AT515155A1 - Mutante - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Variante eines Alkoholoxidase Proteins, insbesondere eines Alkoholoxidase 1 (Aox1, „alcohol oxidase 1“) Proteins oder eines Alkoholoxidase 2 (Aox2) Proteins, welche in der Lage ist einen AOX1 Promotor zu induzieren und welche eine geringere enzymatische Aktivität aufweist als das Wildtyp-Alkoholoxidase 1 oder 2 Proteins und deren Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Variante eines Alkoholoxidase 1 oder Alkoholoxidase 2 Proteins und deren Verwendung bei der Expression von heterologen Proteinen und Polypeptiden in Wirtszellen.

In den letzten Jahrzehnten hat die Bedeutung der eukaryoti-schen Expressionsysteme wie Hefen und Pilze zur Produktion von heterologen Proteinen neben der heterologen Genexpression in Prokaryoten (z.B. E. coli) stark zugenommen. Eukaryotische Expressionssysteme haben insbesondere Vorteile bei der in vivo Faltung, bei der Sekretion und bei den posttranslationalen Modifikationen der herzustellenden Polypeptide und Proteine. Besonders methylotrophe Mikroorganismen wie methylotrophe Hefen etablierten sich zu bedeutende Wirtszellen bei der Herstellung re-kombinanter Proteine, da diese einerseits die Vorteile eukaryo-tischer Expressionssysteme aufweisen und andererseits hohe Produktausbeuten ermöglichen.

Methylotrophe Expressionssysteme zeichnen sich in der Regel durch die Verwendung des Promotors des AOXl (Alkoholoxidase 1, „alcohol oxidase 1") Gens aus, deren offener Leserahmen für eine Alkoholoxidase kodiert. Dieser Promotor wird in Anwesenheit von Methanol aktiviert und in Anwesenheit von Glukose oder Glycerin reprimiert, wodurch im letzteren Fall die Transkriptionsraten im Vergleich zur Induktion mit Methanol auf unter 2 % gesenkt werden können. Die Fähigkeit des AOXl Promotors hohe Transkriptionsraten innerhalb einer Zelle zu bewirken ist darin begründet, dass Pichia pastoris, beispielsweise, mit Methanol als einziger Kohlenstoffquelle überleben kann, die Affinität des Aoxl Enzyms zu Methanol jedoch schwach ist. Zur Kompensation dieser schwachen Affinität muss die Hefe das Enzym in großen Mengen produzieren. Ist in einem Nährmedium Glukose oder Glyzerin in ausreichenden Mengen vorhanden, ist es für die Zelle nicht notwendig das Aoxl Enzym in großen Mengen zu produzieren, so dass die Aoxl Expression drastisch herunterreguliert wird. Deshalb wird der A0X1 Promotor, der die Expression dieses Enzyms reguliert, verwendet, um heterologe Proteine zu exprimieren. Die Stärke des A0X1 Promotors wird auch dadurch ersichtlich, dass unter Methanol verwertenden Bedingungen bis zu 30% der löslichen zellulären Proteine in P. pastoris aus Alkoholoxidase bestehen.

Da der AOXl Promotor in Anwesenheit von Methanol, beispielsweise, aktiviert wird, wird üblicherweise Methanol dazu verwendet, um die heterologe Proteinexpression in Wirtszellen zu regu- lieren. In großtechnischen Fermentoren kann die Lagerung und Zugabe von großen Mengen an Methanol sicherheitstechnische Probleme bereiten, da Methanol leicht entzündlich ist. Aus diesem Grund ist es erstrebenswert Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, um die Menge an Methanol für die Induktion des AOXl Promoters zu reduzieren oder gar zu vermeiden. Beispielsweise werden in der WO 2006/089329 AOXl Promotorvarianten geoffenbart, welche unter dereprimierenden Bedingungen (d.h. in Abwesenheit von Glukose) zu einer höheren Expressionsrate führen als der unveränderte AOXl Wildtyp-Promotor.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung alternative Verfahren und Mittel bereitzustellen, welche eine heterologe Proteinexpression unter Kontrolle eines AOXl-Promotors ermöglichen, wobei die Menge an eingesetztem Induktionsmittel (z.B. Methanol) geringer ist als bei den herkömmlichen Produktionsstämmen .

Es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, dass Alkoholoxidasen, insbesondere Alkoholoxidase 1 (Aoxl) und Alkoholoxidase 2 (Aox2), vorzugsweise Alkoholoxidase 1 (Aoxl) neben ihren enzymatischen Eigenschaften primäre Alkohole mit molekularem Sauerstoff als Elektronenakzeptor zu Aldehyden umzusetzen auch in der Lage sind, den eigenen Promotor (d.h. den AOXl Promotor) zu induzieren, somit eben der enzymatischen Funktion auch eine Funktion als Regulatorprotein aufweisen. Diese Autoinduktion könnte dahingehend genutzt werden, dass anstelle von Methanol, beispielsweise, in der Zelle exprimierte Alkoholoxidasen als Induktionsmittel eingesetzt werden. Andererseits bewirkt die teilweise oder gänzliche Reduktion der enzymatischen Aktivität der Alkoholoxidasen, dass die eingesetzten Mengen an Methanol als Induktionsmittel signifikant reduziert werden können, da Methanol von den Zellen, welche entsprechend mutierte Alkoholoxidasen ex-primieren, nicht mehr verwertet werden können. In herkömmlichen Zellen, welche eine völlig intakte und enzymatisch aktive Alkoholoxidase exprimieren, wird das Induktionsmittel Methanol ständig verwertet und zu Formaldehyd umgesetzt, wodurch Methanol ständig und in relativ großen Mengen beigegeben werden muss. Durch die Expression entsprechender Alkoholoxidasen wäre es somit möglich die eingesetzten Mengen an Methanol als Induktionsmittel signifikant zu reduzieren oder rekombinante Expressionen gänzlich ohne Methanol durchzuführen.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung eine Variante eines Alkoholoxidase Proteins, insbesondere eines Alkoholoxidase 1 (Aoxl, „alcohol oxidase 1") oder Alkoholoxidase 2 Proteins, vorzugsweise eines Alkoholoxidase 1 Proteins, welches in der Lage ist einen AOXl Promotor zu induzieren und welches eine geringere enzymatische Aktivität aufweist als das Wildtyp-Alkoholoxidase 1 bzw. Alkoholoxidase 2 Protein.

Durch die Reduktion der enzymatischen Aktivität der erfindungsgemäßen Alkoholoxidasen-Varianten wird die Umsetzung des zu den Expressionskulturen dazugegebenen Induktionsmittels Methanol signifikant reduziert. Um diesen technischen Vorteil bei der Expression von heterologen Polypeptiden und Proteinen in einer me-thylotrophen Wirtszelle ausnützen zu können, kann die in der me-thylotrophen Wildtypzelle vorkommende Alkoholoxidase entsprechend mutiert werden. Alternativ dazu kann oder können die in der methylotrophen Wildtypzelle vorkommenden Alkoholoxidasen (z.B. Aoxl und Aox2) beispielsweise durch Deletion des gesamten Gens oder des Promotors oder Teilen davon inaktiviert werden und gleichzeitig die erfindungsgemäße Alkoholoxidase 1 Variante in der Wirtszelle exprimiert werden. Als Promotor für die Alkoholoxidase 1 bzw. 2 Variante wird dabei vorzugsweise ein Promotor verwendet, welcher nicht vom AOXl Gen abgeleitet ist. Das Nukleinsäuremolekül kodierend für das zu exprimierende heterologe Protein oder Polypeptid steht vorzugsweise unter der Kontrolle des AOXl Promotors oder Varianten davon.

Die erfindungsgemäße Variante des Alkoholoxidase 1 und Alkoholoxidase 2 Proteins ist „in der Lage einen AOXl Promotor zu induzieren". Dies bedeutet, dass ein natürlich vorkommender AOXl Promoter, bzw. die Transkription eines vom A0X1 Promotor kontrollierten Gens, allein durch die Anwesenheit des Aoxl oder Aox2 Proteins oder der Variante davon die Transkription eines vom Promotor kontrollierten Gens induziert wird. Die Eigenschaft eines Moleküls die Aktivität eines Promotors zu beeinflussen o-der einen Promotor zu induzieren kann getestet werden, in dem die Transkriptionrate bzw. die Proteinexpression eines unter der Kontrolle eines AOXl Promotors befindlichen Gens in An- und Abwesenheit des Moleküls in vivo oder in vitro bestimmt und verglichen wird.

