JP3532902B2 - 変異したスブチリシンプロテアーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、改良された洗浄性能を示す洗浄剤組成物の配
合において有用な新規な突然変異酵素または酵素変異
体、前記酵素を含有するクリーニングおよび洗浄剤組成
物、適当な宿主の細胞または有機体の中に挿入したと
き、前記酵素の発現の遺伝情報をコードする突然変異し
た遺伝子、および親酵素の中の変化すべきアミノ酸残基
を選択して、特定した条件下に所定の洗浄液体の中でよ
りよい性能を方法に関する。

【０００２】発明の背景 洗浄剤工業において、酵素は多年にわたって洗浄配合物
の中に利用されてきている。このような配合物において
使用する酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラー
ゼ、セルラーゼ、ならびに他の酵素、またはそれらの混
合物からなる。プロテアーゼは商業的に最も重要であ
る。プロテアーゼは洗浄剤工業において20年以上の間使
用されてきているが、どの物理学的または化学的特性が
プロテアーゼのすぐれた洗浄性能または能力の原因とな
るかはまだ正確に知られていない。現在使用されている
プロテアーゼは、自然からプロテアーゼを分離し、そし
て洗浄剤配合物中でそれらを試験することによって発見
されてきている。

【０００３】バチルス属（Bacillus）のプロテアーゼ タンパク質の基質の中のアミド結合を切断する酵素は、
プロテアーゼ、または（互換的に）ペプチダーゼとして
分類される（参照、Walsh, 1979, Enzymatic Reaction
Mechanisms, W.H. Freeman and Company、サンフランシ
スコ、第３章）。バチルス属（Bacillus）種のバクテリ
アはプロテアーゼの２つの細胞外の種、中性またはメタ
ロプロテアーゼ、および機能的にエンドペプチダーゼで
あるアルカリ性プロテアーゼ、スブチリシンと呼ぶ、を
分泌する。これらのプロテアーゼの分泌は、バクテリア
の成長サイクルに連結されてきており、定常期の間に、
胞子形成がまた起こるとき、プロテアーゼの発現は最大
である。Joliffe et al. (1980, J. Bactrial 141 : 11
99-1208 ）は、バチルス属（Bacillus）のプロテアーゼ
が細胞壁のターンオーバーにおいて機能することを示唆
した。

【０００４】スブチリシン セリンプロテアーゼは、親酵素結合の加水分解を触媒し
そしてその中に必須セリン残基が活性部位に存在する酵
素である（White, HandlerおよびSmith, 1973,“Princi
ple of Biochemistry,”第５版、McGraw-Hill Book Com
pany、ニューヨーク、pp. 271-272）。

【０００５】バクテリアのセリンプロテアーゼは20,000
〜45,000の範囲の分子量を有する。それらはジイソプロ
ピルヒスフェートにより阻害されるが、メタロプロテア
ーゼと対照的に、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）に対
して抵抗性である（が、それらはカルシウムイオンによ
り高温において安定化される）。それらは簡単な末端の
エステルを加水分解し、そして活性が真核生物のキモト
リプシン、またセリンプロテアーゼに類似する。より狭
い用語、アルカリ性ホスファターゼ、はサブグループを
カバーシ、セリンプロテアーゼのあるものの最適な高い
pH、pH9.0〜11.0 を反映する（概観については、参照、
Priest, 1977, Bacteriological Rev. 41 : 711-75
3）。

【０００６】本発明に関して、スブチリシンはグラム陽
性バクテリアまたは菌類により産生されるセリンプロテ
アーゼである。広範な種類のスブチリシンは同定されて
きており、そしてある数のスブチリシンのアミノ酸配列
は決定された。これらは、次のものを包含する：バチル
ス属（Bacillus）種からの少なくとも６つのスブチリシ
ン、すなわち、スブチリシン168 、スブチリシンBPN'、
スブチリシンカルスバーク（Carlsberg ）、スブチリシ
ンDY、スブチリシンアミロサッカリチクス、およびメセ
ンテリコペプチダーゼ（Kurihara et al., 1972, J. Bi
ol. Chem. 247: 5629-5631 ; Wells et al., 1983, Nuc
leic Acids Res. 11 : 7911-7925 ; StahlおよびFerrar
i, 1984, J. Bacteriol. 159 : 811-819, Jacobs et a
l., 1985, Nucl. Acids Res. 13 : 8913-8926 ; Nedkov
et al., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 : 421-
430, Svendsen et al., 1986, FEBS Lett 196 : 228-23
2）、アクチノミセテスからの１つのスブチリシン、サ
ーモアクチノミセス・ブルガリス（Thermoactinomyces
vulgaris）からのサーミターゼ（Meloun et al., 1985,
FEBS Lett. 1983 : 195-200）、および１つの菌のスブ
チリシン、トリチラキウム・アルブム（Tritirachium a
lbum）（JanyおよびMayer, 1985, Bilol. Chem. Hoppe-
Seyler 366 : 584-492）。

【０００７】スブチリシンは物理学的および化学的によ
く特性決定される。これらの酵素の主な構造（アミノ酸
配列）の知識に加えて、スブチリシンの50を越える高い
分解能のＸ線構造が決定され、これらは基質の結合、転
移の状態、産生物、少なくとも３つの異なるプロテアー
ゼ阻害因子を描写し、そして自然の変異型の構造の結果
を定める（Kraut, 1977, Ann. Rev. Biochem. 46 : 331
-358）。

【０００８】本発明に関して、スブチリシン変異体また
は突然変異したスブチリシンプロテアーゼは、もとのま
たは親の遺伝子を有しかつ対応する親酵素を産生した親
の有機体から誘導された突然変異の遺伝子を発現してい
る有機体により産生されたスブチリシンを意味し、親の
遺伝子は、適当な宿主の中で発現されるとき、前記突然
変異したスブチリシンプロテアーゼを産生する突然変異
の遺伝子を産生するために、親の遺伝子は突然変異され
ている。

【０００９】スブチリシン遺伝子のランダムまたは部位
特異的突然変異は、酵素の物理学的および化学的性質の
知識から生じかつスブチリシンの活性、基質の特異的、
第３構造などに関する情報に寄与した（Wells et al.,
1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 ; 1219-1223
; Wells et al., 1986, Phil. Trans. R. Soc. Lond.
A. 317 : 415-423 ; HwangおよびWarshel, 1987, Bioch
em. 26 : 2669-2673 ;Rao et al., 1987, Nature 328 :
551-554）。

【００１０】スブチリシン遺伝子のことに部位特異的突
然変異は非常に多くの注目を引き付け、そして種々の突
然変異は次の特許出願および特許に記載されている：欧
州特許発行第130756号（GENENTECH）（米国特許第 4,76
0,025号（GENENTECH）対応する）、「カルボニルヒドロ
ラゼ」の中に部位特異的またはランダムに発生した突然
変異および引き続く突然変異した酵素の種々の性質、例
えばＫ_cat ／Ｋ_m 比、pH活性のプロフィル、および酸化
の安定性についてのスクリーニングに関する。部位特異
的突然変異が可能であり、そしてある特定した位置、す
なわち、^-1Tyr, ³²Asp, ¹⁵⁵Asn, ¹⁰⁴Tyr, ²²²Met, ¹⁶⁶G
ly, ⁶⁴His, ¹⁶⁹Gly, ¹⁸⁹Phe, ^{3 3}Ser, ²²¹Ser, ²¹⁷Tyr,
¹⁵⁶Gluまたは¹⁵²Ala、におけるスブチリシンBPN'の突然
変異が変更した性質を示す酵素を提供したということの
証明のほかに、この出願は所望の性質を有する酵素を得
るために突然変異を導入するかどうかを決定するという
問題の解決に寄与しない。

【００１１】欧州特許発行第214435号（HENKEL）、スブ
チリシンカルスバーク（Carlsberg）およびその２つの
突然変異のクローニングおよび発現に関する。この出願
において、¹⁵⁸Aspから¹⁵⁸Serおよび ¹⁶¹選択から¹⁶¹Asp
への突然変異のための理由は与えられていない。国際特
許公開第WO87/04461（AMGEN ）において、親酵素の中に
存在するAsn-Gly 配列の数を制限して、改良されたpHお
よび熱安定性を示す突然変異した酵素えることが提案さ
れており、この出願において、スブチリシンBPN'の中の
¹⁰⁹Asnおよび²¹⁸Asn残基の除去、突然変異、または修飾
について強調されている。

【００１２】国際特許公開第WO87/05050（GENEX ）は、
ランダム突然変異および引き続くスブチリシンBPN'の多
数の突然変異の改良された性質についてのスクリーニン
グを開示している。この出願において、突然変異は位置
²¹⁸Asn, ¹³¹Gly, ²⁵⁴Thr, ^{16 6}Ala, ¹⁸⁸Ser, ¹²⁶Leu、お
よび⁵³Serにおいて記載されている。

【００１３】欧州特許出願第87303761号（GENENTECH ）
において、第１および第３の両者の構造のレベルにおけ
る相同性の考察を、保存されたか否かにかかわらず同等
のアミノ酸残基の同定に応用できる方法が記載されてい
る。この情報はスブチリシンBPN'の第３構造の発明者ら
の知識と一緒に、変更した性質をもつ突然変異を得るこ
とを期待して、突然変異を受け易いある数の位置の選択
に発明者らを導く。

【００１４】そのように同定された位置は次の通りであ
る：¹²⁴Met, ²²²Met, ¹⁰⁴Tyr, ¹⁵²Ala, ¹⁵⁶Glu, ¹⁶⁶Gl
y, ¹⁶⁹Gly, ¹⁸⁹Phe, ²¹⁷Tyr.Also ¹⁵⁵Asn, ²¹Tyr, ²²Th
r, ²⁴Ser, ³²Asp, ³³Ser, ³⁶Asp, ⁴⁶Gly, ⁴⁸Ala, ⁴⁹Se
r, ⁵⁰Met, ⁷⁷Asn, ⁸⁷Ser, ⁹⁴Lys, ⁹⁵Val, ⁹⁶Ley, ¹⁰⁷Il
e, ¹¹⁰Gly, ¹⁷⁰Lys, ¹⁷¹Tyr, ¹⁷²Pro, ¹⁹⁷Asp, ¹⁹⁹Met,
²⁰⁴Ser, ²¹³Lys、および²²¹Ser 、これらの位置は酵素
の種々の性質に影響を及ぼすことが期待されるとして同
定される。また、ある数の突然変異がこれらの示唆を支
持すると例示されている。これらの位置の単一の突然変
異に加えて、発明者らは、また、ある数の多重の突然変
異を実施した。さらに、発明者らは²¹⁵Gly, ⁶⁷Leu, ¹³⁵
Leu、およびセグメント97-103, 126-129, 213-215、お
よび152-172内のアミノ酸残基を興味あるものとして同
定しているが、これらの位置における突然変異は例示さ
れていない。

【００１５】欧州特許発行第260105号（GENENTECH）
は、触媒のトリアド（triad）を含有する酵素における
ある種の性質を触媒のトリアドから約15オングストロー
ム以内のアミノ酸残基を選択することによって修飾する
ことを記載しており、そして選択したアミノ酸残基を他
の残基で置換している。この明細書に記載されているス
ブチリシンの型の酵素は、触媒のトリアドを含有する酵
素のクラスに属するとして特別に述べられている。置換
において、位置222および217は置換のために好ましい位
置として示されている。

【００１６】国際特許公開第WO88/06624（GISTBROCADES
NV）は、スブチリシン309 のアミノ酸配列に対してアミ
ノ酸配列がほとんど100 相同性であるPB92と表示するス
ブチリシンプロテアーゼのDNA およびアミノ酸配列を開
示している。国際特許公開第WO88/07578（GENENTECH ）
は、アミノ酸残基の少なくとも１つの触媒の基の置換ま
たは修飾により、前駆体酵素から誘導された突然変異し
た酵素をクレイムしている。発明者らが述べているよう
に、そのように実施することによって、修飾または置換
された触媒の基を含有する基質と反応性である突然変異
した酵素が得られる（基質促進触媒反応）。

【００１７】一般の理論はバチルス・アミロリクエファ
シエンス（B. amyloliquefacens ）スブチリシン（BP
N'）に基づき、ここで修飾は位置⁶⁴His において記載さ
れており、これは⁶⁴Ala 単独でまたはSer-24-Cysの「ヘ
ルパー」突然変異と組み合わせ修飾された。修飾は、ま
た、アミノ酸残基³²Asp 、および²²¹Ser、およびAla-48
-Gluの「ヘルパー」突然変異において示唆されている。

【００１８】国際特許公開第WO88/08028（GENEX ）は、
タンパク質の安定化のために金属イオン結合部位付近で
遺伝子操作することを開示している。この特許は、ま
た、スブチリシンBPN'を例として使用し、そして次のア
ミノ酸残基を置換の候補として指摘している¹⁷²Pro（P1
72D, P172E）, ¹³¹Gly（G131D）, ⁷⁶Asn（N76D ; N76D+
P172D (E) ）, ⁷⁸Ser（S78D）。さらに、示唆は次の組
み合わせた突然変異についてなされている。N76D+S78D+
G131D+P172D (E) ; N76D+G131D ; S78D+G131D ;S78D+P1
72D (E) AND S78D+G131D+P172D (E）。

【００１９】国際特許公開第WO88/08033（AMGEN ）は、
修飾したカルシウム結合部位および分子の中に存在する
Asn-Gly 配列において置換されたAns またはGly を有
し、これにより改良された熱およびpH安定性を示す酵素
を得る、ある数のスブチリシン類似体を開示している。
カルシウム結合部位は、アミノ酸残基⁴¹Asp, ⁷⁵Leu, ⁷⁶
Asn, ⁷⁷Asn, ⁷⁸Ser, ⁷⁹Ile, ⁸⁰Gly, ⁸¹Val, ²⁰⁸Thr、お
よび²¹⁴Tyrを含むとして開示されている；他の潜在的カ
ルシウム結合部位は¹⁴⁰Asp、および¹⁷²Pro ; ¹⁴Pro、お
よび²⁷¹Gln ; および¹⁷²Proおよび¹⁹⁵Gluまたは¹⁹⁷Asp
であると示唆されている。また、¹⁰⁹Asnおよび²¹⁸Asnの
位置の突然変異が示唆されている。産生された突然変異
は、次の通りである：N109S, N109S+N218S, N76D+N109S
-+N218S, N76D+N770D+N109S+N218S, N76D+I79E+N109S+N
218S。

【００２０】国際特許公開第WO88/08164（AMGEN ）は、
システインで置換して潜在的に安定化するジサルファイ
ド結合形成を可能とすることができる残基をタンパク質
の中で同定する方法を記載している。この方法はタンパ
ク質の３次元の構造の詳述された知識に基づき、そして
位置の選択にコンピューターを使用する。スブチリシン
プロテアーゼに関して、スブチリシンBPN'をモデルの系
として使用した。スブチリシンBPN'についてこの方法を
使用して、ジサルファイド結合のために11の候補を示唆
した（１：T22C+S87C，２：V26C+L235C，３：G47C+P57
C，４：M50C+N109C，５：E156C+T164C，６：V165C+K170
C，７：V165C+S191C，８：Q206C+A216C，９：A230C+V27
0C，10：I234C+A274C，11：H238C+W241C ）。

【００２１】これらのうちで、４つが産生され、（１，
２，４、および８）それらのうちで２は安定化効果を提
供しなかった（２および４）。これらの突然変異の２つ
を互いに組み合わせる、および１つを他の突然変異、す
なわち、T22C+S87C+N218S、およびT22C+S87C+Q206C+A21
6C、ことによって、それ以上の突然変異を産生した。ま
た、ある数のそれ以上の不成功に終わった突然変異、す
なわち、A1C+S78C,S24C+S87C, K27C+S89C, A85C+A232C,
I122C+V147C, S249C+A273C、およびT253C+A273Cが産生
された。

【００２２】また、Thomas, Russel、および Fersht, N
ature 318, 375-376 (1985) が示すように、スブチリシ
ンBPN'において⁹⁹Asp の⁹⁹Ser への交換は酵素のpH依存
性を変化させる。引き続く文献J. Mol. Biol. (1987) 1
93。803-813 において、同一の著者らは、また、¹⁵⁶Glu
の代わりに¹⁵⁶Serの置換を論じている。両者のこれらの
突然変異は活性な⁶⁴His からほぼ15オングストロームの
距離内にある。Nature 328, 496-500 (1987) におい
て、RusselおよびFersht は、彼らの実験の結果を論じ
ており、そして酵素を突然変異させて表面電荷を変化さ
せることによって、pH活性のプロフィルを変化させるル
ールを表している。

