CN101134968A - 一种高效表达木聚糖酶基因的方法及在纸浆漂白工艺中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效表达木聚糖酶基因的方法，特别是涉及一种木聚糖酶基因多拷贝载体的构建，以及在纸浆漂白工艺中的应用：通过对毕赤酵母pAO815的改造，利用多拷贝技术，将筛选到的木聚糖酶表达基因以多拷贝的形式与表达载体融合并连接，获得含木聚糖酶基因的多拷贝表达单元的质粒，转化毕赤酵母后，能高效表达木聚糖酶。这种酶应用于纸浆漂白的工艺流程中，可明显减少用氯量，增加纸浆白度，提高纸浆的裂断长、撕裂度和耐折度，并降低废水污染负荷。

Description

一种高效表达木聚糖酶基因的方法及在纸浆漂白工艺中的应用

技术领域

本发明涉及一种高效表达木聚糖酶基因的方法，特别是涉及一种木聚糖酶基因多拷贝载体的构建，以及在纸浆漂白工艺中的应用。

技术背景

木聚糖是一种在植物体内大量存在的半纤维素，半纤维素是仅次于纤维素之后含量第二丰富的可利用自然资源。木聚糖的降解是对其广泛利用的首选步骤。木聚糖酶(xylanase，EC3.2.1.8)是一类能够特异降解木聚糖的酶类，是木聚糖降解过程中最关键的酶，能够以内切方式作用于木聚糖主链，降解产生不同长度的低聚木糖和少量的木糖。木聚糖酶可广泛应用于生物转化、食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业。

制浆造纸工业是国民经济的重要支柱，但它带来的环境污染也是极其严重的，特别是漂白废水。随着人们对环境保护问题的关注，如何减小制浆造纸业的污染成为热门的研究方向。传统的用氯漂白方式一直被认为是纸浆漂白最经济又有效的漂白方法，但含氯漂剂在漂白过程中会产生二噁英。二噁英是一种强烈的致癌物质。为了减小纸浆漂白对环境的污染和人类健康的损害，国际上已经展开了代替氯化漂白段的研究，纸浆的无元素氯漂白和全无氯漂白成为必然的趋势。

有文献1报道(生物技术在制浆造纸工业应用及其最新进展[J]，广东造纸，1999，(5)，30)，木聚糖酶可以降解纸浆中的木聚糖，同时降解纸浆中与残余木素连接的半纤维素，破坏了LCC(木素碳水化合物)，使浆中半纤维素含量降低，纤维细胞壁结构变得松弛，形成脱木素或有利于脱木素的状态。一些研究资料(文献2：Use of hemicellulollytic enzymes as onestage in bleaching of kraft pulps[J]，Tappi J.，1994，77(3)，243；文献3：Bleaching of softwoodkraft pulps with the enzone process[J]，Holzforschung，1992，46(6)，481；文献4：半纤维素酶在制浆造纸工业的应用研究进展[J]，中国造纸学报，2001，16，146)表明，通过木聚糖酶预处理的纸浆，不仅提高了纸浆白度、降低了打浆能耗、改善了纸浆强度性能，而且可以减少后续漂白工序漂剂的用量，降低废液的毒性、减轻环境污染。用木聚糖酶改善纸浆性能，尤其是提高纸浆白度，被称为“生物漂白”。

众所周知，木聚糖酶可以由多种微生物产生，但由于一般微生物所产的木聚糖酶为中低温或偏酸性，在工业应用上受到了很大限制。耐热或耐高温木聚糖酶在工业应用中有很多优点，因此近年来国外关于这方面的专利较多。例如，USP5,395,765、USP5,437,992、USP5,489,526、USP5,738,384、USP5,888,802、USP5,871,730、USP5,916,795、USP6,083,733、USP6,132,716等，揭示了耐高温木聚糖酶的来源、重组酶及其应用。CN1074935公开了一种生物漂白用木聚糖酶，CN1126784公开了一种利用木聚糖酶改善草浆性能的工艺，CN1170429公开了一种含有木聚糖酶的清洗组合物，CN1143387公开了一种在80℃以上有活性的热稳定性木聚糖酶，CN1266903公开了一种借助PCR扩增荧光假单胞菌(Psmdomonas fhomem)中的木聚糖酶基因得到的重组木聚糖酶及应用，CN1379813公开了改进里氏木霉(Trichodermareesei)木聚糖酶的稳定性并且扩展其pH范围的方法，CN1506461公开了由海栖热袍菌MSB8(Thermotoga maritima MSB8)基因组DNA借助PCR扩增而得到的木聚糖酶B基因(xylanaseB gene，xynB)和构建表达载体在大肠杆菌中表达出该基因编码的重组木聚糖酶。