Die erfindungsgemäße Alkoholoxidase 1 bzw. 2 Variante weist „eine geringere enzymatische Aktivität auf als die Wildtyp-Alkoholoxidase 1 bzw. 2". Die enzymatische Aktivität einer Alko- holoxidase 1 bzw. 2 umfasst die Umsetzung von Methanol und molekularem Sauerstoff zu Formaldehyd. Diese Aktivität kann mit Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Vorzugsweise werden Verfahren verwendet die in Janssen et al. (Bioche-mica et Biophysica Acta 151(1968):330-342) und in Gvozdev AR et al. (Biochemistry (Mose) 75(2010):242-248) beschrieben sind. Besonders bevorzugt wird das in Janssen et al. beschriebene Verfahren verwendet, um die enzymatische Aktivität zu bestimmen. „Eine geringere enzymatische Aktivität" der erfindungsgemäßen Alkoholoxidase 1 oder 2 Variante bedeutet, dass die enzymatische Aktivität der Variante mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, geringer ist als jene des Wildtyp-Alkoholoxidase 1 oder 2 Proteins, von der die erfindungsgemäße Variante abgeleitet ist. Die erfindungsgemäße Variante weist vorzugsweise keine enzymatische Aktivität bzw. maximal geringe Aktivität auf, d.h. die Variante ist praktisch gesehen enzymatisch inaktiv.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bzw. gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die erfindungsgemäße Variante des Alkoholoxidase 1 oder 2 Proteins ein Motiv mit der Aminosäuresequenz PDNX1GX2X3TY (SEQ ID Nr. 1), wobei Xi Valin oder Prolin, X2 Cystein, Glycin, Alanin, Serin oder Threonin und X3 eine beliebige Aminosäure ausgenommen Asparagin ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Valin, Methionin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Serin, Cystein, Threonin, Lysin, Arginin, Histidin und Glutamin, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Valin, Methionin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, insbesondere Alanin.

Die erfindungsgemäße Variante der Alkoholoxidase 1 oder 2 weist ein Motiv mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 auf. Es hat sich herausgestellt, dass eine Substitution der Aminosäure an Position 7 (X3) von SEQ ID Nr. 1 im Vergleich zum Wildtyp Alkoholoxidase 1 oder 2 Protein zu einer Variante mit den erfindungsgemäßen Eigenschaften führt.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist X3 Alanin.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Motiv die Aminosäuresequenz PDNVGCX3TY (SEQ ID Nr. 2).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorlie-gendnen Erfindung weist das Motiv die Aminosäuresequenz PDNVGCATY (SEQ ID Nr. 3) auf.

Die Variante der vorliegenden Erfindung weist vorzugsweise eine Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 4 (Aoxl) oder SEQ ID Nr. 5 (Aox2) von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von mindestens 90%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, insbesondere von mindestens 99%, auf. SEQ ID Nr. 4:

MAIPEEFDILVLGGGSSGSCIAGRLANLDHSLKVGLIEAGENNLNNPWVYLPGIYPRNMKLDSK TASFYTSNPSPHLNGRRAIVPCANVLGGGSSINFMMYTRGSASDYDDFQAEGWKTKDLLPLMKK TETYQRACNNPDIHGFEGPIKVSFGNYTYPVCQDFLRASESQGIPYVDDLEDLVTAHGAEHWLK WINRDTGRRSDSAHAFVHSTMRNHDNLYLICNTKVDKIIVEDGRAAAVRTVPSKPLNPKKPSHK IYRARKQIVLSCGTISSPLVLQRSGFGDPIKLRAAGVKPLVNLPGVGRNFQDHYCFFSPYRIKP QYESFDDFVRGDAEIQKRVFDQWYANGTGPLATNGIEAGVKIRPTPEELSQMDESFQEGYREYF EDKPDKPVMHYSIIAGFFGDHTKIPPGKYMTMFHFLEYPFSRGSIHITSPDPYAAPDFDPGFMN DERDMAPMVWAYKKSRETARRMDHFAGEVTSHHPLFPYSSEARALEMDLETSNAYGGPLNLSAG LAHGSWTQPLKKPTAKNEGHVTSNQVELHPDIEYDEEDDKAIENYIREHTETTWHCLGTCSIGP REGSKIVKWGGVLDHRSNVYGVKGLKVGDLSVCPDNVGCNTYTTALLIGERTATLVGEDLGYSG EALDMTVPQFKLGTYEKTGLARF SEQ ID Nr. 5:

MAIPEEFDILVLGGGSSGSCIAGRLANLDHSLKVGLIEAGENNLNNPWVYLPGIYPRNMKLDSK TASFYTSNPSPHLNGRRAIVPCANILGGGSSINFMMYTRGSASDYDDFEAEGWKTKDLLPLMKK TETYQRACNNPEIHGFEGPIKVSFGNYTYPVCQDFLRATESQGIPYVDDLEDLVTAHGAEHWLK WINRDTGRRSDSAHAFVHSTMRNHDNLYLICNTKVDKIIVEDGRAAAVRTVPSKPLNAKKPTHK VYRARKQIVLSCGTISSPLVLQRSGFGDPIKLRAAGVKPLVNLPGVGRNFQDHYCFFSPYRIKP QYESFDDFVRGDANIQKKVFDQWYANGTGPLATNGIEAGVKIRPTPEELSQMDESFQEGYREYF EDKPDKPVMHYSIIAGFFGDHTKIPPGKYMTMFHFLEYPFSRGSIHITSPDPYATPDFDPGFMN DERDMAPMVWSYKKSRETARKMDHFAGEVTSHHPLFPYSSEARAYEMDLETSNAYGGPLNLTAG LAHGSWTQPLKKPAGRNEGHVTSNQVELHPDIEYDEEDDKAIENYIREHTETTWHCLGTCSIGP REGSKIVKWGGVLDHRSNVYGVKGLKVGDLSVCPDNVGCNTYTTALLIGEKTATLVGEDLGYTG EALDMTVPQFKLGTYEKTGLARF „Identität" zweier oder mehrerer Amino- oder Nukleinsäure-molküle bedeutet, dass die Sequenzen der Moleküle einen gewissen

Grad an Sequenzähnlichkeit teilen, wobei die Sequenzen teilweise identisch sind. Erfindungsgemäß kann die Identität zweier oder mehrere Aminosäure- oder Nukleinsäuremoleküle mit bekannten Algorithmen bestimmt werden. Besonders bevorzugt wird dabei der Algorithmus von Needleman und Wunsch (J Mol Biol 48 (1970) :443) verwendet. Deshalb werden Programme, die auf diesem Algorithmus basieren, bevorzugt. Die Applikation „Needle", beispielsweise, ist Teil der "The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)" (Trends in Genetics 16(2000):276). Daher erfolgen die Berechnungen zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität vorzugsweise mit dem Programm „Needle", vorzugsweise über den gesamten Bereich der Sequenzen. Die folgenden Standardeinstellungen werden für den Vergleich von Sequenzen mit „Needle" verwendet: Matrix: EBLOSUM62, Gap opening penalty: 10.0, Gap extension penalty: 0.5.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Variante die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 6 auf. SEQ ID Nr. 6:

MAIPEEFDILVLGGGSSGSCIAGRLANLDHSLKVGLIEAGENNLNNPWVYLPGIYPRNMKLDSK TASFYTSNPSPHLNGRRAIVPCANVLGGGSSINFMMYTRGSASDYDDFQAEGWKTKDLLPLMKK TETYQRACNNPDIHGFEGPIKVSFGNYTYPVCQDFLRASESQGIPYVDDLEDLVTAHGAEHWLK WINRDTGRRSDSAHAFVHSTMRNHDNLYLICNTKVDKIIVEDGRAAAVRTVPSKPLNPKKPSHK IYRARKQIVLSCGTISSPLVLQRSGFGDPIKLRAAGVKPLVNLPGVGRNFQDHYCFFSPYRIKP QYESFDDFVRGDAEIQKRVFDQWYANGTGPLATNGIEAGVKIRPTPEELSQMDESFQEGYREYF EDKPDKPVMHYSIIAGFFGDHTKIPPGKYMTMFHFLEYPFSRGSIHITSPDPYAAPDFDPGFMN DERDMAPMVWAYKKSRETARRMDHFAGEVTSHHPLFPYSSEARALEMDLETSNAYGGPLNLSAG LAHGSWTQPLKKPTAKNEGHVTSNQVELHPDIEYDEEDDKAIENYIREHTETTWHCLGTCSIGP REGSKIVKWGGVLDHRSNVYGVKGLKVGDLSVCPDNVGCATYTTALLIGEKTATLVGEDLGYSG EALDMTVPQFKLGTYEKTGLARF

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Variante die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 45 auf: SEQ ID Nr. 45:

MAIPEEFDILVLGGGSSGSCIAGRLANLDHSLKVGLIEAGENNLNNPWVYLPGIYPRNMKLDSK TASFYTSNPSPHLNGRRAIVPCANILGGGSSINFMMYTRGSASDYDDFEAEGWKTKDLLPLMKK TETYQRACNNPEIHGFEGPIKVSFGNYTYPVCQDFLRATESQGIPYVDDLEDLVTAHGAEHWLK

WINRDTGRRSDSAHAFVHSTMRNHDNLYLICNTKVDKIIVEDGRAAAVRTVPSKPLNAKKPTHK VYRARKQIVLSCGTISSPLVLQRSGFGDPIKLRAAGVKPLVNLPGVGRNFQDHYCFFSPYRIKP QYESFDDFVRGDANIQKKVFDQWYANGTGPLATNGIEAGVKIRPTPEELSQMDESFQEGYREYF EDKPDKPVMHYSIIAGFFGDHTKIPPGKYMTMFHFLEYPFSRGSIHITSPDPYATPDFDPGFMN DERDMAPMVWSYKKSRETARKMDHFAGEVTSHHPLFPYSSEARAYEMDLETSNAYGGPLNLTAG LAHGSWTQPLKKPAGRNEGHVTSNQVELHPDIEYDEEDDKAIENYIREHTETTWHCLGTCSIGP REGSKIVKWGGVLDHRSNVYGVKGLKVGDLSVCPDNVGCATYTTALLIGEKTATLVGEDLGYTG EALDMTVPQFKLGTYEKTGLARF

Die Alkoholoxidase 1 oder 2 Variante ist vorzugsweise von einer Alkoholoxidase 1 oder 2 aus einer Pilzzelle, insbesondere einer Hefezelle, abgeleitet. D.h. die erfindungsgemäße Variante ist vorzugsweise eine Mutationsvariante einer Wildtyp-Alkoholoxidase 1 oder 2 einer Pilzzelle, insbesondere Hefezelle. Bevorzugte Hefezellen sind methylotrophe Hefen, besonders bevorzugt sind Pichia pastoris und Hansenula polymorpha.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise DNA, kodierend für eine Alkoholoxidase 1 oder 2 Variante gemäß der vorliegenden Erfindung.

Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann funktionell an einen Promoter gebunden sein, um dadurch die Transkription des Nukleinsäuremoleküls kodierend für das erfindungsgemäße Alkoholoxidase 1 oder 2 Proteinvariante und somit die Expression dieser Proteinvariante zu ermöglichen. Das Nukleinsäuremolekül bildet mit dem Promotor und gegebenenfalls weiteren Elementen (wie z.B. Terminatorsequenzen) eine Expressionskassette.

Um das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder die erfindungsgemäße Expressionskassette in eine Wirtszelle einbringen zu können, ist das Nukleinsäuremolekül bzw. die Expressionskassette Teil eines Vektors.

Ein erfindungsgemäßer Vektor kann einen selektierbaren Marker enthalten. Die selektierbaren Marker sind häufig Gene, die Antibiotikaresistenz der Wirtszelle ermöglichen oder Gene, die in der Lage sind, jene Wirtszellen zu ergänzen, welche gut charakterisierte metabolische Mängel aufweisen, solche wie z. B. mangelhafte Mutanten in Histidin. Die bevorzugten selektierbaren Marker inkludieren URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4 oder Gene, die für eine Antibiotikaresistenz kodieren. Der Vektor kann auch einen Replizierungsursprung haben, der in der Lage ist Replikation des Vektors in einer Wirtszelle zu vermitteln.

Als Promotoren, welche sich erfindungsgemäß eignen in Wirtszellen, wie Hefezellen, die Expression eines Gens zu steuern, können beispielsweise AUG1, AOD, ENOl, GPMl, HSP82, ICLl, ILV5, GPDl, PX6, TEF, CUPl, PGK, GAPl, TPI, PH05, AOXl, A0X2, DAS, FLD1, GAL10/CYC1, CYC1, OliC, ADH, TDH, Kex2, MFa oder NMT Promotoren oder Kombinationen oder Varianten der vorstehend genannten Promotoren eingesetzt werden (siehe z.B. Vogl T und Glieder A, New Biotechnology 30(2013):385-404, insbesondere Tabelle 1 von Vogl T und Glieder A).

Der erfindungsgemäße Vektor kann als stabiler Expressionsvektor, in einem künstlichen Chromosom oder durch Integration in das Chromosom in eine Wirtszelle eingebracht werden. Die Integration in das Chromosom kann erreicht werden, indem man einen Vektor verwendet, der sich als ganzes Element oder mit Teilen davon mit dem Chromosom der Hefe rekombiniert. Geeignete Vektoren können Nukleotidsequenzen enthalten, die mit Nukleotidsequenzen des Wirtszellen-Chromosoms homolog sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine rekombinante Zelle umfassend ein Nukleinsäuremolekül, eine Expressionskassette oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Er-f indung.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle sind vorzugsweise in Zellen eingebracht einerseits um diese Moleküle für Klonierungszwecke, beispielsweise, zu vermehren und andererseits, um die Expression in Wirtszellen zu ermöglichen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Zelle eine Pilzzelle, vorzugsweise eine Hefezelle, wobei besonders bevorzugt methylotrophe Hefen und ganz besonders bevorzugt P. pastoris und Hansenula polymorpha verwendet werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine methylotrophe Zelle und die Zelle ein Nukleinsäuremolekül umfasst, welches für ein heterologes Protein oder Polypeptid kodiert, wobei dieses Nukleinsäuremolekül funktionell an einen durch Methanol induzierbaren Promoter, vorzugsweise einen AOXl oder A0X2 Promoter oder einen DAS oder FLDl Promoter, gebunden ist, und eine Mutation des in der methylotrophen Wildtyp-Zelle vorkommenden AOXl und A0X2 Gens und/oder dessen Promoters zur Inaktivierung oder Reduktion der Expression der Wildtyp Aoxl und Aox2 Proteine umfasst.

Durch die Inaktivierung oder Herunteregulierung der in me-thylotrophen Wirtszellen natürlich vorhandenen Alkoholoxidasen werden jene Enzyme in der Wirtszelle nicht mehr exprimiert, welche das dem Nährmedium zugesetzte Induktionsmittel Methanol enzymatisch umsetzen. Daher wird dem Nährmedium zugesetztes Methanol nicht oder nur in geringen Mengen von den Wirtszellen abgebaut. Eine Folge davon ist, dass diese methylotrophen Wirtszellen nicht mehr in der Lage sind in einem Nährmedium zu wachsen, in dem als ausschließlich Kohlenstoffquelle Methanol zur Verfügung steht. Daher müssen diese Zellen in Nährmedien gezüchtet werden, die beispielsweise ein Kohlenhydrat, einen Alkohol oder eine organische Säure oder ein Hydrolysat von Proteinen als Kohlenstof f quelle umfassen.

Das Nukleinsäuremolekül kodierend für ein heterologes Protein oder Polypeptid ist funktionell an einen Promoter gebunden, der durch Methanol, beispielsweise, aktivierbar ist. Derartige Promotoren können AOXl und/oder A0X2 Promotoren sowie DAS oder FLDl Promotoren welche auch durch Methanol induziert werden können, sein. Wirtszellen, welche einerseits nicht mehr in der Lage sind Methanol enzymatisch umzusetzen und andererseits funktionell an einen A0X1 oder A0X2 Promoter gebundene Nukleinsäuremoleküle kodierend für heterologe Proteine oder Polypeptide umfassen, haben den Vorteil, dass die Zugabe von geringen Mengen an Methanol, beispielsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 2 g/L, gegebenenfalls in einer Konzentration von 0,01 bis 0,5 g/L bereits ausreichend ist, die Expression der heterologen Polypeptide und Proteine zu induzieren. Der Grund hierfür liegt in der Tatsache, dass Methanol ohne Alkoholoxidasen in den Wirtszellen nicht mehr umgesetzt werden kann.

Um die Expressionsleistung derartiger Wirtszellen nochmals zu steigern ist es von Vorteil die erfindungsgemäße Alkoholoxidase 1 oder 2 Variante ebenfalls in der Wirtszelle zu exprimie-ren. Die erfindungsgemäße Alkoholoxidase 1 oder 2 Variante ist nämlich in der Lage die verstärkte Induktion des AOXl Promotors zu vermitteln ohne im Nährmedium vorhandenes und in die Zellen eingeschleustes Methanol umzusetzen, wodurch dessen Konzentration im Nährmedium abnehmen würde. Das Nukleinsäuremolekül kodierend für die erfindungsgemäße Variante kann an einen AOXl oder A0X2 Promotor funktionell gebunden sein. Alternativ dazu ist es selbstverständlich möglich für die Expression der erfindungsgemäßen Variante einen anderen Promotor einzusetzen, welcher auch unabhängig von einfachen Alkoholen wie Methanol induzierbar, o-der auch konstitutiv aktiv wie beispielsweise der GAPl Promoter ist.

Zusätzlich ist es auch möglich Varianten von A0X1 und A0X2 Promotoren einzusetzen, die Mutationen aufweisen, um die Eigenschaften der Promotoren zu verändern. Derartige mutierte Promotoren sind beispielsweise in der WO 2006/089329 und in der WO 02/081650 beschrieben.