【００２３】等電点（pI₀） 等電点、pI₀ 、は、酵素分子の複合体（必要に応じて金
属または他のイオンを結合して有する）が中性である、
すなわち、複合体上の静電荷の合計（正味の静電荷＝NE
C ）がゼロに等しい、pH値として定義される。この合計
において、もちろん、個々の静電荷の正または負の性質
を考慮しなくてはならない。等電点は、便利には、問題
の酵素の中の種々の帯電した残基についてのpK値を使用
する平衡の考察を使用し、次いで酵素分子のNEC がゼロ
に等しいpH値を反復して見いだすことによって、計算さ
れる。

【００２４】この計算を使用する１つの問題は、帯電し
た残基のpK値がそれらの環境に依存し、結局変動にさら
されるということである。しかしながら、非常にすぐれ
た結果は特別の近似したpK値を実際の値に無関係に帯電
した残基に割り当てることによって得ることができる。
また、部分的に環境を考慮して、より複雑な計算を実施
することができる。pI₀ は、また、等電点電気泳動によ
るか、あるいは酵素を含有する溶液を滴定することによ
って実験的に決定することができる。また、帯電した残
基についての種々のpK値は滴定により実験的に決定する
ことができる。

【００２５】スブチリシンの工業的応用 プロテアーゼ、例えば、スブチリシンは、タンパク質の
汚れの除去に有用であるので、工業、とくに洗浄剤の配
合物において多くの実用性を見いだした。現在、次のプ
ロテアーゼは既知であり、そしてそれらの多くは世界の
多数の国々において大量に市販されている。スブチリシ
ンBPN'またはNovo、例えばSIGMA 、米国セントルイス、
から入手可能である；

【００２６】スブチリシンカルスバーク（Carlsberg
）、Novo-Noridisk a/s （デンマーク国）によりALCAL
ASE（登録商標）として、およびIBIS（オランダ国）に
よりMAXATASE（登録商標）として市販されている；バチ
ルス・レンツス（Bacillus lentus）スブチリシン、NOV
O INDUSTRI A/S（デンマーク国）によりSAVINASE（登録
商標）として市販されている；SAVINASE（登録商標）に
密接に類似する酵素、例えば、MAXACAL （登録商標）、
IBISにより市販されている、およびOPTICLEAN（登録商
標）、MILES KALI CHEMIE（ドイツ国）により市販され
ている；

【００２７】バチルス・レンツス（Bacillus lentus）
スブチリシン、Novo-Noridisk a/s（デンマーク国）に
よりESPERASE（登録商標）として市販されている；KAZU
SASE（登録商標）、昭和電工（日本国）により市販され
ている。しかしながら、有効であるためには、このよう
な酵素は洗浄条件下に活性を示すばかりでなく、かつま
た洗浄剤の製造および貯蔵の間に他の洗浄剤の成分と適
合性でなくてはならない。

【００２８】例えば、スブチリシンは他の基質に対して
活性な他の酵素と組み合わせて使用することができ、そ
して選択したスブチリシンはこのような酵素に対する安
定性をもつべきであり、そしてまた、選択したスブチリ
シンは好ましくは他の酵素の分解を触媒すべきではな
い。また、選択したスブチリシンは洗浄剤配合物の中の
他の成分、例えば、漂白剤、酸化剤などからの活性に対
して抵抗性であるべきであり、とくに洗浄剤配合物の中
に使用すべき酵素は、貯蔵の間の洗浄剤の中のおよび洗
浄の間の洗浄液の中の酵素以外の成分が発揮した酸化
力、カルシウム結合性質、およびpHに関して安定である
べきである。

【００２９】例えば、洗浄の間に清浄すべき物体上に存
在する種々の天然に存在する基質の分解を触媒する酵素
の能力は、しばしば、洗浄能力、洗浄性、または洗浄性
能と呼ばれる。この出願を通じて、用語洗浄性能をこの
性質を包含するために使用する。天然に存在するスブチ
リシンは、パラメーター、例えば、pHの変動下に、それ
らの洗浄の力または能力に関して高度に価値ある性質を
有する。上の市販されている洗浄剤のプロテアーゼのい
くつかは、事実、約20年前に市販されたものよりすぐれ
た性能を有するが、最適な性能のために、各酵素は配合
および洗浄の条件、例えば、pH、温度、イオン強度（＝
Ｉ）、活性系（テンシド（tensides）、界面活性剤、漂
白剤など）、ビルダーなどに関するそれ自体の特定の条
件を有する。

【００３０】結局、低いpHおよび低いＩにおいて所望の
性質を有する酵素はよりアルカリ性の条件および高いＩ
において魅力に劣るか、あるいは高いpHおよび高いＩに
おいてすばらしい性質を示す酵素は低いpH、低いＩの条
件において魅力に劣ることが発見された。組み換えDNA
技術の出現および発展は、タンパク質化学の分野に強い
影響を及ぼした。これらの技術はペプチドおよびタンパ
ク質、例えば、酵素、およびホルモンを所望の規格に従
い設計することを可能とし、所望の性質を示す化合物の
生産を可能としたと考えられた。

【００３１】現在、所望のアミノ酸配列を有する酵素を
構成することが可能であり、そして上に示したように、
かなりの量の研究が変更された性質をもつスブチリシン
の設計に捧げられてきている。提案の中には、欧州特許
発行第130756号（GENENTECH）（米国特許第 4,760,025
号（GENENCOR）および国際特許公開第WO87/05050号（GE
NEX ）に記載されているような多数の突然変異した酵素
を産生しそしてスクリーニングする技術は、自然の酵素
を分離しそしてそれらをそれらの性質についてスクリー
ニングする古典的方法に相当するが、多数の異なる突然
変異の酵素の存在の知識を通してより効率的である。

【００３２】スブチリシン酵素は典型的には275 アミノ
酸残基からなり、各アミノ酸残基は20の可能な天然に存
在するアミノ酸の中から１つであることができるので、
１つの非常に重大な欠点が存在する、すなわち、非常に
多数の突然変異が発生し、これらの突然変異を予備的に
スクリーニングした後、最初のスクリーニングで興味あ
る特性を示す選択した突然変異をさらに試験しなくては
ならない。なぜなら、問題の使用のために改良された性
質をもつ所望の酵素を得るために、例えば、この場合に
おいて洗浄液の特定した条件下に改良された洗浄性能を
示す洗浄剤組成物を配合するために、どのアミノ酸残基
を変化させることを決定する指針が存在しないからであ
る。

【００３３】これらの特許出願に概説されている手順
は、結局、多年にわたって知られている伝統的ランダム
突然変異の手順よりわずかにすぐれるのみである。他の
既知の技術は、特定の性質、例えば、エステル交換およ
び加水分解の速度（欧州特許発行第260105号（GENENCO
R））、pH−活性のプロフィル（Thomas, Russell、およ
びFersht, supra）、および基質の特異性（国際特許公
開第WO88/07578号（GENENTECH））を変えることに関す
る。これらの刊行物のいずれも酵素の洗浄性能の変化に
関するものではない。

【００３４】存在する他の技術は、ある種のアミノ酸を
置換する潜在的結果を分析するための、タンパク質の３
次元の構造についての詳細な情報を使用することであ
る。このアプローチは使用されてきており、そして欧州
特許（EP）260105号（GENENCOR）、WO88/07578（GENENT
ECH）、WO88/0808（GENEX）、WO88/08033、およびWO88/
08164（GENEX）に記載されている。こうして、上に示し
たように、酵素のよく定められた性質、例えば、前述の
性質と酵素の洗浄性能との間の関係はまだ同定されてい
ない。

【００３５】未公開の国際特許出願PCT/DK88/00002号
（NOVOINDUSTRI A/S）において、突然変異のためにどの
アミノ酸位置を選択すべきであるか、および洗浄性能に
おいて所望の変化を得るためにどのアミノ酸をこれらの
位置において置換すべきであるかを決定するために、相
同性の比較の概説を使用することが提案されている。こ
のような手順を使用することによって、発生する突然変
異の数は非常に小さいので、スクリーニングの仕事は劇
的に減少するが、その手順では、親酵素および比較に使
用する酵素の組み合わせた有用な性質を示す酵素を得る
ことができることが予想されるだけである。

【００３６】問題は、非常に多くの研究が酵素の活性の
メカニズムの明らかにするために向けられてきている
が、酵素の洗浄性能に関して酵素の性質を決定する構造
およびアミノ酸残基の組み合わせにおけるファクターに
ついてまだほんのわずかしか知られていない。結局、酵
素を洗浄系に対してさらに改良および調整し、ならびに
クリーニングまたは洗浄剤組成物の実際の使用における
プロテアーゼの作用のメカニズムのよりよい理解のため
の必要性がなお存在する。このような理解は、合理的な
程度の確実さをもって、洗浄液の中の特定した条件下に
改良された洗浄性能を示す酵素を生ずるであろう。突然
変異の選択に応用することができるルールを生ずること
ができる。

【００３７】発明の要約 これらの問題についてのそれ以上の研究により、今回、
驚くべきことには、洗浄剤組成物におけるスブチリシン
酵素の使用において重要な因子の１つは、基質、すなわ
ち、テキスタイルから除去すべき物質、硬い表面または
清浄すべき他の物質への酵素の吸着であることが示され
た。結局、本発明は突然変異したスブチリシン遺伝子に
より発現される突然変異のスブチリシンの性質を変化す
るスブチリシン遺伝子の突然変異に関し、これにより前
記突然変異スブチリシン酵素は洗浄剤組成物において改
良された挙動を示す。突然変異は、スブチリシン酵素の
中の特定の位置における特定のアミノ酸の発現の原因と
なる親スブチリシン遺伝子の中の特定の核酸において発
生する。

【００３８】本発明は、また、突然変異すべき位置およ
びアミノ酸、これによりムタチス・ムタンジス（mutati
s mutadis ）、すなわち、問題のスブチリシン遺伝子に
おいて変化すべき核酸を選択する方法に関する。本発明
は、一部分、スブチリシン309 およびスブチリシンカル
スバーグ（Carlsberg ）の遺伝子の突然変異、およびpH
値が変動する洗浄液を生ずる異なる洗浄剤組成物におい
て改良された洗浄性能を示す、突然変異のスブチリシン
309 およびカルスバーグ（Carlsberg ）の酵素を保証す
ることに関するが、これらに限定されない。

【００３９】

【表１】

【００４０】突然変異 本発明に従い産生されるか、あるいは考えられる種々の
突然変異の記載において、次の命名法を言及の容易さの
ために適応させた：１または２以上のもとのアミノ酸、
１または２以上の位置、１または２以上の置換されたア
ミノ酸。これに従い、位置195 におけるグリシンのグル
タミン酸による置換は、次のように表示される： Gly195GluまたはG195E 同一位置における欠失は、次の通りである： Gly195*またはG195*

【００４１】そして追加のアミノ酸残基、例えば、リジ
ンの挿入は次の通りである： Gly195GlyLysまたはG195GK 欠失が第Ｉ表に示されるか、あるいは第Ｉ表に示されて
内スブチリシンの中に存在する場合、このような位置に
おける挿入は、位置36におけるアスパラギン酸の挿入に
ついて、次のように示される： *36Aspまたは*36D 多重突然変異はプラスで分離する、すなわち、Arg170Ty
r+Gly195GluまたはR170+G195Eそれぞれ、アルギニンお
よびグリシンをチロシンおよびグルタミン酸で置換する
位置170 および195 における突然変異を表す。

【００４２】

【表２】

【００４３】

【表３】

【００４４】

【表４】

【００４５】

【表５】

【００４６】

【表６】

【００４７】

【表７】

【００４８】

【表８】

【００４９】発明の詳細な説明 前述したように、本発明は、生ずる酵素の表面の上にま
たはそれに密接して位置のアミノ酸の発現の原因となる
コドンにおいて、修飾しようとする、スブチリシン酵素
の遺伝子を突然変異させることによってアミノ酸配列が
変化している、突然変異したスブチリシンに関する。

【００５０】本発明に関して、スブチリシンはグラム陽
性のバクテリアまたは菌カビ類により産生されたセリン
プロテアーゼとして定義される。本発明の多数の実施態
様に適用可能な、より狭い意味において、スブチリシン
はまだグラム陽性バクテリアのセリンプロテアーゼを意
味する。他の定義に従い、スブチリシンは、触媒のトリ
アドの中にアミノ酸残基の比較的順序がAsp-His-Ser
（位置32, 64、および221）である、セリンプロテアー
ゼである。なおより特定の意味において、本発明の実施
態様の多くは、スブチリシンが上の表Ｉに列挙されてい
る、それらの一次構造において実質的に明瞭な相同性と
することができる、グラム陽性バクテリアのセリンプロ
テアーゼに関する。

【００５１】ある数の他の既知のスブチリシンのアミノ
酸配列と整列した上の表Ｉに示す、スブチリシンBPN'の
アミノ酸配列から由来する番号を付すシステムを使用す
ると、スブチリシン酵素の中のアミノ酸残基の位置を明
瞭に示すことができる。スブチリシンBPN'の中のアミノ
酸残基数１の前の位置は、負の数、例えば、サーミター
ゼの中のＮ末端Ｙについて−６が割り当てられるか、あ
るいはプロテイナーゼＫの中のＮ末端Ａについて０が割
り当てられる。スブチリシンBPN'に関するインサートで
あるアミノ酸残基は、スブチリシンBPN'の数に先行する
アルファベットの文字の付加により番号を付され、例え
ば、¹²Serと¹³Thrとの間のプロテイナーゼＫの中の「イ
ンサート」S-T-P-G について12a, 12b, 12d, 12eであ
る。

【００５２】上の番号を付すシステムを使用すると、問
題の位置は次の通りである：

【表９】

【００５３】等電点（pI₀） 洗浄条件下の基質が酵素のそれと反対の静電荷を有する
と仮定すると、基質への酵素の吸着、こうして洗浄性能
は酵素の正味の静電荷、NEC 、を増加することによって
改良されることを期待することができるであろう。しか
しながら、驚くべきことには、このような環境下の酵素
のNEC の減少は酵素の洗浄性能を改良することができる
ことが発見された。

【００５４】換言すると、より低いpHに近付く方向の酵
素の等電点、pI₀ 、の変化は、また、酵素の最適な洗浄
性能のpHをより低い値にシフトすることが発見され、こ
れが意味するように、酵素が活性であるべき低いpHの洗
浄液に対する酵素を設計するためには、既知のスブチリ
シン酵素の洗浄性能の改良は、より低いpI₀ を有する突
然変異の酵素を得るように既知のスブチリシン酵素のた
めの遺伝子を突然変異させることによって得ることがで
きる。この発見は反対がまた可能であることを示す実験
に導いた。これが意味するように、既知のスブチリシン
酵素を、また、そのpI₀ をより高い値にシフトし、これ
により酵素に最適な洗浄性能のpHをより高いpH値にシフ
トすることによって高いpHの洗浄剤において使用するた
めに設計出来る。

【００５５】したがって、本発明は、１つの面におい
て、正味の静電荷が同一pHにおいて親のプロテアーゼに
比較して変化しており、そして突然変異したスブチリシ
ンプロテアーゼの中に、前記親のプロテアーゼに関し
て、より少ないまたはより多い正に帯電したアミノ酸残
基および／またはより多いまたはより少ない負に帯電し
たアミノ酸残基、またはより多いまたはより少ない正の
帯電したアミノ酸残基および／またはより少ないまたは
より多い負に帯電したアミノ酸残基が、アミノ酸残基の
間で、１または２以上の位置

【００５６】

【表１０】

【００５７】に存在し、そしてこれにより前記スブチリ
シンプロテアーゼは、前記親のプロテアーゼのそれよ
り、それぞれ、低いか、あるいは高い等電点pH（pI₀ ）
を有する、突然変異したスブチリシンプロテアーゼに関
する。好ましい実施態様において、本発明は、NEC が同
一pHにおいて親のプロテアーゼに比較して変化してお
り、そして突然変異したスブチリシンプロテアーゼの中
に、前記親のプロテアーゼに関して、より少ないまたは
より多い正に帯電したアミノ酸残基および／またはより
多いまたはより少ない負に帯電したアミノ酸残基、また
はより多いまたはより少ない正に帯電したアミノ酸残基
および／またはより少ないまたはより多い負に帯電した
アミノ酸残基が、アミノ酸残基の間で、１または２以上
の位置

