CN112410264A - 一株高产耐高温碱性木聚糖酶的菌株及生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株高产耐高温碱性木聚糖酶的短小芽孢杆菌及生产方法。该菌株是由实验室保存的短小芽孢杆菌MJ3经NTG诱变后获得的，具体为短小芽孢杆菌(Bucillus pumilus)NGJ763，该菌株已于2020年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20671。有该菌株生产的木聚糖酶耐热、耐碱、酶活力高、性能稳定，并且可以有效地降解各种类型的木聚糖，而不降解纤维素，可以有效地漂白纸浆中的木聚糖部分而不影响纤维素部分，解决了现有木聚糖耐高温与耐碱性无法同时兼顾的问题，将在造纸和纺织工业的应用中显示出其巨大的潜力。

Description

一株高产耐高温碱性木聚糖酶的菌株及生产方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株高产耐高温碱性木聚糖酶的短小芽孢杆菌及生产方法。
背景技术：
木聚糖是植物半纤维素的重要组成成分,也是陆生植物细胞壁中一种最普通的半纤维素,除了纤维素以外,木聚糖是自然界中最丰富的多糖。
木聚糖酶主要是降解半纤维素木聚糖酶的一组酶的总称，它的酶系组成比较复杂，主要包括作用于主链的内切-1,4-β-木聚糖酶和β-木糖苷酶。前者主要是从主链的内部作用于木糖苷链，可以随机地将木聚糖主链降解成为短链的低聚木糖；后者主要是作用于短链的低聚木糖，从其非还原性末端释放出木糖。
碱性木聚糖酶可以应用于生物制浆、纸浆漂白、废纸脱墨处理、废纸二次纤维回收以及纸张表面处理等方面，特别是在纸张生物漂白中有巨大的应用潜力。木聚糖酶可以促使纸浆中残余的木质素降解和溶解性木质素抽除，这样不但可以提高纸浆的白度和稳定性，改善纤维的滤水性和造纸性能，还可以大大减少后续化学漂白剂的用量，进而降低纸浆漂白对环境的污染。在纺织工业中，碱性木聚糖酶可以有效地去除纺织印染产品上残留的杂质。
木聚糖酶在工业生产中有着广阔的应用前景，但是工业生产往往需要高温碱性条件下进行，这就大大限制了酶制剂在工业生产中的应用。因此，耐热耐碱性木聚糖酶在工业中有着巨大的应用前景。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明将提供一株高产耐热耐碱性木聚糖酶的菌株，该菌株是由实验室保存的短小芽孢杆菌MJ3经NTG诱变后获得的，具体为短小芽孢杆菌(Bucillus pumilus)NGJ763，该菌株已于2020年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20671。
本发明的目的还在于提供一种发酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的木聚糖酶的液态微生物发酵生产方法。本发明的目的可以通过以下措施来实现：
(1)液态发酵生产木聚糖酶
发酵罐发酵工艺条件：接种量2％，罐压0.05-0.08Mpa，培养温度36-38℃，转速200-800r/min，当pH升值7.2-7.3时开始补料，控制pH7.0-7.1，培养至70-73h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶时放罐；
发酵结束时，发酵液酶活力为28000-30000U/ml；
(2)木聚糖酶的提取与精制
发酵结束后，按发酵液体积加入40％的水和0.3％氯化钙，加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；用孔径为20kDa的超滤膜对澄清压滤酶液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂8％葡萄糖、氯化钠10％，防腐剂0.15％山梨酸钾，然后用硅藻土进行过滤除菌，即得到木聚糖酶成品酶制剂(“％”表示质量体积比)。
进一步地，发酵罐培养基组成如下：豆饼粉2％，水洗麸皮2％，玉米芯1.5％，玉米浆1.6％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.25％，硫酸铵0.3％，硝酸钠0.8％，其余为水，pH7.0(“％”表示质量体积百分比)；
进一步地，发酵罐灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min。
