JPH0541985A - 変異サイクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ - Google Patents
変異サイクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼInfo
- Publication number
- JPH0541985A JPH0541985A JP3752591A JP3752591A JPH0541985A JP H0541985 A JPH0541985 A JP H0541985A JP 3752591 A JP3752591 A JP 3752591A JP 3752591 A JP3752591 A JP 3752591A JP H0541985 A JPH0541985 A JP H0541985A
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- JP
- Japan
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- cgtase
- cyclodextrin
- region
- modified
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 サイクロデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼ（CGTase）のＡ領域、Ｂ領域又はＣ領域に存在す
るヒスタジン残基の少なくとも１個をアスパラギン残基
に改変したCGTaseを提供する。 【効果】 この改変されたCGTaseを澱粉に使用させた場
合、生成物中のγ−サイクロデキストリンの比率が増加
し、γ−サイクロデキストリンの製造のために好適であ
る。
ラーゼ（CGTase）のＡ領域、Ｂ領域又はＣ領域に存在す
るヒスタジン残基の少なくとも１個をアスパラギン残基
に改変したCGTaseを提供する。 【効果】 この改変されたCGTaseを澱粉に使用させた場
合、生成物中のγ−サイクロデキストリンの比率が増加
し、γ−サイクロデキストリンの製造のために好適であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は改変されたCGTase遺伝
子、改変されたCGTase遺伝子を保持する組換え微生物、
改変されたCGTase、及び改変されたCGTaseを使用したサ
イクロデキストリンの製造方法に関する。
子、改変されたCGTase遺伝子を保持する組換え微生物、
改変されたCGTase、及び改変されたCGTaseを使用したサ
イクロデキストリンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】CGTase（Cyclomaltodextrin glucanotra
nsferase）は澱粉からα−サイクロデキストリン、β−
サイクロデキストリン、及びγ−サイクロデキストリン
等の各種のサイクロデキストリン混合物を生成する酵素
であり、ＥＣ ２．４．１．16として転移酵素に分類さ
れている。現在までに、Bacillus属、Klebsiella属、及
び Micrococcus属に属する細菌が、このCGTaseを生産す
る微生物として報告されている。
nsferase）は澱粉からα−サイクロデキストリン、β−
サイクロデキストリン、及びγ−サイクロデキストリン
等の各種のサイクロデキストリン混合物を生成する酵素
であり、ＥＣ ２．４．１．16として転移酵素に分類さ
れている。現在までに、Bacillus属、Klebsiella属、及
び Micrococcus属に属する細菌が、このCGTaseを生産す
る微生物として報告されている。
【０００３】澱粉からの生成物であるα−サイクロデキ
ストリン、β−サイクロデキストリン、及びγ−サイク
ロデキストリンは、それぞれ６，７、及び８残基のグル
コースがα−１，４−結合により環状構造をとったホモ
・オリゴ糖であり、いずれのサイクロデキストリンも環
状構造の空隙にホストとなる疎水性の様々な物質を保持
して安定な抱接化合物を形成し、親水性を与える。サイ
クロデキストリンは、この抱接機能を持つため、食品・
薬品・その他の産業において有用で且つ生体に安全な物
質である。
ストリン、β−サイクロデキストリン、及びγ−サイク
ロデキストリンは、それぞれ６，７、及び８残基のグル
コースがα−１，４−結合により環状構造をとったホモ
・オリゴ糖であり、いずれのサイクロデキストリンも環
状構造の空隙にホストとなる疎水性の様々な物質を保持
して安定な抱接化合物を形成し、親水性を与える。サイ
クロデキストリンは、この抱接機能を持つため、食品・
薬品・その他の産業において有用で且つ生体に安全な物
質である。
【０００４】代表的なα−、β−、及びγ−のサイクロ
デキストリンは、その環状構造の空隙の直径がそれぞれ
約６，８、及び10オングストロームと異なる。そのた
め、この３種類のサイクロデキストリンを比較した場
合、ホストとなる物質の多様性は空隙の直径が、より大
きい方が望ましく、また親水性の抱接化合物を形成する
為には水への溶解度の高いα−、及びγ−サイクロデキ
ストリンが適している。即ち、この３種類のサイクロデ
キストリンを比較した場合、γ−サイクロデキストリン
の機能が最も高い。
デキストリンは、その環状構造の空隙の直径がそれぞれ
約６，８、及び10オングストロームと異なる。そのた
め、この３種類のサイクロデキストリンを比較した場
合、ホストとなる物質の多様性は空隙の直径が、より大
きい方が望ましく、また親水性の抱接化合物を形成する
為には水への溶解度の高いα−、及びγ−サイクロデキ
ストリンが適している。即ち、この３種類のサイクロデ
キストリンを比較した場合、γ−サイクロデキストリン
の機能が最も高い。
【０００５】従来、この有用なγ−サイクロデキストリ
ンを製造するためには、CGTaseを基質である澱粉に作用
させて、各種のサイクロデキストリンの混合液を生成し
た後、晶出分離・クロマト分離等により、生成物のα
−、またはβ−サイクロデキストリンを系外に除去し
て、高濃度のγ−サイクロデキストリンを調製してい
た。
ンを製造するためには、CGTaseを基質である澱粉に作用
させて、各種のサイクロデキストリンの混合液を生成し
た後、晶出分離・クロマト分離等により、生成物のα
−、またはβ−サイクロデキストリンを系外に除去し
て、高濃度のγ−サイクロデキストリンを調製してい
た。
【０００６】この方法によりγ−サイクロデキストリン
を効率良く生産するには、例えば、特開昭52-79039及び
特開昭60−227693に開示された方法により、界面活性剤
等を酵素反応系に添加して、生成される各種のサイクロ
デキストリンの比率を変え、目的のサイクロデキストリ
ンの収率を上げる方法がある。しかし、この方法では、
界面活性剤等の残留の可能性があるため、食品等に使用
されるサイクロデキストリンの生産に適さない。
を効率良く生産するには、例えば、特開昭52-79039及び
特開昭60−227693に開示された方法により、界面活性剤
等を酵素反応系に添加して、生成される各種のサイクロ
デキストリンの比率を変え、目的のサイクロデキストリ
ンの収率を上げる方法がある。しかし、この方法では、
界面活性剤等の残留の可能性があるため、食品等に使用
されるサイクロデキストリンの生産に適さない。
【０００７】また別の方法として、目的のγ−サイクロ
デキストリン生成比率がより高いCGTase使用して、γ−
サイクロデキストリンを効率良く生産する方法がある。
即ち、γ−サイクロデキストリン生成比率がより高いCG
Taseを生産する微生物を自然界より新たに分離する方法
である。この方法の一例は、『澱粉科学』33， 137−14
3(1986）に堀越等により報告されているBacillus subti
lis No.313株である。報告によれば、この微生物の生産
するCGTaseは澱粉を基質にしてγ−サイクロデキストリ
ンのみを生成するが、しかし澱粉からの生産効率は３％
と低い。
デキストリン生成比率がより高いCGTase使用して、γ−
サイクロデキストリンを効率良く生産する方法がある。
即ち、γ−サイクロデキストリン生成比率がより高いCG
Taseを生産する微生物を自然界より新たに分離する方法
である。この方法の一例は、『澱粉科学』33， 137−14
3(1986）に堀越等により報告されているBacillus subti
lis No.313株である。報告によれば、この微生物の生産
するCGTaseは澱粉を基質にしてγ−サイクロデキストリ
ンのみを生成するが、しかし澱粉からの生産効率は３％
と低い。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、抱接化
合物等に有用なγ−サイクロデキストリンを製造するた
め、上記の界面活性剤等の生体に危険な物質あるいは安