通常，木聚糖酶的许多工业应用都是在高温条件下进行，特别是纸浆漂白工艺流程，要求木聚糖酶不仅具有良好的热稳定性，同时还应具备良好的耐碱性和较高的表达活性。寻找或产生高温、耐碱木聚糖酶，并显著提高木聚糖酶的酶活性及其在宿主中的分泌表达水平，是当前木聚糖酶研究中的一个非常重要的方向。同时，也有了一些相关的研究进展。例如：在国内，文献5(耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究[J]，微生物学报，2004，44(4)，487)报道了耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究结果，其酶活性达到968.108IU/mL，最适反应温度为55℃，在60℃条件下保温2h酶活性下降90％，该木聚糖酶不耐高温；文献6(用玉米芯酶法制备低聚木糖的研究[J]，食品科学，2002，23(5)，81)报道，木聚糖酶活性为3.6IU/mL，不仅发酵酶活低，耐热或耐碱性也不够好；在国外，文献7(Cloning，Expression，and Sequence Analysis of the Gene Encoding theAlkali-Stable，Themostable Endoxylanase from Alkalophilic，Mesophilic Bacillus sp.StrainNG-27[J]，Appl，Environ.Microbiol，2000，66(6)，2631)报道了一个耐热耐碱的木聚糖酶基因的克隆，但只限于在大肠杆菌中实现了该基因的表达，在1000mL摇瓶中测得的酶活性仅为7IU/mL。

现有的木聚糖酶，特别是用于造纸过程的木聚糖酶，均不具有上述耐高温、耐碱性、高表达活性的特性。采用基因构建的分子生物学技术，是解决耐热、耐碱菌株筛选困难，菌株培养与酶表达活性不高的有效手段之一。

毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)是用于表达外源蛋白的最成功的表达系统之一，目前已有200多种蛋白在该表达系统中得以表达(文献8：Recombinant protein expression in Pichiapastoris[J]，Mol Biotechnol，2000，16(1)，23-52)。毕赤酵母属甲醇营养型酵母菌，其生长迅速，培养条件简单，可以高密度连续培养，遗传操作技术比较成熟，其分泌表达系统由于其表达量高，糖基化完全，二硫键和高级结构形成正确，后续分离纯化简单方便而备受青睐。但是，现有的酵母表达载体，多数为单拷贝体，其表达量与表达活性均不是很高。

专利CN02117906.9提供了一种能够使外源基因在酵母中正确分泌表达的多拷贝酵母表达载体，载体上含有大肠杆菌复制起点Col E1和氨苄青霉素及卡那霉素两个抗性基因，可以使毕赤酵母进行多拷贝插入，能正确分泌表达外源蛋白，测序结果显示分泌表达的蛋白与天然蛋白结构一致。

pAO815载体是由Invitrogen公司开发的、适合于不同的外源基因克隆策略、构建多拷贝的商业载体，没有形成信号肽功能的α因子基因序列，属于胞内表达载体，克隆位点只有一个限制性酶EcoR I，对一些要求特殊的外源基因或特异克隆策略，会造成不便。为此，文献9(利用套嵌PCR技术改造酵母表达载体pAO815的研究[J]，生命科学研究，2002，6(4)，310)通过在载体pAO815上加入α因子的方式改造载体，以克服内源表达造成的不便。文献10(一种多拷贝毕赤酵母表达载体的构建及人脑源性神经营养因子的表达[J]，微生物学报，2005，45(1)，34)则通过PCR技术从另一种商业载体pPIC9K上获得HIS42Kan序列片段，插入到商业载体pPICZα载体上，利用pPICZα载体具有的α因子信号肽和多克隆位点的特点，构建出适合体外组建多拷贝基因表达盒和分泌型表达的毕赤酵母表达载体pPICZα1。

然而，针对木聚糖酶基因的多拷贝表达技术，以及在纸浆漂白工艺中的应用，目前尚没有先例。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程的手段，构建一种可高效表达木聚糖酶基因的多拷贝载体，并将其应用于纸浆漂白工艺中。

