CZ29897A3 - Cyclodextringlycosyl transferases for preparing gamma-cyclodextrin, process of their preparation and use - Google Patents

Description

Vynález se týká cyklodextringlykosyltransferáz (CGT) EC 2.4.1.19 pro výrobu gama-cyklodextrinu, způsobu výroby těchto gama-cyklodextringlykosyltransferáz a také jejich použití .

Dosavadní stav techniky

Cyklodextriny se zpravidla vyrábějí ze škrobů nebo ze substrátů podobných škrobu. Škrob je při tom působením cyklodextringlykosyltransferáz enzymaticky přeměňován na cyklodextrin (CD) . Z termodynamického hlediska se škrob přeměňuje nezávisle na k reakci použité cyklodextringlykosyltransf eráze hlavně na β-cyklodextrin, když se reakce provádí až do dosažení termodynamické rovnováhy (maximální výtěžek cyklodextrinu). V iniciační fázi, na počátku konversní reakce škrobu se však při použití různých enzymů ke konversi liší složení primární směsi produktů. V závislosti na enzymem v této iniciační fázi převážně vytvářeném produktu, a- , β- nebo gama-cyklodextrinu se rozlišuje mezi a- , β- nebo gama-cyklodextringlykosyltransferázami.

Takovéto pro průmyslovou produkci cyklodextrinu vhodné a také již použité enzymy byly dosud výhradně zjištěné u bakterií. α-Cyklodextringlykosyltransferázy byly dosud ?

výhradně identifikovány u Bacillus macerans, Bacillus stearothermophilus a Klebsiella oxytoca. β-cyklodextringlykosyltransferázy byly například prokázány u Bacillus circulans, Bacillus megaterium, Bacillus ohbensis, Micrococcus sp. a u taxonomicky ne zcela exaktně klasifikovaných alkalofilních Bacillů, jako je například Bacillus sp. 38-2 , 17-1 , 1011 nebo 1-1 . Přirozeně se vyskytující enzymy s iniciačně vysokou aktivitou tvorby gama-cyklodextrinu byly popsány u Bacillus subtilis 313 ,

Bacillus sp. Al-6 a u Bacillus sp. 290-3 .

Vzhledem k tomu, že cyklodextringlykosyltransferázy, používané při průmyslové výrobě cyklodextrinů, poskytují při přeměně škrobu na cyklodextriny vždy směsi z více cyklodextrinů, byly vypracovány různé způsoby pro výrobu čistých cyklodextrinů (α, β nebo gama) a sice :

Definované cyklodextriny se mohou z produkčních směsí oddělit například na základě svých rozdílných molekulových hmotností chromatograficky (popsáno například v US-A 4,808,232).

Při enzymatické přeměně škrobu na cyklodextrin se přidávají zpravidla komplexotvorné látky, které reagují póze s definovaným cyklodextrinem a s ním tvoří například nerozpustný komplex, který se může potom z reakční směsi fyzikálně oddělit. Potom se komplex rozpustí a získá se homogenní cyklodextrin (popsáno například v EP 0291067).

Přídavkem organického rozpouštědla, jako je například ethylalkohol, k reakční směsi, se může složení produktu při použití β-cyklodextringlykosyltransferázy posunout ve směru ke gama-cyklodextrinu (J. Ferm.

Bioeng. /1990/ 70 (3), str. 150-154).

Při každém ze způsobů se optimálně použije taková cyklodextringlykosyltransferáza, která má pokud možno vysokou iniciační preferenci tvorby produktu pro cyklodextrin, který se má vyrobit jako čistý.

Specifita dosud známých a-cyklodextringlykosyltrans feráz a β-cyklodextringlykosyltransferáz je dostatečná pro technickou produkci odpovídajících cyklodextrinů. Naproti tomu nemají žádné dosud známé gama-cyklodextringlykosy1transferázy produkční specifitu, která by umožnila srovnatelnou produkci gama-cyklodextrinu.

Pro výrobu gama-cyklodextrinu bylo proto v CA 115:157165 navrženo enzymaticky přeměňovat a-cyklodextriny a/nebo β-cyklodextriny na gama-cyklodextrin přídavkem gama -cyklodextrin-specifické komplexotvorné látky glykosylglycylrhizinu, maltosy a cyklodextringlykosyltransferázy.

Další možnost pro výrobu gama-cyklodextrinu spočívá v tom, že se výměnou definovaného zbytku aminokyseliny zvýší specifita β-cyklodextringlykosyltransferázy tak, že muta genisované enzymy produkují ve zvýšené míře gama-cyklodextrin a tím se mohou použít pro technickou výrobu gama-cyklo dextrinu. Odpovídající mutace jsou známé a jsou popsané například v DE 43 24 650 Al (odpovídá US-A-5,474,917), Biochemistry (1994), 33 (33), str. 9929-9936 , Biochemistry (1995), 34 (10), str. 3368-3376 aJ. Biotech. (1994), 32, str. 283-288 .

Takové cyklodextringlykosyltransferázy, které byly vyrobeny mutagenesí β-cyklodextringlykosyltransferáz, mají zvýšenou gama-cyklodextrinovou specifitu a jsou proto vhodné na základě svého produkčního spektra principielně pro technickou výrobu gama-cyklodextrinu. Nevýhodné však je, že specifické aktivity výchozího enzymu, použitého pro mutagenesi, jsou zavedením odpovídající mutace redukovány. V závislosti na zavedených ainokyselinových zbytcích mají mutované enzymy se zvýšenou gama-cyklodextrinovou specifitou pouze 25 % až 50 % aktivity tvorby cyklodextrinu výchozího enzymu (Biochemistry (1994), 33 (33), str. 9929-9936 , Biochemistry (1995, 34 (10), str. 3368-3376).

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu tedy je dát k disposici cyklodextringlykosyltransferázy, které při přeměně škrobu nebo škrobu podobných substrátů na cyklodextrin poskytují ve zvýšené míře gama-cyklodextrin a které mají ještě alespoň 60 % specifické celkové cyklodextrintransferázové aktivity výchozí cyklodextringlykosyltransferázy, použité pro výrobu daného enzymu.

Dalším úkolem předloženého vynálezu je vypracování způsobu výroby uvedených cyklodextringlykosyltransferáz.

Dalším úkolem předloženého vynálezu je konečně vypracování způsobu výroby gama-cyklodextrinu pomocí uvedených cyklodextringlykosyltransferáz.

Výše uvedený úkol byl vyřešen přípravou cyklodextringlykosyltransferáz, které se vyznačují tím, že jejich aminokyselinová sekvence se liší od aminokyselinové sekvence známých cyklodextringlykosyltransferáz v oblasti posice aminokyseliny 155 až do posice aminokyseliny 195 delecí alespoň jedné aminokyseliny, přičemž posice 1 proteinové sekvence je počátkem signálního peptidu cyklodextringlykosyltransferázy a delece způsobuje zvýšení aktivity gamacyklodextringlykosyltransferázy proteinu.

