CN101014704A - 蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及得自达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235、Nocardiopsis prasina DSM 15649、Nocardiopsis prasina(以前是alba)DSM14010、拟诺卡氏菌属的菌种DSM 16424、嗜碱拟诺卡氏菌DSM 44657和卢森坦类诺卡氏菌DSM 44048的蛋白酶，以及同源蛋白酶；它们在各种宿主，包括转基因植物和非人动物中的重组生产，和它们在动物饲料和洗涤剂中的用途。该蛋白酶是酸稳定的、碱稳定的和/或热稳定的。

Description

蛋白酶
技术领域
本发明涉及具有蛋白酶活性的分离多肽和编码该多肽的分离的核酸序列。本发明还涉及含有该核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，包括植物和动物细胞，本发明还涉及产生和使用所述多肽的方法，尤其是所述多肽在动物饲料和洗涤剂中的用途。
背景技术
得自拟诺卡氏菌属的菌株(Nocardiopsis sp.)NRRL 18262和达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的蛋白酶公开于WO88/03947。得自拟诺卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的DNA和氨基酸序列在DK申请no.1996 00013中显示。WO 01/58276中公开酸稳定的蛋白酶在动物饲料中的用途，其中所说的蛋白酶与得自拟诺卡氏菌NRRL 18262以及得自Nocardiopsis alba DSM 14010的蛋白酶相关。
JP 2-255081-A公开一种得自拟诺卡氏菌菌株OPC-210(FERM P-10508)的蛋白酶，然而无序列信息。该菌株不再能够获得，因为保藏被撤销。
DD 200432|8公开了一种得自达松维尔拟诺卡氏菌菌株ZIMET 43647的蛋白水解制剂，然而无序列信息。该菌株似乎不再能够获得。
JP 2003284571-A公开了得自拟诺卡氏菌TOA-1(FERM P-18676)的蛋白酶的氨基酸序列和相应的DNA序列。该序列已经以编号ADF43564进入GENESEQP。
本发明的目的是提供另一种可选择的蛋白酶，尤其是在动物饲料和/或洗涤剂中的用途。
发明内容
克隆、纯化和表征了许多蛋白酶。这些蛋白酶命名如下：得自达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种(Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei)DSM43235的蛋白酶 L1a(参见SEQ ID NOs.1和2)；得自Nocardiopsis prasinaDSM 15649的蛋白酶 L1b(参见SEQ ID NOs：3和4)；得自Nocardiopsisprasina(以前是alba)DSM 14010的蛋白酶 L1c(参见SEQ ID NOs：5和6)；得自拟诺卡氏菌属的菌种DSM 16424的蛋白酶 L2a(参见SEQ ID NOs：7和8)；得自嗜碱拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alkaliphila)DSM 44657的蛋白酶 L2b(参见SEQ ID NOs：9和10)；和得自卢森坦类诺卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis)DSM 44048的蛋白酶L2c(参见SEQ ID NOs：11和12)。
第一个方面，本发明涉及一种具有蛋白酶活性的分离多肽，选自：(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：6的1-192位氨基酸具有至少71.5％的同一性程度；(b)由核酸序列编码的多肽，其中所说的核酸序列在非常高严紧条件下与(i)SEQ ID NO：5的574-1149核苷酸、(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；(c)具有SEQID NO：6的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
其他五个方面，对应于本说明书结尾处给出的五组具体的实施方案，本发明还涉及：
一种具有蛋白酶活性的分离多肽，其选自下组：(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：4的1-192位氨基酸具有至少69.9％的同一性程度；(b)由核酸序列编码的多肽，其中所说的核酸序列在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：3的574-1149位核苷酸、(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；(c)具有SEQ ID NO：4的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
一种具有蛋白酶活性的分离多肽，其选自下组：(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-192位氨基酸具有至少75.1％的同一性程度；(b)由核酸序列编码的多肽，其中所说的核酸序列在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：1的568-1143位核苷酸、(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；(c)具有SEQ ID NO：2的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
一种具有蛋白酶活性的分离多肽，其选自下组：(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：8的1-189位氨基酸具有至少92.2％的同一性程度；(b)由核酸序列编码的多肽，其中所说的核酸序列在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：7的586-1152位核苷酸、(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；(c)具有SEQ ID NO：8的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
一种具有蛋白酶活性的分离多肽，其选自下组：(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：10的1-189位氨基酸具有至少93.2％的同一性程度；(b)由核酸序列编码的多肽，其中所说的核酸序列在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：9的586-1149位核苷酸、(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；(c)具有SEQ ID NO：10的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
一种具有蛋白酶活性的分离多肽，其选自下组：(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：12的1-189位氨基酸具有至少83.3％的同一性程度；(b)由核酸编码的多肽，其中所说的核酸序列在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：11的586-1152位核苷酸、(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；(c)具有SEQ ID NO：12的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
本发明还涉及编码上述多肽的分离的核酸序列并且涉及含有该核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法，特别是在动物饲料和洗涤剂中。
发明详述
具有蛋白酶活性的多肽
具有蛋白酶活性的多肽，或蛋白酶，有时也命名为肽酶、蛋白酶(proteinase)、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是从肽的任何一端开始水解肽的外切型，或者是在多肽链内部起作用的内切型(内肽酶(endopeptidase))。内肽酶在N端和C端阻断的肽底物上显示活性，其中所说的肽底物与所述蛋白酶的特异性有关。
本文中，术语″蛋白酶″定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的任何一个)。EC编号参考NC-IUBMB的酶命名法(Enzyme Nomenclature)1992，Academic Press，San Diego，California，包括分别公布于Eur.J.Bio-chem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650的增补1-5。该命名法定期补充并且更新；参见例如万维网(WWW)在http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
按其催化机理为基础，蛋白酶可分成以下几个组：丝氨酸蛋白酶(S)，半光氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金属蛋白酶(M)和未知的或仍未分类的蛋白酶(U)，参见蛋白水解酶手册(Handbook of Proteolytic Enzymes)，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(编)，Academic Press(1998)，特别是其总体介绍部分。
在具体的实施方案中，本发明和根据本发明用途的蛋白酶选自：
(a)属于EC 3.4.-.-酶组的蛋白酶；
(b)属于上述手册中S组的丝氨酸蛋白酶；
(c)肽酶家族S2A的丝氨酸蛋白酶；和/或
(d)肽酶家族S1E的丝氨酸蛋白酶，描述于Biochem.J.290：205-218(1993)和MEROPS蛋白酶数据库，6.20版本，2003.3.24(www.merops.ac.uk)。该数据库描述于Rawlings，N.D.，O′Brien，E.A.& Barrett，A.J.(2002)MEROPS：the protease database.Nucleic Acids Res.30，343-346。
为测定给定蛋白酶是否是丝氨酸蛋白酶，和S2A家族蛋白酶，参考上述的手册及其中指示的原则。这种测定可针对所有类型的蛋白酶进行，无论是天然存在的还是野生型蛋白酶；或者是基因工程改造或合成的蛋白酶。
蛋白酶活性可以使用任何测试来测定，在测试中使用底物，该底物包括与所述蛋白酶的特异性有关的肽键。测试-pH和测试-温度同样适合于所述的蛋白酶。测试-pH-值的实例为pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。测试-温度的实例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95℃。
蛋白酶底物的实例是酪蛋白，如天青蛋白(Azurine)-交联的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)。本文的实施例4-5描述了三种蛋白酶测试，可以使用其中任何一种来测定蛋白酶的活性。本发明中，所谓的pNA测试是优选的测试方法。
本发明和/或根据本发明用途的蛋白酶，其来源没有限制。由此，术语″蛋白酶″不仅包括从任何属的微生物中获得的天然或野生型蛋白酶，而且包括其显示蛋白酶活性的任何突变体、变体、片段等，以及合成的蛋白酶，如改组蛋白酶和共有蛋白酶。这种基因工程蛋白酶可以按照本领域通常已知的方法制备，例如通过定点突变，通过PCR(在PCR反应中，使用含有所需突变的PCR片段作为引物之一)或者通过随机突变。共有蛋白质的制备在例如EP897985中有所描述。基因改组在例如WO 95/22625和WO 96/00343中一般地描述。蛋白酶基因的重组可以通过Ness，J.E.等在Nature Biotechnology，Vol.20(12)，pp.1251-1255，2002中描述的合成改组独立地由亲本的特定序列制成。，设计在其DNA序列中简并以提供在该组亲本蛋白酶中存在的所有氨基酸的可能性的合成寡核苷酸并根据参考文献组装基因。改组可以针对全长序列进行，或者仅对部分序列，然后再与基因的其余部分合并以得到全长序列。SEQ ID NOs：2、4、6、8、10和12的蛋白酶以及上面所列的现有文献中描述的拟诺卡氏菌属蛋白酶，是这种亲本蛋白酶的具体实例，可以将它们进行如上所述的改组，以便提供本发明的其他的蛋白酶。本文中与给定来源连用的术语″得自″应指，由核酸序列编码的多肽是通过该来源产生的或者通过其中存在来自该来源的核酸序列的细胞产生的。在一个优选的实施方案中，多肽是胞外分泌的。
在具体的实施方案中，蛋白酶是低变应原性(allergenic)变体，被设计成当与动物(包括人)接触时引起免疫反应降低。术语″免疫反应″应理解为接触该蛋白酶的动物的免疫系统所引起的任何反应。一种类型的免疫反应是过敏性反应，导致接触动物中IgE水平增加。低变应原性变体可以使用本领域已知的技术来制备。例如，可以将蛋白酶和与免疫反应有关的蛋白酶的多聚体部分的屏蔽部位或表位缀合(conjugation)。与多聚体缀合可涉及多聚体与蛋白酶的体外化学偶联，例如WO 96/17929、WO 98/30682、WO 98/35026和/或WO99/00489中所描述的。所述的缀合可以附加地或可选择地包括多聚体与蛋白酶的体内偶联。这种缀合可以通过编码蛋白酶的核苷酸序列的基因工程改造，在蛋白酶中插入编码附加糖基化位点的共有序列并且在能够使蛋白酶糖基化的宿主中表达该蛋白酶来完成，例如参见WO 00/26354。另一种提供低变应原性变体的方式是编码蛋白酶的核苷酸序列的基因工程改造，以便引起蛋白酶自寡聚化，致使蛋白酶单体可以屏蔽其他蛋白酶单体的表位并且由此降低寡聚体的抗原性。这种产物及其制备在例如WO 96/16177中有所描述。在免疫反应中涉及的表位可以通过各种方法来鉴定，诸如WO 00/26230和WO01/83559中所述的噬菌体展示方法或EP 561907中描述的随机方法，当表位得到鉴定后，可以改变其氨基酸序列，以通过已知的基因操纵技术来产生蛋白酶的改变免疫特性，所述基因操纵技术例如定点突变(参见例如WO00/26230，WO 00/26354和/或WO 00/22103)和/或多聚体的缀合可以足够接近表位进行以使多聚体屏蔽该表位。
本发明的各个方面涉及具有蛋白酶活性的分离多肽(简称为″蛋白酶″)，以及对应的分离的核酸序列，所说的多肽或核酸分别含有氨基酸序列或核酸序列，它们分别与氨基酸序列或核酸序列的特定片段具有一定程度的同一性，氨基酸序列或核酸序列的特定片段具有特定的SEQ ID NO。特定的片段分别对应于成熟多肽或核酸序列的成熟多肽编码部分。
本发明中，两个氨基酸序列之间的同一性程度以及两个核苷酸序列之间的同一性程度，通过″对比″程序来测定，其是Needleman-Wunsch对比(即整体对比(global alignment))。该程序用于多肽的对比，以及核苷酸序列的对比。使用默认的计分矩阵BLOSUM50进行多肽对比，并且使用默认的同一性矩阵进行核苷酸对比。缺口(gap)的第一个残基的罚分(penalty)对于多肽是-12，而对于核苷酸是-16。缺口其他残基的罚分对于多肽是-2，而对于核苷酸是-4。
″对比″是FASTA软件包v20u6版本中的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS 85：2444-2448，及W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparisonwith FASTP and FASTA，″Methods in Enzymology 183：63-98)。FASTA蛋白对比使用Smith-Waterman算法，对缺口的大小没有限制(参见″Smith-Watermanalgorithm″，T.F.Smith and M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)。
在具体的实施方案中，本发明的多肽与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10或12中任一个的成熟部分具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的同一性程度。
在其他具体的实施方案中，本发明的核酸序列与SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11中任一个的成熟肽编码部分具有至少78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的同一性程度。
在另外的具体实施方案中，本发明的蛋白酶具有与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10和12中任一个的成熟部分相差(i)不超过20，19，18，17，16，15，14，13，12或不超过11个氨基酸；(ii)不超过10，9，8，7，6，5，4，3，2或不超过1个氨基酸；(iii)10或9或8或7或6或5个氨基酸；或(iv)4或3或2个氨基酸，或1个氨基酸的氨基酸序列。
在另外的具体实施方案中，本发明的蛋白酶包括SEQ ID NOs：2、4、6、8、10或12中任一个的成熟部分的氨基酸序列；或者是其等位变体；或其具有蛋白酶活性的片段。
在其他优选的实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12中任一个的成熟肽部分；或其等位变体；或其具有蛋白酶活性的片段组成。
SEQ ID NOs：2、4、6、8、10或12中任一个的片段是从这些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施方案中，片段含有至少75个氨基酸残基，或者至少100个氨基酸残基，或至少125个氨基酸残基，或至少150个氨基酸残基，或至少160个氨基酸残基，或至少165个氨基酸残基，或至少170个氨基酸残基，或至少175个氨基酸残基。
等位变体是指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可选形式的任一种。等位变异通过突变自然发生，并且可在群体中导致多态性(polymorphism)。基因突变可以是沉默的(编码多肽中没有变化)或者可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
本发明还涉及分离的多肽，其具有蛋白酶活性并且由核酸序列编码，所述核酸序列在非常低或低或中等或中-高或高或非常高的严紧条件下与核酸探针杂交，其中所说的核酸探针在相同条件下与(a)SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11中的任一个，或其成熟肽编码部分；(b)(a)的亚序列，或(c)(a)或(b)的互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor，New York)。在具体的实施方案中，核酸探针选自上述(a)，(b)或(c)的核酸序列。
(a)的亚序列可以是至少100个核苷酸，或者在另一个实施方案中，至少200个核苷酸。此外，所述亚序列可以编码具有蛋白酶活性的多肽片段。
SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11中任一种的核酸序列或其成熟肽编码部分或其亚序列，以及SEQ ID NOs：2、4、6、8、10或12中任一种的氨基酸序列或其片段，可以用来根据本领域公知的方法设计核酸探针来鉴别和克隆来自相同或不同属或种的菌株中的编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。具体说，可以依照标准的Southern印迹法，使用这种探针与目标属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中相应的基因。这种探针可以比全序列短得多，但应当为至少15个，优选至少25个，更优选至少35个核苷酸的长度。也可以使用更长的探针。DNA和RNA探针均可使用。通常，(例如，用32p，3H，35S，生物素或抗生物素蛋白)标记探针用于检测相应的基因。这种探针也包括在本发明的范围内。
由此，可以筛选由所述其他生物制备的基因组DNA或cDNA文库，得到与上述探针杂交并且编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他的分离技术，从所述其他的生物中分离基因组或其他DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维或其他适当的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NOs：1、3、5、7、9和11中的任一种或其亚序列同源的克隆或DNA，在Southern印迹中使用载体材料。本发明中，杂交是指在非常低至非常高的严紧条件下，将核酸序列与标记的核酸探针杂交，其中所说的标记的核酸探针对应于这些SEQ ID NOs中任一种所示的核酸序列，其互补链或其亚序列。使用X-射线胶片检测在这些条件下核酸探针所杂交的分子。
在具体的实施方案中，核酸探针是编码SEQ ID NOs：2、4、6、8、10或12中任一种的成熟肽部分的核酸序列或其亚序列。在另一个实施方案中，核酸探针是SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11中任一种的那些核苷酸，其对应于编码区域的成熟多肽。
对于至少100个核苷酸长度的长探针来说，非常低至非常高的严紧条件定义为42℃，在5 X SSPE，0.3％SDS，200μg/ml经剪切和变性的鲑精DNA，和25％甲酰胺(对于非常低和低的严格度)、35％甲酰胺(对于中等和中高的严格度)，或50％甲酰胺(对于高和非常高的严格度)，按照标准的Southem印迹法进行的预杂交和杂交。
对于至少100个核苷酸长度的长探针而言，载体材料最后用2 X SSC，0.2％SDS，优选至少在45℃(非常低严格度)，更优选至少在50℃(低严格度)，更优选至少在55℃(中等严格度)，更优选至少在60℃(中-高严格度)，还更优选至少在65℃(高严格度)，并最优选至少70℃在(非常高严格度)洗涤三次，每次15分钟。优选，使用0.2 X SSC、0.1 X SSC或0.02 X SSC来进行洗涤，其他洗涤条件不变(即洗涤三次，每次15分钟；包括0.2％SDS，洗涤优选至少在45℃(非常低的严格度)，更优选至少在50℃(低严格度)，更优选至少在55℃(中等严格度)，更优选至少在60℃(中等-高严格度)，更优选至少在65℃(高严格度)并且首选至少在70℃(非常高严格度))。
对于约15个核苷酸至约70个核苷酸长度的短探针而言，严紧条件定义为于在低于计算的Tm值5℃至10℃条件下，在0.9 M NaCl、0.09 M Tris-HClpH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP及每毫升0.2mg酵母RNA中，按照标准的Southem印迹法进行预杂交、杂交和杂交后洗涤，其中所说的Tm值是使用Bolton和McCarthy的计算方法(1962，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 48：1390)所计算的。
对于约15个核苷酸至约70个核苷酸长度的短探针，将载体材料在低于所计算的Tm值5℃至10℃条件下，在6X SSC加0.1％SDS中洗涤一次，15分钟，用6X SSC洗涤两次，每次15分钟。
本发明还涉及含有SEQ ID NOs：2、4、6、8、10或12中任一种的成熟部分，并且含有取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体。
变体多肽的氨基酸序列与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10或12中任一种的成熟部分的氨基酸序列的差别可以是插入或缺失一个或多个氨基酸残基和/或用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基。优选，氨基酸的变化是较少天然的，也就是保守性氨基酸取代，其不明显影响蛋白质的折叠和/或活性；小的缺失，一般是1至约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的蛋氨酸残基；最多约20-25个残基的小的连接肽；或者通过改变净电荷或其他功能有助于纯化的小的延伸，如多组氨酸区(poly-histidinetract)，抗原表位或结合域。
保守性取代的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨酸基(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。因此，例如，本发明涉及具有或含有SEQ ID NOs：2、4、6、8、10或12中任一种所列序列或其活性片段的多肽，其中保守性氨基酸取代包括在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)中、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)中、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)中、疏水氨基酸(丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)中、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)中和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)中或其任意组合中的置换，一个置换另一个。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代在本领域是已知的并且由，例如，H.Neurath和R.L.Hill，1979，在，The Proteins，Academic Press，New York中有所描述。最常发生的交换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反过来。
本发明的多肽可以是细菌或真菌多肽。真菌多肽可以来源于丝状真菌或来源于酵母。
在具体的实施方案中，本发明的多肽是i)细菌蛋白酶；ii)放线菌门的蛋白酶；iii)放线菌纲的；iv)放线菌目的；v)拟诺卡氏菌科的；vi)拟诺卡氏菌属的；和/或来源于vii)拟诺卡氏菌属菌种的蛋白酶，所述拟诺卡氏菌属菌种诸如Nocardiopsis alba，嗜碱拟诺卡氏菌，Nocardiopsis antarctica，Nocardiopsis prasina，Nocardiopsis composta，Nocardiopsis exhalans，嗜盐拟诺卡氏菌(Nocardiopsis halophila)，Nocardiopsis halotolerans，Nocardiopsiskunsanensis，李氏拟诺卡氏菌(Nocardiopsis listeri)，卢森坦类诺卡氏菌，Nocardiopsis metallicus，Nocardiopsis synnemataformans，Nocardiopsistrehalosi，Nocardiopsis tropica，Nocardiopsis umidischolae，Nocardiopsisxinjiangensis或达松维尔拟诺卡氏菌，例如来源于达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235，Nocardiopsis prasina DSM 15649，Nocardiopsisprasina(以前是alba)DSM 14010，拟诺卡氏菌属的菌种DSM 16424，嗜碱拟诺卡氏菌DSM 44657中的任一种，或者来源于卢森坦类诺卡氏菌DSM 44048。
在具体的实施方案中，蛋白酶得自于Nocardiopsis alba，嗜碱拟诺卡氏菌，达松维尔拟诺卡氏菌，卢森坦类诺卡氏菌，Nocardiopsis prasina或拟诺卡氏菌属菌种。
上述的分类法是根据章节：The road map to the Manual，G.M.Garrity & J.G.Holt in Bergey′s Manual of Systematic Bacterio1ogy，2001，第二版，volume l，David R.Bone，Richard W.Castenholz。
应当理解的是，对于前述的菌种，本发明包括完全阶段和不完全阶段(perfect and imperfect state)，和其他分类法的等同物，例如无性型(anamorphs)，与它们已知的菌种名称无关。本领域技术人员将容易识别适当等同物的同一性。
公众可以很容易在几个培养物保藏中心得到这些菌种的菌株，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sarumiung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSM)、霉菌培养物中心局(Centraalbureau VoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心(AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。
此外，这种多肽也可以使用上述的探针，从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥(composts)、水等)分离的微生物中鉴定并且获得。从自然的生活环境分离微生物的技术是本领域公知的。然后，可以类似地通过筛选另一个微生物的基因组或cDNA文库来得到核酸序列。一旦用探针检测到编码多肽的核酸序列，就可以利用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该序列(参见，例如，Sambrook等，1989，如上)。
本文中定义的″分离的″多肽是基本上不含其他非蛋白酶多肽的多肽，例如通过SDS-PASE测定，至少约20％纯度，优选至少约40％纯度，更优选约60％纯度，还更优选约80％纯度，最优选约90％纯度，甚至最优选约95％纯度的多肽。
本发明的核酸序列编码的多肽还包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中将另一个多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合多肽通过将编码另一个多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)融合来产生。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括将编码多肽的编码序列连接(ligating)，以使它们位于框中并且使融合多肽的表达处于相同启动子和终止子的控制之下。
在具体的实施方案中，本发明的多肽是酸稳定的。本发明中，术语酸稳定的指在pH2.0、pH2.5或pH3.0及37℃保温2小时后的残留活性，与pH9.0及5℃保温2小时后的相应样品的残留活性相比为至少50％。在具体实施方案中，残余活性为至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％或至少90％。一种测定酸稳定性的适宜的测试方法是实施例2的pH-稳定性测试。
在另一个具体的实施方案中，本发明的多肽是碱稳定的。本发明中，术语碱稳定的是指在pH12.0及37℃保温2小时后的残留活性，与pH9.0及5℃保温2小时后的相应样品的残留活性相比为至少85％。在具体的实施方案中，残留活性为至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，或至少92％。一种测定碱稳定性的适宜的测试方法是实施例4的pH-稳定性测试。
在其他具体的实施方案中，本发明的和根据本发明用途的多肽具有i)在15℃和pH9，至少0.02、0.04、0.06、0.08、0.10或至少0.11的相对活性；ii)在25℃和pH9，至少0.05、0.10、0.15或至少0.17的相对活性；和/或iii)在37℃和pH9，至少0.05、0.10、0.15、0.20、0.25或至少0.30的相对活性。使用实施例4的温度分布试验进行这些测定。
在其他具体实施方案中，本发明的多肽具有如通过DSC测定的至少76.6℃，或至少77、78或至少78.2℃的Tm。Tm在pH7.0下测定，如实施例7中所述。
在一个附加的具体实施方案中，本发明的蛋白酶于pH7.5和25℃对于血红蛋白显示的比活性为至少38.4AU/g。比活性可以如实施例5所述测定。本发明的蛋白酶可以显示至少39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、49.8或至少50AU/g的比活性。
在另外一个具体的实施方案中，本发明的蛋白酶能够将单胃体外消化模型中的玉米/大豆粉(soybean meal)膳食(SBM∶玉米＝2∶3(w/w))的可消化蛋白的水平与空白相比提高至少13％。该模型包括胃消化步骤(1.0小时，在pH3.0和40℃)和随后的肠消化步骤(4.5小时，在pH6.8和40℃)。该模型还包括添加胃蛋白酶(3000U/g，在胃消化步骤中)和胰酶(8mg/g，在肠消化步骤中)。蛋白酶剂量是100mg蛋白酶酶蛋白(EP)每kg膳食。实施例8中描述了合适的模型。提高的水平可以为至少14％、15％或至少16％。
在本发明的其他具体实施方案中，本发明不包括来自(i)达松维尔拟诺卡氏菌NRRL 18133的蛋白酶，其公开于WO 88/03947；(ii)拟诺卡氏菌属的菌株OPC-210(FERM P-10508)的蛋白酶，其公开于JP 2-255081-A；和/或(iii)得自达松维尔拟诺卡氏菌菌种的菌株ZIMET 43647的蛋白酶，其公开于DD200432|8。
核酸序列
