CN112760300B - 一种黄曲霉毒素降解酶突变体及其生产菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一种黄曲霉毒素降解酶突变体及其高产菌株。所述突变体的比酶活得到显著提高，有利于降低该酶的生产成本，促进其在饲料领域中的推广和应用。

Description

一种黄曲霉毒素降解酶突变体及其生产菌株
技术领域
本发明属于基因工程和微生物改造技术领域，具体内容涉及一种黄曲霉毒素降解酶突变体及其生产菌株。
背景技术
霉菌毒素（mycotoxin）是霉菌在生长过程中产生的有毒次级代谢产物，主要包括黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）、单端孢霉烯族毒素（trichothecenes，如T-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇NEO和呕吐毒素 DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OTA）及烟曲霉毒素（fumonisins）等。谷物等原料在田间就会被霉菌污染，在运输、加工、储存过程中如果环境温度、湿度适合，霉菌会继续生长，毒素含量也会相继增加。据联合国粮农组织（FAO）估计，全世界每年有25%的谷物受到霉菌毒素的污染，平均有2%不能食用；加之因毒素污染导致动物中毒引起的疾病和死亡，给粮食工业和畜牧业造成巨大的经济损失。
在霉菌毒素中黄曲霉毒素是毒性最大的一种，具有抑制免疫、诱导突变和致癌的作用。黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等多种真菌产生的次级代谢产物，其包含多种衍生物，目前已分离鉴定出黄曲霉毒素B1（AFB1），黄曲霉毒素B2（AFB2），黄曲霉毒素G1(AFG1)，黄曲霉毒素G2(AFG2)，黄曲霉毒素M1(AFM1)，黄曲霉毒素M2(AFM2)，黄曲霉毒素P1(AFP1)，黄曲霉毒素Q1(AFQ1)，黄曲霉毒素H1(AFH1)，黄曲霉毒素GM(AFGM)，黄曲霉毒素B2a(AFB2a)和毒醇等。
随着对黄曲霉毒素危害的认识，人们迫切的希望能有效消除其产生的不良影响。目前，物理法、化学法和生物法是消除黄曲霉毒素污染的主要方法。去除黄曲霉毒素的物理法主要有：吸附、加热、辐射、萃取。化学法去除黄曲霉毒素毒性的主要原理是利用化学试剂破坏其毒性结构，已有报道的化学法有碱性电解液、臭氧、电解氯化钠、柠檬酸等。生物法降解黄曲霉毒素主要是指微生物产生的代谢产物破坏了黄曲霉毒素的毒性结构，并且产生的降解产物是低毒或无毒的。而这样生物降解一般被认为是酶的作用。有这种作用功能的微生物主要有两类：真菌和细菌。
例如，Doyle等发现寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)能够产生乳过氧化物酶降解黄曲霉毒素。Shantha等从茎点霉(Phoma sp.)中提取到一种热稳定性较高的酶，该酶能够降解99%的AFB1。Zjatic等研究了白腐菌(Trametes versicolor)生物降解黄曲霉毒素。刘大岭等从假密环菌(Armillariella tabescens)中提取到一种生物活性物质可降解样品中80%的黄曲霉毒素B1，该活性物质后被证明是一种胞内酶。Teniola等筛选到了4株具有降解AFB1作用的菌，并且证明了导致黄曲霉毒素降解的原因是酶的作用。孙凤芹等从花生土壤和花生粕中筛选到巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其发酵上清液可降解样本中78.55 %的黄曲霉毒素。
综合以上各方法，由于物理法和化学法对产品的品质和营养成分有不同程度的破坏，且易产生副产物和处理剂残留，对人和动物产生危害。相比较于物理法和化学法，生物法主要利用微生物代谢产酶降解黄曲霉毒素。而酶法具有处理条件温和、产品品质高、特异性强等优点。因此酶法降解黄曲霉毒素是目前研究的一个热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄曲霉毒素降解酶突变体及其高产菌株。所述突变体的比酶活得到显著提高，有利于降低该酶的生产成本，促进其在饲料领域中的推广和应用。
本发明涉及一种黄曲霉毒素降解酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：128，167，293。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：K128A，R167V，T293S。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：K128A，K128A/R167V，K128A/R167V/T293S。
所述突变体具有如SEQ ID NO:3或 SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
本发明还涉及编码上述黄曲霉毒素降解酶突变体的DNA分子。
所述的DNA分子具有如SEQ ID NO:4或 SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
本发明还涉及一种毕赤酵母（Pichia pastoris），包含上述重组表达载体。
将上述的质粒转入毕赤酵母中，重组表达的黄曲霉毒素降解酶突变体的比酶活水平得到显著提升。
在本发明的一些实施例中，所述毕赤酵母还包含乙酰辅酶A合成酶C2基因。
所述乙酰辅酶A合成酶C2基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：9。
将上述乙酰辅酶A合成酶C2基因转入毕赤酵母中，重组表达的黄曲霉毒素降解酶突变体的酶活水平得到显著提高。
所述毕赤酵母命名为毕赤酵母Huang1-B3-17（Pichia pastoris Huang1-B3-17），已于2020年12月2日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020819。