Ve syslu předloženého vynálezu se pod pojmem zvýšení aktivity gama-cyklodextringlykosyltransferázy rozumí to, že ve směsi produktů, která vznikne při reakci škrobu nebo škrobu podobných substrátů s cyklodextringlykosyltransferázami je větší kvocient množství vytvořeného gama-cyklodextrínu množství vytvořeného α-cyklodextrinu + β-cyklodextrinu

Výhodně se liší aminokyselinové sekvence cyklodxtringlykosyltransferáz podle předloženého vynálezu od aminokyselinových sekvencí známých cyklodextringlykosyltransferáz tím, že v oblasti mezi posicí aminokyseliny 155 a posicí aminokyseliny 195 jejich proteinové sekvence jsou čtyři až osm aminokyselinových zbytků deletováno, přičemž posice 1 proteinové sekvence je počátkem signálního peptidu cyklodextringlykosyltransferázy a delece způsobuje zvýšení aktivity cyklodextringlykosyltransferázy proteinu.

Obzvláště výhodně se liší aminokyselinové sekvence cyklodxtringlykosyltransferáz podle předloženého vynálezu od aminokyselinových sekvencí známých cyklodextringlykosyltransferáz tím, že v oblasti mezi posicí aminokyseliny 155 a posicí aminokyseliny 195 jejich proteinové sekvence je šest aminokyselinových zbytků deletováno, přičemž posice 1 proteinové sekvence je počátkem signálního peptidu cyklodextringlykosyltransferázy a delece způsobuje zvýšení aktivity cyklodextringlykosyltransferázy proteinu.

Také pro další uváděné posice aminokyselin platí, že posice 1 proteinové sekvence je počátkem signálního peptidu cyklodextringlykosyltransferázy.

Obzvláště výhodné jsou dále cyklodextringlykosyltransferázy, které se vyznačují tím, že se jejich aminokyselinové sekvence liší od aminokyselinových sekvencí v tabulce 1 uvedených cyklodextringlykosyltransferáz alespoň delecí tučně vytištěných aminokyselinových zbytků, přičemž ostatní aminokyselinová sekvence odopvídající cyklodextringlykosyltransf erázy je tak dalece homologní k aminokyselinové sekvenci v tabulce 1 uvedené cyklodextringlykosyltransferázy, že sekvence má bez delece podle předloženého vynálezu aktivitu cyklodextringlykosyltransferázy.

Jako příklady cyklodextringlykosyltransferáz podle předloženého vynálezu je možno uvést cyklodextringlykosyltransf erázy, které se získají z cyklodextringlykosyltransferáz, uvedených v tabulce 1 , nebo z jiných cyklodextringlykosyltransf eráz delecí jednotlivých aminokyselinových zbytků v oblasti mezi aminokyselinovými zbytky 155 a 195 . Výhodné jsou cyklodextringlykosyltransferázy, u kterých je čtyři až osm zbytků v uvedené oblasti deletováno. Obzvláště výhodné jsou cyklodextringlykosyltransferázy, u kterých je šest, v tabulce 1 tučným tiskem označených, aminokyselinových zbytků v uvedené oblasti deletováno.

Dalšími příklady cyklodextringlykosyltransferáz podle předloženého vynálezu jsou enzymy, u kterých jsou deletovány homologní aminokyseliny k aminokyselinám, uvedeným v tabulce 1 , přičemž tyto enzymy mají bez delece podle předloženého vynálezu aktivitu cyklodextringlykosyltransferázy.

Příklady cyklodextringlykosyltransferáz jsou dále enzymy, u kterých jsou deletovány aminokyselinové zbytky, označené v tabulce 1 tučným tiskem, v oblasti mezi posicí aminokyseliny 155 a posicí aminokyseliny 195 , přičemž ostatní aminokyselinové sekvence cyklodextringlykosyltransferáz podle předloženého vynálezu je tak dalece homologní k aminokyselinové sekvenci cyklodextringlykosyltransferáz z mikroorganismů, uvedených v tabulce 1 , že tyto enzymy, jejichž sekvence neobsahují delece podle předloženého vynálezu, mají aktivitu cyklodextringlykosyltransferázy.

(β

X

I—)

Λ (Ο

Ε-ι

	No 1 )	CN 0 z	m 0 Z	T 0 z
	£\	Q	c
	1—i	M	1-1	Z
	σ'	σ	σ	σ
	φ	φ	φ	φ
	σι	cn	cn	cn
φ	I	1	1	1
υ	Ο	u	o	u
C	C	z	z	z
ο	Ζ	a	c	Q
>		>	>	>
X	>	2	1—i	J
φ	<	U	<	z
σι	U	O	u	o
	ζ	z	z	z
'(0	W	Cd	Cd	z
>	<	<	>	<
0	>	tu		z
C
•Η
r-Η
φ	(Λ	z	Z	z
cn	Ζ	z	CL	E->
	Q	z	Z	o
λ:	Εη	a		E-*
0	Cd	z	Cd	z
C	|J	a	Z	£
•Η
ε
<0	<	<	<	<
	Z	CL	CL	z
	z	cn	cn	z
	cn	Eh	cn	Eh
	z	z	z	Z
	z	z	z	z
	Z 1	CL 1	z 1	z 1
φ
υ
-Η
cn	o	CD	o	CN
0	to	\ΰ	to	Γ'
CL			T“»
				co
				cn
	cn	cn		c
	•H	c	f—	cC
	cn	«	1	i—í
	c	M	T—	3
	Φ	Φ		U
	z	0	•	L
	JZ	IC	CL	•H
Ν	0	ε	cn	G
Π3	cn	cn	cn	cn
Ν	3	3	3	3
ΊΟ	iH	1—1	1—1	rH
Εη	r—C	Z	r“t	r4
Ο	•L	•H	•H	Ή
ο	0	u	0	G
	Ba	(0 ca	to ffl	(0 Z

Cyklodextringlykosyltransferázy podle předloženého vynálezu mají neočekávaně vyšší gama-cyklodextrinovou specifitu než výchozí cyklodextringlykosyltransferázy, použité pro jejich výrobu, při současně ne podstatné redukci celkové aktivity cyklodextringlykosyltransferázy mutovaného enzymu ve srovnání s výchozí cyklodextringlykosyltransferázou.

Cyklodextringlykosyltransferázy podle předloženého vynálezu produkují tedy při reakci škrobu nebo škrobu podob ných substrátů gama-cyklodextrin při rozdělení produktu, př kterém je kvocient z gama-cyklodextrinu a sumy a-cyklodextrinu a β-cyklodextrinu větší než kvocient tohoto produktu, kterého se docílí při reakci škrobu s odpovídajícími nezměněnými výchozími cyklodextrintransferázami.