全であることが確認されていない物質を使用しない方法
であり、且つ、γ−サイクロデキストリンの生成比率の
より高いCGTaseを生産する方法を鋭意研究した。そのた
めに、γ−サイクロデキストリン生成比率が高いCGTase
を生産する微生物を土壌等より新たに分離する方法によ
らず、既に得られているCGTase遺伝子を遺伝子工学的に
改変してγ−サイクロデキストリン生成比率が高いCGTa
seを生産する方法を研究した。
合物等に有用なγ−サイクロデキストリンを製造するた
め、上記の界面活性剤等の生体に危険な物質あるいは安
全であることが確認されていない物質を使用しない方法
であり、且つ、γ−サイクロデキストリンの生成比率の
より高いCGTaseを生産する方法を鋭意研究した。そのた
めに、γ−サイクロデキストリン生成比率が高いCGTase
を生産する微生物を土壌等より新たに分離する方法によ
らず、既に得られているCGTase遺伝子を遺伝子工学的に
改変してγ−サイクロデキストリン生成比率が高いCGTa
seを生産する方法を研究した。
【０００９】現在までに報告されているCGTase遺伝子の
塩基配列から推定されるアミノ酸配列の11種類を比較す
ると、構成するアミノ酸残基数はいずれも約 700アミノ
酸残基であり、またアミノ酸レベルでいずれも互いに約
70％の一致を示している。また、CGTaseと澱粉基質との
結合を支配する活性アミノ酸残基の配列と推定される領
域は、Ａ領域、Ｂ領域、及びＣ領域と推定されている。
それらの位置は、概ね成熟型酵素のアミノ末端から 140
残基目付近、 233残基目付近、及び 327残基目付近に存
在し、これらの領域では高い相同性が認められる。この
位置は、イニシャル・メチオニンから、概ね、 169残基
目付近、 262残基目付近、及び 356残基目付近に存在す
る（表１参照）。
塩基配列から推定されるアミノ酸配列の11種類を比較す
ると、構成するアミノ酸残基数はいずれも約 700アミノ
酸残基であり、またアミノ酸レベルでいずれも互いに約
70％の一致を示している。また、CGTaseと澱粉基質との
結合を支配する活性アミノ酸残基の配列と推定される領
域は、Ａ領域、Ｂ領域、及びＣ領域と推定されている。
それらの位置は、概ね成熟型酵素のアミノ末端から 140
残基目付近、 233残基目付近、及び 327残基目付近に存
在し、これらの領域では高い相同性が認められる。この
位置は、イニシャル・メチオニンから、概ね、 169残基
目付近、 262残基目付近、及び 356残基目付近に存在す
る（表１参照）。
【００１０】
【表１】
【００１１】第１欄は、酵素の由来及び文献を示し、第
２、第３、及び第４欄は、それぞれの酵素のＡ領域、Ｂ
領域、及びＣ領域のアミノ酸配列を１文字表記で示す。
第２、第３、及び第４欄のＨの上の数字は、成熟型酵素
のアミノ末端を１としたときのヒスチジン残基の残基番
号を示し、プラス（＋）の添字のある数字は、イニシャ
ル・メチオニンを１としたときのヒスチジン残基の残基
番号を示す。
２、第３、及び第４欄は、それぞれの酵素のＡ領域、Ｂ
領域、及びＣ領域のアミノ酸配列を１文字表記で示す。
第２、第３、及び第４欄のＨの上の数字は、成熟型酵素
のアミノ末端を１としたときのヒスチジン残基の残基番
号を示し、プラス（＋）の添字のある数字は、イニシャ
ル・メチオニンを１としたときのヒスチジン残基の残基
番号を示す。
【００１２】文献 （１）Kimura,K.,Kataoka,S.,Ishii,Y.,Takano,T.& Yam
ane,K.(1987)J.Bacteriol.169.4399-4402 （２）Nishizawa,M.,Ozawa,F.& Hishinuma,F.(1987)DNA
6.255-265 （３）及び（６）Sakai,S.,Kubota,M.,Yamamoto,K.,Nak
ada,T.,Torigoe,K.,Ando,O.& Sugimoto,T.(1987)Denpun
Kagaku 34.140-147 （４）Takano,T.,Fukuda,M.,Monma,m.,Kobayashi,S.,Ka
inuma,K.& Yamane,k.(1968)J.Bacteriol.166.1118-1122 （５）Binder,F.,Huber,O.& Boeck,A.(1968)Gene 47.26
9-277 （７）Kaneko,T.,Hamamoto,T.& Horikoshi,K.(1988)J.G
eneral Microbiol.134.97-105 （８）Kaneko,T.,Song,K.,Hamamoto,T.,Kudo,T.& Horik
oshi,K.(1989)J.GeneralMicrobiol.135.3447-3457 （９）Schmid,G.,Englbrecht,A.& Schmid,D.(1988)Proc
eedings 4th.Internat.Sympo.Cyclodextrins(Munich,We
st Germany)Kluwer Academic Publishers.pp7-17 （10）Hill,D.,Aldape,R.& Rozzell,D.(1990)Nucleic A
cids Research 18.199 （11）Horikoshi,K.(1988)Proceedings 4th.Internat.S
ymp.Cyclodextrins(Munich,West Germany)Kluwer Acade
mic Publishers.pp71-76
ane,K.(1987)J.Bacteriol.169.4399-4402 （２）Nishizawa,M.,Ozawa,F.& Hishinuma,F.(1987)DNA
6.255-265 （３）及び（６）Sakai,S.,Kubota,M.,Yamamoto,K.,Nak
ada,T.,Torigoe,K.,Ando,O.& Sugimoto,T.(1987)Denpun
Kagaku 34.140-147 （４）Takano,T.,Fukuda,M.,Monma,m.,Kobayashi,S.,Ka
inuma,K.& Yamane,k.(1968)J.Bacteriol.166.1118-1122 （５）Binder,F.,Huber,O.& Boeck,A.(1968)Gene 47.26
9-277 （７）Kaneko,T.,Hamamoto,T.& Horikoshi,K.(1988)J.G
eneral Microbiol.134.97-105 （８）Kaneko,T.,Song,K.,Hamamoto,T.,Kudo,T.& Horik
oshi,K.(1989)J.GeneralMicrobiol.135.3447-3457 （９）Schmid,G.,Englbrecht,A.& Schmid,D.(1988)Proc
eedings 4th.Internat.Sympo.Cyclodextrins(Munich,We
st Germany)Kluwer Academic Publishers.pp7-17 （10）Hill,D.,Aldape,R.& Rozzell,D.(1990)Nucleic A
cids Research 18.199 （11）Horikoshi,K.(1988)Proceedings 4th.Internat.S
ymp.Cyclodextrins(Munich,West Germany)Kluwer Acade
mic Publishers.pp71-76
【００１３】この11種類のCGTaseのそれぞれにより生成
される各種のサイクロデキストリンの比率は異なるが、
いずれも３種類のサイクロデキストリンの混合物を生成
する。それ故、CGTaseの活性アミノ酸残基の配列の一部
を改変することにより、γ−サイクロデキストリン生成
比率が高いCGTaseを創製する事が可能であり、この為に
はCGTaseの遺伝子のＤＮＡ配列を部分的に改変してγ−
サイクロデキストリン生成比率がより高いCGTase遺伝子
を創製することが可能であると考えた。
される各種のサイクロデキストリンの比率は異なるが、
いずれも３種類のサイクロデキストリンの混合物を生成
する。それ故、CGTaseの活性アミノ酸残基の配列の一部
を改変することにより、γ−サイクロデキストリン生成
比率が高いCGTaseを創製する事が可能であり、この為に
はCGTaseの遺伝子のＤＮＡ配列を部分的に改変してγ−
サイクロデキストリン生成比率がより高いCGTase遺伝子
を創製することが可能であると考えた。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明に使用するCGTase
遺伝子の由来は、Bacillus属、Klebsiella属、あるい
は、 Micrococcus属等のCGTase遺伝子を有する微生物な
ら、いずれでも可能であり、１例として好アルカリ性Ba
cillus属由来の遺伝子を挙げることができる。本発明者
等により土壌より分離された好アルカリ性Bacillus sp.
