne (es decir, no conforme a la invención). Más preferiblemente significa al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 210 %, 220 %, 230 %, 240 %, 250 %, 260 %, 270 %, 280 %, 290 % o 300 %. Las pirazinas preferidas son metilpirazina, 2,5-dimetilpirazina, 2-etil-6-metilpirazina. Un pirrol preferido es pirrol. Los productos de oxidación lipídica preferidos son 2-metilbutanal y 3-metilbutanal.

[0018] Los aromas del sustituto de la carne que contienen diferentes concentraciones de mioglobina recombinante pueden analizarse usando cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) con microextracción en fase sólida en espacio de cabeza (HS-SPME).

[0019] En el contexto de la invención, la experiencia de la carne puede imitarse cuando el color del sustituto de la carne es similar al color de la carne. El color de la carne se determina por la concentración de proteína que contiene hemo y/o por su estado de oxidación en la carne. Por lo tanto, la cantidad total de mioglobina aislada añadida al sustituto de la carne determinará el color del sustituto de la carne.

[0020] En una forma de realización, se espera que el sustituto de la carne, preferiblemente un sustituto de carne cruda, imite el color de la carne, preferiblemente de la carne cruda. Sin estar ligado a esta teoría, el color del sustituto de la carne se debe principalmente a la adición de la mioglobina aislada. Preferiblemente, el sustituto de la carne de la invención es capaz de imitar el color de la carne en mayor medida que otros sustitutos de la carne (es decir, no conforme a la invención).

[0021] En una forma de realización preferida, el color del sustituto de la carne, preferiblemente de un sustituto de la carne cruda de la invención, es esencialmente estable durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 días, preferiblemente tras el almacenamiento bajo luz constante a 4 °C. Preferiblemente, el color del sustituto de la carne de la invención es estable durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 días más que el periodo de tiempo donde el color de la carne u otros sustitutos de la carne es estable, más preferiblemente donde un cambio AE del 0 % al 10 % se define como estable. Esencialmente estable durante al menos X días significa preferiblemente un cambio de AE del sustituto de la carne entre el 0 % y el 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 5,5 %, 6 %, 6,5 %, 7 %, 7.5 %, 8 %, 8,5 %, 9 %, 9,5 %, 10 %, 10,5 %, 11 %, 11,5 %, 12 %, 12,5 %, 13 %, 13,5 %, 14 %, 14,5 %, 15 %, 15.5 %, 16 %, 16,5 %, 17 %, 17,5 %, 18 %, 18,5 %, 19 %, 19,5 % o 20 % entre el día 0 y el día X, donde AE es. De la manera más preferible, el AE del sustituto de la carne no cambia en más de un 10 % tras el almacenamiento durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 días. El color puede evaluarse mediante mediciones de absorbancia usando espectrometría.

[0022] En el contexto de la invención, la experiencia de la carne puede imitarse cuando la composición del sustituto de la carne es similar a la composición de la carne. Puede considerarse que la composición del sustituto de la carne es similar a la composición de la carne cuando están presentes los mismos componentes o componentes similares y, opcionalmente, cuando las cantidades en las que están presentes son iguales o similares a las cantidades presentes en la carne. Por ejemplo, en un sustituto de la carne puede estar presente un contenido similar de grasa, proteína y/o hierro hemo que en la carne.

Adición de mioglobina aislada

[0023] En el primer aspecto de la invención, el método para preparar un alimento para animales domésticos comprende añadir una mioglobina aislada. La mioglobina aislada puede ser añadida o aplicada por el fabricante de un alimento para animales domésticos, el consumidor de un alimento para animales domésticos o cualquier otro productor de un alimento para animales domésticos o producto relacionado.

[0024] En una forma de realización, la concentración en peso (total) de hemoproteínas en el alimento para animales domésticos es de al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 210 %, 220 %, 230 %, 240 %, 250 %, 260 %, 270 %, 280 %, 290 % o 300 % superior a la concentración media de hemoproteínas en el producto alimenticio para animales domésticos producido a partir de un proceso tradicional o común que no comprende explícitamente un paso de adición de mioglobina aislada. En este contexto, la concentración media de hemoproteínas en la carne de una especie específica de un animal se determina sobre varios animales correspondientes, donde no se ha añadido mioglobina exógena o aislada a la carne de los animales después de la recolección. En este contexto, el producto alimenticio para animales domésticos resultante de esta invención es comestible para un animal doméstico definido en la presente memoria, y la adición de mioglobina usando el método de esta invención no introduce toxicidad ni afecta a la seguridad alimentaria de dicho producto alimenticio para animales domésticos.

[0025] En una forma de realización, la concentración en peso (total) de hemoproteínas en el alimento para animales domésticos es de al menos un 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1,0 %, 1.1 %, 1,2 %, 1,3 %, 1,4 %, 1,5 %, 1,6 %, 1,7 %, 1,8 %, 1,9 %, 2,0 %, 2,1 %, 2,2 %, 2,3 %, 2,4 %, 2,5 %, 2,6 %, 2.7 %, 2,8 %, 2,9 %, 3,0 %, 3,1 %, 3,2 %, 3,3 %, 3,4 %, 3,5 %, 3,6 %, 3,7 %, 3,8 %, 3,9 %, 4,0 %, 4,1 %, 4,2 %, 4.3 %, 4,4 %, 4,5 %, 4,6 %, 4,7 %, 4,8 %, 4,9 %, 5,0 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, preferiblemente inferior al 10 %, más preferiblemente inferior al 5 %.

[0026] En una forma de realización, la concentración en peso (total) de mioglobinas en el alimento para animales domésticos es de al menos un 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1,1 %, 1,2 %, 1.3 %, 1,4 %, 1,5 %, 1,6 %, 1,7 %, 1,8 %, 1,9 %, 2,0 %, 2,1 %, 2,2 %, 2,3 %, 2,5 %, 2,4 %, 2,6 %, 2,7 %, 2,8 %, 2,9 %, 3,0 %, 3,1 %, 3,2 %, 3,3 %, 3,4 %, 3,5 %, 3,6 %, 3,7 %, 3,8 %, 3,9 %, 4,0 %, 4,1 %, 4,2 %, 4,3 %, 4,4 %, 4.8 %, 4,9 %, 5,0 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, preferiblemente inferior al 10 %, más preferiblemente inferior al 5 %. Se entiende que las mioglobinas comprendidas en el alimento para animales domésticos pueden proceder de la adición de la mioglobina aislada, o de otra fuente.

[0027] En una forma de realización, la fracción en peso de mioglobinas en las hemoproteínas en el alimento para animales domésticos es de al menos un 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

[0028] En una forma de realización, la concentración en peso (total) de hemoproteínas en el alimento para animales domésticos de es al menos un 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1,0 %, 1.1 %, 1,2 %, 1,3 %, 1,4 %, 1,5 %, 1,6 %, 1,7 %, 1,8 %, 1,9 %, 2,0 %, 2,1 %, 2,2 %, 2,3 %, 2,4 %, 2,5 %, 2,6 %, 2,7 %, 2,8 %, 2,9 %, 3,0 %, 3,1 %, 3,2 %, 3,3 %, 3,4 %, 3,5 %, 3,6 %, 3,7 %, 3,8 %, 3,9 %, 4,0 %, 4,1 %, 4,2 %, 4.3 %, 4,4 %, 4,5 %, 4,6 %, 4,7 %, 4,8 %, 4,9 %, 5,0 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, y la fracción en peso de mioglobinas en las hemoproteínas en el alimento para animales domésticos es al menos un 90 %.

[0029] En una forma de realización, la concentración en peso (total) de hemoproteínas en el alimento para animales domésticos es de al menos un 3,0 %, y la fracción en peso de mioglobinas en las hemoproteínas en el alimento para animales domésticos es de al menos un 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

[0030] En una forma de realización, al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de las hemoproteínas en el alimento para animales domésticos se originan a partir de la adición de la mioglobina aislada (por peso). En una forma de realización más preferida, al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de las mioglobinas en el alimento para animales domésticos se originan a partir de la adición de la mioglobina aislada (por peso).

[0031] En una forma de realización, al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de mioglobinas en el alimento para animales domésticos se originan a partir de la adición de la mioglobina aislada (por peso). En una forma de realización más preferida, al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de las mioglobinas en el alimento para animales domésticos se originan a partir de la adición de la mioglobina aislada (por peso).

[0032] En una forma de realización, la mioglobina aislada se añade como parte de una composición, donde la concentración en peso de la mioglobina aislada en la composición es de al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %. En este contexto, la concentración en peso puede expresarse como una masa de mioglobina por volumen o masa total de la composición.

[0033] En una forma de realización, la mioglobina aislada se añade como parte de una composición, donde la fracción en peso de la mioglobina aislada en la fracción proteica comprendida en la composición es de al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %. En este contexto, la fracción en peso es un número adimensional que puede interpretarse como una masa de mioglobina por masa de proteína.

[0034] En una forma de realización, la mioglobina aislada está en forma de polvo. La cantidad de mioglobina aislada que debe añadirse al alimento para animales domésticos puede calcularse o estimarse en base a la concentración de mioglobina en el alimento para animales domésticos antes de la adición y la concentración final deseada de mioglobinas en el alimento para animales domésticos. En este contexto, el alimento para animales domésticos antes de la adición de la mioglobina aislada contiene preferiblemente menos del 0,1 %, menos del 0,2 %, menos del 0,3 %, menos del 0,4 %, menos del 0,5 %, menos del 0,6 %, menos del 0,7 %, menos del 0,8 %, menos del 0,9 %, menos del 1,0 % de hemoproteínas en base al peso. Se puede usar una herramienta, como un recipiente, una taza, una cuchara, una batidora o un mezclador, para añadir la mioglobina aislada. La mioglobina aislada puede añadirse directamente al alimento para animales domésticos, o puede disolverse en un disolvente editable, antes de añadirse al alimento para animales domésticos.

[0035] En una forma de realización, la mioglobina aislada tiene formas sólidas, donde la mioglobina de forma sólida tiene un peso y/o volumen predeterminado. La cantidad de mioglobina aislada que debe añadirse al alimento para animales domésticos puede calcularse o estimarse en base a la concentración de mioglobina aislada y/o el volumen de mioglobina aislada de forma sólida, el peso total del alimento para animales domésticos y la cantidad final deseada de mioglobinas en el alimento para animales domésticos. En este contexto, el alimento para animales domésticos antes de la adición de la mioglobina aislada contiene preferiblemente menos del 0,1 %, menos del 0,2 %, menos del 0,3 %, menos del 0,4 %, menos del 0,5 %, menos del 0,6 %, menos del 0,7 %, menos del 0,8 %, menos del 0,9 %, menos del 1,0 % de hemoproteínas en base al peso. Se puede usar una herramienta, como un recipiente, una taza, una cuchara, una batidora o un mezclador, para añadir la mioglobina aislada. La mioglobina aislada puede añadirse directamente al alimento para animales domésticos, o puede disolverse en un disolvente de grado alimentario, antes de añadirse al alimento para animales domésticos.

[0036] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos es un sustituto de la carne, donde la mioglobina aislada se añade para reticularse con otra sustancia, por ejemplo, una proteína vicilina de guisante.Mioglobina aislada

[0037] En una forma de realización, el método de esta invención comprende añadir mioglobina aislada, donde la mioglobina aislada es una mioglobina recombinante producida por fermentación por un microorganismo que ha sido modificado genéticamente para expresar dicha mioglobina recombinante. Las mioglobinas que pueden representarse por SEQ ID NO: 1-6 pueden estar codificadas por ácidos nucleicos que pueden estar representados por SEQ ID NO: 7-12, respectivamente, aunque se entiende que puede ser necesario optimizar por codón esta secuencia de ácidos nucleicos para ser expresada por el microorganismo.

[0038] En esta solicitud, la numeración de las secuencias de aminoácidos de mioglobina procedentes de ratas (SEQ ID NO: 1), conejos (SEQ ID NO: 2), ratones (SEQ ID NO: 3), mamut de la estepa (SEQ ID NO: 4) y mamut lanudo (SEQ ID NO: 5) utilizadas en el presente documento comienza con metionina o Met o M en la posición 1. Todas estas secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1-5 cuentan 154 residuos de aminoácidos.

[0039] La numeración de la secuencia de aminoácidos de la mioglobina procedente del atún (SEQ ID NO: 6) utilizada en el presente documento es ligeramente diferente de la numeración consecutiva indicada en el listado de secuencias, ya que esta secuencia cuenta únicamente 147 residuos de aminoácidos. Con el fin de comparar SEQ ID NO: 6 directamente con SEQ ID NO: 1-5, a SEQ ID NO: 6 también se le atribuyen 154 posiciones, donde se considera que ocho posiciones son huecos (2, 3, 6, 7, 51, 120, 121).

[0040] Un microorganismo puede ser un procariota, un eucariota o un hongo filamentoso. Un procariota puede ser una bacteria. La bacteria puede ser una bacteria Gram positiva/Gram negativa seleccionada de la siguiente lista:Absidia, Achromobacter, Acinetobacter, Aeribacillus, Aneurinibacillus, Agrobacterium, Aeromonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Arzoarcus, Azomonas, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Beijerinckia, Bradyrhizobium, Brevibacills, Burkholderia, Byssochlamys, Citrobacter, Clostridium, Comamonas, Cupriavidus, Corynebacterium, Deinococcus, Escherichia, Enterobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Gossypium, Klebsiella, Lactobacillus, Listeria, Megasphaera, Micrococcus, Mycobacterium, Norcadia, Porphyromonas, Propionibacterium, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rodococcus, Roseburia, Shewanella, Streptomycetes, Xanthomonas, Xylella, Yersinia, Treponema, Vibrio, Streptococcus, Lactococcus, Zymomonas, Staphylococcus, Salmonella, Sphingomonas, Sphingobium, NovosphingobiumBrucellayMicroscilla.Las bacterias preferidas incluyenAeribacillus pallidus, Aneurinibacillus terranovensis, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Brevibacillus thermoruber, Brevibacillus panacihumi, Cupriavidus basilensis, G. Iraustophilus, Gluconobacter oxydans, Caulobacter crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pelotomaculum thermopropionicum, Pseudomonas zeaxanthinifaciens, Pseudomonas putida, Paracoccus denitrificans, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti, Sphingobium sp., Novosphingobium sp., Sphingomonas henshuiensis,yRhizobium radiobacter.Una bacteria preferida esEscherichia coli.Las cepas deEscherichia colipreferidas incluyen: 58, 679, WG1, DH5a, TG1, TOP10, K12, BL21, BL21 DE3, XL1-Blue, XL10-Gold, TB1, REG-12, W945, HB101, DH1, DP50, AB284, JC9387, AG1, C600, Cavalli Hfr, Y10.