Sestavy, uvedené v tabulce 1 , ukazují příkladně na základě některých cyklodextringlykosyltransferáz homologní oblast aminokyselinových sekvencí, generelně přítomných vm cyklodextringlykosyltransferázách, jakož i pro modifikaci produkční specifity odpovídajících relevantních šest aminokyselinových zbytků uvnitř této sekvenční oblasti.

Jako posice je v tabulce lm označeno číslo první aminokyseliny odpovídající opakující se aminokyselinové sekvence, přičemž jako posice 1 je počítána první aminokyselina signálního peptidu odpovídající sekvence cyklodextringlykosyltransf erázy . Podle všeobecně známých standardních postupů se dá zjistit odpovídající sekvenční oblast u všech cyklodextringlykosyltransferáz. Toto je například možné pomocí známých algoritmů, které spočítají multiplitní sekvenční aligmenty. Jako příklad vhodného počítačového algoritmu je možno uvést program pileup z komerčně dostupných programů sekvenční analysy Visconsin Sequence Analysis Package (Genetic Computer Group, Madison) .

Mutagenesí uvedené oblasti v cyklodextringlykosyltransferázách se dají pomocí známých standardních postupů, jaké jsou například uvedené v předložené přihlášce, vyrobit enzymy podle předloženého vynálezu z libovolných cyklodextringlykosyltransferáz. K tomu se zpravidla gen, kódující cyklodextringlykosyltransferázu, tak mutuje, aby kodoval cyklodextringlykosyltransferázu podle předloženého vynálezu .

Předmětem předloženého vynálezu je dále také způsob výroby mutovaných genů cyklodextringlykosyltransferázy, které kódují cyklodextringlykosyltransferázy podle předloženého vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se sekvence DNK genu, kódujícího výchozí cyklodextringlykosyltransf erázu, pomocí o sobě známých metod mutagenese tak mutuje, aby se sekvence aminokyselin, kódovaná DNK-sekvencí mutujícího genu, lišila delecí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku v oblasti mezi posicí aminokyselin 155 a 195 od aminokyselinové sekvence, kódované DNK nemutovaného genu .

Výhodně se při způsobu podle předloženého vynalezu DNK-sekvence genu, kódujícího výchozí cyklodextringlykosyltransf erázu, mutuje pomocí o sobě známých metod mutagenese tak, aby se aminokyselinová sekvence, kódovaná DNK-sekvencí mutovaného genu, lišila od aminokyselinové sekvence, kódované DNK nemutovaného genu, delecí čtyř až osmi aminokyselinových zbytků v oblasti mezi posici aminokyselin 155 až 19 5 .

Obzvláště výhodně se při způsobu podle předloženého vynálezu DNK-sekvence genu, kódujícího výchozí cyklodextringlykosyltransf erázu, mutuje pomocí o sobě známých metod mutagenese tak, aby se aminokyselinová sekvence, kódovaná DNK-sekvencí mutovaného genu, lišila od aminokyselinové sekvence, kódované DNK nemutovaného genu, delecí šesti aminokyselinových zbytků v oblasti mezi posici aminokyselin 155 až 195.

Předmětem předloženého vynálezu je dále způsob výroby gama-cyklodextringlykosyltransferáz, jehož podstata spočívá v tom, že se alespoň jedna DNK-sekvence exprímuje do mikroorganismu.

Pro výrobu cyklodextringlykosyltransferáz podle předloženého vynálezu jsou vhodné geny všech cyklodextringlykosyltransferáz (výchozí cyklodextringlykosyltransferázy) . Výchozí cyklodextringlykosyltransferázy mohou být všechny přírodně se vyskytující cyklodextringlykosyltransferázy, ale také mutagenesí získané cyklodextringlykosyltransf erázy, jako jsou například takové cyklodextringlykosyltransferázy, u kterých byl poměr tvorby produktů již změněn jinou mutací, ne podle předloženého vynálezu (například mutací, popsanou v DE 43 24 650 Al, což odpovídá US-A 5 474 917) . Výchozí cyklodextringlykosyltransferázy jsou výhodně takové, u kterých byl již poměr tvorby produktů změněn jinou mutací, ne podle předloženého vynálezu (například mutací, popsanou v DE 43 24 650 Al).

Gen, kódující výchozí cyklodextringlykosyltransferázu, se isoluje pomocí známých způsobů a mutace podle předloženého vynálezu se do genu cyklodextringlykosyltransferázy zavede mutagenesním postupem in vivo nebo in vitro.

Takovéto postupy jsou rovněž ze stavu techniky všeobecně známé.

Pod pojmem mutagenesní postupy in vivo se rozumí takové metody, při kterých se mikroorganismy, které obsahují chromosomálně a/nebo episomálně pro cyklodextringlykosyltransferázu kódovaný gen, podrobí nespecifické mutagenesi pomocí mutagenů, jako je například UV-záření, nitrosoguanidin nebo ethylmethylsulfonát. Takovýto způsob byl například popsán Millerem J. H. ve (1972) Experiments in Molecular Genetics; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y. .

V návaznosti na to se pomocí známých metod, jako je například sekvenční analysa metodou odbourávání řetězce podle Sangera a kol., popsaná v PNAS 74 (1977), str. 5463-5467, identifikují mutanty, u kterých je deletován v oblasti aminokyselinových zbytků odpovídající cyklodextringlykosyltransferázy alespoň jeden kodon genu cyklodextringlykosyltransferázy, kódující jeden aminokyselinový zbytek.

Podle předloženého vynálezu se volí jako mutanty výhodně takové, u kterých je v uvedené oblasti deletováno čtyři až osm kodonů.

Obzvláště výhodně se volí takové mutanty, u kterých je v uvedené oblasti deletováno šest kodonů, přičemž ještě výhodněji se volí takové mutanty, u kterých je v uvedené oblasti deletováno šest kodonů, které kódují v tabulce 1 tučně uvedené aminokyselinové zbytky nebo aminokyselinové zbytky k nim homologní v jiných cyklodextringlykosyltransferázách.

Pod pojmem metody mutagenese in vitro” se rozumí ve smyslu předloženého vynálezu takové metody, při kterých se isolovaný gen cyklodextringlykosyltransferázy nebo fragment genu cyklodextringlykosyltransferázy modifikuje o sobě známým způsobem tak, že vznikne gen, který kóduje enzym cyklodextringlykosyltransferázu, u kterého je v oblasti zbytků aminokyselin 155 až 195 aespoň jeden kodon cyklodextringlykosyltransf erázy , kódující tyto aminokyselinové zbytky, deletován.

