CN106148306A - 衍生自北极假交替单胞菌pamc21717的适冷蛋白酶及其用途 - Google Patents

衍生自北极假交替单胞菌pamc21717的适冷蛋白酶及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及衍生自北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonas arctica)PAMC 21717的适冷蛋白酶或通过在大肠杆菌中表达编码适冷蛋白酶的基因获得的重组适冷蛋白酶，并且更具体地，涉及在低温下具有活性的蛋白酶的晶体，用于结晶所述蛋白酶的方法，用于制备所述蛋白酶的方法，表达所述蛋白酶的重组微生物，用于制备所述重组微生物的方法，用于制备所述重组蛋白酶的方法和所述适冷蛋白酶的用途。根据本发明的衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717的适冷蛋白酶或通过在大肠杆菌中表达编码适冷蛋白酶的基因获得的重组适冷蛋白酶在低温下显示高活性，并且甚至在高pH、各种金属离子和表面活性剂存在的情况下可靠地保持其酶活。因此，它可用于各种工业应用中。

Description

衍生自北极假交替单胞菌PAMC21717的适冷蛋白酶及其用途
技术领域
本发明涉及衍生自北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonas arctica)PAMC21717的适冷蛋白酶或通过在大肠杆菌中表达编码适冷蛋白酶的基因获得的重组适冷蛋白酶，并且更具体地，涉及在低温下显示活性的蛋白酶的晶体，用于结晶所述蛋白酶的方法，用于制备所述蛋白酶的方法，表达所述蛋白酶的重组微生物，用于制备所述重组微生物的方法，用于制备所述重组蛋白酶的方法和所述适冷蛋白酶的用途。
背景技术
蛋白酶被用于各种应用，包括药物组合物，例如用于缓解胃肠道紊乱的消化酶剂、溶血栓剂或消炎剂，和用于衣服、隐形眼镜或清洁剂的组合物以及化妆品、皮革处理剂、食物软化剂、肉增强剂(meat enhancer)、饲料或食物添加剂、油和脂肪分离剂、废水处理等。微生物产品中酶的效用已经广为人知。蛋白酶占工业酶市场的最高百分比(60％或更高)，并且其适销性越来越高。
大约25％的工业蛋白酶以去污剂在市场上销售，并且用于去污剂的蛋白酶被要求具有能够降解食物、血液或体液成分的广谱的底物特异性和碱性环境，并且应当是稳定的，这样它们在高温或低温下不会失去它们的表面活性剂活性和酶活。过去，主要采用植物来源的蛋白酶，但近年来，微生物已被频繁用于生产蛋白酶。
如果蛋白酶将被用于工业应用，那么要求它们是非常稳定的。例如，在表面活性剂存在的情况下，大多数蛋白的活性降低或完全消失，并且由于这个原因，在去污剂中所采用的蛋白酶是极其有限的。而且如果在高浓度下使用去污剂，难以预期其中含有的蛋白酶的活性。此外，诸如暴露于极端pH、暴露于重金属或氧化还原的程度的条件均强烈影响酶的活性，并因此如果这些条件超出了合适的范围，酶迅速丧失其活性。由于这个原因，为了使蛋白 酶常规用于工业应用，要求蛋白酶甚至在极端和不稳定的物理和化学条件下保持其活性。
基于丝氨酸的蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶)已被最广泛地用于去污剂工业。此类碱性蛋白酶甚至在存在表面活性剂和氧化剂的高pH条件下可靠地保持它们的活性(Gupta et al.,Appl Microbiol Biotechnol,59:15-32,2002；Haddar et al.,Bioresour Technol,100:3366-3373,2009)，并因此可用于各种工业应用中。
近年来，对冷活性酶的需要有所增加。具体地，已经将低活性蛋白酶加入去污剂，并在15℃或更低的洗涤温度保持它们的高活性。
在迄今为止所报道的关于适冷蛋白酶的文献中，有以下报道：衍生自嗜冷微生物希瓦氏菌(Shewanella)的基于丝氨酸的冷活性蛋白酶基因的克隆、酶的纯化和表征(Kulakova et al.,Appl Environ Microbiol,65:611-617,1999)，嗜冷海洋微生物Colwellia psychrerythraea纯化、表征和测序(Huston et al.,Appl Environ Microbiol,70:3321-3328,2004)，衍生自科尔韦尔氏菌(Colwellia sp.)的基于丝氨酸的适冷蛋白酶的纯化和表征(Wang et al.,Biotechnol Lett,27:1195-1198,2005)等。
因此，本发明人已经做了广泛的努力通过采用分离自南极海洋沉积物的北极假交替单胞菌PAMC 21717产生的适冷和碱性的基于丝氨酸蛋白酶来开发用于各种工业应用的蛋白酶。作为结果，本发明人已经分离了在0至60℃和pH 5.0至11.0的条件下显示酶活的适冷蛋白酶，然后已经鉴定了所述适冷蛋白酶的晶体结构，并已经发现所述适冷蛋白酶在相对低温下(与例如枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶相比)显示高活性，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供或是衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717的适冷蛋白酶或是通过在大肠杆菌中表达编码适冷蛋白酶的基因获得的重组适冷蛋白酶的晶体，和用于结晶所述适冷蛋白酶的方法。