[0041] Un eucariota puede ser una levadura o un hongo filamentoso. Las levaduras preferidas incluyenSaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, Yarrowia, Cryptococcus, Debaromyces, Saccharomycecopsis, Saccharomycodes, Wickerhamia, Debayomyces, Hanseniaspora, Ogataea, Kuraishia, Komagataella, Metschnikowia, Williopsis, Nakazawaea, Torulaspora, Bullera, Rhodotorula, Sporobolomyces.Dentro de las levaduras, se prefieren las especiesKluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha(también conocida comoOgataea henricii), Yarrowia lipolytica, Candida tropicalisyPichia pastoris(también conocida comoKomagataella phaffií).Las cepas dePichiapreferidas se seleccionan de la siguiente lista: Bg09, Bg10, Bg11, Bg12 (ejemplificada), Bg20, Bg21, Bg22, Bg23, Bg24, Bg25, Bg26, Bg40, Bg43, Bg44, Bg45, Y-11430, X-33, GS115, KM71, SMD1168, SMD1165, MC100-3, la más preferida siendo Bg10 y sus derivados. Las cepas deSaccharomycespreferidas se seleccionan de la siguiente lista: S288C, familia CEN.PK, CBS 2354, ATCC 2360, ATCC 4098, ATCC 4124, ATCC 4126, ATCC 4127, ATCC 4921, ATCC 7754, ATCC 9763, ATCC 20598, ATCC 24855, ATCC 24858, ATCC 24860, ATCC 26422, ATCC 46523, ATCC 56069, ATCC 60222, ATCC 60223, ATCC 60493, ATCC 66348, ATCC 66349, ATCC 96581. Una levadura preferida es una cepa dePichia,más preferiblementePichia pastoris.

[0042] Un hongo filamentoso puede seleccionarse de la siguiente lista que incluye:Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora Neocallinastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, UstilagoyTrichoderma.Los hongos filamentosos preferidos se seleccionan de la siguiente lista:Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, Aspergillus vadensis, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Penicillium rubens, Penicillium oxalicum, Penicillium subrubescens, Rasamsonia emersonii, Talaromyces emersonii, Acremonium chrysogenum, Trichoderma reesei, Aspergillus sojaeyChrysosporium lucknowense.Las cepas preferidas de hongos filamentosos se seleccionan de la siguiente lista:Aspergillus nigerCBS 513.88, N593, CBS 120.49, N402, ATCC 1015Aspergillus oryzaeATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC 14488-14491, ATCC 11601, ATCC 12892,Aspergillus vadensisCBS 113365, CBS 102787, IMI 142717, IBT 24658, CBS 113226,Penicillium chrysogenumCBS 455,95,Penicillium citrinumATCC 38065,Penicillium chrysogenumP2, Wisconsin 54-1255,Penicillium subrubescensCBS 132785, FBCC 1632,Talaromyces emersoniiCBS 393.64,Acremonium chrysogenumATCC 36225 o ATCC 48272,Trichoderma reeseiATCC 26921 o ATCC 56765 o ATCC 26921,Aspergillus sojaeATCC 11906,Chrysosporium lucknowenseATCC 44006. En una forma de realización preferida,Aspergillusse usa como un hongo filamentoso. Más preferiblemente, se utiliza una cepa deAspergillus niger.

[0043] En una forma de realización, el microorganismo usado en la fermentación puede ser una bacteria, una levadura, un hongo filamentoso o una línea celular de mamífero cultivada, preferiblementeEscherichia colioSaccharomyces cerevisiae.En este contexto, las células de mamífero individuales, aisladas y cultivadas pueden considerarse como microorganismos. En una forma de realización adicional, el microorganismo puede ser una bacteria, una levadura o un hongo filamentoso. Los microorganismos en el contexto de esta invención son útiles para la producción de una mioglobina. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invención proporciona un método para la producción de una mioglobina como se define en el presente documento, que comprende cultivar los microorganismos en un medio adecuado y opcionalmente recuperar el microorganismo y/o la mioglobina. Opcionalmente, la mioglobina producida no comprende un péptido señal como se define en otra parte en el presente documento.

[0044] El cultivo celular se puede realizar durante una duración de 14, 13,5, 13, 12,5, 12, 11,5, 11, 10,5, 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5 o 1 día, donde dicha duración puede desviarse en un 20 %. Preferiblemente, el cultivo celular se realiza durante una duración de 14, 13,5, 13, 12,5, 12, 11,5, 11, 10,5, 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5 o 1 día, donde dicha duración puede variar en un 10 %. Más preferiblemente, el cultivo celular se realiza durante 5 días, donde dicha duración puede variar en un 20 %, de la manera más preferible en un 10 %.

[0045] El cultivo celular normalmente dará como resultado una producción de al menos 100 mg/l, 200 mg/l, 300 mg/l, 400 mg/l, 500 mg/l, 600 mg/l, 700 mg/l, 800 mg/l, 900 mg/l, 1 g/l, 2 g/l, 3 g/l, 4 g/l, 5 g/l, 6 g/l, 7 g/l, 8 g/l, 9 g/l, 10 g/l, 11 g/l, 12 g/l, 13 g/l, 14 g/l, 15 g/l, 16 g/l, 17 g/l, 18 g/l, 19 g/l, 20 g/l, 21 g/l, 22 g/l, 23 g/l, 24 g/l, 25 g/l, 50 g/l, 75 g/l, 100 g/l, 200 g/l o 300 g/l de una mioglobina.

[0046] El cultivo celular típicamente dará como resultado que al menos el 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %, preferiblemente al menos 20 %, más preferiblemente al menos 40 %, de la manera más preferible al menos 60 % de la fuente de carbono en el medio de crecimiento se convierta en una mioglobina.

[0047] El cultivo celular también puede realizarse mediante la implementación de un método de cultivo de múltiples pasos, preferiblemente de dos pasos. Por ejemplo, un paso de producción de una mioglobina puede ir precedida de un paso de crecimiento de biomasa celular, donde solo tiene lugar una producción limitada o ninguna producción. Los diferentes pasos pueden llevarse a cabo usando diferentes modos de cultivo y/o diferentes medios de crecimiento y/o diferentes valores de parámetros de proceso de cultivo, dependiendo del objetivo de cada paso y/o la célula cultivada. La biomasa durante el paso de producción puede estar creciendo activamente o no.

[0048] Las células huésped y/o la mioglobina pueden recuperarse opcionalmente del medio de cultivo. Cuando está presente intracelularmente, la mioglobina puede recuperarse opcionalmente de la biomasa celular recuperada. Opcionalmente, se purifica la mioglobina recuperada. Preferiblemente, la purificación de la mioglobina dará como resultado una pureza de al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, de la manera más preferible en una mioglobina que sea sustancialmente pura.

[0049] En una forma de realización, el microorganismo produce la mioglobina extracelularmente. La mioglobina se transporta fuera de la célula huésped después de ser sintetizada en la célula huésped. En este contexto, se considera que tanto las fermentaciones secretoras como las extracelulares son producciones extracelulares. Sin estar ligado a esta teoría, un proceso de producción extracelular tiene la ventaja de que el procesamiento posterior para recuperar la mioglobina producida es más conveniente, eficiente y/o efectivo. Además, un proceso de producción extracelular puede dar como resultado una composición que comprende la mioglobina con una alta pureza como al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con un procesamiento posterior mínimo en comparación con métodos intracelulares donde la mioglobina no se transporta fuera de la célula huésped después de su síntesis. La pureza puede medirse como el porcentaje en peso de la fracción proteica total en el sobrenadante libre de células obtenido al final de un proceso o proceso extracelular según la invención. Sin estar ligado a esta teoría, un proceso de producción extracelular tiene la ventaja de que el paso opcional de recuperación de mioglobina no comprende la lisis de la célula huésped. Como resultado, el proceso extracelular puede dar lugar a una composición que tiene una baja concentración de ácidos nucleicos procedentes de la célula huésped.

[0050] La tecnología de procesamiento posterior relevante que puede ser adecuada para la recuperación y/o purificación dependerá de si la mioglobina se acumula dentro de las células cultivadas o se excreta. Dicha tecnología de procesamiento y la elección asociada serán conocidas por el experto en la materia y se analizan, por ejemplo, en Wesselingh, J.A y Kriggsman, J., 1a edición, Downstream Processing in Biotechnology, Delft Academic Press, NL, 2013. En un proceso de recuperación, la biomasa puede recuperarse del medio de cultivo usando, por ejemplo, centrifugación o filtración. Si la mioglobina producida se acumula dentro de las células, puede recuperarse y/o purificarse de la biomasa. Si se excreta, puede recuperarse del medio libre de células o, si se omite el paso de separación de biomasa, directamente del caldo de cultivo. La recuperación y/o purificación se puede realizar de acuerdo con cualquier metodología convencional de recuperación o purificación conocida en la técnica. Los métodos para la recuperación y/o purificación de proteínas son conocidos por el experto en la materia y se analizan en manuales convencionales, tales como Sambrook y Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001 o Ausubel F.et al.,eds., Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, NY, 2003. Los ejemplos de métodos de recuperación y/o purificación ampliamente usados incluyen métodos cromatográficos tales como cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad metálica, cromatografía de filtración en gel, fraccionamiento con precipitantes tales como sulfato de amonio y polietilenglicol, electroforesis en gel y precipitación salina y diálisis. Preferiblemente, se usa la cromatografía de afinidad metálica o la cromatografía de exclusión por tamaño. La recuperación y/o purificación puede potenciarse opcionalmente uniendo el polipéptido enzimático a una secuencia que facilita la purificación, como con un dominio GST, usando técnicas de herramientas moleculares bien conocidas. Opcionalmente, la secuencia que facilita la purificación y/o el péptido señal que facilita la excreción de la mioglobina se elimina del producto final usando técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, proteólisis por endopeptidasas dirigidas a un conector entre la secuencia que facilita la purificación y/o el péptido señal y la mioglobina. En algunas formas de realización, el polipéptido enzimático está unido (fusionado) a un péptido de hexahistidina, como la etiqueta proporcionada en un vector pET23a(+) (Genescript Biotech, Leiden, Países Bajos), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe, por ejemplo, en Gentzet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), el péptido de hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión.

[0051] En una forma de realización preferida, la mioglobina aislada se obtiene mediante recuperación y/o purificación del medio de cultivo. Esto puede realizarse de manera continua con el proceso de producción o posteriormente al mismo. En una forma de realización preferida, la mioglobina aislada se obtiene mediante recuperación y/o purificación de las células cultivadas. Se puede usar un filtro para la purificación de la mioglobina recuperada. Esto puede realizarse de manera continua con el proceso de producción, recogiendo fracciones de células en crecimiento, o posteriormente al mismo.

[0052] En una forma de realización, la mioglobina aislada es esterilizada, triturada, secada por pulverización, liofilizada, mezclada, moldeada, hecha cubos, dosificada o envasada. La esterilización se refiere a cualquier proceso que elimine, destruya o desactive todas las formas de vida (particularmente microorganismos tales como hongos, bacterias, esporas y organismos eucariotas unicelulares) y otros agentes biológicos tales como priones presentes en o sobre una superficie, objeto o fluido específico. La esterilización se puede lograr a través de diversos medios, incluyendo calor, productos químicos, irradiación, alta presión y filtración. El secado por congelación, también conocido como liofilización o criodesecación, es un proceso de deshidratación a baja temperatura que implica congelar el producto, disminuir la presión y, a continuación, retirar el hielo por sublimación. El embalaje tiene como objetivo proporcionar una protección para el producto, resistencia a la manipulación y proporcionar necesidades físicas, químicas o biológicas. El envasado también puede contener información nutricional, características de los productos y una instrucción/guía para uso del producto.

[0053] En una forma de realización preferida, las células huésped cultivadas usadas en la fermentación se inmovilizan. La inmovilización de las células puede conseguirse por cualquier medio conocido por el experto en la materia como se analiza en manuales convencionales tales como Guisan, J.M., Bolivar, J.M., López-Gallego, F., Rocha-Martin, J. (Eds.), Immobilization of Enzymes and Cells: Methods and Protocols, Springer US, USA, 2020. Normalmente, las células huésped pueden inmovilizarse en un soporte semisólido o sólido mediante tres métodos diferentes. El primer método implica polimerizar o solidificar una solución que contiene esporas o células. Los ejemplos de soluciones polimerizables o solidificables incluyen alginato, A-carragenina, quitosano, poliacrilamida, poliacrilamida-hidrazida, agarosa, polipropileno, polietilenglicol, acrilato de dimetilo, poliestireno divinilbenceno, polivinilbenceno, alcohol polivinílico, portador epoxi, celulosa, acetato de celulosa, resina fotoreticulable, prepolímeros, uretano y gelatina. El segundo método implica la adsorción de células sobre un soporte. Ejemplos de tales soportes incluyen carbón óseo, corcho, arcilla, resina, arena, perlas de alúmina porosa de arena, ladrillo poroso, sílice porosa, celite o astillas de madera. Las células huésped pueden colonizar el soporte y formar una biopelícula. El tercer método implica el acoplamiento covalente de las células huésped a un soporte usando agentes químicos como glutaraldehído, o-dianisidina (Pat. de EE.UU. N° 3,983,000), isocianatos poliméricos (Pat. de EE.UU. N° 4,071,409), silanos (Pat. de EE.UU. N° 3,519,538 y 3,652,76l), acrilato de hidroxietilo, soportes activados por metales de transición, cloruro cianúrico, peryodato de sodio, tolueno y similares. Las células huésped cultivadas pueden inmovilizarse en cualquier fase de su crecimiento, por ejemplo, después de que se haya alcanzado una densidad celular deseada en el cultivo. Los modos de cultivo adecuados y/o diferentes valores de parámetros de proceso de cultivo serán conocidos por el experto y se analizan en manuales estándar, tales como Colin R. Phillips C.R., Poon Y.C., Immobilization of Cells: In Biotechnology Monographs book series (Biotechnology, volumen 5), Springer, Berlín, Alemania, 1988; Tampion J., Tampion M. D., Immobilized Cells: Principles and Applications, Cambridge University Press, UK, 1987. Preferiblemente, las células inmovilizadas se cultivan en biorreactores de lecho compacto, también conocidos como biorreactores de flujo de pistón, o biorreactores de lecho expandido (fluidizado). Los medios de crecimiento y métodos de recuperación y/o purificación adecuados se analizan con más detalle en otra parte en el presente documento.

