CN109082434A - 一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株 - Google Patents

一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种毕赤酵母载体的制备方法，包括将包含α分泌信号肽基因和多克隆位点的基因片段正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中。可获得携带α分泌信号肽并具有多克隆位点的毕赤酵母空载体，实现了不同目的基因的定向克隆和在毕赤酵母菌中的蛋白表达与分泌，并免于抗生素筛选。此外，本发明还提供一种毕赤酵母载体，以及应用该载体构建得到的重组毕赤酵母菌株。

Description

一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株。
背景技术
毕赤酵母是真菌表达体系家族的重要一员，利用它作为宿主进行外源基因的表达已经得到越来越多的应用。目前利用毕赤酵母进行蛋白表达的载体主要分为两大类：胞内表达载体和分泌型载体。其中，典型的胞内表达载体如质粒pAO815，如图1所示，该载体只有1个单克隆位点EcoRI，外源基因插入载体后需要确定正确的插入方向才能进行蛋白的表达，且蛋白表达后无法分泌到培养基中，需要对酵母细胞进行破壁处理再进行收集，增加了工艺步骤和生产成本，此外，由于该载体上存在His4基因，可以与毕赤酵母his4菌株进行互补，为选择毕赤酵母重组菌株提供筛选标记，具体地，在电转化酵母后能整合到酵母的基因组上，只有整合成功的毕赤酵母可以在组氨酸营养缺陷型培养基(如MD平板)上生长，整合到GS115菌株获得的表型为His+Mut+，从而在不需要采用抗生素进行阳性转化子的筛选的情况下获得目的表型菌株。而质粒pPIC9K和质粒pPICZαA均为典型的分泌型表达载体，均携带有α分泌信号肽基因和抗生素标记，其中，α分泌信号肽基因表达的α分泌信号肽是使目的基因表达的蛋白分泌的细胞外的关键；除此之外，与胞内表达载体不同的是，其以抗生素标记作为筛选标记，在质粒电转进入酵母后，抗生素基因即整合到毕赤酵母基因组上，使得该毕赤酵母具有相应的抗生素抗性，因而可以在含特定抗生素的培养基中生长，从而利用该方法可以获得转化成功的毕赤酵母重组菌株，例如，pPIC9K携带有G418(遗传霉素)标记，在表达外源蛋白时需要采用抗生素G418筛选高拷贝表达菌株，但G418价格昂贵，采用G418进行体内筛选高拷贝菌株的成功率较低。而pPICZαA携带博来霉素标记，则需要采用博来霉素进行筛选，但是，博来霉素具有毒性，价格不菲，操作过程需要避光，在实际工业生产中，采用大量的抗生素会增加成本，且存在相应的潜在风险。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种经改造的毕赤酵母载体及其制备方法和应用，该载体携带有α分泌信号肽基因以及便于目的基因定向插入的多克隆位点，能适用不同来源和种类的目的基因的导入，避免了为获得不同分泌型重组载体的反复构建，且在导入目的基因后，能方便获得免抗生素筛选的分泌型高拷贝表达菌株，且简化了操作步骤，降低了生产成本，提高了安全性。
为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种毕赤酵母载体的制备方法，其步骤包括：
将包含α分泌信号肽基因的基因片段正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中，得到α重组载体，其中，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因上游的EcoRI位点和下游的多克隆位点，其中，所涉及的酶切位点包括经酶切的相应黏性末端。
可选地，所述基因片段插入所述毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点后获得包含如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的α重组载体。
可选地，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因与其上游EcoRI之间的Kozak序列。
可选地，所述胞内表达载体为pAO815。
可选地，所述多克隆位点为顺次连接的BsmI、AvrII、NotI和EcoRI。
可选地，所述制备方法还包括，采用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列为引物扩增毕赤酵母分泌型载体中的α分泌信号肽基因，并经EcoR I酶切，得到带相应黏性末端的所述基因片段。
可选地，所述制备方法的步骤还包括：
采用定点突变法，选择性地对α重组载体上的酶切位点进行改造，所述α重组载体上的酶切位点包括位于α分泌信号肽基因内及其上下游的酶切位点。
所述制备方法的步骤还包括：