♯1011（微工研菌寄第8685号）は、CGTaseの高生産株で
あり、そのCGTase遺伝子は本発明者等により、既に染色
体ＤＮＡより大腸菌、あるいは枯草菌プラスミド上にク
ローニングされ、塩基配列が決定されている〔(Appl.Mi
crobiol.Biotechnol.26.149(1987) 、J.Bacteriol.169.
4399(1987)、及び特開昭62−208286〕。その際に得られ
たプラスミドpTUE217 は、上記♯1011株のCGTase遺伝子
を含むSaw3AI断片（5.６kb）が大腸菌プラスミドpBR322
のBamHI サイトへ挿入されたプラスミド（10.0kb、図１
にその制限酵素地図を示す。）であり、CGTase遺伝子は
大腸菌内で安定に発現される。
遺伝子の由来は、Bacillus属、Klebsiella属、あるい
は、 Micrococcus属等のCGTase遺伝子を有する微生物な
ら、いずれでも可能であり、１例として好アルカリ性Ba
cillus属由来の遺伝子を挙げることができる。本発明者
等により土壌より分離された好アルカリ性Bacillus sp.
♯1011（微工研菌寄第8685号）は、CGTaseの高生産株で
あり、そのCGTase遺伝子は本発明者等により、既に染色
体ＤＮＡより大腸菌、あるいは枯草菌プラスミド上にク
ローニングされ、塩基配列が決定されている〔(Appl.Mi
crobiol.Biotechnol.26.149(1987) 、J.Bacteriol.169.
4399(1987)、及び特開昭62−208286〕。その際に得られ
たプラスミドpTUE217 は、上記♯1011株のCGTase遺伝子
を含むSaw3AI断片（5.６kb）が大腸菌プラスミドpBR322
のBamHI サイトへ挿入されたプラスミド（10.0kb、図１
にその制限酵素地図を示す。）であり、CGTase遺伝子は
大腸菌内で安定に発現される。
【００１５】このCGTaseにより澱粉から生成される各種
のサイクロデキストリンの生成比率を変化させる目的
で、この酵素の活性アミノ酸残基を含む領域と考えられ
るＡ，Ｂ、及びＣ領域（J.Bacteriol.169:4399(1987))
に存在するヒスチジン残基のいずれかの１残基を、アス
パラギン残基あるいはアルギニン残基にＤＮＡレベルで
改変した。その結果、上記のいずれかのヒスチジン１残
基をアスパラギン残基に改変することにより、γ−サイ
クロデキストリン生成比率がより高いCGTaseを創製する
事が可能となった。
のサイクロデキストリンの生成比率を変化させる目的
で、この酵素の活性アミノ酸残基を含む領域と考えられ
るＡ，Ｂ、及びＣ領域（J.Bacteriol.169:4399(1987))
に存在するヒスチジン残基のいずれかの１残基を、アス
パラギン残基あるいはアルギニン残基にＤＮＡレベルで
改変した。その結果、上記のいずれかのヒスチジン１残
基をアスパラギン残基に改変することにより、γ−サイ
クロデキストリン生成比率がより高いCGTaseを創製する
事が可能となった。
【００１６】即ち、CGTaseの成熟型酵素のアミノ末端よ
り、 140残基目、あるいは 233残基目、あるいは 327残
基目に存在するヒスチジン残基のいずれかの１残基をア
スパラギン残基あるいはアルギニン残基に改変するＤＮ
Ａ配列を有する改変CGTase遺伝子を部位特異的変異（Si
te-Directed Mutagenesis)により創製した。この 140残
基目、 233残基目、あるいは 327残基目に存在するヒス
チジン残基は、それぞれCGTaseのＡ領域、Ｂ領域、及び
Ｃ領域に存在する（表１参照）。
り、 140残基目、あるいは 233残基目、あるいは 327残
基目に存在するヒスチジン残基のいずれかの１残基をア
スパラギン残基あるいはアルギニン残基に改変するＤＮ
Ａ配列を有する改変CGTase遺伝子を部位特異的変異（Si
te-Directed Mutagenesis)により創製した。この 140残
基目、 233残基目、あるいは 327残基目に存在するヒス
チジン残基は、それぞれCGTaseのＡ領域、Ｂ領域、及び
Ｃ領域に存在する（表１参照）。
【００１７】以下に、改変の方法の一例をあげる。以下
の操作において形質転換株のプレート上での分離では、
１％澱粉を含む選択培地を使用して、コロニーの現われ
たプレートにヨウ素液を噴霧してハロー（透明環）を検
出したコロニーを選択した。その後、薄層クロマトグラ
フィー分析によりその株のCGTase活性の有無を確認し
た。
の操作において形質転換株のプレート上での分離では、
１％澱粉を含む選択培地を使用して、コロニーの現われ
たプレートにヨウ素液を噴霧してハロー（透明環）を検
出したコロニーを選択した。その後、薄層クロマトグラ
フィー分析によりその株のCGTase活性の有無を確認し
た。
【００１８】プラスミドpTUE217(図１）を制限酵素SphI
及びSmaIにより切断して調製した1.８kbのＤＮＡ断片に
は、CGTase構造遺伝子のＡ領域からカルボキシ末端に至
る１次構造を完全にコードする塩基配列が含まれてい
る。このＤＮＡ断片を、Messing,J により開発された大
腸菌繊維状ファージ・プラスミドM13mp18(宝酒造（株）
より購入。Methods Enzymol.101.20(1983)) のSphI-Sma
I サイトへ導入し、大腸菌BW313 株（宝酒造（株）より
購入。HfrKL16PO ／45 lsyA(61-62) dut1 ung1 th
i-1 relA1 ）を宿主としてＤＮＡ中にチミンの代わり
に一部ウラシルが混在しているssDNA(一重鎖ＤＮＡ，si
ngle stranded DNA)を調製した。このssDNA にKunkel,
T.A. らの方法（Methods Enzymol.154.367(1987))に従
って変異を導入した。
及びSmaIにより切断して調製した1.８kbのＤＮＡ断片に
は、CGTase構造遺伝子のＡ領域からカルボキシ末端に至
る１次構造を完全にコードする塩基配列が含まれてい
る。このＤＮＡ断片を、Messing,J により開発された大
腸菌繊維状ファージ・プラスミドM13mp18(宝酒造（株）
より購入。Methods Enzymol.101.20(1983)) のSphI-Sma
I サイトへ導入し、大腸菌BW313 株（宝酒造（株）より
購入。HfrKL16PO ／45 lsyA(61-62) dut1 ung1 th
i-1 relA1 ）を宿主としてＤＮＡ中にチミンの代わり
に一部ウラシルが混在しているssDNA(一重鎖ＤＮＡ，si
ngle stranded DNA)を調製した。このssDNA にKunkel,
T.A. らの方法（Methods Enzymol.154.367(1987))に従
って変異を導入した。
【００１９】即ち、CGTaseのアミノ末端より、 140残基
目、あるいは 233残基目、あるいは327残基目に存在す
るヒスチジン残基をアスパラギン残基に改変するＤＮＡ
配列を有する改変遺伝子を部位特異的変異により創製す
るために、以下に示すH140N,H233N, H327N の３種類の
合成ＤＮＡを調製した。 H140N ： 5´CACCGAACAATACATCTC3´ H233N ： 5´GCGGTCAAGAATATGCCA3 ´ H327N ： 5´ATCGACAATAATGACAT3´
目、あるいは 233残基目、あるいは327残基目に存在す
るヒスチジン残基をアスパラギン残基に改変するＤＮＡ
配列を有する改変遺伝子を部位特異的変異により創製す
るために、以下に示すH140N,H233N, H327N の３種類の
合成ＤＮＡを調製した。 H140N ： 5´CACCGAACAATACATCTC3´ H233N ： 5´GCGGTCAAGAATATGCCA3 ´ H327N ： 5´ATCGACAATAATGACAT3´
【００２０】また、CGTaseのアミノ末端より、 140残基
目、あるいは 233残基目、あるいは327残基目に存在す
るヒスチジン残基をアルギニン残基に改変するＤＮＡ配
列を有する改変遺伝子を部位特異的変異により創製する
ために、以下に示すH140R, H233R, H327R の３種類の合
成ＤＮＡを調製した。 H140R ： 5´GCACCGAACCGTACATCTCCG3´ H233R ： 5´GCGGTCAAGCGTATGCCATTC3´ H327R ： 5´ATCGACAATCGTGACATGGAG3´