【００５８】

【表１１】

【００５９】に存在し、そしてこれにより前記スブチリ
シンプロテアーゼは、前記親のプロテアーゼのそれよ
り、それぞれ、低いか、あるいは高い等電点pH（pI₀ ）
を有する、突然変異したスブチリシンプロテアーゼに関
する。他の好ましい実施態様において、本発明は、NEC
が同一pHにおいて親のプロテアーゼに比較して変化して
おり、そして突然変異したスブチリシンプロテアーゼの
中に、前記親のプロテアーゼに関して、より少ないまた
はより多い正に帯電したアミノ酸残基および／またはよ
り多いまたはより少ない負に帯電したアミノ酸残基、ま
たはより多いまたはより少ない正に帯電したアミノ酸残
基および／またはより少ないまたはより多い負に帯電し
たアミノ酸残基が、アミノ酸残基の間で、１または２以
上の位置

【００６０】

【表１２】 に存在し、そして位置

【００６１】

【表１３】

【００６２】の群から選択される位置を占有するアミノ
酸残基に影響を与える少なくとも１つのそれ以上の突然
変異が存在し、そしてこれにより前記スブチリシンプロ
テアーゼは、前記親のプロテアーゼのそれより、それぞ
れ、低いか、あるいは高い等電点pH（pI₀ ）を有する、
突然変異したスブチリシンプロテアーゼに関する。これ
らの面において、本発明は、簡単に述べると、突然変異
のプロテアーゼのpI₀ が親のプロテアーゼのpI₀ より低
く、そして最適な洗浄性能のためのpHが、また、親のプ
ロテアーゼの最適なpHより低い突然変異のプロテアー
ゼ；または突然変異のプロテアーゼのpI₀ が親のプロテ
アーゼのpI₀ より高く、そして最適な洗浄性能のための
pHが、また、親のプロテアーゼの最適なpHより高い突然
変異のプロテアーゼに関する。

【００６３】一般に、反応速度論の性質は酵素の中の活
性部位の付近における表面静電荷を変化させることによ
って影響を及ぼすことができると信じられる（Thomas,
Russell、およびFersht, Supra）が、今回、驚くべきこ
とには、酵素の反応速度論の変化は、また、活性部位か
ら遠い表面電荷を変更することによって発生させること
ができることが発見された。

【００６４】結局、本発明は、また、突然変異のスブチ
リシン酵素の触媒のトリアドから15オングストローム以
上の距離にある１または２以上のアミノ酸残基がその親
酵素のアミノ酸配列に比較して変化されており、こうし
て酵素の最適な洗浄性能のためのpHをシフトしようとす
るのと同一方向にシフトされた等電点（＝pI₀ ）を有す
る突然変異のプロテアーゼを提供する、突然変異のスブ
チリシン酵素を包含すると考えられ、前記最適なpHは、
前記突然変異のプロテアーゼの使用を意図する、洗浄液
のpHに出来るだけ近くあるべきである。

【００６５】本発明のいくつかの実施態様に従い、突然
変異のプロテアーゼが、例えば、負に帯電したアミノ酸
残基（例えば、ＤまたはＥ）または中性の極性残基（例
えば、Ａ、Ｑ、またはＮ）または正のアミノ酸残基、例
えば、ＲまたはＫを挿入するために、位置36に挿入突然
変異を含有する、突然変異のプロテアーゼおよび洗浄剤
組成物が提供される。これは、とくに、例えば、スブチ
リシン309 および147 およびPB92、およびそれがスブチ
リシンBPN'の配列に関して位置36におけるアミノ酸残基
の損失を自然に有することを相同性を示す、任意の他の
配列に適用可能である。

【００６６】位置36における挿入突然変異は、それ以上
の突然変異、例えば、位置120, 170, 195, 235および／
または251 の１または２以上に、および／または位置76
に突然変異を有することができる。位置76における適当
な突然変異は、例えば、負に帯電した残基、例えば、N7
6DまたはN76Eである。

【００６７】位置36における突然変異（ことに負または
極性中性の残基）および位置76における突然変異（負に
帯電した残基による置換）は、しばしば、突然変異のプ
ロテアーゼへの安定化効果を有することができ、そして
組み合わせて使用することができる。例えば、位置120,
170, 195, 235および251 の１または２以上における突
然変異は、酵素活性の増加に関連することが発見され
た。後者の突然変異が安定性の損失に個々に関連する場
合でさえ、それらを位置36および76の一方または両者に
おける突然変異と組み合わせることは許容されかつ有用
であることがある。

【００６８】このようなプロテアーゼ突然変異の有用な
例は、次の突然変異を有するものである：

【００６９】

【表１４】

【００７０】ある条件下に、分子の中のどこかに正の電
荷を挿入するために、位置36に負のアミノ酸残基の挿入
を有する突然変異のプロテアーゼの中にそれ以上の突然
変異を配置することは有利であることがある。これは、
生ずる突然変異のプロテアーゼ、例えば、それ以上の突
然変異が正の電荷、例えば、位置213 における正に帯電
した残基を提供する、例えば、T213K、の水安定性を増
加することができる。

【００７１】本発明に従い、さらに、突然変異のスブチ
リシン酵素は、スブチリシンBPN'、スブチリシンアミロ
サッカリチクス、スブチリシン168 、スブチリシンメセ
ンテリコペプチダーゼ、スブチリシンカルスバーグ（Ca
rlsberg ）、スブチリシンDY、スブチリシン309 、スブ
チリシン147 、サーミターゼ、バチルス属（Bacillus）
PB92プロテアーゼ、およびプロテイナーゼＫ、好ましく
はスブチリシン309 、スブチリシン147 、スブチリシン
カルスバーグ（Carlsberg ）、アクアリシン、プロテア
ーゼTW7 、またはプロテアーゼTW3 である。さらに好ま
しい実施態様は、１または２以上の突然変異を含有する
スブチリシン酵素からなる：

【００７２】

【表１５】

【００７３】

【表１６】

【００７４】さらに特別に好ましい実施態様は、１また
は２以上の突然変異を含有する突然変異したスブチリシ
ンプロテアーゼからなる：

【００７５】

【表１７】

【００７６】

【表１８】

【００７７】

【表１９】

【００７８】本発明のそれ以上の面において、pI₀ につ
いての上の考察は、親酵素の中のアミノ酸についての欠
失、置換または挿入すべき１または２以上の位置および
１または２以上のアミノ酸を決定または選択し、ここで
生ずる突然変異の酵素の中の計算した正味の静電荷（＝
NEC ）が同一pH値において計算した選択の親酵素の中の
NEC に比較して変化している方法で、選択を実施する方
法において、さらに、利用される。

【００７９】本発明によりカバーされるこの原理を表す
他の方法は、酵素の最適な洗浄性能のためのpHをシアト
しようとするのと同一方向にシフトされた等電点（＝pI
₀ ）を有する突然変異のプロテアーゼを提供する方法
で、生ずる突然変異の酵素の中の電荷の合計の数または
合計の電荷含量（＝TCC ）、および／またはNEC が変化
される方法で、前記親酵素の中のアミノ酸のために欠
失、置換または挿入すべき１または２以上の位置および
１または２以上のアミノ酸を選択することであり、最適
なpHは前記突然変異のプロテアーゼの使用を意図する、
洗浄液のpHに出来るだけ近くあるべきである。

【００８０】上に示したように、巨大分子、例えば、酵
素のpI₀ は分子NEC がゼロに等しいpHとして計算され
る。この手順は下の実施例に例示するが、原理はここに
おいてより詳細に記載する。pK値は各潜在的に帯電する
アミノ酸残基に割り当てられる。次いで、帯電または非
帯電の形態の所定のpHにおけるアミノ酸残基の存在の比
（帯電／非帯電、Ｃ／Ｕ（ｉ））は、式IaおよびIbを使
用することによって、両者の負の電荷および正の電荷に
ついて計算する：

【００８１】それぞれ C/U (i)＝exp（ln₁₀(pH-pK_i））（負の電荷） （Ia） C/U (i)＝exp（ln₁₀(pK_i-pH））（正の電荷） （Ib） 式IaおよびIbから理解されるように、pK_i に等しいpHに
おいて、Ｃ／Ｕ（ｉ）は１に等しい。

【００８２】次いで、相対的電荷、Ｑ_r （ｉ）、または
各帯電した残基に割り当てられる電荷の寄与は式IIa お
よびIIb を使用して計算される： Q_r (i) ＝C/U (i) / (1+C/U (i）） （負の電荷） （IIa） Q_r (i) ＝-C/U (i) / (1+C/U (i））（正の電荷） （IIb） 帯電した残基からのすべての電荷の寄与の合計がゼロに
等しいpH値は、十分に密なpH−電荷の合計の表における
反復または補間により見いだされる。

【００８３】突然変異の酵素を含有する洗浄剤組成物 本発明は、また、クリーニンおよび洗浄剤組成物におけ
る本発明の突然変異の酵素の使用および突然変異のスブ
チリシン酵素からなるこのような組成物からなる。本発
明の前の面のいずれかに従う突然変異のスブチリシン酵
素の１または２以上の単独または当業者によく知られて
いるこのような組成物に含まれる通常の成分のいずれと
の組み合わせからなる。

【００８４】このような成分は、ビルダー、例えば、ホ
スフェートまたはゼオライトのビルダー、界面活性剤、
例えば、アニオン、カチオンまたは非イオン型界面活性
剤、ポリマー、例えば、アクリルまたは同等のポリマ
ー、漂白系、例えば、パーボレート−またはアミノ−含
有漂白前駆体またはアクチベーター、構造因子（struct
urant）、例えば、シリケートの構造因子、アルカリま
たは酸のpH調節剤、吸湿剤、および／または中性の無機
塩からなる。いくつかの有用な実施態様において、洗浄
剤組成物は次のようにして配合することができる：

【００８５】ａ）ホスフェートのビルダー、アニオン型
界面活性剤、非イオン型界面活性剤、アクリルまたは同
等のポリマー、パーボレートの漂白前駆体、アミノを含
有する漂白アクチベーター、シリケートまたは他の構造
因子、使用において所望のpHを調節するためのアルカ
リ、および中性の無機塩を含有する粉末として配合され
た洗浄剤組成物。 ｂ）ゼロライトのビルダー、アニオン型界面活性剤、非
イオン型界面活性剤、アクリルまたは同等のポリマー、
パーボレートの漂白前駆体、アミノを含有する漂白アク
チベーター、シリケートまたは他の構造因子、使用にお
いて所望のpHを調節するためのアルカリ、および中性の
無機塩を含有する粉末として配合された洗浄剤組成物。

【００８６】ｃ）アニオン型界面活性剤、非イオン型界
面活性剤、吸湿剤、有機酸、苛性アルカリ、pHを９〜10
に調節する、からなる水性洗浄剤液として配合された洗
浄剤組成物。 ｄ）線状アルコキシル化第１アルコールから本質的に成
る液状非イオン型界面活性剤、トリアセチン、ナトリウ
ムトリホスフェート、苛性アルカリ、パーボレートモノ
ハイドレートの漂白前駆体、および第３アミンの漂白ア
クチベーター、pHを約９〜10に調節する、からなる水性
洗浄剤液として配合された洗浄剤組成物。

【００８７】ｅ）少なくとも 550ｇ／ｌ、例えば、少な
くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有し、アニオンおよび非
イオン型界面活性剤、例えば、アニオン型界面活性剤お
よび約７および約３のそれぞれのアルコキシル化度をも
つ非イオン型界面活性剤の混合物、低いまたは実質的に
ゼロの中性の無機塩、ホスフェートのビルダー、パーボ
レートの漂白前駆体、第３アミンの漂白アクチベータ
ー、ケイ酸ナトリウム、および少量物質および湿分を含
有する、粒体の形態の洗浄剤粉末として配合された洗浄
剤組成物。

【００８８】ｆ）少なくとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有
し、アニオン型界面活性剤および約７および約３のそれ
ぞれのアルコキシル化度をもつ非イオン型界面活性剤の
混合物、低いまたは実質的にゼロの中性の無機塩、ゼオ
ライトのビルダー、パーボレートの漂白前駆体、第３ア
ミンの漂白アクチベーター、ケイ酸ナトリウム、および
少量物質および湿分を含有する、粒体の形態の洗浄剤粉
末として配合された洗浄剤組成物。 ｇ）アニオン型界面活性剤、非イオン型界面活性剤、ア
クリルポリマー、脂肪酸石鹸、炭酸ナトリウム、アミン
を含むか、あるいは含まない粘度粒子、パーボレートの
漂白前駆体、第３アミンの漂白アクチベーター、ケイ酸
ナトリウム、および少量物質および湿分を含有する、洗
浄剤の粉末として配合された洗浄剤組成物。

【００８９】ｈ）タロウおよびココナッツオイルのハン
鹸化混合物に基づく石鹸、オリトリン酸で中和し、プロ
テアーゼと混合し、またギ酸ナトリウム、硼砂、プロピ
レングリコールおよび硫酸ナトリウムと混合し、次いで
石鹸製造ライン上に圧出した、を含有する洗浄剤（石
鹸）の棒として配合された洗浄剤組成物。 ｊ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に相当する速度で使用
するとき、９またはそれより小さい洗浄液のpHを得るよ
うに配合した酵素の洗浄剤組成物。 ｋ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に相当する速度で使用
するとき、8.5 またはそれ以上の洗浄液のpHを得るよう
に配合した酵素の洗浄剤組成物。

【００９０】ｌ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に相当す
る速度で使用するとき、0.03またはそれより小さい、例
えば、0.02またはそれより小さい洗浄液のイオン強度を
得るように配合した酵素の洗浄剤組成物。 ｍ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に相当する速度で使用
するとき、0.01またはそれより大きい、例えば、0.02ま
たはそれより大きい洗浄液のイオン強度を得るように配
合した酵素の洗浄剤組成物。

【００９１】リパーゼと組み合わせて突然変異の酵素か
らなる洗浄剤組成物 驚くべきことには、等電点、pI、の減少、それゆえ洗浄
条件下のスブチリシン型プロテアーゼの正味電荷の減少
は、酵素の洗浄性能を改良するばかりでなく、かつまた
リパーゼとの適合性を改良することができることが発見
された。また、驚くべきことには、プロテアーゼとリパ
ーゼとの適合性はpIによるばかりでなく、かつまたプロ
テアーゼの活性部位に関して電荷が位置する位置により
影響を及ぼされることが発見された：活性部位により密
接した負の電荷の導入または正の電荷の除去は、プロテ
アーゼとリパーゼとの適合性のより強く改良する。

【００９２】したがって、本発明のある種の実施態様
は、リパーゼからなりそしてまた突然変異したスブチリ
シンプロテアーゼからなる、酵素の洗浄剤組成物を提供
し、ここで突然変異したプロテアーゼの正味の分子の静
電荷は親のプロテアーゼに比較してアミノ酸残基の挿
入、欠失または置換により変化しており、そしてここ
で、前記プロテアーゼの中に、前記親酵素に関して、よ
り少ない正に帯電したアミノ酸残基および／またはより
多い負に帯電したアミノ酸残基が存在し、これにより前
記スブチリシンプロテアーゼは前記親酵素のそれより低
い等電点（pI₀ ）を有する。

【００９３】このような使用のための１つの好ましいク
ラスはグラム陰性バクテリアから由来し、そして欧州特
許（EP）0 205 208号および欧州特許（EP）0 206 390号
（両者はUniliver）（ここに引用によって加える）にお
いて定義された群のリパーゼの酵素を包含し、ある種の
Ps. fluorescence, P. gladioli およびクロモバクター
（Chromobacter）種からのものに免疫学的に関係するリ
パーゼを包含する。前述のリパーゼと組み合わせて使用
するための突然変異したスブチリシンプロテアーゼ酵素
の好ましい実施態様は、活性部位、ことに、例えば、位
置170, 120、または195 から約15A-20A の範囲内に位置
するアミノ酸残基の部位に１または２以上の突然変異を
有する。

【００９４】リパーゼは、有用には、脂肪分解酵素と担
体物質（例えば、欧州特許（EP）258068号（Novo Nordi
sk A/S）およびNovo Nordisk A/SのSavinase（登録商
標）およびLipolase（登録商標製品）との粒状組成物
（あるいは溶液またはスラリー））の形態で添加するこ
とができる。リパーゼの添加量は、広い限界内、例え
ば、50〜3,000LU／ｇ の界面活性剤系または洗浄剤組成
物、例えば、しばしば少なくとも 100LU／ｇ、非常に有
用には少なくとも 500LU／ｇ、時には好ましい 100以
上、2000LU／ｇ以上または4000LU／ｇ以上内、こうして
非常に範囲50〜4000LU／ｇおよび可能ならば範囲 200〜
1000LU／ｇ内で選択することができる。この規格におい
て、リパーゼの単位は欧州特許（EP）258068号における
ように定義される。

