CN100999738A - 一种高效表达甘露聚糖酶的多拷贝基因载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基因工程菌的表达载体及其由多个表达单元构建的多拷贝基因载体，特别是涉及一种对甘露聚糖酶基因进行高效分泌表达的表达载体及其多拷贝体：针对毕赤酵母pAO815中的克隆位点，设计引物，将目的表达载体中的多克隆位点区域置换成为Not I、XhoLI、EcoR I，形成多克隆位点，便于克隆；将α－因子信号肽与目的基因融合后连接到表达载体上，使含目的基因的表达载体能够分泌表达甘露聚糖酶；再利用限制性内切酶Bgl II和BamHI得到粘性末端能互补的原则，通过酶切、连接与转化操作，获得含甘露聚糖酶基因的多拷贝表达单元的质粒，转化毕赤酵母后，能高效表达甘露聚糖酶，用于从魔芋粉中制备甘露低聚糖。

Description

一种高效表达甘露聚糖酶的多拷贝基因载体

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌的表达载体，特别是涉及一种对甘露聚糖酶基因进行高效分泌表达的多拷贝表达载体及其构建引物。

技术背景

植物的主要成分是纤维素，半纤维素和木质素。其中甘露聚糖是半纤维素的第二大组份，分布非常广泛。研究发现，甘露聚糖具有低热、稳定、安全无毒等良好的理化性质，同时还具有保护肠道和提高免疫力等作用，可作为保健食品及精细化工产品，具有广阔的市场前景和商业利益。为此，近年来，国内外相继开展低聚糖的生产与应用研究。目前，占市场份额最多的功能性低聚糖产品仍然是属于普通级的低聚糖，即产品干基中仅含有30％～50％的有效成分，而高纯度的功能性低聚糖则属于市场急需的紧缺型产品，迫切需要开发。

众所周知，制备高纯度低聚糖的方法主要有：凝胶过滤色谱法、纳米滤膜法、发酵法、离子交换色普法、葡萄糖异构酶转换法、多酶法(葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶偶联)及聚糖酶酶解魔芋精粉法。这些方法或者成本过高，或者产品难以提纯，或者工艺复杂，大多数不适合工业化大规模生产。其中，利用微生物发酵制备甘露聚糖酶，进而由魔芋粉等半纤维资源中通过酶反应获得甘露低聚糖，是制备天然保健食品的有效而安全的途径，倍受人们关注。

β-甘露聚糖酶又称为β-1，4-甘露聚糖酶，是一类能够水解含β-1，4-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等)的水解内切酶，属于半纤维素酶类，可广泛应用于食品、保健、医药、饲料、造纸和纺织等工业领域。近年来，随着对自然界半纤维素资源的开发利用，β-甘露聚糖酶的研究已经成为研究的热点。国内已有多家单位，如中科院微生物研究所、南开大学等相继报道利用发酵法得到甘露聚糖酶的研究，但所报道的酶活性低、酶解产物纯度低、生产成本高，难以进行工业化开发。

毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)是用于表达外源蛋白的最成功的表达系统之一，近年来发展极为迅速，目前已有200多种蛋白在该表达系统中得以表达(CreggJM，CereghinoJL，Shi JY，et al.，Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J]，Mol Biotechnol，2000，16(1)，23-52)。毕赤酵母属甲醇营养型酵母菌，其生长迅速，培养条件简单，可以高密度连续培养，遗传操作技术比较成熟。

毕赤酵母表达系统包括胞内表达和分泌表达两种方式，其中分泌表达由于其表达量高，糖基化完全，二硫键和高级结构形成正确，尤其是后续分离纯化简单方便而备受青睐。

例如，专利03118984.9(一种酵母基因工程菌及β-甘露聚糖酶制剂和甘露低聚糖的生产方法)提出一种高效表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌的构建方法，用构建环境基因组文库的方法及PCR技术，将从环境微生物中筛选出的β-甘露聚糖酶基因克隆到毕赤酵母整合表达载体并导入到毕赤酵母中，再从中筛选出高效表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌，进而能表达β-甘露聚糖酶，转化制备甘露低聚糖。