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的核酸序列。本发明的具体的核酸序列是(i)SEQ ID NO：1的1-1143、1-87、88-567和568-1143位核苷酸；(ii)SEQ ID NO：3的1-1149、1-87、88-573和574-1149位核苷酸；(iii)SEQ ID NO：5的1-1149、1-87、88-573和574-1149位核苷酸；(iv)SEQ ID NO：7的1-1152、1-87、88-585和586-1152位核苷酸；(v) SEQ ID NO：9的1-1149、1-87、88-585和586-1149位核苷酸；和(vi)SEQ ID NO：11的1-1152、1-87、88-585和586-1152位核苷酸；及(vii)它们的任何组合。
特别优选的核苷酸是(i)SEQ ID NO：1的568-1143位核苷酸；(ii)SEQ IDNO：3的574-1149位核苷酸；(iii)SEQ ID NO：5的574-1149位核苷酸；(iv)SEQ ID NO：7的586-1152位核苷酸；(v)SEQ ID NO：9的586-1149位核苷酸；和(vi)SEQ ID NO：11的586-1152位核苷酸；对应于成熟多肽编码部分或区域。
本发明还包括编码具有SEQ ID NOs：2、4、6、8、1 0或12中任一种的成熟部分的多肽的核酸序列，其由于遗传密码的简并性分别与SEQ ID NOs：1、3、5、7、9和11相应部分有所区别。本发明还涉及SEQ ID NOs：1、3、5、7、9和11中任一种的亚序列，其分别编码SEQ ID NOs：2、4、6、8、10或12的片段并且具有蛋白酶活性。
SEQ ID NOs：1、3、5、7、9和11中任一种的亚序列是包括在SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11中的核酸序列，只是5′和/或3′端缺失一个或多个核苷酸。优选，亚序列含有至少100、125、150、175、200或至少225个核苷酸，更优选至少300个核苷酸，还更优选至少325、350、375、400、425、450、475、500、525、550或至少560个核苷酸。
本发明还涉及与SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11中任一种的成熟肽编码部分具有至少77.7％，优选至少78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的同一性程度的核苷酸序列。
为测定核苷酸同一性的程度，使用如上所述的″对比″程序。
本发明还涉及在上述(i)-(vi)所列的任一核苷酸、优选其成熟肽编码部分中包含至少一个突变的突变核酸序列，其中突变核酸序列编码的多肽(i)由SEQ ID NOs：2、4、6、8、10或12中任一种的氨基酸序列，优选其成熟肽部分组成，或(ii)是(i)中任一序列的变体，其中变体包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸，或(iii)是(i)中任一序列的等位变体，或(iv)是(i)中任一序列的片段。
用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域已知的，并且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可以从这种基因组中实现本发明的核酸序列的克隆，例如通过使用公知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆的DNA片段。参见，例如Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其他的核酸扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription)(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。可以从拟诺卡氏菌属的菌株或另外的或相关的生物中克隆该核酸序列，并且由此可为，例如，核酸序列的多肽编码区的等位或物种变体。
本文所用的术语″分离的核酸序列″是指基本上不含其他核酸序列的核酸序列，例如通过琼脂糖凝胶电泳测定的至少约20％纯度，优选至少约40％纯度，更优选至少约60％纯度，还更优选至少约80％纯度，最优选至少约90％纯度的核酸序列。例如，分离的核酸序列可以通过基因工程中使用的标准克隆方法来获得，所说的基因工程用于将核酸序列从其天然位置重新定位于其将要被复制的不同的位置。这种克隆方法可能涉及将包含编码多肽的核酸序列的所需核酸片段切除并分离，将此片段插入载体分子，并且将重组载体掺入宿主细胞中，核酸序列的多个拷贝或克隆在其中将得到复制。核酸序列可以是基因组，cDNA，RNA，半合成的，合成来源的，或其任何的组合。
编码本发明的多肽的核酸序列的修饰，对于合成与所述多肽基本类似的多肽可为必要的。术语与所述多肽″基本类似″是指非天然存在形式的多肽。这些多肽在某些工程改造方面可能与从其天然来源分离的多肽不同，例如，在比活性、热稳定性、最适pH、变应原性等等有所差异的变体。可以是在核酸序列的基础上构建变体序列，其中所说的核酸序列作为SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11中任一种的多肽编码部分或成熟肽编码部分存在，例如其亚序列，和/或通过引入核苷酸取代来构建，所说的核苷酸取代不产生核酸序列所编码的多肽的其他氨基酸序列，但其对应于意欲生产蛋白酶的宿主生物的密码子使用，或者通过引入可产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。关于核苷酸取代的总体性说明，参见，例如，Ford等，1991，Protein Expression andPurincation 2：95-107。例如，可以如上所述制备低变应原性多肽。
对本领域熟练技术人员来说是显而易见的是，这种取代可以在对分子功能至关重要的区域之外进行，并且仍然产生具有活性的多肽。可以按照本领域已知的方法，例如定点突变或丙氨酸扫描突变(参见，例如Cunningham andWells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定氨基酸残基，所述氨基酸残基对于由本发明的分离的核酸序列所编码的多肽的活性来说是必要的，并且因此优选没有进行取代。在后一种技术中，将突变引入分子中的每一个带正电的残基中，测试所得突变分子的蛋白酶活性，以鉴定对于分子活性至关重要的氨基酸残基。也可以分析通过以诸如核磁共振分析、结晶学或光亲合标记(参见，例如，de Vos等，192，Science 255：306-312：Smith等，1992 Journalof Molecular Biology 224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)的技术所测定的三维结构，来测定底物-蛋白酶反应的位点。
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的核酸序列，其在非常低的严紧条件，优选低严紧条件，更优选中等严紧条件，更优选中-高严紧条件，还更优选高严紧条件，最优选非常高的严紧条件下，与核酸探针杂交，其中所说的核酸探针在相同条件下与SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11中任一种的核酸序列，优选其成熟肽编码部分，或互补链杂交；或如本文所定义的其等位变体或其亚序列(Sambrook等，1989，如上)。
本发明还涉及分离的核酸序列，其通过(a)在非常低、低、中等、中-高、高、非常高的严紧条件下将DNA与上述(i)-(vi)所提及的任一核苷酸，优选其成熟肽编码部分，或其亚序列或互补链杂交；和(b)分离该核酸序列来产生。
产生突变核酸序列的方法
本发明还涉及产生突变核酸序列的方法，包括将至少一个突变引入SEQID NOs：1、3、5、7、9或11中任一种的成熟多肽编码部分，或其亚序列，其中突变核酸序列分别编码由SEQ ID NOs：2、4、6、8、10和12的成熟肽或其具有蛋白酶活性的片段组成的多肽。
向核酸序列中引入突变，以便将核苷酸交换另一个核苷酸，可以通过定点突变使用本领域已知的任一种方法来完成。特别有用的是利用具有目标插入物的超螺旋、双链DNA载体和含有所需突变的两个合成引物的方法。与载体的相反链各自互补的寡核苷酸引物，在温度循环期间借助Pfu DNA聚合酶延伸。一旦掺入引物，便产生包含交错切口(nick)的突变质粒。温度循环之后，用对于甲基化和半甲基化DNA特异性的DpnI处理产物，以消化亲本DNA模板并且选择包含突变的合成DNA。也可以使用本领域已知的其他方法。
核酸构建体
本发明还涉及含有与一个或多个控制序列可操作性相连的本发明核酸序列的核酸构建体，其中所说的控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适当的宿主细胞中表达。表达应理解为包括生产多肽时所涉及的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
本文中的″核酸构建体″定义为单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离，或者是经过修饰，以包含以自然界不存在的其它方式组合和并列的核酸的区段。当核酸构建体包含表达本发明的编码序列所需要的所有控制序列时，术语核酸构建体与术语表达盒是同义的。本文中术语″编码序列″定义为直接说明其蛋白质产物的氨基酸序列的核酸序列。编码序列的界限通常通过位于mRNA 5′端的开放阅读框正上游的核糖体结合位点(原核生物)或ATG起始密码子(真核生物)，及位于mRNA 3′端的开放阅读框正下游的转录终止子序列来确定。编码序列可以包括但不限于DNA、cDNA、以及重组核酸序列。
编码本发明多肽的分离的核酸序列可以按各种各样的方式来操纵，以提供多肽的表达。将核酸序列插入载体之前操纵核酸序列是合意的或是必要的，取决于表达载体。利用重组DNA方法对核酸序列进行修饰的技术是本领域所公知的。
本文中的术语″控制序列″定义为包括表达本发明多肽所必需的或有利的所有组分。每个控制序列对于编码多肽的核酸序列来说可以是天然的或者是外源的。这种控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列最少包括启动子及转录和翻译终止信号。控制序列可与接头一起提供，目的是为了引入特定限制性位点，有助于控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接。本文中，术语″可操作性相连″定义为一种构型，在这种构型中，控制序列被适当地放置在与DNA序列的编码序列相关的位置，以使控制序列指导多肽的表达。
控制序列可以是合适的启动子序列，其为由宿主细胞识别用来表达所述核酸序列的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变、截短和杂合的启动子，并可以由编码胞外或胞内多肽的基因获得，其中所说的基因与宿主细胞同源或异源。
指导本发明核酸构建体转录、特别是在细菌宿主细胞中转录的适宜的启动子的实例为获得自下述的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因以及原核生物β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：3727-3731)的启动子，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。其他启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″in ScientificAmerican，1980，242：74-94中；及在Sambrook等，1989，同上中描述。
指导本发明核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的适宜的启动子的实例为：从米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶和尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶的基因中获得的启动子(WO 96/00787)，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶与米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂合体)，及其突变、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因中获得。其他有用的酵母宿主细胞启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。
控制序列也可以是适宜的转录终止子序列，其为由宿主细胞所识别来终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列3′末端可操作性相连。任何在所选择的宿主细胞中发挥功能的终止子均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因中获得。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因中获得。其他用于酵母宿主细胞的有用终止子由Romanos等，1992，同上描述。
用于细菌宿主细胞例如芽孢杆菌的优选的终止子为来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽胞杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)或解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的终止子。
控制序列还可以是适宜的前导序列，其是mRNA的非翻译区，对宿主细胞的翻译是重要的。前导序列与编码多肽的核酸序列5′末端可操作性相连。任何在所选择的宿主细胞中发挥功能的前导序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因中获得。
用于酵母宿主细胞的适宜的前导序列从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因中获得。
控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，其为与核酸序列的3’末端可操作性相连的序列，当转录时，其作为向转录的mRNA添加多聚腺苷残基的信号由宿主细胞所识别。任何在所选择的宿主细胞中发挥功能的聚腺苷酸化序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列从米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因中获得。
用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列在Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990中有所描述。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码连接于多肽氨基末端的氨基酸序列，并且指导所编码的多肽进入细胞分泌途径。核酸序列的编码序列5′端可以固有地包含信号肽编码区，该信号肽编码区在翻译阅读框中天然地与编码分泌多肽的编码区片段相连。或者，编码区的5′端可以包含对编码序列来说为外源的信号肽编码区。编码序列不天然地包括信号肽编码区时，就需要外源的信号肽编码区。或者，外源信号肽编码区可以简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，引导表达的多肽进入所选择的宿主细胞分泌途径的任何信号肽编码区均可用于本发明。
用于细菌宿主细胞的有效的信号肽编码区是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽胞杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽胞杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因中获得的信号肽编码区。Simonen和Palva，1993，1993，Microbiological Reviews 57：109-137中描述了更多的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因中获得的信号肽编码区。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因中获得。其他的有用信号肽编码区由Romanos等，1992，同上描述。
控制序列还可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得的多肽称为前体酶(proenzyme)或前体多肽(propolypeptide)(有些情况中称为酶原)。前体多肽通常是无活性的并且可以由前体多肽通过前肽催化或自体催化裂解转变为成熟的活性多肽。前肽编码区可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)的基因中获得。
在一个优选的实施方案中，信号肽编码区是SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11中任一种的信号肽编码区。
在另一个优选的实施方案中，前肽编码区是SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11中任一种的前肽编码区。
当信号肽和前肽区两者都存在于多肽的氨基端时，前肽区位于多肽的氨基末端之后，而信号肽区位于前肽区的氨基末端之后。
添加允许相对于宿主细胞生长来调控多肽表达的调控序列也是合意的。调控系统的实例为，可引起基因的表达因响应化学或物理刺激，包括调控化合物的存在，而开启或关闭的那些调控系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡萄糖淀粉酶启动子和米曲霉葡萄糖淀粉酶启动子作为调控序列。调控序列的其他实例为允许基因扩增的那些调控序列。在真核系统中，其包括存在氨甲蝶呤(methotrexate)时扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及以重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核酸序列将与调控序列可操作性相连。
表达载体
本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。上述的各种核酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或多个方便的限制性位点，以允许在这些位点上插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包括该序列的核酸构建体插入用于表达的合适载体来表达本发明的核酸序列。在构建表达载体时，将编码序列置于载体中，以将编码序列与适当的表达控制序列可操作性相连。
重组表达载体可以是能够方便进行重组DNA方法并且可以导致核酸序列表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。通常，载体的选择取决于载体与其将要被导入的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的质粒或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外的实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如，质粒、染色体外成分、微小染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有确保自我复制的任何方式(means)。或者，载体可以是这样的一个载体，当其被导入宿主细胞中时，其整合到基因组中并且与其所整合的染色体(s)一起复制。另外，也可以使用同时包含将要导入宿主细胞基因组的总DNA的单一载体或质粒，或者两个或多个载体或质粒，或者可以使用转座子。
本发明的载体优选包含一个或多个可选择标记，其允许很容易地选择转化的细胞。可选择标记为基因，其产物可提供生物杀虫剂(biocide)或病毒抗性，对重金属的抗性、原养型变为营养缺陷型等等。细菌的可选择标记的实例为来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或可赋予抗生素抗性诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的适宜标记为ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(草铵膦乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶(sulfateadenyltransferase))、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，及其等同物。优选用于曲霉菌细胞的为构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选包含允许载体稳定整合于宿主细胞基因组或者允许载体在细胞中不依赖于基因组而自主复制的一个或多个元件。
为了整合于宿主细胞基因组，载体可能依赖于编码多肽的核酸序列，或者其他任何用于通过同源和不同源重组将载体稳定地整合于基因组的载体元件。或者，载体可以包含通过同源重组指导向宿主细胞基因组整合的附加的核酸序列。附加的核酸序列使载体能够整合于宿主细胞基因组一个或多个染色体中一个或多个精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应当优选包含足够数量的核酸，例如100至1,500个碱基对，优选400至1,500个碱基对，最优选800至1,500个碱基对，这些碱基对与相应的目标序列高度同源，以增加同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的目标序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非编码或编码核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合至宿主细胞基因组。
为了自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所述的宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例为允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322，pUC19，pACYC177和pACYC184，及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110，pE194，pTA1060和pAMβ1的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点的实例为2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1与CEN3的组合及ARS4与CEN6的组合。复制起点可以是具有突变的复制起点，该突变使其在宿主细胞中发挥温度敏感性功能(参见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 75：1433)。
可以将超过一个拷贝的本发明的核酸序列插入宿主细胞中，以增加基因产物的生产。可以通过将至少一个附加拷贝的序列整合于宿主细胞基因组中，或者通过在包含扩增的可选择标记基因拷贝的细胞中，使核酸序列包含可扩增的可选择标记基因，并因此可以在存在适当的可选择试剂的情况下，通过培养细胞来选择附加拷贝的核酸序列，以得到核酸序列拷贝数的增加。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员所熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，如上)。
还可以将蛋白酶与至少一种其他用于动物饲料的目标酶共表达，例如淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶；磷脂酶和/或β-葡聚糖酶。
酶可以从不同载体、从一个载体中表达或使用两种技术的混合技术来共表达。当使用不同的载体时，载体可以具有不同的可选择标记及不同的复制起点。当只使用一个载体时，可以从一个或多个启动子表达基因。如果在一个启动子(二或多顺反子)的调控下克隆，所克隆的基因的顺序可能影响蛋白质的表达水平。蛋白酶也可以作为融合蛋白表达，即，在读码框中，编码蛋白酶的基因融合于编码另一蛋白的基因。该蛋白可能是另一种酶或另一种酶的功能区。
宿主细胞
本发明还涉及包含本发明核酸序列的重组宿主细胞，其有利地用于多肽的重组生产。将包含本发明核酸序列的载体导入宿主细胞，以使载体保持为染色体整合体或作为前述的自我复制的染色体外载体。术语″宿主细胞″包含因复制过程中发生突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如，原核生物，或者是非单核微生物，例如，真核生物。
有用的单细胞是细菌细胞，如革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，或链霉菌属(Streptomyces)细胞，或乳酸细菌的细胞；或者为革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌属(Pseudomonas)的菌种。乳酸细菌包括但不限于乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)的菌种。
可以通过例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneral Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizin，1961，Joumal of Bacteriology 81：823-829，或者Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Joumal of Molecular Biology 56：209-221)，电穿孔法(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)，接合法(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal ofBacteriology 169：5771-5278)将载体导入细菌宿主细胞。
宿主细胞可以是真核细胞，例如非人动物细胞，昆虫细胞、植物细胞或者真菌细胞。
在一个具体的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。本文所用的″真菌″包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等在Ainsworth and Bisby′sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如在Hawksworth等，1995，同上第171页所提及的)和所有的有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同上)。
在另一个具体实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。本文中所用的″酵母″包括产子囊孢子酵母(ascosporogenous)(酵母目(Endomycetales))、产担子孢子(basidiosporogenous)酵母和属于不完全菌纲(Fungi Imperfecti)(酵母菌(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类将来可能会有所变化，因此本发明中，酵母应当按照Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.，编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所描述进行定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)，克鲁维酵母(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、糖酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或者西洋蓍霉(Yarrowia)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。″丝状真菌″包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等，1995，同上，所定义的)。丝状真菌以由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖，甘露聚糖、以及其他复合多糖组成的菌丝体壁为特征。营养生长依靠菌丝的延长并且碳的分解代谢是专性需氧的。相反，诸如酿酒酵母的酵母的营养生长是通过单细胞叶状体(thallus)的芽殖(budding)，并且碳的分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞的实例是但不限于枝顶孢霉属(Acremonium)，曲霉属(Aspergillus)，镰孢属(Fusarium)，腐质霉属(Humicola)，毛霉属(Mucor)，毁丝霉属(Myceliophthora)，脉孢菌属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，梭孢壳属(Thielavia)，Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)菌种的细胞。
真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本领域已知的方式转化。EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述了转化曲霉属宿主细胞的适宜方法。Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787中描述了转化镰孢属菌种的适宜方法。可以使用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编者，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920中描述的方法转化酵母。
生产方法
本发明还涉及本发明的多肽的生产方法，包括(a)培养菌株，该菌株的野生型能够生产多肽，以产生含有多肽的上清液；并且(b)回收多肽。在一个优选的实施方案中，菌株是放线菌门、优选放线菌纲、更优选放线菌目，还更优选是拟诺卡氏菌科，并且最优选是拟诺卡氏菌属的菌株，例如任何拟诺卡氏菌属的菌种，例如前面所列的具体菌株。
本发明还涉及本发明的多肽的生产方法，包括(a)在有利于产生多肽的条件下培养宿主细胞；并且(b)回收多肽。
本发明还涉及本发明的多肽的生产方法，包括(a)在有利于产生多肽的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞含有突变核酸序列，该突变核酸序列在SEQID NOs：1、3、5、7、9或11中任一种的成熟肽编码部分中包含至少一个突变，其中突变核酸序列编码多肽，该多肽(i)分别由SEQ ID NOs：2、4、6、8、10或12中任一种的成熟肽组成；或(ii)是(i)的任一序列的变体，其中变体包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸，或(iii)是(i)的任一序列的等位变体，或(iv)是(i)的任一序列的片段。
在本发明的生产方法中，将细胞在适宜用本领域已知方法生产多肽的营养培养基中培养。例如，可以在实验室或者工业发酵罐中，在适宜的培养基中并且在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、补料-分批的、或者固态发酵)来培养细胞。在包含碳源和氮源以及无机盐的适宜营养培养基中以本领域已知的方法进行培养。合适的培养基可以从供应商处获得，或者可以根据公布的组合物(例如，美国典型培养物保藏中心目录中的)制备。如果多肽分泌到营养培养基中，则可以直接从培养基回收多肽。如果多肽没有分泌，则其可以从细胞裂解物中回收。
可以使用本领域已知的专门用于所述多肽的方法来检测多肽。这些检测方法可包括使用特异性抗体、形成蛋白酶产物、或者蛋白酶底物的消失。例如，可如本文所述使用蛋白酶测试来测定多肽的活性。
所得的多肽可以用本领域已知的方法回收。例如，可以通过传统的方法，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀从营养培养基中回收多肽。
本发明的多肽可以用本领域已知的方法来纯化，包括但不限于层析(例如，离子交换层析、亲合层析、疏水层析、色谱聚焦层析，大小排阻层析)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦电泳)，差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或者提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和LarsRyden，编者，VCH Publishers，New York，1989)。
植物
本发明还涉及转基因植物、植物部分或者植物细胞，其是用编码本发明具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列所转化的，以表达和产生可回收量的多肽。多肽可以从植物或植物部分中回收。或者，就此使用包含重组多肽的植物或植物部分用于改善食物或饲料的质量，例如，提高营养价值、改善适口性和流变性质，或者用于破坏抗营养因子。