Besonders bevorzugte Promotorvarianten sind in der WO 2006/089329 beschrieben und umfassen Mutationen (z.B. Deletionen, Substitutionen) der Nukleotide 170 to 235, Nukleotide 170 to 191, Nukleotide 192 to 213, Nukleotide 192 to 210, Nukleotide 207 to 209, Nukleotide 214 to 235, nucleotides 304 to 350, Nukleotide 364 to 393, Nukleotide 434 to 508, Nukleotide 509 to 551, Nukleotide 552 to 560, Nukleotide 585 to 617, Nukleotide 621 to 660, Nukleotide 625 to 683, Nukleotide 736 to, Nukleotide 737 to 738, Nukleotide 726 to 755, Nukleotide 784 to 800 oder Nukleotide 823 to 861 von Seq ID Nr. 8 (Wildtyp AOX1 Promotor) und Kombinationen davon. SEQ ID Nr. 8: ggtaccagatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccac aggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttg caaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagccca gttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggetactaacaccatgac tttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaac aagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagt ttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaa aagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtca aaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaa aaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgcc gaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgctt ccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaa cccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatc atcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacga cttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattgaaagaattcaacc

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines heterologen Proteins oder Polypeptids umfassend die Expression des heterologen

Proteins oder Polypeptids in einer Zelle bzw. Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines heterologen Proteins oder Polypeptids umfassend a) die Bereitstellung einer methylotrophen Wirtszelle umfassend - ein Nukleinsäuremolekül kodierend für das hete-rologe Protein oder Polypeptid, wobei das Nukleinsäuremolekül funktionell mit einem durch Methanol induzierbaren Promotor verbunden ist, und - eine Mutation des in der methylotrophen Wildtyp-Wirtszelle vorkommenden AOXl und A0X2 Gens und/oder dessen Promoters zur Inaktivierung oder Reduktion der Expression der Wildtyp Aoxl und Aox2 Proteine, und b) die Expression des heterologen Proteins oder Polypeptids mit der Wirtszelle gemäß Punkt a).

Der Methanol-induzierbare Promotor ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem A0X1 Promoter, A0X2 Promoter, DAS Promoter, FLDl Promoter und Varianten davon, wobei es besonders bevorzugt ist einen AOXl Promoter oder A0X2 Promoter oder Varianten davon zu verwenden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Wirtszelle zusätzlich ein Nukleinsäuremolekül, eine Expressionskassette oder einen Vektor wie hierin beschrieben .

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung rekombi-nanter Proteine und Polypeptide verwendet werden. Durch die Verwendung methylotropher Wirtszellen, welche keine oder nur eine geringe Alkoholoxidase 1 und/oder 2 Aktivität aufweisen, kann die Menge an eingesetztem Methanol zur Induktion der Expression der heterologen Proteine und Polypeptide deren korrespondierenden Nukleinäuremolküle unter der Kontrolle eines A0X1 Promoters reduziert werden. Es ist auch möglich eine Induktion der Expression ohne Methanol zu erzielen. Dies hat den Vorteil, dass die Menge an Methanol in der Zellkultur reduziert werden kann oder dass gänzlich ohne Methanol gearbeitet werden kann.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Methanol in einer Konzentration von 0,1 bis 2 g/L, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 0,5 g/L dem Nährmedium zugegeben, um die Expression der heterologen Polypeptide und Proteine zu induzieren. Dies ist vor allem bei der

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele eingehender verdeutlicht, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.

Fig. 1 zeigt die Analyse des Wachstums in einem zweiten Rescreening von Genbank Transformanten. Genbank Transformanten wurden bis zur stationären Phase kultiviert und anschließend auf Agarplatten mit Inulin als einziger C-Quelle gespottet um die Levanaseexpression zu bestimmen. Die Spots der Genbank Transformanten (Al bis Hl, A2 bis H2, A3 bis H3 und A4 bis C4), sowie der P. pastoris Stämme GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 (LevSmut-) und CBS 7435 (wt) wurden nach vier Tagen Wachstum in einer G:box gescannt und mit der GeneTools software (SynGene) quantifiziert. Wachstum auf Inulin wurde für den Stamm P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 (in der Fig. bezeichnet als LevSmut-)normalisisert. Die OD600 Werte der Animpfkulturen waren in allen Fällen vergleichbar, so dass ein unverfälschter Wachstumstest auf Inulinplatten möglich war.

Fig. 2 zeigt die Bestimmung der Levanaseaktivität in Kultur-überständen von ausgewählten Genbanktransformanten (Fig.l). Kul-turüberstände verschiedener Genbank Transformanten (A1-B4), sowie der P.pastoris Stämme GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 (LevSmut-) und Wildtyp CBS 7435 (wt) wurden hinsichtlich derer Levanaseaktivität durch Bestimmung der NADH Bildung bei 340 nm über 10 Minuten getestet.

Fig. 3 zeigt die Analyse des Wachstums von Retransfor-manten, die durch Transformation mit PCR-amplifizierter DNA des in der Genbanktransformante B4 (siehe Fig. 1) enthaltenen Genbankfragments, welches ein funktionelles AOXl Gen umfasst, erhalten worden sind. Einige Transformanten, welche das retrans-formierte Genbank Fragment des Stammes B4 (Fig.l) aufweisen sowie entsprechende Kontrollstämme sind bis zur stationären Phase gezüchtet und anschließend auf Agarplatten mit Inulin oder Methanol als einziger C-Quelle gespottet worden. Die Spots sind nach vier Tagen Wachstum in einer G:box gescannt und mit der GeneTools software (SynGene) quantifiziert worden. Neben den Ret-ransformanten, bezeichnet nach den Positionen in der Mikrotiterplatte (Al bis Hl, A2 bis H2, A3 bis H3 und A4 bis H4), sind die in Fig 1 gezeigte Ausgangs-Genbank Transformante B4 (hier als als GL B4 bezeichnet) P.pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 (LevSmut-) und der Wildtypstamm P.pastoris CBS 7435 (wt) dargestellt. Das Wachstum auf Inulin wurde im Verhältnis zum Stamm P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 (in der Fig. bezeichnet als LevSmut-)normalisiert. Die OD600 Werte der Animpfkulturen waren in allen Fällen vergleichbar, so dass ein unverfälschter Wachstumstest auf Inulinplatten möglich war.

Fig. 4 zeigt die Analyse des Wachstums von Transformanten, die durch Transformation von DNA eines Konstrukts mit einem nicht-funktionellen Allel von AOXl. Ausgewählte Transformanten umfassend ein nicht-funktionelles AOXl Allel sowie entsprechende Kontrollstämme sind bis zur stationären Phase angezüchtet und anschließend auf Agarplatten mit Saccharose als einziger C-Quelle gespottet worden. Die Spots sind nach vier Tagen Wachstum in einer G:box gescannt und mit der GeneTools Software (SynGene) quantifiziert worden. Neben den Transformanten, bezeichnet nach den Positionen in der Mikrotiterplatte (Al bis Hl, A2 bis H2, A3 bis H3 und A4 bis H4), sind die in Fig 1 gezeigte Ausgangs-Genbank Transformante B4 (hier als als GL B4 bezeichnet), P.pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 (LevSmut-) und der Wildtypstamm P.pastoris CBS 7435 (wt) dargestellt. Das Wachstum auf Saccharose wurde im Verhältnis zum Stamm P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 (in der Fig. bezeichnet als LevSmut-)normalisiert. Diese Daten zeigen, dass mit Transformanten die das Konstrukts mit dem nicht-funktionellen AOXl Allel enthalten, keine erhöhte Levanase-Expression festgestellt werden konnte.

Fig. 5 zeigt die Bestimmung der Levanaseaktivität in Kul-turüberständen, um die Stämme unter Bedingungen der Induktion durch Methanol hinsichtlich der Expressionsanktivität des AOXl Promotors zu untersuchen. Kulturüberstände von Transformanten mit verschiedenen Aoxl Mutanten, Genbank Fragment Retransforman-ten („aox funct.", „Retransf. H5"), GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 (LevSmut-) und des Wildtyps CBS 7435 (wt) wurden hinsichtlich derer Levanaseaktivität durch Bestimmung der NADH Bildung bei 340 nm nach 20 Minuten (Endpunkt) untersucht. Die Daten wurden in Bezug auf OD600 normalisiert .

Fig. 6 zeigt ein Alignment („Sequenzabgleich") zwischen einen Teil des Aoxl Proteins („AOX1") und der in Hernändez-Ortega et al (Biochemistry 51(2012):6595-6608) beschriebenen Aryl Alkoholoxidase („Aryl"). Hernändez-Ortega et al haben die für die enzymatische Umsetzung eines primären aromatischen Alkohols in ein Aldehyd verantwortlichen und im aktiven Zentrum befindlichen Aminosäurereste identifiziert. Das Alignment zeigt, dass dieselben Aminosäurereste (fett und unterstrichen gekennzeichnet) in einem vergleichbaren Abstand auch im Aoxl Protein zu finden sind. Das erfindungsgemäße Motiv im Aoxl Protein ist kursiv dargestellt .

Fig. 7 zeigt ein Alignment des Aoxl und des Aox2 Proteins. Die Aminosäurereste, die für die enzymatische Aktivität der Proteine verantwortlich sind, sind fett und unterstrichen gekennzeichnet . BEISPIELE:

Beispiel 1: Herstellung und Charakterisierung von Mutanten des Aoxl-Proteins

Material und Methoden

Stämme und Medien

Escherichia coli: Für Klonierungen ist der Escherichia coli Stamm TOPIOF' (In-vitrogen Corporation, USA)verwendet worden. Die Kultivierung von E.coli Stämmen ist in LB Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl) durchgeführt worden. Wenn benötigt sind den Medien Antibiotika zu einer Endkonzentration an pg/ml Ampicillin bzw. 25 pg/ml Zeocin zugesetzt worden. LB Plattenmedien sind durch Zusatz von 20 g/L Agar Agar hergestellt worden.