Výhodné jsou mutanty, které byly modifikovány tak, aby v uvedené oblasti bylo deletováno čtyři až osm kodonů. Obzvláště výhodné jsou mutanty, které byly modifikovány tak, aby v uvedené oblasti bylo deletováno šest kodonů, přičemž zcela obzvláště výhodné jsou mutanty, které byly modifikovány tak, aby v uvedené oblasti bylo deletováno šest kodonů, které jsou v tabulce 1 tučně vytištěné, nebo ty, které jsou kódované na tyto homologní aminokyselinové zbytky v jiných cyklodextringlykosyltransferázách.

Předmětem předloženého vynálezu jsou také DNK-sekvence , které kódují gama-cyklodextringlykosyltransferázy podle předloženého vynálezu.

Způsoby mutagenese in vitro” , známé ze stavu techniky, jsou například specifické (BioTechniques /1992/ 13 (3), str. 342-346) nebo nespecifické (Technique /1989/ 1 (1), str. 11-15) postupy mutagenese za pomoci PCR-techniky. Rovněž tak jsou známé způsoby, při kterých se mutace, řízená pomocí syntetického oligonukleotidu, zavádí do cílového genu. Toto se může uskutečňovat jak pomocí takzvaného postupu jedné šroubovice (Ausubel F.M. a kol. /1987/ Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing

Associates) nebo také pomocí postupu dvojité šroubovice (Promega 1992-1993 Catalogue, 150) , nebo pomocí jiných postupů, které jsou například popsané v Ann. Rev. Genet. /1985/ 19, str. 423-462 .

Hlavní oblastí využití cyklodextringlykosyltransferáz podle předloženého vynálezu je jejich použití pro získávání gama-cyklodextrinu ze škrobu. Cyklodextringlykosyltransferázy podle předloženého vynálezu se k tomu dají využít pomocí schůdných způsobů výroby.

Předmětem předloženého vynálezu je také způsob výroby gama-cyklodextrinu reakcí škrobu za použití cyklodextringlykosyltransf erázy , jehož podstata spočívá v tom, že se použije alespoň jedna cyklodextringlykosyltransferáza podle některého z nároků 1 až 4 .

Schůdné způsoby výroby pro získání gama-cyklodextrinu, při kterých se dají použít cyklodextringlykosyltransferázy podle předloženého vynálezu namísto tam uváděných cyklodextringlykosyltransferáz, jsou například popsané v :

Journal of Fermentation and Bioengineering (1990) 70 (3), str. 190-192 : Die Herstellung von gama-CD unter Verwendung der β-, gama-CD unter Verwendung der β, gama-CD bildenden CGTase aus Bacillus sp. AL-6 in Gegenwart von Áthanol, welcher eine verstárkte gama-CD-Produktion bewirkť' .

CA 107:57455 : Die Herstellung von gama-CD unter Verwendung der gama-CGTase aus Bacillus sp. 313.

EP 291,067 : Herstellung von gama-CD unter Verwendung der CGTase aus Bacillus macerans. Produkční specifita pro gama-CD se dosáhne přídavkem komplexotvorného činidla, například 8-cyklohexadecen-l-onu.

DE 40 09 822 (odpovídá US-A-5 409 824) : Produktion von gama-CD mit der gama-CGTase aus Bacillus sp. 290-3.

Gama-cyklodextrin má jak ve srovnání s a-cyklodextrinem, tak také ve srovnání s β-cyklodextrinem specifické výhody, které ho předurčují pro celou řadu použití jako jediný možný nebo jako nejlépe vhodný cyklodextrin.

Ve srovnání s α-cyklodextrinem, který je vystaven ze šesti glukosovýcb jednotek, má gama-cyklodextrin, sestávající z osmi glukosových jednotek, vyšší hydrofobní kavitu, která také umožňuje komplexaci takových hostitelských molekul, které se ze sterických důvodů nemohou komplexovat pomocí α-cyklodextrinu.

Ve srovnání s β-cyklodextrinem (rozpustnost ve vodě při teplotě místnosti asi 18,5 g/1) má gama-cyklodextrin podstatně vyšší rozpustnost (při teplotě místnosti asi 232,0 g/1) a je tedy pro komplexační reakce z vodných roztoků lépe vhodný než β-cyklodextrin. Další výhodou gamacyklodextrinu proti β-cyklodextrinu a modifikovaným derivátům β-cyklodextrinu je nepatrná toxicita gama-cyklodextrinu. Jak při orální, tak také při intravenosní aplika ci jsou deriváty α-cyklodextrinu a β-cyklodextrinu na zví řecích modelech toxičtější než deriváty gama-cyklodextrinu.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady provedení slouží k širšímu objasnění předloženého vynálezu.

Příklad 1

Mutagenese cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus circulans #8 (DSM 10559)

Delece libovolného zbytku aminokyseliny v oblasti aminokyselinových zbytků 155 až 195 podle předloženého vynálezu, obzvláště delece šesti aminokyselinových zbytků Μ E T D T S (Seq. ID No. 5) na posici 179 až 184 z Bacillus circulans #8 (viz tab. 1; uloženo v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur v Braunschweigu pod číslem DSM 10559) , se dosáhne tak, že se odpovídající aminokyselinové zbytky kódující triplety basí strukturního genu cyklodextringlykosyltransferázy deletují způsobem pro odborníky známým.

Pro mutagenesi se gen β-cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus circulans #8 nejprve klonuje v komerčně dostupném E. coli-vektoru pUC19 (Boehringer, Mannheim).

K tomu se stejně, jako je popsáno Ausubelem F. M. v Current protocols in molecular biology, vol. 1 ; Greene Publishing Associates & Viley - Interscience, N.Y., isoluje chromosomální DNK z Bacillus circulans #8 (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1990) 33; str. 542 až 546) a štěpí se pomocí restrikčních endonukleáz Hindi II a Xbal (Boehringer, Mannheim) . Isolují se fragmenty v rozmezí velikostí mezi dvěma a pěti kb a inkubují se společně s pUC19-DNK, naštčpenou restrikčními endonukleázami Hindi II a Xbal (Boehringer Mannheim) a T4 DNA-ligázou při teplotě 16 °C po dobu 12 hodin. Ligační vsázka se použije pro transformaci buněk E. coli K 12 , které byly pomocí známých způsobů (Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory /1982/, N.Y) učiněny kompetentními pro příjem DNK . Z takových buněk E. coli, které po transformaci tvoří na škrob obsahujících indikátorových destičkách zóny odbourávání škrobu, se isoluje rekombinantní plasmid, který nese gen pro β-cyklodextringlykosyltransferázu z Bacillus circulans #8 (Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ; Cold Spring Laboratory /1982/, N.Y., str. 86-92).

Mutagenese tohoto genu se provádí pomocí systému Oligonucleotide - directed in vitro mutagenesis systém, version 2.1 , komerčně dostupného od firmy Amersham (Braunschweig), založeném na Ecksteinem objeveném postupu (Nucl. Acids.