本发明通过对毕赤酵母pAO815的改造，利用多拷贝技术，将筛选到的木聚糖酶表达基因以多拷贝的形式与表达载体融合并连接，获得含木聚糖酶基因的多拷贝表达单元的质粒，转化毕赤酵母后，能高效表达木聚糖酶。这种酶应用于纸浆漂白的工艺流程中，可明显减少用氯量，增加纸浆白度，提高纸浆的裂断长、撕裂度和耐折度，并降低废水污染负荷。

本发明通过设计引物，将目的表达载体中的多克隆位点区域置换成为Not I、XhoL I、EcoRI，形成多克隆位点，方便基因的克隆。同时，通过使用融合PCR方法，将α-因子信号肽与目的基因融合，克隆到毕赤酵母内源表达载体pAO816(pAO815的衍生载体)中，使其具有分泌表达木聚糖酶的能力。再利用限制性内切酶Bgl II和BamH I酶切的DNA粘性末端能互补的原则，通过酶切、连接与转化操作，获得含木聚糖酶基因的多拷贝表达单元质粒，完成多拷贝表达载体的构建。

本发明所构建的表达载体(pAO816)的单拷贝表达单元具有如表1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，其多拷贝表达载体的核苷酸序列在此表达单元基础上叠加。

表1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)

                                                                                        

1    atgctaaaaa cgttaagaaa acccttcatt gcaggactag ctttatcatt attactcact 60

61   ggtggagcga gcagtgtatt tgctcaagga aacggtcaag ctggcccacc aaagggaggc 120

121  atttttaaag aaggagaaaa aggaaatggc aatgtccaac cttttgcttg gcaagtggct 180

181  tctcttgcag accgatatga agaatctttt gatattgggg cagcggttga gccgcaccaa 240

241  ctgaatggaa gacaagggaa agtattaaag catcattaca atagtatcgt tgcagaaaat 300

361  gcaatgaagc ccatttcgtt acaacctgaa gaaggtgtgt ttacttggga cggggcagat 420

421  gcgattgttg agtttgctag aaaaaataat atgaacctac gtttcaatac actcgtttgg 480

541  cataaccaag tacctgattg gtttttctta gatgaagaag gcaatccaat ggtagaagaa 600

601  acgaatgaag cgacaagaca ggcgaataaa gaactattat tagaacgcct tgaaacacat 660

721  attaaaacag tagtagatcg ctataaagac gatgtgactg cttgggatgt tgtcaatgaa 780

781  gttgttgacg atggaacacc aaatgaaaga ggattgcgcg aatcagtatg gtaccaaatt 840

841  acaggggatg aatacattcg agttgcgttt gaaacagccc gaaagtatgc aggtgaagac 900

901  gcgaaattat ttattaacga ctacaatacg gaagtgacac cgaagcgtga ccacttatat 960

961  aatctagttc aagacttact cgctgatgga gtaccaatcg atggagtcgg acaccaagca 1020

1021 catattcaaa tcgattggcc aacaattgat gaaattcgaa cgtctatgga aatgtttgct 1080

1081 ggcttaggac ttgataatga agtgacagag ttagatgtta gtttgtatgg atcgccgcct 1140

1141 cgtccagcat tcccaacata tgatgcaatt ccacaagaaa gatttcaagc tcaagccgac 1200

1201 cgttataacc agttgtttga attatatgaa gagcttgatg cagatttaag cagtgtgaca 1260

1261 ttctggggaa tcgcggataa ccatacatgg ttagatgacc gtgcaagaga atataatgat 1320

1381 ggcgttggta aagatgcacc gtttgtattt gacccgaact atcgcgtcaa accagctttt 1440

1441 tggagaatta tcgattaata g                                           1461

                                                                                         

本发明所设计的构建引物，具有如表2所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。

表2核苷酸序列(SEQ ID NO：2)

LinkerA	a-factor信号肽上游引物a-factor信号肽下游引物	5-aaggcggccgcatgagatttccttcaatttttac-35-gtaagcttcagcctctcttttgtcgagag-3
			LinkerB	xyl的上游引物xyl的下游引物	5-gaggctgaagcttacatgctaaaaacgttaagaa-35-aagctcgagctattaatcgataattctccaa-3