本发明的另一个目的是提供用于制备所述适冷蛋白酶的方法。
本发明的又一个目的是提供表达所述适冷蛋白酶的产酶重组微生物，和用于制备所述重组微生物的方法。
本发明的另一个目的是提供采用所述重组微生物用于制备所述适冷蛋白酶的方法。
本发明的再一个目的是提供用于外科或治疗装置的消毒组合物、去污剂组合物、饲料添加剂组合物、食物添加剂组合物和纤维或皮革处理组合物，所述组合物含有作为活性成分的所述适冷蛋白酶。
为了达到上述目的，本发明提供了或是衍生自北极假交替单胞菌PAMC21717的适冷蛋白酶或是通过在大肠杆菌中表达编码适冷蛋白酶的基因获得的重组适冷蛋白酶的晶体，其中所述适冷蛋白酶的晶体具有以下特点：(i)具有枯草杆菌蛋白酶样折叠；(ii)具有四个钙离子和两个二硫键(Cys439-Cys442和Cys207-Cys254)；(iii)形成由十个α-螺旋组成的三维结构，所述十个α-螺旋环绕中央6个β-链(β-strand)和两个β-链；以及(iv)具有P212121空间群的结晶结构，所述P212121空间群具有晶胞参数 α＝β＝γ90°或者表1中所列的2374个原子坐标(包括4个钙离子)。
本发明还提供了用于结晶衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717的适冷蛋白酶或通过在大肠杆菌中表达编码适冷蛋白酶的基因获得的重组适冷蛋白酶的方法，其中所述方法包括在20℃采用含有20mM Tris-HCl(pH 8.0)和150mM NaCl的蛋白溶液和含有0.1M乙酸钠(pH 4.4)和3M氯化钠的防腐溶液进行结晶。
本发明还提供了用于制备适冷蛋白酶的方法，所述方法包括：(a)在含有脱脂牛奶、胰蛋白胨、Fe(C6H5O7)、NaCl、MgCl2、Na2SO4、CaCl2、NaHCO3和KBr的培养基中分批补料培养北极假交替单胞菌PAMC 21717以产生适冷蛋白酶(W-pro21717)；以及(b)回收所产生的适冷蛋白酶。
本发明还提供了产酶的重组微生物，其中引入含有采用SEQ ID NOs：7和8的一组引物通过PCR获得的扩增产物的重组载体。
本发明还提供了用于制备适冷蛋白酶的方法，所述方法包括：(a)在含有葡萄糖、KH2PO4、(NH4)2PO4、柠檬酸、MgSO47H2O、硫胺素、抗生素和痕量金属元素的培养基中培养上述的重组微生物；(b)表达所述重组微生物中的适冷蛋白酶成pH-稳定的分批培养物，同时当培养基的pH和DO增加时供给含有葡萄糖、酵母提取物、(NH4)2PO4、MgSO47H2O和抗生素的预定量 的培养基；以及(c)回收所表达的适冷蛋白酶。
本发明还提供了用于外科或治疗装置的消毒组合物，所述组合物含有作为活性成分的所述适冷蛋白酶或所述适冷蛋白酶的晶体。
本发明还提供了含有作为活性成分的所述适冷蛋白酶或所述适冷蛋白酶的晶体的去污剂组合物。
本发明还提供了含有作为活性成分的所述适冷蛋白酶或所述适冷蛋白酶的晶体的饲料添加剂组合物。
本发明还提供了含有作为活性成分的所述适冷蛋白酶或所述适冷蛋白酶的晶体的食物添加剂组合物。
本发明还提供了含有作为活性成分的所述适冷蛋白酶或所述适冷蛋白酶的晶体的纤维或皮革处理组合物。
附图说明
图1显示了北极假交替单胞菌PAMC 21717的培养物的酶谱分析的结果。(A)：通过酶谱对所述培养物的时间依赖性分析；以及(B)部分分离自96-hr培养物的W-Pro21717。
图2显示了作为温度和pH的函数分析W-Pro21717的活性和稳定性的结果。(A)：W-Pro21717的活性的最佳温度；(B)W-Pro21717的稳定性的最佳温度；(C)W-Pro21717的活性的最佳pH；(D)W-Pro21717的稳定性的最佳pH。
图3显示了分析W-Pro21717在金属离子和表面活性剂存在下的活性和稳定性的结果。
图4显示了采用脱脂牛奶分析W-Pro21717与市售蛋白酶的相容性的结果。
图5显示了为了检查碳和氮对培养基的优化作用在3小时的培养之后测量细胞浓度和W-Pro21717的活性的结果。(A)：碳源对含有脱脂牛奶的培养基的作用；(B)：碳源对不含有脱脂牛奶的培养基的作用(A：对照，B：葡萄糖，C：半乳糖，D：果糖，E：乳糖，F：蔗糖，G：麦芽糖，H：甘油，I：淀粉，J：纤维素)；以及(C)：氮对含有脱脂牛奶的培养基的作用(A：对照，B：蛋白胨，C：胰蛋白胨，D：酵母提取物，E：大豆蛋 白胨，F：胰蛋白酶大豆肉汤)
图6描绘了显示矿物对生产培养基的优化的作用的三维反应曲线。(A)：Fe(C6H5O7)和NaCl；(B)：Fe(C6H5O7)和Na2SO4；(C)：Fe(C6H5O7)和KCl；(D)：NaCl和Na2SO4；(E)：NaCl和KCl；以及(F)：Na2SO4和KCl。
图7显示了在分批补料培养过程中W-Pro21717的时间依赖性活性。(A)●：不含有脱脂牛奶的基本培养基，■：含有脱脂牛奶的基本培养基，▲：优化的矿物培养基；(B)◇：细胞浓度，◆：W-Pro21717的活性。
图8显示了重组蛋白酶R-Pro21717的SDS-PAGE和酶谱分析的结果。(A)：由pDOC载体表达的重组蛋白；(B)在重折叠过程中的重组蛋白；(C)重折叠之后纯化的重组蛋白酶R-Pro21717。(1至5：pDOC122、pDOC125、pDOC128、pDOC131和pDOC131洗涤后的包涵体，6：重折叠48小时后的pDOC131，7：重折叠72小时后的pDOC131，8：重折叠后通过色谱纯化的pDOC131的表达产物R-Pro21717)。
