DE945502T1 - Mutierte Subtilisin-protease - Google Patents

Mutierte Subtilisin-protease

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DE945502T1
DE945502T1 DE0945502T DE99102452T DE945502T1 DE 945502 T1 DE945502 T1 DE 945502T1 DE 0945502 T DE0945502 T DE 0945502T DE 99102452 T DE99102452 T DE 99102452T DE 945502 T1 DE945502 T1 DE 945502T1
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Claims (39)

DE / E PO 94 5 5.02 T1 -1 - EP 99 102 452.2 21. November 2001 Novozymes A/S N36858DE Bö/HvC/sh Patentansprüche
1. Mutierte Subtilisin Protease, wobei die elektrostatische Nettoladung im Vergleich zu der Ausgangsprotease bei gleichem pH verändert wurde, so dass es in der Protease, relativ zu der Ausgangsprotease weniger oder mehr positiv-geladene(n) Aminosäurerest(e) gibt und/oder mehr oder weniger negativ-geladene(n) Aminosäurerest(e) gibt, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Mutation von den Aminosäureresten an einer oder mehrerer der Positionen
1, 2, 3, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 40, 43, 44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100, 105, 106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146, 165, 167, 173, 183, 184, 185, 191, 192, 209, 210, 211, 212, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 251, 252, 253, 255, 256, 257,259, 263, 269, 271, 272,
verursacht ist durch Deletion, Substitution oder Insertion (einfach oder mehrfach) in Nachbarschaft zu den genannten Positionen, wobei die mutierte Subtilisin Protease einen niedrigeren isoelektrischen Punkt (plo) hat als die Ausgangsprotease.
2. Mutierte Subtilisin Protease, wobei die elektrostatische Nettoladung im Vergleich zu der Ausgangsprotease bei gleichem pH verändert wurde, so dass es in der Protease, relativ zu der Ausgangsprotease weniger oder mehr positiv-geladene(n) Aminosäurerest(e) gibt und/oder mehr oder weniger negativ-geladene(n) Aminosäurerest(e) gibt, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Mutation von den Aminosäureresten an einer oder mehreren der Positionen
1,2, 3,4,10,14,15,17,18,20,40,43, 44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98,100,105,
106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146, 165, 167,173,
DE/EP O 945502T1
-2-
183, 184, 185, 191, 192, 209, 210, 211, 212, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247,
248, 251,252, 253,255, 256,257,259,263,269, 271,272,
verursacht ist durch Deletion, Substitution oder Insertion (einfach oder mehrfach) in Nachbarschaft zu den genannten Positionen, wobei die Subtilisin Protease einen höheren Isoelektrischen Punkt (plo) hat als die Ausgangsprotease.
3. Protease nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine Mutation besitzt, die einen Aminosäurerest beeinflusst, der eine Position besetzt, ausgewählt aus der Gruppe von Positionen
1, 2, 3, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 40, 43, 44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100, 105, 106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146, 165, 167, 173, 183, 184, 185, 191, 192, 209, 210, 211, 212, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247, 248,251,252,253,255,256,257,259,263,269,271,272,
und mindestens eine weitere Mutation, die einen Aminosäurerest beeinflusst, der eine Position besetzt, ausgewählt aus der Gruppe von Positionen
1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 36, 37, 38, 40, 41, 43,. 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144i 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256,257,259, 260, 261,262,263,265,269, 271, 272,275.