与野生型相比，本发明提供的黄曲霉毒素降解酶突变体HUANG1-B1、HUANG1-B2、HUANG1-B3在毕赤酵母中重组表达，比酶活分别提高了157.2%、168.3%、226.2%，取得了意料不到的技术效果。
此外，通过在毕赤酵母工程菌中胞内共表达乙酰辅酶A合成酶C2基因能显著提高其表达黄曲霉毒素降解酶突变体的酶活。改造后的毕赤酵母Huang1-B3-17发酵酶活最高达到983U/ml，比改造前提高了40%。所述毕赤酵母菌株可广泛应用于黄曲霉毒素降解酶的生产，有助于降低该酶的生产成本，从而促进其在饲料领域中的广泛应用。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、pPICZA、Amp、G418、Zeocin购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：DNA聚合酶购买自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司，黄曲霉毒素降解酶检测试剂盒RIDASCREENAflatoxin B1 30/15 R1211购自R-Biopharm公司。
培养基配方：
大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；
LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；
酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；
YPD+Zeocin培养基：YPD培养基加100μg/ml Zeocin；
酵母筛选培养基（MD培养基）：1.34% YNB，4×10-5生物素，1%甘油、2%琼脂糖；
BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5生物素，1%甘油；
BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5生物素，0.5%甲醇。
实施例1、黄曲霉毒素降解酶HUANG1的基因合成
将来源于假蜜环菌（Armillariella tabescens）的黄曲霉毒素降解酶基因，命名为HUANG1，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1。由华大基因公司进行全基因合成。
实施例2、黄曲霉毒素降解酶HUANG1突变体的筛选
为了进一步提高黄曲霉毒素降解酶HUANG1的比酶活，通过定向进化技术对该酶的基因进行了大量突变的筛选；以黄曲霉毒素降解酶HUANG1为模板，利用引物1(F)和引物1(R)用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增。
引物1(F)：GCGCGAATTCATGGCCACCACAACTGTCCACCGGG；
引物1(R)：TAAAGCGGCCGCTCACAATCGTCTCTCAATGAAACTT。
胶回收PCR产物，EcoRI、Not I进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养；待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150 ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃、220rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有黄曲霉毒素降解酶的大肠杆菌细胞裂解液。再离心去除菌体，将上清液分别进行黄曲霉毒素降解酶活力和蛋白含量测定，计算比酶活。
实验结果表明，有些突变对黄曲霉毒素降解酶HUANG1的比酶活没有影响，有些突变甚至使其比酶活变得更低了。最终，申请人筛选获得比酶活显著提高的突变位点及组合：K128A单点突变，K128A/R167V两点突变，K128A/R167V/T293S三点突变。
将含K128A单点突变的黄曲霉毒素降解酶突变体命名为HUANG1-B1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:4。
将含K128A和R167V两点突变的黄曲霉毒素降解酶突变体命名为HUANG1-B2，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:6。
将含K128A、R167V和T293S的三点突变的黄曲霉毒素降解酶突变体命名为HUANG1-B3，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:8。
以上核苷酸序列由华大基因公司合成。
用引物1(F)和引物1(R)对上述三个突变体进行PCR扩增，PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸2min30s，35个循环后，72℃保温10min。HUANG1-B1、HUANG1-B2、HUANG1-B3三个基因长度与HUANG1基因相同，全长2088bp。
实施例3、表达重组黄曲霉毒素降解酶的毕赤酵母工程菌的构建
1、重组质粒的构建
将克隆得到的野生型黄曲霉毒素降解酶基因HUANG1和三个突变体基因（HUANG1-B1、HUANG1-B2、HUANG1-B3）分别用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，100 μl酶切体系如下：黄曲霉毒素降解酶基因HUANG1（HUANG1-B1、HUANG1-B2、HUANG1-B3）的 PCR产物40μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10 μl、EcoR I 5 μl、Not I 5 μl、ddH2O 30 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