进一步地，补料培养基组成如下：玉米芯10％，豆饼粉2.5％，玉米浆3.5％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.2％，其余为水，pH7.0(“％”表示质量体积百分比)。
本发明制备的木聚糖酶，酶学特性如下：
(1)最适反应温度为80℃，在90℃条件下保温2h，仍能保持85％以上的酶活，热稳定性较好；
(2)最适反应pH为11.0，在pH6.0-13.0的条件下处理2h，相对酶活力仍然保持在80％以上。
有益效果：
1、本发明提供了一种耐热、耐碱、酶活力高、性能稳定而且价格较低的木聚糖酶。该木聚糖酶可以有效地降解各种类型的木聚糖，而不降解纤维素，可以有效地漂白纸浆中的木聚糖部分而不影响纤维素部分，解决了现有木聚糖耐高温与耐碱性无法同时兼顾的问题，将在造纸和纺织工业的应用中显示出其巨大的潜力。
2.本发明提供了一种发酵活力更高、提取收率更高、制造成本更低的木聚糖酶液态生物发酵的生产方法和生产菌株。
附图说明：
图1最适反应温度曲线图；
图2热稳定性曲线图；
图3最适反应pH曲线图；
图4pH稳定性曲线图。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
实施例1菌株的诱变选育
将实验室保存的短小芽孢杆菌MJ3菌种接种到种子培养基中，37℃培养至对数期，然后收集菌体，8000rpm离心5min，用生理盐水重悬菌体，使菌体浓度为106-107个/ml，并加入NTG母液，使得最终浓度为0.2g/L。然后于37℃反应30min，经适当稀释之后，取100μL涂布于筛选平板上37℃培养24h左右，计算致死率。挑取筛选平板上透明圈较大的单菌落接入种瓶中培养，待种子长好后接入发酵摇瓶。最终筛选到一株酶活提高2.3倍的高产菌株NGJ763，通过酶学特性研究，该突变菌株产生的木聚糖酶具有良好的耐热性和耐碱性。
(1)木聚糖酶高产菌株NGJ763的稳定性传代实验
挑取筛选平板上生长情况较好的NGJ763单菌落接种到种瓶中，37℃，240rpm培养10h左右，按2％接种量转接到发酵摇瓶，37℃，240rp培养72h左右，测定酶活。将该菌株连续传代10次的摇瓶结果如表1所示：
表1.菌株NGJ763稳定性检测结果
Figure BDA0002825391950000031
Figure BDA0002825391950000041
将该突变菌株传代培养10代，实验结果由表1可以看出，该突变菌株的遗传性稳定好。
实施例2木聚糖酶酶活测定方法
(1)木聚糖酶活单位的定义
在50℃，pH8.0条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量定义为1个酶活单位。
(2)酶活测定方法
取2ml浓度为1％的木聚糖底物(pH8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制)加入到比色管中，50℃预热10min，再加入2ml经pH8.0缓冲液适当稀释并预热好的木聚糖酶酶液，混匀后于50℃反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀终止反应，然后沸水浴煮沸10min，用水冷却至室温，加水定容至25ml，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值A。
酶活计算公式：
Figure BDA0002825391950000042
式中：X为木聚糖酶的活力，U/ml；A为酶反应液的吸光度；B为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量；t为反应时间；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。
实施例3菌株液体发酵生产木聚糖酶及其提取
1、种子培养
培养基质量体积百分比组成如下：
(1)平板分离培养基
牛肉膏0.3％；蛋白胨1％，氯化钠0.5％，木聚糖1.5％，刚果红0.02％，琼脂2％，其余为水，pH7.0。
(2)种子培养基
玉米芯2％，牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，其余为水，pH7.0。
(3)发酵摇瓶酵培养基