[0054] En una forma de realización, una mioglobina aislada es una mioglobina que no está comprendida en una célula o un tejido antes de la adición. En otras palabras, la mioglobina aislada se añade como una proteína "separada" (o aislada) que no está comprendida en una célula o un tejido. Por lo tanto, aislada en este contexto no se refiere al origen de la mioglobina (es decir, aislada de una fuente como una célula o un tejido), sino al hecho de que se añade una proteína separada. Por supuesto, se entiende que la mioglobina aislada puede formar parte de una célula o un tejido una vez que se ha añadido al alimento para animales domésticos.

[0055] Una mioglobina aislada puede derivarse de rata, conejo, ratón, mamut o atún. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos se deriva de rata, conejo, ratón, mamut o atún, mediante la adición, deleción y/o sustitución de al menos un aminoácido. La invención también contempla la adición, deleción y/o sustituciones de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos. Los ejemplos de la secuencia de aminoácidos de mioglobina de rata, conejo, ratón, mamut o atún se han descrito más adelante en una SEQ ID NO: 1-6 dada. Tal mioglobina aislada derivada de rata, conejo, ratón, mamut o atún también puede ejercer al menos un nivel detectable de una actividad de una mioglobina aislada como se explica más adelante en el presente documento. Un mamut puede ser cualquier especie del géneroMammuthus,como un mamut lanudo(Mammuthus primigenius)o un mamut de la estepa(Mammuthus trogontherii),en el contexto de esta solicitud, a menos que se indique explícitamente lo contrario.

[0056] En una forma de realización, la mioglobina aislada es una mioglobina de rata, una mioglobina de conejo, una mioglobina de ratón, una mioglobina de mamut o una mioglobina de atún, o una mioglobina derivada de cualquiera de estas mioglobinas. En una forma de realización, la mioglobina aislada es mioglobina de rata o deriva de la misma. En una forma de realización, la mioglobina aislada es mioglobina de conejo o deriva de la misma. En una forma de realización, la mioglobina aislada es mioglobina de ratón o deriva de la misma. En una forma de realización, la mioglobina aislada es mioglobina de mamut de la estepa o deriva de la misma. En una forma de realización, la mioglobina aislada es mioglobina de mamut lanudo o deriva de la misma. En una forma de realización, la mioglobina aislada es mioglobina de atún o deriva de la misma.

[0057] En una forma de realización, la mioglobina aislada puede estar representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente por las SEQ ID NO: 1 o 2.

[0058] En una forma de realización, la mioglobina aislada es de una rata como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente es una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, más preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, en combinación con G en la posición 6, Q en la posición 9, M en la posición 10, N en la posición 13, I en la posición 14, L en la posición 22, A en la posición 23, Q en la posición 27, L en la posición 30, I en la posición 31, G en la posición 32, K en la posición 35, A en la posición 36, E en la posición 42, K en la posición 43, N en la posición 49, S en la posición 52, E en la posición 53, E en la posición 54, E en la posición 55, S en la posición 58, H en la posición 65, C en la posición 67, A en la posición 72, T en la posición 75, K en la posición 79, Q en la posición 82, Q en la posición 92, S en la posición 93, T en la posición 96, V en la posición 102, E en la posición 110, V en la posición 111, Q en la posición 114, L en la posición 116, K en la posición 117, K en la posición 118, R en la posición 119, S en la posición 121, G en la posición 122, D en la posición 123, A en la posición 128, G en la posición 130, S en la posición 133, I en la posición 143, A en la posición 145, K en la posición 146, E en la posición 149, L en la posición 150 o Q en la posición 153.

[0059] En una forma de realización, la mioglobina aislada es de un conejo como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente es una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, más preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, en combinación con A en la posición 6, Q en la posición 9, L en la posición 10, N en la posición 13, V en la posición 14, L en la posición 22, A en la posición 23, Q en la posición 27, L en la posición 30, I en la posición 31, G en la posición 32, H en la posición 35, T en la posición 36, E en la posición 42, K en la posición 43, H en la posición 49, S en la posición 52, E en la posición 53, D en la posición 54, E en la posición 55, A en la posición 58, H en la posición 65, N en la posición 67, A en la posición 72, A en la posición 75, K en la posición 79, H en la posición 82, Q en la posición 92, S en la posición 93, T en la posición 96, V en la posición 102, E en la posición 110, A en la posición 111, H en la posición 114, L en la posición 116, H en la posición 117, S en la posición 118, R en la posición 119, P en la posición 121, G en la posición 122, D en la posición 123, A en la posición 128, A en la posición 130, S en la posición 133, I en la posición 143, A en la posición 145, K en la posición 146, E en la posición 149, L en la posición 150 o Q en la posición 153.

[0060] En una forma de realización, la mioglobina aislada es de un ratón como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente es una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3, más preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3, en combinación con G en la posición 6, Q en la posición 9, L en la posición 10, N en la posición 13, V en la posición 14, L en la posición 22, A en la posición 23, Q en la posición 27, L en la posición 30, I en la posición 31, G en la posición 32, K en la posición 35, T en la posición 36, D en la posición 42, K en la posición 43, N en la posición 49, S en la posición 52, E en la posición 53, E en la posición 54, D en la posición 55, G en la posición 58, H en la posición 65, C en la posición 67, A en la posición 72, T en la posición 75, K en la posición 79, Q en la posición 82, Q en la posición 92, S en la posición 93, T en la posición 96, V en la posición 102, E en la posición 110, I en la posición 111, E en la posición 114, L en la posición 116, K en la posición 117, K en la posición 118, R en la posición 119, S en la posición 121, G en la posición 122, D en la posición 123, A en la posición 128, G en la posición 130, S en la posición 133, I en la posición 143, A en la posición 145, K en la posición 146, E en la posición 149, L en la posición 150 o Q en la posición 153.

[0061] En una forma de realización, la mioglobina aislada procede de una mamut de la estepa como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente es una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, más preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 en combinación con G en la posición 6, E en la posición 9, L en la posición 10, K en la posición 13, T en la posición 14, I en la posición 22, P en la posición 23, L en la posición 27, F en la posición 30, V en la posición 31, T en la posición 35, G en la posición 36, E en la posición 42, K en la posición 43, H en la posición 49, T en la posición 52, E en la posición 53, G en la posición 54, E en la posición 55, A en la posición 58, Q en la posición 65, V en la posición 67, A en la posición 72, G en la posición 75, K en la posición 79, H en la posición 82, Q en la posición 84, A en la posición 85, I en la posición 87, Q en la posición 88, P en la posición 89, H en la posición 92, S en la posición 93, T en la posición 96, I en la posición 102, D en la posición 110, A en la posición 111, H en la posición 114, L en la posición 116, Q en la posición 117, S en la posición 118, P en la posición 121, A en la posición 122, E en la posición 123, A en la posición 128, G en la posición 130, K en la posición 133, I en la posición 143, A en la posición 145, K en la posición 146, E en la posición 149, L en la posición 150 o Q en la posición 153.

[0062] En una forma de realización, la mioglobina aislada es de una mamut lanudo como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente es una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5, más preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 en combinación con G en la posición 6, E en la posición 9, L en la posición 10, K en la posición 13, T en la posición 14, I en la posición 22, P en la posición 23, L en la posición 27, F en la posición 30, V en la posición 31, T en la posición 35, G en la posición 36, E en la posición 42, K en la posición 43, H en la posición 49, T en la posición 52, E en la posición 53, G en la posición 54, E en la posición 55, A en la posición 58, Q en la posición 65, V en la posición 67, A en la posición 72, G en la posición 75, K en la posición 79, H en la posición 82, Q en la posición 84, A en la posición 85, I en la posición 87, Q en la posición 88, P en la posición 89, Q en la posición 92, S en la posición 93, T en la posición 96, I en la posición 102, D en la posición 110, A en la posición 111, H en la posición 114, L en la posición 116, Q en la posición 117, S en la posición 118, P en la posición 121, A en la posición 122, E en la posición 123, A en la posición 128, G en la posición 130, K en la posición 133, I en la posición 143, A en la posición 145, K en la posición 146, E en la posición 149, L en la posición 150 o Q en la posición 153.

[0063] En una forma de realización, la mioglobina aislada es de un atún como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente es una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, más preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6 en combinación con D en la posición 9, A en la posición 10, K en la posición 13, C en la posición 14, Y en la posición 22, T en la posición 23, G en la posición 27, L en la posición 30, T en la posición 31, K en la posición 35, E en la posición 36, K en la posición 42, L en la posición 43, G en la posición 49, A en la posición 52, Q en la posición 53, A en la posición 54, D en la posición 55, G en la posición 58, H en la posición 65, A en la posición 67, K en la posición 72, E en la posición 75, A en la posición 79, S en la posición 82, A en la posición 84, A en la posición 85, L en la posición 87, K en la posición 88, P en la posición 89, N en la posición 92, S en la posición 93, T en la posición 96, I en la posición 102, E en la posición 110, V en la posición 111, K en la posición 114, M en la posición 116, H en la posición 117, E en la posición 118, A en la posición 122, G en la posición 123, Q en la posición 128, T en la posición 130, R en la posición 133, L en la posición 143, A en la posición 145, N en la posición 146, E en la posición 149, L en la posición 150 o S en la posición 153.

[0064] En una forma de realización, la mioglobina aislada puede estar representada por una de las siguientes secuencias de aminoácidos:

a) teniendo al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y teniendo al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos:

- M en la posición 10, y/o

- A en la posición 36, y/o

- S en la posición 58, y/o

- M en la posición 10 y A en la posición 36, y/o

- M en la posición 10 y S en la posición 58, y/o

- A en la posición 36 y S en la posición 58, y/o

- M en la posición 10 y A en la posición 36 y S en la posición 58;

b) teniendo al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y teniendo un aminoácido A en la posición 6;

c) teniendo al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3, y teniendo al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos:

- D en la posición 55, y/o

- I en la posición 111, y/o

- E en la posición 114, y/o

- D en la posición 55 e I en la posición 111, y/o

- D en la posición 55 y E en la posición 114, y/o

- I en la posición 111 y E en la posición 114, y/o

- D en la posición 55 e I en la posición 111 y E en la posición 114;

d) teniendo al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 4 o 5, y teniendo F en la posición 30 y/o Q en la posición 65;

e) teniendo al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 6, y teniendo H en la posición 65 y/o la posición 94;

f) teniendo al menos un 90%de identidad con la SEQ ID NO: 1, 2 o 3, y teniendo al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos;

- L en la posición 22, y/o

- A o T en la posición 36, y/o

- G en la posición 122;

- L en la posición 22 y A o T en la posición 36, y/o

- L en la posición 22 y G en la posición 122; y/o

- A o T en la posición 36 y G en la posición 122, y/o

- L en la posición 22 y A o T en la posición 36 y G en la posición 122;

g) teniendo al menos un 90 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 5, y teniendo I en la posición 87;

h) teniendo al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o 3, y teniendo al menos uno o más de los siguientes aminoácidos o cualquier combinación de los mismos;

- N en la posición 49, y/o

- E en la posición 54, y/o

- C en la posición 67, y/o

- T en la posición 75, y/o

- Q en la posición 82, y/o

- K en la posición 117, y/o

- K en la posición 118, y/o

- S en la posición 121,

i) teniendo al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 4, y teniendo al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos:

- H en la posición 92, y/o

- H en la posición 92 y F en la posición 30, y/o

- H en la posición 92 y Q en la posición 65, y/o;

- H en la posición 92 y F en la posición 30 y Q en la posición 65.

[0065] En una forma de realización, la mioglobina aislada es una mioglobina recombinante, donde la mioglobina recombinante es de una rata como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, más preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, en combinación con G en la posición 6, Q en la posición 9, M en la posición 10, N en la posición 13, I en la posición 14, L en la posición 22, A en la posición 23, Q en la posición 27, L en la posición 30, I en la posición 31, G en la posición 32, K en la posición 35, A en la posición 36, E en la posición 42, K en la posición 43, N en la posición 49, S en la posición 52, E en la posición 53, E en la posición 54, E en la posición 55, S en la posición 58, H en la posición 65, C en la posición 67, A en la posición 72, T en la posición 75, K en la posición 79, Q en la posición 82, Q en la posición 92, S en la posición 93, T en la posición 96, V en la posición 102, E en la posición 110, V en la posición 111, Q en la posición 114, L en la posición 116, K en la posición 117, K en la posición 118, R en la posición 119, S en la posición 121, G en la posición 122, D en la posición 123, A en la posición 128, G en la posición 130, S en la posición 133, I en la posición 143, A en la posición 145, K en la posición 146, E en la posición 149, L en la posición 150 o Q en la posición 153.

[0066] En una forma de realización, la mioglobina aislada es una mioglobina recombinante, donde la mioglobina recombinante es de un conejo como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, más preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, en combinación con A en la posición 6, Q en la posición 9, L en la posición 10, N en la posición 13, V en la posición 14, L en la posición 22, A en la posición 23, Q en la posición 27, L en la posición 30, I en la posición 31, G en la posición 32, H en la posición 35, T en la posición 36, E en la posición 42, K en la posición 43, H en la posición 49, S en la posición 52, E en la posición 53, D en la posición 54, E en la posición 55, A en la posición 58, H en la posición 65, N en la posición 67, A en la posición 72, A en la posición 75, K en la posición 79, H en la posición 82, Q en la posición 92, S en la posición 93, T en la posición 96, V en la posición 102, E en la posición 110, A en la posición 111, H en la posición 114, L en la posición 116, H en la posición 117, S en la posición 118, R en la posición 119, P en la posición 121, G en la posición 122, D en la posición 123, A en la posición 128, A en la posición 130, S en la posición 133, I en la posición 143, A en la posición 145, K en la posición 146, E en la posición 149, L en la posición 150 o Q en la posición 153.

[0067] En una forma de realización, la mioglobina aislada es una mioglobina recombinante, donde la mioglobina recombinante es de un ratón como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3, más preferiblemente

una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3, en combinación con

G en la posición 6, Q en la posición 9, L en la posición 10, N en la posición 13, V en la posición 14, L en la

posición 22, A en la posición 23, Q en la posición 27, L en la posición 30, I en la posición 31, G en la posición 32,

K en la posición 35, T en la posición 36, D en la posición 42, K en la posición 43, N en la posición 49, S en la

posición 52, E en la posición 53, E en la posición 54, D en la posición 55, G en la posición 58, H en la posición

65, C en la posición 67, A en la posición 72, T en la posición 75, K en la posición 79, Q en la posición 82, Q en la

posición 92, S en la posición 93, T en la posición 96, V en la posición 102, E en la posición 110, I en la posición

111, E en la posición 114, L en la posición 116, K en la posición 117, K en la posición 118, R en la posición 119,

S en la posición 121, G en la posición 122, D en la posición 123, A en la posición 128, G en la posición 130, S en

la posición 133, I en la posición 143, A en la posición 145, K en la posición 146, E en la posición 149, L en la

posición 150 o Q en la posición 153.