将表达载体pPIC9K先用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：表达载体pPIC9K 20 μl、10×H buffer 10 μl、EcoR I 5 μl、ddH2O 65 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶Not I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：pPIC9K回收片段20 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10 μl、10×Triton 10 μl、Not I 5 μl、ddH2O 45 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
将经EcoR I和Not I双酶切的HUANG1片段、HUANG1-B1片段、HUANG1-B2片段、HUANG1-B3片段分别与经同样酶切后的表达载体pPIC9K连接，构建重组表达质粒pPIC9K-HUANG1、pPIC9K-HUANG1-B1、pPIC9K-HUANG1-B2、pPIC9K-HUANG1-B3。连接体系如下：表达载体pPIC9K双酶切产物5 μl、HUANG1（HUANG1-B1、HUANG1-B2、HUANG1-B3）基因双酶切产物3 μl、10×T4 ligase buffer 1 μl、T4 ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB+Amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pPIC9K-HUANG1（pPIC9K-HUANG1-B1、pPIC9K-HUANG1-B2、pPIC9K-HUANG1-B3）。
、转化与筛选
将重组酵母表达质粒pPIC9K-HUANG1、pPIC9K-HUANG1-B1、pPIC9K-HUANG1-B2、pPIC9K-HUANG1-B3分别用Sal I进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素G418的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。
、摇瓶发酵验证
挑取单个多拷贝转化子分别接入BMGY培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液分别进行酶活力和蛋白含量测定，计算比酶活。
结果显示，在摇瓶条件下，重组表达野生型黄曲霉毒素降解酶基因HUANG1的转化子发酵酶活最高达到227U/ml，蛋白含量为0.51g/l，比酶活为445.1 U/mg。将该转化子命名为毕赤酵母HUANG1-55（Pichia pastoris HUANG1-55）；
重组表达黄曲霉毒素降解酶突变体基因HUANG1-B1的转化子发酵酶活最高达到561U/ml，蛋白含量为0.49g/l，比酶活为1144.9 U/mg。将该转化子命名为毕赤酵母HUANG1-B1-48（Pichia pastoris HUANG1-B1-48）；
重组表达黄曲霉毒素降解酶突变体基因HUANG1-B2的转化子发酵酶活最高达到633U/ml，蛋白含量为0.53g/l，比酶活为1194.3U/mg。将该转化子命名为毕赤酵母HUANG1-B2-112（Pichia pastoris HUANG1-B2-112）；
重组黄曲霉毒素降解酶突变体基因HUANG1-B3的转化子发酵酶活最高达到697U/ml，蛋白含量为0.48g/l，比酶活为1452.1U/mg。将该转化子命名为毕赤酵母HUANG1-B3-74（Pichia pastoris HUANG1-B3-74）。
从上述结果可以看出，与野生型相比，本发明提供的突变体基因HUANG1-B1、HUANG1-B2、HUANG1-B3在毕赤酵母中重组表达，比酶活分别提高了157.2%、168.3%、226.2%，取得了意料不到的技术效果。
（一）黄曲霉毒素降解酶酶活检测方法
1、酶活力单位定义
在pH 6.0，30℃条件下，每分钟降解1 pmol AFB1所需的酶量为一个酶活力单位（U/g或U/ml）。
2、样品处理方法
液体样品：离心取上清，直接用于后续测定。
3、酶反应实验步骤
表1 酶反应步骤
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注: 酶反应试验操作时，可先精密取缓冲液（0.02 M柠檬酸-0.04 M磷酸氢二钠，pH6.0）45ml与AFB1标准储备液（2ug/ml）2.5ml混匀（即为18:1），再精密量取1.9ml，以缩小检验偏差。
4、酶活计算方法
Figure DEST_PATH_IMAGE003
式中：
U为酶活，U/ml；
F为稀释倍数；
C对照：对照组AFB1浓度，ppb；
C试验：试验组AFB1浓度，ppb；
V：取样体积，ml。
（二）考马斯亮蓝法检测蛋白含量
1、试剂
（1）考马斯亮蓝G-250染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升，常温可使用1个月；
（2）标准蛋白溶液：用牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度，配制成1 mg/ml的蛋白质标准溶液；
（3）标准原液的配制：在分析天平上精确称取0.05g结晶牛血清蛋白，于小烧杯中，加入少量蒸馏水溶解后转入50ml容量瓶中，烧杯内残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。配制成标准原液，其中牛血清蛋白浓度为1000μg/ml。
2、标准曲线的绘制。
（1）分别取6支试管，编号，按下表加入试剂，混匀。
管号 1 2 3 4 5 6
样品（ml） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
水（ml） 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5
蛋白质含量（mg/ml） 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