目、あるいは 233残基目、あるいは327残基目に存在す
るヒスチジン残基をアルギニン残基に改変するＤＮＡ配
列を有する改変遺伝子を部位特異的変異により創製する
ために、以下に示すH140R, H233R, H327R の３種類の合
成ＤＮＡを調製した。 H140R ： 5´GCACCGAACCGTACATCTCCG3´ H233R ： 5´GCGGTCAAGCGTATGCCATTC3´ H327R ： 5´ATCGACAATCGTGACATGGAG3´
【００２１】ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社のDN
A Synthesizer model 380Aを使用し、固相β−シアノエ
チル法により合成した。合成ＤＮＡの精製にはApplied
Biosystems社のOligonucleotide Purification Cartrid
geを使用した。これらの変異の導入の結果は、ＤＮＡシ
ーケンスにより確認した。
A Synthesizer model 380Aを使用し、固相β−シアノエ
チル法により合成した。合成ＤＮＡの精製にはApplied
Biosystems社のOligonucleotide Purification Cartrid
geを使用した。これらの変異の導入の結果は、ＤＮＡシ
ーケンスにより確認した。
【００２２】その後、これらの変異の導入された６種類
のファージのRF−DNA(replicativeform−DNA)をアルカ
リ−ＳＤＳ法（Birnboim,H.C.& Doly,J.Nucleic Acids
Res.7.1513(1979)）により抽出し、その変異を受けたＤ
ＮＡ配列を含む６種類のSphI−Afl II断片（1.８kb）を
調製した。この1.８kbのＤＮＡ断片（以下、変異ＤＮＡ
断片という。）には、いずれもCGTaseのＡ領域からカル
ボキシ末端に至る１次構造に相当する領域を完全にコー
ドする塩基配列が含まれており、但し、この塩基配列で
は部位特異的変異により、それぞれの一か所のヒスチジ
ン残基のコードが変異を受けている。
のファージのRF−DNA(replicativeform−DNA)をアルカ
リ−ＳＤＳ法（Birnboim,H.C.& Doly,J.Nucleic Acids
Res.7.1513(1979)）により抽出し、その変異を受けたＤ
ＮＡ配列を含む６種類のSphI−Afl II断片（1.８kb）を
調製した。この1.８kbのＤＮＡ断片（以下、変異ＤＮＡ
断片という。）には、いずれもCGTaseのＡ領域からカル
ボキシ末端に至る１次構造に相当する領域を完全にコー
ドする塩基配列が含まれており、但し、この塩基配列で
は部位特異的変異により、それぞれの一か所のヒスチジ
ン残基のコードが変異を受けている。
【００２３】次に、上記プラスミドpTUE217 のHind III
断片（5.０kb）を調製する。このＤＮＡ断片には、CGTa
se遺伝子が完全に含まれている。このＤＮＡ断片を、Me
ssing,J により開発された大腸菌プラスミドpUC13(宝酒
造（株）より購入。MethodsEnzymol.101.20(1983)) のH
ind IIIサイトへ、lac Z 遺伝子とCGTase遺伝子の転写
方向が同じになるように、挿入し、新たなプラスミドpT
UE254 を構築した。このプラスミド上のCGTase遺伝子は
大腸菌内で安定に発現される。
断片（5.０kb）を調製する。このＤＮＡ断片には、CGTa
se遺伝子が完全に含まれている。このＤＮＡ断片を、Me
ssing,J により開発された大腸菌プラスミドpUC13(宝酒
造（株）より購入。MethodsEnzymol.101.20(1983)) のH
ind IIIサイトへ、lac Z 遺伝子とCGTase遺伝子の転写
方向が同じになるように、挿入し、新たなプラスミドpT
UE254 を構築した。このプラスミド上のCGTase遺伝子は
大腸菌内で安定に発現される。
【００２４】この新たなプラスミドpTUE254 において、
存在するCGTase遺伝子に含まれるSphIサイト及びAfl II
サイトで囲まれるＤＮＡ領域（1.８kb。この領域には、
CGTaseのＡ領域からカルボキシ末端に至る１次構造を完
全にコードする塩基配列が含まれている。）を消化し
た。そこへ上記の６種類の変異ＤＮＡ断片をそれぞれ挿
入し、プラスミドを構築し、宿主である大腸菌ME8417株
に形質転換し、変異CGTase遺伝子を含む６種類のプラス
ミドを分離した。これらの６種類のプラスミドを含む大
腸菌ME8417形質転換株において、変異CGTase遺伝子は安
定に発現されることを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動（分子量は♯1011株のCGTaseと同様で66kD
であった。）、及びサザン・ブロッティング、更に薄層
クロマトグラフィー分析によるサイクロデキストリンの
検出により確認した。この６種類のプラスミドをそれぞ
れpH140N, pH233N, pH327N, pH140R, pH233R及びpH327R
と称する。
存在するCGTase遺伝子に含まれるSphIサイト及びAfl II
サイトで囲まれるＤＮＡ領域（1.８kb。この領域には、
CGTaseのＡ領域からカルボキシ末端に至る１次構造を完
全にコードする塩基配列が含まれている。）を消化し
た。そこへ上記の６種類の変異ＤＮＡ断片をそれぞれ挿
入し、プラスミドを構築し、宿主である大腸菌ME8417株
に形質転換し、変異CGTase遺伝子を含む６種類のプラス
ミドを分離した。これらの６種類のプラスミドを含む大
腸菌ME8417形質転換株において、変異CGTase遺伝子は安
定に発現されることを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動（分子量は♯1011株のCGTaseと同様で66kD
であった。）、及びサザン・ブロッティング、更に薄層
クロマトグラフィー分析によるサイクロデキストリンの
検出により確認した。この６種類のプラスミドをそれぞ
れpH140N, pH233N, pH327N, pH140R, pH233R及びpH327R
と称する。
【００２５】この部位特異的変異により創製された変異
CGTase遺伝子は、ここで大腸菌形質転換株にクローン化
されたが、宿主は限定されず、枯草菌等の細菌、放線
菌、酵母等のいずれの微生物でも可能である。また、親
株を含めてこれらの微生物の染色体ＤＮＡにインテグレ
ートして発現することも可能である。
CGTase遺伝子は、ここで大腸菌形質転換株にクローン化
されたが、宿主は限定されず、枯草菌等の細菌、放線
菌、酵母等のいずれの微生物でも可能である。また、親
株を含めてこれらの微生物の染色体ＤＮＡにインテグレ
ートして発現することも可能である。
【００２６】変異CGTaseの精製は、以下の手順によっ
た。上記の６種類の変異CGTase遺伝子をそれぞれ含むプ
ラスミドpH140N, pH233N, pH327N, pH140R, pH233R、及
びpH327Rを安定して保持する６株の大腸菌ME8417形質転
換株を、pH140N-E.coli ME8417, pH233N-E.coli ME841
7, pH327N-E.coli ME8417, pH140R-E.coli ME8417, pH2
33R-E.coli ME8417、及び pH327R-E.coli ME8417 と称
する。この６株について、250μｇ／mlアンピシリン、2
0μｇ／テトラサイクリンを含むＬ−ブロス培地（トリ
プトン １％、酵母エキス 0.５％、NaCl 0.５％)500
mlで培養し、集菌し、オスモチック・ショック法（Cha
n,S.J.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78.5401(198
1))により、大腸菌ペリプラズム画分を調製する。
た。上記の６種類の変異CGTase遺伝子をそれぞれ含むプ
ラスミドpH140N, pH233N, pH327N, pH140R, pH233R、及
びpH327Rを安定して保持する６株の大腸菌ME8417形質転
換株を、pH140N-E.coli ME8417, pH233N-E.coli ME841
7, pH327N-E.coli ME8417, pH140R-E.coli ME8417, pH2
33R-E.coli ME8417、及び pH327R-E.coli ME8417 と称