4. Mutierte Subtilisin Protease, wobei die elektrostatische Nettoladung im Vergleich zu der Ausgangsprotease bei gleichem pH verändert wurde, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere der folgenden Mutationen enthält:
RlOF5RlOL,
DE/EPO 345.502 &Pgr;
-3-
RI0F+R45A+E89S+E136Q+R145A+D181N+R186P+E271Q, R10F+R19Q+E89S+E136Q+R145A+D181N+E271Q+R275Q, Q12K,Q12R,
Q12K+P14D+T22K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D+ N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, Q12R+P14D+T22R+N43R+ Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+ S256K+S259D+A272R,Q12K+P14D+T22K+T38K+N43R+Q59E+N76D+A98R+ S99D+S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259+A272-R, Q12R+P14D+T22R+T38R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E- +A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, Q12K+P14D+T22K+T3 8K+N43R+Q5 9E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R+ S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, Q12R+P14D+T22R+T3 8R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+ S141R+S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D- +A272R,
P14K, P14K+*36D, P14K+N218D, P14K+P129D, A15K, A15R, R19Q, T22R, D32*, *36D,
*36D+R170Y+G195E+K251E, *36D+H120D+R170Y+G195E+K235L, * 36D+H120D+R170 Y+G195E+K23 5L+K251E,
♦36D+H120D+G195E+K235L, T38K, T38R, N43R, N43K, R45A, E53R, E53K, E53G+K235L, E54G, E54Y, Q59E, Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+- S256K+S259D+A272R,
D60N, E89S, E89S+K251N, Y91F, G97D, G97D+H120K, A98K, A98R, S99D, S99D+N140K, E112T, H120K, H120D+K235L, H120D+G195E+K235L, H120D+R170Y+G195E+K235L, H120D+R170Y+G195E+K235L+R251E, P129D, E136Q, E136R, E136Q+R10L, N140D, N140K, N140R, S141K, SW IR, R145A, S156E, S156E+A158R+A172D+N173K, S156E+A158R+A172D+N173K+T213R, Sl 56E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, A158R, A158K, Y167V, R170Y+G195E, R170Y+K251E, R170Y+G195E+K251E, R170Y+G195E+K235L, Y171T, N173K, N184K,
DE/ EP O 94 5 562 T1
N184R, N185D, R186P, Y192V, Y192V, Y192A, G195E+T213R, G195E+K251E, G195E+K235L, D197N, D197K, D197E, Q206D, Q206E, Y209L, T213R, Y214T, Y214S, N218D, K235L, K235R, K237R, W241Y, W241L, W241Y+H249R, W241L+H249R, N248D, K25IR, K251E, K251N, T255E, S256R, S256K, S259L, S259D, Y263W, S265R, E271Q, E271G, E271G+K27V, E271Q E271G, A272R, R275Q, D14K, D14K+D120K, D14K+D120K+D140K, D14K+D120K+D140K+D172K,
E54T, E54Y, N97D, N97D+S98D, N97D+T213D, S98D, S98D+T213D, D120K, D140K, S156E, D172K, T213D,N218D.
5. Mutierte Subtilisin Protease, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Insertionsmutation an Position 36 besitzt.
6. Protease nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine einen negativ geladenen Aminosäurerest gebende Insertionsmutation an Position 36 besitzt.
7. Protease nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation *36D oder *36Eist.
8. Protease nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertionsmutation einen neutralen Aminosäurerest zur Verfügung stellt.
9. Protease nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation *36A, *36Q. oder *36N ist.
10. Protease nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertionsmutation einen positiv geladenen Aminosäurerest zur Verfügung stellt.
DE /EP O 94 5 5.02 Tl
11. Protease nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation *36R oder *36K ist.
12. Protease nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine weitere Mutation an mindestens einer der Positionen 120, 170, 195, 235, und 251 hat.
13. Protease nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertion *36D, *36E, oder *36Q ist und die mindestens eine weitere Mutation ausgewählt ist aus H120D, R170Y.G195E, K235L undK251E.
14. Protease nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine weitere Mutation an Position 76 besitzt.
15. Protease nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Mutation dazu da ist, einen negativ-geladenen Aminosäurerest in Position 76 zu ersetzen.
16. Protease nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Mutation N76D oder N76E ist.
17. Protease nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine weitere Mutation in mindestens einer oder mehr der Positionen 120, 170, 195, 235, and 251 besitzt.
18. Protease nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte mindestens eine weitere Mutation ausgewählt ist aus H120D, Rl 7OY, G195E, K235L und K251E.
DE/EP O 94 5 502 TI
-6-
19. Protease nach einem der Ansprüche 5 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine weitere Mutation besitzt, die anderswo in dem Proteasemolekül eine weitere positive Ladung einfugt.
20. Protease nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Mutation in Position 213 ist.
21. Protease nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation T213K ist.
22. Protease nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Mutation einer Ausgangsprotease darstellt, ausgewählt aus Subtilisin BPN', Subtilisin amylosacchariticus, Subtilisin 168, Subtilisin Mesentericopeptidase, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin 309, Subtilisin 147, Thermitase, Aqualysin, Bacillus PB92 Protease, Proteinase K, Protease TW7 und Protease TW3.