（2）准确吸取2.5ml 考马斯亮蓝溶液于6支干净试管中，准确吸取上述各管溶液0.1ml，对应放于各自编号的试管中，涡旋混匀，室温放置5min后，以1号试管调零，测定在595nm处比色，记录吸光值。
（3）绘制标准曲线：记录1-6管所读吸光值，以蛋白质含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。注意，由于考马斯亮蓝染色能力强，比色杯一定要洗干净。不可用石英杯测定。
3、样品的测定
（1）样品的准备：
将待测样品稀释至蛋白含量0.1-0.3mg/ml，控制除去空白后的吸光值（减去空白以后）在0.2-0.4之间；
（2）样品检测：
取干净试管，加入到含有2.5ml考马斯亮蓝溶液，然后加入待测样品，涡旋震荡摇匀，室温放置5min，以标准曲线空白作对照，用1cm光径的微量比色杯在595nm测定吸光度，根据标曲求得蛋白含量。
4、蛋白含量计算
蛋白含量=X*稀释倍数*标样折算系数。
X：根据标曲求出的蛋白含量（mg/ml）。
标样折算值：标样为47mg/ml，根据实测值折算一个系数。
（三）比酶活的计算
“比酶活 (Specific Activity)”是指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。一般来说，比酶活越高，酶越纯。
比活力计算公式：比酶活（U/mg）=酶活（U/mL）/ 蛋白含量（mg/mL）。
实施例4 毕赤酵母HUANG1-B3-74的调控基因改造
1、乙酰辅酶A合成酶C2的克隆
以毕赤酵母GS115的基因组为模板，用PCR反应克隆乙酰辅酶A合成酶C2基因，引物和反应条件如下：
引物1(F)：GCGCGAATTCATGACTTTTCCAGAGCCAAGAGAACACAAA；
引物1(R)：TAAAGCGGCCGCCTACTTCTTGAAGAACTGGTTATCAACAG。
PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸2min30s，35个循环后，72℃保温10min。乙酰辅酶A合成酶C2基因全长2019bp，其核苷酸序列为SEQ IDNO：9。
、乙酰辅酶A合成酶C2基因的表达质粒构建
将克隆得到的乙酰辅酶A合成酶C2基因用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，50 μl酶切体系如下：乙酰辅酶A合成酶C2基因43μl、10×FastDigest Buffer 5 μl、EcoR I 1 μl、Not I 1 μl。37℃酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
将表达载体pPICZA用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，50 μl酶切体系如下：载体pPICZA 43μl、10×FastDigest Buffer 5 μl、EcoR I 1 μl、Not I 1 μl。37℃酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
将经EcoR I和Not I双酶切的乙酰辅酶A合成酶C2基因片段与经同样酶切后的表达载体pPICZA连接，构建重组表达质粒pPICZA-C2。连接体系如下：表达载体pPICZA双酶切产物5 μl、乙酰辅酶A合成酶C2基因双酶切产物3 μl、10×T4 ligase buffer 1 μl、T4ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LC+Zeocin液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为酵母胞内表达质粒pPICZA-C2。
、调控基因C2转入毕赤酵母HUANG1-B3-74
将重组质粒pPICZA-C2用限制性内切酶SacI进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母HUANG1-B3-74，涂布YPD+Zeocin平板。在YPD+Zeocin平板上生长出的菌落即为转入C2的毕赤酵母工程菌株。
、菌株摇瓶发酵筛选验证
挑取多个阳性转化子分别接入BMGY培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基中，30℃、220rpm振荡培养，以HUANG1-B3-74菌株为对照，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液进行黄曲霉毒素降解酶活力测定。
结果显示，在摇瓶条件下，改造前的毕赤酵母HUANG1-B3-74的发酵酶活为703U/ml；而转入C2基因的转化子中发酵酶活最高的达到983U/ml，将该转化子命名为毕赤酵母Huang1-B3-17（Pichia pastoris Huang1-B3-17）。从而说明，通过在毕赤酵母工程菌中胞内共表达C2基因能显著提高其表达黄曲霉毒素降解酶突变体HUANG1-B3的酶活，其提高比例达到40%，取得了意料不到的技术效果。
申请人已于2020年12月2日将毕赤酵母Huang1-B3-17（Pichia pastoris Huang1-B3-17）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020819。
序列表
<110> 潍坊康地恩生物科技有限公司
青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一种黄曲霉毒素降解酶突变体及其生产菌株
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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attccccgcg tcgacgcaga agcttttgag tcagtggtca aagcctctag caacgcagac 420
cagggctcgg cactattcac caagttgaaa caacacatat atgcgctttc tcctgagtca 480