本发明所构建的载体为多拷贝表达载体，其拷贝数为两个或两个以上。

本发明所构建的多拷贝载体转化到毕赤酵母后，能高效分泌表达木聚糖酶，制备木聚糖酶，用于纸浆漂白的工艺流程中或者是其他的工业用途。

本发明是这样实现的：

建基因组文库获得木聚糖酶基因，命名为xyl-1。

取毕赤酵母的商业化表达质粒pAO815，针对其EcoR I的线性化，设计一对Linker，该Linker具有表2所示的核苷酸序列，可将pAO815中的多克隆位点区域(MCS区域)置换成为Not I、XhoL I、EcoR I等克隆位点，形成3个以上的限制性酶切位点(附图1)。Linker在94℃温浴5分钟后自然降温到常温，然后与EcoR I线性化的pAO815相连，经转化后得到重组子，命名为pAO816(附图2)。

将来自pPIC9K的α-因子信号肽(α-SS)与基因xyl-1进行PCR融合，方法为：①设计引物LinkerA(表2)，扩增α-SS，在其上游引物区引入Not I位点，PCR得到250bp的片段；②设计xyl-1的引物Linker B(表2)，其上游引物带有的15个碱基与Linker A的下游引物匹配，其下游引物引入XhoL I位点，PCR得到去SS序列的xyl的全长。③取以上Not I-α-SS片段、xyl-XhoL I片段各1μL作为模板，以Linker A的上游引物和Linker B的下游引物分别为融合片段的上、下游引物做PCR，得到一个全长为1.4kb左右的片段，命名为α-xyl。

将载体pAO816用限制性内切酶Not I与XhoL I做酶切，α-xyl也同时用这两个酶做酶切，连接转化，得到可依靠α-SS指导的xyl分泌的单体质粒，命名为pAO816-α-xyl。

以Bgl II和BamH I酶切pAO816-α-xyl质粒，得到一个2.7kb的片段，同时将pAO816-α-xyl质粒用BamH I单酶切，得到一个9kb的质粒，利用Bgl II和BamH I得到粘性末端能互补的原则，将两种片段用NEB Ligase连接过夜并且转化，抽提转化子的质粒，再用Bgl II和BamHI的酶切转化子的质粒，得到5.4kb左右的带，该质粒命名为2-xyl-pAO，即为双拷贝木聚糖酶表达单元的质粒。

用同样的方法依此类推，可得到能高效表达木聚糖酶的四拷贝、六拷贝等的质粒，即为可高效表达木聚糖酶的多拷贝基因载体。

所得到的木聚糖酶的最适反应温度为75℃，在pH9.0的偏碱性环境中具有很好的稳定性。该酶作为助漂剂应用于制浆造纸行业表现出良好的应用前景。

附图说明

附图1为本发明所设计构建引物引入MCS区域多克隆位点的示意图。

附图2为本发明表达载体的构建示意图。

附图3为本发明表达载体的酶切鉴定图。其中，p2表示二拷贝，p4表示四拷贝，p8表示八拷贝的酶切图谱。

附图4为本发明多拷贝体的构建的操作流程图。

附图5为木聚糖酶表达活性的标准曲线。

附图6为温度、pH值对木聚糖酶活性率的影响。

附图7为木聚糖酶加入前后的纸浆白度对比结果。

附图8为木聚糖酶加入前后纸浆尘埃度、清洁度和残氯的合格率变化。其中，A组没有加入木聚糖酶；B组加入了木聚糖酶。

实施例

实施例1木聚糖酶产生菌的筛选

取陈年草垛下土壤，在0.5％木聚糖、0.5％硫酸铵、0.5％磷酸氢二钾、0.1％硫酸镁培养基、30℃、180rpm中进行富集培养。10天后取上清液，按照10～1000的比例稀释涂布平板，该平板由LB培养基和0.3％RBB交联的木聚糖组成。30℃下静置培养16h后，观察平板上的透明圈，挑选透明圈大的菌作为木聚糖酶产生菌Xyl M。

实施例2木聚糖酶基因的克隆

将木聚糖酶产生菌xyl-M用LB培养基在30℃下静置培养培养过夜后，按照如下方法提取其基因组DNA：将培养好的菌体用1.5mL的离心管、12000rpm下离心2～3min，收集菌体；将菌体悬浮于200μL TE(pH8.0)中，加入20mg/mL溶菌酶50μL，37℃保温30min；加入裂解液Buffer 400μL，用高速振荡法破碎细胞；再加入300μL5M NaCL液体，混匀，12000rpm下离心15min；转移上清液至另一新离心管，加入等体积氯仿后轻柔混匀，用12000rpm离心5min；再转移上层水相至另一新离心管，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA；用70％乙醇洗涤、干燥后溶于TE备用。提取的DNA用Sau3AI部分酶切，获得主带在3～15kb的系列片断。胶回收其中大小为4～10kb的片断。