Res. /1986/ 14, str. 9679-9698 a Nucl. Acids. Res. /1988/ 16, str. 791-802) . Mutagenese se provádí exaktně podle protokolu, který je k uvedenému mutagenesnímu systému firmy Amersham přiložen. Způsob se v následujícím reprodukuje sumaricky. Detaily je možno získat v protokolu uvedeného mutagenesního systému.

Za použití komerčně dostupných enzymů, jako jsou restrikční endonukleázy a T4 DNA-ligáza (Boehringer Mannheim) se taková část v pUC19 klonovaného genu pro β-cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus circulans #8 , která kóduje uvedenou oblast aminokyselinových zbytků 155 až 195 této cyklodextringlykosyltransferázy, klonuje v komerčně dostupném vektoru M13 (New England Biolabs). Příkladem takovéhoto fragmentu je 1,6 kb veliký AccI-fragment. Tento fragment se klonuje v M13-vektoru, rozštěpeném restrikční endonukleázou AccI .

Z takovýchto hostitelských buněk Escherichia coli, které přijaly rekombinantní M13-vektor, se podle pokusného protokolu, dodávaného s výše uvedeným mutagenesním systémem firmy Amersham, isoluje jednošrobovicová, rekombinantní M13-DNK (předlohová DNK).

Pro vlastní mutagenesí se syntetisují chemicky definované mutagenesní oligonukleotidy s odpovídající požadovanou sekvencí. Takové oligonukleotidy jsou například komerčně dostupné u firmy MVG (Ebersberg). Sekvence mutagenesního oligonukleotidu se volí tak, že pořadí basí v mutagenesním oligonukleotidu je inversně komplementární k části sekvence nukleotidů předlohové DNK, která obklopuje deletovaný triplet basí, obsažený v předlohové DNK , β-cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus circulans #8 , vždy 15 basí po směsu a proti směru vlákna.

V následující tabulce 2 jsou znázorněny sekvence použitého mutagenesního oligonukleotidu.

Tabulka 2

5’ - CAC ACC TCT CCA GCG TTT GCC GAA AAT GGC - 3’ (Seq. ID.

No 6)

Použití v tabulce 2 znázorněného mutagenesního oligonukleotidu vede ke genovému fragmentu β-cyklodextrin19 glykosyltransferázy, který kóduje aminokyselinový fragment, u kterého je šest aminokyselinových zbytků Μ Ε T D T S (Seq. ID No. 5) deletováno.

Mutagenesní oligonukleotid se na 5’-konci fosforyluje za použití T4 polynukleotid-kinázy a ATP (Amersham). Fosforylovaný mutagenesní oligonukleotid se váže na homologní oblasti předlohové DNK . K tomu se 5 gg jednovláknové předlohové DNK inkubuje s asi 4 pmol fosforylovaného mutagenesního oligonukleotidu po dobu 3 minut při teplotě 70 °C a potom po dobu 30 minut při teplotě 37 °C . Potom probíhá syntesa vlákna DNK, komplementárního k předlohové DNK s výjimkou deletovaných nukleotidů, přičemž mutagenesní oligonukleotid, vázaný na předlohovou DNK , slouží jako startovací bod syntesy a předlohová DNK jako předloha pro novou syntesu mutovaného vlákna DNK . Syntesa sama probíhá po přídavku Klenow-fragmentu DNK-polymerázy (Amersham) ,

T4 DNA-ligázy a směsi nukleotidů, obsahující nukleotidy dATP , dGTP , dTTP a namísto dCTP thionukleotid dCTPaS (Amersham) po dobu 15 hodin při teplotě 16 °C .

Z této reakční směsi se zbylé molekuly jednovláknové předlohové DNK odstraní. K tomu se vsázka smísí s chloridem sodným a filtruje se přes nitrocelulosový filtr (Amersham), který specificky váže jednovláknovou DNK . Do filtrátu prošlá dvouvláknová hybridní DNK se zakoncentruje srážením ethylalkoholem a potom se odsolí. Potom se hybridní DNK štěpí pomocí Ncil (Amersham, restrikční endonukleázy, která rozezná sekvenci nukleotidů CC(G/C)GG , ale pouze nativní vlákna DNK , ne však taková, která obsahují nukleotid-analogon dCTPaS , ve vhodném inkubačním pufru (Amersham) po dobu 90 minut při teplotě 37 °C . Pomocí tohoto zpracování se provedou štěpy pouze v nemutagenisovaném vlákně (předlohová DNK) .

Při třicetiminutovém zpracování při teplotě 37 °C s exonukleázou III (Amersham) , enzymem, který odbourává vlákna DNK od volných konců, se potom předlohová DNK odstraní. Po tepelné inaktivaci exonukleázy III (15 minut při teplotě 70 °C) se zbylé jednovláknové a mutagenisované DNK-vlákno inkubuje po dobu 3 hodin při teplotě 16 °C s DNK-polymerázou I (Amersham) , T4 DNK-ligázou a s nukleotidy dATP , dTTP , dCTP a dGTP . Při tom se mutagenisovaná jednovláknová DNK doplní na dvojité vlákno. Po dalším srážení ethylalkoholem pro vyčištění se může mutagenisovaná DNK transformovat do kompetentních buněk E. coli K12 .

Sekvenčí analysou odpovídající oblasti rekombinantní DNK z pěti klonů, získaných při transformaci, se kontroluje úspěch procedury mutagenese. Z vektoru, u kterého byla mutace potvrzena, se DNK-fragment, původně pro mutagenesí klonovaný v M13 , vyštěpí pomocí vhodného restrikčního enzymu Xhol a Ndel .

Nakonec se odpovídající, avšak nemutagenisovaný Xhol/Ndel-fragment z expresního plasmidu na basi pUC19 pro β-cyklodextringlykosyltransferázu z Bacillus circulans #8 odštěpí a za použití T4 DNK-ligázy se nahradí mutagenisovaným fragmentem.

Příklad 2

Mutagenese β-cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus sp.

1-1

Analogicky jako je popsáno v příkladě 1 se šest kodonů genu β-cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus sp.

1-1 , který kóduje aminokyselinové zbytky L E Τ N Ρ N (Seq. ID No. 7) na posici 167 až 172 odpovídající cyklodextringlykosyltransferázy (viz tabulka 1), deletuje za použití v tabulce 3 znázorněného oligonukleotidu (A) v př. 8, srovnání 2) . Stejné deleci byl podroben také derivát této cyklodextringlykosyltransferázy, popsaný v DE 43 24 650 Al, u kterého byla již zvýšena výměnou aminokyseliny (Tyr -> Trp) gama-cyklodextrinová specifita ve srovnání s divokým typem enzymu (B) v př. 8, srovnání 2) .