23. Protease nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin Subtilisin 309 ist.
24. Protease nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie irgendeine der folgenden Substitutionen hat
RlOF5RlOL,
R10F+R45A+E89S+E136Q+R145A+D181N+R186P+E271Q,
R10F+R19Q+E89S+E136Q+R145A+D181N+E271Q+R275Q,
Q12K, Q12R,
Q12K+P14D+T22K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D- +N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R,
Q12R+P14D+T22R+N43R+ Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D- +N173K+T213R+N248D+T255E+ S256K+S259D+A272R,
Q12K+P14D+T22K+T3 8K+N43R+Q59E+N76D+A98R+ S99D+S156E-
+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259+A272R,
OE/EP 0 945502T1
-7-
Q12R+P14D+T22R+T38R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E- +Al 58R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, Q12K+P14D+T22K+T38K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R+ S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, Q12R+P14D+T22R+T38R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140+S141R--S156E+A15 8R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, P14D, P14K, P14K+*36D, P14K+N218D, P14K+P129D, A15K, A15R, R19Q, T22K, T22R, D32*, *36, *36D+R170Y+G195E+K251E, *36D+- H120D+R170Y+G195E+K235L, *36D+H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E, *36D+H120D+G195E+K235L, T38K, T38R, D41E, N43R, N43K, R45A, E53R, E53K, E53G+K235L, E54G, E54Y, Q59E, Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+- S256K+S259D+A272R,
D60N, N76D, E89S, E89S+K251N, Y91F, K94R, G97D, G97D+H120K, A98K, A98R, S99D, S99D+N140K, El 12T, H120K, H120D, H120D+K235L, H120D+G195E+K235L,H120D+R170Y+G195E+K235L, H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E, P129D, E136Q, E136K, E136R, E136Q+R10L, N140D, N140K, N140R, S141K, S141R, R145A, S156E, S156E+A158R+A172D+N173K, S156E+A158R+A172D+N173K+T213R, S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, A158R, A158K, Y167V, R170Y+G195E, R170Y+K251E, R170Y+G195E+K251E, R170Y+G195E+K235L, Y171E, Y171T, A172D, N173K, D181N, N184K, N184R, N185D, R186P, Y192V, Y192V, Y192A, G195E+T213R, G195E+K251E, G195E+K235L, D197N, D197K, D197E, Q206D, Q206E, Y209L, T213R, T213K, Y214T, Y214S, N218D, K235L, K235R, K237R, W241Y5 W241L, W241Y+H249R, W241L+H249R, N248D, H249R, K251R, K251E, K251N, T255E, S256R, S256K, S259L, S259D, Y263W, S265K, S265R, E271Q, E271G, E271G+K27V, E271Q, E271G, A272R, A272R, R275Q.
25. Protease nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation mindestens eine der folgenden ist:
DE/EP O 9455.02 Tl
-8-
S004) R170Y+G195E S005) K251E S006) H120D S008) H120D+G195E 5 S009) T71D SOlO) T71D+G195E Soll) R170Y+K251E 'SO12) R170Y+G195E+K251E SO13) T71D+R1.70Y+K251E 10 SO 14) T71D+R170Y+G195E+K251E Sol5) K235L SO 16) H120D+K235L SOl 7) H120D+G195E+K235L S018) G195E+K251E 15 SO 19) Hl 20D+R170Y+G195E+K235L S020) H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E S021) *36D S022) *36D+R170Y+G195E+K25IE S023) *36D+H120D+R170Y+G195E+K235L 20 S024) !|!36D+H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E S025) *36D+H120D+G195E+K235L S026) E136R S027) E89S S028) D181N 25 S029) E89S+E136R S030) E89S+D181N S031) D197N+E271Q S032) D197N S033) E271Q 30 S035) *36D+N76D+H120D+G195E+K235L S041) G195F S201) N76D
-9-
DE/EP O 945 502 Tl
5202) N76D+G195E
5203) N76D+R17OY+G195E
5204) H120D+G195E+K235L+K251E
5223) Q59E+N76D+A98R+S99D+T213K+K235L+N248D+T255E- -S256K+S259D+A272R
5224) Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R- +K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R
5225) ♦36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+R170Y+S156E+A158R- +A172D+N173R+K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R
S226) *36Q
5227) *36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D +S141R+R170Y+G195E+K235L+N248D+T255E- +S256K+S259D+A272R
5228) *36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R+ S156E+A158R+A172D+N173K+K235L+N248D+- T255E+S256K+S259D+A272R
5229) Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R- +S156E+A158R+A172D+N173K+K235L+N248D+T255E+- S256K+ 259D+A272R