取载体pBluescript，经BamH I酶切使其线性化，用PROMEGA公司的CIP试剂进行去磷酸化处理，再与以上胶回收的4～10kb的片断进行连接(片断100ng，载体20ng，用NEB的连接酶和缓冲液在16℃下连接过夜)。

将连接后的产物转化大肠杆菌DH5a，在由LB培养基、100μg/mLAP、0.3％RBB交联的木聚糖组成的平板上37℃下培养14个小时以上，筛选有透明圈的单克隆菌落，即得到木聚糖酶基因的克隆菌。

将以上重组菌在由LB培养基和终浓度100μg/mL的AP组成的培养基中振荡，培养，提取质粒。质粒的提取方法为：将含有质粒的菌株接入补加了氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃摇床培养至饱和状态。取1.5mL培养液于小离心管12,000rpm离心2～3min收集菌体，去上清液。用100μL溶液I重悬菌体并于室温静置5min。加入200μL溶液II，迅速混匀，在冰上放置5min。加入150μL溶液III，迅速混匀，在冰上放置5min。12,000rpm离心10min，取上清400μL至另一干净的小离心管中，加入800μL无水乙醇沉淀DNA。用12,000rpm离心5min，去上清后用1mL70％的乙醇洗沉淀。沉淀干燥后用30μLTE缓冲液溶解，测序，结果显示，该基因与来源于Bacillussp.NG-27的木聚糖酶基因AF015445在核苷酸水平具99％的同源性，在氨基酸水平具100％同源性。

实施例3 毕赤酵母载体的改造

取毕赤酵母的商业化表达质粒pAO815，针对其EcoR I的线性化，设计两条部分互补的linker，该linker具有表2所示的核苷酸序列，可将pAO815中的MCS区域置换成为Not I、XhoL I、EcoR I等克隆位点，形成3个以上的多克隆位点。方法为两条linker在94℃保温5分钟，然后自然降温到室温(即退火)。退火后与线性化的pAO815相连，经转化后得到重组子，命名为pAO816(附图2)。

实施例4 突变的木聚糖酶基因与载体的融合

将来自pPIC9K的α-因子信号肽(α-SS)与基因XylM-1进行PCR融合，方法为：①设计引物Linker A(表2)，用高保真的DNA聚合酶pyrobest扩增α-SS，在其上游引物区引入Not I位点，进行PCR(条件为94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35cycles；72℃5min；4℃保持)，得到250bp的片段；②设计Xyl M-1的引物Linker B(表2)，其上游引物带有的15个碱基与Linker A的下游引物匹配，其下游引物引入XhoL I位点，PCR得到去SS序列的xyl的全长。③取以上Not I-α-SS片段、xyl-XhoL I片段各1μL作为模板，以LinkerA的上游引物和Linker B的下游引物分别为融合片段的上、下游引物做PCR，得到一个全长为1.4kb左右的片段，命名为α-xyl。

实施例5 带信号肽的木聚糖酶基因的克隆

将载体pAO816用限制性内切酶Not I与XhoL I做酶切，α-xyl也同时用这两个酶做酶切，再将处理后的片段和处理后的载体用NEB的ligase连接过夜，转化DH5α菌株后，得到可依靠α-SS指导的xyl分泌的单体质粒，命名为pAO816-α-xyl。

得到的转化子首先以5’AOX的引物及xyl的下游引物，以转化子为模板做菌落PCR。PCR为阳性结果所对应的转化子用LB+AP振荡抽提其质粒，用EcoR I酶切验证重组，取酶切正确的两个质粒α、β进行测序，结果是融合产物插入到载体的合适地方，没有发生移码和突变。

实施例6 木聚糖酶系列多拷贝的构建

以Bgl II和BamH I酶切pAO816-α-xyl质粒，得到一个2.7kb的片段，同时将pAO816-α-xyl质粒用BamH I单酶切，得到一个9kb的质粒，利用Bgl II和BamH I得到粘性末端能互补的原则，将两种片段用NEB Ligase16℃连接过夜并且转化大肠杆菌DH5a(转化采用冰浴30分钟后42℃热激法)。抽提转化子的质粒，再用Bgl II和BamH I的酶切转化子的质粒，得到5.4kb左右的带，该质粒命名为2-xyl-pAO，即为双拷贝木聚糖酶表达单元的质粒。