采用定点突变法，将如图3所示的位于所述α重组载体上依次含EcoRI位点、Kozak序列、α分泌信号肽基因、BsmI位点、AvrII位点、NotI位点和EcoRI位点的核苷酸序列改造为如图4所示的依次含Kozak序列、α分泌信号肽基因、EcoRI位点、AvrII位点、NotI位点和XhoI位点的核苷酸序列。
进一步地，所述依次含EcoRI位点、Kozak序列、α分泌信号肽基因、Bsm I位点、AvrII位点、NotI位点和EcoRI位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述依次含Kozak序列、α分泌信号肽基因、EcoRI位点、AvrII位点、Not I位点和XhoI位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
可选地，所述胞内表达载体为pAO815，所述引物突变法的步骤包括：
对所述α重载体的SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，采用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物定点突变掉Kozak序列上游的EcoRI酶切位点；采用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物定点突变掉α信号肽序列中的XhoI酶切位点，同时将α分泌信号肽下游端的α个BsmI位点突变为EcoRI；采用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物定点突变掉Not I酶切位点下游的EcoRI酶切位点，同时引入XhoI酶切位点。
可选地，采用所述定点突变法用于将如SEQ ID NO:1所示序列的基因片段突变为SEQ ID NO:2所示序列的基因片段。
可选地，所述毕赤酵母分泌型载体选自pPIC9K、pPICZαA、pPICZαB或pPICZαC。
为了实现本发明的目的，本发明还提供一种毕赤酵母载体，其由前面所述毕赤酵母载体的制备方法所制备得到。
一种毕赤酵母载体，其包括pAO815质粒除去单克隆位点以外的全长基因和如SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
前面所述毕赤酵母载体在构建含目的基因且免抗生素筛选的分泌型重组表达载体中的应用，包括：将待表达的目的基因插入前面所述毕赤酵母载体的多克隆位点。
一种毕赤酵母重组载体，其包括前面所述毕赤酵母载体除多克隆位点以外的全长基因和待表达的目的基因。
为了实现本发明的目的，本发明还提供一种重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌中含有由前面所述的毕赤酵母载体与目的基因构建得到的免抗生素筛选的分泌型重组表达载体。
本发明的有益效果
本发明提供一种毕赤酵母重组载体及其制备方法和应用，通过将包含α分泌信号肽基因和至少一个酶切位点的基因片段正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中，获得一种新的毕赤酵母载体，可实现不同目的基因的定向克隆插入和在毕赤酵母菌中的蛋白表达与分泌，避免了为获得不同分泌型重组载体的反复构建，且连入载体时有更多的可选择酶切位点，便于实现定向克隆，避免了酶连后需进行方向验证来筛选连入方向正确的转化子，并能在α分泌信号肽的作用下，方便获得免抗生素进行阳性转化子筛选的分泌型表达菌株，无需破壁收集，又避免工业化生产中抗生素的使用。并具有表达和分泌所述目的基因编码的蛋白的功能
此外，在α分泌信号肽基因上游引入KOZAK序列，进一步加强了插入的目的基因编码蛋白的表达，通过引物突变改变酶切位点，进一步提高了目的基因引入的便利性和适用广度。
附图说明
图1为胞内表达载体pAO815质粒的图谱；
图2为本发明实施例2经定点突变后获得的毕赤酵母载体的图谱；
图3为引物定点突变前载体中α片段的酶切位点图谱；
图4为引物定点突变后载体中α片段的酶切位点图谱；
图5为构建pAO815α质粒后经PstI和XhoI双切后的凝胶电泳验证结果；
其中，M为含10000,8000,6000,5000,4000,3000,2500,2000,1500,1000,750,500bp的DNA Marker；1为pAO815α原质粒经PstI和XhoI双切后的碱基片段；2～4为选取的不同组pAO815α/DH5α阳性菌落PCR产物经PstI和XhoI双切后的碱基片段。
图6为构建pAO815α-HA重组质粒后PCR扩增产物的凝胶电泳验证结果；
其中，M为含10000,8000,6000,5000,4000,3000,2500,2000,1500,1000,750,500bp的DNA Marker；
图7为构建pAO815α-2HA重组质粒后选取四组经sacI和SalI双酶切后的凝胶电泳验证结果；
其中，M为含10000,8000,6000,5000,4000,3000,2500,2000,1500,1000,750,500bp的DNA Marker；
图8为构建含HA基因表达载体的重组酵母菌的凝胶电泳验证结果；