[0068] En una forma de realización, la mioglobina aislada es una mioglobina recombinante, donde la mioglobina recombinante es de un mamut de la estepa tal como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4,

más preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4

en combinación con G en la posición 6, E en la posición 9, L en la posición 10, K en la posición 13, T en la

posición 14, I en la posición 22, P en la posición 23, L en la posición 27, F en la posición 30, V en la posición 31,

T en la posición 35, G en la posición 36, E en la posición 42, K en la posición 43, H en la posición 49, T en la

posición 52, E en la posición 53, G en la posición 54, E en la posición 55, A en la posición 58, Q en la posición

65, V en la posición 67, A en la posición 72, G en la posición 75, K en la posición 79, H en la posición 82, Q en la posición 84, A en la posición 85, I en la posición 87, Q en la posición 88, P en la posición 89, H en la posición 92, S en la posición 93, T en la posición 96, I en la posición 102, D en la posición 110, A en la posición 111, H en la

posición 114, L en la posición 116, Q en la posición 117, S en la posición 118, P en la posición 121, A en la

posición 122, E en la posición 123, A en la posición 128, G en la posición 130, K en la posición 133, I en la

posición 143, A en la posición 145, K en la posición 146, E en la posición 149, L en la posición 150 o Q en la

posición 153.

[0069] En una forma de realización, la mioglobina aislada es una mioglobina recombinante, donde la mioglobina recombinante es de un mamut lanudo como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5,

más preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5

65, V en la posición 67, A en la posición 72, G en la posición 75, K en la posición 79, Q en la posición 84, A en la posición 85, I en la posición 87, Q en la posición 88, P en la posición 89, Q en la posición 92, S en la posición 93, T en la posición 96, I en la posición 102, D en la posición 110, A en la posición 111, H en la posición 114, L en la

posición 116, Q en la posición 117, S en la posición 118, P en la posición 121, A en la posición 122, E en la posición 123, A en la posición 128, G en la posición 130, K en la posición 133, I en la posición 143, A en la posición 145, K en la posición 146, E en la posición 149, L en la posición 150 o Q en la posición 153.

[0070] En una forma de realización, la mioglobina aislada es una mioglobina recombinante, donde la mioglobina recombinante es de un atún como se ha definido anteriormente en el presente documento, preferiblemente una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, más preferiblemente

una mioglobina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6 en combinación con

D en la posición 9, A en la posición 10, K en la posición 13, C en la posición 14, Y en la posición 22, T en la posición 23, G en la posición 27, L en la posición 30, T en la posición 31, K en la posición 35, E en la posición 36,

K en la posición 42, L en la posición 43, G en la posición 49, A en la posición 52, Q en la posición 53, A en la

posición 54, D en la posición 55, G en la posición 58, H en la posición 65, A en la posición 67, K en la posición

72, E en la posición 75, A en la posición 79, S en la posición 82, A en la posición 84, A en la posición 85, L en la

posición 87, K en la posición 88, P en la posición 89, N en la posición 92, S en la posición 93, T en la posición

96, I en la posición 102, E en la posición 110, V en la posición 111, K en la posición 114, M en la posición 116, H

en la posición 117, E en la posición 118, A en la posición 122, G en la posición 123, Q en la posición 128, T en la

posición 130, R en la posición 133, L en la posición 143, A en la posición 145, N en la posición 146, E en la

posición 149, L en la posición 150 o S en la posición 153.

[0071] En una forma de realización, la mioglobina aislada es una mioglobina recombinante, donde la mioglobina recombinante puede estar representada por una de las siguientes secuencias de aminoácidos:

a) teniendo al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y teniendo al menos una de

las siguientes combinaciones de aminoácidos:

- M en la posición 10, y/o

- A en la posición 36, y/o

- S en la posición 58, y/o

- M en la posición 10 y A en la posición 36, y/o

- M en la posición 10 y S en la posición 58, y/o

- A en la posición 36 y S en la posición 58, y/o

- M en la posición 10 y A en la posición 36 y S en la posición 58;

- D en la posición 55, y/o

- I en la posición 111, y/o

- E en la posición 114, y/o

- D en la posición 55 e I en la posición 111, y/o

- D en la posición 55 y E en la posición 114, y/o

- I en la posición 111 y E en la posición 114, y/o

- D en la posición 55 e I en la posición 111 y E en la posición 114;

d) teniendo al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 4 o 5, y teniendo F en la posición 30 y/o Q en la posición 65;

f) teniendo al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, 2 o 3, y teniendo al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos;

- L en la posición 22, y/o

- A o T en la posición 36, y/o

- G en la posición 122;

- L en la posición 22 y A o T en la posición 36, y/o

- L en la posición 22 y G en la posición 122; y/o

- A o T en la posición 36 y G en la posición 122, y/o

- L en la posición 22 y A o T en la posición 36 y G en la posición 122;

- N en la posición 49, y/o

- E en la posición 54, y/o

- C en la posición 67, y/o

- T en la posición 75, y/o

- Q en la posición 82, y/o

- K en la posición 117, y/o

- K en la posición 118, y/o

- S en la posición 121.

[0072] En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la mioglobina aislada o, preferiblemente, la mioglobina recombinante identificada anteriormente en el presente documento comprende una secuencia que tiene al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad o similitud con la SEQ ID NO: 1 en combinación con al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos:

- M en la posición 10, y/o

- A en la posición 36, y/o

- S en la posición 58, y/o

- M en la posición 10 y A en la posición 36, y/o

- M en la posición 10 y S en la posición 58, y/o

- A en la posición 36 y S en la posición 58, y/o

- M en la posición 10 y A en la posición 36 y S en la posición 58.

[0073] En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la mioglobina aislada o preferiblemente la mioglobina recombinante identificada anteriormente en el presente documento comprende una secuencia que tiene al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad o similitud con la SEQ ID NO: 2 y que tiene un aminoácido A en la posición 6.

[0074] En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la mioglobina aislada o preferiblemente la mioglobina recombinante identificada anteriormente en el presente documento comprende una secuencia que tiene al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad o similitud con la SEQ ID NO: 3 en combinación con al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos:

- D en la posición 55, y/o

- I en la posición 111, y/o

- E en la posición 114, y/o

- D en la posición 55 e I en la posición 111, y/o

- D en la posición 55 y E en la posición 114, y/o

- I en la posición 111 y E en la posición 114, y/o

- D en la posición 55 e I en la posición 111 y E en la posición 114.

[0075] En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la mioglobina aislada o, preferiblemente, la mioglobina recombinante identificada anteriormente en el presente documento comprende una secuencia que tiene al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad o similitud con la SEQ ID NO: 4 o 5 y que tiene F en la posición 30 y/o Q en la posición 65.

[0076] En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la mioglobina aislada o, preferiblemente, la mioglobina recombinante identificada anteriormente en el presente documento comprende una secuencia que tiene al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad o similitud con la SEQ ID NO: 6 y que tiene H en la posición 65 y/o la posición 94.

[0077] En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la mioglobina aislada o, preferiblemente, la mioglobina recombinante identificada anteriormente en el presente documento comprende una secuencia que tiene al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad o similitud con la SEQ ID NO: 1, 2 o 3 en combinación con al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos:

- L en la posición 22, y/o

- A o T en la posición 36, y/o

- G en la posición 122;

- L en la posición 22 y A o T en la posición 36, y/o

- L en la posición 22 y G en la posición 122; y/o

- A o T en la posición 36 y G en la posición 122, y/o

- L en la posición 22 y A o T en la posición 36 y G en la posición 122.

[0078] En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la mioglobina aislada o, preferiblemente, la mioglobina recombinante identificada anteriormente en el presente documento comprende una secuencia que tiene al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad o similitud con la SEQ ID NO: 1 a 5, y que tiene I en la posición 87.

[0079] En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la mioglobina aislada o, preferiblemente, la mioglobina recombinante identificada anteriormente en el presente documento comprende una secuencia que tiene al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % de identidad o similitud con la SEQ ID NO: 1 o 3 y que tiene al menos uno o más de los siguientes aminoácidos o cualquier combinación de los mismos;

- N en la posición 49, y/o

- E en la posición 54, y/o

- C en la posición 67, y/o

- T en la posición 75, y/o

- Q en la posición 82, y/o

- K en la posición 117, y/o

- K en la posición 118, y/o

- S en la posición 121.

Un alimento para animales domésticos

[0080] En el presente documento se describe, pero no se reivindica, un alimento para animales domésticos obtenible mediante los métodos descritos en el presente documento. Este alimento para animales domésticos comprende una mioglobina, donde la mioglobina aislada es una mioglobina de rata, una mioglobina de conejo, una mioglobina de ratón, una mioglobina de mamut, una mioglobina de atún, o una combinación de dos, tres, cuatro o cinco de dichas mioglobinas.

[0081] Todas las preferencias y formas de realización enumeradas para los métodos de preparación de un alimento para animales domésticos del primer aspecto de la invención pueden aplicarsemutatis mutandisal alimento para animales domésticos.

[0082] Por ejemplo, cualquier especificación de la secuencia de la mioglobina aislada añadida durante el método puede aplicarse a la secuencia de una mioglobina comprendida en el alimento para animales domésticos.

[0083] Esto es evidente dado que el alimento para animales domésticos se puede obtener mediante el método de la invención.

[0084] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, no comprende una o más proteínas de la leche seleccionadas del grupo que consiste en p-caseína, K-caseína, a-S1-caseína, a-S2-caseína, a-lactoalbúmina, p-lactoglobulina, lactoferrina y transferrina, donde dicha proteína de leche es de un mamut lanudo. En otra forma de realización, el sustituto de la carne no comprende una o más proteínas de la leche seleccionadas del grupo que consiste en p-caseína, K-caseína, a-S1-caseína, a-S2-caseína, a-lactoalbúmina, p-lactoglobulina, lactoferrina y transferrina, donde dicha proteína de la leche es de un mamut.

[0085] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, no comprende una o más proteínas de la leche seleccionadas del grupo que consiste en p-caseína, K-caseína, a-S1-caseína, a-S2-caseína, a-lactoalbúmina, p-lactoglobulina, lactoferrina y transferrina, donde dicha proteína de la leche no ha sido producida por un mamífero o una célula de mamífero.

[0086] En una forma de realización más preferida, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, no comprende una proteína de la leche tal como p-caseína, K-caseína, a-S1-caseína, a-S2-caseína, a-lactoalbúmina, p-lactoglobulina, lactoferrina o transferrina, donde dicha proteína de la leche es de un mamut lanudo. En otra forma de realización más preferida, el sustituto de la carne no comprende una proteína de la leche tal como p-caseína, K-caseína, a-S1-caseína, a-S2-caseína, a-lactoalbúmina, p-lactoglobulina, lactoferrina o transferrina, donde dicha proteína de la leche es de un mamut.

[0087] En otra forma de realización más preferida, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, no comprende una proteína de la leche tal como p-caseína, K-caseína, a-S1-caseína, a-S2-caseína, a-lactoalbúmina, p-lactoglobulina, lactoferrina o transferrina, donde dicha proteína de la leche no ha sido producida por un mamífero o una célula de mamífero.

[0088] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, no comprende una K-caseína de un mamut lanudo. En una forma de realización adicional, el sustituto de la carne no comprende una proteína representada por una secuencia que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 13. En una forma de realización adicional, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, no comprende una proteína representada por la SEQ ID NO: 13.

[0089] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, no comprende una p-caseína de un mamut lanudo. En una forma de realización adicional, el sustituto de la carne no comprende una proteína representada por una secuencia que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14. En una forma de realización adicional, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, no comprende una proteína representada por la SEQ ID NO: 14.

[0090] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, no comprende una hemoglobina simbiótica que ha sido producida por una bacteria que vive en simbiosis en los nódulos de raíz de una planta de soja. En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, no comprende una leghemoglobina. En una forma de realización, la mioglobina aislada descrita en el presente documento puede ser la única fuente de proteína que contiene hemo presente en el sustituto de la carne. Significa que el sustituto de la carne puede comprender otras proteínas distintas de la mioglobina aislada como se describe en el presente documento. Los ejemplos de proteínas que pueden estar presentes incluyen proteínas de soja.

[0091] En el contexto de la invención, una proteína que contiene hemo, como se define, puede referirse a todas las proteínas o subunidades de proteínas que son capaces de unirse covalente o no covalentemente a una fracción hemo. Los polipéptidos que contienen hemo pueden transportar o almacenar oxígeno. Algunos ejemplos de proteína que contiene hemo incluyen globina, hemoglobina, leghemoglobina.

[0092] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, se prepara mezclando (es decir, añadiendo) de 10 % a 40 % de una fuente de proteínas, de 5 % a 30 % de una fuente de lípidos, de 0,1 % a 5 % de NaCl, de 0,1 % a 5 % de una fuente de fibra, y de 0,1 % a 5 % de una mioglobina aislada. En una forma de realización más preferida, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, se prepara mezclando desde 20 % hasta 30 % de una fuente de proteínas, desde 10 % hasta 20 % de una fuente de lípidos, desde 0,5 % hasta 2 % de NaCl, desde 0,5 % hasta 1.5 % de una fuente de fibra, y desde 0,1 % hasta 3 % de una mioglobina aislada.

[0093] Preferiblemente, la fuente de proteínas es proteína de soja texturizada, aislado de proteína de guisante, proteína de haba, proteína de judía mungo, proteína de trigo texturizada, proteína de arroz o proteína de patata. En este contexto, la proteína de soja texturizada es un producto de harina de soja desgrasada, también conocido como proteína vegetal texturizada (TVP) o carne de soja, como es evidente para el experto. Preferiblemente, la fuente de lípidos es aceite de girasol, aceite de coco, aceite de canola o manteca de cacao. Preferiblemente, la fuente de fibra es metilcelulosa o almidón de patata.