依此类推，可得到了双拷贝、三拷贝、四拷贝、五拷贝等的质粒，分别命名为3-xyl-pAO，4-xyl-pAO等。

实施例7 木聚糖酶多拷贝表达质粒的转化及酶的诱导表达

用含木聚糖酶基因的多拷贝表达单元质粒转化毕赤酵母GS11S、KM71、SMD1168等菌株后，能高效表达木聚糖酶，用于纸浆漂白等工业用木聚糖酶的制备。

制备毕赤酵母感受态细胞：将毕赤酵母(GS115，KM71，SMD1168)接种于YEPD平板上活化，挑单菌落于10mL YEPD液体培养基，30℃，250rpm培养过夜后，转接培养物至新的YEPD液体培养基中，使初始OD600≈0.1，于30℃，250rpm培养至OD600≈0.5～0.8，用8,000rpm离心3min，收集菌体，再用50mL BufferA(1M Sorbitol，10mM Bicine(pH8.35)，3％(v/v)ethylene glycol)重悬菌体，离心收集菌体，用4mL Buffer A重悬菌体，并按每管0.2mL分装至无菌的2mL冻干管，加11μL DMSO混匀后快速放入液氮中，30min后转至-70℃储存备用。

转化毕赤酵母：在尚未融化的感受态细胞中加入待转化的DNA和线性单链DNA，即含木聚糖酶基因的多拷贝表达单元质粒，在37℃水浴中5min，其间轻柔混合样品1-2次，再加入Buffer B(40％PEG1000，0.2M Bicine(pH8.35))1.5mL，充分混匀后，置于30℃水浴中1h后，用6,000rpm离心10min，去上清，用1.5mL Buffer C(0.15M NaCl，10mM Bicine(pH8.35))重悬菌体，6,000rpm下离心5min，去上清，用0.2mL Buffer C重悬菌体，将重悬的菌液涂布相应的选择平板，28℃倒置培养2-4d，获得毕赤酵母转化子。

实施例8 木聚糖酶表达活性的测定

1.绘制标准曲线

取9支大试管，分别按下表加入各种试剂(其中，DNS为3，5-二硝基水杨酸)，建立标准曲线，每5min产生1mg还原糖的酶量为一个单位。

管号	0	1	2	3	4	5	6	7	8
										糖总量(mg)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	1.4	1.6

标准木聚糖(ml)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1	1.2	1.4	1.6
										双蒸水(ml)	2.0	1.8	1.6	1.4	1.2	1.0	0.8	0.6	0.4
DNS液(ml)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
										加热	在沸水浴中加热5分钟
冷却	立即用流动冷水冷却
										双蒸水(ml)	21.5	21.5	21.5	21.5	21.5	21.5	21.5	21.5	21.5
OD520	0	0.121	0.281	0.433	0.588	0.741	0.905	1.033	1.154

2.酶解液中含糖量的测定

取一支大试管，分别加入酶解液1mL，双蒸水1mL，DNS试剂1.5mL混匀后在沸水浴中加热5分钟，立即用流动冷水冷却，补加21.5mL双蒸水，混匀，用分光光度计测定OD520值，在标准曲线上查出对应含糖量。

实施例9 木聚糖酶表达菌发酵制备木聚糖酶

挑取重组毕赤酵母单菌落于BMGY液体培养基，在28～30℃、250～300rpm条件下培养至对数期(OD600＝2～6)；7000rpm下离心收集菌体，去除上清液；菌体转至BMMY液体培养基，使其初始OD600＝1.0，在28～30℃，250～300rpm条件下培养，每隔24h按照总培养体积的0.5％补加浓度为100％的甲醇，诱导培养48个小时后终止培养，5000rpm下离心除菌，收集上清液，即为木聚糖粗酶液，酶纯度达到90％以上。经检测，酶活为526IU/mL。所得到的木聚糖酶有着很好的热稳定和耐碱性：最适反应温度为75℃，在50℃～80℃范围内仍具有80％以上的酶活性；最适反应pH为9.0，在pH4.0～10.6范围内仍具有80％以上酶活性；在75℃、pH9.0时的半衰期为45min。