gcgctattca ttggcaaagt taaggacggt cacgtatcaa attactatct tggtgaacct 540
gttggagatg ctgaggtcga tgctatccag aatgtcgctg agaagttagg cgttgatatc 600
ctcaatactc gcgtgaagaa gaatggagcg ggtgattaca cgctcttagt tgcctctgct 660
aaaaccagtc caccctccgt gcatgacttc caaatcgact caactccggc taaattgacg 720
attgagtatg gcgactacgc gtcatctcta acgaaagttg tcgccgccct tcaggaggcc 780
aaacagtata ccgcgaacga tcatcaatca gcgatgatcg aaggctatgt caaatcgttc 840
aactcaggat caattccgga acacaaagct gcgtcaacag aatgggtgaa agatattgga 900
ccggttgtag agtcctacat cgggttcgtc gaaacctatg tcgacccata tggcggacgc 960
gcggaatggg agggtttcac tgccatcgtc gacaagcagc tgagtgcgaa gtacgaagca 1020
ttggttaacg gtgctcctaa gttgatcaag agtcttccgt ggggaacgga cttcgaggtt 1080
gacgtcttca ggaagccgga ctttactgcg ttggaagtcg tatcatttgc aacaggaggt 1140
attcctgccg gaatcaatat accaaactat tatgaagtcc gggaaagcac agggtttaag 1200
aatgtttcgc tagcgaatat tttggcggcc aaggtaccaa acgaggagtt aactttcatc 1260
catcctgatg acgtagaact atataacgct tgggatagtc gcgcgtttga acttcaggtg 1320
gccaaccacg aacttttggg tcatggctcc ggcaagcttt tccaagaagg tgctgatggg 1380
aaactgaact tcgatcccga aaaggtcata aaccctctga ctggaaagcc gataacttca 1440
tggtataagc cagggcaaac gccggattct gttttaggcg aagtgtcgtc gtcaatggaa 1500
gaatgtcggg cggagaccgt agcgctctac ttggttagca acctcgatat tcttaaaatt 1560
ttcaattacg tcgacaagca agacattgaa gatatccagt acatcacgtt cttgcttatg 1620
gcccgcgctg gtctgcgggc actagagttt tatgatccag ccaccaagaa gcacggacag 1680
gcacatatgc aggccagaat gggcataacc cagtacctga ttcaagctgg gattgcgaga 1740
cttgaattga tccaggatgc caacggcgaa ctcgaaaact tatacgttcg ggttgaccgg 1800
gagaaagtgt tgtccaaagg aaaggaggtt gttggtcaat tgctgatcga actccaagtc 1860
cggaaaagta ccgcagacgg caccggctcc cgagatttct acacaacgct gaccgaacca 1920
atctctggat gggagggcaa gatccgagac atcgttttga agaagaagct tcctcgaaaa 1980
atctttgtcc aacccaatac ttttgtcgtc aacggcgaag tccagctcaa agagtatcct 2040
ttgacggctg ccggggtaat tgaaagtttc attgagagac gattgtga 2088
<210> 7
<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Thr Thr Thr Val His Arg Glu Arg Phe Leu Ala Asp Lys Ser
1 5 10 15
Ala Pro Leu Cys Gly Met Asp Ile Arg Lys Ser Phe Asp Gln Leu Ser
20 25 30
Ser Lys Glu Lys Leu Tyr Thr His Tyr Val Thr Glu Ala Ser Trp Ala
35 40 45
Gly Ala Arg Ile Ile Gln Ala Gln Trp Thr Pro Gln Ala Thr Asp Leu
50 55 60
Tyr Asp Leu Leu Ile Leu Thr Phe Ser Val Asn Gly Lys Leu Ala Asp
65 70 75 80
Leu Asn Ala Leu Lys Thr Ser Ser Gly Leu Ser Glu Asp Asp Trp Glu
85 90 95
Ala Leu Ile Gln Tyr Thr Val Gln Val Leu Ser Asn Leu Val Asn Tyr
100 105 110
Lys Thr Phe Gly Phe Thr Lys Ile Ile Pro Arg Val Asp Ala Glu Ala
115 120 125
Phe Glu Ser Val Val Lys Ala Ser Ser Asn Ala Asp Gln Gly Ser Ala
130 135 140
Leu Phe Thr Lys Leu Lys Gln His Ile Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Ser