在一个具体的实施方案中，将所述多肽定位于种子的胚乳存储液泡中。这可以通过用适当的信号肽将其合成为前体来获得，参见Horvath等，PNAS，Feb.15，2000，vol.97，no.4，p.1914-1919。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或者单子叶的(单子叶植物)或其工程改造的变体。单子叶植物的实例为禾草，例如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，蓝草(Poa))，饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)，寒地型牧草(temperate grass)，如剪股颖属(Agrostis)和谷类，例如小麦、燕麦，黑麦，大麦、水稻、高粱、黑小麦(小麦(Triticum)和黑麦(Secale)的稳定化杂种)及玉米。双子叶植物的实例是烟草，豆科植物，例如向日葵(Helianthus)，棉花(Gossypium)，羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖用甜菜、豌豆、菜豆(bean)和大豆(soybean)及十字花科植物，例如花椰菜、油菜籽以及非常相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。例如，美国专利5,689,054和美国专利6,111,168中描述的低肌醇六磷酸植物为工程改造的植物的实例。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎，以及包含这些部分的单独的组织，例如表皮、叶肉，薄壁组织、维管组织、分生组织。特定的植物细胞区室例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也被认为是植物部分。另外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样，植物部分例如为方便本发明利用而分离的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如，胚、胚乳、糊粉和种皮。
这些植物、植物部分和植物细胞的后代也包括在本发明的范围之内。
可以按照本领域已知的方法构建表达本发明的多肽的转基因植物或植物细胞。简单地说，将一个或多个编码本发明多肽的表达构建体整合至植物宿主基因组，并且将所得的修饰的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞，以此来构建植物或植物细胞。
方便地，所述表达构建体为核酸构建体，其包含与适当的调控序列可操作性相连的编码本发明多肽的核酸序列，其中所说的调控序列是在所选植物或植物部分中表达核酸序列所需要的。另外，表达构建体可以包含可选择标记，该标记用于鉴定其中已整合了表达构建体的宿主细胞，和将所述构建体导入所述植物所必需的DNA序列(后者依赖于所使用的DNA导入方法)。
调控序列的选择，例如启动子和终止子序列和可选的信号或转运序列的选择，例如，以需要何时、何地及如何表达多肽为基础来确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型或诱导型，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以定向至特定的细胞区室、组织或植物部分例如种子或叶子。调控序列，例如，在Tague等，1988，Plant Physiology 86：506有所描述。
对于组成型表达，可以使用以下的启动子：35S-CaMV启动子(Frantk等，1980，Cell 21：285-294)，玉米泛素(maize ubiqutin)1(Christensen AH，SharrockRA和Quail 1992.Maize polyubiquitin genes：structure，thermal perturbation ofexpression and transcript splicing，and promoter activity following transfertoprotoplasts by electroporation)，或者稻肌动蛋白(rice actin)1启动子(Plant Mo.Biol.18，675-689.；Zhang W，Mc Elroy D.和Wu R 1991，Analysis of rice Actl5′region activity in transgenic rice plants.Plant Cell 3，1155-1165)。器官特异性启动子可以是，例如，来自贮藏汇集组织(storage sink tissue)如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或者来自代谢汇集组织如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异的启动子，如来自水稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白和白蛋白的启动子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆(vicia faba)启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39：935-941)，来自Brassica napus的贮藏蛋白napA启动子，或者本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如WO 91/14772所描述的。另外，启动子可以是叶特异性启动子，例如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology102：991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra and Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或者水稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或者创伤诱导的启动子，例如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样，启动子可以是能够由非生物处理如温度、干旱、盐度改变所诱导的，或者是能够由激活启动子的外源施加的物质如乙醇、雌激素、植物激素像乙烯、脱落酸、赤霉酸和/或重金属所诱导的。
也可以使用启动子增强子元件，以便在植物中获得更高的蛋白酶表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子和编码本发明多肽的核苷序列之间的内含子。例如，Xu等，1993，如上公开了稻肌动蛋白1基因的第一个内含子用于增强表达的用途。
更进一步，可对于所述的植物物种优化密码子选择，以改善表达(参见，上文引用的Horvath等)。
可选择标记基因和表达构建体的任何其他部分可选自本领域中可获得的那些。
根据本领域已知的常规技术将核酸构建体整合至植物基因组，所述的常规技术包括土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪法转化、和电穿孔(Gasser等，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature 338：274)。
目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)-介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物的优选方法(其综述，参见Hooykas and Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，其也可以用于转化单子叶植物，尽管其他的转化方法对于这些植物来说是更常用的。目前，补充根癌土壤杆菌方法用于产生转基因单子叶植物的优选方法是对胚胎愈伤组织或发育中的胚胎进行粒子轰击(用转化DNA包覆的微小的金或钨粒子)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。用于单子叶植物转化的另一种可替代的方法基于Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology21：415-428中所述的原生质体转化。
转化之后，根据本领域公知的方法选择其中具有整合的表达构建体的转化体，并且使其再生为完整的植物。通常，设计转化方法，通过使用例如用两个单独的T-DNA构建体共转化或者通过特异性重组酶进行选择基因的位点特异性切除以在再生期间或下一代中选择性消除选择基因。
本发明还涉及生产本发明的多肽的方法，包括(a)在有利于产生多肽的条件下，培养转基因植物或植物细胞，其中所说的转基因植物或植物细胞含有编码本发明的具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列；并且(b)回收多肽。
动物
本发明还涉及转基因非人动物及其产品或部分，其实例是体液，如奶和血液、器官、肉、以及动物细胞。例如在哺乳动物细胞中表达蛋白质的技术是本领域已知的，参见，例如，the handbook Protein Expression：A PracticalApproach，Higgins和Hames(编)，Oxford University Press(1999)，以及涉及基因转录、RNA加工、翻译后加工的该系列中的三本其他手册。通常来讲，为制备转基因动物，用编码本发明的具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列转化所选动物的选定细胞，以表达和产生多肽。可以从动物例如雌性动物的奶中回收多肽，或者可表达多肽以对动物自身有利，例如帮助动物消化。动物的实例在下面标题为动物饲料的部分将会提到。
为了生产转基因动物从而从动物的奶中回收蛋白酶，可以将编码蛋白酶的基因插入所述动物的受精卵，例如通过使用含有适当的奶蛋白启动子和编码蛋白酶的基因的转基因表达载体来实现。将转基因表达载体显微注射到受精卵，并优选永久整合至染色体。一旦卵开始生长分裂，就将潜在的胚胎植入代孕母亲，并鉴定携带有转化基因的动物。然后可以通过传统的饲养方法繁殖所得的动物。可以从动物的奶中纯化多肽，参见，例如Meade，H.M.等(1999)：Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals，Gene expression systems：Using nature for the art of expression，J，M.Fernandez和J.P.Hoeffler(编)，Academic Press。
在可选方案中，为产生在其体细胞和/或生殖细胞的基因组中携带包括异源转基因构建体的核酸序列的转基因非人动物，其中所说的转基因构建体包括编码蛋白酶的转基因，可以如WO 2000064247所公开的，将该转基因与用于蛋白酶唾液腺特异性表达的第一个调控序列可操作性相连。
组合物
在又一个方面，本发明涉及含有本发明的多肽的组合物。
多肽组合物可以按照本领域已知的方法来制备，而且多肽组合物可以是液体或干燥组合物的形式。例如，多肽组合物可以是颗粒或微颗粒的形式。可以按照本领域已知的方法使将要包含在该组合物中的多肽稳定化。
下面将给出本发明的多肽或多肽组合物的优选用途的实例。
动物饲料
本发明还涉及在动物饲料中使用具有蛋白酶活性的多肽的方法，以及含有本发明多肽的饲料组合物和饲料添加剂。
术语动物包括所有的动物，包括人在内。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如绵羊、山羊、马、和牛，例如肉牛、母牛和小牛。在一个具体实施方案中，动物是非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如猪(pigs)或猪(swine)(包括但不限于猪仔、生长猪、和母猪)；家禽，例如火鸡、鸭、鸡(包括但不限于童子鸡、蛋鸡)；小牛；和鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲤鱼)；及甲壳动物(包括但不限于虾、对虾)。
术语饲料或饲料组合物意指适于或者希望动物摄入的任何化合物、制剂、混合物或组合物。
在本发明的用途中，可将蛋白酶在给动物饮食之前、之后或者与饮食同时饲喂动物。后者是优选的。
在一个具体的实施方案中，蛋白酶，以添加到饲料中的形式或当包含在饲料添加剂中时，是明确的。″明确的″是指如通过大小排阻层析所测定的(参见WO 01/58275的实施例12)，蛋白酶制剂的纯度为至少50％。在其他具体的实施方案中，通过此方法测定的蛋白酶制剂为至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％纯度的。
明确的蛋白酶制剂是有利的。例如，比较容易向饲料中添加正确剂量的蛋白酶而基本不受其他蛋白酶的干扰或污染。术语正确剂量具体是指获得一致或恒定结果的目的，和基于所需的效果而优化剂量的能力。
然而，用于动物饲料用途时，蛋白酶无需具有那样的纯度；例如它可以包括其他的酶，这种情况下其可以称为蛋白酶制剂。
蛋白酶制剂可以(a)直接添加到饲料中(或直接在蛋白质的处理过程中使用)，或者(b)可以用于生产一种或多种中间组合物，如饲料添加剂或者预混料，随后将其添加到饲料中(或在处理过程中使用)。上述的纯度指原始蛋白酶制剂的纯度，无论其是用于上述的(a)或是(b)中。
特别地，具有这种纯度数量级的蛋白酶制剂是可使用重组生产的方法获得的，而使用传统的发酵方法生产蛋白酶时，它们是不能够如此容易地获得的，并且有较高的批次与批次(barch-to-batch)的差异。
当然，可以将这种蛋白酶制剂可以与其他的酶混合。
在一个具体的实施方案中，用于本发明用途的蛋白酶能够按照本文实施例8的体外模型增溶蛋白质。
蛋白质可以是动物蛋白，例如肉和骨粉和/或鱼粉；或者可以是植物蛋白。
本文所用的术语植物蛋白是指包括得自或来源于植物的至少一种蛋白质的任何化合物、组合物、制剂或混合物，包括修饰的蛋白和蛋白质衍生物。在具体的实施方案中，植物蛋白的蛋白质含量为至少10，20，30，40，50或60％(w/w)。
植物蛋白可以得自植物蛋白源，例如豆类和谷类，例如来自豆科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)植物的原料，例如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。
在一个具体的实施方案中，植物蛋白源是一种或多种豆科植物的原料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或大豆。
在其他具体的实施方案中，植物蛋白源是一种或多种藜科植物的原料，例如甜菜、糖用甜菜、菠菜或奎奴亚藜(quinoa)。
植物蛋白源的其他实例是油菜籽、向日葵籽、棉花籽和甘蓝。
大豆是优选的植物蛋白源。
植物蛋白源的其他实例是谷类，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米(corn)、水稻、黑小麦和高梁。
根据本发明，用至少一种本发明的蛋白酶处理蛋白质，与空白相比可以使蛋白质的溶解增加。参考实施例8的体外模型，使用本发明的蛋白酶，可以获得至少101％，或102％、103％、104％、105％、106％或至少107％的增溶蛋白。术语蛋白质的增溶基本上是指使一种或多种蛋白质进入溶液。这种增溶可以归因于蛋白质从常见复合天然组合物如饲料的其他成分中释放，这种释放是由蛋白酶介导的。增溶可以作为可溶性蛋白对照没有蛋白酶处理的样品的增加量来测定(参见实施例8)。
根据本发明，用至少一种本发明的蛋白酶处理蛋白质，与空白相比可以增加蛋白质的可消化性。参考实施例8的体外模型，使用本发明的蛋白酶，可以获得至少101％，或102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％或至少116％的可消化蛋白。
在处理方法的一个具体实施方案中，所述一种或多种蛋白酶影响(或作用于、或发挥增溶作用影响于)蛋白质例如植物蛋白或蛋白源。为达到此，通常将蛋白质或蛋白源悬浮于溶剂中，例如含水溶剂如水，并且针对所述酶的特征，调整pH和温度值。例如，处理可以在实际蛋白酶的活性为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％，70％，80％或至少90％的pH值下进行。同样地，例如，处理可以在实际蛋白酶的活性为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％，70％，80％或至少90％的温度下进行。上述的百分数活性指标是相对于最大活性而言的。使酶反应持续至得到所需结果为止，此后可以通过将酶灭活，如通过热处理步骤来终止酶反应，也可不终止。
在本发明处理方法的另一个具体实施方案中，蛋白酶作用是持续的(sustained)，意指，例如，将蛋白酶添加至蛋白质中，但其增溶作用可以说没有开启，直至以后需要时，一旦建立了适宜的增溶条件，或者一旦任何酶抑制剂被失活，或者任何其他可能用于延迟酶作用的任何方式被取消。
在一个实施方案中，所述的处理是对动物饲料或动物饲料中使用的蛋白质的预处理，即在摄取前将蛋白质增溶。
术语改善动物饲料的营养价值意指改善蛋白质的可利用性，由此使蛋白质的提取增加，蛋白质的产量增高，和/或改善蛋白质的利用。因此，饲料的营养价值得到提高，动物的生长率和/或增重和/或饲料转化率(即，摄取的饲料重量与增重的对比)就会得到改善。
可以将蛋白酶以任何形式加入饲料中，其可以是相对纯的蛋白酶，或者是与欲加入动物饲料的其他成分一起的掺混物，例如，以饲料添加剂的形式，例如，所谓的动物饲料预混料。
另一方面，本发明涉及在动物饲料中使用的组合物，例如动物饲料和动物饲料添加剂，例如预混料。
除本发明的蛋白酶外，本发明的动物饲料添加剂还含有至少一种脂溶性维生素和/或至少一种水溶性维生素和/或至少一种痕量矿物质和/或至少一种常量(macro)矿物质。
此外，可选地，饲料添加剂成分是着色剂，例如，类胡萝卜素，如β-胡萝卜素、虾青素、叶黄素；芳香化合物；稳定剂；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸；活性氧生成物质和/或至少一种其他的酶，其中所说的酶选自：肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)；磷脂酶Al(EC3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，例如，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
在一个具体的实施方案中，这些其他酶是明确的(如上述针对蛋白酶制剂所定义的)。
抗微生物肽(AMP’s)的实例为CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、Protegrin-1、死亡肽(Thanstin)、防卫素(Defensin)、乳铁蛋白(Lactoferrin)、乳铁蛋白肽(Lactoferricin)和Ovispirin，诸如Novispirin(Robert Lehrer，2000)、Plectasins和抑制素类(Statins)，包括WO 03/044049和WO 03/048148中公开的化合物和多肽，以及保留抗微生物活性的上述肽的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP’s)的实例为WO 94/01459和WO 02/090384中所公开的巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉肽，以及其保留抗真菌活性的变体和片段。
多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚麻酸(gamma-linoleic acid)。
活性氧生成物质的实例是化学物质，例如过硼酸盐、过硫酸盐或者过碳酸盐；和酶，例如氧化酶、加氧酶或者合成酶(syntethase)。
常见脂溶性和水溶性维生素以及痕量矿物质形成欲往饲料中添加的所谓预混料的一部分，而常量矿物质通常单独添加到饲料中。这些组合物类型的任一种，当富含本发明的蛋白酶时，是本发明的动物饲料添加剂。
在一个具体的实施方案中，欲包含(或规定必需包含)在动物膳食或饲料中的本发明的动物饲料添加剂的水平为0.01至10.0％，更特别地在0.05至5.0％；或0.2至1.0％(％指g添加剂每100g饲料)。在预混料中尤其如此。
下面为这些成分的实例的非排他性列表：
脂溶性维生素的实例为维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。
水溶性维生素的实例为维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐(panthothenate)例如Ca-D-泛酸盐。
痕量矿物质的实例为锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。
常量矿物质的实例为钙、磷和钠。
这些成分的营养要求(以禽类和小猪/猪为例)列于WO 01/58275的表A中。营养要求是指这些成分应该以所指出的浓度在膳食中提供。
在一个选择方案中，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种WO01/58275的表A中所具体列出的单一成分。至少一种是指一种、或两种、或三种、或四种等等，直至所有13种，或者直至所有l5种单一成分中的任一种、一种或多种。更具体说，这种至少一种单一成分在本发明添加剂中的含量应当能够提供表A第四栏或第五栏或第六栏所示范围之内的饲料中浓度。
在又一个实施方案中，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种下列维生素，优选提供下面表1具体所示范围之内的饲料中浓度(分别对于小猪膳食和小鸡膳食)。
表1：典型维生素推荐
维生素 小猪膳食 小鸡膳食
维生素A 10,000-15,000IU/kg饲料 8-12,500IU/kg饲料
维生素D3 1800-2000IU/kg饲料 3000-5000IU/kg饲料
维生素E 60-100mg/kg饲料 150-240mg/kg饲料
维生素K3 2-4mg/kg饲料 2-4mg/kg饲料
维生素B1 2-4mg/kg饲料 2-3mg/kg饲料
维生素B2 6-10mg/kg饲料 7-9mg/kg饲料
维生素B6 4-8mg/kg饲料 3-6mg/kg饲料
维生素B12 0.03-0.05mg/kg饲料 0.015-0.04mg/kg饲料
烟酸(维生素B3) 30-50mg/kg饲料 50-80mg/kg饲料
泛酸 20-40mg/kg饲料 10-18mg/kg饲料
叶酸 1-2mg/kg饲料 1-2mg/kg饲料
生物素 0.15-0.4mg/kg饲料 0.15-0.3mg/kg饲料
氯化胆碱 200-400mg/kg饲料 300-600mg/kg饲料
本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或膳食具有相对高的蛋白质含量。家禽和猪的膳食可以如WO 01/58275表B第2-3栏所示来表征。鱼的膳食可以如表B第4栏所示来表征。此外，这种鱼的膳食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
WO 01/58275，对应于US 09/779334，其并入本文作为参考。
本发明的动物饲料组合物中具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且还包括至少一种本发明所要求的蛋白酶。
此外，或者可选地(对于上述指定的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量的含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的可利用磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在具体的实施方案中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量在WO 01/58275表B(R.2-5)中2、3、4或5中的任意一个范围之内。
粗蛋白计算为氮(N)乘以因数6.25，即，粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。氮含量通过Kjeldahl法(A.O.A.C.，1984，Official Methods of Analysis第14版，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)测定。
可代谢能量可以根据NRC publication Nutrient requirements in swine，第9修订版1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animal nutrition，board of agriculture，national research council.National Academy Press，Washington，D.C.，pp.2-6，和European Table of Energy Values for PoultryFeed-stuffs.Spelderholt centre for poultry research and extension，7361 DABeekbergen，The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5进行计算。
完全动物膳食中的钙、可利用磷和氨基酸的膳食含量可以根据饲料表，如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheiden voederwaarde van voedermiddelen；Central Veevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7进行计算。
在一个具体的实施方案中，本发明的动物饲料组合物中含有至少一种上述定义的植物蛋白。其也可以含有动物蛋白，例如肉和骨粉，和/或鱼粉，一般来说，其量为0-25％。
在其他具体的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有0-80％的玉米；和/或0-80％的高梁；和/或0-70％的小麦；和/或0-70％的大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-25％的鱼粉；和/或0-25％的肉和骨粉；和/或0-20％的乳清。
动物膳食可以制成例如糊状饲料(非粒状)或粒状饲料。一般，将磨碎的饲料-食料混和，并且按照对所述物质的说明，加入足够量的必需维生素和矿物质。酶可以作为固体或液体酶制剂加入。例如，固体酶制剂一般可以在混和步骤之前或混和过程中加入；而液体酶制剂一般是在制粒步骤之后加入。也可以将酶掺入饲料添加剂或者预混料中。
膳食中的最终酶浓度在0.01-200mg酶蛋白每kg膳食的范围内，例如在0.5-25mg酶蛋白每kg动物膳食的范围内。
当然，蛋白酶应当以有效量施用，即，足够改善饲料增溶性、可消化性和/或提高其营养价值的量。本发明包括以一个或多个下述的用量(剂量范围)施用酶：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或者0.10至10，所有这些范围均以mg蛋白酶蛋白每kg饲料(ppm)计。
为测定mg酶蛋白每kg饲料，将蛋白酶从饲料组合物中纯化，使用相关的测试(参见下面的蛋白酶活性，底物和测试)来测定纯化的蛋白酶的比活性。饲料组合物的蛋白酶活性也使用相同的测试方法如此测定，并且以这两个测定为基础，计算以mg酶蛋白每kg饲料计的剂量。
应用同样的方法测定饲料添加剂中的mg蛋白酶蛋白。当然，如果可以获得用于制备饲料添加剂或者饲料的蛋白酶样品，就由该样品测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化蛋白酶)。
洗涤剂组合物
本发明的蛋白酶可以添加到洗涤剂组合物中，由此成为洗涤剂组合物的组分。
本发明的洗涤剂组合物可以配制成例如手洗或机洗的洗涤剂组合物，其包含适于预处理污染织物的洗衣添加剂组合物和漂洗加入的织物软化剂组合物，或者可以配制成用于常规家用物品硬表面清洗操作的洗涤剂组合物，或者可以配制成用于手洗或机洗洗碗操作的洗涤剂组合物。
在一个具体的方面，本发明提供一种含有本发明蛋白酶的洗涤剂添加剂。洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物中可以包含一种或多种其他的酶，例如另一种蛋白酶，诸如源于芽孢杆菌的碱性蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或过氧化物酶。
通常，所选一种或多种酶的性质应当与选择的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶学和非酶学组分的相容性等)，并且所述一种或多种酶应当以有效量存在。
适宜的脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。包括化学修饰的或蛋白质工程突变体。有用的脂肪酶的例子包括来自腐质霉属(同义词Thermomyces)的脂肪酶，例如EP 258068和EP 305216所述来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)或者如WO 96/13580所述来自H.insolens，假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaiigenes)或者类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis (WO 96/12012)的脂肪酶，芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或者短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。其他的实例是例如WO 92/05249，WO 94/01541，EP 407225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO 95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO97/07202中描述的脂肪酶变体。优选的商业上可获得的脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novozymes A/S)。适宜的淀粉酶(α-和/或β-)包括细菌或真菌来源的淀粉酶。包括化学修饰的或者蛋白质工程突变体。淀粉酶包括，例如，由芽孢杆菌，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株获得的α-淀粉酶，GB 1,296,839中有其更为详细的描述。有用的淀粉酶的实例为WO94/02597，WO 94/18314，WO 95/26397，WO 96/23873，WO 97/43424，WO00/60060和WO 01/66712中描述的变体，特别是在下述一个或多个位置具有取代的变体：15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。商业上可获得的淀粉酶为NatalaseTM，SupramylTM，StainzymeTM，DuramylTM，TermamylTM，FungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)，RapidaseTM和PurastarTM(来自Genencor Intemational Inc.)。
适宜的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶。包括化学修饰的或者蛋白质工程突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US 5,776,757和WO 89/09259中公开的从Humicola insolens、嗜热毁丝霉和尖镰孢生产的真菌纤维素酶。特别适宜的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这种纤维素酶的实例是EP 0 495257，EP 531372，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他的实例为纤维素酶变体，例如WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US 5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和WO 99/01544中所描述的。商业上可获得的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymerTM(Novozymes A/S)，ClazinaseTM和Puradax HATM(GenencorIntemationalInc.)及KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
适宜的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。包括化学修饰的或者蛋白质工程突变体。有用的过氧化物酶的实例包括WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所描述的来自鬼伞属(Coprinus)，例如灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶及其变体。商业上可获得的过氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozyroes)。
可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂或者通过添加包含所有这些酶的组合的添加剂，将一种或多种洗涤剂酶加入洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等，优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
无粉尘颗粒可以例如US 4,106,991和4,661,452中所公开的进行生产，并且可任选地使用本领域已知的方法涂覆。蜡状涂覆材料的实例为具有1000至20000平均摩尔重量的聚环氧乙烷产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇包含12至20个碳原子，且其具有15至80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单酸甘油酯、二酸甘油酯及三酸甘油酯。GB 1483591中给出了适于通过流化床技术施用的膜形成涂覆材料。可以根据已建立的方法，通过例如加入多元醇(polyol)如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或者硼酸将液态酶制剂稳定化。可以根据EP 238216中公开的方法制备被保护的酶。