[0094] En una forma de realización más preferida, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, se prepara mezclando de 20 % a 30 % de proteína de soja texturizada, de 10 % a 20 % de aceite de girasol, de 0,5 % a 2 % de NaCl, de 0,5 % a 1,5 % de metilcelulosa, y de 0,1 % a 10 % de una mioglobina aislada. Incluso más preferiblemente, el porcentaje en peso de la mioglobina aislada en el sustituto de la carne según la forma de realización más preferida es de desde el 0,1 % hasta el 5 %, 4,9 %, 4,8 %, 4,7 %, 4.6 %, 4,5 %, 4,4 %, 4,3 %, 4,2 %, 4,1 %, 4 %, 3,9 %, 3,8 %, 3,7 %, 3,6 %, 3,5 %, 3,4 %, 3,3 %, 3,2 %, 3,1 %, 3 %, 2,95 %, 2,9%,2,85%,2,8%,2,75 %, 2,7 %, 2,65 %, 2,6 %, 2,55 %, 2,5 %, 2,45 %, 2,4 %, 2,35 %, 2,3 %, 2,25 %, 2,2 %, 2,15 %, 2,1 %, 2,05 %, 2 %, 1,95 %, 1,9 %, 1,85 %, 1,8 %, 1,75 %, 1,7 %, 1,65 %, 1,6 %, 1,55 %, 1,5 %, 1,45 %, 1,4 %, 1,35 %, 1,3 %, 1,25 %, 1,2 %, 1,15 %, 1,1 %, 1,05 %, 1 %, 0,95 %, 0,9 %, 0,85 %, 0,8 %, 0,75 %, 0,7 %, 0,65 %, 0,6 %, 0,55 % o 0,5 %.

[0095] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, se prepara mezclando de 20 % a 30 % de proteína de soja texturizada, de 10 % a 20 % de aceite de girasol, de 1 % a 2 % de NaCl, de 0,5 % a 1,5 % de metilcelulosa, de 50 % a 70 % de agua y de 0,2 % a 0,8 % de mioglobina aislada. En una forma de realización preferida, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, se prepara mezclando desde 23 % hasta 27 % de proteína de soja texturizada, desde 13 % hasta 17 % de aceite de girasol, desde 1,25 % hasta 1,75 % de NaCl, desde 0,75 % hasta 1,25 % de metilcelulosa, desde 55 % hasta 60 % de agua y desde 0,45 % hasta 0,55 % de mioglobina aislada.

[0096] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, se prepara mezclando un 25 % de proteína de soja texturizada, un 15 % de aceite de girasol, un 1.5 % de NaCl, un 1,0 % de metilcelulosa, un 57 % de agua y un 0,5 % de mioglobina aislada, donde estos porcentajes en peso se redondean a dos dígitos significativos.

[0097] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, se prepara mezclando de 15 % hasta 35 % de proteína de soja texturizada, de 10% a 20 % de aceite de girasol, de 0,5 % a 2,5 % de NaCl, de 0,5 % a 1,5 % de metilcelulosa, de 50 % a 70 % de agua y de 0,5 % a 1.5 % de mioglobina aislada. En una forma de realización preferida, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, se prepara mezclando de 22 % a 27 % de proteína de soja texturizada, de 13 % a 17 % de aceite de girasol, de 1,25 % a 1,75 % de NaCl, de 0,75 % a 1,25 % de metilcelulosa, de 50 % a 60 % de agua y de 0,75 % a 1,25 % de mioglobina aislada.

[0098] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, se prepara mezclando un 25 % de proteína de soja texturizada, un 15 % de aceite de girasol, un 1.5 % de NaCl, un 1,0 % de metilcelulosa, un 57 % de agua y un 1,0 % de mioglobina aislada, donde estos porcentajes en peso se redondean a dos dígitos significativos.

[0099] En los sustitutos de carne anteriores, % se refiere a un porcentaje en peso. En la medida en que los porcentajes en peso que describen la composición de un sustituto de la carne no suman el 100 %, se supone la adición de agua hasta un porcentaje correspondiente.

[0100] En una forma de realización, el alimento para animales domésticos, que es preferiblemente un sustituto de la carne, comprende una cantidad similar de hierro biodisponible o hierro hemo que la carne genuina homóloga. En una forma de realización, dicha cantidad varía de 0,3 a 20 mg de hierro biodisponible o hierro hemo por 100 gramos de alimento para animales domésticos. En una forma de realización, dicha cantidad varía de 0,1 mg hasta 16,5 mg, 16,17 mg, 15,84 mg, 15,51 mg, 15,18 mg, 14,85 mg, 14,52 mg, 14,19 mg, 13,86 mg, 13,53 mg, 13,2 mg, 12,87 mg, 12,54 mg, 12,21 mg, 11,88 mg, 11,55 mg, 11,22 mg, 10,89 mg, 10,56 mg, 10,23 mg, 9,9 mg, 9,735 mg, 9,57 mg, 9,405 mg, 9,24 mg, 9,075 mg, 8,91 mg, 8,745 mg, 8,58 mg, 8,415 mg, 8,25 mg, 8,085 mg, 7,92 mg, 7,755 mg, 7,59 mg, 7,425 mg, 7,26 mg, 7,095 mg, 6,93 mg, 6,765 mg, 6,6 mg, 6,435 mg, 6,27 mg, 6,105 mg, 5,94 mg, 5,775 mg, 5,61 mg, 5,445 mg, 5,28 mg, 5,115 mg, 4,95 mg, 4,785 mg, 4,62 mg, 4,455 mg, 4,29 mg, 4,125 mg, 3,96 mg, 3,795 mg, 3,63 mg, 3,465 mg, 3,3 mg, 3,135 mg, 2,97 mg, 2,805 mg, 2,64 mg, 2,475 mg, 2,31 mg, 2,145 mg, 1,98 mg, 1,815 mg o 1,65 mg de hierro biodisponible o hierro hemo por 100 gramos de alimento para animales domésticos. En otra forma de realización, dicha cantidad es 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10.7, 10,8, 10,9, 11, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12.7, 12,8, 12,9, 13, 13,1, 13,2, 13,3, 13,4, 13,5, 13,6, 13,7, 13,8, 13,9, 14, 14,1, 14,2, 14,3, 14,4, 14,5, 14,6, 14.7, 14,8, 14,9, 15, 15,1, 15,2, 15,3, 15,4, 15,5, 15,6, 15,7, 15,8, 15,9, 16, 16,1, 16,2, 16,3, 16,4, 16,5, 16,6, 16.7, 16,8, 16,9, 17, 17,1, 17,2, 17,3, 17,4, 17,5, 17,6, 17,8, 17,9, 18, 18,1, 18,2, 18,3, 18,4, 18,5, 18,6, 18,7, 18.8, 18,9, 19, 19,1, 19,2, 19,3, 19,4, 19,5, 19,6, 19,7, 19,8, 19,9, o 20 mg de hierro biodisponible o hierro hemo por 100 gramos de comida para animales domésticos.

Términos generales

[0101] A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que habitualmente y normalmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención, y leídos a la vista de esta divulgación.

[0102] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que se incluyen los elementos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los elementos no mencionados específicamente. Además, el verbo "consistir" puede ser sustituido por "consistir esencialmente en" lo que significa que un método como se describe en el presente documento puede comprender paso(s) adicional(es) a los identificados específicamente, sin que dicho(s) paso(s) adicional(es) altere(n) la característica única de la invención. Además, el verbo "consistir" puede ser reemplazado por "consistir esencialmente en" lo que significa que un alimento para animales domésticos, un sustituto de la carne, una mioglobina aislada, una construcción génica, una célula (o métodos) huésped como se describe en el presente documento pueden comprender componente(s) adicional(es) (o pasos adicionales) a los identificados específicamente, sin que dicho(s) componente(s) adicional(es) alteren la característica única de la invención.

[0103] La referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que más de uno de los elementos esté presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una" significa, por lo tanto, normalmente "al menos uno". Como se usa en el presente documento, con "al menos" un valor particular significa ese valor particular o más. Por ejemplo, se entiende que "al menos 2" es igual a "2 o más", es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,..., etc.

[0104] Además, los términos primero, segundo, tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones, se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Debe entenderse que los términos así usados son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las formas de realización de la invención descritas en el presente documento pueden funcionar en secuencias distintas de las descritas o ilustradas en el presente documento. La palabra "alrededor de" o "aproximadamente" cuando se usa en asociación con un valor numérico (por ejemplo, alrededor de 10) significa preferiblemente que el valor puede ser el valor dado (de 10) más o menos 0,1 % del valor. Como se usa en el presente documento, el término "y/o" indica que uno o más de los casos indicados pueden ocurrir, solos o en combinación con al menos uno de los casos indicados, hasta con todos los casos indicados.

[0105] En el contexto de esta solicitud, todos los porcentajes en el contexto de una concentración o composición se refieren a porcentajes en peso, a menos que se defina lo contrario. En el contexto de esta solicitud, expresiones tales como "un parámetro que tiene un valor de al menos X, Y o Z" deben interpretarse como dicho parámetro que tiene un valor de al menos X, de al menos Y o de al menos Z.

[0106] En el presente documento se describen diversas formas de realización. Cada forma de realización identificada en el presente documento puede combinarse entre sí a menos que se indique lo contrario.

[0107] Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no se limita de ninguna manera a los métodos y materiales descritos. La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención.

Identidad de secuencia

[0108] En el contexto de la invención, una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ácido nucleico que codifica una mioglobina aislada, está representada por una secuencia de ácido nucleico o nucleótido que codifica un fragmento de proteína, un polipéptido, un péptido o un péptido derivado. Debe entenderse que cada molécula de ácido nucleico o fragmento de proteína, polipéptido, péptido o péptido derivado o construcción como se identifica en el presente documento por un número de identidad de secuencia dado (SEQ ID NO) no se limita a esta secuencia específica como se describe. Cada secuencia codificante identificada en el presente documento codifica un fragmento de proteína o polipéptido, péptido, péptido derivado o construcción o es en sí mismo un fragmento de proteína o polipéptido, construcción, péptido o péptido derivado.

[0109] A lo largo de esta solicitud, cada vez que se hace referencia a una secuencia de nucleótidos específica SEQ ID NO (tomando como ejemplo la SEQ ID NO: X) que codifica un fragmento de proteína o polipéptido, péptido o péptido derivado dado, se puede reemplazar por:

i. Una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: X; o

ii. una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) debido a la degeneración del código genético; o

iii. una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad o similitud de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: X.

[0110] Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 70 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 75 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 80 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 85 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 90 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 95 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 99 %.

[0111] A lo largo de esta solicitud, cada vez que se hace referencia a una secuencia de aminoácidos específica SEQ ID NO (tomando la SEQ ID NO: Y como ejemplo), se puede reemplazar por: un polipéptido representado por una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia que tiene al menos un 60 % de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: Y. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 70 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 75 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 80 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 85 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 90 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 95 %. Otro nivel preferido de identidad o similitud de secuencia es el 99 %.

[0112] Cada secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento en virtud de su porcentaje de identidad o similitud con una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos dada tiene respectivamente, en una forma de realización preferida adicional, una identidad o similitud de al menos el 60 %, al menos el 61 %, al menos el 62 %, al menos el 63 %, al menos el 64 %, al menos el 65 %, al menos el 66 %, al menos el 67 %, al menos el 68 %, al menos el 69 %, al menos el 70 %, al menos el 71 %, al menos el 72 %, al menos el 73 %, al menos el 74 %, al menos el 75 %, al menos el 76 %, al menos el 77 %, al menos el 78 %, al menos el 79 %, al menos el 80 %, al menos el 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos 99 % o 100 % con la secuencia de nucleótidos o aminoácidos dada, respectivamente.

[0113] Los términos "homología", "identidad de secuencia" y similares se usan indistintamente en el presente documento. La identidad de secuencia se describe en el presente documento como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos), según se determina comparando las secuencias. En una forma de realización preferida, la identidad de secuencia se calcula basándose en la longitud completa de dos SEQ ID NO dadas o en una parte de las mismas. Parte de la misma significa preferiblemente al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de ambas SEQ ID NO En la técnica, "identidad" también se refiere al grado de relación de secuencia entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea el caso, según se determine por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en Bioinformatics and the Cell: Modern Computational Approaches in Genomics, Proteomics and transcriptomics, Xia X., Springer International Publishing, Nueva York, 2018; y Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Mount D., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 2004, cada una incorporada en el presente documento por referencia.

[0114] La "identidad de secuencia" y la "similitud de secuencia" se pueden determinar mediante la alineación de dos secuencias peptídicas o nucleotídicas usando algoritmos de alineación globales o locales, dependiendo de la longitud de las dos secuencias. Las secuencias de longitudes similares se alinean preferiblemente usando algoritmos de alineamiento global (por ejemplo, Needleman-Wunsch) que alinean las secuencias óptimamente a lo largo de toda la longitud, mientras que las secuencias de longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineamiento local (por ejemplo, Smith-Waterman). Las secuencias pueden entonces denominarse "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando (cuando se alinean óptimamente, por ejemplo, mediante el programa EMBOSS needl o EMBOSS water usando parámetros por defecto) comparten al menos un cierto porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se describe más adelante).

[0115] Se usa adecuadamente un alineamiento global para determinar la identidad de secuencia cuando las dos secuencias tienen longitudes similares. Cuando las secuencias tienen una longitud global sustancialmente diferente, se prefieren alineamientos locales, tales como los que usan el algoritmo de Smith-Waterman. El EMBOSS needle usa el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch para alinear dos secuencias sobre toda su longitud (longitud completa), maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de huecos. El EMBOSS water utiliza el algoritmo de alineación local de Smith-Waterman. Generalmente, se usan los parámetros por defecto de EMBOSS needl y EMBOSS water, con una penalización por apertura de hueco = 10 (secuencias de nucleótidos) / 10 (proteínas) y una penalización por extensión de hueco = 0,5 (secuencias de nucleótidos) / 0,5 (proteínas). Para las secuencias de nucleótidos, la matriz de puntuación por defecto usada es DNAfull y para las proteínas la matriz de puntuación por defecto es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919 incorporada en el presente documento como referencia).

[0116] Alternativamente, el porcentaje de similitud o identidad puede determinarse buscando en bases de datos públicas, usando algoritmos tales como FASTA, BLAST, etc. Por tanto, las secuencias de ácido nucleico y proteína de algunas formas de realización de la presente invención pueden usarse adicionalmente como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden realizarse usando los programas BLASTn y BLASTx (versión 2.0) de Altschul,et al.(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, incorporados en el presente documento por referencia. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácido nucleico oxidorreductasa de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa BLASTx, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineaciones separadas con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschulet al.,(1997) Nucleic Acids Res.

25(17): 3389-3402, incorporado en el presente documento por referencia. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTx y BLASTn).Véasela página principal del Centro Nacional de Información Biotecnológica accesible en la web mundial www.ncbi.nlm.nih.gov/.

[0117] Opcionalmente, al determinar el grado de similitud de aminoácidos, el experto en la materia también puede tener en cuenta las denominadas sustituciones conservadoras de aminoácidos. Como se usa en el presente documento, las sustituciones "conservadoras" de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Los ejemplos de clases de residuos de aminoácidos para sustituciones conservadoras se dan en las siguientes tablas.

