KR20180030415A - 내독소의 측정을 위한 개선된 박테리아 내독소 시험 - Google Patents
내독소의 측정을 위한 개선된 박테리아 내독소 시험 Download PDFInfo
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Abstract
항체 (이는 박테리아 세포를 사용하여 생산되었음) 의 샘플 중의 낮은 농도의 박테리아 내독소의 측정 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법이 본원에서 보고된다:
i) 마그네슘 이온을 샘플에 첨가하는 단계,
ii) 샘플을 희석하는 단계,
iii) 5.7-8.0 의 pH-값을 갖는 샘플을 내독소-비함유 수성 용액에 대해 투석하는 단계, 및
iv) 샘플 중의 박테리아 내독소를 박테리아 내독소 시험, 특히 리뮐루스 변형유주세포 용해물 검정법을 사용하여 측정하는 단계.
i) 마그네슘 이온을 샘플에 첨가하는 단계,
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iii) 5.7-8.0 의 pH-값을 갖는 샘플을 내독소-비함유 수성 용액에 대해 투석하는 단계, 및
iv) 샘플 중의 박테리아 내독소를 박테리아 내독소 시험, 특히 리뮐루스 변형유주세포 용해물 검정법을 사용하여 측정하는 단계.
Description
내독소 차폐로 인한 낮은 내독소 회수 (low endotoxin recovery) (LER) 효과를 극복하는 박테리아 내독소 시험 (bacterial endotoxin test) (BET) 샘플 제조 방법이 본원에서 보고된다.
단백질 치료제 (예컨대 모노클로날 항체) 는 종종 유전적으로 형질전환된 진핵생물 및 원핵생물 세포, 예컨대 예를 들어 박테리아를 사용하여 생성된다. 박테리아에 의한 생산에 사용되는 것은 빠르게 성장하는 박테리아 예컨대 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 이다. 그러나, 재조합 단백질의 성장 및 배양 동안 고도로 독성인 지질다당류 (lipopolysaccharides) (LPS) 가 배지 내로 분비된다. 이들 성분은 박테리아 내독소 (짧은 내독소) 로서 지칭된다. 그람-음성 박테리아는 LPS 를 그들의 세포 벽의 필수적 성분으로서 보유한다. 그람-음성 박테리아 세포는 대략 3.5 x 105 개의 LPS 분자를 함유하며, 이들 LPS 분자는 대략 4.9 ㎛2 의 전체 면적을 차지한다 (Rietschel, 1994, FASEB J. 8:217-225). 에스케리키아 콜라이의 경우에, 그것은 LPS 가 전체 박테리아 세포 표면의 약 4 분의 3 에 해당한다는 것을 의미한다. 대략 10,000 CFU (집락 형성 단위 (colony forming units)) 의 그람-음성 박테리아 종은 1 내독소 단위 (Endotoxin Unit) (EU) 에 상응한다 (Rietschel, 1994, FASEB J. 8:217-225). EU 는 내독소/LPS 를 나타낸다; 1 EU 
100 pg LPS (사용되는 LPS 에 따라). 그러나, 제품이 재조합 수단에 의해 생산되지 않는 경우에도, 가장 많이 이용되는 시약은 내독소로 오염되며, 그 이유는 그것의 생산이 무균 또는 심지어는 멸균 조건 하에 실시되는 경우는 드물기 때문이다. 그러므로, 약제의 생산 동안 멸균 및/또는 무균 조건이 유지될 수 없는 경우에 LPS 는 아주 흔한 (ubiquitous) 잠재적 오염물이다. 모든 알려진 박테리아 화합물 중에서, 내독소는 포유동물에게 가장 독성인 자연적 화합물 중 하나이다. 그람-음성 박테리아의 세포 벽에 존재하는 LPS 는 인간 혈류에 진입할 때 발열의 유도를 포함하여 엄청난 면역활성화를 야기하는 것으로 알려져 있다. 그것은 극도로 낮은 농도 (피코그람-범위) 에서 각각 심혈관 및 림프계에 진입할 때 섬망 (delirious) 효과를 야기한다. 불행하게도 박테리아 내독소는 열 안정적이고, 그들의 독성은 박테리아 세포의 존재와 전혀 연관되지 않는다. 또한 모든 단백질 치료제는, 그들의 생산 방법과 무관하게, 낮은 극미량의 박테리아 내독소 (소위 "자연에 존재하는 내독소 (natural occurring endotoxin)", NOE) 로 오염될 것으로 예상 또는 간주되어야 한다고 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 내독소 오염은 약제 예컨대 치료적 모노클로날 항체의 생산에 관해 계속되는 도전으로 남아 있다. 이는 2012 년 6 월에 미국 식품 의약국 (FDA) 에 의해 발행된 "Guidance for Industry, pyrogen and endotoxin testing" 에서 매우 분명히 강조하여 개요서술된 바 있다.