但是，现有的酵母表达载体，对外源基因进行分泌表达时，表达蛋白往往存在着不正确的N端序列，这些多出的氨基酸残基会影响和改变所表达的蛋白的结构和功能(Goda S，Takano K，Yamagata Y，et al.Effect of extra N-terminal residues on the stability and folding ofhuman lysozyme expressed in Pichia pastoris[J]，Protein Eng，2000，13(4)，299-307)。并且，现有的甘露低聚糖酶的表达载体，均为单拷贝体，其表达量与表达活性均不是很高。

专利CN02117906.9(对外源基因进行正确分泌表达的多拷贝酵母表达载体)提供了一种能够使外源基因在酵母中正确分泌表达的多拷贝酵母表达载体，载体上含有大肠杆菌复制起点Col E1和氨苄青霉素及卡那霉素两个抗性基因，可以使毕赤酵母进行多拷贝插入，能正确分泌表达外源蛋白，测序结果显示分泌表达的蛋白与天然蛋白结构一致。

然而，针对由魔芋粉转化甘露低聚糖的甘露聚糖酶的制备，目前尚没有多拷贝的表达方式。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程的手段，构建一种可高效表达甘露聚糖酶的多拷贝基因载体。

本发明通过设计引物，将目的表达载体中的多克隆位点区域置换成为NotI、XhoLI、EcoRI，形成多克隆位点，方便基因的克隆。同时，通过使用融合PCR方法，将α-因子信号肽与目的基因融合，克隆到毕赤酵母内源表达载体pAO816(pAO815的衍生载体)中，使其具有分泌表达甘露聚糖酶的能力。再利用限制性内切酶Bgl II和BamH I酶切的DNA粘性末端能互补的原则，通过酶切、连接与转化操作，获得含甘露聚糖酶基因的多拷贝表达单元质粒，完成多拷贝表达载体的构建。

本发明所使用的目的表达载体是毕赤酵母pAO816，所构建的表达载体的单拷贝表达单元具有如表1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，其多拷贝表达载体的核苷酸序列在此表达单元基础上叠加。

表1核苷酸序列(SEQ ID No：1)

18116124132140148156164172180188196110411121120112811361144115211601168117611841192120012081216122412321240124802561

agatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattcgaaacgaggaattgcggccgcatgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctgaagcttacgaagcgcatactgtgtcgcctgtgaatcctaatgcccagcagacaacaaaaacagtgatgaactggcttgcgcacctgccgaaccgaacggaaaacagagtcctttccggagcgttcggaggttacagtcatgacacattttctatggctgaggctgatagaatccgaagcgccaccgggcaatcgcctgctatttatggctgcgattatgccagaggatggcttgaaacagcaaatattgaagattcaatagatgttagctgcaacggcgatttaatgtcgtattggaaaaatggcggaattccgcaaatcagtttgcacctggcgaaccctgcctttcagtcagggcattttaaaacaccgattacaaatgatcagtataaaaaaatactagattcttcaacagcagaaggaaagcggctaaatgccatgctcagcaaaattgctgacggactgcaagagctggagaaccaaggtgtgcctgttctgttcaggccgctgcatgaaatgaacggtgaatggttttggtggggacttacatcatataatcaaaaggataatgaaagaatctctctatataaacagctctacaagaaaatctatcattatatgaccgacacaagaggactagatcatttgatttgggtttactctcccgacgccaaccgagattttaaaactgatttttacccgggcgcgtcttacgtggatattgtcggattagatgcgtactttcaagatgcctactcgatcaatggatacgatcagctaacagcgcttaataaaccacttgcttttacagaagttggcgcgcaaacagcaaacggcagcttcgattacagcctgttcatcaatgcaataaaacaaaaatatcctaaaaccatttacttcctcgcatggaatgatgaatggagcccagcagtaaacaagggtgcttcaggtttatatcatgacagctggacactcaataagggagaaatatggaatggcgattctttaacgccaatcgttgaatgactcgagaattcgccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagacgttcgtttgtgcggatcc

80160240320400480560640720800880960104011201200128013601440152016001680176018401920200020802160224023202400248025602588

本发明所设计的构建引物，具有如表2所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。

表2核苷酸序列(SEQ ID NO：2)

LinkerA	a-factora-factor	信号肽上游引物信号肽下游引物	5-aag，gcggccgc，atgagatttccttcaatttttac-35-gtaagcttcagcctc，tcttttctcgagag-3
				LinkerB		man的上游引物man的下游引物	gaggctgaagcttac，gaagcgcatactgtgtcgccaag，ctcgag，tcattcaacgattggcgttaaaga

本发明所构建的载体为多拷贝表达载体，其拷贝数为两个或两个以上。

本发明所构建的载体的表达基因，是通过以甘露聚糖酶为模板，在含5-溴尿嘧啶的PCR体系中的错配机制引入甘露聚糖酶基因的突变而实现的。

本发明所构建的多拷贝载体转化到毕赤酵母后，能高效分泌表达甘露聚糖酶，用于从魔芋粉中制备甘露低聚糖或者是其他的工业用途。

本发明是这样实现的：

建基因组文库获得甘露聚糖酶，针对其两端设计引物，以甘露聚糖酶为模板，在PCR体系中加入浓度为1％～10％的5-溴尿嘧啶溶液，利用在5-溴尿嘧啶体系中基因扩增所产生的错配，将突变引入到甘露聚糖酶基因中，再用LB+AP+0.3％魔芋粉+0.5％Trypon-blue平板进行筛选，挑选筛选水解圈大的基因，即为构建载体所需的表达基因，命名为man37-1。

取毕赤酵母的商业化表达质粒pAO815，针对其EcoR I的线性化，设计一对Linker，该Linker具有表2所示的核苷酸序列，可将pAOP815中的多克隆位点区域(MCS区域)置换成为Not I、XhoL I、EcoR I等克隆位点，形成3个以上的限制性酶切位点(附图1)。Linker在94℃温浴5分钟后自然降温到常温，然后与EcoR I线性化的pAO815相连，经转化后得到重组子，命名为pAO816(附图2)。

将来自pPIC9K的α-因子信号肽(α-SS)与基因man37-1进行PCR融合，方法为：①设计引物LinkerA(表2)，扩增α-SS，在其上游引物区引入Not I位点，PCR得到250bp的片段；②设计man37-1的引物LinkerB(表2)，其上游引物带有的15个碱基与LinkerA的下游引物匹配，其下游引物引入XhoL I位点，PCR得到去SS序列的man的全长。③取以上Not I-α-SS片段、man-XhoL I片段各1μL作为模板，以Linker A的上游引物和Linker B的下游引物分别为融合片段的上、下游引物做PCR，得到一个全长为1.4kb左右的片段，命名为α-man。

将载体pAO816用限制性内切酶Not I与XhoL I做酶切，α-man也同时用这两个酶做酶切，连接转化，得到可依靠α-SS指导的man分泌的单体质粒，命名为pAO816-α-man。

以Bgl II和BamH I酶切pAO816-α-man质粒，得到一个2.7kb的片段，同时将pAO816-α-man质粒用BamH I单酶切，得到一个9kb的质粒，利用Bgl II和BamH I得到粘性末端能互补的原则，将两种片段用NEB Ligase连接过夜并且转化，抽提转化子的质粒，再用Bgl II和BamH I的酶切转化子的质粒，得到5.4kb左右的带，该质粒命名为2-man-pAO，即为二拷贝甘露聚糖酶表达单元的质粒。