Tabulka 3

5’- CAT TCA TCA CCG GCA TAT GTT GAA AAT GGG - 3’ (Seq. ID No. 8)

Příklad 3

Mutagenese β-cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus circulans #8 a jejích derivátů podle vynálezu v E. coli

Pro výrobu gama-cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus circulans #8 a jejích podle příkladu 1 vyrobených derivátů se v příkladě 1 popsané expresní plasmidy na basi pUC19 transformují do sekrečního kmene E. coli. Jako sekreční kmen E. coli se použije kmen E. coli VCM105. Tento kmen byl vyroben z E. coli DS 410 , jak je popsáno

- 22 v EP 3388410 .

Pro produkci gama-cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus circulans #8 nebo jejích derivátů se tedy buňky

E. coli VCM105, které obsahují vhodné expresní plasmidy cyklodextringlykosyltransferázy, inkubují v LB-mediu (Maniatis, Holecular Cloning, A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory /1982/, N.Y.) , které obsahuje 10 g/1 laktosy a 0,1 g/1 ampicilinu, po dobu 72 hodin při teplotě 30 °C ve třepačce na vodní lázni (250 otáček za minutu). Potom se buňky oddělí odstředěním při 5000 x g . Kultivační zbytek, prostý buněk, obsahuje gamacyklodextringlykosyltransferázu nebo její deriváty.

Příklad 4

Výroba β-cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus sp. 1-1 a jejích derivátů podle vynálezu v E. coli

Výroba probíhá analogicky jako je popsáno v příkladě 3 , za použití expresních plasmidů, popsaných v příkladě 2 .

Příklad 5

Čištění β-cyklodextringlykosyltransferázy pomocí adsorpce na β-cyklodextrinu, vázaném na nosiči

Specifické a šetrné čištění cyklodextringlykosyltransferáz se provádí afinitním čištěním pomocí na sepharose kopulovaných molekul β-cyklodextrinu.

g epoxy-aktivované sepharosy 6B (Sigma) se promyje třikrát vždy 10 ml vody a potom jednou 5 ml 0,1 N hyd roxidu sodného. Potom se sepharosa 6B suspenduje ve 2 ml 2,8% (hmotnost/objem) roztoku β-cyklodextrinu v 0,1 N hydroxidu sodném a inkubuje se po dobu 20 hodin při teplotě 45 °C za lehkého protřepáván!. Potom se kopulační produkt z β-cyklodextrinu a sephadexu 6B promyje dvakrát vždy 5 ml vody. Po suspendování promytého materiálu ve 2,5% (hmotnost/objem) roztoku glukosy ve vodě se materiál pro nasycení zbylých volných kopulačních míst inkubuje po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Potom se postupně promyje dvakrát vždy ř ml vody, dvakrát vždy 5 ml 0,1 M borátového pufru oH 8 , dvakrát vždy 5 ml 0,1 M acetátového pufru pH 4 a dvakrát 2 ml 20 mM triethanolaminu/Cl pH 7,2 . Kopulační produkt se smísí s 0,2 ml 20 mM triethanolaminu/Cl pH 7,2 (konečný objem asi 2 až 2,5 ml) a při teplotě 4 °C se skladuje až do potřeby.

Pro specifickou vazbu cyklodextringlykosyltransferáz na β-cyklodextrin, kopulovaný na sepharose 6B (CD-sepharosa) se kultivační kapalina obsahující cyklodextringlykosyltransf erázu , prostá buněk, získaná postupem podle příkladu 3 nebo 4 , smísí s 0,2 ml CD-sepharosy a inkubuje se po dobu 1,5 hodiny při teplotě 4 °C za lehkého protřepávání. Při tom se naváže enzym na CD-sepharosu. Komplex enzym-CD-sepharosa se získá centrifugací (5 min, 4000 x g) a promyje se dvakrát vždy 10 ml 20 mM triethanolaminu/Cl pH 7,2 . Potom se enzym cyklodextringlykosyltransferáza eluuje inkubací komplexu po dobu 1,5 hodiny při teplotě 4 °C 2 ml 1% roztoku β-cyklodextrinu ve 20 mM triethanolaminu/Cl pH 7,2 . Po následujícícentrifugaci (5 min, 4000 x g) se odebere kapalina, obsahující vyčištěnou cyklodextringlykosyltransferázu.

Před charakterisací takto vyčištěné cyklodextringlykosyltransf erázy se musí ještě odstranit v roztoku obsažený, pro eluci použitý β-CD . K tomu se ekvilibruje komerčně dostupný PD-10-sloupec (sephadex G-25 M; Pharmacia) pomocí 35 ml 20 mM tris/Cl pH 7,2 a 5 mM CaCl2 (TC-pufr). β-Cyklodextrin obsahující roztok se doplní TC-pufrem na objem 2,5 ml a nanese se na sloupec. Potom se eluuje pomocí 3,5 ml TC-pufru. Při tom získaný eluát obsahuje vyčištěnou cyklodextringlykosyltransferázu, prostou β-cyklodextrinu.

Příklad 6

Konverse škrobu na cyklodextrin

Stanovení aktivity cyklodextringlykosyltransferázy se provádí pomocí metody, popsané v Eur. J. Biochem. (1990)

191, str. 177-185.

Různá množství roztoku testované cyklodextringlykosyltransf erázy se inkubuje s 5% roztokem rozpustného škrobu (Merck, Darmstadt) v pufru, sestávajícím ze 20 mM Tris/HCl pH 7,2 a 5 mM chloridu vápenatého, po definovanou dobu při teplotě 45 °C . Po dané době se reakce ukončí přídavkem 1,5 objemových dílů methylalkoholu. Nezreagovaný zbytkový škrob se vysráží jednohodinovou inkubací při teplotě 4 °C a oddělí se odstředěním (10 minut, 12000 x g) . Vzniklý produkt se určí pomocí HPLC na sloupci Nukleosilu IO-NH2 (Mancherey & Nagel, Duřen) , přičemž jako standard slouží definované cyklodextriny (Sigma, Munchen). Jako jedna jednotka (1 U) je definované množství enzymu, které ze škrobu vytvoří za popsaných podmínek ΙμΜ cyklodextrinu za minutu.

Příklad 7

Zjištění specifické aktivity celkové cyklodextringlykosy1transferázy vyčištěné cyklodextringlykosyItransferázy

Specifická aktivita celkové cyklodextringlykosyltransferázy vyčištěné cyklodextringlykosyltransferázy je definována jako objemová aktivita pro množství proteinu (U/mg).

Objemová aktivita cyklodextringlykosyltransferázy (U/ml) vzorku enzymu je zjišťována postupem, popsaným v příkladě 6 .

Obsah proteinu (mg/ml) roztoku vyčištěné cyklodextringlykosyltransf erázy se zjišťuje metodou, popsanou M. Bradfordem (Anal. Biochem. (1976) 72, str. 248 a další).