图9显示了作为温度和pH的函数分析重组R-Pro21717的活性和稳定性的的结果。(A)：R-Pro21717的活性的最佳温度；(B)R-Pro21717的稳定性的最佳温度；(C)R-Pro21717的活性的最佳pH；以及(D)R-Pro21717的稳定性的最佳pH。
图10显示了分析重组R-Pro21717在金属离子和表面活性剂存在下的活性和稳定性的结果。将R-Pro21717加入含有1mM的每种材料的标准缓冲液并然后使得R-Pro21717在冰上1小时之后，测量活性。
图11显示了具有四个钙离子键和由催化三联体组成的活性位点的适冷蛋白酶(R-Pro21717)的三维晶体结构，所述催化三联体由Asp185、His244和Ser425组成。
本发明涉及的北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonas arctica)PAMC21717，保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，该保藏机构位于韩国大田市(305-806)广域市汝城区科学路125号的韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)，保藏日期是2013年9月3日，保藏号是KCTC 12482BP。
实施本发明的最佳方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。一般地，本文所使用的命名法和实验方法是本领域公知的并且通常使用的。
在本发明中，检查了由分离自南极海洋沉积物的北极假交替单胞菌PAMC 21717所制备的适冷、碱性的基于丝氨酸的蛋白酶的三维晶体结构和活性位点，并分析了所述蛋白酶的特征。本发明中所使用的北极假交替单胞菌PAMC 21717于2013年9月3日以保藏号KCTC 12482BP被保藏。
在一个方面，本发明涉及衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717的适冷蛋白酶或是通过在大肠杆菌中表达编码适冷蛋白酶的基因获得的重组适冷蛋白酶的晶体，其中所述适冷蛋白酶的晶体具有以下特点：(i)具有枯草杆菌蛋白酶样折叠；(ii)具有四个钙离子和两个二硫键(Cys439-Cys442和Cys207-Cys254)；(iii)形成由十个α-螺旋组成的三维结构，所述十个α-螺旋环绕中央6个β-链和两个β-链；以及(iv)具有P212121空间群的结晶结构，所述P212121空间群具有晶胞参数 α＝β＝γ90°或者表1中所列的2374个原子坐标(包括4个钙离子)。
在本发明中，所述蛋白酶的晶体包括由氨基酸残基Asp185、His244和Ser425的催化三联体组成的酶活性位点。
本发明的适冷蛋白酶的三维晶体结构可以由下表1中所示的原子坐标来表示。
表 1
在表1中，A：原子(atom)；B：原子序数；C：原子名称；D：残基名称；E：链名称；F：残基序数；G：x轴信息；H：y轴信息；I：z轴信息；J：占位率；以及K：温度因子。
在另一方面，本发明涉及用于结晶衍生自北极假交替单胞菌PAMC21717的适冷蛋白酶或通过在大肠杆菌中表达编码适冷蛋白酶的基因获得的重组适冷蛋白酶的方法，其中所述方法包括在20℃采用含有20mM Tris-HCl(pH 8.0)和150mM NaCl的蛋白溶液以及含有0.1M乙酸钠(pH 4.4)和3M氯化钠的防腐溶液进行结晶。
通常采用x射线晶体学进行此结晶步骤，并且在x射线晶体学之前应当 进行多种结晶过程作为预处理步骤。在本发明的一个实施方案中，基于浓度平衡的传统方法可以被用作此结晶方法。例如，可以采用蒸发平衡法、坐滴或悬滴气相扩散法或透析法(连续或分批)。在本发明的例子中，坐滴法被用于结晶并浓缩所述适冷蛋白酶。
在又一个方面，本发明涉及用于制备适冷蛋白酶的方法，所述方法包括：(a)在含有脱脂牛奶、胰蛋白胨、Fe(C6H5O7)、NaCl、MgCl2、Na2SO4、CaCl2、NaHCO3和KBr的培养基中分批补料培养北极假交替单胞菌PAMC 21717以产生适冷蛋白酶(W-pro21717)；以及(b)回收所产生的适冷蛋白酶。
在又一个方面，本发明涉及用于制备表达适冷蛋白酶的产酶重组微生物的方法，所述方法包括：(a)用SEQ ID NOs：7和8的一组引物进行PCR以获得编码衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717的适冷蛋白酶(W-pro21717)的基因；(b)将所述基因插入重组表达载体pEXP5-CT/TOPO；以及(c)用所述重组表达载体转化宿主大肠杆菌。
如本文所使用的术语“载体”是指含有DNA序列的DNA构建体，所述DNA序列可操作性连接至能够在合适的宿主中表达所述DNA的合适的控制序列。所述载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或简单地为潜在的基因组插入物。一旦被转化入合适的宿主，载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或在某些情况下可以将其自身整合入基因组。在本说明书中，质粒和载体有时可互换使用，因为质粒是目前最常使用的载体形式。出于本发明的目的，优选采用质粒载体。可用于此目的的典型的质粒载体具有：(a)复制起点，通过它可以有效进行复制这样每个宿主细胞可以制造几百个质粒载体；(b)抗生素抗性基因，通过它可以选择转化了质粒载体的宿主细胞；以及(c)限制性酶切位点，在此可插入外源DNA片段。即便载体中不存在合适的限制性酶切位点，使用常规合成的寡核苷酸接头能够很容易地连接载体和外源DNA。