[0118] Clases alternativas de sustitución conservadora de residuos de aminoácidos:

[0119] Clasificaciones físicas y funcionales alternativas de los residuos de aminoácidos:

[0120] Por ejemplo, un grupo de aminoácidos con cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales alifáticas-hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos con cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valinaleucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Las variantes sustitucionales de la secuencia de aminoácidos divulgada en el presente documento son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo en las secuencias divulgadas y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Preferiblemente, el cambio de aminoácido es conservador. Las sustituciones conservadoras preferidas para cada uno de los aminoácidos naturales son las siguientes: Ala a Ser; Arg a Lys; Asn a Gln o His; Asp a Glu; Cys a Ser o Ala; Gln a Asn; Glu a Asp; Gly a Pro; His a Asn o Gln; Ile a Leu o Val; Leu a Ile o Val; Lys a Arg; Gln o Glu; Met a Leu o Ile; Phe a Met, Leu o Tyr; Ser a Thr; Thr a Ser; Trp a Tyr; Tyr a Trp o Phe; y, Val a Ile o Leu.Proteínas y aminoácidos

[0121] Los términos "proteína" o "polipéptido" o "secuencia de aminoácidos" se usan indistintamente y se refieren a moléculas que consisten en una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción, tamaño, estructura tridimensional u origen específicos. En secuencias de aminoácidos como se describe en el presente documento, los aminoácidos o "residuos" se indican mediante símbolos de tres letras. Estos símbolos de tres letras, así como los símbolos de una letra correspondientes, son bien conocidos por un experto en la técnica y tienen el siguiente significado: A (Ala) es alanina, C (Cys) es cisteína, D (Asp) es ácido aspártico, E (Glu) es ácido glutámico, F (Phe) es fenilalanina, G (Gly) es glicina, H (His) es histidina, I (Ile) es isoleucina, K (Lys) es lisina, L (Leu) es leucina, M (Met) es metionina, N (Asn) es asparagina, P (Pro) es prolina, Q (Gln) es glutamina, R (Arg) es arginina, S (Ser) es serina, T (Thr) es treonina, V (Val) es valina, W (Trp) es triptófano, Y (Tyr) es tirosina. Un residuo puede ser cualquier aminoácido proteinogénico, pero también cualquier aminoácido no proteinogénico tal como D-aminoácidos y aminoácidos modificados formados por modificaciones postraduccionales, y también cualquier aminoácido no natural, tal como se describe en el presente documento.Secuencia codificante o génica

[0122] El término "gen" significa un fragmento de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm) en una célula, operativamente unida a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor). Un gen comprenderá normalmente varios fragmentos unidos operativamente, tales como un promotor, una secuencia líder 5', una región codificante y una secuencia no traducida 3' (extremo 3'), por ejemplo, que comprende un sitio de terminación de la poliadenilación y/o transcripción. "Expresión de un gen" se refiere al proceso en el que una región de ADN que está operativamente unida a regiones reguladoras apropiadas, particularmente un promotor, se transcribe en un ARN, que es biológicamente activo, es decir, que puede traducirse en una proteína o péptido biológicamente activo. Como se usa en el presente documento, un "regulador" o "regulador transcripcional" es una proteína que controla la velocidad de transcripción de información genética desde el ADN al ARN mensajero, mediante la unión a una secuencia de ADN específica.

Promotor

[0123] Como se usa en el presente documento, el término "promotor" o "secuencia reguladora de la transcripción" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de una o más secuencias codificantes, y se localiza previamente con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de la transcripción de la secuencia codificante, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, pero sin limitarse a sitios de unión a factores de transcripción, sitios de unión a proteínas represoras y activadoras, y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida por un experto en la técnica para actuar directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción desde el promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" y/o "reprimible" es un promotor que está regulado fisiológica o evolutivamente para ser inducido y/o reprimido, por ejemplo, mediante la aplicación de un inductor químico o señal represora.

[0124] Como se usa en el presente documento, el término "unido operativamente" se refiere a un enlace de elementos polinucleótidos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia reguladora de la transcripción está operativamente unida a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Unido operativamente significa que las secuencias de ADN que se unen suelen ser contiguas y, cuando sea necesario se unen dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en marco de lectura. La unión puede realizarse mediante ligadura en sitios de restricción convenientes o en adaptadores o enlazadores insertados en lugar de los mismos, o mediante síntesis génica.

Construcciones génicas y vectores de expresión

[0125] Las construcciones génicas como se describen en el presente documento podrían prepararse usando cualquier técnica de clonación y/o ADN recombinante, como es conocido por un experto en la técnica, en la que una secuencia de nucleótidos que codifica dicha mioglobina aislada se expresa en una célula adecuada, por ejemplo, células cultivadas o células de un organismo multicelular, tal como se describe en Ausubelet al.,"Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1987) y en Sambrook y Russell (2001,supra);ambas se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.Véasetambién, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488 (que describe mutagénesis dirigida al sitio) y Robertset al.(1987) Nature 328:731-734 o Wells, J.A.,et al.(1985) Gene 34: 315 (que describe la mutagénesis en casete).

[0126] La expresión "vector de expresión" o "vector" se refiere generalmente a una herramienta en biología molecular usada para obtener la expresión génica en una célula, por ejemplo, introduciendo una secuencia de nucleótidos que sea capaz de efectuar la expresión de un gen o una secuencia codificante en un huésped compatible con tales secuencias.

[0127] Un vector de expresión porta un genoma que es capaz de estabilizarse y permanecer episomal en una célula. Dentro del contexto de la invención, una célula puede significar abarcar una célula usada para hacer la construcción o una célula en la que se administrará la construcción. Alternativamente, un vector es capaz de integrarse en el genoma de una célula, por ejemplo, mediante recombinación homóloga o de otro modo.

[0128] Estos vectores de expresión incluyen normalmente al menos secuencias promotoras adecuadas y opcionalmente, señales de terminación de la transcripción. También se puede usar un factor adicional necesario o útil para efectuar la expresión como se describe en el presente documento. Se incorpora un ácido nucleico o ADN o secuencia de nucleótidos que codifica una mioglobina en una construcción de a Dn capaz de introducirse y expresarse en un cultivo celularin vitro.Específicamente, una construcción de ADN es adecuada para la replicación en un huésped procariótico, tal como bacterias, por ejemplo,E. coli,o se puede introducir en un mamífero, planta, insecto (por ejemplo, Sf9), levadura, hongo u otras líneas celulares eucariotas.

[0129] Una construcción de ADN preparada para su introducción en un huésped particular puede incluir un sistema de replicación reconocido por el huésped, un segmento de ADN previsto que codifica un polipéptido deseado, y secuencias reguladoras de la iniciación y terminación transcripcionales y traduccionales unidas operativamente al segmento que codifica el polipéptido. El término "unido operativamente" ya se ha descrito en el presente documento. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si estimula la transcripción de la secuencia. El ADN para una secuencia señal está unido operativamente al ADN que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción de un polipéptido. Generalmente, una secuencia de ADN que está operativamente unida es contigua, y, en el caso de una secuencia señal, tanto contigua como en el marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no necesitan ser contiguos con una secuencia codificante cuya transcripción controlan. La unión se logra mediante ligadura en sitios de restricción convenientes o en adaptadores o enlazadores insertados en lugar de los mismos, o mediante síntesis génica.

[0130] La selección de una secuencia promotora apropiada depende generalmente de la célula huésped seleccionada para la expresión de un segmento de ADN. Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas incluyen promotores procarióticos y eucarióticos bien conocidos en la técnica(véase,por ejemplo, Sambrook y Russell, 2001,supra).Una secuencia reguladora transcripcional incluye normalmente un potenciador o promotor heterólogo que sea reconocido por el huésped. La selección de un promotor apropiado depende del huésped, pero promotores tales como los promotores trp, lac y fago, promotores ARNt y promotores de enzimas glicolíticas se conocen y están disponibles(véase,por ejemplo, Sambrook y Russell, 2001,supra).Un vector de expresión incluye el sistema de replicación y secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales junto con el sitio de inserción para el segmento codificante del polipéptido. En la mayoría de los casos, el sistema de replicación solo es funcional en la célula que se usa para hacer el vector (célula bacteriana comoE. coli).La mayoría de los plásmidos y vectores no se replican en las células infectadas con el vector. Los ejemplos de combinaciones factibles de líneas celulares y vectores de expresión se describen en Sambrook y Russell (2001,supra)y en Metzgeret al.(1988) Nature 334: 31-36. Por ejemplo, los vectores de expresión adecuados pueden expresarse en levadura, por ejemplo, S.cerevisiae,por ejemplo, células de insecto, por ejemplo, células Sf9, células de mamífero, por ejemplo, células CHO y células bacterianas, por ejemplo,E. coli.Una célula puede ser, por lo tanto, una célula huésped procariota o eucariota. Una célula puede ser una célula que sea adecuada para el cultivo en un medio líquido o sólido. Alternativamente, una célula huésped es una célula que es parte de un organismo multicelular tal como una planta o animal transgénico.

[0131] Por ejemplo, si se usa una bacteria (preferiblementeE. coli)como célula huésped, pueden usarse las siguientes regiones reguladoras. Un promotor adecuado para ser usado en una bacteria es lac, trp, tac, T7, phoA, ara, xapA, cad, recA, spc, bla, P1 y P2 del operón de ARN ribosómico rrnB, promotor PL del fago A. Un terminador adecuado para ser usado en una bacteria es lac, trp, tac, T7 (usado en el ejemplo), phoA, ara, xapA, cad, recA, spc, bla, P1 y P2 del operón de ARN ribosómico rrnB, terminador PL del fago A. Un promotor preferido usado es un promotor T7 y/o un terminador preferido es el terminador T7. Un péptido señal preferido para la excreción es el péptido de reconocimiento Sec deE. coli(SecA), el péptido de reconocimiento Tet deE. coli,dsbA deE. coli,phoA deE. coli,pelB deE. coli,MBP deE. coli(proteína de unión a maltosa). Un marcador adecuado paraE. colies la ampicilina. Alternativamente, el operón proBA de la cepa K12 deE. coli,incluyendo sus elementos reguladores de la transcripción originales, puede usarse para facilitar la selección sin antibióticos.

[0132] En otro ejemplo, si se usa una levadura como célula huésped, pueden usarse las siguientes regiones reguladoras. Un promotor adecuado para ser utilizado en levadura puede ser un promotor constitutivo. Los ejemplos de promotores constitutivos adecuados incluyen: un promotor glicolítico seleccionado de FBA1, TPI1, PGK1, PYK1, TDH3, ENO2, HXK2, PGI1, PFK1, PFK2, GPM1 o un promotor no glicolítico del gen TEF2. Un promotor adecuado para ser utilizado en levadura puede ser inducible. Si la levadura es unaPichia,se prefiere el promotor inducible por metanol AOX1. Del contrario, el promotor GAL1 (inducible por galactosa) puede usarse cuando la levadura es S.cerevisiae.Los genes mencionados a partir de los cuales se podría derivar un promotor para una levadura como célula huésped también se podrían usar para derivar un terminador para la misma levadura. Un péptido señal preferido para la excreción paraPichia(ySaccharomyces)incluye: el péptido señal de pre-pro-secreción del factor de acoplamiento alfa de S.cerevisiae,el péptido señal de Ost1 de S.cerevisiae,el péptido señal Aga2 y sus fusiones.

[0133] En otro ejemplo, si se usa un hongo filamentoso como célula huésped, pueden usarse las siguientes regiones reguladoras. Se pueden utilizar los siguientes promotores:Aspergillus nigerpromotor de glucoamilasa(glaA),el promotor de alcohol deshidrogenasaAspergillus nidulans (alcA)o el promotor de taka-amilasa AAspergillus oryzae (amyB),el promotor de alcohol deshidrogenasaAspergillus niger (acfM),el promotor de piruvato quinasaTrichoderma reesei (pki)o el promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasaAspergillus nidulas (gpdA).Los genes mencionados a partir de los cuales se podría derivar un promotor para un hongo filamentoso como célula huésped también se podrían usar para derivar un terminador para el mismo hongo filamentoso. Un péptido señal preferido para la excreción para un hongo filamentoso, preferiblemente unAspergillusincluye el péptido señal de glucoamilasaAspergillus niger (glaA),el péptido señal deAspergillus nigera-galactosidasa (AgB) y la celobiohidrolasa ITrichoderma reesei (Cbhl).Un promotor y terminador preferidos paraAspergillus(más preferiblemente paraAspergillus niger)son el promotor de glucoamilasa y el terminador de glucoamilasa deAspergillus niger.

[0134] Las construcciones génicas descritas en el presente documento pueden colocarse en vectores de expresión. Por tanto, en otro aspecto se proporciona un vector de expresión que comprende una construcción génica como se describe en cualquiera de las formas de realización anteriores.

[0135] La expresión puede evaluarse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, la expresión puede evaluarse midiendo los niveles de expresión transgénica en el tejido transducido en el nivel del ARNm o la proteína mediante ensayos convencionales conocidos por un experto en la materia, tales como qPCR, secuenciación de ARN, análisis Northern blot, análisis Western blot, análisis de espectrometría de masas de péptidos derivados de proteína o ELISA. La expresión puede evaluarse en cualquier momento después de la administración de la construcción génica, el vector de expresión o la composición tal como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización en el presente documento, la expresión puede evaluarse después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 14 semanas, 16 semanas, 18 semanas, 20 semanas, 22 semanas, 24 semanas, 28 semanas, 32 semanas, 36 semanas, 40 semanas o más.

[0136] Los métodos de cultivo celular adecuados para su uso en el proceso de producción de proteína recombinante son conocidos por el experto, por ejemplo, en van't Riet, K. y Tramper, J., 1a edición, Basic Bioreactor Design, CRC Press, NY, 1991. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, la fermentación sumergida en medios líquidos, la fermentación superficial en medios líquidos y las fermentaciones en estado sólido. El cultivo celular puede realizarse, por ejemplo, mediante cultivo en placas de microtitulación, matraces de agitación, biorreactores de sobremesa a pequeña escala, biorreactores a escala media y/o biorreactores a gran escala en un laboratorio y/o un entorno industrial. Los modos de cultivo celular adecuados incluyen, pero no se limitan a, la fermentación continua, discontinua y/o discontinua alimentada, así como sus combinaciones. El cultivo celular puede realizarse usando fermentación continua, fermentación discontinua, preferiblemente fermentación discontinua alimentada.