豆饼粉2％；水洗麸皮2％，玉米芯1.5％，玉米浆1.6％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.25％，硫酸铵0.3％，硝酸钠0.8％，其余为水，pH7.0。
(4)培养条件
分离平板：37℃培养24h；
液体种子：37℃培养10h，摇床转速240r/min；
发酵摇瓶：37℃培养72h，摇床转速240r/min，接种量2％。
2、种子罐扩大培养
培养基质量体积百分比组成如下：
(1)种子罐培养基
玉米芯3％，蛋白胨2.5％，豆饼粉2％，氯化钠1％，硫酸铵2％，硫酸镁0.5％，其余为水，pH 7.0；
(2)种子罐灭菌工艺条件：121℃，0.12MPa条件下，灭菌35min；
(3)种子罐培养工艺条件
罐压0.05MPa，培养温度37℃，搅拌转速200r/min，接种量2％，pH控制7.0；
(4)种子罐移种条件：菌体染色深、粗壮，无杂菌。
3、液态发酵生产木聚糖酶
培养基质量体积百分比组成如下：
(1)发酵罐培养基：豆饼粉2％，水洗麸皮2％，玉米芯1.5％，玉米浆1.6％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.25％，硫酸铵0.3％，硝酸钠0.8％，其余为水，pH7.0；
(2)发酵罐灭菌工艺条件：121℃，0.12MPa条件下，灭菌35min。
(3)发酵罐发酵工艺条件：罐压0.05Mpa，培养温度37℃，转速600r/min，接种量2％，当pH升值7.2时开始补料，控制pH7.1，发酵至菌体自溶严重，酶活无明显提高时放罐；
4、补料
(1)补料培养基：玉米芯10％，豆饼粉2.5％，玉米浆3.5％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.2％，其余为水，pH 7.0。
(2)补料方法：当pH升值7.2时开始补料，控制pH7.1。
5、放罐
培养至70-73h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐。
6、木聚糖酶的提取与精制
发酵结束后，按发酵液体积加入40％的水和0.3％氯化钙，加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；用20KDa超滤膜对澄清压滤酶液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂8％葡萄糖、氯化钠10％，防腐剂0.15％山梨酸钾，然后用硅藻土进行过滤除菌，即得到木聚糖酶成品酶制剂。
应用上述短小芽孢杆菌诱变菌株CGMCC NO.20671及培养方法进行发酵，表2是进行6批发酵的发酵周期和发酵液酶活力，平均发酵液酶活力为28575U/mL。
表2. 3L小罐发酵实验结果
Figure BDA0002825391950000061
由表2可以看出，诱变菌株NGJ763发酵水平较稳定，发酵酶活均达到了28000U/ml以上。
实施例4最适反应温度
取实施例3制备的木聚糖酶成品，采用实施例2所述的方法，以正常条件pH8.0，分别在40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95℃、100℃条件下测定木聚糖酶活力，以80℃时的酶活为100％计算相对酶活。结果如图1所示，最适反应温度为80℃，70-90℃条件下酶活稳定。
实施例5热稳定性
取实施例3制备的木聚糖酶成品，将酶液分别置于70、75、80、85、90、95、100℃条件下保温处理2h，保温结束后采用实施例2所述的方法测定酶活，以未处理的原始酶活力为100％计算相对酶活。其实验结果如图2所示。在90℃条件下保温2h，仍能保持85％以上酶活，热稳定性较好。
实施例6最适反应pH
取实施例3制备的木聚糖酶成品，根据实施例2所述的酶活测定方法，在温度为80℃条件下，分别测定在pH值在7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0条件下木聚糖酶活力，以pH11.0时的酶活力为100％计算相对酶活。测定结果如图3所示，木聚糖酶的酶活在pH为11.0附近时酶活最高。
实施例7耐酸碱性
取实施例3制备的木聚糖酶成品分别用0.1M的NaOH或0.1M的HCl将其酶液的pH调整为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，分别置于室温条件下静置2h后测定酶活力，以未处理的原始酶活力为100％计算相对酶活。测定结果如图4所示，在pH6.0-13.0的条件下处理2h后，相对酶活力仍然保持在80％以上。