用同样的方法依此类推，可得到能高效表达甘露聚糖酶的四拷贝、六拷贝等的质粒，即可高效表达甘露聚糖酶的多拷贝基因载体。

附图说明

附图1为本发明所设计构建引物引入MCS区域多克隆位点的示意图。

附图2为本发明表达载体的构建示意图。

附图3为本发明表达载体的酶切鉴定图。其中，p2表示二拷贝，p4表示四拷贝，p8表示八拷贝的酶切图谱。

附图4为本发明多拷贝体的构建的操作流程图。

附图5为甘露聚糖酶表达活性的标准曲线。

附图6为甘露低聚糖的质谱分析图。

实施例

实施例1甘露聚糖酶产生菌的筛选

取陈年草垛下土壤，在：2％魔芋粉，0.5％硫酸铵，0.5％磷酸氢二钾，0.1％硫酸镁培养基、30℃、180rpm中进行富集培养。10天后取上清液，按照10～1000的比例稀释涂布平板，该平板由LB培养基、0.3％魔芋粉和0.5％Trypon-blue组成。30℃下静置培养16h后，观察平板上的透明圈，挑选透明圈大的菌作为甘露聚糖酶产生菌man37。

实施例2甘露聚糖酶基因的克隆

将甘露聚糖酶产生菌用LB培养基在30℃下静置培养培养过夜后，按照如下方法提取其基因组DNA：将培养好的菌体用1.5mL的离心管、12000rpm下离心2～3min，收集菌体；将菌体悬浮于200μL TE(pH8.0)中，加入20mg/mL溶菌酶50μL，37℃保温30min；加入裂解液Buffer 400μL，用高速振荡法破碎细胞；再加入300μL 5M NaCL液体，混匀，12000rpm下离心15min；转移上清液至另一新离心管，加入等体积氯仿后轻柔混匀，用12000rpm离心5min；再转移上层水相至另一新离心管，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA；用70％乙醇洗涤、干燥后溶于TE备用。提取的DNA用Sau3A I部分酶切，获得主带在3～15kb的系列片断。胶回收其中大小为4～10kb的片断。

取载体pBluescript，经BamH I酶切使其线性化，用PROMEGA公司的CIP试剂进行去磷酸化处理，再与以上胶回收的4～10kb的片断进行连接(片断100ng，载体20ng，用NEB的连接酶和缓冲液在16℃下连接过夜)。

将连接后的产物转化大肠杆菌DH5a，在由LB培养基、100μg/mLAP、0.3％魔芋精粉和0.4％Trypon-blue组成的平板上37℃下培养14个小时以上，筛选有透明圈的单克隆菌落，即得到甘露聚糖酶基因的克隆菌。

将以上重组菌在由LB培养基和终浓度100μg/mL的AP组成的培养基中振荡，培养，提取质粒。质粒的提取方法为：将含有质粒的菌株接入补加了氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃摇床培养至饱和状态。取1.5mL培养液于小离心管12,000rpm离心2～3min收集菌体，去上清液。用100μL溶液I重悬菌体并于室温静置5min。加入200μL溶液II，迅速混匀，在冰上放置5min。加入150μL溶液III，迅速混匀，在冰上放置5min。12,000rpm离心10min，取上清400μL至另一干净的小离心管中，加入800μL无水乙醇沉淀DNA。用12,000rpm离心5min，去上清后用1mL 70％的乙醇洗沉淀。沉淀干燥后用30μLTE缓冲液溶解，测序，结果显示，与已知的枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶(AY601725，Kweun，M.A.，et al，Mannanase productionby a soybean isolate，Bacillus subtilis WL-7，Hanguk Misaengmul Saengmyong Konghakhoe Chi31，277-283，(2003)；Yoon，K.-H.，Direct Submission，(19-APR-2004)School of Applied Foodand Nutritional Science，Woosong University，17-2，Jayang-dong，Dong-gu，Daejeon，300～718，Korea)相比，同源性达到99％(表1)。

实施例3甘露聚糖酶的定向诱变

取已知的甘露聚糖酶，针对其两端设计引物，以甘露聚糖酶为模板，在PCR体系中加入浓度为1％～10％的5-溴尿嘧啶溶液，使用rTaq DNA聚合酶进行PCR(条件为94℃ 4min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，35cycles；72℃ 5min；4℃保持)，利用在5-溴尿嘧啶体系中基因扩增所产生的错配，将突变引入到甘露聚糖酶基因中，再用由LB培养基、100μg/mL的AP、0.3％魔芋粉及0.4％Trypon-blue的平板进行筛选，挑选筛选水解圈大的基因，即为构建载体所需的表达基因，命名为man37-1。