【００９５】脂肪分解酵素は広い範囲のリパーゼの中か
ら選択することができる：とくに、例えば、次の特許明
細書、欧州特許（EP）214761号（Novo Nordisk A/S）、
欧州特許（EP）0 258 068号 に記載されているリパーゼ
およびことにサーモミセス・ラヌギノスス（Thermomyce
s lanuginosus）ATCC22070からのリパーゼに対してレイ
ズされた抗血清との免疫学的交差反応性を示すリパー
ゼ、欧州特許（EP）0 205 208号および欧州特許（EP）0
206 390号およびクロモバクター・ビスコスム・バル・
リポリチクム（Chromobacter viscosum varlipolyticu
m）NRRL B-3673 に対して、またはアルカリゲネス（Alc
aligenes）PL-679, ATCC31371 およびFERM-P3783 に対
してレイズされた抗血清と免疫学的に交差反応性のリパ
ーゼ、また、明細書WO87/00859（Gist-Brocades）およ
び欧州特許（EP）0 204 284号（サッポロ醸造会社）。

【００９６】とくに、例えば、次の商業的に入手可能な
リパーゼ調製物に示すである： Novo Lpolase（登録商
標）、アマノ（Amano）リパーゼCE、Ｐ、Ｂ、AP、Ｍ−A
P、AML、およびCES 、およびメイト（Meito）リパーゼ
MY-30、OF、および PL、またEsterase（登録商標）MM、
Lipozym（登録商標）、SP225、SP285、サイケン（Saike
n）リパーゼ、エンゼコ（Enzeco）リパーゼ、東洋醸造
リパーゼおよびジオシンス（Diosynth）リパーゼ（商
標）。

【００９７】酵素の遺伝子工学は、適当なリパーゼ遺伝
子、例えば、サーモミセス・ラヌギノスス（Thermomyce
s lanuginosus ）またはその突然変異からのリパーゼの
遺伝子を抽出し、そして遺伝子またはその誘導体を適当
な産生体の有機体、例えば、アスペルギルス属（Asperg
illus ）の中に導入しそして発現させることによって達
成することができる。WO88/02775（Novo Nordisk A/
S）、欧州特許（EP）0 243 338号（Labofina）、欧州特
許（EP）0 268 425号（Genencor）および顕著には欧州
特許（EP）0 305 216号（Novo Nordisk A/S）、または
欧州特許（EP）0 283075号（Gist-Brocades）に記載さ
れている技術を適用および適合させることができる。

【００９８】同様な考察は、また、存在することができ
る、他の酵素の場合においてムタチス・ムタンジス（mu
tatis mutadis ）を適用する。制限なしに、アミラーゼ
は、例えば、洗浄剤組成物の１ｇ当たり約１〜約 100MU
（マルトース単位）（または0.014〜1.4、例えば、0.07
〜0.7、KNU／ｇ（Novo単位）の範囲の量で存在すると
き、使用することができる。セルラーゼは、例えば、洗
浄剤組成物の１ｇ当たり約 0.3〜約35CEVU単位の範囲の
量で存在するとき、使用することができる。

【００９９】洗浄剤組成物は、さらに、次の通常の洗浄
剤の成分を通常の量で含むことができる。それらはビル
トまたはアンビルトであることができ、そしてゼロ−Ｐ
型（すなわち、リンを含有するビルダーを含有しない）
であることができる。こうして、組成物は凝集した形態
で１〜50重量％、例えば、少なくとも５重量％および約
35〜40重量％の１または２以上の有機および／または無
機のビルダーを含有することができる。

【０１００】このようなビルダーの典型的な例は、上に
既に述べたものを包含し、より広くアルカリ金属のオル
ト、ピロ、およびトリポリホスフェート、アルカリ金属
のカーボネートを、単独でまたはカルサイト、アルカリ
金属のクエン酸塩、アルカリ金属のニトロトリアセテー
ト、カルボキシメチルオキシスクシネート、ゼオライ
ト、オリアセタールカルボキシレートなどを包含する。
さらに、洗浄剤組成物は１〜35％の漂白剤または漂白前
駆体または漂白剤および／または前駆体とそのアクチベ
ーターとからなる系を含有することができる。それ以上
の任意の成分は、泡ブースター、泡抑制剤、腐食防止
剤、汚れ懸濁剤、金属封鎖剤、汚れ再付着防止剤、香
料、色素、酵素の安定剤などである。

【０１０１】組成物はテキスタイル材料、ことに限定さ
れないが綿およびポリエステルに基づくテキスタイルお
よびそれらの混合物の洗浄に使用することができる。例
えば、約60〜65℃以下、例えば、約30℃〜35℃以下の温
度においてが疑われる洗浄法はことに適当である。洗浄
液の中に、例えば、0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤を提供
するために十分な速度で組成物を使用することは非常に
適当であるが、もちろん必要に応じてこれより少ない
か、あるいは多い量で使用することができる。制限なし
に、例えば、洗浄剤配合物の約３ｇ／ｌから約６ｇ／ｌ
の使用割合は、配合物が実施例におけるようなときの場
合における使用に適当であると、述べることができる。

【０１０２】スブチリシン遺伝子の中で突然変異を産生
する方法 遺伝子の中に突然変異を導入する多数の方法はこの分野
においてよく知られている。スブチリシン遺伝子のクロ
ーニングの簡単な説明後、スブチリシン遺伝子内の両者
のランダム部位および特定の部位を論ずる。

【０１０３】スブチリシン遺伝子のクローニング スブチリシンをコードする遺伝子は、この分野において
よく知られている種々の方法により、グラム陽性のバク
テリアまたは菌類からクローニングすることができる。
まず、DNA のゲノムおよび／またはcDNAのライブラリー
を研究すべきスブチリシンを産生する有機体由来の染色
体のDNA またはメッセンジャーRNA を使用して構築する
ことができる。

【０１０４】次いで、スブチリシンのアミノ酸配列が既
知である場合、相同性の標識したオリゴヌクレオチドの
プローブを合成し、そしてバクテリアのDNA のゲノムの
ライブラリーからか、あるいは菌類のcDNAライブラリー
から、スブチリシンをコードするクローンを同定するた
めに使用することができる。あるいは、バクテリアまた
は菌類の他の菌株からのスブチリシンに対して相同性の
物質を含有する標識したオリゴヌクレオチドのプローブ
を、より低い厳密さのハイブリダイゼーションおよび洗
浄の条件を使用して、スブチリシンをコードするクロー
ンを同定する。

【０１０５】スブチリシンを産生する同定するなお他の
方法は、ゲノムのDNA の断片を発現ベクター、例えば、
プラスミドの中に挿入し、プロテアーゼ陰性のバクテリ
アを生ずるゲノムのDNA ライブラリーで形質転換し、次
いで形質転換されたバクテリアをスブチリシンのための
基質、例えば、スキムミルクを含有する寒天の上にプレ
イティングすることを包含する。スブチリシンを有する
プラスミドを含有するバクテリアは、分泌したスブチリ
シンによりスキムミルクの消化のために、透明な寒天の
ハローにより取り囲まれたコロニーを産生する。

【０１０６】スブチリシン遺伝子の中のランダム突然変
異の発生 いったんスブチリシン遺伝子が適当なベクター、例え
ば、プラスミドの中にクローニングされたら、いくつか
の方法を使用してランダム突然変異を遺伝子の中に導入
することができる。１つの方法はクローニングしたスブ
チリシン遺伝子を、回転可能なベクターの一部分とし
て、大腸菌（Escherichia coli）の突然変異の株の中に
組み込むことであろう。

【０１０７】他の方法は、スブチリシン遺伝子の単一の
標準の形態を発生し、次いでスブチリシン遺伝子を他の
DNA 断片とともに含有するDNA の断片をアニーリング
し、こうしてスブチリシン遺伝子の一部分が一本鎖で止
まるようにすることを包含する。次いで、この明確な、
一本鎖の領域はある数の突然変異誘発因子のいずれかに
暴露し、これらの因子は、次のものを包含するが、これ
らに限定されない：重亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシル
アミン、亜硝酸、ギ酸、またはヒドララジン。

【０１０８】このランダム突然変異を発生する方法の特
定の例は、Shortle およびNathans（1978, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 75 : 2170-2174）により記載され
た。ShortleおよびNathans の方法に従い、スブチリシ
ン遺伝子を有するプラスミドは遺伝子内で切断する制限
酵素により切り込まれる。このニックはDNA ポリメラー
ゼＩのエキソヌクレアーゼ作用を使用してギャップに広
くされるであろう。次いで、生ずる一本鎖のギャップを
前述の突然変異誘発因子のいずれか１つを使用して突然
変異誘発することができるであろう。

【０１０９】あるいは、自然のプロモーターおよび他の
コントロール配列を包含する、バチルス属（Bacillus）
種からのスブチリシン遺伝子は、両者のE.coliおよび枯
草菌（B. subtilis）のためのレプリコン、ヘルパーフ
ァージIR1による重感染のとき一本鎖のプラスミドDNA
の産生のための選択可能な表現型のマーカーおよび M13
由来を含有するプラスミドの中にクローニングすること
ができるであろう。クローニングしたスブチリシン遺伝
子を含有する一本鎖のプラスミドDNA を分離し、スブチ
リシンのベクター配列を含有するが、解読領域を含有し
ないDNA 断片とアニーリングし、ギャップド二重らせん
分子を生ずる。突然変異を、重亜硫酸ナトリウム、亜硝
酸またはギ酸を使用するか、あるいは前述したように、
E.coliの突然変異体株の中の複製により、スブチリシン
遺伝子の中に導入する。

【０１１０】重亜硫酸ナトリウムは一本鎖DNA の中のシ
トシンともっぱら反応するので、この突然変異原でつく
った突然変異は解読領域にのみ制限される。反応時間お
よび重亜硫酸塩を異なる実験において変化させ、こうし
て平均してスブチリシン遺伝子当たり１〜５つの突然変
異がつくられる。10μｇのギャップド二重らせんDNAを
４モルの重亜硫酸ナトリウム、pH6.0 の中で37℃におい
て９分間インキュベーションすると、一本鎖の領域の中
の約１％のシトシンを実証する。成熟したスブチリシン
の解読領域は、DNA の鎖に依存して、約 200のシトシン
を含有する。有利には、反応時間は４分（200 の中で約
１の突然変異の頻度を生成するために）から約20分（20
0 の中で約５）まで変化させることができる。

【０１１１】突然変異誘発後、ギャップド分子をDNA ポ
リメラーゼＩ（クレノー断片）で試験管内処理して、完
全に二本鎖の分子および６つの突然変異をつくる。次い
で、能力E.coliを突然変異誘発したDNA で形質転換し
て、突然変異のスブチリシンの増幅したライブラリーを
産生する。増幅した突然変異のライブラリーは、また、
その誤まりがちなDNA ポリメラーゼのために突然変異の
ための領域を増加するE.coliのMut Ｄ株の中でプラスミ
ドDNA を成長させることによってつくることができる。

【０１１２】突然変異原の亜硝酸およびギ酸を、また、
使用して突然変異のライブラリーを生成することができ
る。これらの化学物質は重亜硫酸ナトリウムほど一本鎖
DNAに対して特異的でないので、突然変異誘発反応は次
の手順に従い実施する。スブチリシン遺伝子の解読部分
を、M13 ファージの中で、標準の方法および調製された
一本鎖のファージDNA によりクローニングする。次い
で、一本鎖DNA を１モル亜硝酸pH4.3 と15〜16分間23℃
において反応させるか、あるいは 2.4モルのギ酸と１〜
５分間23℃において反応させる。

【０１１３】これらの反応時間の範囲は、1000の中で１
から1000の中で５までの突然変異の頻度を生成する。突
然変異誘発後、汎用プライマーをM13 のDNA に対してア
ニーリングし、そして二重らせんDNA 鋳型として突然変
異誘発した一本鎖DNA を使用して合成し、こうしてスブ
チリシン遺伝子の解読部分は完全に二本鎖となるように
する。この時点において、解読領域はM13 ベクターから
制限酵素で切り出し、そして突然変異誘発しない発現ベ
クターの中に結合し、こうして突然変異が制限断片にお
いてのみ起こるようにする。（Myers et al., Science
229 : 242-257(1985)）。

【０１１４】スブチリシン遺伝子の中の部位特異的突然
変異の発生 いったんスブチリシン遺伝子がクローニングされ、そし
て突然変異のために望ましい部位が同定されると、これ
らの突然変異は合成オリゴヌクレオチドを使用して導入
することができる。これらのオリゴヌクレオチドは所望
の突然変異部位をフランキングするヌクレオチド配列を
含有する；突然変異のヌクレオチドをオリゴヌクレオチ
ドの合成の間に挿入する。好ましい方法において、DNA
の一本鎖、スブチリシン遺伝子の架橋、を一本鎖DNA の
相同性部分にアニーリングする。次いで、残りのギャッ
プをDNA ポリメラーゼＩ（クレノー断片）によりフィル
インし、そして構成体をT4リガーゼを使用して結合す
る。

【０１１５】この方法の特定の実施例はモリナガら（19
84, Biotechnology 2 : 646-639）に記載されている。
モリナガらに従い、遺伝子内の断片は制限エンドヌクレ
アーゼを使用して除去する。次いで、ベクター／遺伝
子、ここでギャップを含有する、を変性し、そしてギャ
ップの代わりに、ギャップの中に含まれる区域の外側の
部位において他の制限エンドヌクレアーゼで切断したベ
クター／遺伝子にハイブリダイゼーションする。次い
で、遺伝子の一本鎖領域を突然変異したオリゴヌクレオ
チドとのハイブリダイゼーションのために利用可能であ
り、残りのギャップはDNA ポリメラーゼＩのクレノー断
片によりフィルインし、挿入をT4DNA リガーゼで結合
し、そして、１サイクルの複製後、所望の突然変異を有
する二本鎖のプラスミドを産生する。

【０１１６】モリナガの方法を新しい制限部位を構成す
る追加の操作を排除し、したがって、多重部位における
突然変異の発生を促進する。米国特許第 4,760,025号、
Estellet al., 1988年７月26日発行、は、カセットの小
さい変更を実施することによって多重突然変異を有する
オリゴヌクレオチドを導入し、しかしながら、なおより
大きい種々の突然変異は任意の１つの時間にモリナガの
方法により導入することができる。なぜなら、種々の長
さの１つの長さのオリゴヌクレオチドを導入することが
できるからである。

【０１１７】スブチリシン突然変異の発現 本発明に従い、前述の方法、またはこの分野において知
られている任意の別の方法により産生された突然変異し
た遺伝子は、酵素の形態で、発現ベクターを使用して発
現させることができる。発現ベクターは一般にクリーニ
ンベクターの定義下に入る。なぜなら、発現ベクターは
通常典型的なクリーニンの成分、すなわち、微生物のゲ
ノムに無関係のメカニズムでベクターの自律的複製を可
能とする要素、および選択の目的で１または２以上の表
現型のマーカーを包含するからである。

【０１１８】発現ベクターはプロモーター、オペレータ
ー、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルをエンコー
ドするコントロール配列、および、リプレッサー遺伝子
または種々のアクチベーター遺伝子を包含する。発現さ
れたタンパク質の分泌を可能とするために、「シグナル
配列」をコードするヌクレオチドを遺伝子の解読配列の
前に挿入することができる。コントロール配列の指令下
の発現のために、本発明に従い処理すべき標的遺伝子を
適切なリーディングフレームの中のコントロール配列に
操作的に結合する。

【０１１９】プラスミドベクターの中に組み込むことが
でき、そして突然変異スブチリシン遺伝子の転写を支持
することができるプロモーター配列は、次のものを包含
するが、これらに限定されない：原核生物のβ−ラクタ
ムプロモーター（Villa-Kamaroff, et al., 1987, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 3727-3731）およびtac
プロモーター（DecBoer, et al., 1987, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 80 :21-25）。それ以上の参考文献
は、また、“Usefull proteins from recmbinantbacter
ia”, Scientific American, 1980, 242 : 74-94に見い
だすことができる。