S234) Q206D
S235) *36D+N76D
S242) *36Q+N76D+H120D+G195E+K235L
26. Protease nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin Subtilisin 147 ist.
27. Protease nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin Subtilisin Carlsberg ist.
28. Protease nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine der folgenden Substitutionen hat:
D14K, D14K+D120K, D14K+D120K+D140K, D14K+D120K+D140K+D172K, E54T, E54Y, N97D, N97D+S98D, N97D+T213D, S98D, S98D+T213D, D120K, D140K, S156E, D172K, T213D, N218D.
DE/EP O 945 5.02 &Tgr;1
-10-
29. Protease nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation eine der folgenden ist:
COOl) D14K
C002) D120K
C003) D140K
C004) D14K+D120K
C008) D172K
C009) D14K+D120K+D140K
COlO) D14K+D120K+D140K+D172K
CO13) N97D.
CO14) S98D
C015) T213D
COl 7) S156E
CO18) N97D+S98D
CO19) N97D+T213D
C022) S98D+T213D
C028) N218D
ClOO) V51D
ClOl) E54T
C102) E54Y.
30. Protease nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin die Bacillus PB92 Protease ist.
31. Protease nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass sie irgendeine der folgenden Substitutionen hat
RlOF5RlOL, R10F+R45A+E89S+E136Q+R145A+D181N+R186P+E271Q, R10F+R19Q+E89S+E136Q+R145A+D181N+E271Q+R275Q, Q12K, Q12R, Q12K+P14D+T22K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D-
DE/EP O 94 5 5.02 Tl
-11-
+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, Q12R+P14D+T22R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156&Egr;+&Agr;158R+A172D- +N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, Q12K+P14D+T22K+T38K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E- +A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259+A272R, Q12R+P14D+T22R+T38R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E- +A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, Q12K+P14D+T22K+T38K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+- S141R+S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+- A272R,
Q12R+P14D+T22R+T38R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140+S141R— S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, P14D, &Rgr;14&Kgr;, P14K+*36D, P14K+N218D, P14K+P129D, A15K, A15R, R19Q, T22K, T22R, D32*,
*36D, *36D+R170Y+G195E+K251E,
*36D+H120D+R170Y+G195E+K235L,
*36D+H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E,
*36D+H120D+G195E+K235L,
T38K, T38R, D41E, N43R, N43K, R45A, E53R, E53K, E53G+K235L, E54G, E54Y, Q59E,
Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E^- S256K+S259D+A272R,
D60N, N76D, E89S, E89S+K251N, Y91F, K94R, G97D, G97D+H120K, A98K, A98R, S99D, S99D+N140K, El 12T, H120K,H120D,H120D+K235L,H120D+G195E+K235L, H120D+R170Y+G195E+K235L,
H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E,
P129D, E136Q, E136K, E136R, E136Q+R10L, N140D, NHOK, N140R, SHlK, SHlR, R145A, S156E, S156E+A158R+A172D+N173K, S156E+A158R+A172D+N173K+T213R,
S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, A158R, A158K, Y167V, R170Y+G195E, R170Y+K251E, R170Y+G1-
-12-
DE/EP O 945502T1
95E+K251E, R170Y+G195E+K235L, Y171E, Y171T, A172D, N173K, D181N, N184K, N184R, N185D, R186P, Y192V, Y192V, Y192A, G195E+T213R, G195E+K251E, G195E+K235L, D197N, D197K, D197E, Q206D, Q206E, Y209L, T213R, T213K, Y214T, Y214S,N218D, K235L, K235R, K237R, W241Y, W241L, W241Y+H249R, W241L+H249R, N248D, H249R, K251R, K251E, K251N, T255E, S256R, S256K, S259L, S259D, Y263W, S265K, S265R, E271Q, E271G, E271G+K27V, E271Q, E271G, A272R, A272R, R275Q .