K tomu potřebné chemikálie pocházejí od firmy Bio-Rad .

Pro β-cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus circulans #8 a Bacillus circulans sp. 1-1 , jakož i pro z nich vyrobené deleční mutanty (popsané v příkladech 1 a 2) , byly zjištěny v následující tabulce uvedené aktivity celkové cyklodextringlykosyltransferázy (specifické aktivity) :

Tabulka

Enzym	rel. aktivita (%)	spec. aktivita (U/mg)
divoký typ CGTázy z Bacillus circulans #8	100	100
z ní odvozený deleční mutant	77	82
divoký typ CGTázy z Bacillus sp. 1-1	100	120
z ní odvozený deleční mutant	65	78
mutovaný derivát (Tyr-Trp) CGTázy z Bacillus sp. 1-1	100	23
z ní odvozený deleční mutant	73	17

- 27 Příklad

Konverse škrobu za použití nemutagenisované gama-cyklodextringlykosyltransferázy z Bacillus circulans #8 a Bacillus sp. 1-1 , jakož i derivátů, vyrobených podle příkladů 3 a 4

Pro srovnání produkčních spekter nemutagenisovaných cyklodextringlykosyltransferáz s deriváty, získaných z nich deleční mutagenesí, popsanou v příkladech 1 a 2 , se použij i dvě stejné enzymové aktivity pro konversi škrobu (př. 6). K definovanému časovému úseku se zjišťuje popsanou metodou složení produktu, přičemž se získají následující výsledky :

Srovnání 1 : Bacillus circulans #8

doba (min)	divoký typ CGTázy-· .	deleční mutant '
a-CD (%)	β-CD (%)	γ-CD (%)	γ/(α+β)	a-CD (%)	β-CD (%)	γ-CD (%)	γ/(α-τβ)
5	13	70	17	0,2	9	58,0	33	0,49
10	13,5	70,3	16,2	0,19	8,2	60,5	31,3	0,46
15	11,7	66,3	22,0	0,28	9,4	62,0	28,6	0,40

Srovnání 2 : Bacillus sp. 1-1 A)

doba (min)	divoký typ CGTázy	deleční mutant
a-CD (%)	β-CD (%)	γ-CD (¾)	γ/(α+β)	a-CD (%)	β-CD (%)	γ-CD (%)	γ/(α+β)
5	0	100	0	0	63	32	33	0,47
10	0	88	12	0,14	0	68	32	0,47
15	0	88	12	0,14	0	67,7	32,3	0,48

Β)

dcba (min)	divoký typ CGTázy	deleční mutant !
a-CD (%)	β-CD (%)	v-CD (%)	γ/(α+β)	a-CD (¾)	β-CD (%)	γ-CD (%)	γ/(α+β)
5	0	27	73	2,7	0	0	100	-
10	. 0	31	69	2,23	0	22	78	3,54
15	0	32,5	67,5	2,08	0	16,6	83,4	5,02

Sekvenční protokol (1) Všeobecné údaje

(i)	Přihlašovatel
	(A)	Jméno :	Consortium fúr elektrochemische
			Industrie GmbH
	(B)	Ulice :	Zielstattstrasse 20
	(C)	Místo :	Munchen
	(D)	Spolková země : Bavorsko
	(E)	Země : BRD
	(F)	PSČ : 81379
	(θ)	Telefon	: 049-89-74844-0
	(H)	Telefax	: 049-89-74844-350
(ii)	Název	vynálezu	: Cyklodextringlykosyltransferázy
			pro výrobu gama-cyklodextrinu
(iii)	Počet	sekvencí : 8

(IV) Počítačově čitelná forma :

(A) Nosič dat : Floppy disk (B) Počítač : IBM PC kompatibilní (C) Operační systém : PC-DOS/MS-DOS (D) Software : Patentln Release #1.0, Verse #1.30 (EPA) (2) Údaje k SEQ ID NO : 1 :

(i) Znaky sekvence :

(A) Délka : 24 aminokyselin (B) Druh : aminokyseliny (C) Forma šroubovice :

	(D) topologie	: lineární
(ii)	Druh molekuly :	peptid
(iii)	Hypoteticky : ne
(V)	Druh fragmentu :	vnitřní fragment
(ví)	Původ : (A) Organismus	: Bacillus ohbensis
(xi)	Popis sekvence :	SEQ ID NO : 1 :

Pro Asn His Ser Ser Pro Ala Leu Glu Thr Asp Pro Ser 15 10

Tyr Ala Glu Asn Gly Ala Val Tyr Asn Asp Gly 15 20 (2)

Údaj e	k SEQ	ID NO : 2 :
(i)	Znaky	sekvence :
	(A)	Délka : 24 aminokysel
	(B)	Druh : aminokyseliny
	(C)	Forma šroubovice :
	(D)	topologie : lineární
(ii)	Druh	molekuly : peptid
(iii)	Hypoteticky : ne

(v) Druh fragmentu ; vnitřní fragment (2)

(vi)	Původ
	(A)	Organismus	: Bacillus macerans
(xi)	Popis	sekvence :	SEQ ID NO : 2 :
Pro Asn His	Thr Ser Pro	Ala Asp Arg Asp Asn
1		5	10
Phe Ala Glu	Asn Gly Gly	Met Tyr Asp Asn Gly
15		20
Údaj e	k SEQ	ID NO : 3 :
(i)	Znaky	sekvence :
	(A)	Délka : 24	aminokyselin
	(B)	Druh : aminokyseliny
	(C)	Forma šroubovice :
	(D)	topologie :	lineární
(ii)	Druh molekuly : peptid
(iii)	Hypoteticky : ne
(v)	Druh	fragmentu :	vnitřní fragment
(vi)	Původ
	(A)	Organismus	: Bacillus sp. 1-1
(xi)	Popis	sekvence :	SEQ ID NO : 3 :
Pro Asn His	Ser Ser Prc	j Ala Leu Glu Thr Asn
1		5	10

Tyr Val Glu Asn Gly Ala Ile Tyr Asp Asn Gly 15 20

Údaj e	k SEQ	ID NO : 4 :
(i)	Znaky	sekvence :
	(A)	Délka : 24	aminokyselin
	(B)	Druh : aminokyseliny
	(C)	Forma šroubovice :
	(D)	topologie	: lineární
(ii)	Druh ;	molekuly :	peptid
(iii)	Hypoteticky : ne
(v)	Druh	fragmentu :	vnitřní fragment
(vi)	Původ
	(A)	Organismus	: Bacillus circulans #8
(xi)	Popis	sekvence :	SEQ ID NO : 4 :

Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Met Glu Thr Asp Thr Ser 15 10

Phe Ala Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly 15 20 (2) Údaje k SEQ ID NO : 5 :

(i) Znaky sekvence :