【０１２０】１つの実施態様に従い、B. subtilis を突
然変異したDNA を有する発現ベクターにより形質転換さ
れる。発現は分泌する微生物、例えば、B. subtilis の
中で実施する場合、シグナル配列は翻訳開始シグナルに
従いそして問題のDNA 配列に先行する。シグナル配列は
発現産生物を細胞壁に輸送し、ここでそれは分泌のとき
産生物から切断される。上に定義した用語「コントロー
ル配列」は、それが存在するとき、シグナルsqを包含す
る。

【０１２１】実施例 スブチリシン遺伝子の部位特異的突然変異は有用な特性
をもつ突然変異体を生じさせる 材料および方法 バクテリアの株 B. subtilis 309および147 は、NCIBに受託されそして
受け入れ番号NCIB10147およびNCIB10309 を与えられ、
そして米国特許第 3,723,250号、1973年３月27日に発行
（これに引用によって加える）に記載されている、バチ
ルス・レンツス（Bacillus lentus）の変異型である。

【０１２２】B. subtilis DN497 は、米国特許出願第 0
39,298号、1987年４月17日発行、欧州特許発行第 242,2
20号に相当する（ここに引用によって加える）に記載さ
れており、そしてSL438 からの染色体のDNA をもつRUB2
00の aro＋形質転換体、バイオゲン（Biogen ）のキム
・ハーディ（Kim Hardy）博士から得た胞子形成および
プロテアーゼ欠乏株である。E.coli MC1000r^-m＋（Casa
daban, M.J.およびCohen, S.N. (1980), J. Mol. Biol.
138 : 179-207）は、慣用方法によりｒ^-m＋とされそし
て、また、米国特許出願第 039,298号に記載されてい
る。B. subtilis DB105は、次の文献に記載されてい
る：カワムラ、F.、ドイ、R.H.（1984）、細胞外のアル
カリ性および中性ホスファターゼに欠乏する枯草菌（Ba
cillus subtilis）の二重突然変異の構成、J. Bactrio
l. 160 (2), 442-444。

【０１２３】プラスミド pSX50（米国特許出願第 039,298号 に記載されており、
そしてここに引用によって加える）は、プロモーター−
オペレーターＰ₁Ｏ₁ 、B. pumilus xyn Ｂ遺伝子および
B. subtilis xyl Ｒ遺伝子からなるプラスミドpDN1050
の誘導体である。pSX62（米国特許出願第 039,298号、s
upraに記載されている）は、子牛プロキモシン遺伝子お
よびpSX50（supra）の中に挿入された B. pumilus xyn
Ｂ遺伝子からなる、pSX52（ibid）の誘導体である。pSX
62は E.coli rrn ＢターミネーターをpSX52 の中のプロ
キモシン遺伝子の背後に挿入することによって発生させ
た。

【０１２４】pSX65（米国特許出願第 039,298号、supra
に記載されている）は、プロモーター−オペレーターＰ
₂Ｏ₂ 、B. pumilus xyn Ｂ遺伝子およびB. subtilis xy
l Ｒ遺伝子からなるプラスミドpDN1050 の誘導体であ
る。pSX88（未発行の国際特許公開第PCT/DK88/00002号
（NOVO INDUSTRI A/S）は、スブチリシン309遺伝子から
なるpSX50の誘導体である。pSX92は、スブチリシン309
をClaIおよびHindIIIで切断したプラスミドpSX62（supr
a ）の中に挿入し、ClaIをフィルインし、次いでクリー
ニンしたスブチリシン309遺伝子から断片DraI-NheIおよ
びNheI-HindIIIを挿入することによって産生した。

【０１２５】pSX93 、図３に示す、は、ポリリンカー配
列の中に挿入したターミネーターを包含するスブチリシ
ン309遺伝子の0.7kbのXbaI-HindIII断片からなるpUC13
（VieraおよびMessing, 1982, Gene 19 : 259-268）で
ある。pSX119（未発行の国際特許公開第 PCT/DK88/0000
2号（NOVO INDUSTRI A/S）は、ポリリンカーの中に挿入
されたスブチリシン309 遺伝子のEcoRI-XbaI断片を収容
するpUC13である。

【０１２６】pSX120は、pSX88からのスブチリシン309遺
伝子をもつHpaI-HindIII断片がpDN1681上のEcoRV-HindI
IIの中に挿入し、こうしてプロテアーゼ遺伝子をamyMお
よびamyQプロモーターにより発現させた、プラスミドで
ある。pDN1681 は、プロモーターをもつamyQ遺伝子を有
するB. amyloliquefaciensからの挿入された2.85bpのCl
aI断片をもつpDN1380（Diderichsen, B. およびChristi
ansen, L. : 1988, FEMS Microbiology Letters 56 : 5
3-60）から得られる（Takkinen et al., J. Biol. Che
m. 258 : 1007ff）。

【０１２７】pUC13は、Vieira, J. およびMessing, J.
: Gene 19 : 259-268 に記載されている。pUC19は、Ya
nisch-Perron, C, Vieira, J. およびMessing, J. : Ge
ne 33 : 103-119に記載されている。pUB110は、次の文
献に記載されている：Lacey, R.W., Chopra, J. (197
4)、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の多重
抵抗性株の遺伝学的研究、J. Med. Microbiol. 7, 285-
297およびZyprian, E., Matzura, H. (1986) 黄色ブド
ウ球菌（Staphylococcus aureus）のプラスミドpUB110
へのシグナル促進遺伝子の発現の特性決定およびグラム
陽性発現ベクター系の開発、DNA 5 (3), 219-225。

【０１２８】遺伝子 種々のスブチリシンのための遺伝子は、前述の文献の中
に記載されているようにして得た。とくに、スブチリシ
ン309および147酵素のための遺伝子は、未発行の国際特
許公開第 PCT/DK88/00002号（NOVO INDUSTRI A/S）（そ
の全体をここに引用によって加える）に記載するように
して得た。

【０１２９】スブチリシンカルスバーグ（Carlsberg）
遺伝子の構築 合成遺伝子を、成熟スブチリシンカルスバーグのプロテ
アーゼおよび転写ターミネーターの解読配列に基づいて
設計し（Jacobs, M., Eliasson, M., Uhlen, M., Floc
k, J.-I. (1985) 、バチルス・レンツス（Bacillus len
tus）からのスブチリシンカルスバーグのスクリーニン
グ、配列決定および発現、Nucleic AcidsRes. 13 (24),
8913-8926 ）、スブチリシンBPN'プロテアーゼのpreお
よびpro解読配列に結合した（Wells, J.A., Ferrari,
E., Henner, D.J., Estell, D.A.,Chen. E.Y. (1983)
、B. subtilisの中のBacillus amyloliquefaciens の
スブチリシンのスクリーニング、配列決定および分泌、
Nucleic Acids Res. 11 (22),7911-7925 ）。

【０１３０】遺伝子を127〜313塩基対の範囲の長さの７
つの断片に再分割し、各断片は16〜77ヌクレオチドの化
学的に合成したオリゴから構成した。２つの鎖のオリゴ
の間のオーバーラップを最適化して、各断片の１工程の
アニーリングを促進した（Mullenbach, G.T., Tabrizi,
A., blacher, R.W., Steimre, K.S.、ペプチド-III）
を活性化する結合組織をコードする遺伝子の酵母菌の中
の化学的合成および発現、J. Biol. Chem. 261 (2), 71
9-722 ）。

【０１３１】各断片をE.coliのスクリーニングおよび配
列決定ベクターの中でアセンブリングおよびスクリーニ
ングした。次いで、断片のすべてをpUB110の中でアセン
ブリングおよびスクリーニングし（Lacey, R.W., Chopr
a, J. (1974) 、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aure
us）の多重抵抗性株の遺伝学的研究、J. Med. Microbio
l. 7, 285-297）そしてB. subtilisの中に入れた（カワ
ムラ、F.、ドイ、R.H. (1984) 、細胞外のアルカリ性お
よび中性のホスファターゼに欠乏する枯草菌（Bacillus
subtilis ）の二重突然変異体の構築、J. Bactriol. 1
60 (2), 442-444 ）。

【０１３２】遺伝子の転写は、pUB110プラスミドベクタ
ーのHpaIIプロモーターにより開始した（Zyprian, E.,
Matzura, H. (1986)、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus
aureus）のプラスミドpUB110 へのシグナル促進遺伝子
の発現の特性決定およびグラム陽性発現ベクター系の開
発、DNA 5 (3), 219-225）。遺伝子の構築プロセスにお
いて、一番長い断片（#5 ; 313塩基対の長さ）は、この
むしろ長い断片のアセンブリーを使用する問題を回避す
るために、それ以上の断片化（断片#8および#9）を必要
とした。

【０１３３】ヌクレオチド配列から推定したアミノ酸配
列は、早期に発表された位置129, 157, 161および212に
おけるスブチリシンカルスバーグ配列と異なる（Smith,
E.L., De Lange, R.J., Evans, W.H., Landon, W., Ma
rkland, F.S. (1968) 、スブチリシンカルスバーグＶ。
完全な配列：スブチリシンBPN'との比較；発展的関係、
J. Biol. Chem. 243 (9), 2184-2191）。Jacobs et al.
(1985) により報告される第５の変更は、ここに記載す
るカルスバーグのクローンにおいて確証することができ
なかった。

【０１３４】等電点（pI₀）の計算 スブチリシン309 の野生型酵素（S000）の等電点の計算
を、使用する手順を明らかにするために下に例示する。
同一手順は、もちろん、酵素が突然変異の酵素か否かに
かかわらず、酵素の計算に適用可能である。pK値は各潜
在的に帯電したアミノ酸残基（Tyr, Asp, Glu, Cys, Ar
g, His, Lys、Ｎ末端、Ｃ末端のCa²⁺）に割り当てた。
この場合において、環境を考慮し、これにより異なるpK
値をその付近に依存して同一アミノ酸残基のために使用
する。割り当てた値を表IIに示す。

【０１３５】次いで、帯電または非帯電の形態における
所定のpHにおけるアミノ酸残基の存在の比（帯電／非帯
電、Ｃ／Ｕ（ｉ））を、負および正の帯電の両者につい
て、それぞれ、式IaおよびIbを使用することによって計
算した。第II表において、この比はpI₀ に等しいpHにつ
いてのみ示す。引き続いて、相対的電荷、Qr（ｉ）、ま
たは各帯電した残基に割り当てた電荷の寄与を、式IIa
およびIIbに使用することによって計算した：

【０１３６】

【表２０】

【０１３７】上および第II表に示したように、各アミノ
酸に割り当てたpK値は、環境の中の局所的変動を考慮す
ると、異なった。これは計算における増大した精度をは
じめて生ずるが、経験により、一定の推定したpK値は、
所定の突然変異の酵素についてのpI₀ が親の酵素のpI₀
に比較して動く方向を示すとき、有用であることが示さ
れた。これは第III 表に示されており、ここで推定した
pK値についてのpI₀ 値が示されている。

【０１３８】種々の酵素および突然変異の酵素を比較す
るために、下に詳細に記載する洗浄試験を実施した。第
III 表に、親の酵素およびスブチリシン309 からの突然
変異の酵素（S000などと表示する）およびスブチリシン
カルスバーグ（C000などと表示する）を使用するこれら
の試験からの結果を記載して、使用した洗浄液の異なる
pH値における、pI₀ と洗浄性能との間の相関関係を実証
する。洗浄試験において、洗浄剤の実施例D7に従うpH8.
3 の低い塩の液状洗浄剤配合物、および洗浄剤の実施例
D2に従うpH10.2の通常の塩の粉末状洗浄剤を使用した。
第III 表において、野生型の酵素と比較して相対的抵抗
性として結果を示す（それぞれ、S000およびC000）。ま
た、酵素についての計算したpI₀ および観測されたpI₀
が示されている。

【０１３９】

【表２１】

【０１４０】第III 表から理解されるように、pI₀ をよ
り低い値にシフトする（Ｓ−系列）と、低いpH（pH＝8.
3 ）において洗浄性能が改良され、これに対してpI₀ の
上方のシフト（Ｃ−系列）は高いpH（pH＝10.2）におけ
る洗浄性能を改良する。こうして、等電点の概念は、親
の酵素の中の変化すべきアミノ酸の位置の選択におい
て、非常に有用であることが発見された。一般に、酵素
分子の表面にまたはその付近に位置するアミノ酸に相当
するコドンの中で実施し、これにより親の酵素の内部構
造を出来るだけ多く保持すべきであることが発見され
た。

【０１４１】スブチリシンの精製 この手順は、スブチリシン147 酵素、スブチリシン309
酵素またはそれらの突然変異の10リットル規模の発酵の
典型的な精製に関する。ほぼ８リットルの発酵ブロスを
１リットルのビーカーの中で5000rpm で35分間遠心し
た。上澄み液を10％の酢酸でpH6.5 に調節し、そしてサ
イツ・スプラ（Seitz Supra）S100フィルタープレート
で濾過した。

【０１４２】濾液を、アミコン（Amicon）S1Y10UFカー
トリッジを装備したアミコンCH2A UFユニットを使用し
て、ほぼ 400mlに濃縮した。UF濃縮物を遠心し、そして
濾過した後、バシトラシン（Bacitracin）親和カラムで
pH７、室温において吸収させた。プロテアーゼをバシト
ラシンカラムから室温において、0.01ジメチルグルタル
酸、 0.1モルのホウ酸および 0.002モルの塩化カルシウ
ム、pH７、を含む緩衝液中の25％の２−プロパノールお
よび１モルの塩化ナトリウムを使用して溶離した。

【０１４３】バシトラシン精製工程からのプロテアーゼ
活性をもつ分画を一緒にし、そして0.01ジメチルグルタ
ル酸、 0.2モルのホウ酸および 0.002モルの塩化カルシ
ウム、pH6.5 、を含有する緩衝液と平衡化した、 750ml
のセファデックス（Sephadex）G25 カラム（５cmの直
径）に適用した。セファデックス（Sephadex）25カラム
からのタンパク質分解活性をもつ分画を一緒にし、そし
て0.01モルのジメチルグルタル酸、 0.2モルのホウ酸お
よび 0.002モルの塩化カルシウム、pH6.5 、を含有する
緩衝液と平衡化した、 150mlのセファローズ（Sepharos
e）CL6Bカチオン交換カラム（５cmの直径）に適用し
た。

【０１４４】２リットルの同一緩衝液中の０〜0.1モル
の塩化ナトリウム（スブチリシン147 の場合において０
〜0.2モル の塩化ナトリウム）の直線の勾配を使用し
て、プロテアーゼを溶離した。最後の精製工程におい
て、CMセファローズ（Sepharose ）カラムからのプロテ
アーゼを含有するプロテアーゼを一緒にし、そしてGR81
PP膜を装備したアミコン限外濾過セル（Danish Sugar F
actories Inc. から）の中で濃縮した。

【０１４５】

【表２２】 を、この手順により精製した。

【０１４６】（突然変異）スブチリシンカルスバーグの
プロテアーゼの精製 発酵媒質を直接バシトラシン親和カラム（５cmの直径×
15cm；10ミリモルのトリス／HCl 緩衝液pH7.9；流速ほ
ぼ100ml／時間）上に適用するか、あるいはネフロス・
アンダンテ（Nephross Andante）H.F. 透析装置（Organ
on Technka）により10〜12psi の背圧および外側回路の
中に脱イオン水を使用して 500mlに濃縮した。後者の場
合において、 600ｇ／ｌの硫酸アンモニウムの添加によ
り、プロテアーゼを濃縮物から沈澱させた。沈澱を遠心
により集め、そしてほぼ 500mlの脱イオン水の中に再溶
解した。前述したのと同一の透析装置を使用して、硫酸
アンモニウムをプロテアーゼの溶液から形成した。最後
の体積はほぼ 300mlであるが、pHをpH6.0 に調節した。
プロテアーゼをバクトラシンカラム（前述のもの）から
2.7モルのNaClおよび18％のイソプロパノールを含有す
る10ミリモルのトリス緩衝液（pH7.9 ）を使用して溶離
した。

【０１４７】バクトラシン精製したまたは濃縮したプロ
テアーゼ物質の透析後、CM−トリスアシルイオン交換カ
ラム（直径５cm×15cm；0.03モルのリン酸ナトリウムpH
6.0と平衡化した）に 200ml／時間の流速を使用して適
用することによって達成した。プロテアーゼをカラムか
らリン酸塩緩衝液中の０〜0.3モル のNaCl（２×500ml
）の直線の勾配で溶離した。プロテアーゼ活性が含有
する分画をプールし、そして凍結乾燥後、−20℃におい
て緩衝塩の存在下に貯蔵した。