连接之后，载体应当被转化入合适的宿主细胞。可以采用Sambrook,et al.(同上)的1.82节中所述的氯化钙法很容易地进行转化。或者，也可以采用电穿孔(Neumann,et al.,EMBO J.,1:841,1982)转化此类细胞。
对于本发明的基因的过表达，可以采用本领域已知的表达载体。
本领域公知，为了提供转化的基因在宿主细胞中的表达水平，基因应当可操作地连接至能够在所选择的表达宿主中发挥功能的转录和翻译控制序列。优选地，相应的基因和表达控制序列包含于含有细菌选择性标记和复制起点的单个表达载体中。
用上述重组载体转化的宿主细胞构成本发明的另一个方面。如本文所使用的术语“转化”是指将DNA引入宿主细胞使得DNA能够或者作为染色体整合体或者作为染色体外元件复制。
当然，应该理解的是，所有载体并不同等地发挥作用来表达本发明的DNA序列。同样，所有宿主细胞对于同一表达系统并不同等地发挥作用。但是，本领域的任何技术人员可以在不偏离本发明的保护范围并且无需过度实验的情况下正确地选择载体、表达控制序列和宿主细胞。例如，在选择载体时应当考虑宿主细胞，因为载体应当可以在其中被复制。而且，应当考虑载体的复制数、控制复制数的能力和由载体编码的其它蛋白(例如抗生素标记)的表达。
本发明所使用的重组载体优选是包括在pEXP5-CT/TOPO中引入的pro21717-I基因的pDOC载体，并且更优选pDOC131。重组微生物优选大肠杆菌，如大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM101、大肠杆菌K12、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene)、大肠杆菌BL21等。
在另一个方面，本发明涉及用于制备适冷蛋白酶的方法，所述方法包括：(a)在含有葡萄糖、KH2PO4、(NH4)2PO4、柠檬酸、MgSO47H2O、硫胺素、抗生素和痕量金属元素的培养基中培养本文所述的重组微生物；(b)表达所述重组微生物中的适冷蛋白酶成pH-稳定的分批培养物，同时当培养基的pH和DO增加时供给预定量的培养基，所述培养基含有葡萄糖、酵母提取物、(NH4)2PO4、MgSO47H2O和抗生素；以及(c)回收所表达的适冷蛋白酶。
在本发明中，所述蛋白酶特征在于它在0至60℃和pH 5.0至11.0的条件下显示酶活性，并采用解折叠缓冲液(pH 8.5；8M尿素，50mM巯基乙醇和20mM Tris-HCl)、重折叠缓冲液(20mM Tris-HCl、100mM NaCl、20mM CaCl2和0.05％Tween 20)通过Sephacryl S-100柱纯化，和透析步骤。
在又一个方面，本发明涉及用于外科或治疗装置的消毒组合物、去污剂 组合物、饲料添加剂组合物、食物添加剂组合物和纤维或皮革处理组合物，所述组合物含有作为活性成分的适冷蛋白酶或适冷蛋白酶的晶体。
本发明的蛋白酶可以用作用于外科或治疗装置的消毒组合物。外科或治疗装置可以是被插入身体的医疗装置，例如内窥镜、导管等。
本发明的蛋白酶可以用作去污剂组合物。去污剂组合物可以用于各种应用，包括洗衣、餐具洗涤、隐形眼镜的洗涤、假牙的洗涤等。除了本发明的蛋白酶外，去污剂组合物可以包括其它酶组分和添加剂。本发明的去污剂组合物可以包括至少一种表面活性剂，并且表面活性剂为阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性或两性离子表面活性剂或以上两种或更多的混合物。此外，本发明的去污剂组合物还可以包括其它本领域已知的去污剂组分，例如，摩擦剂、漂白剂、表面活性剂、抗腐蚀剂、金属离子螯合剂、抗污渍复位剂、用于香料、酶和漂白剂的稳定剂、制剂助剂、光学增亮剂、泡沫促进剂、螯合剂、填充剂、织物柔软剂等。此外，本发明的去污剂组合物可以配制成例如粉末、液体等的任意便利形式。
本发明的蛋白酶可以是饲料添加剂、食物添加剂或药物组合物。所述蛋白酶可以被用于包括食物软化剂、肉增强剂、油和脂肪分离剂等的应用。此外，它可以被用作缓解胃肠道紊乱、消化异常和胃肠道手术后的异常疾病的消化酶制剂、直接作用于血栓以溶解纤维蛋白的溶血栓剂、作为体内防御系统防御外来毒性物质以去除炎性物质或坏死组织的消炎酶或者用于手术后或创伤后水肿的消炎剂。根据本发明的药物组合物包括本发明的蛋白酶混合物中的药学上可接受的载体。药物制剂是本领域公知的，并且包含所述蛋白酶的药物组合物可以由本领域技术人员容易地配制。药物组合物可以肠胃外(例如，静脉内、皮下或肌内)施用。优选地，它是静脉内施用的。药物组合物优选被以含有足够量的使得溶液等渗的盐、葡萄糖或葡聚糖的无菌水溶液的形式使用。对于口服施用，药物组合物可以被以片剂、胶囊、锭剂、含片、粉末、糖浆、酏剂、溶液或悬液的形式使用，并可以包含各种崩解剂(例如淀粉)和润滑剂。
本发明的蛋白酶可以被用作纤维或皮革处理剂，并可被用于从丝纤维去除橡胶材料、浸泡皮革等。
实施例
在下文中，将参照实施例对本发明进行更详细地说明。对本领域的普通技术人员来说显而易见的是，这些实施例是示例的目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。