本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如，条、片剂、粉剂、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般含有多至70％的水分和0-30％的有机溶剂，或者是不含水的。
洗涤剂组合物中含有一种或多种的表面活性剂，其可以是非离子型的，包括半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子型的。表面活性剂一般以0.1wt％至60wt％的水平存在。
当其中含有阴离子表面活性剂时，洗涤剂通常含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或者肥皂。
当其中含有非离子表面活性剂时，洗涤剂通常含有约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或者葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“glucamides”)。
洗涤剂可以含有0-65％的洗涤剂助剂或者络合剂(complexing agent)，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid)、乙二胺四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可以含有一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可以含有漂白系统，其可以包含H2O2源，例如过硼酸盐或者过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白激活剂组合，其中所述形成过酸的漂白激活剂例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸盐。或者，漂白系统可以含有例如酰胺、酰亚胺、砜类型的过氧酸。
可以使用常规的稳定化试剂，来使本发明洗涤剂组合物的一种或多种酶稳定化，所述稳定化试剂例如多元醇，如丙二醇或丙三醇，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且可以按照例如WO 92/19709和WO92/19708中所述来配制组合物。
洗涤剂中还可以含有其他常规的洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土，发泡促进剂，抑泡剂，防腐剂，污垢悬浮剂，防污垢再沉积剂，染料，杀菌剂，荧光增亮剂，助水溶物，失泽抑制剂或香料。
可预期在本发明的洗涤剂组合物中可以以相当于0.01-100mg酶蛋白每升洗涤液，优选0.05-5mg酶蛋白每升洗涤液，特别是0.1-1mg酶蛋白每升洗涤液的量添加任何酶，特别是本发明的酶。
可以将本发明的酶附加地掺入WO 97/07202所公开的洗涤剂配方中。
具体实施方案
本发明还涉及以下具体实施方案，按编号1-21和42-121排列：
1、一种具有蛋白酶活性的分离多肽，选自：(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：4的1-192位氨基酸具有至少69.9％的同一性程度；(b)由核酸序列编码的多肽，其中所说的核酸序列在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：3的574-1149位核苷酸，(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；(c)具有SEQ ID NO：4的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
2、实施方案1的多肽，其含有以下蛋白酶中的任何一种：(a)SEQ ID NO：6的1-192位氨基酸；(b)SEQ ID NO：10的1-189位氨基酸；(c)SEQ ID NO：2的1-192位氨基酸；或(d)SEQ ID NO：4的1-192位氨基酸。
3、一种分离的核酸序列，其含有编码具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且该核酸序列(a)编码实施方案1-2中任一项的多肽；(b)在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：3的574-1149位核苷酸，(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列；和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；和/或(c)与SEQ ID NO：3的574-1149位核苷酸具有至少77.7％的同一性程度。
4、实施方案3的核酸序列，其含有以下蛋白酶-编码核酸序列中的任何一种：(a)SEQ ID NO：3的574-1149位核苷酸；(b)SEQ ID NO：5的574-1149位核苷酸；(c)SEQ ID NO：7的586-1152位核苷酸；或(d)SEQ ID NO：1的568-1143位核苷酸。
5、一种分离的核酸序列，其通过(a)将DNA在低严紧条件下与(i)SEQ IDNO：3的574-1149位核苷酸；(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列；或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；并且(b)分离核酸序列来生产。
6、一种核酸构建体，含有与一个或多个控制序列可操作性相连的实施方案3-5中任一项的核酸序列，其中所说的控制序列指导多肽在适宜表达宿主中产生。
7、一种含有实施方案6的核酸构建体的重组表达载体。
8、一种含有实施方案6的核酸构建体或实施方案7的载体的重组宿主细胞。
9、一种转基因植物或植物部分，能够表达实施方案1-2中任一项的多肽。
10、一种转基因非人动物或其产品或元件，能够表达实施方案1-2中任一项的多肽。
11、一种实施方案1-2中任一项的多肽的生产方法，该方法包括(a)培养实施方案8的重组宿主细胞以产生含有多肽的上清液；并且(b)回收多肽。
12、一种实施方案1-2中任一项的多肽的生产方法，该方法包括(a)培养以下菌株中的任何一种：(i)达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235，(ii)Nocardiopsis prasina DSM 15649，(iii)Nocardiopsis prasina DSM 14010，或(iv)嗜碱拟诺卡氏菌DSM 44657；并且(b)回收多肽。
13、实施方案1-2中任一项的至少一种蛋白酶的用途，用于(i)动物饲料；(ii)动物饲料添加剂；(iii)制备动物饲料中使用的组合物；(iv)改善动物饲料的营养价值；(v)增加动物饲料中可消化的和/或可溶性蛋白；(vi)增加动物饲料中蛋白水解程度；和/或(vii)处理蛋白质。
14、一种改善动物饲料营养价值的方法，其中将实施方案1-2中任一项的至少一种蛋白酶添加至饲料中。
15、一种动物饲料添加剂，含有(a)实施方案1-2中任一项的至少一种蛋白酶；和(b)至少一种脂溶性维生素，和/或(c)至少一种水溶性维生素，和/或(d)至少一种痕量矿物质。
16、实施方案15的动物饲料添加剂，还含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
17、一种动物饲料，具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有实施方案1-2中任一项的至少一种蛋白酶。
18、一种处理蛋白质的方法，包括将实施方案1-2中任一项的至少一种蛋白酶添加至至少一种蛋白质或蛋白源的步骤。
19、实施方案18的方法，其中至少一种蛋白源中包括大豆。
20、实施方案1-2中任一项的至少一种蛋白酶在洗涤剂中的用途。
21、拟诺卡氏菌属的菌种DSM 16424。
42、一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，选自下组：(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-192位氨基酸具有至少75.1％的同一性程度；(b)由核酸序列编码的多肽，其中所说的核酸序列在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：1的568-1143位核苷酸，(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；(c)具有SEQ ID NO：2的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
43、实施方案42的多肽，其含有以下蛋白酶中的任何一种：(a)SEQ IDNO：6的1-192位氨基酸；(b)SEQ ID NO：2的1-192位氨基酸；或(c)SEQ IDNO：4的1-192位氨基酸。
44、一种分离的核酸序列，含有编码具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且该核酸序列(a)编码实施方案42-43中任一项的多肽；(b)在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：1的568-1143位核苷酸，(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；和/或(c)与SEQ ID NO：1的568-1143位核苷酸具有至少81.2％的同一性程度。
45、实施方案3或44的核酸序列，其含有以下编码蛋白酶的核酸序列中的任何一种：(a)SEQ ID NO：3的574-1149位核苷酸；(b)SEQ ID NO：5的574-1149核苷酸；或(c)SEQ ID NO：1的568-1143位核苷酸。
46、一种分离的核酸序列，通过下述产生：(a)将DNA在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：1的568-1143位核苷酸；(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；和(b)分离核酸序列。
47、一种核酸构建体，含有与一个或多个控制序列可操作性相连的实施方案44-46中任一项的核酸序列，其中所说的控制序列指导多肽在适宜表达宿主中产生。
48、一种含有实施方案47的核酸构建体的重组表达载体。
49、一种含有实施方案47的核酸构建体或实施方案48的载体的重组宿主细胞。
50、一种转基因植物或植物部分，其能够表达实施方案42-43中任一项的多肽。
51、一种转基因非人动物或其产品或元件，其能够表达实施方案42-43中任一项的多肽。
52、一种生产实施方案42-43中任一项的多肽的方法，该方法包括(a)培养实施方案49的重组宿主细胞，产生含有多肽的上清液；并且(b)回收多肽。
53、一种生产实施方案42-43中任一项的多肽的方法，该方法包括(a)培养以下菌株中的任何一种：(i)达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235，(ii)Nocardiopsis prasina DSM 15649，或(iii)Nocardiopsis prasina DSM 14010；并且(b)回收多肽。
54、实施方案42-43中任一项的至少一种蛋白酶的用途，用于(i)动物饲料；(ii)动物饲料添加剂；(iii)制备动物饲料中使用的组合物；(iv)提高动物饲料的营养价值；(v)增加动物饲料中可消化和/或可溶性蛋白；(vi)增加动物饮食中蛋白水解程度；和/或(vii)处理蛋白质。
55、一种提高动物饲料营养价值的方法，其中将实施方案42-43中任一项的至少一种蛋白酶添加至饲料中。
56、一种动物饲料添加剂，含有(a)实施方案42-43中任一项的至少一种蛋白酶；和(b)至少一种脂溶性维生素，和/或(c)至少一种水溶性维生素，和/或(d)至少一种痕量矿物质。
57、实施方案56的动物饲料添加剂，还含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
58、一种动物饲料，具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有实施方案42-43中任一项的至少一种蛋白酶。
59、一种处理蛋白质的方法，包括将实施方案42-43中任一项的至少一种蛋白酶添加至至少一种蛋白质或蛋白源的步骤。
60、实施方案59的方法，其中至少一种蛋白源中包括大豆。
61、实施方案42-43中任一项的至少一种蛋白酶在洗涤剂中的用途。
62、一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，其选自下组：(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：8的1-189位氨基酸具有至少92.2％的同一性程度；(b)由核酸序列编码的多肽，其中所说的核酸序列在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：7的586-1152位核苷酸，(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；(c)具有SEQ ID NO：8的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
63、实施方案1或62的多肽，其含有SEQ ID NO：8的1-189位氨基酸。
64、一种分离的核酸序列，其含有编码具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且该核酸序列(a)编码实施方案62-63中任一项的多肽；(b)在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：7的586-1152位核苷酸，(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；和/或(c)与SEQ ID NO：7的586-1152位核苷酸具有至少93.6％的同一性程度。
65、实施方案64的核酸序列，其含有SEQ ID NO：7的586-1152位核苷酸。
66、一种分离的核酸序列，其通过如下产生：(a)将DNA在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：7的586-1152位核苷酸；(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；和(b)分离核酸序列。
67、一种核酸构建体，其含有与一个或多个控制序列可操作性相连的实施方案64-66中任一项的核酸序列，其中所说的控制序列指导多肽在适宜表达宿主中产生。
68、一种含有实施方案67的核酸构建体的重组表达载体。
69、一种含有实施方案67的核酸构建体或实施方案68的载体的重组宿主细胞。
70、一种转基因植物或植物部分，其能够表达实施方案62-63中任一项的多肽。
71、一种转基因非人动物或其产品或元件，其能够表达实施方案62-63中任一项的多肽。
72、一种产生实施方案62-63中任一项的多肽的方法，该方法包括(a)培养实施方案69的重组宿主细胞，以产生含有所述多肽的上清液；并且(b)回收所述多肽。
73、一种产生实施方案62-63中任一项的多肽的方法，该方法包括(a)培养(i)拟诺卡氏菌属的菌种DSM 16424；并且(b)回收所述多肽。
74、实施方案62-63中任一项的至少一种蛋白酶的用途，用于(i)动物饲料；(ii)动物饲料添加剂；(iii)制备动物饲料中使用的组合物；(iv)提高动物饲料营养价值；(v)增加动物饲料中可消化和/或可溶性蛋白；(vi)增加动物饮食中蛋白水解程度；和/或(vii)处理蛋白质。
75、一种提高动物饲料营养价值的方法，其中将实施方案62-63中任一项的至少一种蛋白酶添加至饲料中。
76、一种动物饲料添加剂，其含有(a)实施方案62-63中任一项的至少一种蛋白酶；和(b)至少一种脂溶性维生素，和/或(c)至少一种水溶性维生素，和/或(d)至少一种痕量矿物质。
77、实施方案76的动物饲料添加剂，还含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
78、一种动物饲料，具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有实施方案62-63中任一项的至少一种蛋白酶。
79、一种处理蛋白质的方法，包括将实施方案62-63中任一项的至少一种蛋白酶添加至至少一种蛋白质或蛋白源的步骤。
80、实施方案79的方法，其中至少一种蛋白源中包括大豆。
81、实施方案62-63中任一项的至少一种蛋白酶在洗涤剂中的用途。
82、一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，其选自下组：(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：10的1-189位氨基酸具有至少93.2％的同一性程度；(b)由核酸序列编码的多肽，其中所说的核酸序列在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：9的586-1149位核苷酸，(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；(c)具有SEQ ID NO：10的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
83、实施方案1或82的多肽，其含有SEQ ID NO：10的1-189位氨基酸。
84、一种分离的核酸序列，其含有编码具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且该核酸序列(a)编码实施方案82-83中任一项的多肽；(b)在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：9的586-1149位核苷酸，(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；和/或(c)与SEQ ID NO：9的586-1149位核苷酸具有至少90.3％的同一性程度。
85、实施方案3或84的核酸序列，其含有SEQ ID NO：9的586-1149位核苷酸。
86、一种分离的核酸序列，其通过下述产生：(a)将DNA在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：9的586-1149位核苷酸；(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；并且(b)分离所述核酸序列。
87、一种核酸构建体，含有与一个或多个控制序列可操作性相连的实施方案84-86中任一项的核酸序列，其中所说的控制序列指导多肽在适宜的表达宿主中产生。
88、一种含有实施方案87的核酸构建体的重组表达载体。
89、一种含有实施方案87的核酸构建体或实施方案88的载体的重组宿主细胞。
90、一种转基因植物或植物部分，其能够表达实施方案82-83中任一项的多肽。
91、一种转基因非人动物或其产品或元件，能够表达实施方案82-83中任一项的多肽。
92、一种产生实施方案82-83中任一项的多肽的方法，该方法包括(a)培养实施方案89的重组宿主细胞，以产生含有所述多肽的上清液；并且(b)回收该多肽。
93、一种产生实施方案82-83中任一项的多肽的方法，该方法包括培养嗜碱拟诺卡氏菌DSM 44657；并且回收所述多肽。
94、实施方案82-83中任一项的至少一种蛋白酶的用途，用于(i)动物饲料；(ii)动物饲料添加剂；(iii)制备动物饲料中使用的组合物；(iv)提高动物饲料营养价值；(v)增加动物饲料中可消化和/或可溶性蛋白；(vi)增加动物饮食中蛋白水解程度；和/或(vii)处理蛋白质。
95、一种提高动物饲料营养价值的方法，其中将实施方案82-83中任一项的至少一种蛋白酶添加至饲料中。
96、一种动物饲料添加剂，含有(a)实施方案82-83中任一项的至少一种蛋白酶；和(b)至少一种脂溶性维生素，和/或(c)至少一种水溶性维生素，和/或(d)至少一种痕量矿物质。
97、实施方案96的动物饲料添加剂，还含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
98、一种动物饲料，具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有实施方案82-83中任一项的至少一种蛋白酶。
99、一种处理蛋白质的方法，包括将实施方案82-83中任一项的至少一种蛋白酶添加至至少一种蛋白质或蛋白源的步骤。
100、实施方案99的方法，其中至少一种蛋白源中包括大豆。
101、实施方案82-83中任一项的至少一种蛋白酶在洗涤剂中的用途。
102、一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，选自：(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：12的1-189位氨基酸具有至少83.3％的同一性程度；(b)由核酸序列编码的多肽，其中所说的核酸序列在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：11的586-1152位核苷酸，(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；(c)具有SEQ ID NO：12的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
103、实施方案1或102的多肽，其含有SEQ ID NO：12的1-189位氨基酸。
104、一种分离的核酸序列，其含有编码具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且该核酸序列(a)编码实施方案102-103中任一项的多肽；(b)在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：11的586-1152位核苷酸，(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；和/或(c)具有与SEQ ID NO：11的586-1152位核苷酸至少83.9％的同一性程度。
105、实施方案104的核酸序列，其含有SEQ ID NO：11的586-1152位核苷酸。
106、一种分离的核酸序列，其通过下述产生：(a)将DNA在低严紧条件下与(i)SEQ ID NO：11的586-1152位核苷酸；(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；并且(b)分离所述核酸序列。
107、一种核酸构建体，含有与一个或多个控制序列可操作性相连的实施方案104-106中任一项的核酸序列，其中所说的控制序列指导多肽在适宜的表达宿主中产生。
108、一种含有实施方案107的核酸构建体的重组表达载体。
109、一种含有实施方案107的核酸构建体或实施方案108的载体的重组宿主细胞。
110、一种转基因植物或植物部分，其能够表达实施方案102-103中任一项的多肽。
111、一种转基因非人动物或其产品或元件，其能够表达实施方案102-103中任一项的多肽。
112、一种产生实施方案102-103中任一项的多肽的方法，该方法包括(a)培养实施方案109的重组宿主细胞，以产生含有所述多肽的上清液；并且(b)回收该多肽。
113、一种产生实施方案102-103中任一项的多肽的方法，该方法包括培养卢森坦类诺卡氏菌DSM 44048；并且回收所述多肽。
114、实施方案102-103中任一项的至少一种蛋白酶的用途，用于(i)动物饲料；(ii)动物饲料添加剂；(iii)制备动物饲料中使用的组合物；(iv)提高动物饲料营养价值；(v)增加动物饲料中可消化和/或可溶性蛋白；(vi)增加动物饮食中蛋白水解的程度；和/或(vii)处理蛋白质。
115、一种提高动物饲料营养价值的方法，其中将实施方案102-103中任一项的至少一种蛋白酶添加至饲料中。
116、一种动物饲料添加剂，其含有(a)实施方案102-103中任一项的至少一种蛋白酶；和(b)至少一种脂溶性维生素，和/或(c)至少一种水溶性维生素，和/或(d)至少一种痕量矿物质。
117、实施方案116的动物饲料添加剂，还含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
118、一种动物饲料，具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有实施方案102-103中任一项的至少一种蛋白酶。
119、一种处理蛋白质的方法，包括将实施方案102-103中任一项的至少一种蛋白酶添加至至少一种蛋白质或蛋白源的步骤。
120、实施方案119的方法，其中至少一种蛋白源中包括大豆。
121、实施方案102-103中任一项的至少一种蛋白酶在洗涤剂中的用途。
生物材料的保藏
以下生物材料已经按照布达佩斯条约的条款保藏于DSMZ (德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，Mascheroder Weg 1 b，D-38124 Braunschweig，Germany)，并且给出以下保藏号：
保藏                              保藏号       保藏日期
拟诺卡氏菌属菌株                  DSM 16424    2004.5.24
Nocardiopsis prasina              DSM 15649    2003.5.30
Nocardiopsis prasina(以前是alba)  DSM 14010    2001.1.20
这些菌株在确保在本专利申请未结案期间，由专利与商标委员依据37C.F.R.§1.14和35 U.S.C.§122所授权的人能够得到该菌株的条件下保藏。这种保藏表示所保藏的菌株基本上是纯的培养物。这种保藏可以在提交了这些申请的副本或其后续文本的国家，依据该外国专利法的要求获得。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明将侵犯由政府行为所授予的专利权。
菌株DSM 15649是在2001年从丹麦的土壤样品中分离的。
以下菌株是公众可以从DSMZ中获得的：
达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种   DSM 43235
嗜碱拟诺卡氏菌                   DSM 44657
卢森坦类诺卡氏菌                 DSM 44048
达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种菌株DSM 43235也在如下的其它保藏机构中进行了保藏：ATCC 23219，IMRU 1250，NCTC 10489。
本文所描述及所要求保护的本发明不受本文所公开的具体实施方案的范围所限制，因为这些实施方案旨在作为本发明几个方面的举例说明。任何等效的实施方案都将被认为在本发明的范围之内。事实上，按照前面的描述，在本文所示和所述的基础上对本发明作出各种修改，对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些修改也都落在所附的权利要求的范围内。对于有冲突的情况，将以包括定义的本公开为准。
本文所提到的各参考文献，其公开的内容整体并入本文作为参考。
实施例
实施例1：三种蛋白酶(L1a、L1b和L1c)的克隆和表达
试剂和培养基
LB琼脂     描述于Ausubel，F.M.等(编)″Current protocols in Molecular
           Biology″John Wiley and Sons，1995；
LB-PG琼脂  LB琼脂，补充0.5％葡萄糖和0.05 M磷酸钾，pH7.0
PS-1       10％蔗糖，4％大豆粉，1％Na3PO4-12H2O，0.5％CaCO3，
           和0.01％普鲁兰酸(pluronic acid)
TE         10mM Tris-HCl，pH7.4
           1mM EDTA，pH 8.0
TEL        50mg/ml溶菌酶(Lysozym)于TE-缓冲液中
硫氰酸盐   5M硫氰酸胍
           100mM EDTA
         0.6％w/v N-月桂基肌氨酸，钠盐，
         将60g硫氰酸盐，20ml 0.5M EDTA，pH8.0，20ml H2O
         在65℃下溶解。冷却至室温(RT)并且添加0.6g N-月桂基
         肌氨酸。加H2O至100ml并且通过0.2μ无菌滤器过滤
NH4Ac    7.5M CH3COONH4
TER      1μg/ml RNAse A于TE-缓冲液中
CIA      氯仿/异戊醇24∶1
拟诺卡氏菌属菌株的发酵
将达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235，Nocardiopsis prasinaDSM 15649和Nocardiopsis prasina(以前是alba)DSM 14010各菌株在以下培养基中在30℃培养3天，然后收获：
胰酶解酪蛋白(trypticase)    20g
酵母提取物                  5g
氯化亚铁                    6mg
硫酸镁                      15mg
蒸馏水至                    1000ml
添加碳酸钠将pH调节至9
制备基因组DNA
按照如下步骤分离基因组DNA：
1.收获1.5ml培养物并且重悬于100μl TEL中。37℃下保温30min。
2、加入500μl硫氰酸盐缓冲液，并且在室温放置10min。
3、加入250μl NH4Ac，并且置于冰上10min。
4、加入500μl CIA，并且混合。
5、转移至微型离心机并且全速旋转10min。
6、将上清转移至新的Eppendorf管，并且加入0.54体积的冷异丙醇，彻底混和。
7、旋转并且用70％EtOH洗涤DNA小丸。
8、将基因组DNA重悬于100μl TER中。
枯草芽孢杆菌表达菌株Sav-L1a、Sav-L1b和Sav-L1c的构建
用以下引物1424和1485在从达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM43235中分离的基因组DNA上扩增前-成熟(pro-mature)蛋白酶L1a的编码区(SEQ ID NO：1的88-1143位核苷酸)：
引物1485(SEQ ID NO：14)：
5′-gcttttagttcatcgatcgcatcggctgcgaccgtaccggccgagccag-3′
引物1424(SEQ ID NO：15)：
5′-ggagcggattgaacatgcgattactaaccggtcaccagggacagcc-3′
用以下引物1751和1753在从Nocardiopsis prasina DSM15649中分离的基因DNA上扩增前-成熟蛋白酶L1b的编码区(SEQ ID NO：3的88-1149位核苷酸)：
1751(SEQ ID NO：16)：5′-gttcatcgatcgcatcggctgtcaccgcacccaccgagcc-3′
1753(SEQ ID NO：17)：5′-ggagcggattgaacatgcgattagctggtgacgaggctgaggttc-3′
用以下引物1755和1756在从Nocardiopsis prasina DSM14010中分离的基因组DNA上扩增前-成熟蛋白酶L1c的编码区(SEQ ID NO：5的88-1149位核苷酸)：
  1755(SEQ ID NO：18)：5′-gttcatcgatcgcatcggctgtgaccgcccccgccgag-3′
  1756(SEQ ID NO：19)：5′-ggagcggattgaacatgcgattagctcgtgacgaggctgaggttc-3′
将这些L1a、L1b和L1c多核苷酸，通过PCR，各自在框内融合成编码Sav信号肽(SEQ ID NO：13)的异源DNA片段。
  通过在枯草芽孢杆菌MB1053宿主细胞基因组(WO 03/95658)上进行同源重组来掺入这些基因(包括信号肽编码部分)以构建枯草芽孢杆菌菌株，分别命名为Sav-L1a，Sav-L1b和Sav-L1c。在三启动子系统(如WO 99/43835中所述)的控制下表达基因，其中所说的三启动子系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子和包括稳定化序列的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)crylllA启动子组成。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标记(例如在Diderichsen，B.；Poulsen，G.B.；Joergensen，S.T.；A useful cloning vector for Bacillus subtilis.Plasmid 30：312(1993)中描述)。
检查氯霉素抗性转化体在1％脱脂奶LB-PG琼脂平板(补充6μg/ml氯霉素)上的蛋白酶活性。通过对插入片段进行DNA测序来进一步分析一些蛋白酶阳性菌落，以证实正确的DNA序列，并对于每个构建体选择一个菌株。
芽孢杆菌属宿主菌株的发酵
将每个转化的枯草芽孢杆菌宿主菌株在旋转摇床(250r.p.m.)上，于500ml带挡板的锥形瓶中发酵，其中所说的锥形瓶中含有补充6μg/ml氯霉素的100ml PS-1培养基，在37℃发酵16小时，并且在26℃发酵额外4天。
实施例2：蛋白酶L2a的克隆和表达
通过实施例1所述的步骤从拟诺卡氏菌属的菌种DSM 16424中分离蛋白酶编码基因(SEQ ID NO：7的88-1152位核苷酸)的前体形式(pro-form)，不同之处是使用以下引物：
1718(SEQ ID NO：20)：5′-gttcatcgatcgcatcggctgcgcccggccccgtcccccag-3′
1720(SEQ ID NO：21)：5′-ggagcggattgaacatgcgatcagctggtgcggatgcgaac-3′。
相应的蛋白酶(SEQ ID NO：8)命名为L2a。
也如实施例1一般地描述，构建了枯草芽孢杆菌宿主菌株，命名为Sav-L2a，选择氯霉素抗性的、蛋白酶阳性菌落并通过对插入物的DNA测序进行分析。
实施例3：两种另外的蛋白酶的克隆