【０１４８】オリゴヌクレオチドの合成 すべての不一致のプライマーをアプライド・バイオシス
テムス（Applied Biosystems）280AのDNA 合成装置で合
成し、そしてポリアクリルアミドゲルの電気泳動（PAG
E）により精製した。

【０１４９】タンパク質分解活性についてのアッセイ 突然変異の酵素のタンパク質分解活性をアッセイして、
酵素の活性がどこまで保持されるかを決定した。決定は
ジメチルカゼイン（DMC ）法により実施し、この方法は
NOVOパブリケイションAF220-gp（または後の版）に記載
されており、Novo Nordisk a/s、デンマーク国バグバー
ド、から入手可能であり、その刊行物をここに引用によ
って加える。

【０１５０】洗浄性能についてのアッセイ Ａ：草のジュースを含有するマチス・ウォッシング・ア
ンド ドライング・ユニット（Mathis Washing and Dry
ing Unit）TH型（Werner Mathis AG、スイス国チューリ
ッヒ）の中の容器に、脱サイズ剤した綿（100％ の綿、
DS71）クロスを通すことによって、試験クロス（2.2cm
×2.2cm）、ほぼ 0.1ｇ）を製造した。

【０１５１】最後に、このクロスを強い空気流の中で室
温において乾燥し、室温において３週間貯蔵し、引き続
いて使用の前に−18℃に保持した。すべての試験はモデ
ルのミニウォッシュシステムにおいて実施した。この系
において、６枚の試験クロスを60mlの洗浄剤溶液を含有
する 150mlのビーカーの中で洗浄した。ビーカーを30℃
のサーモスタッーの水浴の中に磁気的に撹拌しながら保
持する。

【０１５２】洗浄剤として、次の標準の液状洗浄剤を使
用した： AE, Berol 160 15％ LAS, Nasa 1169/P 10％ ヤシ脂肪酸 9％ オレイン酸 1％ トリエタノールアミン 9％ グリセロール 10.5％ エタノール 1.5％ トリ・Na・シトレート・２H₂O 8％ CaCl・２H₂O 0.1％ NaOH 1％ LASからの水 23.3％ グリセロールからの水 1.5％ 水を加えて 34.9％

【０１５３】記載する百分率は活性含量の百分率であ
る。pHを１ＮのNaOHで8.14に調節した。使用する水は約
６°dH（ドイツ硬度）であった。試験は０、1.0mg の酵
素タンパク質／ｌおよび10.0mgの酵素タンパク質／ｌの
酵素濃度で実施し、そして試験の２つの独立の組を突然
変異の各々について実施した。下に示す結果はこれらの
試験の意味である。洗浄は60分間実施し、洗浄に引き続
いてクロスを流れる水道水でバケツの中で25分間フラッ
シュした。

【０１５４】次いで、クロスを一夜空気乾燥し（日光に
対して保護した）そしてレミッション（remission）、
Ｒ、を、ELREPHO 2000 フォトメーター（Datacolor S.
A.、スイス国ディトキコンから）で 460nmにおいて決定
した。洗浄性能の測度として、微分のレミッション、デ
ルタＲ、を使用し、これは酵素を添加して洗浄後のレミ
ッション−酵素を添加しないで洗浄後のレミッションに
等しい。

【０１５５】Ｂ：種々の突然変異の洗浄性能を、前述の
方法に従い、草のジュースで汚れた綿のクロスに対して
試験した。2.0ｇ／ｌの商業的US液状洗浄剤を使用し
た。洗浄剤をイオン交換した水中の 0.005モルのエタノ
ールアミン中に溶解した。pHをNaOH／HClで、それぞ
れ、pH8.0, 9.0, 10.0および11.0に調節した。温度を30
℃の等温に10分間保持した。突然変異体の各々を0.25mg
の酵素タンパク質／ｌで投与した。

【０１５６】Ｃ：下の洗浄剤の実施例において例示する
洗浄剤組成物を使用する洗浄試験を、顔料、脂肪、およ
びタンパク質（カゼイン）を含有する綿に基づく試験ク
ロスを利用するミニウォッシャーの中で実施した。条件
は次の通りであった： ａ）６°fHの水中の５ｇ／ｌの洗浄剤D3, pH8.3、また
は ｂ）15°fHの水中の５ｇ／ｌの洗浄剤D2, pH10.2。 リンスおよび乾燥後、 460nmにおける反射を測定した。

【０１５７】改良ファクターを投与量応答曲線、および
問題の野生型酵素（S000およびC000）に比較して所定の
デルタＲを得るために必要な酵素の量に対する関係から
計算し、２の改良ファクターは同一デルタＲ値を得るた
めに半分の酵素のみが必要であることを示すことを意味
する。これらの試験の結果を、上の表III に示す。

【０１５８】Ｄ：リパーゼ安定性の実験的試験を、例え
ば、次の物質を使用して、実施した：１LU／mlのシュー
ドモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia ）のリパー
ゼを、２つの型ＯおよびＷ（下に記載する）の各々の洗
浄液の中でインキュベーションした。アリコートを間隔
をおいて取り、そしてリパーゼ活性について試験した。
プロテアーゼを使用しないか、あるいは下に記載する種
々の型のプロテアーゼを使用して、平行のインキュベー
ションを実施して、野生型プロテアーゼを20GU／mlにお
いて試験し、突然変異したプロテアーゼを 0.5μｇ／ml
において試験した。

【０１５９】酵素変異型からなる洗浄剤組成物 洗浄剤D1：ホスフェートのビルダーを含有する本発明の
実施態様に従う洗浄剤粉末を、次の成分を含有するよう
に配合した：合計の活性洗浄剤、約16％、アニオン型洗
浄剤、約９％、非イオン型洗浄剤、約６％、ホスフェー
トを含有するビルダー、約20％、アクリルまたは同等の
ポリマー、約 3.5％（あるいは、約２％に低下する）、
パーボレートの漂白前駆体、約６〜18％、アミノを含有
する漂白アクチベーター、約２％、シリケートまたは他
の構造因子、約 3.5％、あるいは約８％まで、約８グリ
シンユニツト／mg活性の酵素、使用のときアルカリで所
望のpHに調節する、および中性の無機塩、および酵素
（約 0.5％、各酵素）。

【０１６０】アニオン型洗浄剤は、ナトリウムドデシル
−ベンゼンスルホネート、または線状アルキル−ベンゼ
ン−スルホネート、６％、および第１アルキルサルフェ
ート、３％の混合物である。非イオン型洗浄剤は、７エ
トキシレート残基／モルをもつほぼC13−C15第１アルコ
ールのエトキシレートである。ポリマーはポリアクリル
酸、またはアクリル／マレイン酸コポリマーである。パ
ーボレートの漂白前駆体は、ナトリウムテトラボレート
テトラハイドレートまたはモノハイドレートである。ア
クチベーターはテトラ−アセチル−エチレン−ジアミン
である。構造因子はケイ酸ナトリウムである。中性の無
機塩は硫酸ナトリウムである。酵素は、突然変異S001に
従うプロテアーゼ、あるいはプロテアーゼS003，S004，
S005，C001，C002，C003，C004，C005，C008，S015，S0
17，S021，S226，S223，S224、またはS225からなる。

【０１６１】洗浄剤D1a：ホスフェートのビルダーを含
有する本発明の実施態様に従う洗浄剤粉末を、次の成分
を含有するように配合した：合計の活性洗浄剤、約15
％、アニオン型洗浄剤、約７％、非イオン型洗浄剤、約
６％、ホスフェートを含有するビルダー、約25％、アク
リルまたは同等のポリマー、約 0.5％、パーボレートの
漂白前駆体、約10％、アミノを含有する漂白アクチベー
ター、約２％、シリケートまたは他の構造因子、約６
％、約８グリシンユニット／mg活性のプロテアーゼ酵
素、使用のときアルカリで所望のpHに調節する、および
中性の無機塩、および酵素（約 0.5％、各酵素）。

【０１６２】アニオン型洗浄剤は、ナトリウム線状アル
キル−ベンゼン−スルホネートである。非イオン型洗浄
剤は、７エトキシレート残基／モルをもつほぼC13−C15
第１アルコールのエトキシレートまたはこれと２残基／
モル程度にエトキシル化された対応するアルコールとの
混合物である。ホスフェートのビルダーはナトリウムト
リポリホスフェートである。パーボレートまたは過酸の
漂白前駆体は、ナトリウムテトラボレートテトラハイド
レートである。アクチベーターはテトラ−アセチル−エ
チレン−ジアミンである。構造因子はケイ酸ナトリウム
である。中性の無機塩は硫酸ナトリウムである。酵素
は、突然変異S001に従うプロテアーゼ、あるいはプロテ
アーゼS003，S004，S005，C001，C002，C003，C004，C0
05，C008，S015，S017，S021，S226からなる。

【０１６３】洗浄剤D2：ゼオライトのビルダーを含有す
る本発明の実施態様に従う洗浄剤粉末を、次の成分を含
有するように配合した：合計の活性洗浄剤、約16％、ア
ニオン型洗浄剤、約９％、非イオン型洗浄剤、約６％、
ゼオライトを含有するビルダー、約20％、アクリルまた
は同等のポリマー、約 3.5％、パーボレートの漂白前駆
体、約６〜18％、アミノを含有する漂白アクチベータ
ー、約２％、シリケートまたは他の構造因子、約 3.5
％、あるいは約 2.5％まで低下する、約８（あるいは約
15）グリシンユニット／mgグレード、使用のときアルカ
リで所望のpHに調節する、および中性の無機塩、および
酵素（約 0.5％、各酵素）。

【０１６４】アニオン型洗浄剤は、ナトリウムドデシル
−ベンゼンスルホネート、または線状アルキル−ベンゼ
ン−スルホネート、６％、および第１アルキルサルフェ
ート、３％の混合物である。非イオン型洗浄剤は、７エ
トキシレート残基／モルをもつほぼC13−C15第１アルコ
ールのエトキシレートである。ポリマーはポリアクリル
酸である。パーボレートの漂白前駆体は、ナトリウムテ
トラボレートテトラハイドレートまたはモノハイドレー
トである。アクチベーターはテトラ−アセチル−エチレ
ン−ジアミンである。構造因子はケイ酸ナトリウムであ
る。中性の無機塩は硫酸ナトリウムである。酵素は、突
然変異S001に従うプロテアーゼ、あるいはプロテアーゼ
S003，S004，S005，C001，C002，C003，C004，C005，C0
08，S015，S017，S021，S226からなる。

【０１６５】洗浄剤D2a：ゼオライトのビルダーを含有
する本発明の実施態様に従う洗浄剤粉末を、次の成分を
含有するように配合した：合計の活性洗浄剤、約14％、
アニオン型洗浄剤、約７％、非イオン型洗浄剤、約７
％、ゼオライトを含有するビルダー、約25％、アクリル
または同等のポリマー、約３％、パーボレートまたは過
酸の漂白前駆体、約10％、アミノを含有する漂白アクチ
ベーター、約２％、シリケートまたは他の構造因子、約
0.5％、約６グリシンユニット／mg活性のグレード、使
用のときアルカリで所望のpHに調節する、および中性の
無機塩、および酵素（約 0.5％、各酵素）。

【０１６６】アニオン型洗浄剤は、ナトリウム線状アル
キル−ベンゼン−スルホネートである。非イオン型洗浄
剤は、それぞれ、７および３エトキシレート残基／モル
をもつほぼC13−C15第１アルコールのエトキシレート混
合物である。ゼオライトのビルダーはＡ型ゼオライトで
ある。ポリマーはアクリル酸／マレイン酸コポリマーで
ある。パーボレートまたは過酸の漂白前駆体は、ナトリ
ウムテトラボレートモノハイドレートである。アクチベ
ーターはテトラ−アセチル−エチレン−ジアミンであ
る。構造因子はケイ酸ナトリウムである。中性の無機塩
は硫酸ナトリウムである。酵素は、突然変異S001に従う
プロテアーゼ、あるいはプロテアーゼS003，S004，S00
5，C001，C002，C003，C004，C005，C008，S015，S01
7，S021，S226からなる。

【０１６７】洗浄剤D3：本発明の実施態様に従う水性洗
浄剤液体を、次の成分を含有するように配合した：合計
の活性洗浄剤16％、C12−C15線状アルコールと７モル／
モルのエオレンオキシドとの縮合物２％、モノエタノー
ルアミン２％、クエン酸 6.5％、ナトリウムキシレンス
ルホネート６％、水酸化ナトリウム約 4.1％、プロテア
ーゼ 0.5％、少量物質および水で 100％。pHを９〜10の
値に調節する。酵素は、突然変異S020、あるいはS019，
S012，S004，S001，S002，S003，S004，S005，S015，S0
17，S021，S022，S025，S035，S201，S223，S224，S226
およびS235からなる。

【０１６８】洗浄剤D4：本発明の実施態様に従う水性洗
浄剤液体を、次の成分を配合することによって配合す
る：38.5％の 4.9モル／モルのエオレンオキシドおよび
2.7モル／モルのプロピレンオキシド、５％のトリアセ
チン、30％のナトリウムトリホスフェート、４％のソー
ダ灰、15.5％の小さい比率のオキソボレートを含有する
ナトリウムパーボレートモノハイドレート、４％のTAE
D、0.25％のEDTA、その 0.1％はリン酸として、エーロ
シル（Aerosil）0.6％、SCMC １％、および６％のpHを
９〜10の値に調節する。酵素は、突然変異S001、あるい
はS003またはS004，S021，S035，S201，S225，S226、ま
たはS235からなる。

【０１６９】洗浄剤D5：本発明の実施態様に従う洗浄剤
の粉末を、少なくとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有し、次
の成分を含有する粒体の形態で配合する：約20重量％の
界面活性剤、その約10％はドデシル硫酸ナトリウムであ
り、そして残部はシンペロニック（Synperonic）A7およ
びシンペロニックA3（約5.5％〜4.5％）の混合物であ
る、およびゼロ中性の無機塩（例えば、硫酸ナトリウ
ム）、＋ホスフェートのビルダー約33％、ナトリウムパ
ーボレートテトラハイドレート約16％、TADEアクチベー
ター約4.5％、ケイ酸ナトリウム約６％、および炭酸ナ
トリウムを包含する少量物質約２％、および湿分約10
％、酵素は、突然変異S001に従うプロテアーゼ、あるい
はプロテアーゼS003，S004，S005，C001，C002，C003，
C004，C005，C008，S223，S224，S225，S226またはS235
からなる。

【０１７０】洗浄剤D6：本発明の実施態様に従う洗浄剤
の粉末を、少なくとも 600ｇ／ｌ、あるいは約550ｇ／
ｌのかさ密度を有し、次の成分を含有する粒体の形態で
配合する：約20重量％、あるいは約16重量％までに低下
する、の界面活性剤、その約９％、あるいは７％はドデ
シル硫酸ナトリウム、あるいはナトリウム線状アルキル
ベンゼンスルホネートであり、そして残部はシンペロニ
ック（Synperonic）A7およびシンペロニックA3（または
同様なエトキシレート）（それぞれ、約５％および６
％、あるいは約４％〜７％）の混合物である、およびゼ
ロ中性の無機塩（例えば、硫酸ナトリウム）、＋ゼオラ
イトのビルダー約30％、あるいは約25％、ナトリウムパ
ーボレートテトラハイドレート、あるいはモノハイドレ
ート、約14％または15％、TADEアクチベーター約 3.6
％、および炭酸ナトリウムを包含する少量物質約９％、
あるいは15％まで、Dequest^R 2047 約 0.7％、および湿
分約10％。酵素は、突然変異S001、あるいはS003，S00
4，S005，C001，C002，C003，C004，C005，C008，S22
3，S224，S225，S226またはS235に従うプロテアーゼか
らなる。

【０１７１】洗浄剤D6a：本発明の実施態様に従う洗浄
剤の粉末を、少なくとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有し、
次の成分を含有する粒体の形態で配合する：約15重量％
の界面活性剤、その約７％はナトリウム線状アルキルベ
ンゼンスルホネート、２％の第１アルコールサルフェー
トであり、そして残部はシンペロニック（Synperonic）
A7または同様なエトキシレート、およびゼロ中性の無機
塩（例えば、硫酸ナトリウム）、＋ゼオライトのビルダ
ー約22％、ナトリウムパーボレートテトラハイドレート
約15％、TADEアクチベーター約７％、および炭酸ナトリ
ウムを包含する少量物質約15％まで Dequest^R 2047 約
0.7％、および湿分約10％。酵素は、突然変異S001、あ
るいはS003，S004，S005，C001，C002，C003，C004，C0
05，C008，S223，S224，S225，S226またはS235に従うプ
ロテアーゼからなる。