145 150 155 160
Ala Leu Phe Ile Gly Lys Val Lys Asp Gly His Val Ser Asn Tyr Tyr
165 170 175
Leu Gly Glu Pro Val Gly Asp Ala Glu Val Asp Ala Ile Gln Asn Val
180 185 190
Ala Glu Lys Leu Gly Val Asp Ile Leu Asn Thr Arg Val Lys Lys Asn
195 200 205
Gly Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Leu Val Ala Ser Ala Lys Thr Ser Pro
210 215 220
Pro Ser Val His Asp Phe Gln Ile Asp Ser Thr Pro Ala Lys Leu Thr
225 230 235 240
Ile Glu Tyr Gly Asp Tyr Ala Ser Ser Leu Thr Lys Val Val Ala Ala
245 250 255
Leu Gln Glu Ala Lys Gln Tyr Thr Ala Asn Asp His Gln Ser Ala Met
260 265 270
Ile Glu Gly Tyr Val Lys Ser Phe Asn Ser Gly Ser Ile Pro Glu His
275 280 285
Lys Ala Ala Ser Ser Glu Trp Val Lys Asp Ile Gly Pro Val Val Glu
290 295 300
Ser Tyr Ile Gly Phe Val Glu Thr Tyr Val Asp Pro Tyr Gly Gly Arg
305 310 315 320
Ala Glu Trp Glu Gly Phe Thr Ala Ile Val Asp Lys Gln Leu Ser Ala
325 330 335
Lys Tyr Glu Ala Leu Val Asn Gly Ala Pro Lys Leu Ile Lys Ser Leu
340 345 350
Pro Trp Gly Thr Asp Phe Glu Val Asp Val Phe Arg Lys Pro Asp Phe
355 360 365
Thr Ala Leu Glu Val Val Ser Phe Ala Thr Gly Gly Ile Pro Ala Gly
370 375 380
Ile Asn Ile Pro Asn Tyr Tyr Glu Val Arg Glu Ser Thr Gly Phe Lys
385 390 395 400
Asn Val Ser Leu Ala Asn Ile Leu Ala Ala Lys Val Pro Asn Glu Glu
405 410 415
Leu Thr Phe Ile His Pro Asp Asp Val Glu Leu Tyr Asn Ala Trp Asp
420 425 430
Ser Arg Ala Phe Glu Leu Gln Val Ala Asn His Glu Leu Leu Gly His
435 440 445
Gly Ser Gly Lys Leu Phe Gln Glu Gly Ala Asp Gly Lys Leu Asn Phe
450 455 460
Asp Pro Glu Lys Val Ile Asn Pro Leu Thr Gly Lys Pro Ile Thr Ser
465 470 475 480
Trp Tyr Lys Pro Gly Gln Thr Pro Asp Ser Val Leu Gly Glu Val Ser
485 490 495
Ser Ser Met Glu Glu Cys Arg Ala Glu Thr Val Ala Leu Tyr Leu Val
500 505 510
Ser Asn Leu Asp Ile Leu Lys Ile Phe Asn Tyr Val Asp Lys Gln Asp
515 520 525
Ile Glu Asp Ile Gln Tyr Ile Thr Phe Leu Leu Met Ala Arg Ala Gly
530 535 540
Leu Arg Ala Leu Glu Phe Tyr Asp Pro Ala Thr Lys Lys His Gly Gln
545 550 555 560
Ala His Met Gln Ala Arg Met Gly Ile Thr Gln Tyr Leu Ile Gln Ala
565 570 575
Gly Ile Ala Arg Leu Glu Leu Ile Gln Asp Ala Asn Gly Glu Leu Glu
580 585 590
Asn Leu Tyr Val Arg Val Asp Arg Glu Lys Val Leu Ser Lys Gly Lys
595 600 605
Glu Val Val Gly Gln Leu Leu Ile Glu Leu Gln Val Arg Lys Ser Thr
610 615 620
Ala Asp Gly Thr Gly Ser Arg Asp Phe Tyr Thr Thr Leu Thr Glu Pro
625 630 635 640
Ile Ser Gly Trp Glu Gly Lys Ile Arg Asp Ile Val Leu Lys Lys Lys
645 650 655
Leu Pro Arg Lys Ile Phe Val Gln Pro Asn Thr Phe Val Val Asn Gly
660 665 670
Glu Val Gln Leu Lys Glu Tyr Pro Leu Thr Ala Ala Gly Val Ile Glu
675 680 685
Ser Phe Ile Glu Arg Arg Leu
690 695
<210> 8
<211> 2088