其中，M为含10000,8000,6000,5000,4000,3000,2500,2000,1500,1000,750,500bp的DNA Marker；1,7为以单独GS115菌株基因组扩增作为负对照；2,8为以pET22b-HA质粒作为模板的PCR产物作为阳性对照；3～4为对pAO815α-HA电转GS115后挑选的重组子的PCR产物；5～6为对pAO815α-2HA电转GS115后挑选重组子的PCR产物；9～11:为对pPICZαA-HA电转GS115后挑选重组子的PCR产物。
图9为为96h后取培养基上清浓缩后进行SDS-PAGE电泳的实验结果；
其中，M为含200,150,120,100,85,70,60,50,20,15,10KD标准分子量的蛋白质Marker；1为A1-2号重组子pAO815α-2HA/GS115的上清液；2为A1-4号重组子pAO815α-HA/GS115的上清液；3为B1-1号重组子
pPICZαA-HA/GS115的上清液；4为B 1-2号重组子pPICZαA-HA/GS115的上清液；5为B 1-3号重组子pPICZαA-HA/GS115的上清液。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1
1.α分泌信号肽序列的获取与加工
1.1引物设计
以pPIC9K为模板，设计上游引物α-F和下游引物α-R，引物如下所示，
其中，下划线所示为EcoRI酶切位点：
α-F：atagaattcgccaccatgagatttccttca
α-R：atagaattcgcggccgccacgagcctaggggccgcgcattcagcttcagcctctcttttctcg
1.2α分泌信号肽基因的扩增
利用设计的引物α-F和α-R通过PCR扩增出含α分泌信号肽基因的序列，其中，PCR反应体系如下表1所示，
表1.PCR反应体系1
且PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸30s，72℃总延伸3min，循环次数为30次。
扩增结束后取5μl进行凝胶电泳验证，剩余的进行PCR产物回收，得到扩增出来的含α分泌信号肽基因的扩增片段，其上游端带EcoR I酶切位点及Kozak序列，下游端依次为Bsm I、Avr II、Not I、EcoR I酶切位点，然后采用EcoR I酶切该片段获得相应的含α分泌信号肽的基因片段，即α片段，
2.载体处理：酶切及回收
另外，采用EcoR I酶切pAO815空载体，然后进行去磷酸化处理，反应体系如下表2所示，反应条件为，在37℃下反应1小时，然后在75℃下反应10min，最后通过凝胶回收得到的线性载体。
表2.去磷酸化反应体系1
3.α片段酶切产物与线性载体的连接
3.1连接
将线性载体与经过EcoR I酶切扩增片段回收得到的α片段产物在16℃下酶连反应2小时，酶连体系如下表3所示，连接得到pAO815α载体
表3.酶连反应体系1
pAO815α载体中被连入的α片段连接完成后形成如下所示的核苷酸序列：gaattcgccaccatgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctgaagct gaatgcgcggcccctaggctcgtggcggccgcgaattc。
3.2验证筛选
将连接后的质粒pAO815α转化入DH5α感受态细胞中，均匀涂于LB(A+)板37℃培养16h，待平板上长出单菌落后，挑选菌落至10μl双蒸水中溶解，取5μl作为模板，进行PCR验证，找出阳性重组菌，剩余5μl转移至Amp抗性的LB培养基中培养；其中，PCR反应体系如下表4所示。
表4.PCR反应体系2
PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸30s，72℃总延伸3min，循环次数为30次。
PCR结束后取5μl进行凝胶电泳，若能扩增出305bp大小的条带，表明酶连成功，则从相应的液体培养基中提取质粒，然后通过酶切以选择正向连接的克隆子。具体地，采用PstI和XhoI双切质粒，在37℃下酶切1小时，酶切体系如下表5所示，正向连接则切下大小为2050bp和5970bp的片段，反向连接则切下大小为1851bp和6169bp的片段。将正向连接的克隆进行扩大培养，提取质粒送测序，测序无误后对相应克隆进行保菌。从琼脂糖凝胶电泳图(图5)上可看出2号克隆为对应片段大小的阳性克隆，送测序后表明为正向连接。进行甘油保菌。
表5.酶切反应体系
在确定α片段正确连入到pAO815载体上的EcoR I酶切位点后，即获得重组的新载体pAO815α，其酶切位点如图3所示，其中，在连接后的α片段上游端有一个EcoRI酶切位点，其下游端依次为Bsm I、Avr II、Not I、EcoR I酶切位点。
在本实施例中，Kozak序列的引入，使得本发明构建的载体在插入外源目的基因之后，能够大幅提高外源基因的表达，提高目标蛋白的产量。但是，α片段中的Kozak序列的缺失并不妨碍本发明技术方案的实现，具体的，可在制备过程中，采用不含Kozak序列的引物构建新载体。
值得说明的是，α片段下游端酶切位点的引入数量可以是1个，2个，3个或者更多，当引入的酶切位点的数量为多个时，它们之间尽可能地互不相同。