【０１７２】洗浄剤D7：本発明の実施態様に従う洗浄剤
の粉末を、次の成分を含有するように配合することによ
って配合する：ドデシルベンゼンスルホン酸約６％、C1
2−C15線状アルコールと７モル／モルのエチレンオキシ
ドとの縮合物、脂肪酸石鹸３％、Sokolan^R CP5ポリマー
３％、ゼオライト A22％、炭酸ナトリウム10％、硫酸ナ
トリウム17％、粘土粒子８％、ナトリウムパーボレート
テトラハイドレート13％、テトラアセチル−エチレンジ
アミン２％、プロテアーゼ 0.5％、少量物質約および水
100％まで。pHを９〜10の値に調節する。酵素は、突然
変異S001、あるいはS003，S004，S005，C001，C002，C0
03，C004，C005，C008，S223，S224，S225，S226または
S235に従うプロテアーゼからなる。

【０１７３】洗浄剤D8：本発明の実施態様に従う洗浄剤
（石鹸）の棒を次のように配合する：パン鹸化した82％
タロウに基づく石鹸、18％のココナッツオイル、0.15％
のオルトリン酸で中和し、プロテアーゼ（組成物の１mg
当たり約８GU）と混合しそしてギ酸ナトリウム２％、硼
砂２％、プロピレングリコール２％および硫酸ナトリウ
ム１％と混合した、を石鹸製造ライン上で圧縮する。酵
素は、突然変異S001、あるいはS003，S004，S005，C00
1，C002，C003，C004，C005，C008，S021，S025，S03
5，S201，S202，S223，S224，S225，S226またはS235に
従うプロテアーゼからなる。

【０１７４】洗浄剤D9：構造化（structured）液体洗浄
剤は、例えば、ここに記載するプロテアーゼに加えて、
２〜15％の非イオン界面活性剤、５〜40％の合計の界面
活性剤、これは非イオンおよび必要に応じてアニオン界
面活性剤からなる、５〜35％のホスフェートを含有する
か、あるいは含有しないビルダー、0.2〜0.8％のポリマ
ーの増粘剤、例えば、分子量 106以上の架橋したアクリ
ルポリマー、所望のpH、好ましくはpH９〜10またはそれ
以上、例えば、pH11に調節するための少なくとも10％の
ケイ酸ナトリウム、例えば、中性の水ガラス、アルカリ
（例えば、カリウムを含有するアルカリ）、ナトリウム
カチオン：ケイ素アニオン（遊離シリカとして）（重量
による）の比は0.7：１以下であり、そして粘度は0.3〜
30Pas（20℃および20s−１において）である。

【０１７５】適当な実施例は、約５％の非イオン界面活
性剤の約５EO基／モルおよび約 2.7PO基／モルでアルコ
キシル化したC13−C15アルコール、15〜23％の中性の水
ガラス、シリカおよびナトリウムオキシドの重量比 3.
5、13〜19％のKOH、823％のSTPP、０〜11％の炭酸ナト
リウム、0.5％の Carbopol^R 941を含有する。プロテア
ーゼ（例えば、 0.5％）は、突然変異S001、あるいはS0
21，S025，S035，S201，S202，S223，S224，S225，S226
またはS235に従うプロテアーゼを包含する。

【０１７６】 洗浄剤D10： 洗濯の使用に適当な構造化、粘性、水性液体洗浄剤は、次のように配合する（ 重量％）： クエン酸 2.5 硼砂（10aq） 4 NaOH 2 グリセロール 5 C14−C15線状アルキルベンゼンスルホネート、 またはC14−C15第１アルコールサルフェート 6.5 シンペロニック（Snyperonic）A3 非イオン性C12−C15 3EO 1.2 シンペロニックA7

【０１７７】 非イオン性C12−C15 7EO 3.6 ゼオライト 20 プロテアーゼ 0.5 アミラーゼ（Termamyl^R 300LDX） 0.2 少量物質および水 100％となる量 pHは９〜10の値に調節することができる。酵素は、プロ
テアーゼ突然変異S020、あるいはS019，S012，S004，S0
01，S003，S005，S021，S035，S201，S223，S224，S22
5，S226またはS235からなる。

【０１７８】 洗浄剤D11： 洗濯の使用に適当な等方性水性液体洗浄剤は、次のように配合する（重量％） ： クエン酸 2 ホウ酸 1 NaOH 3 KOH 4.5 グリセロール 10 エタノール 6.5

【０１７９】 非イオン性界面活性剤 （C12−アルコール 6.5EO エトキシレート基／モル） またはナトリウム第１アルコールサルフェート 10 オレイン酸 16 ココナッツオイル（C12）石鹸 11 プロテアーゼ 0.5 少量物質および水 100％となる量 pHは９〜10の値に調節することができる。酵素は、プロ
テアーゼ突然変異S020、あるいはS019，S012，S004，S0
01，S003，S005，S021，S025，S035，S201，S223，S22
4，S225，S226またはS235からなる。

【０１８０】 洗浄剤D12： 水性液体洗浄剤組成物を次の成分を含有するように配合する： ナトリウムアルキルベンゼンスルホネート 14.5 C18ナトリウム石鹸 2 非イオン型洗浄剤（C12−C15 6EO） 9 脂肪酸（オレイン酸） 4.5 ナトリウムアルケニルスクシネート 11 プロパンジオール 1.5

【０１８１】 エタノール 3.6 クエン酸ナトリウム 3.2 錯化剤、例えば、Dequest 2060 0.7 プロテアーゼ 0.5 アミラーゼ 0.1 塩化ナトリウム 0.5 少量物質および水 100％となる量 pHは９〜10の値に調節することができる。酵素は、プロ
テアーゼ突然変異S020、あるいはS019，S012，S004，S0
01，S003，S005，S021，S205，S035，S201，S202，S22
3，S224，S225，S226またはS235からなる。

【０１８２】 洗浄剤D13： 水性液体洗浄剤組成物を次の成分を含有するように配合する： ナトリウムアルキルベンゼンスルホネート 8 非イオン型洗浄剤 6.5EO 10 オレイン酸ジエチルアミド 10 脂肪酸（C12／C18 75：25） 18 クエン酸ナトリウム 1 トリエタノールアミン 5 プロパノール 7

【０１８３】 エタノール 5 Dequest 2060 0.5 プロテアーゼ 0.5 アミラーゼ 0.1 塩化ナトリウム 0.5 少量物質および水 100％となる量 pHは９〜10の値に調節することができる。酵素は、プロ
テアーゼ突然変異S020、あるいはS019，S012，S004，S0
01，S003，S005，S021，S205，S035，S201，S202，S22
3，S224，S225，S226またはS235からなる。

【０１８４】 洗浄剤D14： 非水性液体洗浄剤組成物を次の成分を含有するように配合する： 液状非イオン型洗浄剤（C10−12、6.2EO） 41 トリアセチン 5 線状アルキルベンゼンスルホン酸 6 酸化マグネシウム安定剤 1 炭酸ナトリウムビルダー／塩基 18

【０１８５】 炭酸カルシウムビルダー 8 漂白アクチベーターTAED 3.5 漂白前駆体パーボレートモノハイドレート 10.5 部分的疎水性のシリカ 2 プロテアーゼ 0.4 リパーゼ（Liolase^R） 3 少量物質または追加の液状非イオン型 洗浄剤（水なし） 100％となる量

【０１８６】この組成物の配合において、液状非イオン
型洗浄剤およびトリアセチンをまず添加し、次いで酸化
マグネシウム、次いで酵素を除外した他の成分を添加す
る。この混合物をコロイドミルで粉砕し、冷却し、最後
に酵素および他の熱感受性少量物質を添加する。酵素
は、プロテアーゼ突然変異S020、あるいはS019，S012，
S004，S001，S003，S005，S021，S025，S035，S201，S2
02，S223，S224，S225，S226またはS235からなる。ま
た、欧州特許（EP）0 342 177号 に記載されかつ例示さ
れている洗浄剤配合物の任意の１つを使用することがで
きる。また、欧州特許（EP）0 342 177号 に例示されて
いる洗浄剤配合物と、洗浄剤D3についてのような突然変
異と組み合わせて使用することができる。

【０１８７】結果 スブチリシン309遺伝子の部位特異的突然変異の発生 部位特異的突然変異は、モリナガら（Biotechnology, s
upra）の方法により実施した。突然変異の導入に次のオ
リゴヌクレオチドを使用した：

【０１８８】

【表２３】

【０１８９】

【表２４】

【０１９０】

【表２５】

【０１９１】ギャップド二重らせん突然変異誘発をプラ
スミドpSX93、pSX119、およびpSX120 を使用して実施し
た。pSX93 は第３図に示し、そしてポリリンカーの中に
挿入されたターミネーターを包含するスブチリシン309
遺伝子の0.7kbのXbaI-HindIIIを収容するpUC13（Viera,
J. およびMessing, J. : Gnene 19 : 259-268）であ
る。酵素のＮ末端の中に突然変異を導入するために、プ
ラスミドpSX119を使用した。pSX119は、ポリリンカーの
中に挿入されたスブチリシン309 遺伝子のEcoRI-XbaI断
片を収容するpUC13 である。次いで、鋳型pSX93 および
pSX119はスブチリシン309 遺伝子の全体をカバーする。

【０１９２】pSX120は、プロテアーゼがamyMおよびamyQ
プロモーターにより発現される方法で、pDN1681 上のEc
oRV-HindIIIの中に、pSX88からのスブチリシン309 遺伝
子をもつHpaI-HindIIIが挿入された、プラスミドであ
る。pDN1681 は、amyQをプロモーターとともに有するB.
amyloliquefaciensからの挿入された2.85bpのClaI断片
（takkinen et al., J. Biol. Chem. 258 : 1007ff）を
もつpDN1380（Diderichsen, B. およびChristiansen,
L. : FEMS Microbiology Letters 56 : 53-60）から得
られる。pSX120の構築は第１図に概説されており、pDN1
681 をEcoR5およびHindIIIで、pSX88をHindIIIおよびHp
aIで切断し、その後結合はamyMおよびamyQプロモーター
により調節されるpSX120を生ずる。４つのそれ以上のpS
X170，pSX172，pSX173、およびpSX186を、スブチリシン
309 遺伝子のギャップド二重らせん突然変異誘発のため
に構成した：

【０１９３】

【表２６】

【０１９４】図２は、pSX120の多少の詳細な制限地図を
示し、プラスミドpSX170，pSX172，pSX173、およびpSX1
86の構成にどのプラスミドを使用したかを示す。突然変
異ａ）は、図３に示しそして節「スブチリシン遺伝子の
中の部位特異的突然変異の発生」および未発行の国際特
許公開第PCT/DK88/00002号（NOVO INDUSTRI A/S）に記
載するような、XbaIおよびClaIでpSX93を切断すること
によって実施した。突然変異ｂ）、ｄ）およびｅ）は、
対応してpSX170をSphIおよびKpnIで切断することによっ
て実施した。

【０１９５】突然変異ｆ）およびｇ）は、上に類似する
が、pSX170の代わりにpSX173を使用して実施した。突然
変異ｃ）は、対応してpSX186をPstIおよびEcoRI で切断
することによって実施した。突然変異ｈ）〜ｏ）はDNA
断片を単一のまたは二重の突然変異ａ）〜ｇ）と、制限
部位NheI，XbaI，ClaI，AvaII 、およびKpnIを適当に使
用して、組み合わせることによって構成した。それ以上
の突然変異は、同様な方法または文献から知られている
一般の方法を使用して生成した。

【０１９６】スブチリシンカルスバーグの突然変異 この明細書中で述べたスブチリシンカルスバーグの中の
突然変異のある種の実施例のために、遺伝子のヌクレオ
チド配列における次の変化を導入した：

【０１９７】

【表２７】

【０１９８】これらの変化は、問題の断片の中の対応す
るオリゴを変化させることによって導入した。新しい配
列の正しさを確証し、その後もとのオリゴをこれらの新
しい配列と置換し、そして新しいDNA 断片の中にアセン
ブリングした。最後に、断片を新しいスブチリシンカル
スバーグ遺伝子の中に再アセンブリングした。

【０１９９】突然変異のスブチリシンの発現 正しい突然変異の配列の確証に引き続いて、突然変異し
たDNA 断片をプラスミドpSX92 またはpSX120の中に挿入
しこれらを突然変異の産生に使用した。pSX92 を図４に
示し、そしてSub109遺伝子をClaIで切断したプラスミド
pSX62の中にクリーニンすることによって生成し、DNA
ポリメラーゼＩのクレノー断片をフィルインし、そして
HindIII で切断した後、クリーニンしたSub109遺伝子か
らの断片DraI-NheIおよびNheI-HindIIIを挿入した。

【０２００】突然変異を発現するために、突然変異した
断片（XbaI-ClaI，XbaI-HindIII 、またはEcoRI-XbaI）
を、それぞれ、適当な突然変異のプラスミド pSX93，pS
X119，pSX170，pSX172，pSX173、およびpSX186から切除
し、そしてpSX92、またはpSX120 の中に挿入し、種々の
突然変異を発現することができるプラスミドを得た。次
いで、突然変異したpSX92 またはpSX120を使用して、B.
subtilis DN497 を形質転換した。

【０２０１】次いで、形質転換した細胞を、10ミリモル
のホスフェート、pH７、６μｇ／mlのクロランフェニコ
ール、および 0.2％のキシロースを含むLB寒天プレート
上に広げて、プラスミドの中で xyn−プロモーターを誘
発した。プレートは、また、１％のスキムミルクを含有
して、形質転換体を産生するプロテアーゼがスキムミル
クが分解した明瞭なハローにより検出することができる
ようにした。適当な成長後、突然変異した酵素を回収
し、そして精製した。

【０２０２】スブチリシンカルスバーグ種の発酵 前述したようにBPN'のための突然変異遺伝子を有する微
生物を基礎とするプロテアーゼ酵素を産生するために、
８つの平らなブレードのインペラーおよび８リットルの
有効体積をもつルシュトン（Rushton）型ケモファーム
（Chemoferm）発酵器を使用した。VMT についての安定
な安全性と合致するように発酵器の形状を調製し、そし
て次の成分から成っていた：

【０２０３】ａ） 0.1バール以上の過圧空気供給をカッ
トオフする圧力コントローラー（４−3122型、Bell & H
owell ）。これは排気フィルターの詰まりを防止するた
めに実施した。 ｂ）底に泡防止を有する20リットルの吸引容器から作ら
れたガス出口の泡トラップ。 ｃ）冷却水またはトアップ水ドレインの汚染を防止する
ために、シールをもたない冷却水ジャケット。 ｄ）絶対的排気フィルターを使用する（Gelman acro 5
0、0.45ミクロン）。 ｅ）小さい内部体積をもつサンプリングポンプdvc を経
るサンプリング。

【０２０４】コントロール 質量流れメーターを使用して気体の流れをコントロール
した（Brooks、5852型、範囲０〜10リットル）。ハート
マン・アンド・ブラウン（Hartmann and Braun）トラン
スミッターおよびフィルップス（Philips）のコントロ
ーラー（Witromat）を使用して、pH をコントロールし
た。濃NaOH（３モル）を中和剤として使用した。

【０２０５】ウノム（Unor）4N（C02）およびオキシゴ
ール（Oxygor）7N（02）（Maihak, Westinghouse か
ら）を使用して、排気ガスを分析した。工業的ポラログ
ラフの滅菌可能な酵素プローブ（Ingold322756702型 ）
を使用して、培地の中の酸素のテンションを決定した。
PT100センサーおよびハネウェル（Honeywell）温度コン
トローラー（クラス84）を使用して、培地の温度をモニ
ターした。発泡は接触電極を使用して許容されうるレベ
ルに保持し、その間レベルスイッチは泡防止投与ポンプ
を作動させた。すべての外部のコントロールは、ヘウレ
ット・パッカード（Hewlett Packard）マイクロコンピ
ューター（HP220）のコントロール下に配置した。

【０２０６】培養条件 回転震盪器（LH発酵器、MKx 型）の中で250rpmおよび30
℃において、震盪フラスコの培養物を16時間インキュベ
ーションすることによって、接種物を調製した。実際の
発酵器条件（pH7.0、30℃；空気の流れ 3.5ｌ／分、撹
拌機1000〜1500rpm）においてコンディショニングして
いる８リットルの培地のために、 300mlの接種物を使用
した。溶解した酵素の濃度を空気の飽和より25％上に保
持した。使用した発泡防止剤はシリコーン油に基づく物
質であった（Rhodorsil R426, Rhone Poulenc）。