实施例 1 ：衍生自北极假交替单胞菌 PAMC 21717 的蛋白酶 (W-Pro21717) 的检测
1 － 1 ：培养并检测 W-Pro21717 的生产
在含有葡萄糖的ZoBell培养基(每升，5g蛋白胨、1g酵母提取物、0.01g FePO4、750ml海水和250ml蒸馏水)中在三个温度条件(5℃、15℃和25℃)下培养北极假交替单胞菌PAMC 21717，然后在25℃培养1天。
为了测量W-Pro21717的降解活性，培养的PAMC 21717细胞在4℃以12,000xg离心30分钟，上清与含有0.65％偶氮酪蛋白底物的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.6)混合，并在25℃置1小时，然后在向其加入110mM三氯乙酸之后37℃额外反应1小时。离心反应溶液，然后通过具有0.45μm的孔径的滤器进行过滤，将滤液混合并与Folin&Ciocalteu的苯酚溶液和500mM碳酸钠溶液37℃反应30分钟。接着，在660nm基于L-酪氨酸标准曲线测量反应产物的酶活性，将25℃下1纳摩尔/min/mg的氨基酸产量定义为蛋白酶的1个活性单位。
结果显示，W-Pro21717的最大活性在15℃为2.7U/ml，在5℃为2.1U/ml，在25℃为1.4U/ml，这表明所述蛋白酶生产的最佳温度为15℃。
1 － 2 ： W-Pro21717 的酶谱分析和类型
北极假交替单胞菌PAMC 21717在15℃培养96小时，然后从细胞分离的酶蛋白在包含0.3％脱脂牛奶和1％明胶的10％的SDS-PAGE凝胶上进行电泳。PAGE凝胶与变性缓冲液(27g/L Triton X-100)反应，然后在凝胶用考马斯亮蓝染色之后，与显影缓冲液(每升蒸馏水，1.21g Tris碱、6.3gTris-HCl、11.7g NaCl、0.74g CaCl2、0.02％Brij35)反应30分钟，并通过酶谱分析检测蛋白的降解活性。
结果显示，在酶谱中发现了两个蛋白(37kDa和74kDa)其N末端含有氨基酸序列GAQNSSWH，并且所述氨基酸序列与衍生自假交替单胞菌菌种的许多丝氨酸蛋白酶的序列一致。衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717 的37kDa和74kDa蛋白被命名为“W-Pro21717”(图1)，具有更高活性的74kDa的蛋白可能是37kDa蛋白的同型二聚体。
W-Pro21717的类型通过与各种蛋白酶抑制剂反应来进行分析。
结果如下表2中所能看到的，W-Pro21717的活性被PMSF和HgCl2抑制，但不受其它半胱氨酸蛋白酶抑制剂的影响。而且，W-Pro21717的活性略微被金属蛋白酶抑制剂EDTA抑制。因此，发现二硫键对于酶活性是重要的并且W-Pro21717是基于丝氨酸的蛋白酶。
表 2
抑制剂 浓度(mM) 剩余活性(％)
无 - 100
EDTA 1 75±9
PMSF 1 40±8
HgCl2 1 23±8
碘乙酰胺 1 94±3
APMA 1 131±2
N-乙基马来酰亚胺 1 107±8
亮肽素 1 98±2
Na-对-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮 1 137±13
实施例 2 ：衍生自北极假交替单胞菌 PAMC 21717 的蛋白酶 (W-Pro21717) 的表征
2 － 1 ：在温度和 pH 条件下 W-Pro21717 的活性和稳定性
在0至60℃的温度范围内分析了W-Pro21717活性的最佳温度，并通过在50mM乙酸钠(pH 2.0－6.0)、50mM磷酸钾(pH 7.0－10.0)和50mM四硼酸钠(pH 10.0)中反应1小时分析了最佳pH。采用3μm市售蛋白酶嘉士伯枯草杆菌蛋白酶作为对照。
结果显示，W-Pro21717在30～40℃的温度显示出最高活性并且W-Pro21717活性的最佳温度为40℃(图2A)。对照枯草杆菌蛋白酶嘉士 伯(subtilisin Carlsberg)在60℃显示出最佳活性。此外，在大约0℃，W-Pro21717显示出30％的活性。
在40℃反应1小时后，W-Pro21717显示出活性降低30％(图2B)，但枯草杆菌蛋白酶嘉士伯显示出活性降低80％。因此，发现W-Pro21717是具有高的低温活性和稳定性的适冷蛋白酶。
W-Pro21717在pH 8.0－9.5显示出高活性，并且在pH9.0显示出最高活性(图2C)。此外，它在相对宽的pH范围(pH 5.0－10.0)内显示出稳定性，但在低于5.0的pH和高于10.0的pH丧失其活性(图2D)。
2 － 2 ：在金属离子和表面活性剂存在下 W-Pro21717 的活性和稳定性
为了分析金属离子和去污剂的影响，W-Pro21717与含有1mM BaCl2、CuSO4、MgSO4、CaCl2、ZnSO4、FePO4、KCl、NaCl、N2SO4、直链烷基苯磺酸钠(LAS)或SDS的标准缓冲液中冰上反应1小时。此外，采用脱脂牛奶在10℃和30℃的温度分析W-Pro21717与市售去污剂(LG Household&Health Care,韩国；含有枯草杆菌蛋白酶嘉士伯)的相容性。
结果显示，CuSO4提高了W-Pro21717的活性大约60％，Ba2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、K+和Na2+不影响W-Pro21717的活性(图3)。