通过实施例1描述的方法，分别从嗜碱拟诺卡氏菌DSM 44657和卢森坦类诺卡氏菌DSM 44048中分离两种另外的蛋白酶编码基因(分别是核苷酸SEQ ID NO：9的88-1149位核苷酸和SEQ ID NO：11的88-1152位核苷酸)的前体形式，不同之处是分别使用引物1728和1763；及1747和1749：
1728(SEQ ID NO：22)：5′-gttcatcgatcgcatcggctgcccccgccccccagtc-3′；
1763(SEQ ID NO：23)：
5′-ggagcggattgaacatgcgattaggtgcgcagacgcaggcccca-3′；
1747(SEQ ID NO：24)：5′-gttcatcgatcgcatcggctggaaccgtacccaccccccagg-3′；
1749(SEQ ID NO：25)：5′-ggagcggattgaacatgcgattagctggtgcgcagtcgcac-3′
相应的蛋白酶(分别是SEQ ID NO：10和12)分别命名为L2b和L2c。
也如实施例1一般地描述，构建枯草芽孢杆菌宿主菌株，分别命名为Sav-L2b和Sav-L2c，并且选择氯霉素抗性的、蛋白酶阳性菌落并通过对插入物的DNA测序进行分析。
实施例4：  L1a蛋白酶的纯化和表征
蛋白酶测试
1)pNA测试：
pNA底物    ：Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400)
温度       ：室温(25℃)
测试缓冲液 ：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM
CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0和12.0。
将20μl蛋白酶(用0.01％Triton X-100稀释)与100μl测试缓冲液混和。通过添加100μl pNA底物(50mg溶于1.0ml DMSO中并进一步用0.01％TritonX-100稀释45x)开始测试。监测OD405的增加，作为蛋白酶活性的量度。
2)Protazyme AK测试：
底物：      Protazyme AK片(交联并染色的酪蛋白；来自Megazyme)
温度：      受控(测试温度)
测试缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM
CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0。
通过轻轻搅动将Protazyme AK片悬浮于2.0ml 0.01％Triton X-100中。将500μl此悬浮液和500μl测试缓冲液在Eppendorf管中混和并且放在冰上。加入20μl蛋白酶样品(在0.01％Triton X-100中稀释)。通过将Eppendorf管转移至设置为测试温度的Eppendorf热混合器中来开始测试。将管在Eppendorf热混合器中以其最高的摇动速率(1400rpm)保温15分钟。通过将管转移至冰浴中来停止保温。然后将管在冰冷的离心机中离心几分钟并且将200μl上清液转移至微量滴定板中。读取OD650值作为蛋白酶活性的量度。测试中包括缓冲液空白(buffer blind)(代替酶)。
纯化
也如实施例1所述，将实施例1所述的表达L1a蛋白酶的转化的芽孢杆菌属宿主发酵，但在26℃下发酵6天。将培养液离心(20000xg，20min)并且将上清液仔细地从沉淀中倾析出来。将合并的上清液通过Seitz EKS板过滤，以便除去剩余的芽孢杆菌属宿主细胞。将EKS滤液转移至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3、5mM琥珀酸、1mM CaCl2，pH7中。向来自G25 sephadex柱的酶溶液添加固体硫酸铵，得到1.6M最终(NH4)2SO4浓度的酶溶液。在添加(NH4)2SO4期间将此酶溶液用磁力搅拌器轻轻混和并且在添加之后继续搅拌30分钟以使系统达到平衡。然后将酶溶液上样于Butyl Toyopearl柱，该柱在100mM H3BO3、10mM琥珀酸、2mM CaCl2、1.6M(NH4)2SO4，pH7中平衡。用平衡缓冲液大量冲洗该柱之后，用线性(NH4)2SO4梯度(1.6至0M)在相同缓冲液中洗脱蛋白酶。收集合有蛋白酶的级分并且转移至G25 sephadex柱上的20mM HEPES，pH8中并且上样于Q sepharose FF柱，该柱在相同缓冲液中平衡。将柱用平衡缓冲液大量冲洗之后，用线性NaCl梯度(0至0.5M)在相同缓冲液中洗脱蛋白酶。分析柱级分的蛋白酶活性(在pH9使用Suc-AAPF-pNA测试)并且通过SDS-PAGE进一步分析活性级分。收集只有一个条带的级分(如通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶来判断)，以便提供用于进一步表征的纯化的制备物。
如下表征L1a蛋白酶，与得自达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM43235的其他蛋白酶进行比较，其按WO 2004/111220中所述来制备(在下文中简单命名为″L2蛋白酶″)。
pH-活性、pH-稳定性和温度-活性
使用pNA测试来获得pH-活性分布以及pH-稳定性分布。对pH-稳定性分布，将蛋白酶在测试缓冲液中稀释10x并且在37℃保温2小时。保温之后，进行残余活性测试之前，通过在pH9测试缓冲液中稀释，将蛋白酶样品转变至相同的pH(pH9)。使用Protazyme AK测试，获得pH 9的温度-活性分布。结果示于下表1-3。
表1：pH-活性分布
    pH     L1a蛋白酶     L2蛋白酶
    2     0.00     0.00
    3     0.00     0.00
    4     0.02     0.03
    5     0.10     0.11
    6     0.25     0.21
    7     0.38     0.37
    8     0.66     0.71
    9     0.97     0.97
    10     1.00     1.00
    11     0.99     0.94
    12     0.94     -
表2：pH-稳定性分布
   pH     L1a蛋白酶     L2蛋白酶
   2.0     0.50     1.00
   2.5     0.81     0.95
   3.0     0.93     0.97
   3.5     0.94     1.01
   4.0     0.97     0.98
   5.0     0.96     0.97
   6.0     0.95     0.98
   7.0     0.99     0.96
   8.0     0.97     0.99
   9.0     0.93     0.99
   10.0     0.94     0.96
   11.0     0.94     0.94
   12.0     0.92     0.84
   9.0和5℃下2小时后     1.00     1.00
表3：温度-活性分布
    温度(℃)     L1a蛋白酶     L2蛋白酶
15 0.11 0.01
    25     0.17     0.01
    37     0.30     0.03
    50     0.58     0.09
    60     0.90     0.19
    70     1.00     0.63
    80     0.34     1.00
    90     -     0.35
其他特征
L1a蛋白酶是一种α-分解蛋白酶样的酶(肽酶家族S1E，旧称S2A)，据发现其可通过苯甲基磺酰氟(PMSF)和链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(Streptomyces Subtilisin Inhibitor)(SSI)来抑制。其相对分子量通过SDS-PAGE测定为Mr＝22kDa，并且N-末端序列：ADIVGGEAY(SEQ ID NO：26)。
实施例5：L1a蛋白酶的比活性
使用实施例4所述的纯化的蛋白酶制剂测定比活性。当通过SDS-PAGE分析(如WO 01/58275中的实施例2A所述测定)时，制品的纯度为95％以上。将此蛋白酶样品一分为二。一部分通过氨基酸分析来分析蛋白含量(mg/ml)，另一部分分析蛋白酶活性。
氨基酸分析(AAA)/(mg/ml)
将蛋白酶样品的肽键进行酸水解，然后在Biochrom 20 Plus氨基酸分析仪(可从Bie & Bemtsen A/S，Sandbaekvej 5-7，DK-2610 Roedovre，Denmark商购获得)上根据制造商的说明分离并且定量释放的氨基酸。为进行酸水解，将蛋白质样品在真空离心机中干燥，溶解于18.5％(体积/体积)HCl+0.1％(体积/体积)苯酚中，110℃下保温16小时。保温之后，将样品在真空离心机中再次干燥，溶解于上样缓冲液(0.2M柠檬酸钠，pH2.2)，上样到Biochrom 20Plus氨基酸分析仪。
为了定量，将水解的样品加样到阳离子交换树脂UltroPac no.8，钠形式(Sodium-form)，其可从Bie & Bemtsen A/S商购获得，目录号80-2104-15。根据制造商的说明，将pH(pH1至pH8)和离子强度变化的缓冲液泵送通过柱子，以便分离不同的氨基酸。同样根据制造商的说明，精确控制柱温(从53℃至92℃，并回到53℃)，以确保所需要的分离。将柱洗脱液与茚三酮试剂(Bie& Berntsen，目录号80-2038-07)混合，并使混合物穿过氨基酸分析仪的高温反应盘管(reaction coil)。在反应盘管中，茚三酮与氨基酸反应形成有色化合物，有色化合物的量与所存在的氨基酸的量成正比。
蛋白酶活性测试(AU/ml)
将变性血红蛋白(0.65％(w/w)，于6.7mM KH2PO4/NaOH缓冲液中，pH7.50)在25℃用蛋白酶降解10分钟，用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白，并通过过滤除去。用Folin & Ciocalteu的苯酚试剂测定滤液中的TCA可溶性的血红蛋白降解产物，所述的试剂使几种氨基酸显示蓝色。参照ALCALASETM标准测量并且确定活性单位(AU)，测试的详细描述以及ALCALASETM标准的样品可根据要求从Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark获得(测试号EB-SM-0349.02/01)。
比活性计算为：比活性(AU/g)＝(活性(AU/ml)/AAA(mg/ml))×1000(mg/g)。
L1a蛋白酶的比活性为49.8AU/g，与之对比来源于拟诺卡氏菌属的菌种NRRL 18262的蛋白酶的比活性为38.3AU/g。
实施例6：L2a蛋白酶的纯化和表征
将实施例2所述的表达L2a蛋白酶的转化的芽孢杆菌属宿主如实施例1所述进行发酵，但在30℃下发酵5天。将培养液离心(20000xg，20min)并且将上清液仔细地从沉淀中倾析出来。将组合的上清液通过Seitz EKS板过滤，以便除去剩余的芽孢杆菌属宿主细胞。将EKS滤液转移至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3、5mM琥珀酸、1mM CaCl2，pH7中，并且上样于在相同缓冲液中平衡的杆菌肽二氧化硅柱(silica column)。用平衡缓冲液大量冲洗杆菌肽柱之后，用100mM H3BO3、10mM琥珀酸、2mM CaCl2，1M NaCl、25％异丙醇，pH7分步洗脱(step-eluted)。将杆菌肽洗脱液转移至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3、10mM CH3COOH、1mM CaCl2，pH4.5中并且上样于在相同缓冲液中平衡的S sepharose HP柱。用平衡缓冲液大量洗涤该柱之后，用相同缓冲液中的线性NaCl梯度(0至0.5M)洗脱蛋白酶。分析来自柱的级分的蛋白酶活性(使用Protazyme AK测试，在37℃和pH9)并且通过SDS-PAGE进一步分析活性级分。收集只有一个条带的级分(如通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶所判断的)，以提供用于进一步表征的纯化的制备物。
如上面实施例4所述表征L2a蛋白酶，与得自拟诺卡氏菌属的菌种NRRL18262的已知蛋白酶(简称为″蛋白酶10″)进行比较。结果示于下表4-6。
表4：DH-活性分布
    pH     L2a蛋白酶     蛋白酶10
    2     0.00     -
    3     0.00     0.00
    4     0.02     0.02
    5     0.10     0.07
    6     0.22     0.21
    7     0.41     0.44
    8     0.75     0.67
    9     0.97     0.88
    10     0.99     1.00
    11     1.00     0.93
    12     0.85     -
表5：pH-稳定性分布
   pH     L2a蛋白酶     蛋白酶10
   2.0     0.67     0.78
   2.5     0.93     1.00
   3.0     0.95     1.03
   3.5     0.96     0.98
   4.0     0.97     0.99
   5.0     0.94     1.02
   6.0     0.95     1.00
   7.0     0.97     1.01
   8.0     0.96     0.98
   9.0     0.95     0.99
   10.0     0.96     0.99
   11.0     0.90     0.86
   12.0     0.60     -
   9.0和5℃下2小时后     1.00     1.00
表6：温度活性分布
    温度(℃)     L2a蛋白酶     蛋白酶10
    15     0.02     0.02
    25     0.02     0.02
    37     0.05     0.07
    50     0.13     0.20
    60     0.31     0.51
    70     0.79     1.00
    80     1.00     0.39
    90     0.28     -
其他特征
L2a蛋白酶是一种α-分解蛋白酶样的酶(肽酶家族S1E，旧称S2A)，据发现其受苯基甲基磺酰氟(PMSF)抑制。其相对分子量通过SDS-PAGE测定为Mr＝20kDa，并且N-末端序列：ANIIGGLAYT(SEQ ID NO：27)。
实施例7：L2a蛋白酶的解链温度(melting temprature)
差式扫描量热法(DSC)
使用DSC，测定源自拟诺卡氏菌属的菌种DSM 16424的L2a蛋白酶在pH7.0下的温度稳定性。将蛋白酶如实施例6所述纯化并对10mM磷酸钠、50mM氯化钠，pH7.0在4℃透析过夜，并且在VP-DSC仪器(Micro Cal)上，从20℃至100℃以1.5℃/min的恒定扫描速率进行操作。使用MicroCal Origin软件进行数据处理。
所得的变性或解链温度(Tm或Td)为78.2℃；蛋白酶10的Tm为76.5℃。
实施例8：L2a蛋白酶在单胃体外消化模型中的性能
在模拟单胃动物中的消化的体外模型中测试实施例6描述的纯化的L2a蛋白酶的性能，与源自拟诺卡氏菌的菌种NRRL 18262的已知的蛋白酶(″蛋白酶10″)比较。具体地说，检测蛋白酶改善溶解和消化玉米/-SBM(玉米/-大豆粉)蛋白的能力。该体外系统由18个烧瓶组成，其中将玉米/-SBM底物起初与HCl/胃蛋白酶一起保温-模拟胃的消化，随后与胰酶一起保温-模拟肠的消化。在胃阶段开始时，用蛋白酶配制8个烧瓶，而剩余的10个烧瓶作为空白。在肠保温阶段结束时，移出体外消化的样品并且分析增溶和消化的蛋白质。
体外消化过程概况
添加的组分 pH 温度 时间 模拟的消化阶段
10g玉米/-SBM底物(6∶4)，41ml HCl(0.105M) 3.0  40℃  t＝0min 混和
5ml HCl(0.105M)/胃蛋白酶(3000U/g底物)，1ml蛋白酶(以提供100mg蛋白酶酶蛋白每kg底物) 3.0 40℃ t＝30min 胃消化
16ml H2O 3.0  40℃  t＝1.0小时 胃消化
7ml NaOH(0.39M) 6.8  40℃  t＝1.5小时 肠消化
5ml NaHCO3(1M)/胰酶(8mg/g饮食) 6.8  40℃  t＝2.0小时 肠消化
终止保温 7.0  40℃  t＝6.0小时
条件
底物：    4g SBM，6g玉米(预混的)
pH：      3.0胃步骤/6.8-7.0肠步骤
HCl：     0.105M，1.5小时(即30min HCl-底物预混和)
胃蛋白酶：3000U/g饮食，1小时
胰酶：    8mg/g饮食，4小时
温度：    40℃
重复次数：n
溶液
0.39M NaOH
0.105M HCl
0.105M HCl，含6000U胃蛋白酶每5ml
1M NaHCO3，含16mg胰酶每ml
125mM NaAc-缓冲液，pH6.0
酶蛋白测定
在A 280值和氨基酸序列(氨基酸组成)的基础上，使用S.C.Gill & P.H.vonHippel，Ahalytical Biochemistry 182，319-326，(1989)中概述的原理，计算蛋白酶酶蛋白(EP)的量。
体外模型的实验过程
根据上述概况进行实验过程。在第1、2.5和5.5小时测定pH。6小时后终止保温并且移出30ml样品，放在冰上，然后离心(10000xg，10min，4℃)。移出上清液并且在-20℃储存。
分析
使用凝胶过滤分析所有样品的增溶和消化的蛋白的含量。
增溶和消化的蛋白的估测
使用凝胶过滤HPLC通过定量粗蛋白(CP)，来估测来自体外消化样品的上清液中增溶蛋白的含量。将上清液融化，通过0.45μm聚碳酸酯过滤器过滤并且用H2O稀释(1∶50，v/v)。使用Superdex Peptide PE(7.5×300mm)凝胶过滤柱(Global)将稀释的样品通过HPLC进行层析。用于等度洗脱(isocraticelution)的洗脱剂为含有150mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)。每次操作洗脱剂的总体积为26ml且流速为0.4ml/min。在214nm记录洗脱图(elution profile)，并且通过积分确定所述图线下的总面积。为了从积分面积估测蛋白含量，由具有已知总蛋白含量的体外消化的对照玉米/-SBM样品的稀释系列中，获得校正曲线(R2＝0.9993)。在对照样品中，使用Kjeldahl方法(测定％氮；A.O.A.C.(1984)Official Methods of Analysis第14版，Washington DC)进行蛋白测定。
通过将对应于具有1500 Dalton或更低的分子量的肽和氨基酸的色谱图面积进行积分，来估测消化蛋白的含量(Savoie，L.；Gauthier，S.F.Dialysis CellFor The In-vitro Measurement Of Protein Digestibility.J.Food Sci.1986，51，494-498；Babinszky，L.；Van，D.M.J.M.；Boer，H.；Den，H.L.A.An In-vitroMethod for Prediction of The Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds.J.Sci.Food A gr.1990，50，173-178；Boisen，S.；Eggum，B.O.Critical Evaluationof In-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals.Nutrition Research Reviews 1991，4，141-162)。为测定1500 Dalton分界线，使用细胞色素C(Boehringer，Germany)、抑肽酶、胃泌素I和物质P(SigmaAldrich，USA)作为分子量标准进行校准。
结果
下表7中所示的结果说明，L2a蛋白酶，如同蛋白酶10，使可溶性和可消化蛋白的水平相对于空白显著增加。此外，L2a蛋白酶至少在数字上看起来使可消化蛋白的水平与已知的蛋白酶10相比得到提高。
表7：增溶和消化的粗蛋白
酶  N 相对于空白
 ％可消化CP  CV％ ％可溶性CP   CV％
空白  10  100.0   a  5.5  100.0   a   4.4
L2a蛋白酶  3  116.1   b 0.7 107.2   b 1.1
蛋白酶10  5  112.1   b 1.0 110.2 b 0.6
同一栏中的不同字母表示显著差异(1-way ANOVA，Tukey-Kramer试验，P＜0.05)。SD＝标准偏差。％CV＝方差系数＝(SD/平均值)×100％
实施例9：动物饲料和动物饲料添加剂
含有本发明蛋白酶L2a的动物饲料添加剂，为维生素和矿物质预混物的形式，由下表8所示组分组成。维生素和类胡萝卜素可从DSM NutritionalProducts商购获得。所有量按g/kg计。
表8：预混组合物
维生素A  ROVIMIX A 500     4.00
维生素D3  ROVIMIX D3 500     1.00
维生素E  ROVIMIX E 50 Ads     8.00
维生素B2  ROVIMIX B2 80-SD     1.0
 CAROPHYLL Yellow     10.0
 氯化胆碱50％，min.     300.0
矿物质  Mn氧化物     60.0
 Zn氧化物     12.0
 Fe硫酸盐一水合物     20.0
 Cu氧化物     2.0
 Co硫酸盐     0.2
酶 蛋白酶L2a(酶蛋白)     10.0
小麦粗粉(middlings)     571.8
表8的预混物与下表9中所示的组合物包含在产卵鸡(layers)的饮食中。各成分的量以％(w/w)表示。L2a蛋白酶在饮食中的浓度为100mg蛋白酶酶蛋白每kg饮食。
表9：产卵鸡饮食
玉米     55.00
小麦     10.00
燕麦     7.50
大豆     20.00
石灰石     7.50
表8的预混物     1.00
序列表
<110>诺维信公司(Novozymes A/S)
<120>蛋白酶
<130>10644.204-WO
<160>27
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1146
<212>DNA
<213>达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1143)
<220>
<221>sig_肽
<222>(1)..(87)
<220>
<221>mat_肽
<222>(568)..(1143)
<400>1
atg cga ccc tcc ccc  gct atc tcc gct atc  ggc acc ggc gca ctc         45
Met Arg Pro Ser Pro  Ala Ile Ser Ala Ile  Gly Thr Gly Ala Leu
                -185                 -180                 -175
gcg ttc ggt ctg gcg  ttc tcc gtg acg ccg  ggc gcc agt gcg gcg         90
Ala Phe Gly Leu Ala  Phe Ser Val Thr Pro  Gly Ala Ser Ala Ala
                -170                 -165                 -160
acc gta ccg gcc gag  cca gcg agc gag gcc  cag acg atg atg gaa         135
Thr Val Pro Ala Glu  Pro Ala Ser Glu Ala  Gln Thr Met Met Glu
                -155                 -150                 -145
gcg ctg cag aga gac  ctc ggc ctc acc ccg  ctc ggg gcc gag gag         180
Ala Leu Gln Arg Asp  Leu Gly Leu Thr Pro  Leu Gly Ala Glu Glu
                -140                 -135                 -130
ctg ctc tcg gcg cag  gaa gag gcg atc gag  acc gac gcc gag gcc         225
Leu Leu Ser Ala Gln  Glu Glu Ala Ile Glu  Thr Asp Ala Glu Ala
                -125                 -120                 -115
acc gag gcc gcg gga  gcg tcc tac ggc ggc  tcc ctg ttc gac acc         270
Thr Glu Ala Ala Gly  Ala Ser Tyr Gly Gly  Ser Leu Phe Asp Thr
                -110                 -105                 -100
gag acc ctc cag ctc acc gtg ctg gtg acc gac gcc tcg gcc gtc gag       318
Glu Thr Leu Gln Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ser Ala Val Glu
                -95                 -90                 -85
gcg gtg gag gcc acc ggc gcc gag gcc acc gtg gtc tca cac ggc gca       366
Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val Ser His Gly Ala
            -80                 -75                 -70
gag ggc ctg gcc gag gtg gtc gac gcg ctc gac gag acc ggc ggc cgg       414
Glu Gly Leu Ala Glu Val Val Asp Ala Leu Asp Glu Thr Gly Gly Arg
        -65                 -60                 -55
gaa ggg gtc gtc ggc tgg tac ccg gac gtg gag agc gac acc gtc gtg       462
Glu Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu Ser Asp Thr Val Val
    -50                 -45                 -40
gtc cag gtc gcc gag ggc gcc agc gcc gac ggc ctc atc gag gcc gcg      510
Val Gln Val Ala Glu Gly Ala Ser Ala Asp Gly Leu Ile Glu Ala Ala
-35                 -30                 -25                 -20
ggc gtg gac ccc tcc gcc gtc cgg gtg gag gag acc agt gag act ccg      558
Gly Val Asp Pro Ser Ala Val Arg Val Glu Glu Thr Ser Glu Thr Pro
                -15                 -10                 -5
cgc ctg tac gcc gac atc gtc ggc ggc gag gcg tac tac atg ggc ggc      606
Arg Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly
        -1  1               5                   10
gga cgc tgc tcg gtc ggg ttc gcc gtg acc gac ggc tcc ggc gcg ggc      654
Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Gly Ser Gly Ala Gly
    15                  20                  25
ggc ttc gtg acg gcg ggc cac tgc ggc acc gtc ggc acc ggc gcc gag      702
Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Ala Glu
30                  35                  40                  45
agc tcc gac ggc agc ggc tcc gga acc ttc cag gag tcc gtc ttc ccg      750
Ser Ser Asp Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Gln Glu Ser Val Phe Pro
                50                  55                  60
ggc agc gac ggc gcc ttc gtc gcg gcc acc tcc aac tgg aac gtg acc      798
Gly Ser Asp Gly Ala Phe Val Ala Ala Thr Ser Asn Trp Asn Val Thr
            65                  70                  75
aac ctg gtc agc cgg tac gac tcc ggc agc ccc cag gcg gtg tcg ggt      846
Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Gln Ala Val Ser Gly
        80                  85                  90
tcc agc cag gcc ccg gag ggc tcg gcg gtg tgc cgc tcc ggc tcc acc      894
Ser Ser Gln Ala Pro Glu Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr
    95                  100                 105
acc ggc tgg cac tgc ggg acc atc gag gcc cgc ggc cag acg gtg aac      942
Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Val Asn
110                 115                 120                 125
tac ccg cag ggc acg gtc cag gac ctg acc cgg acg gac gtg tgc gcc      990
Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asp Leu Thr Arg Thr Asp Val Cys Ala
                130                 135                 140
gag ccc ggt gac tcc ggc ggc tcg ttc atc gcc ggt tcg cag gcc cag      1038
Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser Gln Ala Gln
            145                 150                 155
ggc gtc acc tcc ggc ggc tcg ggc aac tgc acc tcc ggc ggc acg acc      1086
Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly Thr Thr
        160                 165                 170
tac tac cag gag gtc act ccc ctg ctg agc agc tgg ggg ctg tcc ctg      1134
Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Leu Leu Ser Ser Trp Gly Leu Ser Leu
    175                 180                 185
gtg acc ggt tag                                                      1146
Val Thr Gly
190
<210>2
<211>381
<212>PRT
<213>达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235
<400>2
Met Arg Pro Ser Pro  Ala Ile Ser Ala Ile  Gly Thr Gly Ala Leu
                -185                 -180                 -175
Ala Phe Gly Leu Ala  Phe Ser Val Thr Pro  Gly Ala Ser Ala Ala
                -170                 -165                 -160