【０２０７】スブチリシンプロテアーゼの産生 遺伝子の構成下に前述の突然変異遺伝子を含有するB. s
ubtilis DB105 株を使用して、（突然変異）プロテアー
ゼを産生した。培地は次の成分から成る：８ｇ／ｌのNH
4Cl；４ｇ／ｌのKH2PO4；４ｇ／ｌのK2HPO4；2PO4ｇ／
ｌ のスクロース；pH7.0そして120℃において45分滅菌
した。滅菌後、25mg／ｌのトリプトファン；20mg／ｌの
ネオマイシンを添加した。20〜30時間後、発酵を停止し
た。遠心により培地から細胞を取り出した。

【０２０８】突然変異スブチリシンのタンパク質分解活
性 種々の突然変異のタンパク質分解活性を、DMC法supraに
従い、タンパク質基質としてカゼインに対して試験し
た。結果を第IV表に記載する。この表から理解されるよ
うに、突然変異（S005）は親（S000）と比較してわずか
に増大した活性を示すが、これに対して残りの突然変異
はわずかに減少した活性を示す。

【０２０９】

【表２８】

【０２１０】突然変異スブチリシンの洗浄性能 Ａ：pH8.14の標準の液体洗浄剤の中の種々の突然変異の
洗浄性能を、上に詳述した方法に従い、草のジュースに
対して、モデル系において試験した。結果を第Ｖ表に記
載する。

【０２１１】

【表２９】

【０２１２】この表から理解されるように、試験した突
然変異のすべては、野生型の親の酵素と比較して改良さ
れたまたは等しい性能を示した。突然変異S019およびS0
20の洗浄性能は改良されるので、 1.0mg／ｌのこれらの
酵素はおおよそ10.0mg／ｌの野生型親酵素の代わりに使
用され、これにより本発明の突然変異の酵素についての
洗浄性能の実質的な改良を示す。

【０２１３】Ｂ：モデルの系中の種々のpH値における変
更した商業的US液体洗浄剤中の本発明の酵素変異型のあ
るものの試験からの結果を、第VI表に示す。

【０２１４】

【表３０】

【０２１５】結果が明瞭に示すように、酵素の洗浄性能
のために最適なpHをシフトさせて洗浄液のpHに近付けよ
うとする方向に、酵素のpIをシフトとさせると、酵素の
洗浄性能は改良される。種々の突然変異の洗浄性能は、
アッセイＡに記載する方法に従い、草のジュースで汚し
た綿のクロスに対して試験した。2.0ｇ／ｌ の液体洗浄
剤（洗浄剤D3）を使用した。洗浄剤をイオン交換した水
中に溶解した。pHをNaOH／HClで9.1に調節した。温度を
20℃の等温に10分間保持した。突然変異は0.25；0.5；
1.0；2.0；5.0；および10.0mgの酵素タンパク質／ｌ各
々で投与した。

【０２１６】試験の突然変異の安定性は、差動走査熱量
計、DSC により変性温度（最大の過剰の熱量）を測定す
ることによって決定した。安定性は、その組成がアッセ
イＡに記載されている、91％の標準の液体洗浄剤の中に
ほぼ２mg／mlの突然変異を含有する溶液の中で試験し
た。この溶液は、100mlの酵素溶液（0.01モルのジメチ
ルグルタル酸、0.002モルのCaCl₂、0.2モルのH₃BO₃およ
び０〜0.1モルのNaClの緩衝液、pH6.5 、の中のほぼ20m
gの酵素／ml）を 100μｌの標準の液体洗浄剤と混合す
ることによってつくった。スブチリシン309の突然変異
の群の範囲内で、DSCにより得られた安定性の結果は、
伝統的貯蔵安定性の試験により得られた安定性と一致す
る。

【０２１７】結果 液体洗浄剤の中の種々の突然変異の洗浄性能を表VII に
記載されている。結果は野生型の親の酵素に関する改良
ファクターとして示されている。改良ファクターはアッ
セイＣにおけるように定義される。また、第VII表に、D
SCによる標準の液体洗浄剤の中の変性温度、および野生
型の親の酵素の変性温度と問題の突然変異のそれとの間
の差が示されている。

【０２１８】

【表３１】

【０２１９】第VII 表から理解されるように、試験した
突然変異のすべての野生型の親の酵素と比較して改良さ
れた洗浄性能を示す。最良の洗浄性能は、洗浄溶液のpH
に等しいか、あるいはそれよりちょうど低いpI₀ を有す
る突然変異により達成される。DSCによる変性温度が示
すように、単一の突然変異S021（＋36D）およびS201（N
76D）の安定性は、野生型の親の酵素に関して、それぞ
れ、4.0℃および4.2℃だけ増加する。

【０２２０】第VII 表に記載されている突然変異の１ま
たは２以上を組み込んだ突然変異の間で、突然変異R170
YおよびK251Eは突然変異を野生型の親の酵素に関して脱
安定化するが、これに対して突然変異 H120D，G195Eお
よびK235Lは安定性に関して普通である。第VII 表から
理解されるように、１つの脱安定性突然変異を含有する
突然変異は、安定化突然変異を含める場合においてさ
え、脱安定化される。

【０２２１】*36DおよびN76Dの安定化効果は加法的であ
る。これは突然変異S025およびS035により示される。S0
25は安定性および安定化突然変異*36Dに対して普通であ
る、３つの突然変異を含有する。S025についての変性温
度は、野生型の親の酵素のそれに関して 3.9℃だけ増加
し、これは単一の*36D，S021について測定した増加に等
しい。S035は同一突然変異N76Dを含有する。S035につい
ての変性温度は、野生型の親の酵素に関して 7.3℃だけ
増加し、これは、実験誤差の範囲内で、単一の突然変異
*36D，S021およびN76D，S201について測定した増加の合
計に等しい。

【０２２２】Ｅ．３つの突然変異の洗浄性能を、アッセ
イＡに記載する方法に従い、草のジュースで汚した綿の
クロスに対して試験した。2.0ｇ／ｌ の液体洗浄剤D3を
使用した。洗浄剤をイオン交換した水中に溶解した。pH
をNaOH／HClで9.1に調節した。温度を30℃の等温に10分
間保持した。突然変異は 1.0および10.0mgの酵素タンパ
ク質／ｌ各々で投与した。 結果 商業的US液体洗浄剤の中の３つの突然変異の洗浄性能を
第VIII表に記載されている。

【０２２３】

【表３２】

【０２２４】第VIII表から理解されるように、突然変異
のすべては野生型の親の酵素と比較して改良された洗浄
性能を示す。さらに、理解されるように、最良の洗浄性
能は、洗浄溶液のpHに最も近いpI₀ を有する突然変異に
より達成される。

【０２２５】Ｆ：洗浄剤D3の中の２つの突然変異の洗浄
性能を、草のジュースで汚した綿のクロスに対して試験
した。結果を第IX表に示す。

【表３３】

【０２２６】第IX表から理解されるように、突然変異の
すべては野生型の親の酵素と比較して改良された洗浄性
能を示す。さらに、理解されるように、最良の洗浄性能
は、洗浄溶液のpHに最も近いpI₀ を有する突然変異によ
り達成される。

【０２２７】Ｇ．種々の突然変異の洗浄性能を、アッセ
イＡに記載する方法に従い、草のジュースで汚した綿の
クロスに対して試験した。2.0ｇ／ｌ の液体洗浄剤D3を
使用した。洗浄剤を緩衝液（イオン交換した水中で調製
した0.0025モルのホウ酸および0.001モルの２ナトリウ
ム水素ホスフェート）中に溶解した。pHをNaOH／HCl
で、それぞれ、7.0、8.0、9.0および10.0に調節した。
温度を30℃の等温に10分間保持した。突然変異は 0.2mg
の酵素タンパク質／ｌ各々で投与した。

【０２２８】結果 モデル系の中の種々のpH値において本発明の酵素変異型
のいくつかの洗浄性能を第Ｘ表に示す。

【０２２９】

【表３４】

【０２３０】第Ｘ表から明瞭に理解されるように、プロ
テアーゼのpIを洗浄液のpHに向けてシフトさせると、プ
ロテアーゼの洗浄性能を改良する。結果が、また、示す
ように、試験したすべての変異型はpH10.0以下において
野生型の親の酵素と比較して改良された性能を有する。

【０２３１】Ｈ．種々の突然変異の洗浄性能を、アッセ
イＡに記載する方法に従い、草のジュースで汚した綿の
クロスに対して試験した。2.0ｇ／ｌ の液体洗浄剤D3を
使用した。洗浄剤をイオン交換した水中で調製した0.00
5モルのグリシン中に溶解した。pHをNaOHで、それぞ
れ、10.0、10.25、10.50、10.75、11.0、11.5、および1
2.0に調節した。温度を30℃の等温に10分間保持した。
突然変異は 0.2mgの酵素タンパク質／ｌ各々で投与し
た。

【０２３２】結果 モデル系の中の種々のpH値において本発明の酵素変異体
のいくつかの洗浄性能を第XI表に示す。この場合におい
て、野生型の親の酵素よりわずかに高いpIをもつ変異体
を研究した。pH10.0〜12.0のpH範囲を、前の実施例より
詳細に研究する。

【０２３３】

【表３５】

【０２３４】第XI表中のデータが示すように、高いpH値
において、最大の性能は計算したpIよりわずかに上のpH
値において達成される。プロテアーゼのpIのなお増加す
ると、最大の性能のpHは増加する。効果は、低いpH値
（アッセイＢおよびＧ）において見られるほど顕著では
ない。

【０２３５】Ｉ：プロテアーゼの等電点とプロテアーゼ
がその最大の性能を有するpHとの間の相関関係を可視化
するために、実施例Ｂ、Ｇ、およびＨからの結果を使用
して、研究した変異型（および野生型の親の酵素）の各
々がその最大の性能を有するpHを見いだす。第５図にお
いて、このpH_max は計算したpI₀ の関数として示す。pH
範囲を 1.0のpH値のステップで研究することを考慮する
と、相関関係は明らかである。

【０２３６】本発明の突然変異とリパーゼとの組み合わ
せに関すると、実験結果は次の実際的結論に導いた：リ
パーゼはＯ型の洗浄液中で37℃において１時間安定であ
った。Savinase^R no存在は急速に不活性化に導いた。Ka
zusase^R は試験期間にわたってリパーゼの実質的に少な
い不活性化に導いた。プロテイナーゼＫは、Savinase^R
より攻撃的でないが、Kazusae^Rより攻撃的である。しか
しながら、スブチリシンBPN'はこれらの条件下にリパー
ゼをまったく不活性化しなかった。

【０２３７】例えば、Ｏ型で表される洗浄組成物中のリ
パーゼと組み合わせて、使用するために好ましいプロテ
アーゼは、突然変異S001，S003，S004，S012，S019，S0
20，S021，S025，S035，S235である。Ｏ型洗浄液は、次
の洗浄剤の配合（重量％）から誘導された、37℃の５ｇ
／ｌの溶液であった：

【０２３８】 アニオン性界面活性剤 6 非イオン性界面活性剤 5 脂肪酸 2.8 アクリルポリマー 3 ゼオライト 22 炭酸塩 10 硫酸塩 17.5 粘土 8 第３アミン 2 パーボレートモノハイドレート 13 少量物質および水を添加して 100

【０２３９】例えば、Ｗ型で表される洗浄組成物中のリ
パーゼと組み合わせて、使用するために好ましいプロテ
アーゼは、突然変異S020，S021，S025，S035，S235であ
る。Ｗ型洗浄液は、次の液体洗浄剤の配合（重量％）か
ら誘導された、37℃の２ｇ／ｌの溶液であった：

【０２４０】 アニオン性界面活性剤 16 非イオン性界面活性剤 7 ヒドロトロープ 6 クエン酸 6.5 NaOH 4.1 モノエタノールアミン 2 少量物質および水を添加して 100 本発明をその種々の特定の実施態様に関して論じそして
例示したが、本発明はその応用およびその開示に限定さ
れると解釈すべきでなく、上にならびに添付した請求の
範囲において述べかつ記載した特徴のすべての組み合わ
せおよび下位の組み合わせに拡張される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドpSX88の構成を示す。

【図２】図２は、プラスミドpSX88の制限地図を示す。

【図３】図３は、本発明の酵素を発現する突然変異のス
ブチリシン309 遺伝子の構成を例示する。

【図４】図４は、プラスミドpSX92の制限地図を示す。

【図５】図５は、本発明の突然変異の酵素の最大の性能
と計算したpIとの間の関係をグラフで実証する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 オルセン，オレ ホビルステド デンマーク国，デーコー−2700 ブレー ンシェーイ，ベッケスコウバイ 38 (72)発明者 ネールスコフ−ラウリトセン，レイフ デンマーク国，デーコー−4600 ケー ゲ，ストレービェゲデ，ビルケバイ 10 (72)発明者 シモンセン，メレテ デンマーク国，デーコー−2100 ケーベ ンハウン エー，フィーアト，ブレグド ムスバイ 114 (72)発明者 アースリュンク，ドリット デンマーク国，デーコー−4000 ロスキ ルデ，スボゲルスレフ，フュレン ８ (72)発明者 カステレェイン，エリク オランダ国，2907 セーヘー カペル アー／デーイセル，パレティエルブルク 105 (72)発明者 エクモント，マールテン ローバト オランダ国，3461 ヘーデー リンショ テン，デ ネス 34 (72)発明者 ハベルカムプ，ヨハン オランダ国，2661 カーエル ベルクシ ェンフック，デ クルスカルペル 40 (72)発明者 マルク，ヨーン ダビト オランダ国，3524 ベーエル ウトヒ ト，フィベリンゴ 141 (72)発明者 モーレン，アルノルドゥス テオドルス アントニウス オランダ国，3136 テーペー ブラール ディンゲン，ズワルウェンラーン 461 (56)参考文献 国際公開88／008033（ＷＯ，Ａ１) Ｎａｔｕｒｅ，1985年，318［6044］, ｐ．375−376 Ｎａｔｕｒｅ，1987年，328［6130］, ｐ．496−500 Ｎａｔｕｒｅ，1987年，330［6143］, ｐ．86−88 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/32 C12N 9/56 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 正味電荷が同一pHにおいて親プロテアー
   ゼに比較して変化している変異したスブチリシンプロテ
   アーゼであって、親プロテアーゼに比べて高い等電点を
   有し、そして成熟スブチリシンBPN'のアミノ酸配列に対
   応する89位、181位、197位及び 271位から選ばれた少な
   くとも１部位が他のアミノ酸により置換されている変異
   スブチリシンプロテアーゼ。
2. 【請求項２】 E89S；D181N；D197N＋E271Q；D197N；又
   はE271Qのいずれかである、請求項１に記載の変異スブ
   チリシンプロテアーゼ。
3. 【請求項３】 前記親プロテアーゼが、スブチリシンBP
   N'、スブチリシンアミロサッカリチクス、スブチリシン
   168 、スブチリシンメセンテリコペプチダーゼ、スブチ
   リシンカールスバーグ（Carlsberg）、スブチリシンDY
   、スブチリシン309、スブチリシン147、サーミター
   ゼ、アクアリシン、バチルス（Bacillus）属PB92プロテ
   アーゼ、プロテアーゼＫ、プロテアーゼTW7、又はプロ
   テアーゼTW3である、請求項１又は２に記載の変異スブ
   チリシンプロテアーゼ。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の変
   異スブチリシンプロテアーゼをコードするDNA。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のDNAを含んでなるベク
   ター。
6. 【請求項６】 発現ベクターである請求項５に記載のベ
   クター。
7. 【請求項７】 請求項５又は６に記載のベクターにより
   形質転換された微生物宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の変
   異スブチリシンプロテアーゼの製造方法において、前記
   変異スブチリシンプロテアーゼをコードするDNAを含ん
   で成る発現ベクターにより形質転換された微生物宿主細
   胞を培養し、この培養物から前記スブチリシンプロテア
   ーゼを採取することを特徴とする方法。
9. 【請求項９】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の変
   異スブチリシンプロテアーゼを含んで成る洗剤添加剤。
10. 【請求項１０】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の
    変異スブチリシンプロテアーゼまたは請求項９に記載の
    洗剤添加剤を含んでなる洗剤組成物。