实施例2
1.重组载体pAO815α的定点突变
根据实施例1得到的pAO815α载体，为了后续方便地在载体中的α信号肽基因后面引入目的基因，使用引物突变法，通过设计引物，对重组载体进行点突变，以屏蔽某些酶切位点，并引入新的酶切位点。
具体地，
设计引物M1-F和M1-R，突变掉α片段上游端的EcoR I的酶切位点。
设计引物M23-F和M23-R，突变掉α片段上α信号肽基因中的XhoI酶切位点，同时将α片段下游端的第一个BsmI位点突变为EcoR I。
设计引物M45-F和M45-R，突变掉α片段下游端Not I酶切位点后面的EcoRI酶切位点，同时邻近地引入XhoI酶切位点。
其中涉及的突变引物的核苷酸序列如下所示：
M1-F：attcgaaacgaggaagtcgccaccatgaga
M1-R：tctcatggtggcgacttcctcgtttcgaat
M23-F：gaagaaggggtatctcttgagaaaagagaggctgaagctgaattcgcggcccctaggctc
M23-R：gagcctaggggccgcgaattcagcttcagcctctcttttctcaagagataccccttcttc
M45-F：gcccctaggctcgaggcggccgcgagttcgccttagacat
M45-R：atgtctaaggcgaactcgcggccgcctcgagcctaggggc
以上引物均为突变所用，为基本的分子生物学技术，现以M1-F和M1-R引物突变掉α片段上游端的EcoR I酶切位点举例详述。
以pAO815α为模板，进行PCR，PCR体系如下表6所示。
表6.PCR反应体系3
PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸6min，72℃总延伸5min，循环次数为20次。
反应结束后取5μl电泳检测，剩余进行DpnI酶37℃消化0.5小时，用以切除甲基化的模板质粒，反应体系如下表7所示，
表7.DpnI酶消化反应体系
消化完毕后进行转化至DH5α感受态细胞中，挑单克隆培养后进行测序验证突变是否成功。
采用引物M1-F和M1-R定点突变重组载体的类似方法，可以使用其它引物对前述突变验证成功的底物进行进一步的突变。
通过对pAO815α中的α片段定点突变以后，进一步构建得到如图2所示的新的载体，pAO815α载体中原来的α片段被改造为包含由Kozak序列、α分泌信号肽基因、EcoR I酶切位点、Avr II酶切位、Xho I酶切位点和Not I酶切位点顺次连接的基因片段，其酶切位点如图4所示，其具体核苷酸序列如下所示：
gaagtcgccaccatgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctcttgagaaaagagaggctgaagctgaattcgcggcccctaggctcgaggcggccgcgagttc。
根据实施例1和实施例2构建完载体后，可以适用于将不同的目的基因插入到pAO815α载体中α分泌信号肽的之后的多克隆位点中，并且可选择地通过EcoR I、Avr II、Xho I、Not I 4个位点中的任意一个或两个插入，可实现定向克隆，并可在电转至酵母后通过MD平板筛选阳性转化子，且蛋白表达时可直接分泌至培养基中，工业化生产时既避免了使用抗生素，又省去了酵母破壁这一工艺环节。
实施例3
1.pAO815α-HA基因重组载体的构建
以引物HA-F：CGCgaattcATGAGCATTATCGTTATC(小写为EcoRI位点)，和HA-R：ATActcgagATGGTGATGATGATGATG(小写为XhoI位点)，对预先构建的pET22b-HA质粒进行PCR扩增，经EcoRI和XhoI双切，并经Axygen凝胶回收试剂盒回收后获得的含HA基因的片段与同样经过EcoRI和XhoI双切后回收的pAO815α在16℃进行酶连1小时，pAO815α酶切体系以及酶连体系分别如下表8和下表9所示。
表8 pAO815α基因双切体系
表9 pAO815α-HA酶连体系
2.重组载体的鉴定
酶连结束后，进行转化涂布Amp+平板，37℃培养14小时。挑选平板上的单菌落进行PCR验证，PCR验证体系如下表10所示。
表10.PCR反应体系
扩增出HA基因的大小为800bp时，进一步对该阳性转化子培养，提取质粒送测序进行验证。测序正确的克隆子命名为pAO815α-HA。
琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示：图中可看出约在800bp处有一条特异性条带，与HA基因大小一致，确认为正确的重组子。将PCR产物送测序后鉴定表明与目的基因序列一致，对该正确的重组子进行保菌。
实施例4
双拷贝pAO815α-2HA的构建
1.表达盒的获取
将实施例3中阳性克隆子进行增菌，提取质粒pAO815α-HA，采用BamHI和Bgl II双切，获得HA基因的表达盒,双酶切体系如下表11所示：
表11 pAO815α基因双切体系
37℃酶切1小时，双切完成后采用Axygen凝胶回收试剂盒进行回收。