Pichia pastoris : Für die Konstruktion von rekombinanten Pichia pastoris Stämmen sind die Stämme P. pastoris GS200 (his4, arg4; Herkunft: G.L.P. Lin-Cereghino (FEMS Microbiology Reviews 24 (2000) 45- 66)), P. pastoris CBS 7435 (Wildtyp, Herkunft: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Niederlande), P. pastoris KM71H (arg4, aoxlh::ARG4, Phänotyp Muts, Invitrogen Corporation, USA)und P. pastoris X-33 (Wildtyp, Invitrogen Corporation, USA) verwendet worden.

Zur Kultivierung von P. pastoris sind folgende Medien verwendet worden: YPD Medium (10 g/L Hefeextrakt, 20 g/L Pepton, 20 g/L Glucose)oder BMD Medium (13.4 g/L „yeast nitrogen base" ohne Aminosäuren, 10 g/L Glucose, 0,4 mg/L Biotin, 200 mM Kaliumphosphat, pH 6.0. Plattenmedien sind durch Zusatz von 20 g/L Agar Agar hergestellt worden, Kaliumphosphat ist dabei nur zu einer Konzentration von 100 mM zugesetzt worden. Bei Bedarf wurde den Medien Zeocin zu einer Konzentration von 100 mg/L bzw. die Ami nosäuren Histidin oder Arginin zu einer Konzentration von jeweils 40 mg/L zugesetzt.

Basierend auf dem BMD Medium sind Selektionsmedien durch Ersetzen der Glukose durch andere C-Quellen hergestellt worden: BMM Medium: 0.5 % Methanol BMI Medium: 5 g/L Inulin aus Dahlia tubers (Fluka BioChemi- ka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, CH) BMIMe Medium: Dem BMI Medium sind noch zusätzlich 0.5 % Methanol zugesetzt worden. BMS: 5 g/L Saccharose (Sucrose) BMMS Medium: 0.5 % Methanol, 5 g/L Saccharose BYPD Medium: 1 % Pepton, 0.5 % Hefeextrakt, 1 % Glukose, 200 mM Kaliumphosphat Puffer pH 7.0 BYP0.1%D Medium: 1 % Pepton, 0.5 % Hefeextrakt, 0.1 % Glukose, 200 mM Kaliumphosphat Puffer pH 7.0

Bei Verwendung von Agarmedien mit Methanol als C-Quelle sind die P.pastoris Stämme auf aufgelegte sterile Nylonmembrane (0,2 pm Porendurchmesser)ausgestrichen und zur Kompensation der Verdunstungsverluste die Membrane mit den gewachsenen Stämmen in Abständen von 1-3 Tagen auf frische Agarplatten überführt worden .

PCR PCR Reaktionen sind entweder mit HotStarTaq DNA Polymerase (QIAGEN GmbH, Germany)oder Phusion™ Polymerase (Finnzymes Oy, Finnland)nach den Manualen der Hersteller durchgeführt worden. Für „Overlap-Extension" PCR Reaktionen sind je 10 ng der beiden DNA Matritzen eingesetzt worden. Für die Verifikation von genomischen Konstellationen (Integrationen oder Deletionen - „knockouts" - sind jeweils eine frisch gewachsene Kolonie in 50pL H20 supendiert, für 10 min bei 95 °C inkubiert und anschließend die Zellfragmente bei maximaler Geschwindigkeit in einer Eppendorf 5415R Zentrifuge abzentrifugiert worden. 10 pL des Überstands sind als Matritze in der PCR Reaktion eingesetzt worden.

Die verwendeten Primer sind in der Tabelle 1 angeführt.

Tabelle 1:

Transformation von Pichia pastoris

Zur Anzucht der Zellen sind 50 mL YPD Medium in einem Weit-hals-Erlenmeyer Kolben mit Schikanen mit einer Einzelkolonie des entsprechenden Stammes beimpft und bei 30°C und 110 Upm bis zu einer optische Dichte (OD, 600 nm) von 0,8 - 2,0 gezüchtet worden. Die Herstellung von kompetenten Zellen ist exakt nach bei dem von Lin-Cereghino et al (BioTechnigues 38 (2005) :44, 46, 48) beschriebenen „condensed protocol" durchgeführt worden. Für den Transformationsansatz sind 2 bis 5 pg DNA mit 100 pL der kompetenten Zellen gemischt und für 2 min auf Eis inkubiert worden. Nach der Elektroporation bei 1,5 V, 200 Ohm, 25 pF sind die Zellen in 500 pL 1 M Sorbitol suspendiert und vor dem Plattieren auf das entsprechende selektive Agarmedium für 2 -3 h bei 30 °C ohne schütteln zur Regeneration inkubiert worden. Im Falle der Verwendung von Zeocin-Resistenzkassetten als Selektionsmarker sind dem Ansatz nach 1 h noch 500 pL YPD Medium zugesetzt worden.

Konstruktion eines Reporterstammes

Als Reporter zum Nachweis der Expression von Genen unter der Kontrolle des AOXl Promoters von P. pastoris ist das Levanase Gen von Bacillus subtilis (Friehs K, et al, J Biotechnol 3(1986):333-341) verwendet worden. Das Enzym Levanase hydrolysiert Polyfruktane wie Levane oder Inulin und auch das Disaccharid Saccharose. Der Wildtyp von P.pastoris kann diese Kohlenhyd rate nicht verwerten, wird jedoch das Levanase-Gen funktionell exprimiert kann P. pastoris auf Medien, die eine dieser Substanzen als alleinige C-Quelle enthält, wachsen. Zur Herstellung einer entsprechenden Reporterkassette ist die für das Levanase Protein kodierende Sequenz aus dem Plasmid pKF3 (Friehs K, et al, J Biotechnol 3(1986):333-341) ohne die eigene Signalsequenz aber mit den notwendigen flankierenden Randsequenzen für den Einbau in den P. pastoris Expressionsvektor pPIC9 (Invitrogen Corporation, USA) durch PCR amplifiziert und in pPIC9 einklo-niert worden. Das erhaltene Plasmid ist durch Schneiden mit der Restriktionsendonuklease Bglll linearisiert und in den Stamm P. pastoris GS200 transformiert worden. Histidin-prototrophe Mutanten sind zuerst auf BMM Medium supplementiert mit Arginin auf ihre Fähigkeit zur Verwertung von Methanol getestet worden. Transformanten des Phänotyps Muts („knockout" des AOXl Strukturgens) sind anschließend noch durch PCR Analyse mit den Primerpaaren 5 'AOXl_fwd / alpha-col_rev und downstr ._3 'AOXl_rev / AOXlTT_fwd verifiziert worden. Eine Transformante mit der korrekten Integration („gene replacement") der Levanase-Reporterkassette im AOXl Lokus ist ausgewählt (Bezeichnung P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4) und in weiterer Folge zur Deletion des A0X2 Gens eingesetzt worden. Dazu ist ein DNA Konstrukt hergestellt worden, in dem das ARG4 Gen von P.pastoris flankierend durch „overlap-extension PCR" mit den A0X2 Promoter (5y seitig, 917 bp) bzw. dem A0X2 Terminator (3y seitig, 672 bp) Sequenzen versehen worden ist. Die entsprechenden Fragmente sind unter Verwendung der Primer fpA0X2Pr / rpA0X2Pr bzw. fwdAOX2Te2 / rpA0X2Te mit genomischer DNA des Stammes P. pastoris CBS7435 hergestellt worden. Das A0X2 Gen ist mit DNA des Plasmids pBLARG-IX (Lin Cereghino GP et al, Gene 263(2001):159-169) unter Verwendung der Primer fwdARG4FC2 und rpARG4F amplifiziert worden. Für die „overlap extension PCR" sind 24 bp bzw. 25 bp an homologen Sequenzen zwischen dem ARG4 Gen und dem A0X2 Promoter A0X2 Terminator bzw. dem A0X2 Terminator Fragment zur Verfügung gestanden. Das gesamte Konstrukt ist in den E.coli Vektor pBluescript II SK(-) (Fermentas Inc, USA) via Pstl und Notl ein-kloniert und das erhaltene Plasmid mit pBSII SK(-) AOX2KO bezeichnet worden. Zur Deletion des AOX2 Gens (knockout)ist DNA dieses Plasmids mit der Restriktionsendonuklease EcoRV linearisiert und in den Stamm P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 transformiert worden. Arginin-prototrophe Mutanten sind zuerst auf BMM Medium auf ihre Fähigkeit zur Verwertung von Methanol getestet worden. Transformanten des Phänotyps Mut- („knockout" des AOXl und A0X2 Strukturgens) sind anschließend noch durch PCR Analyse mit den Primerpaaren colonyl / rev4 und colony2 / fwd7 verifiziert worden. Eine Transformante mit der Deletion des A0X2 Gens ist ausgewählt und mit P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 bezeichnet worden.