する。この６株について、250μｇ／mlアンピシリン、2
0μｇ／テトラサイクリンを含むＬ−ブロス培地（トリ
プトン １％、酵母エキス 0.５％、NaCl 0.５％)500
mlで培養し、集菌し、オスモチック・ショック法（Cha
n,S.J.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78.5401(198
1))により、大腸菌ペリプラズム画分を調製する。
【００２７】低温にて25％硫安の塩析条件で１時間維持
した後、遠心上清をあらかじめpH8.０のトリス−塩酸緩
衝液、25％硫安で平衡化したToyopearl HW-55Fを充填し
たカラムでカラムクロマトグラフィー分析し、CGTaseを
カラムに吸着させた後、pH8.０のトリス−塩酸緩衝液で
CGTaseを溶出させた。酵素の澱粉分解活性をFuwaの方法
（Fuwa,H J.Biochem.41.583(1954))によるヨウ素澱粉反
応で分析し、活性フラクッションを集め、pH8.０のトリ
ス−塩酸緩衝液で透析し、６種類の精製酵素標品をそれ
ぞれ約20mg得た。
した後、遠心上清をあらかじめpH8.０のトリス−塩酸緩
衝液、25％硫安で平衡化したToyopearl HW-55Fを充填し
たカラムでカラムクロマトグラフィー分析し、CGTaseを
カラムに吸着させた後、pH8.０のトリス−塩酸緩衝液で
CGTaseを溶出させた。酵素の澱粉分解活性をFuwaの方法
（Fuwa,H J.Biochem.41.583(1954))によるヨウ素澱粉反
応で分析し、活性フラクッションを集め、pH8.０のトリ
ス−塩酸緩衝液で透析し、６種類の精製酵素標品をそれ
ぞれ約20mg得た。
【００２８】本研究における澱粉分解活性は、酵素溶液
50μl を0.５％澱粉溶液（20mMマキルベン緩衝液、pH6.
０)100μl に加え、37℃にて10分間維持した後、ヨウ素
溶液（1.７mMヨウ化カリウム、0.17mMヨウ素、0.５％塩
酸）を3.75ml加え、 660nmにおける吸光度を測定した。
澱粉分解活性は、１分間に基質とした澱粉の吸光度を１
％減少させる活性を１ユニットと定義した。澱粉試薬
は、メルク社製可溶性澱粉（♯1252）を使用した。得ら
れた６種類の改変CGTase、及び親株である♯1011のCGTa
se（wild type)について澱粉分解活性の比活性を分析
し、結果を表２に示す。
50μl を0.５％澱粉溶液（20mMマキルベン緩衝液、pH6.
０)100μl に加え、37℃にて10分間維持した後、ヨウ素
溶液（1.７mMヨウ化カリウム、0.17mMヨウ素、0.５％塩
酸）を3.75ml加え、 660nmにおける吸光度を測定した。
澱粉分解活性は、１分間に基質とした澱粉の吸光度を１
％減少させる活性を１ユニットと定義した。澱粉試薬
は、メルク社製可溶性澱粉（♯1252）を使用した。得ら
れた６種類の改変CGTase、及び親株である♯1011のCGTa
se（wild type)について澱粉分解活性の比活性を分析
し、結果を表２に示す。
【００２９】ここで使用した♯1011のCGTaseについて
は、好アルカリ性Bacillus sp.♯1011（微工研菌寄第86
85号）をポリペプトン 1.０％、酵母エキス 0.５％、
澱粉２％、K2HPO4 0.１％、MgSO4 ・７H2O 0.02 ％、
NaCO3 １％を含む培地（但しNaCO3 １％のみ別にオート
クレーブした後に添加する。）で、40℃、48時間好気的
に培養して遠心上清を得、低温にて25％硫安の塩析条件
で１時間維持した後、上記の変異CGTaseと同様の操作に
より精製酵素標品を得て、比活性はpH8.０にて分析し
た。
は、好アルカリ性Bacillus sp.♯1011（微工研菌寄第86
85号）をポリペプトン 1.０％、酵母エキス 0.５％、
澱粉２％、K2HPO4 0.１％、MgSO4 ・７H2O 0.02 ％、
NaCO3 １％を含む培地（但しNaCO3 １％のみ別にオート
クレーブした後に添加する。）で、40℃、48時間好気的
に培養して遠心上清を得、低温にて25％硫安の塩析条件
で１時間維持した後、上記の変異CGTaseと同様の操作に
より精製酵素標品を得て、比活性はpH8.０にて分析し
た。
【００３０】即ち、CGTaseの活性アミノ酸残基を含む領
域と考えられるＡ，Ｂ、及びＣ領域に存在するヒスチジ
ン残基のいずれかの１残基が、アスパラギン残基に改変
された変異CGTaseの澱粉分解活性は、親株である♯1011
のwild type のCGTae と比較して、約５分の１に減少し
た。しかし、Ａ，Ｂ、及びＣ領域に存在するヒスチジン
残基のいずれかの１残基を、アルギニン残基に改変され
た変異CGTaseの澱粉分解活性は、ほとんど認められなか
った。
域と考えられるＡ，Ｂ、及びＣ領域に存在するヒスチジ
ン残基のいずれかの１残基が、アスパラギン残基に改変
された変異CGTaseの澱粉分解活性は、親株である♯1011
のwild type のCGTae と比較して、約５分の１に減少し
た。しかし、Ａ，Ｂ、及びＣ領域に存在するヒスチジン
残基のいずれかの１残基を、アルギニン残基に改変され
た変異CGTaseの澱粉分解活性は、ほとんど認められなか
った。
【００３１】次に、これらの変異CGTaseの生成するサイ
クロデキストリンの生成比率を分析した。本研究におけ
るサイクロデキストリンの生成比率は、基質として１％
可溶性澱粉（10mM 酢酸カルシウム、pH6.０）２mlに、
100ユニットの精製酵素を添加し、37℃にて３時間反応
した後、煮沸して酵素を失活する。その後、生化学工業
（株）製グルコアミラーゼ 100ユニットを加え、65℃に
て１時間反応し、その一部をとり液体クロマトグラフィ
ー分析（メルク社製LiChrospher 100NH2（５μｍ）カラ
ム（250mmL×4.６mmD)、及び70％アセトニトリル溶離液
を使用）によりαー、β−、及びγ−サイクロデキスト
リンを定量した。
クロデキストリンの生成比率を分析した。本研究におけ
るサイクロデキストリンの生成比率は、基質として１％
可溶性澱粉（10mM 酢酸カルシウム、pH6.０）２mlに、
100ユニットの精製酵素を添加し、37℃にて３時間反応
した後、煮沸して酵素を失活する。その後、生化学工業
（株）製グルコアミラーゼ 100ユニットを加え、65℃に
て１時間反応し、その一部をとり液体クロマトグラフィ
ー分析（メルク社製LiChrospher 100NH2（５μｍ）カラ
ム（250mmL×4.６mmD)、及び70％アセトニトリル溶離液
を使用）によりαー、β−、及びγ−サイクロデキスト
リンを定量した。
【００３２】得られた３種類の改変CGTase、及び親株で
ある♯1011のCGTase（wild type)について、酵素反応に
よるサイクロデキストリン生成比率を分析し、結果を表
３に示す。
ある♯1011のCGTase（wild type)について、酵素反応に
よるサイクロデキストリン生成比率を分析し、結果を表
３に示す。
【００３３】即ち、CGTaseにより澱粉から生成される各
種のサイクロデキストリンの生成比率を変化させる目的
で、この酵素の活性アミノ酸残基を含む領域と考えられ
るＡ，Ｂ、及びＣ領域（J.Bacteriol.169.4399(1987))
に存在するヒスチジン残基のいずれかの１残基を、アス
パラギン残基にＤＮＡレベルで改変して得られた変異CG
Taseは、親株である♯1011のwild type のCGTae と比較
して、澱粉からのγ−サイクロデキストリンの生成比率
が約３倍に増加した。換言すれば、Ａ，Ｂ、及びＣ領域
に存在するヒスチジン残基のいずれかの１残基を、アス
パラギン残基にＤＮＡレベルで改変して得られた変異CG
Tase遺伝子を構築することにより、γ−サイクロデキス
トリン生成比率がより高いCGTase遺伝子を創製する事が
可能となった。
種のサイクロデキストリンの生成比率を変化させる目的
で、この酵素の活性アミノ酸残基を含む領域と考えられ
るＡ，Ｂ、及びＣ領域（J.Bacteriol.169.4399(1987))
に存在するヒスチジン残基のいずれかの１残基を、アス
パラギン残基にＤＮＡレベルで改変して得られた変異CG
Taseは、親株である♯1011のwild type のCGTae と比較
して、澱粉からのγ−サイクロデキストリンの生成比率
が約３倍に増加した。換言すれば、Ａ，Ｂ、及びＣ領域
に存在するヒスチジン残基のいずれかの１残基を、アス