32. Protease nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation mindestens eine der folgenden ist:
5004) R170Y+G195E
5005) K251E
5006) H120D
S008) H120D+G195E
5009) T71D
5010) T71D+G195E SOU) R170Y+K251E S012) -R170Y+G195E+K251E S013) T71D+R170Y+K251E S014) T71D+R170Y+G195E+K251E •S015) K235L
5016) H120D+K235L
5017) H120D+G195E+K235L SO 18) G195E+K251E
5019) H120D+R170Y+G195E+K235L
5020) H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E
5021) *36D
5022) *36D+R170Y+G195E+K251E
S023) *36D+H120D+R170Y+G195E+K235L
5024) *36D+H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E
5025) *36D+H120D+G195E+K235L
-13-
5026) E136R
5027) E89S
5028) D181N
5029) E89S+E136R SO3O) E89S+D181N
5031) D197N+E271Q
5032) D197N
5033) E271Q
SO35) *36D+N76D+H120D+G195E+K235L S041) G195F
5201) N76D
5202) N76D+G195E
5203) N76D+R170Y+G195E
5204) H12OD+G195E+K235L+K251E
S223) Q59E+N76D+A98R+S99D+T213K+K235L+N248D+T255E-
+S256K+S259D+A272R
5224) Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R- +K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R
5225) *36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+R170Y+S156E+A158R- +Al 72D+N173R+K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+
A272R
5226) *36Q
5227) *36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D
+S141R+R170Y+G195E+K235L+N248D+T255E- +S256K+S259D+A272R
5228) *36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R+
S156E+A158R+A172D+N173K+K235L+N248D+-
T255E+S256K+S259D+A272R
S229) Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R- +S156E+A158R+A172D+N173K+BC235L+N248D+T255E+-
S256K+ 259D+A272R S234) Q206D
- 14 -
S235) *36D+N76D
S242) ♦36Q+N76D+H120D+G195E+K235L.
33. Verfahren zur Bestimmung oder Selektion der in einem Ausgangsenzym zu deletierenden, zu substituierenden oder zu inserierenden Position(en) und Aminosäure(n), dadurch gekennzeichnet, dass die Selektion in einer Weise durchgeführt wird, dass die berechnete Nettoladung (=NEC) in einem erwägtem Mutanten-Enzym im Vergleich zu der NEC des Ausgangsenzyms der Wahl verändert wurde, berechnet bei gleichem pH Wert und dass der ausgewählte Aminosäurerest aus den Aminonsäureresten an irgendeiner oder mehreren der Positionen ausgewählt wird:
1, 2, 3, 4, 10, 14,15, 17, 18,20,40, 43, 44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100, 105, 106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137,141, 143, 144, 145,146, 165, 167, 173, 183, 184, 185, 191, 192, 209, 210, 211, 212, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 251, 252, 253, 255, 256, 257, 259, 263, 269, 271, 272,
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die gewählte Aminosäurereste so ausgewählt sind, dass sie einen Aminosäurerest bewirken, der eine der Positionen belegt ausgewählt aus der Gruppe von Positionen
1, 2, 3, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 40, 43, 44, 49, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100, 105, 106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146,165, 167, 173, 183, 184, 185, 191, 192, 209, 210, 211, 212, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 251, 252, 253, 255, 256, 257, 259, 263, 269, 271, 272,
und mindestens ein weiterer bewirkt einen Aminosäurerest, der eine der Positionen belegt, ausgewählt aus der Gruppe der Positionen:
1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171, 172,173, 181, 182,183, 184, 185,186, 188, 189, 191,192, 194, 195,197, 204,206,
DE/EP 0
HL/ L. &igr; — -
-15-
209, 210, 211, 212, 213, 214, 215,216, 217, 218,235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262,263,265,269,271,272,275.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsenzym ausgewählt ist aus Subtilisin BPN', Subtilisin amylosacchariticus, Subtilisin 168, Subtilisin mesentericopeptidase, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin 309, Subtilisin 147, Thermitase, Bacillus PB92 Protease, Proteinase K, Protease TW7 und Protease TW3.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin Subtilisin 309 ist.
37. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin Subtilisin 147 ist.
38. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin Subtilisin Carlsberg ist.
39. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin Bacillus PB92 Protease ist.
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