Konstruktion einer genomischen Genbank DNA des Stamms P. pastoris X-33 ist partiell mit der Rest-riktionsendonuklease Bspl43l (15 mU/pg DNA) for 1 h at 37°C geschnitten worden. Die Enden der Fragmente sind anschließend partiell mit DNA Polymerase I Klenow Fragment unter Zugabe von dATP und dGTP aufgefüllt und in den mit Xhol geschnittenen Vektor pGAPZ A, dessen Enden vorher ebenfalls partiell mit DNA Polymerase I Klenow Fragment (Invitrogen Corporation, USA) unter Zugabe von dCTP und dTTP aufgefüllt worden waren, einkloniert. Transformation der erhaltenen rekombinanten DNA Moleküle in E.coli hat eine Genbibliothek von genomischen Fragmenten mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 4,4 kbp ergeben. Insgesamt 10.500 Klone sind mit dem QPixII Roboter (Genetix, UK) gepickt und in 384 well Mikrotiterplatten als Glycerin-Stammkultur konserviert worden.

Ausgehend von dieser Stammkultur sind die Klone mit einem 384 Nadel-Replikator auf LB Agarplatten geimpft worden. Nach 24 h Inkubation bei 37°C sind die gewachsenen Kolonien in insgesamt 5 ml sterilem Wasser suspendiert worden. Anschließend ist aus diesem Pool an Klonen Plasmid DNA mit dem QIAprep® Spin Miniprep Kit (QIAGEN GmbH, Germany) isoliert worden.

Die erhaltene DNA ist nach Linearisierung in parallelen Ansätzen mit jeweils einem der Enzyme Bhlll, Paql oder Avril und anschließender Vermischung in gleichen Anteilen in den Stamm P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 transformiert worden. Transformanten sind auf BMI Platten mit 50 mg/L Zeocin selektio-niert und nach Picken der Kolonien als Glycerin-Stammkulturen in 96 well Mikrotiterplatten Platten konserviert worden.

Konstruktion von Mutanten des Aoxl Proteins

Die Mutationen sind mit PCR mit Hilfe von mutagenen Primern und „overlap-Extension" PCR in die für das Aoxl Protein codierende Sequenz eingeführt worden. Die Strategie ist so gewählt gewesen, dass ein DNA Fragment erhalten wird, in dem die Mutationen in die AOXl Sequenz des in der Transformante H5 enthalte nen Genbankfragments eingebracht wird. Zur Herstellung der Mutationen an den Positionen His567 und Asn616 sind in einer ersten PCR Reaktion PCR Fragmente mit dem Primer pTeflstart_fwd und jeweils mit dem Primer Aoxlmut616for (Mutante N616A) oder dem Primer AoxlmutH567Afor (Mutante H567A)oder dem Primer AoxlmutH567Nfor (Mutante H567N)oder dem Primer AoxlmutH567Qfor (Mutante H567Q) amplifiziert worden. In einer zweiten PCR Reaktion sind PCR Fragmente mit dem Primer A2int_rev und jeweils mit dem Primer AoxlmutN616Arev (Mutante N616A) oder dem Primer AoxlmutH567Arev (Mutante H567A)oder dem Primer AoxlmutH567Nrev (Mutante H567N)oder dem Primer AoxlmutH567Qrev (Mutante H567Q) amplifiziert worden. In der dritten PCR sind die beiden PCR Produkte der jeweiligen Mutante aus den ersten beiden PCR Reaktionen in einer primerlosen „overlap extension" PCR verbunden worden und anschließend ist das gesamte Fragment nach Zugabe der außenliegenden Primer pTEFlstart_fwd und A2int_rev in einer Standard PCR Reaktion noch amplifiziert worden. In analoger Weise sind auch die Stoppcodons in den Leserahmen des für das Aoxl Protein codierenden Sequenzbereichs des A0X1 Lokus (Primer pTEFlstart fwd und AOX CDSmut rev für die erste PCR und A2int rev und AOX CDSmut fwd für die zweite PCR) sowie in den am dazu komplementären Strang befindlichen Leserahmen (Primer pTEFlstart fwd und AOX CDSmut2 rev für die erste PCR und A2int rev und AOX CDSmut2 fwd für die zweite PCR) eingeführt worden. Die Verbindung der Fragmente durch „overlap extension" PCR sowie die anschließende Amplifikation sind in gleicher Weise wie bei der Herstellung der oben beschriebenen Punktmutationen durchgeführt worden.

Das Ergebnis dieser PCR Reaktionen ist dann ein DNA Fragment gewesen, das das gesamte AOXl Gen mit der ensprechenden Mutation einschließlich der Promoter- und Terminatorbereiche sowie die Zeocinresistenzkassette aus dem Plasmid pGAPZ A enthält. Diese Fragmente mit dem mutierten AOXl Gen sind dann in weiterer Folge zur Analyse des Expressionsverhaltens in den Stamm P. pasto-ris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 eintransformiert worden.

Semi-quantitative Bestimmung der Levanase Expression

Je 300 pL BMD Medium in „96 well footprint depp well" Platten (Bel-Art Products, USA)sind mittels Nadelreplikator mit Zellen der P.pastoris Genbanktransformanten beimpft worden. Nach 48 h Inkubation in einem Multitron II Schüttler (Infors AG,

Schweiz) bei 320 Upm bei 28°C und 80% Luftfeuchte (Zellen sind in der stationären Wachstumsphase) sind die Zellsuspensionen 10-fach und 100-fach verdünnt worden. Mit diesen Verdünnungen sind anschließend verschiedene Agarmedien (BMI, BMIMe, BMM, BMS, ) mit dem 96-Nadelreplikator oder mit einer Multikanalpipette (definiertes Volumen von 5 pL) beimpft worden. Nach Inkubation der Platten für 3-4 Tage bei 28°C oder Raumtemperatur ist das Wachstum der einzelnen Kulturen durch Erfassung der Trübung in einer G:Box (SynGene, Synoptics Ltd., England)bestimmt worden. Dazu ist zuerst ein Image von jeder Platte bei Beleuchtung von oben mit Weißlicht aufgenommen worden. Für die Quantifizierung sind die Images invertiert und die Signale der einzelnen Wells mittels der integrierten GenTools software quantifiziert worden.

Die Signale sind auf die gemittelten Signale des jeweils unter gleichen Bedingungen mitgeführten Referenzstamms (P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4)normiert worden. Photometrische Messung der Levanase Aktivität (Standard Methode)

Zur photometrischen Messung der Levanase Aktivität sind Medien in 96 Well Platten wie oben schreiben beimpft, kultiviert und nach 48 h zur Abtrennung der Zellen für 20 min bei 3200 Upm in einer Eppendorf 5810R Zentrifuge zentrifugiert worden. Je 200 pL der zellfreien Überstände sind mit in Halbmikro Küvetten (Greiner Bio One GmbH, Germany) mit 225 pL Wasser und 475 pL „Glucose UV" Reagens (Dipromed, Austria, Hexokinase basierter Test Kit)gemischt und nach einer min mit 100 pL 10% Saccharoselösung versetzt worden. Die durch Levanase katalysierte Freisetzung von Glukose ist anschließend über Messung der Absorption bei 340 nm über 10 min jede 10 sec bestimmt worden.

Bestimmung der Levanase Aktivität (erweiterte Methode)

Um exakte Bedingungen bei der Anzucht zu gewährleisten und Einflüsse von Restbestandteilen aus den Vorkulturen zu vermeiden sind Analysen des Expressionsverhaltens von einzelnen Stämmen nach einer erweiterten Methode durchgeführt worden. Dazu sind zuerst Vorkulturen durch beimpfen von 10 mL V2 BYPD Medium mit jeweils einer frisch gewachsenen Einzelkolonie und Inkubation in einem Schüttelinkubator für 24 h bei 28°C und 150 Upm angelegt worden. Mit dieser Vorkultur ist eine zweite Kultur durch Beimpfen von 30 ml BYP0.1%D Medium (in 100 mL Erlenmeyer Flaschen mit Schikanen) zu einer OD (600 nm)von 0,2 und Inkubation für 24 h bei 18°C und 120 Upm angelegt worden. Diese zweite Kultur ist anschließend unter sterilen Bedingungen abzentrifugiert (2500 Upm, 5 min)und anschließend im selben Volumen entweder BYP oder BYP0.1%D Medium resuspendiert worden. 200 pL dieser Suspension sind nach Messung der OD (600 nm) in je 8 Wells (eine Reihe) einer Deep Well Platte gefüllt und mit dem gewünschten Substrat in der jeweils gewünschten Konzentration versetzt worden. Anschließend sind die Platten auf einem Titrimax 1000 Schüttler (Heidolph) bei 28 °C und 900 rpm für 12 oder 24 h inkubiert worden. Nach Messung der OD (600 nm) sind die Kulturen in Mikrotiterplatten mit V-Boden (Greiner Bio-One GmbH, Austria)überführt und bei 3000 rpm für 15 min abzentrifugiert (Eppendorf 5810R) worden. 20 pL des Überstands sind anschließend in Mikotiterplatten, Wells befüllt mit je 20 pL 1 % Saccharose Lösung, übertragen und gemischt worden. Nach Inkubation des Ansatzes für 20 min bei Raumtemperatur sind 10 pL auf eine weitere Mikrotierplatte (UV durchlässig), Wells befüllt mit jeweils 190 pL „Glucose UV" Reagens (Dipromed, Austria)übertragen und gemischt worden. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min wurde die freigesetzte Glucose durch Messung der OD (340 nm) in einem Synergy-Mx Biotek plate reader (Biotek GmbH, Germany) nach der Endpunktmethode bestimmt .