パラギン残基にＤＮＡレベルで改変して得られた変異CG
Tase遺伝子を構築することにより、γ−サイクロデキス
トリン生成比率がより高いCGTase遺伝子を創製する事が
可能となった。
【００３４】更に、上記の３株の大腸菌形質転換株の変
異CGTaseを使用して、澱粉を基質としてγ−サイクロデ
キストリンの生成比率がより多い反応液を調製し、特開
昭57−146600等に示される公知の分離精製法によりγ−
サイクロデキストリンを得ることができる。
異CGTaseを使用して、澱粉を基質としてγ−サイクロデ
キストリンの生成比率がより多い反応液を調製し、特開
昭57−146600等に示される公知の分離精製法によりγ−
サイクロデキストリンを得ることができる。
【００３５】即ち、pH6.０に調製した20％コーンスター
チ糊液100ｇに、形質転換株pH233N-E.coli ME8417 から
調製した３万ユニットの変異CGTaseの精製酵素を添加
し、65℃にて20時間反応した後、煮沸して酵素を失活す
る。その後、グルコアミラーゼ処理し、この反応液を精
製濃縮し、β−サイクロデキストリンの結晶4.５ｇを分
離した。残った糖液を、あらかじめＮa 型にした強酸性
陽イオン交換樹脂カラムに通液し、水でクロマト分画
し、サイクロデキストリン画分、及びグルコース画分を
得た。次に、このサイクロデキストリン画分を濃縮し、
Toyopearl HW-40Sカラムに通液し、水でクロマト分画
し、γ−サイクロデキストリン画分を70ｇ得た。この画
分を液体クロマトグラフィー法により分析した結果、γ
−サイクロデキストリンの純度は91.7％であった。
チ糊液100ｇに、形質転換株pH233N-E.coli ME8417 から
調製した３万ユニットの変異CGTaseの精製酵素を添加
し、65℃にて20時間反応した後、煮沸して酵素を失活す
る。その後、グルコアミラーゼ処理し、この反応液を精
製濃縮し、β−サイクロデキストリンの結晶4.５ｇを分
離した。残った糖液を、あらかじめＮa 型にした強酸性
陽イオン交換樹脂カラムに通液し、水でクロマト分画
し、サイクロデキストリン画分、及びグルコース画分を
得た。次に、このサイクロデキストリン画分を濃縮し、
Toyopearl HW-40Sカラムに通液し、水でクロマト分画
し、γ−サイクロデキストリン画分を70ｇ得た。この画
分を液体クロマトグラフィー法により分析した結果、γ
−サイクロデキストリンの純度は91.7％であった。
【００３６】以上、前記好アルカリ性 Bacillus ♯1011
株を用いて本発明の効果を確認したが、既知のCGTaseが
いずれも類似の構造を有し、類似の酵素的性質を有して
いることから、CGTaseのＡ領域、Ｂ領域又はＣ領域に存
在するヒスチジン残基の少なくとも１個をアスパラギン
残基に改変したCGTaseはいずれも、上記具体的に記載し
たのと同様の効果、すなわちγ−サイクロデキストリン
の生成の増加、をもたらすことが明らかである。従って
本発明は、上記の様にアミノ酸残基が改変されたCGTas
e、例えば前記11種類のCGTaseの改変体をも包含する。
株を用いて本発明の効果を確認したが、既知のCGTaseが
いずれも類似の構造を有し、類似の酵素的性質を有して
いることから、CGTaseのＡ領域、Ｂ領域又はＣ領域に存
在するヒスチジン残基の少なくとも１個をアスパラギン
残基に改変したCGTaseはいずれも、上記具体的に記載し
たのと同様の効果、すなわちγ−サイクロデキストリン
の生成の増加、をもたらすことが明らかである。従って
本発明は、上記の様にアミノ酸残基が改変されたCGTas
e、例えば前記11種類のCGTaseの改変体をも包含する。
【００３７】
【実施例】以下、実施例を例示して説明する。実施例１ ．CGTase遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドpTUE21
7 のクローニング 本願の発明者等により土壌中より新たに分離された好ア
ルカリ性Bacillus sp.♯1011（微工研菌寄第8635号、以
後、♯1011という。）は、CGTaseの高生産株である。既
に、このCGTaseの遺伝子のクローニングは、本願の発明
者等により特開昭62−208286号において、並びに、App
l.Microbiol.Biotech.,26.149-153(1987)及び、J.Bacte
riol.,169.4399-4402(1987)において開示されている。
7 のクローニング 本願の発明者等により土壌中より新たに分離された好ア
ルカリ性Bacillus sp.♯1011（微工研菌寄第8635号、以
後、♯1011という。）は、CGTaseの高生産株である。既
に、このCGTaseの遺伝子のクローニングは、本願の発明
者等により特開昭62−208286号において、並びに、App
l.Microbiol.Biotech.,26.149-153(1987)及び、J.Bacte
riol.,169.4399-4402(1987)において開示されている。
【００３８】即ち、特開昭62−208286号において記され
たプラスミドpTUE202 、並びに、Appl.Microbiol.Biote
ch.,26.149-153(1987)及び、J.Bacteriol.,169.4399-44
02(1987)において記されたプラスミドpTUE202 、及び、
プラスミドpTUE217 は、いずれも同じ方法により得られ
たものである。両プラスミドは、いずれも大腸菌ベクタ
ーpBR322のBamHI サイトへ、♯1011（微工研菌寄第8635
号）のCGTase遺伝子ＤＮＡがクローニングされたもので
あり、両者の差異は、♯1011の染色体ＤＮＡ上における
CGTase遺伝子の近傍領域の長さの違いのみである。
たプラスミドpTUE202 、並びに、Appl.Microbiol.Biote
ch.,26.149-153(1987)及び、J.Bacteriol.,169.4399-44
02(1987)において記されたプラスミドpTUE202 、及び、
プラスミドpTUE217 は、いずれも同じ方法により得られ
たものである。両プラスミドは、いずれも大腸菌ベクタ
ーpBR322のBamHI サイトへ、♯1011（微工研菌寄第8635
号）のCGTase遺伝子ＤＮＡがクローニングされたもので
あり、両者の差異は、♯1011の染色体ＤＮＡ上における
CGTase遺伝子の近傍領域の長さの違いのみである。
【００３９】その為に、プラスミドpTUE202 は9.１kb
2、また、プラスミドpTUE217 は、10.0kbであった。本
願の実施にはいずれのプラスミドでも可能であるが、実
施例ではプラスミドpTUE217 を使用した。♯1011株のCG
Tase遺伝子の塩基配列については、ダイデオキシ・チェ
イン・ターミネーション法により決定された結果、その
構造遺伝子としての2,139bp からなるオープン・リーデ
ィリング・フレーム(713アミノ酸）、及びその上流側の
プロモータ配列、並びにＳＤ配列が認められた。
2、また、プラスミドpTUE217 は、10.0kbであった。本
願の実施にはいずれのプラスミドでも可能であるが、実
施例ではプラスミドpTUE217 を使用した。♯1011株のCG
Tase遺伝子の塩基配列については、ダイデオキシ・チェ
イン・ターミネーション法により決定された結果、その
構造遺伝子としての2,139bp からなるオープン・リーデ
ィリング・フレーム(713アミノ酸）、及びその上流側の
プロモータ配列、並びにＳＤ配列が認められた。
【００４０】実施例２．部位特異的変異 プラスミドpTUE217 を制限酵素SphI及びSmaIにより切断
して調製した1.８kbのＤＮＡ断片を、M13mp18(宝酒造
（株）製）のSphI−SmaIサイトへ導入し、大腸菌BW313
株（宝酒造（株）製）を宿主としてＤＮＡ中にチミンの
代わりに一部ウラシルが混在しているssDNA を調製し
た。このssDNA にKunkel,T.A. らの方法に従って変異を
導入した。
して調製した1.８kbのＤＮＡ断片を、M13mp18(宝酒造
（株）製）のSphI−SmaIサイトへ導入し、大腸菌BW313
株（宝酒造（株）製）を宿主としてＤＮＡ中にチミンの
代わりに一部ウラシルが混在しているssDNA を調製し
た。このssDNA にKunkel,T.A. らの方法に従って変異を
導入した。
【００４１】即ち、CGTaseのアミノ末端より、 140残基