实施例4毕赤酵母载体的改造

取毕赤酵母的商业化表达质粒pAO815，针对其EcoR I的线性化，设计两条部分互补的linker，该linker具有表2所示的核苷酸序列，可将pAO815中的MCS区域置换成为Not I、XhoL I、EcoR I等克隆位点，形成3个以上的多克隆位点。方法为两条linker在94℃保温5分钟，然后自然降温到室温(即退火)。退火后与线性化的pAO815相连，经转化后得到重组子，命名为pAO816(附图2)。

实施例5突变的甘露聚糖酶基因与载体的融合

将来自pPIC9K的α-因子信号肽(α-SS)与基因man37-1进行PCR融合，方法为：①设计引物Linker A(表2)，用高保真的DNA聚合酶pyrobest扩增α-SS，在其上游引物区引入Not I位点，进行PCR(条件为94℃ 4min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35cycles；72℃5min； 4℃保持)，得到250 bp的片段；②设计man37-1的引物Linker B(表2)，其上游引物带有的15个碱基与Linker A的下游引物匹配，其下游引物引入XhoL I位点，PCR得到去SS序列的man的全长。③取以上Not I-α-SS片段、man-XhoL I片段各1μL作为模板，以Linker A的上游引物和Linker B的下游引物分别为融合片段的上、下游引物做PCR，得到一个全长为1.4kb左右的片段，命名为α-man。

实施例6带信号肽的甘露聚糖酶基因的克隆

将载体pAO816用限制性内切酶Not I与XhoL I做酶切，α-man也同时用这两个酶做酶切，再将处理后的片段和处理后的载体用NEB的ligase连接过夜，转化DH5α菌株后，得到可依靠α-SS指导的man分泌的单体质粒，命名为pAO816-α-man。

得到的转化子首先以5’AOX的引物及man的下游引物，以转化子为模板做菌落PCR。PCR为阳性结果所对应的转化子用LB+AP振荡抽提其质粒，用EcoR I酶切验证重组，取酶切正确的两个质粒α、β进行测序，结果是融合产物插入到载体的合适地方，没有发生移码和突变。

实施例7甘露聚糖酶系列多拷贝的构建

以Bgl II和BamH I酶切pAO816-α-man质粒，得到一个2.7kb的片段，同时将pAO816-α-man质粒用BamH I单酶切，得到一个9kb的质粒，利用Bgl II和BamH I得到粘性末端能互补的原则，将两种片段用NEB Ligase16℃连接过夜并且转化大肠杆菌DH5a(转化采用冰浴30分钟后42℃热激法)。抽提转化子的质粒，再用Bgl II和BamH I的酶切转化子的质粒，得到5.4kb左右的带，该质粒命名为2-man-pAO，即为二拷贝甘露聚糖酶表达单元的质粒。

依此类推，可得到了双拷贝、三拷贝、四拷贝、五拷贝等的质粒，分别命名为3-man-pAO，4-man-pAO等。

实施例8甘露聚糖酶双拷贝表达质粒的转化及酶的诱导表达

用含甘露聚糖酶基因的多拷贝表达单元质粒转化毕赤酵母GS11S、KM71、SMD1168等菌株后，能高效表达甘露聚糖酶，用于从魔芋粉中制备甘露低聚糖。

制备毕赤酵母感受态细胞：将毕赤酵母(GS115，KM71，SMD1168)接种于YEPD平板上活化，挑单菌落于10mL YEPD液体培养基，30℃，250rpm培养过夜后，转接培养物至新的YEPD液体培养基中，使初始OD600≈0.1，于30℃，250rpm培养至OD600≈0.5～0.8，用8,000rpm离心3min，收集菌体，再用50mL Buffer A重悬菌体，离心收集菌体，用4mL BufferA重悬菌体，并按每管0.2mL分装至无菌的2mL冻干管，加11μL DMSO混匀后快速放入液氮中，30min后转至-70℃储存备用。