Ergebnisse

Etablierung eines Levanase-basierten Selektionssystems.

Das Ziel dieses Beispiels ist die Identifizierung von genetischen Elementen die eine Expression von Genen unter der Kontrolle des AOXl Promoters ohne Zugabe von Methanol oder bei stark reduzierter Zugabe von Methanol ermöglichen. Zu diesem Zweck ist vorerst ein Screeningsystem, dass die Detektion der Erhöhung des Expressionsniveaus von AOXl-Promoter kontrollierten Genen ermöglicht, etabliert worden. Es ist eine auf Wachstum basierte Strategie gewählt und dazu das Levanase Gen von Bacillus subtilis unter die Kontrolle des P. pastoris AOXl Promoters gebracht worden. Als Kohlenstoffquelle ist Inulin oder Saccharose benutzt worden, da diese Kohlenhydrate von P. pastoris dazu nur dann genutzt werden kann, wenn Levanase funktionell expri-miert wird. Daher ist das Wachstum von P. pastoris Stämmen, die das Levanase Gen unter der Kontrolle des AOXl Promoters beinhalten, direkt von der Expressionsaktivität dieses Promoters abhängig .

Um das AOXl Strukturgen durch die Levanase-codierende Sequenz zu ersetzen ist DNA des Plasmids pPIC9-LevS in den Stamm P. pastoris GS200 transformiert worden. Von den erhaltenen Transformanten ist eine mit Muts Phänotyp (schwaches Wachstum auf BMM Agarmedium) ausgewählt, durch PCR Analyse verifiziert und als P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 bezeichnet worden. Im Anschluss daran ist in diesem Stamm noch das A0X2 Gen deletiert worden um beide Alkoholoxidasen auszuschalten. Dies ist durch Transformation von EcoRV geschnittener DNA des Plasmids pBSII SK(-) A0X2K0 in den Stamm P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 durchgeführt worden. Von den erhaltenen Transformanten ist eine mit Mut- Phänotyp (kein Wachstum auf BMM Agarmedium) ausgewählt, durch PCR Analyse verifiziert und als P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 bezeichnet worden.

Der nächste Schritt hat darin bestanden, geeignete Screeningbedingungen zur Identifikation von Transformanten des Stamms P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 die Fragmente einer genomischen Genbibliothek eines P. pastoris Wildtypstammes enthalten und ohne Induktion durch Methanol wachsen können. Das ist dadurch erreicht worden, indem entsprechende Stämme (P. pastoris GS200 und P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4) auf Agarmedien mit Inulin als einziger C-Quelle mit und ohne Methanolinduktion bezüglich des Wachstumsverhaltens untersucht worden sind. Es ist dabei wichtig gewesen, eine klare Unterscheidung zwischen einer basalen und einer erhöhten Expression des Levanase-Gens zu sehen. Letzlich ist das durch Verwendung von BMI Agarmedium (5 g/L Inulin) oder BMS Agarmedium (5 g/L Saccharose) erreicht worden. P. pastoris ohne Levanase Gen (Wildtyp) oder der nicht mit Methanol induzierte Stamm mit dem Levanase Gen unter der Kontrolle des A0X1 Promoters (P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4) haben kein signifikantes Wachstum gezeigt. Beim Stamm P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 mit dem Levanase Gen unter der Kontrolle des A0X1 Promoters ist bei Induktion mit Methanol gutes Wachstum auf Inulin enthaltendem Medium (BMIMe Medium) jedoch auf BMM kein signifikantes Wachstum feststellbar gewesen. Das hat klar gezeigt, dass Wachstum dieses Stammes auf BMIMe Platten durch die Aktivität der exprimierten Levanase bedingt ist.

Identifizierung von genetischen Elementen die Levanase Expression verstärken

Eine P.pastoris Genbibliothek bestehend aus durchschnittlich 4,4 kbp großen genomischen Fragmenten von DNA des P. pastoris Wildtypstamms X-33 ist in 5 unabhängigen Ansätzen in den Stamm P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 transformiert worden. Die DNA ist zuvor mit 3 verschiedenen Restriktionsendonuk- leasen linearisiert worden um das Risiko zu reduzieren, dass die in den Genbank-Klonen enthaltenen Gene dabei durch möglicherweise für eines der Enzyme enthaltene Schnittstellen zerstört werden. Nach 5 Tagen Inkubation auf selektivem Agarmedium sind insgesamt ca. 20000 Transformanten erhalten worden. Unter diesen sind in einem primären Screening 45 auf BMI schneller wachsende Klone identifizert worden. Nach zwei Rescreening Runden sind letztlich 27 klar auf Medium mit Inulin als einziger C-Quelle (BMI) schneller als der Kontrollstamm P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 wachsende und somit erhöhte Levana-se-Expression zeigende Klone Vorgelegen (Fig. 1). In einem Kon-trollexperiment wurde DNA des leeren Vektors pGAPZ A anstelle der Genbank DNA in P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 transormiert. Aus diesem Ansatz konnten keine Klone mit erhöhtem Wachstum auf BMI Medium gefunden werden. 10 aus diesen 28 Transformanten zufällig ausgewählte Klone sind auch mit dem photometrischen Assay auf Levanase-Aktivität im Kulturüberstand getestet worden. Alle haben im Vergleich zum Kontrollstamm P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 signifikant höhere Aktivitäten gezeigt (Fig. 2). Diese Ergebnisse haben sehr gut mit den Ergebnissen des auf Wachstum basierten Screeningassays korreliert womit auch belegt werden konnte, dass diese Transformanten genetische Elemente enthalten müssen, die ohne Metaholinduktion erhöhte Expression des Levanase Gens unter der Kontrolle des AOXl Promoters bewirken. In weiterer Folge sind von diesen 10 näher charakterisierten Klonen die Inserts mit PCR (Primer pGAPbasal fwd und Segl rev) amplifiziert und die PCR-Produkte anschließend seguenziert worden. Das überraschende Ergebnis ist gewesen, dass 9 von den 10 Transformanten das gesamte AOXl Gen einschließlich der Promoter- und Terminatorregionen, insertiert im 51 stromaufwärts des AOXl Promoters gelegenen Genombereichs, enthalten haben. Durch die Gegenwart eines intakten AOXl Gens ist gefunden worden, dass diese Stämme auf BMM wachsen konnten, also den Mut+ Phänotyp aufgewiesen haben. Das hat einen Hinweis darauf gegeben, dass das AOXl Protein neben der enzymatischen Aktivität eine autoregulatorische Funktion aufweist.

Autoregulatorische Eigenschaft des AOXl Lokus

Um zu bestätigen, dass die Integration des AOXl Gens für die verstärkte Levanase Expression verantwortlich ist, ist ein Fragment, das das AOXl Gen einschließlich 2 kbp upstream Region und die Zeocin Resistenzkassette von pGAPZ A mittels PCR aus genomischer DNA der Tränstormante B4 als Matrize und den Primern pTeflstart_fwd und A2int_rev amplifiziert worden. Diese DNA ist anschließend in den Stamm P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 transformiert worden. Einige zufällig ausgewählte Zeocinresistente Transformanten sind in gleicher Weise wie für die Genbank_Transformanten oben beschrieben analysiert worden. Praktisch alle analysierten Klone haben verstärktes Wachstum auf BMI Agarmedium gezeigt (Fig. 3)und alle haben den Mut+ Phänotyp aufgewiesen. Im Gegensatz dazu hat die Transformation eines Fragments, das nur die Zeocin Resistenzkassette und den 2 kbp upstream Bereich enthält, keine Klone mit verstärktem Wachstum ergeben. Daraus konnte geschlossen werden, dass der für das Aoxl Protein codierende Bereich des AOXl Gens für den Effekt der erhöhten Levanase-Expression verantwortlich ist.

Innerhalb des AOXl Strukturgens existiert noch ein offener Leserahmen (ORF) auf dem zum Aoxl Protein codierenden komplementären DNA Strang, der für ein Protein von 474 Aminosäuren codieren könnte. Um eine mögliche Rolle dieses ORF in der Regulation des AOXl Promoters auszuschließen, sind in das oben beschriebene zur Retransformation verwendete Fragment zwei Stoppcodons in diesen Leserahmen durch „overlap extension PCR" so eingefügt worden, dass im für das Aoxl Protein codierenden Bereich nur stille Mutationen vorliegen, somit die Aoxl Proteinsequenz nicht verändert wird. Transformation dieses Fragments in P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 hat ergeben, dass dieselben Ergebnisse wie mit dem unmutierten Fragment erhalten werden konnten. Transformanten haben den Mut+ Phänotyp sowie erhöhte Levanase-Expression gezeigt. Die Anwesenheit der Mutationen ist durch Sequenzierung von Kolonie-PCR Produkten von Transformanten verifiziert worden.