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggccacca caactgtcca ccgggagcga ttcctggcag ataagtctgc tcctttgtgt 60
ggtatggata ttagaaagtc atttgatcag ctcagctcta aggaaaagct ctacacgcat 120
tacgtgaccg aagcttcttg ggcgggcgca agaatcatcc aggctcagtg gaccccgcag 180
gcgacagatc tatatgatct gttgatcctt acgttcagcg taaatggaaa gctcgccgac 240
ctgaatgccc ttaagacgtc gtcaggcctt tcagaggacg attgggaggc cttgatacag 300
tacacggtcc aggtattgag caatcttgtc aactacaaga cgttcggatt tacgaagatc 360
attccccgcg tcgacgcaga agcttttgag tcagtggtca aagcctctag caacgcagac 420
cagggctcgg cactattcac caagttgaaa caacacatat atgcgctttc tcctgagtca 480
gcgctattca ttggcaaagt taaggacggt cacgtatcaa attactatct tggtgaacct 540
gttggagatg ctgaggtcga tgctatccag aatgtcgctg agaagttagg cgttgatatc 600
ctcaatactc gcgtgaagaa gaatggagcg ggtgattaca cgctcttagt tgcctctgct 660
aaaaccagtc caccctccgt gcatgacttc caaatcgact caactccggc taaattgacg 720
attgagtatg gcgactacgc gtcatctcta acgaaagttg tcgccgccct tcaggaggcc 780
aaacagtata ccgcgaacga tcatcaatca gcgatgatcg aaggctatgt caaatcgttc 840
aactcaggat caattccgga acacaaagct gcgtcatctg aatgggtgaa agatattgga 900
ccggttgtag agtcctacat cgggttcgtc gaaacctatg tcgacccata tggcggacgc 960
gcggaatggg agggtttcac tgccatcgtc gacaagcagc tgagtgcgaa gtacgaagca 1020
ttggttaacg gtgctcctaa gttgatcaag agtcttccgt ggggaacgga cttcgaggtt 1080
gacgtcttca ggaagccgga ctttactgcg ttggaagtcg tatcatttgc aacaggaggt 1140
attcctgccg gaatcaatat accaaactat tatgaagtcc gggaaagcac agggtttaag 1200
aatgtttcgc tagcgaatat tttggcggcc aaggtaccaa acgaggagtt aactttcatc 1260
catcctgatg acgtagaact atataacgct tgggatagtc gcgcgtttga acttcaggtg 1320
gccaaccacg aacttttggg tcatggctcc ggcaagcttt tccaagaagg tgctgatggg 1380
aaactgaact tcgatcccga aaaggtcata aaccctctga ctggaaagcc gataacttca 1440
tggtataagc cagggcaaac gccggattct gttttaggcg aagtgtcgtc gtcaatggaa 1500
gaatgtcggg cggagaccgt agcgctctac ttggttagca acctcgatat tcttaaaatt 1560
ttcaattacg tcgacaagca agacattgaa gatatccagt acatcacgtt cttgcttatg 1620
gcccgcgctg gtctgcgggc actagagttt tatgatccag ccaccaagaa gcacggacag 1680
gcacatatgc aggccagaat gggcataacc cagtacctga ttcaagctgg gattgcgaga 1740
cttgaattga tccaggatgc caacggcgaa ctcgaaaact tatacgttcg ggttgaccgg 1800
gagaaagtgt tgtccaaagg aaaggaggtt gttggtcaat tgctgatcga actccaagtc 1860
cggaaaagta ccgcagacgg caccggctcc cgagatttct acacaacgct gaccgaacca 1920
atctctggat gggagggcaa gatccgagac atcgttttga agaagaagct tcctcgaaaa 1980
atctttgtcc aacccaatac ttttgtcgtc aacggcgaag tccagctcaa agagtatcct 2040
ttgacggctg ccggggtaat tgaaagtttc attgagagac gattgtga 2088
<210> 9
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgacttttc cagagccaag agaacacaaa gtggtgcacg aagccaacgg cgtaagggct 60
atcaaaaccc ctcaatcatt ttatgacaag caacctgtta agtcattgga ggcattggaa 120