Thr Val Pro Ala Glu  Pro Ala Ser Glu Ala  Gln Thr Met Met Glu
                -155                 -150                 -145
Ala Leu Gln Arg Asp  Leu Gly Leu Thr Pro  Leu Gly Ala Glu Glu
                -140                 -135                 -130
Leu Leu Ser Ala Gln  Glu Glu Ala Ile Glu  Thr Asp Ala Glu Ala
                -125                 -120                 -115
Thr Glu Ala Ala Gly  Ala Ser Tyr Gly Gly  Ser Leu Phe Asp Thr
                -110                 -105                 -100
Glu Thr Leu Gln Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ser Ala Val Glu
                95                  -90                 -85
Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val Ser His Gly Ala
            -80                 -75                 -70
Glu Gly Leu Ala Glu Val Val Asp Ala Leu Asp Glu Thr Gly Gly Arg
        -65                 -60                 -55
Glu Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu Ser Asp Thr Val Val
    -50                 -45                 40
Val Gln Val Ala Glu Gly Ala Ser Ala Asp Gly Leu Ile Glu Ala Ala
-35                 30                  -25                 -20
Gly Val Asp Pro Ser Ala Val Arg Val Glu Glu Thr Ser Glu Thr Pro
                -15                 10                  -5
Arg Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly
        -1  1               5                   10
Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Gly Ser Gly Ala Gly
    15                  20                  25
Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Ala Glu
30                  35                  40                  45
Ser Ser Asp Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Gln Glu Ser Val Phe Pro
                50                  55                  60
Gly Ser Asp Gly Ala Phe Val Ala Ala Thr Ser Asn Trp Asn Val Thr
             65                 70                  75
Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asp Ser Gly Sar Pro Gln Ala Val Ser Gly
        80                  85                  90
Ser Ser Gln Ala Pro Glu Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr
    95                  100                 105
Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Val Asn
110                 115                 120                 125
Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asp Leu Thr Arg Thr Asp Val Cys Ala
                130                 135                 140
Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser Gln Ala Gln
            145                 150                 155
Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly Thr Thr
        160                 165                 170
Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Leu Leu Ser Ser Trp Gly Leu Ser Leu
    175                 180                 185
Val Thr Gly
190
<210>3
<211>1152
<212>DNA
<213>Nocardiopsis prasina DSM 15649
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1149)
<220>
<221>sig_肽
<222>(1)..(87)
<220>
<221>mat_肽
<222>(574)..(1149)
<400>3
atg cga  ccc tcc ccc gtc atc  tcc gcg atc ggc acg  gga gca ctg        45
Met Arg  Pro Ser Pro Val Ile  Ser Ala Ile Gly Thr  Gly Ala Leu
    -190                 -185                 -180
gcc ttc  ggg ctc gcg ctc tcg  gtc gcg ccc ggc gcc  tcc gcc gtc        90
Ala Phe  Gly Leu Ala Leu Ser  Val Ala Pro Gly Ala  Ser Ala Val
    -175                 -170                 -165
acc gca  ccc acc gag ccc gcg  ccc cag ggc gag gcg  gcc acc atg        135
Thr Ala  Pro Thr Glu Pro Ala  Pro Gln Gly Glu Ala  Ala Thr Met
    -160                 -155                 -150
cag gaa  gcg ctt gag agg gac  ttc ggc ctc acc ccg  ttc gag gcc        180
Gln Glu  Ala Leu Glu Arg Asp  Phe Gly Leu Thr Pro  Phe Glu Ala
    -145                 -140                 -135
gaa gac  ctg ctc gaa gcc cag  aat gac gct ctc ggg  atc gac acg        225
Glu Asp  Leu Leu Glu Ala Gln  Asn Asp Ala Leu Gly  Ile Asp Thr
    -130                 -125                 -120
gcg gcg  gcc aag gcc gcc ggt  gac gcc tac gcg ggc  tcc gtg ttc        270
Ala Ala  Ala Lys Ala Ala Gly  Asp Ala Tyr Ala Gly  Ser Val Phe
    115                  -110                 -105
gac acc  gac acc ctg gaa ctg acc gtc ctg ctc acg gac gcc gga gcc      318
Asp Thr  Asp Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Leu Thr Asp Ala Gly Ala
    -100                 -95                 -90
gtg tcg gac gtc gag gcc acc ggc gcc ggg acc gaa ctg gtc tcg tac       366
Val Ser Asp Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu Val Ser Tyr
-85                 -80                 -75                 -70
ggc acc gag ggc ctg gcg gag atc atg gac gag ctc gac gca gcc ggc       414
Gly Thr Glu Gly Leu Ala Glu Ile Met Asp Glu Leu Asp Ala Ala Gly
                -65                 -60                 -55
gcc cag ccg ggt gtc gtc ggc tgg tac ccg gac ctc gcc ggc gac acc       462
Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Leu Ala Gly Asp Thr
            -50                 -45                 -40
gtc gtc atc gag gcc acc gac acc tcc gag gcc cag agc ttc gtc gag       510
Val Val Ile Glu Ala Thr Asp Thr Ser Glu Ala Gln Ser Phe Val Glu
        -35                 -30                 -25
gcc gcg ggc gtg gac tcc tcc gcc gtc cag gtg gag cag acc gac gag      558
Ala Ala Gly Val Asp Ser Ser Ala Val Gln Val Glu Gln Thr Asp Glu
    -20                 -15                 -10
gcg ccg cag ctg tac gcc gac atc gtc ggc ggt gac gcc tac tac atg      606
Ala Pro Gln Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met
-5              -1  1               5                   10
ggc ggc ggg cgc tgc tcg gtc gga ttc gcg gtc acc gac agt tcc ggc      654
Gly Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Ser Ser Gly
            15                  20                  25
aac gac gga ttc gtg acg gcc ggc cac tgc ggc acg gtc ggc acc tcc      702
Asn Asp Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ser
        30                  35                  40
gcc gac agc gag gac ggc agc ggc tcc ggt gtg ttc gag gag tcc arc      750
Ala Asp Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Glu Glu Ser Ile
    45                  50                  55
ttc ccg ggc aac gac gcg gcc ttc gtc agt tcg acg tcc aac tgg acc      798
Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Ser Ser Thr Ser Asn Trp Thr
60                  65                  70                  75
gtc acc aac ctg gtc aac atg tac agc tcg ggt ggc acc cag tcc gtc      846
Val Thr Asn Leu Val Asn Met Tyr Ser Ser Gly Gly Thr Gln Ser Val
                80                  85                      90
ggc ggc tcc agc cag gcc ccg gtc ggc gcg gcc gtc tgc cgt tcc ggc      894
Gly Gly Ser Ser Gln Ala Pro Val Gly Ala Ala Val Cys Arg Ser Gly
            95                  100                     105
tcc acc acg ggc tgg cac tgc ggg tcc atc gag gcc cgc ggg cag tcg      942
Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Ser Ile Glu Ala Arg Gly Gln Ser
        110                 115                     120
gtg agc tac ccg gag ggc acc gtc acc gac atg acc cgt acc gac gtg      990
Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asp Met Thr Arg Thr Asp Val
    125                 130                     135
tgc gcc gag ccc ggc gac tcc ggc ggt tcg ttc atc gcc gac gac cag      1038
Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ala Asp Asp Gln
140                 145                 150                 155
gcc cag ggc atg acc tcg ggc ggc tcc ggc aac tgc tcc tcc ggt ggt      1086
Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ser Gly Gly
                160                 165                 170
acc acg tac tac cag gag gtc ggc ccg gcg ctg agc acc tgg aac ctc      1134
Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Gly Pro Ala Leu Ser Thr Trp Asn Leu
            175                 180                 185
agc ctc gtc acc agc tag                                              1152
Ser Leu Val Thr Ser
        190
<210>4
<211>383
<212>PRT
<213>Nocardiopsis prasina DSM 15649
<400>4
Met Arg  Pro Ser Pro Val Ile  Ser Ala Ile Gly Thr  Gly Ala Leu
    -190                 -185                 -180
Ala Phe  Gly Leu Ala Leu Ser  Val Ala Pro Gly Ala  Ser Ala Val
    -175                 -170                 -165
Thr Ala  Pro Thr Glu Pro Ala  Pro Gln Gly Glu Ala  Ala Thr Met
    -160                 -155                 -150
Gln Glu  Ala Leu Glu Arg Asp  Phe Gly Leu Thr Pro  Phe Glu Ala
    -145                 -140                 -135
Glu Asp  Leu Leu Glu Ala Gln  Asn Asp Ala Leu Gly  Ile Asp Thr
    -130                 -125                 -120
Ala Ala  Ala Lys Ala Ala Gly  Asp Ala Tyr Ala Gly  Ser Val Phe
    -115                 -110                 -105
Asp Thr  Asp Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Leu Thr Asp Ala Gly Ala
    -100                 -95                 -90
Val Ser Asp Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu Val Ser Tyr
-85                 -80                 -75                 -70
Gly Thr Glu Gly Leu Ala Glu Ile Met Asp Glu Leu Asp Ala Ala Gly
                -65                 -60                 -55
Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Leu Ala Gly Asp Thr
            -50                 -45                 -40
Val Val Ile Glu Ala Thr Asp Thr Ser Glu Ala Gln Ser Phe Val Glu
        -35                 -30                 -25
Ala Ala Gly Val Asp Ser Ser Ala Val Gln Val Glu Gln Thr Asp Glu
   -20                  -15                  -10
Ala Pro Gln Leu Tyr Ala Asp lle Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met
-5              -1  1               5                   10
Gly Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Ser Ser Gly
            15                  20                  25
Asn Asp Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ser
        30                  35                  40
Ala Asp Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Glu Glu Ser Ile
    45                  50                  55
Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Ser Ser Thr Ser Asn Trp Thr
60                  65                  70                  75
Val Thr Asn Leu Val Asn Met Tyr Ser Ser Gly Gly Thr Gln Ser Val
                80                  85                  90
Gly Gly Ser Ser Gln Ala Pro Val Gly Ala Ala Val Cys Arg Ser Gly
            95                  100                 105
Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Ser Ile Glu Ala Arg Gly Gln Ser
        110                 115                 120
Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asp Met Thr Arg Thr Asp Val
    125                 130                 135
Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ala Asp Asp Gln
140                 145                 150                 155
Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ser Gly Gly
                160                 165                 170
Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Gly Pro Ala Leu Ser Thr Trp Asn Leu
            175                 180                 185
Ser Leu Val Thr Ser
        190
<210>5
<211>1152
<212>DNA
<213>Nocardiopsis prasina DSM 14010
<220>
<221>CDS
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<220>
<221>sig_肽
<222>(1)..(87)
<220>
<22l>mat_肽
<222>(574)..(1149)
<400>5
atg cga  ccc tcc ccc gtc atc  tcc gcg atc ggc acg  gga gcg ctg        45
Met Arg  Pro Ser Pro Val Ile  Ser Ala Ile Gly Thr  Gly Ala Leu
    -190                 -185                 -180
gcc ttc  ggg ctc gcg ctc tcg  gtc gct ccc ggc gcc  tcc gcc gtg        90
Ala Phe  Gly Leu Ala Leu Ser  Val Ala Pro Gly Ala  Ser Ala Val
    -175                 -170                 -165
acc gcc  ccc gcc gag ccc tcg  ccc cag ggc gag gcg  acc acc atg        135
Thr Ala  Pro Ala Glu Pro Ser  Pro Gln Gly Glu Ala  Thr Thr Met
    -160                 -155                 -150
cag gaa  gcg ctt gag agg gac  ttc ggc ctc acc ccg  ttc gag gcc        180
Gln Glu  Ala Leu Glu Arg Asp  Phe Gly Leu Thr Pro  Phe Glu Ala
    -145                 -140                 -135
gac gac  ctg ctc gaa gcc cag  aag gag gcc ctc ggg  atc gac acg        225
Asp Asp  Leu Leu Glu Ala Gln  Lys Glu Ala Leu Gly  Ile Asp Thr
    -130                 -125                 -120
gcg gcg  gcc gag gcc gcc ggc  gac gcc tac gcg ggc  tcc gtg ttc        270
Ala Ala  Ala Glu Ala Ala Gly  Asp Ala Tyr Ala Gly  Ser Val Phe
    -115                 -110                 -105
gac acc  gac acc ctg gaa ctg acc gtc ctg ctc acg gac ggc ggc ccg      318
Asp Thr  Asp Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Leu Thr Asp Gly Gly Pro
    -100                 -95                 -90
gcg tcg gac gtc gag gcc gcc ggc gcc gag acc tcg gtg gtc tcc cac       366
Ala Ser Asp Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Thr Ser Val Val Ser His
-85                 -80                 -75                 -70
ggc acc gac ggc ctg gcg gcg atc atg gac gag ctc gac gcg gtc ggc       414
Gly Thr Asp Gly Leu Ala Ala Ile Net Asp Glu Leu Asp Ala Val Gly
                -65                 -60                 -55
gcc cag ccg ggt gtc gtc ggc tgg tac ccc gac ctc gcc agc gac acg       462
Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Leu Ala Ser Asp Thr
            -50                 -45                 -40
gtg gtc gtc gag gcc acc gac gcg tcc gac gcc cag ggc ttc atc gag       510
Val Val Val Glu Ala Thr Asp Ala Ser Asp Ala Gln Gly Phe Ile Glu
        -35                 -30                 -25
gcc gcc ggc gtg gac tcc tcc gcc gtc cag gtg gag gag acc gac gag       558
Ala Ala Glv Val Asp Ser Ser Ala Val Gln Val Glu Glu Thr Asp Glu
    -20                 -15                 -10
tcg ccc gag ctg tac gcc gac atc gtc ggc ggc gac gcc tac tac atg       606
Ser Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met
-5              -1  1               5                   10
ggc ggc gga cgc tgc tcg gtg ggc ttc gcg gcc acc gac agc gcg ggc       654
Gly Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asp Ser Ala Gly
            15                  20                  25
aac gac gga ttc gtg acg gcc ggc cac tgc ggc acc gtc ggc acc tcc       702
Asn Asp Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ser
        30                  35                  40
gcc gac agc gag gac ggc agc ggc tcc ggt gtg itc gag gag tcg atc       750
Ala Asp Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Glu Glu Ser Ile
    45                  50                  55
ttc ccg ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgg tcc acg tcc aac tgg acc       798
Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Ser Thr Ser Asn Trp Thr
60                  65                  70                  75
gtc acc aac ctg gtc aac atg tac agc tcc ggc ggc acc cag tcc gtc       846
ValThr Asn Leu Val Asn Met Tyr Ser Ser Gly Gly Thr Gln Ser Val
               80                  85                  90
ggc ggc tcc acc cag gcc ccg gtc ggc gcg gcc gtg tgc cgc tcc ggt       894
Gly Gly Ser Thr Gln Ala Pro Val Gly Ala Ala Val Cys Arg Ser Gly
            95                  100                 105
tcc acc acg ggc tgg cac tgc ggc acc atc gag gcc cga ggc cag tcg       942
Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Ser
            110                 115                 120
gtg agc tac ccg gag ggc acc gtc aac gac atg acc cgg acc aac gtg       990
Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Asn Asp Met Thr Arg Thr Asn Val
    125                 130                 135