In weiterer Folge sind, um zu testen ob ein funktionelles Aoxl Protein für die Erhöhung der Levanase-Expression benötigt wird, in das Retransformations-Fragment Mutationen so in die A0X1 codierende Sequenz eingefügt worden, dass die A0X1 Sequenz 2 Stoppcodons enthält. Die nach Transformation des mutierten Fragments in P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 erhaltenen Klone sind nach Verifizierung der Anwesenheit der Mutationen durch Sequenzierung von Kolonie-PCR Produkten wiederum auf erhöhte Levanase-Expression und auf Methanolverwertung getestet worden. Levanase-Expression ist in diesem Fall durch Tes- ten des Wachstums auf BMS Medium durchgeführt worden. Da Levanase auch Saccharose hydrolysiert ist dieses Medium in gleicher Weise geeignet, was durch entsprechende Kontrollen verifiziert werden konnte. Das Ergebnis hat gezeigt, dass keine der Transformanten verstärktes Wachstum auf Agarmedium mit Saccharose als alleinige C-Quelle zeigt (Fig. 4). Nicht-Wachstum auf BMM Medium hat auch den erwarteten Mut- Phänotyp bestätigt. Aus diesen Ergebnissen konnte geschlossen werden, dass nur ein intakt expri-miertes Aoxl Protein in der Lage ist, eine erhöhte Expression des unter der Kontrolle des A0X1 Promoters stehenden Levanase Gens unter Methanol-freien Bedingungen erhöhen kann.

Mutanten des AOXl Proteins

Hernändez-Ortega et al (Biochemistry 51(2012):6595-6608) haben beschrieben, dass im aktiven Zentrum von Alkoholoxidasen Paare von entweder zwei Histidin Resten oder einem Histidin und einem Asparagin Rest eine wichtige Rolle in der katalytischen Funktion besitzen. Aus Sequenz-„Alignments" konnten die entsprechenden Positionen im Aoxl Protein mit Histidin 567 und Asparagin 616 identifiziert werden (Fig. 6). Es sind Varianten des AOXl Gens hergestellt worden, in denen His 567 zu Alanin, Asparagin oder Glutamin bzw. Asp 616 zu Alanin ausgetauscht worden ist. Diese Genvarianten sind in derselben wie oben für die Ret-ransformation beschriebenen Fragmentkonstellation eingebracht worden. Nach Transformation in P. pastoris GS200 aoxlA::LevSHIS4 aox2A::ARG4 sind die erhaltenen Transformanten wiederum auf das Wachstumsverhalten auf Agarmedien mit Inulin (BMI Medium) oder Saccharose (BMS Medium) sowie auf die Verwertung von Methanol (BMM Medium) getestet worden. Aus den Daten konnte gesehen werden, dass alle Stämme beinhaltend Mutanten von AOXl auf BMS Medium nur sehr schwaches Wachstum zeigten. Überraschenderweise zeigte jedoch die Mutante N616A starkes Wachstum auf BMS Medium mit Methanol. Die anderen Mutanten zeigten hier nur schwaches Wachstum. Das Wachstumsverhalten auf BMM Medium war wie erwartet für alle Mutanten negativ.

In weiterer Folge sind die oben beschriebenen Transformanten mit den Konstrukten, die die verschiedenen Varianten des AOXl Gens enthalten, hinsichtlich der Levanase-Expression nach der erweiterten Methode zur Bestimmung der Levanase Aktivität in Kulturüberständen untersucht worden. Dazu sind die Stämme in verschiedenen Medien mit und ohne Methanol angezüchtet worden.

Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Auf den Medien ohne

Methanol konnte keine signifikanten Unterschiede bei den einzelnen Stämmen gesehen werden. Überraschenderweise konnte aber bei Methanolinduktion gesehen werden, dass die Retransformante mit der N616A Mutation im Vergleich zu den anderen Mutantionsvarian-ten des Aoxl Proteins eine stark erhöhte Expression der Levanase zeigt, die auf demselben Niveau wie die ursprüngliche Transfor-mante H5, die ein funktionelles AOXl Gen aufweist, liegt. Auch die Retransformante mit dem Fragment aus der ursprünglichen Transformante B4 hat erhöhte Expression gezeigt, aber auf etwas niedrigerem Niveau. Aus diesen Daten konnte abgeleitet werden, dass das Aoxl Protein der Variante N616A zwar keine katalytische Aktivität besitzt, aber noch effizient als positiv regulatorisches Protein wirken kann.

Claims (18)

1. Ansprüche : 1. Variante eines Alkoholoxidase Proteins, insbesondere eines Alkoholoxidase 1 (Aoxl, „alcohol oxidase 1") Proteins oder eines Alkoholoxidase 2 (Aox2) Proteins, welche in der Lage ist einen A0X1 Promotor zu induzieren und welche eine geringere enzymatische Aktivität aufweist als das Wildtyp-Alkoholoxidase 1 oder 2 Proteins.
2. 2. Alkoholoxidase Variante gemäß Anspruch 1 umfassend ein Motiv mit der Aminosäuresequenz PDNX1GX2X3TY (SEQ ID Nr. 1), wobei Χχ Valin oder Prolin, X2 Cystein, Glycin, Alanin, Serin oder Threonin und X3 eine beliebige Aminosäure ausgenommen Asparagin ist.
3. 3. Alkoholoxidase Variante gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Motiv die Aminosäuresequenz PDNVGCX3TY (SEQ ID Nr. 2) umfasst.
4. 4. Alkoholoxidase Variante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Variante eine Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von mindestens 90%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, insbesondere von mindestens 99%, aufweist.
5. 5. Alkoholoxidase Variante gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Motiv mit dem substituierten Aminosäurerest die Aminosäuresequenz PDNVGCATY (SEQ ID Nr. 3) umfasst
6. 6. Alkoholoxidase Variante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Variante die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 45 aufweist.
7. 7. Alkoholoxidase Variante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkoholoxidase aus einer Pilzzelle, insbesondere eine Hefezelle, stammt.
8. 8. Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Alkoholoxidase Variante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
9. 9. Expressionskassette umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 8.
10. 10. Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 8 oder eine Expressionskassette gemäß Anspruch 9.
11. 11. Rekombinante Zelle umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 8, eine Expressionskassette gemäß Anspruch 9 oder einen Vektor gemäß Anspruch 10.
12. 12. Zelle gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Pilzzelle, vorzugsweise eine Hefezelle, ist.
13. 13. Zelle gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine methylotrophe Zelle ist und die Zelle ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein heterologes Protein oder Polypeptid umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül kodierend für ein heterologes Protein oder Polypeptid funktionell mit einem durch Methanol induzierbaren Promoter verbunden ist, und eine Mutation des in der methylotrophen Wildtyp-Zelle vorkommenden AOX1 und AOX2 Gens und/oder dessen Promoters zur Inaktivierung oder Reduktion der Expression der Wildtyp Aoxl und Aox2 Proteine umfasst.
14. 14. Zelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine methylotrophe Zelle ist und die Zelle ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein heterologes Protein oder Polypeptid umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül kodierend für ein heterologes Protein oder Polypeptid funktionell mit einem durch Methanol induzierbaren Promoter AOXl oder A0X2 oder DAS oder FLDl Promoter oder Methanol-induzierbaren Varianten davon verbunden ist, und eine Mutation des in der methylotrophen Wildtyp-Zelle vorkommenden AOXl und A0X2 Gens und/oder dessen Promoters zur Inaktivierung oder Reduktion der Expression der Wildtyp Aoxl und Aox2 Proteine umfasst.
15. 15. Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines heterologen Proteins oder Polypeptids umfassend die Expression des heterologen Proteins oder Polypeptids in einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14.
16. 16. Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines heterologen Proteins oder Polypeptids umfassend a) die Bereitstellung einer methylotrophen Wirtszelle umfassend - ein Nukleinsäuremolekül kodierend für das hete-rologe Protein oder Polypeptid, wobei das Nukleinsäuremolekül funktionell mit einem durch Methanol induzierbaren Promotor verbunden ist, und - eine Mutation des in der methylotrophen Wildtyp-Wirtszelle vorkommenden AOXl und A0X2 Gens und/oder dessen Promoters zur Inaktivierung oder Reduktion der Expression der Wildtyp Aoxl und Aox2 Proteine, und b) die Expression des heterologen Proteins oder Polypeptids mit der Wirtszelle gemäß Punkt a).
17. 17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Methanol-induzierbare Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem A0X1 Promoter, A0X2 Promoter, DAS Promoter, FLDl Promoter und Varianten davon.
18. 18. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle zusätzlich ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 8, eine Expressionskassette gemäß Anspruch 9 oder einen Vektor gemäß Anspruch 10 umfasst.