目、あるいは 233残基目、あるいは327残基目に存在す
るヒスチジン残基をアスパラギン残基に改変するＤＮＡ
配列を有する改変遺伝子を部位特異的変異により創製す
るために、以下に示すH140N,H233N, H327N の３種類の
合成ＤＮＡを調製した。
目、あるいは 233残基目、あるいは327残基目に存在す
るヒスチジン残基をアスパラギン残基に改変するＤＮＡ
配列を有する改変遺伝子を部位特異的変異により創製す
るために、以下に示すH140N,H233N, H327N の３種類の
合成ＤＮＡを調製した。
【００４２】H140N ： 5´CACCGAACAATACATCTC3 ´ H233N ： 5´GCGGTCAAGAATATGCCA3 ´ H327N ： 5´ATCGACAATAATGACAT3´
【００４３】また、CGTaseのアミノ末端より、 140残基
目、あるいは 233残基目、あるいは327残基目に存在す
るヒスチジン残基をアルギニン残基に改変するＤＮＡ配
列を有する改変遺伝子を部位特異的変異により創製する
ために、以下に示すH140R, H233R, H327R の３種類の合
成ＤＮＡを調製した。
目、あるいは 233残基目、あるいは327残基目に存在す
るヒスチジン残基をアルギニン残基に改変するＤＮＡ配
列を有する改変遺伝子を部位特異的変異により創製する
ために、以下に示すH140R, H233R, H327R の３種類の合
成ＤＮＡを調製した。
【００４４】H140R ： 5´GCACCGAACCGTACATCTCCG3´ H233R ： 5´GCGGTCAAGCGTATGCCATTC3´ H327R ： 5´ATCGACAATCGTGACATGGAG3´
【００４５】これらの変異の導入の結果は、ＤＮＡシー
ケンスにより確認した。その後、これらの変異の導入さ
れた６種類のファージのRF−DNA をアルカリＳＤＳ法に
より抽出し、その変異を受けたＤＮＡ配列を含む６種類
のSphI−Afl II断片（1.８kb）を調製した。この1.８kb
のＤＮＡ断片には、いずれもCGTaseのＡ領域からカルボ
キシ末端に至る１次構造に相当する領域を完全にコード
する塩基配列が含まれており、但し、この塩基配列では
部位特異的変異により、それぞれの一か所のヒスチジン
残基のコードが変異を受けている。
ケンスにより確認した。その後、これらの変異の導入さ
れた６種類のファージのRF−DNA をアルカリＳＤＳ法に
より抽出し、その変異を受けたＤＮＡ配列を含む６種類
のSphI−Afl II断片（1.８kb）を調製した。この1.８kb
のＤＮＡ断片には、いずれもCGTaseのＡ領域からカルボ
キシ末端に至る１次構造に相当する領域を完全にコード
する塩基配列が含まれており、但し、この塩基配列では
部位特異的変異により、それぞれの一か所のヒスチジン
残基のコードが変異を受けている。
【００４６】実施例３．変異CGTase遺伝子の構築、及び
精製変異CGTaseの調製 pTUE217 のプラスミドＤＮＡを制限酵素Hind III（宝酒
造（株）製）を使用して、CGTase遺伝子を完全に含む約
5.０kbのHind III断片を調製した。次に、シーケンス用
ベクターpUC13(3.２kb、宝酒造（株）製）のHind IIIサ
イトへ、挿入し、新たなプラスミドpTUE254 を構築し
た。
精製変異CGTaseの調製 pTUE217 のプラスミドＤＮＡを制限酵素Hind III（宝酒
造（株）製）を使用して、CGTase遺伝子を完全に含む約
5.０kbのHind III断片を調製した。次に、シーケンス用
ベクターpUC13(3.２kb、宝酒造（株）製）のHind IIIサ
イトへ、挿入し、新たなプラスミドpTUE254 を構築し
た。
【００４７】この新たなプラスミドpTUE254 において、
存在するCGTase遺伝子に含まれるSphIサイト及びAfl II
サイトで囲まれるＤＮＡ領域を消化した。そこへ上記の
実施例２にて調製した６種類の変異ＤＮＡ断片をそれぞ
れ挿入し、プラスミドを構築し、宿主である大腸菌ME84
17株に形質転換し、変異CGTase遺伝子を含む６種類のプ
ラスミドを分離した。この６種類のプラスミドをそれぞ
れpH140N,pH233N, pH327N, pH140R, pH233R、及びpH327
Rと称し、それらを安定して保持する６株の大腸菌ME841
7形質転換株を、pH140N-E.coli ME8417, pH233N-ME841
7, pH327N-ME8417, pH140R-ME8417, pH233R-ME8417、及
び pH327R-ME8417と称する。この６株について、 250μ
ｇ／mlアンピシリン、20μｇ／テトラサイクリンを含む
Ｌ−ブロス培地 500mlで培養し、集菌し、オスモチック
・ショック法により、大腸菌ペリプラズム画分を調製す
る。25％硫安塩析、及びToyopearl HW-55Fのカラムクロ
マトグラフィー分析により変異CGTaseを精製して、６種
類の精製酵素標品を調製した。実施例４ ．変異CGTaseの比活性及び酵素反応生成物の分
析 ６種類の変異CGTaseの比活性を分析した結果を下の表２
に示す。
存在するCGTase遺伝子に含まれるSphIサイト及びAfl II
サイトで囲まれるＤＮＡ領域を消化した。そこへ上記の
実施例２にて調製した６種類の変異ＤＮＡ断片をそれぞ
れ挿入し、プラスミドを構築し、宿主である大腸菌ME84
17株に形質転換し、変異CGTase遺伝子を含む６種類のプ
ラスミドを分離した。この６種類のプラスミドをそれぞ
れpH140N,pH233N, pH327N, pH140R, pH233R、及びpH327
Rと称し、それらを安定して保持する６株の大腸菌ME841
7形質転換株を、pH140N-E.coli ME8417, pH233N-ME841
7, pH327N-ME8417, pH140R-ME8417, pH233R-ME8417、及
び pH327R-ME8417と称する。この６株について、 250μ
ｇ／mlアンピシリン、20μｇ／テトラサイクリンを含む
Ｌ−ブロス培地 500mlで培養し、集菌し、オスモチック
・ショック法により、大腸菌ペリプラズム画分を調製す
る。25％硫安塩析、及びToyopearl HW-55Fのカラムクロ
マトグラフィー分析により変異CGTaseを精製して、６種
類の精製酵素標品を調製した。実施例４ ．変異CGTaseの比活性及び酵素反応生成物の分
析 ６種類の変異CGTaseの比活性を分析した結果を下の表２
に示す。
【表２】
【００４８】次に、これらの変異CGTaseの生成するサイ
クロデキストリンの生成比率を分析した。基質として１
％可溶性澱粉（10mM 酢酸カルシウム、pH6.０）２ml
に、 100ユニットの精製酵素を添加し、37℃にて３時間
反応した後、煮沸して酵素を失活する。その後、グルコ
アミラーゼ 100ユニットを加え、65℃にて１時間反応
し、その一部をとり液体クロマトグラフィー分析により
α−、β−、及びγ−サイクロデキストリンを定量し
た。
クロデキストリンの生成比率を分析した。基質として１
％可溶性澱粉（10mM 酢酸カルシウム、pH6.０）２ml
に、 100ユニットの精製酵素を添加し、37℃にて３時間
反応した後、煮沸して酵素を失活する。その後、グルコ
アミラーゼ 100ユニットを加え、65℃にて１時間反応
し、その一部をとり液体クロマトグラフィー分析により
α−、β−、及びγ−サイクロデキストリンを定量し
た。
【００４９】得られた３種類の改変CGTase、及び親株で
ある♯1011のCGTase（wild type)について、酵素反応に
よるサイクロデキストリン生成比率を分析し、結果を下
の表３に示す。
ある♯1011のCGTase（wild type)について、酵素反応に
よるサイクロデキストリン生成比率を分析し、結果を下
の表３に示す。
【表３】
【００５０】実施例５．変異CGTaseを使用したγ−サイ
クロデキストリンの製造 上記の大腸菌ME8417形質転換株pH140N-E.coli ME8417か
ら調製した変異CGTase３万ユニットを、50mM燐酸ナトリ
ウム緩衝液にてpH6.０に調製した20％コーンスターチ糊
液 100ｇに、添加し、65℃にて30時間反応した後、煮沸
して酵素を失活する。その後、pH5.０に調整し、グルコ
アミラーゼ処理した。この反応液を精製濃縮し、β−サ
イクロデキストリンの結晶22ｇを分離した。
クロデキストリンの製造 上記の大腸菌ME8417形質転換株pH140N-E.coli ME8417か