2.pAO815α-HA的线性化
采用BamHI对pAO815α-HA进行线性化，酶切体系如下表12所示：
表12.去磷酸化反应体系1
37℃酶切1小时，线性化后采用Axygen PCR clean up试剂盒进行回收。
回收后采用碱性磷酸酶进行磷酸化，磷酸化体系为如下表13所示：
表13.去磷酸化反应体系1
在37℃下反应1小时，然后在75℃下反应10min，最后通过Axygen凝胶回收试剂盒回收得到的去磷酸化的线性化载体。
3.pAO815α-2HA的构建和鉴定
表14.pAO815α-2HA酶连体系
16℃酶连2小时，酶连结束后，进行转化涂布Amp+平板，37℃培养14小时。挑选平板上的单菌落共4个进行增菌提取质粒，并进行双酶切鉴定。双酶切体系如下表15所示：
表15.pAO815α基因双切体系
37℃酶切1小时，双酶切后依次产生2360bp、3730bp、5250bp的片段，经过琼脂糖凝胶电泳，结果如图7，从图可知，2号为构建成功的双拷贝pAO815α-2HA质粒，对相应菌株进行保菌。
实施例5
1.对照组重组载体pPICZαA-HA的构建
将实施例3中回收酶切的含HA基因的片段同时连入经过EcoRI和XhoI酶切回收的酵母载体pPICZαA中，该载体已突变掉α信号肽上的XhoI位点，因而可以采用EcoRI和XhoI进行基因克隆。测序正确后命名为pPICZαA-HA。
2.重组质粒的酵母菌株转化
将步骤1和实施例3所得的重组质粒pAO815α-HA和pPICZαA-HA分别转化至大肠杆菌DH5α中，挑取单菌落进行摇瓶培养后大量抽提质粒，以单菌落为准。利用限制性内切酶SalI对pAO815α-HA进行线性化单酶切，利用限制性内切酶PmeI对pPICZαA-HA进行线性化单酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切线性化完全后，对酶切载体进行胶回收。
制备新鲜的GS115酵母感受态细胞，将线性化的载体电转化至GS115酵母感受态细胞中，同时转化线性化pAO815和pPICZαA空载体作为对照，电转条件为：2000V，25μF，400Ω，电击5ms。电击完后，迅速加入1mL预冷的1M的山梨醇溶液，混合后将菌液转移至1.5mL EP管中，放入30℃水浴1h。水浴结束后，将pAO815α-HA、pAO815α-2HA及空载体pAO815α转化后的菌液涂布MD平板,平板编号为A1、A2、A0，将pPICZαA-HA及空载体pPICZαA转化后的菌液涂布于含有100μg/mLZeocin的YPD平板上，平板编号为B1号和B0号，将平板放置于30℃恒温培养箱中避光培养2～4天至转化子长出。
3.重组酵母菌的筛选及鉴定
挑取上述线性载体转化后在A1号、A2号和B1号平板上长出的重组子于液体YPD培养基中，从A1号平板中挑选2个重组子分别编号A1-1、A1-2，从A2号平板中挑选2个重组子分别编号A2-1、A2-2于含有100ug/mL Amp和Kan双抗的YPD培养基培养，从B1号平板中挑选三个重组子分别编号B1-1、B1-2、B1-3，于100ug/mL Zeocin的YPD培养基并避光培养，36小时后利用酵母基因组提取试剂盒对重组子菌液进行总DNA的抽提，取少量总DNA为模板，对重组子进行PCR反应，PCR反应所用引物分别为HA-F和HA-R，PCR反应体系如下表16所示。
表16.PCR反应体系
琼脂糖凝胶电泳结果如图8所示：图8中1为负对照(GS115酵母菌总DNA模板PCR产物)，2和8为正对照(pET22b-HA质粒模板PCR产物)，12为阴性对照，3～6分别为A1-1、A1-2、A2-1、A2-2重组子PCR产物，9～11为B1、B2、B3重组子PCR产物，可看出图中4(编号A1-2)、6(编号A2-2)、9(编号B1-1)、10(编号B1-2)、11(编号B1-3)约在800bp处有一条特异性条带，与正对照中HA基因片段大小一致，确认为正确的酵母重组子。将PCR产物送测序后鉴定表明与目的基因序列一致，对该正确的重组子进行保菌。
步骤4.重组酵母菌的表达
将步骤3所得PCR鉴定为阳性的重组酵母菌A1-2和A2-2以及B1-1、B1-2和B1-3接种于BMGY液体培养基中，30℃、250rpm条件下摇瓶过夜培养直至OD600＝2-6，室温4000rpm离心5min，去除上清，收集细胞，用BMMY液体培养基重悬细胞至OD600＝1左右，进行诱导表达，每24小时加入甲醇至终浓度为0.5％-1％以继续诱导，28℃、250rpm条件下摇瓶培养。分别取0、24、48、72、96、120、144h的样品，利用SDS-PAGE检测各时间段蛋白表达情况。图9为96h后取培养基上清进行SDS-PAGE电泳的实验结果，图9中：M为蛋白质标记，1～2分别为A2-2和A1-2重组子在96小时后的培养基上清，经过浓缩后上样。3-5分别对应B1-1、B1-2和B1-3编号的重组子在96小时后的培养基上清，经过浓缩后上样。从图上看到，1、2、5号泳道均出现30KD大小清晰条带，说明与预测蛋白相对分子质量一致，而1号由于是双拷贝质粒(pAO815α-2HA)，其泳道蛋白含量明显更多，表明双拷贝表达了更多的蛋白至培养基上清，充分说明，利用pAO815α载体构建的重组毕赤酵母菌株具有高拷贝表达和分泌目的基因编码的蛋白的功能，与其它同类载体相比，不仅避免了昂贵的抗生素筛选和潜在的抗生素的毒性，而且避免了体内筛选高拷贝菌株的工作量和不确定性，利于大幅度提高生产效率，并节约成本。