tgc gcc gag ccc ggc gac tcc ggc ggt tcg ttc atc tcc gac gac cag       1038
Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Asp Asp Gln
140                 145                 150                 155
gcc cag ggc atg acc tcg ggc ggc tcc ggc aac tgc acc tcc ggt ggt       1086
Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly
                160                 165                 170
acg acg tac tac cag gag gtc ggc ccg gcg ctg agc acc tgg aac ctc       1134
Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Gly Pro Ala Leu Ser Thr Trp Asn Leu
            175                 180                 185
agc ctc gtc acg agc tag                                               1152
Ser Leu Val Thr Ser
        190
<210>6
<211>383
<212>PRT
<213>Nocardiopsis prasina DSM 14010
<400>6
Met Arg  Pro Ser Pro Val Ile  Ser Ala Ile Gly Thr  Gly Ala Leu
    -190                 -185                 -180
Ala Phe  Gly Leu Ala Leu Ser  Val Ala Pro Gly Ala  Ser Ala Val
    -175                 -170                 -165
Thr Ala  Pro Ala Glu Pro Ser  Pro Gln Gly Glu Ala  Thr Thr Met
    -160                 -155                 -150
Gln Glu  Ala Leu Glu Arg Asp  Phe Gly Leu Thr Pro  Phe Glu Ala
    -145                 -140                 -135
Asp Asp  Leu Leu Glu Ala Gln  Lys Glu Ala Leu Gly  Ile Asp Thr
    -130                 -125                 -120
Ala Ala  Ala Glu Ala Ala Gly  Asp Ala Tyr Ala Gly  Ser Val Phe
    -115                 -110                 -105
Asp Thr  Asp Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Leu Thr Asp Gly Gly Pro
    -100                 -95                 -90
Ala Ser Asp Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Thr Ser Val Val Ser His
-85                 -80                 -75                 -70
Gly Thr Asp Gly Leu Ala Ala Ile Met Asp Glu Leu Asp Ala Val Gly
                -65                 -60                 -55
Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Leu Ala Ser Asp Thr
            -50                 -45                 -40
Val Val Val Glu Ala Thr Asp Ala Ser Asp Ala Gln Gly Phe Ile Glu
        -35                 -30                 -25
Ala Ala Gly Val Asp Ser Ser Ala Val Gln Val Glu Glu Thr Asp Glu
    -20                 -15                 -10
Ser Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met
-5              -1  1               5                   10
Gly Gly Gly Arg Cys Ser ValGly Phe Ala Ala Thr Asp Ser Ala Gly
            15                 20                  25
Asn Asp Gly Phe ValThr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ser
        30                 35                  40
Ala Asp Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Glu Glu Ser Ile
    45                  50                  55
Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Ser Thr Ser Asn Trp Thr
60                  65                  70                  75
Val Thr Asn Leu Val Asn Mer Tyr Ser Ser Gly Gly Thr Gln Ser Val
                80                  85                  90
Gly Gly Ser Thr Gln Ala Pro Val Gly Ala Ala Val Cys Arg Ser Gly
            95                  100                 105
Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Ser
        110                 115                 120
Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Asn Asp Met Thr Arg Thr Asn Val
    125                 130                 135
Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Asp Asp Gln
140                 145                 150                 155
Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly
                160                 165                 170
Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Gly Pro Ala Leu Ser Thr Trp Asn Leu
            175                 180                 185
Ser Leu Val Thr Ser
        190
<210>7
<211>1155
<212>DNA
<213>拟诺卡氏菌DSM 16424
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1152)
<220>
<221>sig_肽
<222>(1)..(87)
<220>
<221>mat_肽
<222>(586)..(1152)
<400>7
atg  aga ccc tcc acc atc  gcc tcc gcc gtc ggc  aca gga gca ctg        45
Met  Arg Pro Ser Thr Ile  Ala Ser Ala Val Gly  Thr Gly Ala Leu
-195                 -190                 -185
gcc  ttc ggt ctg gca ctg  tcc atg gcc ccc gga  gcc ctc gcg gcg        90
Ala  Phe Gly Leu Ala Leu  Ser Met Ala Pro Gly  Ala Leu Ala Ala
-180                 -175                 -170
ccc  ggc ccc gtc ccc cag  acc ccc gtc gcc gac  gac agc gcc gcc        135
Pro  Gly Pro Val Pro Gln  Thr Pro Val Ala Asp  Asp Ser Ala Ala
-165                 -160                 -155
agc  atg acc gaa gcg ctc  aag cgt gac ctc aac  ctc tcc tcg gcc        180
Ser  Met Thr Glu Ala Leu  Lys Arg Asp Leu Asn  Leu Ser Ser Ala
-150                 -145                 140
gag  gcc gag gag ctg ctc  tcg gcg cag gaa gcc  gcg atc gag acc        225
Glu  Ala Glu Glu Leu Leu  Ser Ala Gln Glu Ala  Ala Ile Glu Thr
-135                 -130                 -125
gac  gcc gag gcc gcc gag  gcc gcg gga gag gcc  tac ggc ggc tcc        270
Asp  Ala Glu Ala Ala Glu  Ala Ala Gly Glu Ala  Tyr Gly Gly Ser
-120                 -115                 -110
ctg  ttc gac acc gaa acc  ctc gaa ctc acc gtg ctg gtg acc gac acc     318
Leu  Phe Asp Thr Glu Thr  Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Thr
-105                 -100                 -95                 -90
acg gcc gtc gac gcg gtc gag gcc acc gga gcc gag gcc acc gtg gtc       366
Thr Ala Val Asp Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val
                -85                 -80                 -75
acc cac ggc acc gac ggc ctg gcc gag gtc gtg gag gac ctc aac agc       414
Thr His Gly Thr Asp Gly Leu Ala Glu Val Val Glu Asp Leu Asn Ser
            -70                 -65                 -60
gcc gac gcc ccg gcg ggc gtc ctc ggc tgg tac ccc gac atg gag agc       462
Ala Asp Ala Pro Ala Gly Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Met Glu Ser
        -55                 -50                 -45
gac acc gtg gtg gtc gag gtg ctg gag ggc tcc gac gcc gac gtc gcc       510
Asp Thr Val Val Val Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val Ala
    -40                 -35                 -30
gcc ctg ctc gcc gac gcc ggc gtg gac gcc tcc gcc gtc cgg gtg gag       558
Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Arg Val Glu
-25                 20                  -15                 -10
gag gcg gag gag gtc ccg cag gtc tac gcc aac atc atc ggc ggc ctg       606
Glu Ala Glu Glu Val Pro Gln Val Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu
                -5              -1  1               5
gcc tac acc atg ggc gga cgc tgc tcc gtc ggc ttc gcg gcg acc aac       654
Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn
            10              15                  20
agc gcc gga cag ccc ggt ttc gtg acg gcg ggc cac tgc ggc acc gtc      702
Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val
    25                  30                  35
ggc acc gcc gtg acc atc ggc gac ggc cgc ggc gtc ttc gag cgc tcg      750
Gly Thr Ala Val Thr Ile Gly Asp Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser
40                  45                  50                  55
gtc ttc ccc ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgc ggc acc tcc aac ttc      798
Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe
                60                  65                  70
acc ctg acc aac ctg gtc tcc cgc tac aac tcc ggc ggc cac cag gcg      846
Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly His Gln Ala
            75                  80                  85
gtg acc ggc acc agc cag gcc ccg gcc ggc tcg gcc gtc tgc cgc tcc      894
Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser
        90                  95                  100
ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc cgc aac cag      942
Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln
    105                 110                 115
acc gtg cgc tac ccg cag ggc acc gtc aac gcg ctc acc cgc acc aac      990
Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Asn Ala Leu Thr Arg Thr Asn
120                 125                 130                 135
gtg tgc gcc gag ccc ggt gac tcc ggc ggc tcg ttc atc tcc ggc tcg      1038
Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser
                140                 145                 150
cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgc tcc ttc ggc      1086
Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Phe Gly
            155                 160                 165
ggc acg acc tac tac cag gag gtc gcc ccg atg atc aac tcc tgg ggc      1134
Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Ala Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly
        170                 175                 180
gtt cgc atc cgc acc agc tga                                          1155
Val Arg Ile Arg Thr Ser
    185
<210>8
<211>384
<212>PRT
<213>拟诺卡氏菌DSM 16424
<400>8
Met  Arg Pro Ser Thr Ile  Ala Ser Ala Val Gly  Thr Gly Ala Leu
-195                 -190                 -185
Ala  Phe Gly Leu Ala Leu  Ser Met Ala Pro Gly  Ala Leu Ala Ala
-180                 -175                 -170
Pro  Gly Pro Val Pro Gln  Thr Pro Val Ala Asp  Asp Ser Ala Ala
-165                 -160                 -155
Ser  Met Thr Glu Ala Leu  Lys Arg Asp Leu Asn  Leu Ser Ser Ala
-150                 -145                 -140
Glu  Ala Glu Glu Leu Leu  Ser Ala Gln Glu Ala  Ala Ile Glu Thr
-135                 -130                 -125
Asp  Ala Glu Ala Ala Glu  Ala Ala Gly Glu Ala  Tyr Gly Gly Ser
-120                 -115                 -110
Leu  Phe Asp Thr Glu Thr  Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Thr
-105                 -100                 -95                 -90
Thr Ala Val Asp Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val
                -85                 -80                 -75
Thr His Gly Thr Asp Gly Leu Ala Glu Val Val Glu Asp Leu Asn Ser
            -70                 -65                 -60
Ala Asp Ala Pro Ala Gly Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Met Glu Ser
        -55                 -50                 -45
Asp Thr Val Val Val Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val Ala
    -40                 -35                 -30
Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Arg Val Glu
25                  -20                 -15                 -10
Glu Ala Glu Glu Val Pro Gln Val Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu
                -5                  -11                 5
Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn
        10                  15                  20
Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val
    25                  30                  35
Gly Thr Ala Val Thr Ile Gly Asp Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser
40                  45                  50                  55
Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe
                60                  65                  70
Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly His Gln Ala
            75                  80                  85
Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser
        90                  95                  100
Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln
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Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Asn Ala Leu Thr Arg Thr Asn
120                 125                 130                 135
Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser
                140                 145                 150
Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Phe Gly
            155                 160                 165
Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Ala Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly
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Val Arg Ile Arg Thr Ser
    185
<2l0>9
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<212>DNA
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<220>
<221>CDS
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 <220>
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 <222>(1)..(87)
 <220>
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 <222>(586)..(1149)
 <400>9
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 gcc  ttc ggc ctg gct ctg  ggc act tcc ccc gcg  gcc atc gcc gcc        90
 Ala  Phe Gly Leu Ala Leu  Gly Thr Ser Pro Ala  Ala Ile Ala Ala
 -180                 -175                 -170
 ccc  gcc ccc cag tcc ccc  gac acc gaa acg cag  gcc gag gcc gtc        135
 Pro  Ala Pro Gln Ser Pro  Asp Thr Glu Thr Gln  Ala Glu Ala Val
 -165                 -160                 -155
 acc  atg gcc gaa gcc ctc  caa cgc gat ctc ggt  ctg tcc tcc tcc        180
 Thr  Met Ala Glu Ala Leu  Gln Arg Asp Leu Gly  Leu Ser Ser Ser
 150                  -145                 -140
 gag  gcc acc gaa ctc ctc  gcc gca cag gcc gag  gcg ttc gag gtc        225
 Glu  Ala Thr Glu Leu Leu  Ala Ala Gln Ala Glu  Ala Phe Glu Val
 -135                 -130                 -125
 gac  gag gcc gcc acc gag  gcc gcc gcc gac gcc  tac ggc ggc tcc        270
 Asp  Glu Ala Ala Thr Glu  Ala Ala Ala Asp Ala  Tyr Gly Gly Ser
 -120                 -115                 -110
 ctc  ttc gac acc gac agc  ctc gaa ctg acc gtg ctg gtc acc gac agc     318
 Leu  Phe Asp Thr Asp Ser  Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ser
 -105                 -100                 -95                 -90
 gcc gcc gtc gac gcg gtc gag gcc acc ggc gcc aag gcc gag gtc gtc       366
 Ala Ala Val Asp Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Lys Ala Glu Val Val
                 -85                 -80                 -75
 gac cac ggt atc gag ggc ctc gag gag atc gtc gac gaa ctc aac gag       414
 Asp His Gly Ile Glu Gly Leu Glu Glu lle Val Asp Glu Leu Asn Glu
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 tcc aac gcc aag tcg ggc gtc gtc ggt tgg tac ccc gac gtg gcc ggt       462
 Ser Asn Ala Lys Ser Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly
         -55                 -50                 -45
 gac acg gtc gtc ctg gag gtc atg gaa ggc tcc gag gcc gac gtg gac       510
 Asp Thr Val Val Leu Glu Val Met Glu Gly Ser Glu Ala Asp Val Asp
      -40                 -35                 -30
 gcc ctg ctc gcc gag acc ggg gtc gac gcc gcc gac gtc acg gtg gag       558
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 acc acc acc gag cag ccc gag ctc tac gcc gac atc atc ggt ggc ctg       606
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 Ser Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Val
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ggc acc ggc gtc acc atc ggt aac ggc cgg ggc gtc ttc gag cgt tcc      750
Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser
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atc ttc ccg ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgt ggc acg tcc aac ttc      798
Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe
                60                  65                  70
acc ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac aac tcc ggc ggc tac gcc acg      846
Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Ala Thr
            75                  80                  85
gtg tcc ggg tcc tcc gcg gcc ccg atc ggc tcc cag gtg tgc cgc tcc      894
Val Ser Gly Ser Ser Ala Ala Pro Ile Gly Ser Gln Val Cys Arg Ser
        90                  95                  100
ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc cgc aac cag      942
Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln
    105                 110                 115
acg gtg cgc tac ccg cag ggc acc gtc cag gcc ctg acc cgc acc agc      990
Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Ala Leu Thr Arg Thr Ser
120                 125                 130                 135
gtg tgc gcc gag ccc ggt gac tcc ggt ggt tcc ttc atc tcc ggc agc      1038
Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser
                140                 145                 150
cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggt ggc tcg ggc aac tgc cgc acc ggt      1086
Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly
            155                 160                 165
ggc acg acc tac tac cag gag gtc aac ccc atg ctc aac agc tgg ggc      1134
Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Asn Ser Trp Gly
        170                 175                 180
ctg cgt ctg cgc acc tga                                              1152
Leu Arg Leu Arg Thr
    185
<210>10
<211>383
<212>PRT
<213>嗜碱拟诺卡氏菌DSM 44657
<400>10
Met  Arg Pro Ser Pro Val  Val Ser Ala Ile Gly  Thr Gly Ala Leu
-195                 190                  -185
Ala  Phe Gly Leu Ala Leu  Gly Thr Ser Pro Ala  Ala Ile Ala Ala
-180                 -175                 170
Pro  Ala Pro Gln Ser Pro  Asp Thr Glu Thr Gln  Ala Glu Ala Val
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Thr  Met Ala Glu Ala Leu  Gln Arg Asp Leu Gly  Leu Ser Ser Ser
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Glu  Ala Thr Glu Leu Leu  Ala Ala Gln Ala Glu  Ala Phe Glu Val
-135                 -130                 -125
Asp  Glu Ala Ala Thr Glu  Ala Ala Ala Asp Ala  Tyr Gly Gly Ser
-120                 -115                 -110
Leu  Phe Asp Thr Asp Ser  Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ser
-105                -100                -95                  -90
Ala Ala Val Asp Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Lys Ala Glu Val Val
                -85                 -80                 -75
Asp His Gly Ile Glu Gly Leu Glu Glu Ile Val Asp Glu Leu Asn Glu
            -70                 -65                 -60
Ser Asn Ala Lys Ser Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly
        -55                 -50                 -45
Asp Thr Val Val Leu Glu Val Met Glu Gly Ser Glu Ala Asp Val Asp
    -40                 -35                 -30
Ala Leu Leu Ala Glu Thr Gly Val Asp Ala Ala Asp Val Thr Val Glu
-25                 -20                 -15                 -10
Thr Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu
                -5              -1  1               5
Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn
        10                  15                  20
Ser Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Val
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Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly ValPhe Glu Arg Ser
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Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe
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Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Ala Thr
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Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln
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Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Ala Leu Thr Arg Thr Ser
120                 125                 130                 135
Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser
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Leu Arg Leu Arg Thr
    185
<210>11
<211>1155
<212>DNA
<213>卢森坦类诺卡氏菌DSM 44048
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1152)
<220>
<221>sig_肽
<222>(1)..(87)
<220>
<221>mat_肽
<222>(586)..(1152)
<400>11
atg  cga ccc tcc ccc gtt  atc tcc gcc cta gga  acc ggc gcc ctc       45
Met  Arg Pro Ser Pro Val  Ile Ser Ala Leu Gly  Thr Gly Ala Leu
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Ala  Phe Gly Leu Val Ile  Thr Met Ala Pro Gly  Val Asn Ala Gly
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Thr  Val Pro Thr Pro Gln  Ala Pro Val Pro Asp  Asp Glu Ala Thr
-165                 -160                 -155
acc  atg ctc gaa gcc atg  gag agg gat ctc gac  ctc acc ccg ttc       180
Thr  Met Leu Glu Ala Met  Glu Arg Asp Leu Asp  Leu Thr Pro Phe
-150                 -145                 -140
gag  gcc gag gaa ctc ttc  gag gca cag gaa gag  gcc atc gac ctc       225
Glu  Ala Glu Glu Leu Phe  Glu Ala Gln Glu Glu  Ala Ile Asp Leu
-135                 -130                 -125
gac  gag gag gcc acc gaa  gcg gcc ggt gcg gcc  tac ggc ggt tcg       270
Asp  Glu Glu Ala Thr Glu  Ala Ala Gly Ala Ala  Tyr Gly Gly Ser
120                  -115                 -110
ctc  ttc gac acc gaa acc  cac gaa ctc acc gtc ctg gtg acc gac gtc    318
Leu  Phe Asp Thr Glu Thr  His Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Val
-105                 -100                 -95                 -90
gac gcg gtc gag gcc gtg gag gcc acc gga gcc gcc gcc gag gtc gtc      366
Asp Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Ala Ala Glu Val Val
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tcc cac ggc tcc gac ggt ctg gcc gac atc gtc gag gac ctc aac gcc      414
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Asp Ser Val Val Val Glu Val Val Glu Gly Ser Asp Val Asp Val Asp
   -40                 -35                 -30
tcc atc gtc gag ggc acg ggc gtc gac ccg gcg gtc atc gag gtc cag      558
Ser Ile Val Glu Gly Thr Gly Val Asp Pro Ala Val Ile Glu Val Gln
-25                 -20                 -15                 -10
gag gtc tcc gaa cag cct cag acc tac gcc aac atc atc ggc ggc ctg      606
Glu Val Ser Glu Gln Pro Gln Thr Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu
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       10                  15                  20
acc aac agc tcc ggc cag ccg ggc ttc gtc acg gcg ggc cac tgc ggc      702
Thr Asn Ser Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly
   25                  30                  35
acc gtc ggc acc ggc gtc acc atc ggc aac ggc cgc ggc acc ttc gag      750
Thr Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Thr Phe Glu
40                  45                  50                  55
cgc tcc gtg ttc ccc ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cga ggc acg tcc      798
Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser
                60                  65                  70
aac ttc acg ctg tac aac ctc gtc tac cgc tac agc ggc tac cag acc      846
Asn Phe Thr Leu Tyr Asn Leu Val Tyr Arg Tyr Ser Gly Tyr Gln Thr
            75                  80                  85
gtg acg ggc agc aac gcc gcc ccg atc ggc tcg tcc atc tgc cgt tcc      894
Val Thr Gly Ser Asn Ala Ala Pro Ile Gly Ser Ser Ile Cys Arg Ser
        90                  95                  100
ggt tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc cgc aac cag      942
Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln
    105                 110                 115
acc gtc cgg tac ccg cag ggc acc gtc tac tac ctg acc cgt acc aac      990
Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Thr Asn
120                 125                 130                 135
gtg tgc gcc gag ccc ggc gac tcc gga ggc tcc ttc atc tcc gga acg      1038
Val Cvs Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Thr
                140                 145                 150
cag gcc cag ggc atg acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgc agc agc ggt      1086
Gln Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ser Gly
            155                 160                 165
ggc acc acc ttc tac cag gag gtg gac ccg gtg gag agc gcc tgg ggc      1134
Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Asp Pro Val Glu Ser Ala Trp Gly
        170                 175                 180
gtg cga ctg cgc acc agc tag                                          1155
Val Arg Leu Arg Thr Ser
    185
<210>12
<211>384
<212>PRT
<213>卢森坦类诺卡氏菌DSM 44048
<400>12
Met  Arg Pro Ser Pro Val  Ile Ser Ala Leu Gly  Thr Gly Ala Leu
-195                 -190                 -185
Ala  Phe Gly Leu Val Ile  Thr Met Ala Pro Gly  Val Asn Ala Gly
-180                 -175                 -170
Thr  Val Pro Thr Pro Gln  Ala Pro Val Pro Asp  Asp Glu Ala Thr
-165                 -160                 -155
Thr  Met Leu Glu Ala Met  Glu Arg Asp Leu Asp  Leu Thr Pro Phe
-150                 -145                 -140
Glu  Ala Glu Glu Leu Phe  Glu Ala Gln Glu Glu  Ala Ile Asp Leu
-135                 -130                 -125
Asp  Glu Glu Ala Thr Glu  Ala Ala Gly Ala Ala  Tyr Gly Gly Ser
-120                 -115                 -110
Leu  Phe Asp Thr Glu Thr  His Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Val
-105                 -100                 -95                 -90
Asp Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Ala Ala Glu Val Val
                -85                 -80                 -75
Ser His Gly Ser Asp Gly Leu Ala Asp Ile Val Glu Asp Leu Asn Ala
            -70                 -65                 -60
Thr Asp Ala Gly Ser Glu Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Thr Ser
        -55                 -50                 -45
Asp Ser Val Val Val Glu Val Val Glu Gly Ser Asp Val Asp Val Asp
        -40                 -35                 -30
Ser Ile Val Glu Gly Thr Gly Val Asp Pro Ala Val Ile Glu Val Gln
    -25                 -20                 -15             -10
Glu Val Ser Glu Gln Pro Gln Thr Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu
                    -5          -1  1               5
Ala Tyr Tyr Met Ser Ser Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Pro Ala
        10                  15                  20
Thr Asn Ser Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly
    25                  30                  35
Thr Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Thr Phe Glu
40                  45                  50                  55
Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser
                60                  65                  70
Asn Phe Thr Leu Tyr Asn Leu Val Tyr Arg Tyr Ser Gly Tyr Gln Thr
            75                  80                  85
Val Thr Gly Ser Asn Ala Ala Pro Ile Gly Ser Ser Ile Cys Arg Ser
        90                  95                  100
Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln
    105                 110                 1l5
Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Thr Asn
120                 125                 130                 135
Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Thr
                140                 145                 150
Gln Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ser Gly
            155                 160                 165
Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Asp Pro Val Glu Ser Ala Trp Gly
        170                 175                 180
Val Arg Leu Arg Thr Ser
    185
<210>13
<211>81
<212>DNA
<213>Bacillus clausii
<220>
<221>sig_肽
<222>(1)..(81)
<400>13
atgaagaaac cgttggggaa aattgtcgca agcaccgcac tactcatttc tgttgctttt    60
agttcatcga tcgcatcggc t                                              81
<210>14
<211>49
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>14
gcttttagtt catcgatcgc atcggctgcg accgtaccgg ccgagccag 49
<210>15
<211>46
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>15
ggagcggatt gaacatgcga ttactaaccg gtcaccaggg acagcc 46
<210>16
<211>40
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>16
gttcatcgat cgcatcggct gtcaccgcac ccaccgagcc 40
<210>17
<211>45
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>17
ggagcggatt gaacatgcga ttagctggtg acgaggctga ggttc 45
<210>18
<211>38
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>18
gttcatcgat cgcatcggct gtgaccgccc ccgccgag    38
<210>19
<211>45
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>19
ggagcggatt gaacatgcga ttagctcgtg acgaggctga ggttc 45
<210>20
<211>41
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>20
gttcatcgat cgcatcggct gcgcccggcc ccgtccccca g     41
<210>21
<211>41
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>21
ggagcggatt gaacatgcga tcagctggtg cggatgcgaa c     41
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>22
gttcatcgat cgcatcggct gcccccgccc cccagtc          37
<210>23
<211>44
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>23
ggagcggatt gaacatgcga ttaggtgcgc agacgcaggc ccca  44
<210>24
<211>42
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>24
gttcatcgat cgcatcggct ggaaccgtac ccacccccca gg    42
<210>25
<211>41
<212>DNA
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>25
ggagcggatt gaacatgcga ttagctggtg cgcagtcgca c 41
<210>26
<211>9
<212>PRT
<213>达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>N-末端
<400>26
Ala Asp Ile Val Gly Gly Glu Ala Tyr
1               5
<210>27
<211>10
<212>PRT
<213>拟诺卡氏菌DSM 16424
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>N-末端
<400>27
Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr
1               5                   10

Claims (20)

1.一种具有蛋白酶活性的分离多肽，其选自：
(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列与SEQ ID NO：6的1-192位氨基酸具有至少71.5％的同一性程度；
(b)由核酸序列编码的多肽，其中所述的核酸序列在非常高严紧条件下与
(i)SEQ ID NO：5的574-1149位核苷酸，
(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列，和/或
(iii)(i)或(ii)的互补链
杂交；
(c)具有SEQ ID NO：6的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸的多肽的变体；
(d)(a)或(b)的等位变体；和
(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
2.权利要求1的多肽，其包括以下蛋白酶中的任何一种：
(a)SEQ ID NO：6的1-192位氨基酸；
(b)SEQ ID NO：2的1-192位氨基酸；
(c)SEQ ID NO：4的1-192位氨基酸；或
(d)SEQ ID NO：8的1-189位氨基酸。
3.一种分离的核酸序列，其含有编码具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且该核酸序列
(a)编码权利要求22-23任一项的多肽；
(b)在非常高的严紧条件下，与
(i)SEQ ID NO：5的574-1149位核苷酸，
(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列；和/或
(iii)(i)或(ii)的互补链
杂交；和/或
(c)与SEQ ID NO：5的574-1149位核苷酸具有至少79.3％的同一性程度。
4.权利要求3的核酸序列，其含有以下编码蛋白酶的核酸序列中的任何一种：
(a)SEQ ID NO：3的574-1149位核苷酸；
(b)SEQ ID NO：5的574-1149位核苷酸；
(c)SEQ ID NO：7的586-1152位核苷酸；或
(d)SEQ ID NO：1的568-1143位核苷酸。
5.一种分离的核酸序列，其通过下述产生：
(a)将DNA在非常高的严紧条件下与
(i)SEQ ID NO：5的574-1149位核苷酸；
(ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列；或
(iii)(i)或(ii)的互补链
杂交；并且
(b)分离所述核酸序列。
6.一种核酸构建体，其含有与一个或多个控制序列可操作性相连的权利要求3-5中任一项的核酸序列，其中所述的控制序列引导多肽在适宜表达宿主中产生。
7.一种含有权利要求6的核酸构建体的重组表达载体。
8.一种含有权利要求6的核酸构建体或权利要求7的载体的重组宿主细胞。
9.一种转基因植物或植物部分，其能够表达权利要求1-2中任一项的多肽。
10.一种转基因非人动物或其产品或组成部分，其能够表达权利要求1-2中任一项的多肽。
11.一种产生权利要求1-2中任一项的多肽的方法，该方法包括：
(a)培养权利要求8的重组宿主细胞，以产生含有多肽的上清液；并且
(b)回收多肽。
12.一种产生权利要求1-2中任一项的多肽的方法，该方法包括：
(a)培养以下菌株中的任何一种：
(i)达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235，
(ii)Nocardiopsis prasina DSM 15649，
(iii)Nocardiopsis prasina DSM 14010，或
(iv)拟诺卡氏菌属的菌种DSM 16424；并且
(b)回收所述多肽。
13.权利要求1-2中任一项的至少一种蛋白酶用于如下方面的用途：
(i)动物饲料；
(ii)动物饲料添加剂；
(iii)制备动物饲料中使用的组合物；
(iv)改善动物饲料的营养价值；
(v)增加动物饲料中可消化的和/或可溶性蛋白；
(vi)增加动物饮食中蛋白质水解的程度；和/或
(vii)处理蛋白质。
14.一种改善动物饲料营养价值的方法，其中将权利要求1-2中任一项的至少一种蛋白酶添加至饲料中。
15.一种动物饲料添加剂，其含有
(a)权利要求1-2中任一项的至少一种蛋白酶；和
(b)至少一种脂溶性维生素，和/或
(c)至少一种水溶性维生素，和/或
(d)至少一种痕量矿物质。
16.权利要求15的动物饲料添加剂，其还含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
17.一种动物饲料，其具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有权利要求1-2中任一项的至少一种蛋白酶。
18.一种处理蛋白质的方法，包括将权利要求1-2中任一项的至少一种蛋白酶添加至至少一种蛋白质或蛋白质源的步骤。
19.权利要求18的方法，其中至少一种蛋白质源中包括大豆。
20.权利要求1-2中任一项的至少一种蛋白酶在洗涤剂中的用途。
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