ら調製した変異CGTase３万ユニットを、50mM燐酸ナトリ
ウム緩衝液にてpH6.０に調製した20％コーンスターチ糊
液 100ｇに、添加し、65℃にて30時間反応した後、煮沸
して酵素を失活する。その後、pH5.０に調整し、グルコ
アミラーゼ処理した。この反応液を精製濃縮し、β−サ
イクロデキストリンの結晶22ｇを分離した。
【００５１】残った糖液を、あらかじめＮa 型にした強
酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンSK−IBS)カラムに
通液し、水でクロマト分画し、２％のサイクロデキスト
リン画分、及び３％のグルコース画分を得た。次に、こ
のサイクロデキストリン画分を20％に濃縮し、Toyopear
lHW-40Sカラムに通液し、水でクロマト分画し、2.８％
濃度のγ−サイクロデキストリン画分を70ｇ得た。この
画分を液体クロマトグラフィー法により分析した結果、
γ−サイクロデキストリンの純度は91.7％であった。
酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンSK−IBS)カラムに
通液し、水でクロマト分画し、２％のサイクロデキスト
リン画分、及び３％のグルコース画分を得た。次に、こ
のサイクロデキストリン画分を20％に濃縮し、Toyopear
lHW-40Sカラムに通液し、水でクロマト分画し、2.８％
濃度のγ−サイクロデキストリン画分を70ｇ得た。この
画分を液体クロマトグラフィー法により分析した結果、
γ−サイクロデキストリンの純度は91.7％であった。
【図１】図１はプラスミドpTUE217 の制限酵素地図を示
す。
す。
Claims (4)
- 【請求項１】 サイクロマルトデキストリングルカノト
ランスフェラーゼ（CGTase）において、CGTaseのＡ領
域、Ｂ領域またはＣ領域に存在するヒスチジン残基の少
なくとも１個がアスパラギン残基に改変されたCGTase。 - 【請求項２】 請求項１に記載の改変されたCGTaseの製
造方法であって、該改変されたCGTaseをコードするＤＮ
Ａを含有する発現ベクターにより形質転換された宿主微
生物を培養し、該培養物から該改変されたCGTaseを採取
することを特徴とする方法。 - 【請求項３】 CGTaseの遺伝子において、CGTaseのＡ領
域、Ｂ領域またはＣ領域に存在するヒスチジン残基をコ
ードするコドンの少なくとも１個を、アスパラギン残基
をコードするコドンに改変したCGTase遺伝子。 - 【請求項４】 CGTaseにおいて、CGTaseのＡ領域、Ｂ領
域またはＣ領域に存在するヒスチジン残基の少なくとも
１個をアスパラギン残基に改変したCGTaseを澱粉に作用
せしめ、その反応液よりγ−サイクロデキストリンを分
離してなるγ−サイクロデキストリンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3752591A JPH0541985A (ja) | 1991-03-04 | 1991-03-04 | 変異サイクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3752591A JPH0541985A (ja) | 1991-03-04 | 1991-03-04 | 変異サイクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0541985A true JPH0541985A (ja) | 1993-02-23 |
Family
ID=12499959
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3752591A Pending JPH0541985A (ja) | 1991-03-04 | 1991-03-04 | 変異サイクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0541985A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0630967A1 (de) * | 1993-06-24 | 1994-12-28 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-Cyclodextrin |
| EP0802259A1 (de) * | 1996-04-18 | 1997-10-22 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-Cyclodextrin |
| US6004790A (en) * | 1995-04-21 | 1999-12-21 | Novo Nordisk A/S | Cyclomaltodextrin glucanotransferase variants |
| US6042670A (en) * | 1997-03-27 | 2000-03-28 | Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha | Method of mounting vehicular window glass |
| WO2006064978A1 (ja) * | 2004-12-16 | 2006-06-22 | Nippon Meat Packers, Inc. | 蓄水産物中の残留動物用薬剤の抽出液 |
-
1991
- 1991-03-04 JP JP3752591A patent/JPH0541985A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0630967A1 (de) * | 1993-06-24 | 1994-12-28 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-Cyclodextrin |
| US5474917A (en) * | 1993-06-24 | 1995-12-12 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | Modified cyclodextrin glycosyltransferases for producing γ-cyclodextrins |
| US6004790A (en) * | 1995-04-21 | 1999-12-21 | Novo Nordisk A/S | Cyclomaltodextrin glucanotransferase variants |
| EP1632566A2 (en) * | 1995-04-21 | 2006-03-08 | Novozymes A/S | Cyclomaltodextrin glucanotransferase variants |
| EP1632566A3 (en) * | 1995-04-21 | 2006-08-16 | Novozymes A/S | Cyclomaltodextrin glucanotransferase variants |
| EP0802259A1 (de) * | 1996-04-18 | 1997-10-22 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-Cyclodextrin |
| US6042670A (en) * | 1997-03-27 | 2000-03-28 | Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha | Method of mounting vehicular window glass |
| US6245173B1 (en) | 1997-03-27 | 2001-06-12 | Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha | Method of mounting vehicular window glass |
| WO2006064978A1 (ja) * | 2004-12-16 | 2006-06-22 | Nippon Meat Packers, Inc. | 蓄水産物中の残留動物用薬剤の抽出液 |
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