[0137] En el contexto de la invención, "medio de cultivo", en lo sucesivo en el presente documento alternativamente denominado "medio de crecimiento", puede interpretarse que abarca casos donde las células cultivadas están ausentes, así como casos donde las células cultivadas están presentes en el medio de cultivo. "Caldo de cultivo" se refiere al medio de cultivo donde están presentes las células cultivadas. "Sobrenadante de cultivo" se refiere al medio de cultivo donde las células cultivadas están ausentes. "Extracto libre de células" se refiere a un lisado celular que no comprende los restos celulares. El cultivo celular como parte del procedimiento de la invención se puede realizar en condiciones que conduzcan a la producción de las mioglobinas introducidas, que son conocidas por el experto. Tales condiciones dependen no solo de la composición química del medio de cultivo sino también de otros parámetros del proceso incluyendo la duración del cultivo, la temperatura, los niveles de O2 en el caldo de cultivo y/o espacio de cabeza, los niveles de CO2 en el caldo de cultivo y/o espacio de cabeza, el pH, la fuerza iónica, la velocidad de agitación, la presión hidrostática y similares. El cultivo celular puede tener lugar usando un medio de cultivo que comprenda nutrientes adecuados, tales como fuentes de carbono y nitrógeno y compuestos adicionales tales como sales inorgánicas y vitaminas, usando procedimientos conocidos en la técnica(véase,por ejemplo, Bennett, W. y Lasure, L., 1a edición, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Los medios de crecimiento adecuados están disponibles en proveedores comerciales o pueden prepararse usando composiciones publicadas que son adecuadas para los respectivos huéspedes (por ejemplo, en catálogos de la Colección Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) o de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC).

[0138] La composición exacta del medio de crecimiento y los valores de los parámetros del proceso de cultivo no son características críticas de la invención. Puede contemplarse cualquier composición de medio de crecimiento, siempre que permita el crecimiento de la célula huésped y la producción de las mioglobinas introducidas. El medio de crecimiento normalmente comprenderá una fuente de carbono que se utilizará para el crecimiento de la célula cultivada. El experto en la materia entiende que las fuentes de carbono adecuadas pueden añadirse externamente al medio de crecimiento o pueden estar ya presentes en dicho medio. Las fuentes de carbono pueden estar presentes o añadirse individualmente o en mezclas de múltiples fuentes de carbono. Los ejemplos de fuentes de carbono adecuadas conocidas en la técnica incluyen azúcares simples tales como glucosa, glicerol, maltosa, sacarosa, xilosa, arabinosa, azúcares complejos tales como maltodextrinas, almidón hidrolizado, almidón, melazas y materias primas de segunda generación. Las materias primas de segunda generación pueden ser particularmente atractivas debido a su menor huella de carbono. Las materias primas de segunda generación normalmente comprenderán material lignocelulósico. Dicho material incluye cualquier material basado en lignocelulosa y/o hemicelulosa. Dicho material puede proceder de corrientes de residuos agrícolas, industriales o municipales, preferiblemente agrícolas. Los ejemplos de materiales adecuados incluyen biomasa (agrícola), materia orgánica comercial, residuos sólidos municipales, biomasa virgen tal como papel residual y residuos de jardín, o biomasa no virgen. Las formas generales de biomasa incluyen árboles, arbustos y pastos, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, pasto varilla, hierba de pampa japonesa, maíz, rastrojo de maíz, mazorca de maíz, tallo de canola, tallo de soja, maíz dulce, granos de maíz, productos y subproductos de la molienda de cereales (incluyendo la molienda húmeda y la molienda seca), tales como maíz, trigo y cebada, a menudo denominados "salvado o fibra", y sólidos municipales. La biomasa también puede consistir en materiales herbáceos, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel residual y residuos de fábricas de pasta y papel. La biomasa agrícola incluye ramas, arbustos, estopas, maíz y paja de maíz, cultivos energéticos, bosques, frutas, flores, cereales, pastos, cultivos herbáceos, hojas, corteza, agujas, troncos, raíces, árboles jóvenes, cultivos leñosos rotatorios a corto plazo, arbustos, hierbas, árboles, verduras, frutas, vides, pulpa de remolacha azucarera, harinillas de trigo, cáscaras de avena y madera dura y blanda (sin incluir la madera tóxica), y materiales de desecho orgánicos que resultan de procesos agrícolas que incluyen actividades agrícolas y forestales, particularmente desechos de madera forestal. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de los anteriores por separado, o cualquier combinación o mezcla de los mismos. También se pueden contemplar fuentes de carbono tales como ácidos orgánicos, aldehídos, cetonas, ésteres y alcoholes. El uso de medios de crecimiento que comprenden combinaciones de múltiples fuentes de carbono diferentes también puede contemplarse en el proceso de la invención. Tales medios podrían, como un ejemplo no limitativo, combinar fuentes de carbono más oxidadas tales como ácidos orgánicos con fuentes de carbono más reducidas tales como alcoholes. Los ejemplos de fuentes de nitrógeno adecuadas conocidas en la técnica incluyen harina de soja, licor de maceración de maíz, extracto de levadura, proteína de suero, proteína de huevo, hidrolizado de caseína, urea, amoniaco, sales de amonio y sales de nitrato. Los ejemplos de compuestos adecuados adicionales conocidos en la técnica incluyen fosfato, sulfato, metales tales como magnesio, oligoelementos y vitaminas. Los requisitos exactos del medio de crecimiento variarán en base a la célula huésped, por ejemplo, entre levaduras, bacterias y hongos filamentosos, siendo dichos requisitos conocidos por el experto. Por consiguiente, el medio de crecimiento puede ser un medio completo (rico) o un medio mínimo, es decir, un medio que comprenda solo los componentes absolutamente necesarios para el crecimiento dependiendo de la célula huésped cultivada.

[0139] De manera similar a la composición del medio de crecimiento, a los parámetros del proceso se les puede asignar cualquier valor, siempre que permitan el crecimiento de la célula huésped y la producción de las mioglobinas introducidas. Normalmente, dichos valores diferirán en base a la célula huésped que se está cultivando y serán conocidos por el experto. Preferiblemente, el proceso según la invención es un proceso aeróbico o de oxígeno limitado, lo que significa que el cultivo celular se realiza en condiciones aeróbicas o de oxígeno limitado, más preferiblemente el proceso es de oxígeno limitado. Las condiciones de oxígeno limitado, también conocidas como condiciones microaeróbicas, son condiciones de cultivo en las que el consumo de oxígeno está limitado por la disponibilidad de oxígeno. El grado de limitación de oxígeno se determina por la cantidad y composición del flujo de gas entrante así como las propiedades de mezcla/transferencia de masa reales del equipo de fermentación usado. Preferiblemente, en condiciones de oxígeno limitado en un cultivo líquido, la velocidad de consumo de oxígeno es de al menos alrededor de 5,5 mmol/l/h, más preferiblemente de al menos alrededor de 6 mmol/l/h e incluso más preferiblemente de al menos alrededor de 7 mmol/l/h. Las condiciones aeróbicas son condiciones de cultivo en las que el consumo de oxígeno no está limitado por la disponibilidad de oxígeno.

[0140] El cultivo celular puede realizarse a un valor de temperatura que sea óptimo para la célula, normalmente en un intervalo de temperatura de 16-42 °C. En algunas formas de realización, la temperatura varía entre 20-40 °C, más preferiblemente entre 25-38 °C, de la manera más preferible entre 28-36 °C. En algunas formas de realización más preferidas, se usa un valor de temperatura de alrededor de 30 o 36 °C.

[0141] El cultivo celular puede realizarse a un valor de pH que sea óptimo para la célula. En algunas formas de realización, el valor de pH del cultivo es de aproximadamente pH 2,5, aproximadamente pH 3,0, aproximadamente pH 3,5, aproximadamente pH 4,0, aproximadamente pH 4,5, aproximadamente pH 5, aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 6, aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, aproximadamente pH 8,5 o aproximadamente pH 9. En formas de realización preferidas, el pH oscila de aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente pH 9, más preferiblemente de aproximadamente pH 3,5 a pH 7. En algunas formas de realización más preferidas, se usa un valor de pH de aproximadamente 6.

[0142] El cultivo celular puede realizarse a un valor de fuerza iónica del medio de cultivo que sea óptimo para la célula, normalmente en un intervalo entre 50 mM - 2 M. En algunas formas de realización, la fuerza iónica del medio de cultivo varía entre 75 mM - 1 M, más preferiblemente entre 100 mM - 750 mM. En algunas formas de realización más preferidas, se usa un valor de fuerza iónica de aproximadamente 100 mM.

Resumen del listado de secuencias

[0143]

Secuencias detalladas

[0144]

- SEQ ID NO: 1 Mioglobina de rata

MGLSDGEWQMVLNIWGKVEGDLAGHGQEVLISLFKAHPETLEKFDKFKNLKSEEEMKSSED

LKKHGCTVLTALGTILKKKGQHAAEIQPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEVIIQVLKKRYSGDFGA

DAQGAMSKALELFRNDIAAKYKELGFQG

- SEQ ID NO: 2 Mioglobina de conejo

MGLSDAEWQLVLNVWGKVEADLAGHGQEVLIRLFHTHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASED

LKKHGNTVLTALGAILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIHVLHSKHPGDFGA

DAQAAMSKALELFRNDIAAQYKELGFQG

- SEQ ID NO: 3 mioglobina de ratón

MGLSDGEWQLVLNVWGKVEADLAGHGQEVLIGLFKTHPETLDKFDKFKNLKSEEDMKGSED

LKKHGCTVLTALGTILKKKGQHAAEIQPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEIIIEVLKKRHSGDFGAD

AQGAMSKALELFRNDIAAKYKELGFQG

- SEQ ID NO: 4 Mioglobina de mamut de la estepa

MGLSDGEWELVLKTWGKVEADIPGHGLEVFVRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEGEMKASED

LKKQGVTVLTALGGILKKKGHHQAEIQPLAHSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLQSKHPAEFGA

DAQGAMKKALELFRNDIAAKYKELGFQG

- SEQ ID NO: 5 Mioglobina de mamut lanudo

MGLSDGEWELVLKTWGKVEADIPGHGLEVFVRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEGEMKASED

LKKQGVTVLTALGGILKKKGHHQAEIQPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLQSKHPAEFGA

DAQGAMKKALELFRNDIAAKYKELGFQG

- SEQ ID NO: 6 Mioglobina de atún

MADFDAVLKCWGPVEADYTTMGGLVLTRLFKEHPETQKLFPKFAGIAQADIAGNAAISAHGA

TVLKKLGELLKAKGSHAAILKPLANSHATKHKIPINNFKLISEVLVKVMHEKAGLDAGQQTALR

NVMGIIIADLEANYKELGFSG

- SEQ ID NO: 7 Ácido nucleico de mioglobina de rata

ATGGGCCTGAGCGATGGCGAATGGCAGATGGTGCTGAACATTTGGGGCAAAGTGGAAG

GCGATCTGGCGGGCCATGGCCAGGAAGTGCTGATTAGCCTGTTTAAAGCGCATCCGGA

AACCCTGGAAAAATTT G ATAAATTT AAAAACCT GAAAAGCG AAG AAG AAAT G AAAAGCAG

CGAAGATCTGAAAAAACATGGCTGCACCGTGCTGACCGCGCTGGGCACCATTCTGAAAA

AAAAAGGCCAGCATGCGGCGGAAATTCAGCCGCTGGCGCAGAGCCATGCGACCAAACA

TAAAATTCCGGTGAAATATCTGGAATTTATTAGCGAAGTGATTATTCAGGTGCTGAAAAAA

CGCTATAGCGGCGATTTTGGCGCGGATGCGCAGGGCGCGATGAGCAAAGCGCTGGAAC

TGTTTCGCAACGATATTGCGGCGAAATATAAAGAACTGGGCTTTCAGGGC

- SEQ ID NO: 8 Ácido nucleico de mioglobina de conejo

ATGGGCCTGAGCGATGCGGAATGGCAGCTGGTGCTGAACGTGTGGGGCAAAGTGGAAG

CGGATCTGGCGGGCCATGGCCAGGAAGTGCTGATTCGCCTGTTTCATACCCATCCGGAA

ACCCT GGAAAAATTT GATAAATTTAAACATCT GAAAAGCGAAGAT GAAATGAAAGCGAGC

GAAGATCTGAAAAAACATGGCAACACCGTGCTGACCGCGCTGGGCGCGATTCTGAAAAA

AAAAGGCCATCATGAAGCGGAAATTAAACCGCTGGCGCAGAGCCATGCGACCAAACATA

AAATTCCGGTGAAATATCTGGAATTTATTAGCGAAGCGATTATTCATGTGCTGCATAGCAA

ACATCCGGGCGATTTTGGCGCGGATGCGCAGGCGGCGATGAGCAAAGCGCTGGAACTG

TTTCGCAACGATATTGCGGCGCAGTATAAAGAACTGGGCTTTCAGGGC

- SEQ ID NO: 9 Ácido nucleico de mioglobina de ratón

ATGGGCCTGAGCGATGGCGAATGGCAGCTGGTGCTGAACGTGTGGGGCAAAGTGGAAG

CGGATCTGGCGGGCCATGGCCAGGAAGTGCTGATTGGCCTGTTTAAAACCCATCCGGA

AACCCTGGATAAATTTGATAAATTTAAAAACCTGAAAAGCGAAGAAGATATGAAAGGCAG

CGAAGATCTGAAAAAACATGGCTGCACCGTGCTGACCGCGCTGGGCACCATTCTGAAAA

AAAAAGGCCAGCATGCGGCGGAAATTCAGCCGCTGGCGCAGAGCCATGCGACCAAACA

TAAAATTCCGGTGAAATATCTGGAATTTATTAGCGAAATTATTATTGAAGTGCTGAAAAAA

CGCCATAGCGGCGATTTTGGCGCGGATGCGCAGGGCGCGATGAGCAAAGCGCTGGAA

CTGTTTCGCAACGATATTGCGGCGAAATATAAAGAACTGGGCTTTCAGGGC

- SEQ ID NO: 10 Ácido nucleico de mioglobina de mamut de la estepa

ATGGGACTCAGCGACGGGGAATGGGAGTTGGTGTTGAAAACCTGGGGGAAAGTGGAGG CTGACATCCCGGGCCATGGGCTGGAAGTCTTCGTCAGGCTCTTCACAGGTCATCCCGAG ACCCTGGAGAAGTTCGACAAGTTTAAGCACCTGAAGACAGAGGGCGAGATGAAGGCCTC CGAGGACCTGAAGAAGCAAGGTGTTACTGTGCTCACTGCCCTGGGGGGCATCCTCAAG AAGAAAGGGCATCACCAGGCGGAGATTCAGCCCCTGGCCCATTCTCATGCCACCAAGCA CAAGATCCCCATCAAGTATCTGGAGTTCATCTCGGACGCCATCATCCACGTTCTGCAAAG CAAGCATCCTGCGGAATTTGGCGCTGATGCCCAGGGAGCCATGAAAAAGGCCTTGGAG CTGTTCCGGAATGACATTGCGGCCAAGTATAAGGAGCTGGGGTTCCAGGGCTAG