由实施例3和实施例4对构建得到的毕赤酵母载体的应用可知，通过引入含α分泌信号肽基因和多克隆位点的基因片段对pAO815载体改造，获得分泌型表达载体，能够实现目的基因从原核表达载体如pET系列载体向该载体的定向转移，在本实施例中，如选用EcoRI和XhoI或者EcoRI和SalI这两个酶切位点，均可以实现目的基因从原核表达载体中定向连入本发明实施例1或2构建的载体中，避免了原载体pAO815单克隆位点只有一个目的基因插入该载体时酶连会出现反向连接的情况。
综上所述，本发明提供一种毕赤酵母重组载体及其制备方法和应用，通过将包含α分泌信号肽基因和多克隆位点的基因片段正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中，获得一种新的毕赤酵母载体，可实现不同目的基因的定向克隆在毕赤酵母菌中的蛋白表达与分泌，实现了不同目的基因自原核表达载体向本发明提供的毕赤酵母载体，即真核表达载体的转移，避免了为获得不同分泌型重组载体的反复构建，以及酶连后需进行方向验证来筛选连入方向正确的转化子，并能在α分泌信号肽的作用下，方便获得免抗生素进行阳性转化子筛选的分泌型表达菌株，无需破壁收集，又避免工业化生产中抗生素的使用。
此外，在α分泌信号肽基因上游引入KozaK序列以及方便地后续人工体外构建高拷贝的表达盒，进一步加强了的目的基因编码蛋白的表达和分泌，通过引物突变改变酶切位点，进一步提高了目的基因引入的便利性和适用广度。
序列表
<110> 深圳上泰生物工程有限公司
<120> 一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 317
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcgcca ccatgagatt tccttcaatt tttactgctg ttttattcgc agcatcctcc 60
gcattagctg ctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaa cggcacaaat tccggctgaa 120
gctgtcatcg gttactcaga tttagaaggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc 180
aacagcacaa ataacgggtt attgtttata aatactacta ttgccagcat tgctgctaaa 240
gaagaagggg tatctctcga gaaaagagag gctgaagctg aatgcgcggc ccctaggctc 300
gtggcggccg cgaattc 327
<210> 10
<211> 317
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaagtcgcca ccatgagatt tccttcaatt tttactgctg ttttattcgc agcatcctcc 60
gcattagctg ctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaa cggcacaaat tccggctgaa 120
gctgtcatcg gttactcaga tttagaaggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc 180
aacagcacaa ataacgggtt attgtttata aatactacta ttgccagcat tgctgctaaa 240
gaagaagggg tatctcttga gaaaagagag gctgaagctg aattcgcggc ccctaggctc 300
gaggcggccg cgagttc 327
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attcgaaacg aggaagtcgc caccatgaga 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctcatggtg gcgacttcct cgtttcgaat 30
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaagaagggg tatctcttga gaaaagagag gctgaagctg aattcgcggc ccctaggctc 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagcctaggg gccgcgaatt cagcttcagc ctctcttttc tcaagagata ccccttcttc 60