此外，在一般市售去污剂的标准成分(Na2SO4和LAS)存在下W-Pro21717显示出足够的稳定性。而且，W-Pro21717与一般去污剂的相容性的测量结果表明，W-Pro21717在30℃和10℃分别显示出54.9±2.2U/mg和20.7±3.4U/mg的活性(图4)。
2 － 3 ： W-Pro21717 的底物特异性
采用5mM每种的以下7种不同的合成肽分析了W-Pro21717的底物特异性：N-琥珀酰-Ala-Ala-Val-对-硝基苯胺(AAV)、N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Leu-对硝基苯胺(AAPL)、N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺(AAA)、N-琥珀酰-Gly-Gly-Phe-对硝基苯胺(GGF)、N-琥珀酰-Thr-Leu-Val-对硝基苯胺(TLV)、N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(AAPF)和N-琥珀酰-Ala-Ala-Val-Ala-对硝基苯胺(AAVA)。W-Pro21717与含有0.83mM底物的标准缓冲液在25℃反应10分钟，然后在410nm测量其相对活性。
结果如下表3中能够看到的，W-Pro21717针对AAPF(100％)和AAPL (66.5％)显示出高活性，并且枯草杆菌蛋白酶嘉士伯也具有100％和68.3％的底物特异性，与W-Pro21717相似。
表 3 ：在 W-Pro21717 和枯草杆菌蛋白酶嘉士伯之间多种底物特异性的比较
实施例 3 ：生产衍生自北极假交替单胞菌 PAMC 21717 的适冷蛋白酶 (W-Pro21717) 的培养优化
在该实施例中，为了W-Pro21717生产的统计学优化，通过在15℃分批补料培养确定了生产衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717的W-Pro21717的最佳条件。对于碳、氮和矿物培养基的优化，采用了Plackett-Burman设计。
结果是，果糖被选为碳源，并且显示酶活性在含有脱脂牛奶的培养基中为8.0U/L和在不含有脱脂牛奶的培养基中为3.4U/L，这表明脱脂牛奶使酶活增加了2.3倍(图5A和5B)。氮源对酶活性没有显示出差异，但是胰蛋白胨被选为氮源(图5C)，并且当Fe(C6H5O7)、NaCl、Na2SO4和KCl作为矿物源含量分别为0.1、24.8、4.4和0.7g/L的时显示酶活性增加了3.4倍(图6)。
在含有10g/L脱脂牛奶、0.6g/L胰蛋白胨、0.1g/L Fe(C6H5O7)、24.8g/LNaCl、5.9g/L MgCl2、4.4g/L Na2SO4、1.8g/L CaCl2、0.16g/L NaHCO3和 0.08g/L KBr的培养基组合物中在15℃进行分批补料培养。在所述培养基中诱导的W-Pro21717的活性为53.4U/L，其至少15倍高于非优化过的培养基中的活性(图7A和7B)。
实施例 4 ：基于 W-Pro21717 的遗传信息的重组蛋白酶 (R-Pro21717) 的构建
4 － 1 ：含有编码 W-Pro21717 基因的载体
在该实施例中，采用CopyControl Fosmid文库生产试剂盒(Epicentre)构建北极假交替单胞菌PAMC 21717的基因组文库。在13个具有蛋白水解活性的克隆中，EPI-P38被选中并用8种不同的限制性酶酶切，之后，将其引入pUC19载体，从而获得具有蛋白水解活性的克隆Rosetta-P38-4。
用下面的引物扩增编码适冷蛋白酶的W-Pro21717基因，然后插入表达载体pEXP5-CT/TOPO，从而构建并选择具有优异蛋白水解活性的质粒。
采用北极假交替单胞菌PAMC 21717菌株的染色体DNA作为模板和以下引物组通过PCR扩增W-Pro21717基因：用于pDOC122的SEQ ID Nos：1和2的引物组，用于pDOC125的SEQ ID Nos：3和4的引物组，用于pDOC128的SEQ ID Nos：5和6的引物组或用于pDOC131的SEQ ID Nos：7和8的引物组。
pDOC122
SEQ ID NOs:1:5'-ATGACAACAAGTAAAACTTTTAAAAGATGCGC-3'
SEQ ID NOs:2:5'-CACTTAGCGGACAATACCAACCG-3'
pDOC125
SEQ ID NOs:3:5'-ATGCAATCAGTTTCAAGTTCAATGGC-3'
SEQ ID NOs:4:5'-CACTTAGCGGACAATACCAACCG-3'
pDOC128
SEQ ID NOs:5:5'-ATGACAACAAGTAAAACTTTTAAAAGATGCGC-3'
SEQ ID NOs:6:5'-GCAGCTGTTGCAGCAGCAAGT-3'
pDOC131
SEQ ID NOs:7:5'-ATGCAATCAGTTTCAAGTTCAATGGC-3'
SEQ ID NOs:8:5'-GCAGCTGTTGCAGCAGCAAGT-3'
4 － 2 ： R-Pro21717 的表达和纯化
在该实施例中，分析了衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717的蛋白酶(W-Pro21717)的重组蛋白R-Pro21717的功能。
过表达实施例4－1中所构建的四个质粒，通过在10％SDS-PAGE凝胶上的酶谱分析了R-Pro21717的包涵体(IB)。