- SEQ ID NO: 11 Ácido nucleico de mioglobina de mamut lanudo ATGGGACTCAGCGACGGGGAATGGGAGTTGGTGTTGAAAACCTGGGGGAAAGTGGAGG CTGACATCCCGGGCCATGGGCTGGAAGTCTTCGTCAGGCTCTTCACAGGTCATCCCGAG ACCCTGGAGAAGTTCGACAAGTTTAAGCACCTGAAGACAGAGGGCGAGATGAAGGCCTC CGAGGACCTGAAGAAGCAAGGTGTTACTGTGCTCACTGCCCTGGGGGGCATCCTCAAG AAGAAAGGGCATCACCAGGCGGAGATTCAGCCCCTGGCCCAGTCTCATGCCACCAAGC ACAAGATCCCCATCAAGTATCTGGAGTTCATCTCGGACGCCATCATCCACGTTCTGCAAA GCAAGCATCCTGCGGAATTTGGCGCTGATGCCCAGGGAGCCATGAAAAAGGCCTTGGA GCTGTTCCGGAATGACATTGCGGCCAAGTATAAGGAGCTGGGGTTCCAGGGCTAG

- SEQ ID NO: 12 Ácido nucleico de mioglobina de atún ATGGCTGACTTTGATGCAGTTCTGAAGTGTTGGGGTCCAGTGGAGGCGGACTACACCAC CATT GG AGGCCTGGTT CT G ACCCGTTT ATTCAAAGAGC ACCCT G AG ACCCAGAAGCT GT TCCCCAAATTCGCTGGCATCGCCCAGGCTGACATAGCCGGTAACGCAGCTGTTTCTGCT CATGGTGCCACTGTGCTGAAGAAACTTGGAGAGCTGCTGAAGGCCAAAGGCAGTCACG CTGCCATCCTAAAACCACTGGCAAACAGCCATGCCACTAAGCACAAGATTCCCATTAATA ACTTCAAGCTGATTTCTGAGGTCCTTGTGAAGGTCATGCATGAGAAGGCAGGACTCGAT GCCGGTGGGCAGACAGCCCTGAGGAACGTGATGGGTATCATCATCGCCGACCTTGAGG CCAACTACAAAGAGCTGGGCTTCTCTGGCTGA

- SEQ ID NO: 13 K-caseína de mamut lanudo MKGFLLVVNILLLPLFLAAEVQNQEESRCLEKDERWFCQKAVKYIPNDYVLKSYYRYEPNYN QFRAAVPINNPYLIYLYPAKQVAVRPHTQIQWQVPSNIYPSPSVPHTYLKPPFIIPPKKTQDKPI IPPTGTVASIEATVEPKVNTVVNAEASSEFIATNTPEATTVPVISPQI

- SEQ ID NO: 14 p-caseína de mamut lanudo MKVFILACLVAFALGRETVENLSSSEIRQFYSEQKPEGVKHEEQQREDEHQNKIQPLFQPQP LVYPFAEPIPYTVFPPNAIPLAQPIVVLPFPQPEVQLPEAKEITFPRQKLMSFLKSPVMPFFDP QPNLGTDLENLHLPLPLLQPLRHQLHQPLAQTPVLPLPLSLPKVLPVPQQVIPYPQRGRPIQN LLYEEPLLDPTRKIYPVAQPLAPVYNPVAYMIGIPCCSTLLTYLHQSSRSQYPIQNKLGYLIAM PKKVRPTEJEMPLOS

[0145] A modo de ejemplo y no de limitación, los siguientes ejemplos no limitativos son ilustrativos de varias formas de realización proporcionadas por la presente divulgación.

Ejemplo 1 Producción de un alimento para perros que comprende mioglobina de conejo aislada

[0146] Producción de mioglobina de conejo purificada porEscherichia coli.

[0147] El gen de mioglobina de conejo de longitud completa SEQ ID NO: 2 se sintetiza y clona en un vector pET-23a(+) modificado, que comprende el promotor y terminador T7 y una etiqueta hexa His C-terminal (Genscript Biotech, Leiden, Países Bajos). El gen marcadorampRoriginalmente presente en dicho vector es reemplazado por el gen marcadorproBAoperón de la cepa K12 deE. coli,incluyendo sus elementos reguladores de la transcripción originales, para facilitar la selección sin antibióticos. Los plásmidos ensamblados correctamente se confirman por PCR y se usan para transformar una cepa de producción de proteína auxótrofa de prolinaE. coli (E. coliK12AproBA).Las cepas transformadas se incuban durante la noche en matraces de agitación que contienen un medio mínimo (10,5 g/l de K<2>HPO<4>, 4,5 g/l de KH<2>PO<4>, 1,0 g/l (NH<4>)<2>SO<4>, 0,12 g/l de mgSO<4>, 0,5 g/l de Nacitrato, 2 g/l de glucosa y 5,0 mg/l de tiamina.HClat 37 °C y 150 rpm (pH 6). Se transfieren 500 |_il del cultivo de toda la noche a un matraz de agitación de 1 L que contiene 500 ml de medio mínimo y se incuba a 37 °C y 150 rpm, hasta que se alcanza una DO600 de 0,4-1. Se añade IPTG (isopropil-p-D-tiogalactósido) a una concentración de 100 pM al cultivo, tras lo cual el cultivo se incuba durante 24 h a 16 °C y 150 rpm. El cultivo se recoge y se centrifuga a 3500 x g (4 °C) durante 15 minutos. El sobrenadante se desecha y el sedimento se disuelve en 50 ml de reactivo de extracción de proteínas BugBuster (Novagen), que contiene 1 KU/ml de lisozima (Sigma-Aldrich), 25 U de Benzonase<®>Nucleasa y cOmplete™, cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA (Roche). El sedimento disuelto se incuba durante 30 min a 4 °C en un agitador. Se repite el paso de centrifugación y se recoge el extracto libre de células (sobrenadante) y se analiza mediante SDS-PAGE para confirmar la producción de mioglobinas. La producción de mioglobinas de conejo por las respectivas cepas transformadas se confirma por la presencia de bandas de proteína del tamaño correcto.

[0148] Para la purificación, los extractos libres de células que contienen la fracción soluble de proteínas se cargan en una columna HisTrap FF 1 ml (Cytiva, MA, EE.UU.), acoplada con un sistema de inicio AKTA. La columna se equilibra con HEPES 20 mM, NaCl 0,4 M e imidazol 20 mM, pH 7,5, a un caudal de 1 ml/min. La proteína se eluye con HEPES 20 mM, NaCl 0,4 M e imidazol 400 mM, pH 7,5. Las fracciones que contienen las mioglobinas de conejo se agrupan, se concentran y se confirman mediante SDS-PAGE y Western Blot usando un anticuerpo anti-etiqueta de histidina (Bio-Rad), que confirma la purificación exitosa de todas las mioglobinas. Las mioglobinas de conejo purificadas se almacenan a -20 °C para su uso posterior.

Producción de alimentos para animales domésticos

[0149] Se prepararon 100 kg de producto de control de alimento seco para perros con ingredientes en las proporciones mostradas en la tabla 1. Los ingredientes para el basal seco se pesaron y colocaron en un mezclador. Estos se mezclaron y molieron con un molino de martillos y se transportaron a un contenedor de retención.

[0150] La mezcla basal seca se introdujo en una extrusora a 250 kg/h y el aceite de pescado a 2,4 kg/h. Se añadió agua (10 l/h) y vapor (27 l/h) a la mezcla de ingredientes en el barril de la extrusora. La velocidad del tornillo de la extrusora fue de 900 rpm y las condiciones de la masa fundida se mantuvieron a 20 bares y al menos 104 °C. A medida que las cuerdas de masa expandida salieron de los troqueles de la extrusora, se cortaron en trozos de pienso usando cuchillas que giraban a 900 rpm a través de la cara de los troqueles. El pienso se introdujo en un secador y se secó a 125 °C durante 21 minuto hasta un contenido de humedad del 9,2 %. El pienso recubierto se volteó durante 5 minutos más después de pulverizar todos los líquidos.

[0151] Se toman muestras de una pequeña cantidad de pienso para determinar la estabilidad del color, el análisis aromático y nutricional. A continuación, el pienso recubierto se introdujo en bolsas de polietileno y se selló.

Ejemplo 2 Producción de comida casera para gatos que comprende mioglobina de rata aislada

[0152] Se preparó 1 kg de producto alimenticio casero para gatos con ingredientes en las proporciones mostradas en la tabla 2. Los ingredientes se pesaron y se colocaron en una batidora. Estos se mezclaron con una batidora. Después de batir la mezcla, se añade mioglobina aislada a la mezcla y se mezcla durante otros 2 minutos. La mioglobina aislada en forma de potencia se mide con una balanza doméstica. Alternativamente, si la mioglobina aislada tiene forma de cubo, cada cubo es de 10 g, entonces se añaden 5 cubos a la mezcla, seguido de 2 minutos adicionales de mezcla. La mezcla se coloca entonces en un molde, y se cuece durante 30 min a 180 °C en un horno. La mezcla también puede procesarse adicionalmente en un secador hasta un contenido de humedad de aproximadamente el 10 %.

T l 2. r r mi r

[0153] Es posible modificar los ingredientes, y se pueden añadir tipos alternativos de ingredientes. La verdura puede incluir espinaca, lechuga, col rizada, lentejas, guisantes, garbanzos o judías. Los cereales pueden incluir arroz, maíz, cebada, avena o trigo. Los tubérculos pueden incluir patatas o boniatos. Los brotes pueden incluir soja, lentejas, centeno o sésamo. Las flores pueden incluir alcachofas, brócoli o coliflor. Los tallos pueden incluir apio o espárragos. Las semillas pueden incluir calabaza o girasol.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para preparar un alimento para animales domésticos, donde el método comprende añadir una mioglobina aislada, donde la mioglobina aislada es una mioglobina de rata, una mioglobina de conejo, una mioglobina de ratón, una mioglobina de mamut o una mioglobina de atún.

2. Método según la reivindicación 1, donde la mioglobina aislada no está comprendida en una célula o un tejido antes de la adición.

3. Método para preparar un alimento para animales domésticos según la reivindicación 1 o 2, donde la mioglobina aislada se añade como parte de una composición, donde la fracción en peso de la mioglobina aislada en la fracción proteica comprendida en la composición es al menos del 75 %.

4. Método para preparar un alimento para animales domésticos según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la concentración en peso de hemoproteínas en el alimento para animales domésticos es de al menos el 1 %, y donde la fracción en peso de mioglobina en las hemoproteínas es de al menos el 50 %.

5. Método para preparar un alimento para animales domésticos según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el animal doméstico es carnívoro.

6. Método para preparar un alimento para animales domésticos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el animal doméstico es un perro o un gato.

7. Método para preparar un alimento para animales domésticos según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el alimento para animales domésticos es un alimento para animales domésticos seco, un alimento para animales domésticos semihúmedo, un alimento para animales domésticos húmedo, o cualquier combinación de estos tipos de alimentos para animales domésticos.

8. Método para preparar un alimento para animales domésticos según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el alimento para animales domésticos es un sustituto de la carne.

9. Método para preparar un alimento para animales domésticos según la reivindicación 8, donde el sustituto de la carne es un sustituto de la carne a base de células, un sustituto de carne cultivado o un sustituto de la carne a base de plantas.

10. Método para preparar un alimento para animales domésticos según la reivindicación 8 o 9, donde el sustituto de la carne imita el aspecto, forma, estructura, composición, palatabilidad, sabor, textura, color, aroma, apariencia y/o valor nutricional de la carne.

11. Método para preparar un alimento para animales domésticos según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la mioglobina aislada es una mioglobina recombinante obtenida de fermentación por un microorganismo que ha sido modificado genéticamente para expresar la mioglobina recombinante.

12. Método para preparar un alimento para animales domésticos según la reivindicación 10, donde el microorganismo es una bacteria, una levadura, un hongo filamentoso o una línea celular de mamífero cultivada, preferiblementeEscherichia colioSaccharomyces cerevisiae.

13. Método para preparar un alimento para animales domésticos según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la mioglobina aislada está representada por una de las siguientes secuencias de aminoácidos:

a) una secuencia con al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y con al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos:

- M en la posición 10, y/o

- A en la posición 36, y/o

- S en la posición 58, y/o

- M en la posición 10 y A en la posición 36, y/o

- M en la posición 10 y S en la posición 58, y/o

- A en la posición 36 y S en la posición 58, y/o

- M en la posición 10 y A en la posición 36 y S en la posición 58;

b) una secuencia con al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y con un aminoácido A en la posición 6;

c) una secuencia con al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3, y con al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos:

- D en la posición 55, y/o

- I en la posición 111, y/o

- E en la posición 114, y/o

- D en la posición 55 e I en la posición 111, y/o

- D en la posición 55 y E en la posición 114, y/o

- I en la posición 111 y E en la posición 114, y/o

- D en la posición 55 e I en la posición 111 y E en la posición 114;

d) una secuencia con al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 4 o 5, y con F en la posición 30 y/o Q en la posición 65;

e) una secuencia con al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 6, y con H en la posición 65 y/o la posición 94;

f) una secuencia con al menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 1, 2 o 3, y con al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos;

- L en la posición 22, y/o

- A o T en la posición 36, y/o

- G en la posición 122;

- L en la posición 22 y A o T en la posición 36, y/o

- L en la posición 22 y G en la posición 122; y/o

- A o T en la posición 36 y G en la posición 122, y/o

- L en la posición 22 y A o T en la posición 36 y G en la posición 122;

g) una secuencia con al menos un 90 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 5, y con I en la posición 87,

- N en la posición 49, y/o

- E en la posición 54, y/o

- C en la posición 67, y/o

- T en la posición 75, y/o

- Q en la posición 82, y/o

- K en la posición 117, y/o

- K en la posición 118, y/o

- S en la posición 121,

i) teniendo al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 4, y teniendo al menos una de las siguientes combinaciones de aminoácidos;

- H en la posición 92, y/o

- H en la posición 92 y F en la posición 30, y/o

- H en la posición 92 y Q en la posición 65, y/o;

- H en la posición 92 y F en la posición 30 y Q en la posición 65.

14. Método para preparar un alimento para animales domésticos según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la mioglobina aislada está representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 6, preferiblemente por las SEQ ID NO: 1 o 2.