实施例8木聚糖酶底物特异性
取实施例3制备的木聚糖酶成品，分别加入到以pH11.0的1％桦木木聚糖、燕麦木聚糖、榉木木聚糖、玉米芯、微晶纤维和淀粉为底物的溶液中(木聚糖酶用量为40U/ml底物溶液)，80℃条件下反应2h，薄层层析分析其产物组成，以木二糖、木三糖、木四糖和木五塘作为标准。由表3可以看出该木聚糖酶对桦木木聚糖、燕麦木聚糖、榉木木聚糖、玉米芯等结构组成类似的半纤维素原料有良好的降解作用，而对微晶纤维和淀粉没有检测到酶活，说明该木聚糖酶可以有效地降解各种类型的木聚糖，而不降解纤维素，可以有效地漂白纸浆中的木聚糖部分而不影响纤维素部分。
表3.木聚糖酶底物特异性
底物(10g/L) 转化率(％) 水解产物
桦木木聚糖 99.8 三糖、四糖、五糖
燕麦木聚糖 89.5 二糖、三糖、四糖
榉木木聚糖 93.6 三糖、四糖、五糖
玉米芯 97.8 二糖、三糖、四糖
微晶纤维 0 -
淀粉 0 -
实施例9木聚糖酶在麦草纸浆漂白中的效果
(1)木聚糖酶预处理阶段工艺条件
浆浓5％；温度80℃；反应时间2h；木聚糖酶用量为20U/g浆。
(2)二氧化氯漂白阶段工艺条件
浆浓5％；温度60℃；反应时间1.5h；
纸浆经木聚糖酶预处理及二氧化氯漂白结果如表4所示，其中M0为未经木聚糖酶预处理，只经二氧化氯漂白(对照组)；M1和M2为经过木聚糖酶预处理，再用不同浓度的二氧化氯进行漂白。从表4的结果可知，麦草浆经木聚糖酶预处理后，可以显著的改善二氧化氯的漂白性能，当二氧化氯用量为2％时，麦草浆经酶预处理比未经酶处理纸浆白度提高了25.6％；当漂白同等白度时，经木聚糖预处理的比对照组可节省35％的二氧化氯用量。
表4.经不同处理后漂白纸浆的结果
编号 M0 M1 M2
酶用量(IU/ml) 0 20 20
二氧化氯用量(％) 2 2 1.3
白度(％) 60.2 85.8 60.2
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (8)

1.一株高产耐热耐碱性木聚糖酶的菌株，其特征在于，所述菌株具体为短小芽孢杆菌(Bucillus pumilus)NGJ763，保藏编号为CGMCC NO.20671。
2.权利要求1所述短小芽孢杆菌NGJ763在生产木聚糖酶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵生产木聚糖酶的方法如下：接种量2％，罐压0.05-0.08Mpa，培养温度36-38℃，转速200-800r/min，当pH升值7.2-7.3时开始补料，控制pH7.0-7.1，培养至70-73h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶时放罐。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，培养基组成如下：豆饼粉2％，水洗麸皮2％，玉米芯1.5％，玉米浆1.6％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.25％，硫酸铵0.3％，硝酸钠0.8％，其余为水，pH7.0。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，补料培养基组成如下：玉米芯10％，豆饼粉2.5％，玉米浆3.5％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.2％，其余为水，pH7.0。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，木聚糖酶的提取与精制方法如下：
发酵结束后，按发酵液体积加入40％的水和0.3％氯化钙，加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；用孔径为20kDa的超滤膜对澄清压滤酶液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂8％葡萄糖、氯化钠10％，防腐剂0.15％山梨酸钾，然后用硅藻土进行过滤除菌，即得到木聚糖酶成品酶制剂。
7.权利要求3-6任意一项生产的木聚糖酶。
8.权利要求7所述木聚糖酶在造纸和纺织工业中的应用。
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