结果是，没有观察到72.6kDa的pDOC122和49.7kDa的pDOC128蛋白的表达。但是，观察到了69.9kDa pDOC125和47kDa pDOC131的表达(图8A)。最终选择了在酶谱分析中显示出显著高蛋白水解活性的pDOC131。
在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养含有pDOC131的大肠杆菌BL21star(DE3)pLysS。当达到1.0的OD600时，向细胞加入IPTG，然后细胞培养24小时，从而诱导R-Pro21717重组蛋白的表达。离心细胞，用解折叠缓冲液洗涤被解折叠的IB(包涵体)。用重折叠缓冲液稀释被解折叠的蛋白溶液，并通过FPLC透析和纯化。纯化的蛋白是具有蛋白水解活性的Pro21717重组蛋白。
可以观察到重组蛋白的不溶性部分而不是水溶性部分的表达，在重折叠过程中发生大小的转变(shift)。在48小时的重折叠之后蛋白从50kDa变成37kDa并且在72小时的重折叠之后变成63kDa(图8B)。可以看到，W-Pro21717的酶活性是42.1±3.5U/mg，但R-Pro21717重组蛋白的酶活是116.4±2.7U/mg，其是W-Pro21717的2.8倍。通过尺寸排阻色谱法纯化重折叠的蛋白酶，从而构建显示酶活为268.6±7.5U/mg(其是W-Pro21717的6.4倍)的R-Pro21717重组蛋白(图8C)。
实施例 5 ：重组蛋白酶 (R-Pro21717) 的活性和稳定性
5 － 1 ：温度和 pH 的影响
在该实施例中，分析了在低温和高pH下R-Pro21717的活性和稳定性。
为了确定蛋白酶活性最佳的温度，使R-Pro21717在0～70℃的不同温度下进行反应，然后进行分析。通过使R-Pro21717在0～70℃的不同温度下1 小时分析R-Pro21717针对温度的稳定性，然后将R-Pro21717与含有0.65％的偶氮酪蛋白的标准缓冲液在30℃反应30分钟。嘉士伯枯草杆菌蛋白酶用作对照酶。
为了确定蛋白酶活性最佳的pH，将具有不同pH的含有R-Pro21717的缓冲液在30℃进行反应，然后对其进行分析。通过将具有不同pH的含有R-Pro21717的缓冲液在冰上反应1小时，然后R-Pro21717在含有0.65％的偶氮酪蛋白的标准缓冲液在30℃反应30分钟，分析R-Pro21717针对pH的稳定性。嘉士伯枯草杆菌蛋白酶用作对照酶，并在40℃的反应温度下进行分析。
结果显示R-Pro21717蛋白酶在范围从30至40℃的温度下显示出最高活性，并且R-Pro21717蛋白酶的活性最佳的温度为30℃，并且在0℃，R-Pro21717蛋白酶显示出在30℃的最高活性的50％的蛋白水解活性(图9A)。但是，对照酶嘉士伯枯草杆菌蛋白酶在60℃显示出最高活性，并且与其显示最高活性的60℃相比在0℃并未显示出蛋白水解活性。此外，显示R-Pro21717蛋白酶针对温度的稳定性在20℃或更高处降低(图9B)，并且对照酶嘉士伯枯草杆菌蛋白酶在50℃或更高处显示出酶活的降低。
此外，显示R-Pro21717蛋白酶在pH 9.0显示出最高活性(图9C)，所述酶的稳定性的最佳pH为5.0－11.0(图9D)，并且对照酶嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(碱性酶)也显示出与R-Pro21717相同的结果。
5 － 2 ：金属离子和表面活性剂的影响
在所述实施例中，分析了在金属离子和表面活性剂存在下R-Pro21717蛋白酶的活性和稳定性。
通过将R-Pro21717加入含有CaCl2、CuSO4、NaCl、N2SO4、LAS、SDS、PMSF或1％H2O2的标准缓冲液进行分析，使混合物在冰上反应1小时，然后向其加入0.65％的偶氮酪蛋白(图10)。
结果显示，在金属离子和表面活性剂的存在下，R-Pro21717蛋白酶的活性和稳定性比诸如对照酶嘉士伯枯草杆菌蛋白酶的一般去污剂酶更好。
5 — 3 ：底物特异性
在所述实施例中，分析了在合成肽底物存在下R-Pro21717蛋白酶的活性。结果显示R-Pro21717蛋白酶显示出与对照酶嘉士伯枯草杆菌蛋白酶相 似的活性，并且在包括胶原蛋白和角蛋白的复杂底物的存在下显示出相对低的活性(表4)。
因此，发现根据本发明的衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717的适冷蛋白酶在低温下显示高活性，并甚至在包含于去污剂组合物中的各种金属离子和表面活性剂存在下可靠地保持其酶活。这表明衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717的适冷蛋白酶能够被用于各种工业应用。
表 4
实施例 6 ：生产重组蛋白酶 (R-Pro21717) 的培养优化
在该实施例中，为了优化重组蛋白酶R-Pro21717的生产，通过分批型培养和分批补料培养确定了在实施例4中制备的重组微生物中生产R-Pro21717的最适条件。
在含有葡萄糖、KH2PO4、(NH4)2PO4、柠檬酸、MgSO47H2O、硫胺素、抗生素和痕量金属元素的培养基中在37℃进行培养，然后当由于葡萄糖的 完全消耗导致培养基的pH和DO上升时，进行至少15小时的pH-稳定分批补料同时加入含有葡萄糖、酵母提取物、(NH4)2PO4、MgSO47H2O和抗生素的预先确定量的培养基，从而表达适冷蛋白酶。以这种方式，R-Pro21717的生产得到优化。