(A) Délka : 6 aminokyselin (B) Druh : aminokyseliny

	(C) (D)	Forma šroubovice : jednoduchá šroubovice
topologie	: lineární
(ii)	Druh	molekuly :	peptid
(iii	) Hypoteticky : ne
(iv)	Antisense : ne
(v)	Druh	fragmentu :	vnitřní fragment
(xi)	Popis	sekvence ;	SEQ ID NO : 5 :
Met	Glu Thr	Asp Thr Ser

5 (2) Údaje k SEQ ID NO : 6 :

(i) Znaky sekvence :

(A) Délka : 30 párů basí (B) Druh : nukleotid (C) Forma šroubovice : jednoduchá šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : jiná nukleová kyselina (A) popis : /desc = syntetický (iii) Hypoteticky : ne (iv) Antisense : ne (vii) Posice v genomu :

(C) Jednotky : bp (xi) Popis sekvence : SEQ ID NO : 6 :

CACACCTCTC CAGCGTTTGC CGAAAATGGC 30 (2) Údaje k SEQ ID NO : 7 :

(i) Znaky sekvence :

(A) Délka : 6 aminokyselin (B) Druh : aminokyseliny (C) Forma šroubovice : jednoduchá šroubovice (D) topologie : lineární

(ii)	Druh molekuly	: peptid
(iii)	Hypoteticky : j	ne
(iv)	Antisense : ne
(v)	Druh fragmentu	: vnitřní fragment
(xi)	Popis sekvence	: SEQ ID NO : 7 :
Leu Glu Thr Asn Pro	Asn

5 (2) Údaje k SEQ ID NO : 8 :

(i) Znaky sekvence :

(A) Délka : 30 párů basí (B) Druh : nukleotid (C) Forma šroubovice : jednoduchá šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : jiná nukleová kyselina (A) popis : /desc = syntetický (iii) Hypoteticky : ne (iv) Antisense ; ne (vii) Posice v genomu :

(C) Jednotky : bp (xi) Popis sekvence ; SEQ ID NO : 8 ;

CATTCATCAC CGGCATATGT TGAAAATGGG 30 advokát

V£ů CO PfiAHA 2, HťS®W}|.>

Claims (10)

1. Cyklodextringlykosyltransferázy, které při přeměně škrobu nebo škrobu podobných substrátů na cyklodextrin poskytují ve zvýšené míře gama-cyklodextrin a které mají ještě alespoň 60 % specifické celkové cyklodextringlykosyltransf erázové aktivity výchozí cyklodextringlykosyltransferázy, použité pro výrobu daného enzymu, vyznačující se tím, že jejich aminokyselinová sekvence se liší od aminokyselinové sekvence známých cyklodextringlykosyltransferáz v oblasti posice aminokyseliny 155 až do posice aminokyseliny 195 včetně deleci alespoň jedné aminokyseliny, přičemž posice 1 proteinové sekvence je počátkem signálního peptidu cyklodextringlykosyltransf erázy a delece způsobuje zvýšení aktivity gama-cyklodextringlykosyItransferázy proteinu.

2. Cyklodextringlykosyltransferázy podle nároku 1 , vyznačující se tím, že v oblasti mezi posicí aminokyseliny 155 a posicí aminokyseliny 195 jejich proteinové sekvence jsou čtyři až osm aminokyselinových zbytků deletováno, přičemž posice 1 proteinové sekvence je počátkem signálního peptidu cyklodextringlykosyltransferázy a delece způsobuje zvýšení aktivity gama-cyklodextringlykosyltransferázy proteinu.

3. Cyklodextringlykosyltransferázy podle nároku 1 , vyznačující se tím, že v oblasti mezi posicí aminokyseliny 155 a posicí aminokyseliny 195 jejich proteinové sekvence je šest aminokyselinových zbytků deletováno, přičemž posice 1 proteinové sekvence je počátkem signálního peptidu cyklodextringlykosyltransferázy a delece způsobuje zvýšení aktivity gama-cyklodextringlykosyltransferázy proteinu.

4. Cyklodextringlykosyltransferázy podle nároku 1 , vyznačující se tím, že se jejich aminokyselinové sekvence liší od aminokyselinových sekvencí v tabulce 1 uvedených cyklodextringlykosyltransferáz alespoň delecí tučně vytištěných aminokyselinových zbytků, přičemž ostatní aminokyselinová sekvence odopvídající cyklodextringlykosyltransferázy je tak dalece homologní k aminokyselinové sekvenci cyklodextringlykosyltransferázy v tabulce 1 uvedeného mikroorganismu, že sekvence má bez delece podle předloženého vynálezu aktivitu cyklodextringlykosyltransf erázy .

5. Způsob výroby mutovaných genů cyklodextringlykosyltransf erázy, které kódují cyklodextringlykosyltransferázy podle předloženého vynálezu, vyznačující se tím, že se sekvence DNK genu, kódujícího výchozí cyklodextringlykosyltransferázu, pomocí o sobě známých metod mutagenese tak mutuje, že se sekvence aminokyselin, kódovaná DNK-sekvencí mutujícího genu, liší delecí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku v oblasti mezi posicí aminokyselin 155 a 195 od aminokyse38 línové sekvence, kódované DNK nemutovaného genu.

6. Způsob podle nároku 5 , vyznačující se tím, že se DNK-sekvence genu, kódujícího výchozí cyklodextringlykosyltransferázu, mutuje pomocí o sobě známých metod mutagenese tak, že se aminokyselinová sekvence, kódovaná DNK-sekvencí mutovaného genu, liší od aminokyselinové sekvence, kódované DNK nemutovaného genu, delecí čtyř až osmi aminokyselinových zbytků v oblasti mezi posici aminokyselin 155 až 195.

7. Způsob podle nároku 5 , vyznačující se tím, že se DNK-sekvence genu, kódujícího výchozí cyklodextringlykosyltransferázu, mutuje pomocí o sobě známých metod mutagenese tak, že se aminokyselinová sekvence, kódovaná DNK-sekvencí mutovaného genu, liší od aminokyselinové sekvence, kódované DNK nemutovaného genu, delecí šesti aminokyselinových zbytků v oblasti mezi posici aminokyselin 155 až 195.

8. Sekvence DNK , vyznačující se tím, že kóduje cyklodextringlykosyltransferázy podle nároku 1 .

9. Způsob výroby gama-cyklodextringlykosyltransferáz, vyznačující se tím, že se alespoň jedna DNK-sekvence podle nároku 8 exprimuje do mikroorganismu.

10. Způsob výroby gama-cyklodextrinu přeměnou škrobu za použití cyklodextringlykosyltransferázy, vyznačující se tím, že se jako cyklodextringlykosyltransf eráza použije alespoň jedna cyklodextrin glykosyltransferáza podle některého z nároků 1 až 4 .