cattatcaag agctgtacca gaagtccatc gaggacccag aggaattctt cggccaaatg 180
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gaaggtgatg ctgcgtggtt ccttggtgga gagctgaatg cttcgtacaa ctgtgttgac 300
cgacatgctt tttcgcaccc tgatcgtccc gccgtaattt tcgaagcgga cgaggaatct 360
gaatctcgaa caataactta tgcagaactt ctacgtgagg tctctcgtgt tgcaggagta 420
ctgcagagct ggggtgtacg caaaggtgac actgtcgcaa tctacttgcc catgactacc 480
gaggccattg tggccatgct ggcagtggca cgtctgggtg cagtgcactc cgttatcttt 540
tctggatttt cgtcaggatc tatccgggac agagttaacg atgctggatc taaggcaatt 600
attacctgtg atgagggacg ccgtgggggt cgtattgtga acaataagaa aattgtcgat 660
gccgctgttg acagctgccc cacagtggaa aaaatcctgg tttataagag gactggtaac 720
ccagaaatca agatggtaga aggaagagac ttctggtggc aggaagaggt tgagaaattc 780
cctggttaca ttgcccctgt ccctgtaaac tcggaggacc cactatttct tttgtatact 840
tcgggatcta ctggttctcc caaaggtgtg gtacactcca caggtggtta tttgctggga 900
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gttccaacca ttgtttttga gggaactcct gtctaccctg actacggaag attgtggaag 1080
atttgcgcca aacataaagc cacacacttt tacatcgctc ctactgctct tcgtcttttg 1140
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ggaaactgtc atattgctga tacttactgg cagactgaat ctggttctca tttgattgct 1320
ccattagcag gtgccgttcc ccaaaagccg ggtgcagcta ctgttccttt ctttggtatt 1380
gatgcttgta tcattgaccc tgtttctggt aaggaacttg aaggcaacga tgtggaaggt 1440
gttttagctg tcaagtccac ttggccatca atggctcgta cagtctggag aaaccacgct 1500
aaatacctcg acacatatat gcgtccttat ccaggctact actttactgg cgatggtgcc 1560
ggtagagatc acgatggtta ttactggatc cgtggtcgtg ttgacgatgt tgtcaatgta 1620
tctggccacc gtttatccac ttctgaaatt gaaagtgctt tactggaaaa tggcaaagtt 1680
gctgaagctg ctgtgattgg tatttccgat gagctaactg gtcaagctgt tattgctttt 1740
gtcgccttga aagatgccac tgactctgag aatttagacg ctctcagacg tgccttagtc 1800
ttgcatgttc gtggagaaat tggtccattt gcagctccta agtccgtgat tgtggttgat 1860
gacttgccta agacccgatc aggtaagatc atgcgtagag ttttaagaaa gatttcttgc 1920
catgaagctg atcaattggg tgatatgtct actttggcca atcctgaatc ggtagactct 1980
ataatcggag ctgttgataa ccagttcttc aagaagtag 2019

Claims (7)

1.一种黄曲霉毒素降解酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO:3或 SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7。
2.编码权利要求1所述突变体的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO:4或 SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述的DNA分子。
4.一种毕赤酵母（Pichia pastoris），其特征在于，所述毕赤酵母包含权利要求3所述的重组表达载体。
5.如权利要求4所述的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母还包含乙酰辅酶A合成酶C2基因。
6.如权利要求5所述的毕赤酵母，其特征在于，所述乙酰辅酶A合成酶C2基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：9。
7.如权利要求6所述的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母的保藏编号为CCTCC NO：M2020819。
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