转化毕赤酵母：在尚未融化的感受态细胞中加入待转化的DNA和线性单链DNA，即含甘露聚糖酶基因的双拷贝表达单元质粒，在37℃水浴中5min，其间轻柔混合样品1-2次，再加入Buffer B 1.5mL，充分混匀后，置于30℃水浴中1h后，用6,000rpm离心10min，去上清，用1.5mL Buffer C重悬菌体，6,000rpm下离心5min，去上清，用0.2mL Buffer C重悬菌体，将重悬的菌液涂布相应的选择平板，28℃倒置培养2-4d，获得毕赤酵母转化子。

实施例9甘露聚糖酶表达活性的测定

绘制标准曲线：

取9支大试管，分别按下表加入各种试剂(其中，DNS为3，5-二硝基水杨酸)，建立标准曲线，每5min产生1mg还原糖的酶量为一个单位。

管号	0	1	2	3	4	5	6	7	8
										糖总量(mg)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	1.4	1.6
标准甘露糖(ml)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1	1.2	1.4	1.6
										双蒸水(ml)	2.0	1.8	1.6	1.4	1.2	1.0	0.8	0.6	0.4
DNS液(ml)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
										加热	在沸水浴中加热5分钟
冷却	立即用流动冷水冷却
										双蒸水(ml)	21.5	21.5	21.5	21.5	21.5	21.5	21.5	21.5	21.5
OD520	0	0.121	0.281	0.433	0.588	0.741	0.905	1.033	1.154

2.酶解液中含糖量的测定

取一支大试管，分别加入酶解液1mL，双蒸水1mL，DNS试剂1.5mL混匀后在沸水浴中加热5分钟，立即用流动冷水冷却，补加21.5mL双蒸水，混匀，用分光光度计测定OD520值，在标准曲线上查出对应含糖量。

实施例10甘露聚糖酶表达菌发酵魔芋粉中制备甘露低聚糖

取含甘露聚糖酶基因的多拷贝表达单元质粒转化毕赤酵母菌，在含有胰蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖(5％～10％、10％～20％、10％～20％，特别是8％、16％、16％)的培养基中，220rpm、30℃下培养48h后，5000rpm下离心，将分离出的上清液与磨芋粉按照(5％～40％∶95％～60％，特别是10％∶90％)的比例混和，在30℃～60℃(特别是42℃)之间搅拌24～48h(如36h)，至不溶性磨芋粉降解可溶性的甘露低聚糖。由质谱图(附图6)中可以看出，分子离子峰为689.4，是一个四糖的钠峰(分子量666)。

Claims (8)

1.一种基因工程菌的表达载体，其特征在于具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述，其特征在于所构建的载体为多拷贝体表达载体，其拷贝数为两个以上。

3.如权利要求1所述，其特征在于所构建载体的表达基因，是通过以甘露聚糖酶为模板，将在含5-溴尿嘧啶的PCR体系中发生的错配引入甘露聚糖酶基因的突变而实现的。

4.如权利要求1和2所述，其特征在于所述引物可将目的表达载体中的多克隆位点区域置换成为Not I、XhoL I、EcoR I等多克隆位点。

5.如权利要求1所述，其特征在于所构建的载体是由α-因子信号肽与目的基因通过融合后连接到表达载体上，含有能够分泌表达甘露聚糖酶的目的基因。

6.如权利要求1所述，其特征在于所构建的载体为多拷贝表达载体，是利用限制性内切酶Bgl II和BamH I酶切可得到粘性末端能互补的原则，通过酶切、连接与转化操作，获得含甘露聚糖酶基因的多拷贝表达单元的质粒。

7.如权利要求1所述，其特征在于所构建的载体转化到毕赤酵母菌株后，能高效表达甘露聚糖酶。

8.如权利要求1和7所述，其特征在于所构建的载体，可用于从魔芋粉中制备甘露低聚糖或者是其他的工业用途。

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