实施例 7 ：适冷蛋白酶的结晶和结构分析
纯化的蛋白酶被浓缩至250mg/ml的浓度，然后采用坐滴蒸发扩散法在20℃进行结晶。针对结晶，采用0.81μl的蛋白溶液(含有250mg/ml蛋白、20mM Tris-HCl(pH 8.0)和150mM NaCl)和0.81μl的防腐溶液(0.1M乙酸钠(pH 4.4)和3M氯化钠)的蛋白溶液。单晶以针的形式生长，这样2天后最长的轴具有大约0.5mm或更小的长度。对于低温试验，蛋白酶晶体被浸入paratone油中，并且2分钟后，浸入液氮中。在浦项加速实验室(韩国浦项)的7A光束以的分辨率对X射线衍射数据进行分析并采用HKL2000程序进行索引。
结果显示蛋白酶晶体具有P212121空间群，晶胞尺寸为 和蛋白酶晶体具有下表5和上表1中所示的原子坐标。
此外，通过分子替换方法采用MOLREP程序和AprV2结构(PDB码3LPA)作为模板分析了晶体的结构，并采用REFMAC5和Coot程序进行结构的细化。
所述蛋白酶的整体结构具有枯草杆菌蛋白酶样折叠并由环绕中央6个β-链和两个β-链的十个α-螺旋组成。酶促活性位点是由催化三联体组成的，所述催化三联体由三个残基(Asp159、His218和Ser399)组成。因此，可以从所述蛋白酶的结构信息发现所述蛋白酶是基于丝氨酸的蛋白酶。此外，所述蛋白酶具有协助蛋白酶的稳定的四个钙离子键(图11)。
表 5
虽然本发明已经参考具体的特征进行了详细描述，对本领域技术人员来说显而易见的是，该说明书仅为优选的实施方案并非限制本发明的保护范围。因此，本发明的实质保护范围将由所附的权利要求书及其等同物定义。

Claims (13)

1.衍生自北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonas arctica)PAMC 21717的适冷蛋白酶或是通过在大肠杆菌(E.coli)中表达编码所述适冷蛋白酶的基因获得的重组适冷蛋白酶的晶体，其中所述适冷蛋白酶的晶体具有以下特点：
(i)具有枯草杆菌蛋白酶样折叠；
(ii)具有四个钙离子和两个二硫键(Cys439-Cys442和Cys207-Cys254)；
(iii)形成由十个α-螺旋组成的三维结构，所述十个α-螺旋环绕中央6个β-链和两个β-链；以及
(iv)具有P212121空间群的结晶结构，所述P212121空间群具有晶胞参数α＝β＝γ90°或者表1中所列的2374个原子坐标(包括4个钙离子)。
2.权利要求1所述的晶体，其包含酶活位点，所述酶活位点由氨基酸残基Asp185、His244和Ser425的催化三联体组成。
3.用于结晶衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717的适冷蛋白酶或通过在大肠杆菌中表达编码所述适冷蛋白酶的基因获得的重组适冷蛋白酶的方法，其中所述方法包括在20℃采用含有20mM Tris-HCl(pH 8.0)和150mMNaCl的蛋白溶液和含有0.1M乙酸钠(pH 4.4)和3M氯化钠的防腐溶液进行结晶。
4.用于制备适冷蛋白酶的方法，所述方法包括：
(a)在含有脱脂牛奶、胰蛋白胨、Fe(C6H5O7)、NaCl、MgCl2、Na2SO4、CaCl2、NaHCO3和KBr的培养基中分批补料培养北极假交替单胞菌PAMC21717，以产生适冷蛋白酶(W-pro21717)；以及
(b)回收所产生的适冷蛋白酶。
5.用于制备表达适冷蛋白酶R-pro21717的产酶重组微生物的方法，所述方法包括：
(a)用SEQ ID NOs：7和8的一组引物进行PCR以获得编码衍生自北极假交替单胞菌PAMC 21717的适冷蛋白酶W-pro21717的基因；
(b)将所述基因插入重组表达载体pEXP5-CT/TOPO；以及
(c)用所述重组表达载体转化宿主大肠杆菌。
6.产酶重组微生物，其中引入有重组载体，所述重组载体含有采用SEQID NOs：7和8的一组引物通过PCR获得的扩增产物。
7.权利要求6所述的产酶重组微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。
8.用于制备适冷蛋白酶R-pro21717的方法，所述方法包括：
(a)在含有葡萄糖、KH2PO4、(NH4)2PO4、柠檬酸、MgSO47H2O、硫胺素、抗生素和痕量金属元素的培养基中培养权利要求6所述的重组微生物；
(b)在所述重组微生物中表达适冷蛋白酶直至获得pH-稳定的分批培养物，同时当培养基的pH和DO增加时供给含有葡萄糖、酵母提取物、(NH4)2PO4、MgSO47H2O和抗生素的预定量的培养基；以及
(c)回收所表达的适冷蛋白酶R-pro21717。
9.用于外科或治疗装置的消毒组合物，所述组合物含有权利要求1所述的适冷蛋白酶或通过权利要求4或8所述的方法制备的适冷蛋白酶的晶体。
10.去污剂组合物，其含有权利要求1所述的适冷蛋白酶或通过权利要求4或8所述的方法制备的适冷蛋白酶的晶体。
11.饲料添加剂，其含有权利要求1所述的适冷蛋白酶或通过权利要求4或8所述的方法制备的适冷蛋白酶的晶体。
12.食物添加剂，其含有权利要求1所述的适冷蛋白酶或通过权利要求4或8所述的方法制备的适冷蛋白酶的晶体。
13.纤维或皮革处理组合物，其含有权利要求1所述的适冷蛋白酶或通过权利要求4或8所述的方法制备的适冷蛋白酶的晶体。
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