其中，BMGY液体培养基的配制方法为：1％Yeast extract，2％peptone，121℃灭菌20min后，加入1.34％YNB(过滤除菌)，4×10-5％Biotin(过滤除菌)，100mM Potassium phosphatepH6.0(过滤除菌)，1％Glycerol(过滤除菌)；BMMY液体培养基的配制方法为：1％Yeastextract，2％peptone，121℃灭菌20min后，加入1.34％YNB(过滤除菌)，4×10-5％Biotin(过滤除菌)，100mM Potassium phosphate pH6.0(过滤除菌)，0.5％Methanol(过滤除菌)。木聚糖酶活力按如下标准方法测定：取0.5mL酶液(稀释2～10倍)，与1.0mL用0.05moL/L柠檬酸缓冲液配制的浓度为1％的桦木木聚糖(Sigma公司制造)悬浮液混合，于50℃下反应30min。酶活单位(IU)定义为：每分钟生成1μmoL木糖所需的酶量。

实施例10 木聚糖酶用于纸浆漂白的工艺流程

在麦草纸浆漂白的传统CEH三段漂工艺上，应用本发明制备的木聚糖酶进行漂白。

配制木聚糖酶溶液：将1L木聚糖酶液稀释在400L的清水中，搅拌均匀，配制成为0.25％(V/V)的溶液。用计量泵将配制好的酶溶液均匀地加入到麦草纸浆漂白前的真空鼓式洗浆机的出浆螺旋处，具体的工艺条件为：纸浆温度72±5℃，浓度8～12％，pH值7.0～9.5，残碱0.1～0.4g/L，硬度(高锰酸钾值)10～14，反应时间1.0～1.5h，木聚糖酶用量45～50g/t浆。木聚糖酶溶液的加入流量按公式(L＝QW/360N)确定，其中：L表示酶溶液流量(mL/10s)，Q表示产浆量(t/h)，W表示木聚糖酶的用量(g/t浆)，N表示酶溶液的质量分数(％)。纸浆硬度、白度、粘度等指标参照文献11(制浆造纸分析与检测[M]，北京，中国轻工业出版社，2003)进行测定。

实施结果：在70～80℃时木聚糖酶的活性率较高；最适宜的pH值为8.5～9.5(附图6)；木聚糖酶使用前后的数据对比显示，使用木聚糖酶之后的纸浆白度有明显提高(附图7)，纸浆的尘埃度、清洁度、残氯合格率有明显的改善(附图8)，成浆中纤维束明显减少，成浆的光泽感和弹性感增强，返黄现象减轻。漂白时间由原来的2.5～3.0h缩短为2.0h，产量由此而得到提高，氯耗由使用木聚糖酶之前的140kg/t浆降为83kg/t浆，节省40.7％的氯用量。

Claims (8)

1.一种高效表达木聚糖酶基因的方法，其特征在于采用多拷贝构建技术，将木聚糖酶基因以两个或两个以上的多拷贝形式与表达载体融合并连接，获得含木聚糖酶基因的多拷贝表达单元的质粒，再转化毕赤酵母后分泌表达木聚糖酶，并应用于纸浆漂白的工艺流程中。

2.如权利要求1所述，其特征在于所述的高效表达木聚糖酶基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述，其特征在于采用多拷贝构建技术构建多拷贝表达载体，其拷贝数为两个或两个以上。

4.如权利要求1和3所述，其特征在于所述的多拷贝技术，是通过设计引物，将目的表达载体中的多克隆位点区域置换成为NotI、XhoLI、EcoRI等多克隆位点而实现的。

5.如权利要求1和3所述，其特征在于所述的多拷贝技术，是将α-因子信号肽与木聚糖酶基因通过融合后连接到表达载体上，使其成为含有能分泌表达木聚糖酶基因的表达载体。

6.如权利要求1和3所述，其特征在于所构建的多拷贝表达载体，是利用限制性内切酶BglII和BamH I酶切可得到粘性末端能互补的原则，通过酶切、连接与转化操作，获得含木聚糖酶基因的多拷贝表达单元的质粒。

7.如权利要求1所述，其特征在于所构建的载体转化到毕赤酵母菌株后，能高效表达木聚糖酶。

8.如权利要求1和8所述，其特征在于所表达的木聚糖酶，可用于纸浆漂白的工艺流程中，或者是其他的工业用途。

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