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcccctaggc tcgaggcggc cgcgagttcg ccttagacat 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgtctaagg cgaactcgcg gccgcctcga gcctaggggc 40
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atagaattcg ccaccatgag atttccttca 30
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atagaattcg cggccgccac gagcctaggg gccgcgcatt cagcttcagc ctctcttttc 60
tcg 65

Claims (10)

1.一种毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤包括：
将包含α分泌信号肽基因的基因片段，正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中，得到α重组载体，其中，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因上游的EcoRI位点和下游的多克隆位点。
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因与其上游EcoRI位点之间的Kozak序列。
3.根据权利要求1所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括:
采用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列为引物扩增毕赤酵母分泌型载体中的α分泌信号肽基因，并经EcoR I酶切，得到带相应黏性末端的所述基因片段,其中，所述多克隆位点为顺次连接的BsmI、AvrII、NotI和EcoRI位点。
4.根据权利要求1所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤还包括：
采用定点突变法，选择性地对所述α重组载体上的酶切位点进行改造，所述α重组载体上的酶切位点包括位于α分泌信号肽基因内及其上下游的酶切位点。
5.根据权利要求3所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，
所述制备方法的步骤还包括：
采用定点突变法，将所述α重组载体上依次含有EcoRI位点、KozaK序列、α分泌信号肽基因、BsmI位点、AvrII位点、NotI位点和EcoRI位点的且如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列改造为含Kozak序列、α分泌信号肽基因、EcoRI位点、AvrII位点、NotI位点和XhoI位点顺次连接而成的如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，
所述毕赤酵母胞内表达载体为pAO815，所述定点突变法的步骤包括：
对所述α重载体的SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，采用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物，定点突变掉Kozak序列前的EcoRI位点；并采用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示引物定点突变掉α分泌信号肽基因序列中的XhoI位点，同时将α分泌信号肽基因后的BsmI位点突变为EcoRI；以及采用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示引物定点突变掉NotI位点后的EcoRI位点，同时引入XhoI位点。
7.一种毕赤酵母载体，其特征在于，所述载体由权利要求1至6任一项所述毕赤酵母载体的制备方法所制备得到。
8.一种毕赤酵母载体，其特征在于，所述载体包括pAO815质粒除去单克隆位点以外的全长基因和如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
9.如权利要求7或8所述毕赤酵母载体在构建含目的基因且免抗生素筛选的分泌型重组表达载体中的应用，包括：将待表达的目的基因定向插入权利要求7～8任一项所述毕赤酵母载体的多克隆位点。
10.一种重组毕赤酵母菌株，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌中含有由权利要求7或8所述的毕赤酵母载体与目的基因构建得到的免抗生素筛选的分泌型重组表达载体。
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