주사가능한 단백질 치료제 (예컨대 모노클로날 항체) 가 인간 사용에 안전한 것을 보장하기 위해서, 내독소 시험이 실시되어야 한다. 내독소 시험은 통상적으로 미국 약전 <85>, 유럽 약전 2.6.14 또는 일본 약전 4.01 의 전서 (compendial) 방법과 겔-응고 (gel-clot), 발색 또는 비탁 리뮐루스 변형유주세포 용해물 (Limulus amoebocyte lysate) (LAL) 기술 (또한 LAL 검정법 또는 LAL 시험으로 표시됨) 을 사용하여 수행된다. LAL 검정법에 대한 전서 명칭은 박테리아 내독소(들) 시험 (bacterial endotoxin(s) test) (BET) 이다. BET 은 주어진 샘플 또는 물질 중의 안전하지 않은 수준의 내독소, 특히 그람-음성 박테리아 내독소의 존재를 확인하게 위해 사용된다.
LAL 검정법은 일상적으로 희석된 시험 샘플을 양성 대조군과 함께 사용하여 수행되며, 양성 대조군은 알려진 양의 스파이킹된 (spiked) 대조군 표준 내독소 (control standard endotoxin) (CSE) 샘플이다. CSE 는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, Lonza, Associates of Cape Cod, Inc. (ACC), 또는 Charles River Laboratories International, Inc. 에 의해 공급되는) 정의된 형태의 내독소이다. 전서 LAL 검정법 방법 자격인정조건에 따르면, CSE 는 희석된 샘플에 비-간섭 농도 (NIC) 로 스파이킹되어 50-200% 의 수용가능한 회수율을 달성한다. 이러한 접근은 약학적 제형의 샘플 매트릭스의 성분 뿐만 아니라 저장 조건이 미희석 제품 샘플에 존재하는 내독소의 LAL 반응성에 잠재적으로 영향을 미친다는 것을 인식하는데 실패한다. 미희석 제품 샘플이 내독소 예컨대 CSE 로 스파이킹되고 그에 뒤이어 LAL 검정법이 수행될 때, 낮은 내독소 회수 (< 50%) 가 특정 생물제제 제품에서 관찰되었다. 그러한 낮은 내독소 회수는 특히 제품의 제형이 양친매성 화합물 예컨대 세제를 함유한 경우에 관찰되었다. 치료적 단백질을 용해시키기 위해서 세제가 제품에 첨가된다. 내독소의 이러한 차폐는 특히 LPS 오염이 낮은 경우에 내독소의 유의하게 감소된 검출을 초래한다. 이러한 현상은 내독소 회수가 스파이킹 후 샘플 희석에 의해 증가될 수 없는 경우에 "내독소 차폐" 로 호칭된다.
검정법 저해 및/또는 증강을 극복하기 위한 LAL 검정법에 관한 상이한 샘플 전처리가 알려져 있다. 그러나, 현재 이들 샘플 전처리는 만족스러운 결과를 낳지 않는다. 그러므로, 내독소 차폐로 인해 LAL 검정법에 의해 검출될 수 없는 약제의 제조 동안 내독소 오염이 발생할 위험이 여전히 존재한다. 현재의 지식에 기초하여 2 가지 상이한 유형의 내독소 차폐가 존재한다:
1) 샘플에 존재하는 내독소-결합 단백질에 의해 야기되는 내독소 차폐 ("단백질 차폐 (protein masking)", Petsch, Anal. Biochem. 259, 1998, 42-47). 예를 들어 인간 지질단백질 Apo A1, 라이소자임, 리보뉴클레아제 A 또는 인간 lgG 와의, 예를 들어 단백질-내독소 응집물의 형성은 내독소의 LAL 반응성을 감소시키는 것으로 잘 알려져 있다 (Emancipator, 1992; Petsch, Anal. Biochem. 259, 1998, 42-47).
2) 약학적 제품에 종종 존재하는 특정 제형 성분 또는 완충제 성분에 의해 야기되는 내독소 차폐. 예를 들어, 폴리소르베이트 + 시트레이트 또는 포스페이트 중 어느 하나의 조합에 의해 특이적으로 야기되는 내독소 차폐는 "낮은 내독소 회수 (low endotoxin recovery)" 또는 LER 로 명명된다 (Chen, J. and Williams, K. L., PDA Letter 10, 2013, 14-16, Williams, American Pharmaceutical Review, October 28, 2013: Endotoxin Test Concerns of Biologics). 내독소 차폐는 또한 임의의 기타 완충제 성분 및 비-이온성 세제 또는 그의 조합에 의해 야기될 수 있다.
LER 효과로 인해, 제조 동안 발생하는 잠재적 내독소 오염은 종래의 LAL 검정법이 사용될 때 여전히 과소평가 또는 미검출된다. LER 효과는 약학적 제품에서 계속되는 도전을 제시한다 (Hughes, BioPharm. Asia March/April 2015, 14-25).
따라서, 본 발명의 기저를 이루는 기술적 과제는 LER 효과를 극복하기 위한 수단 및 방법의 제공이다.
상기 기술적 과제는 아래 상술되는 본 발명의 방법에 의해 극복되었다.
본원에서 보고되는 것은 내독소의 정량화를 위한 개선된 LAL 검정법이다. 이러한 개선된 LAL 검정법은 양친매성 매트릭스가 내독소 측정을 차폐할 때 (낮은-내독소-회수; LER) 특히 유용하다.
특히, 본 발명의 맥락에서 놀랍게도 마그네슘 이온을, 예를 들어 MgCl2 의 형태로, 샘플에 첨가하고; 샘플을 희석하고; 5.7-8.0 의 pH-값을 갖는 샘플을 투석하는 연속 수행에 의해, LER 효과가 성공적으로 극복될 수 있다는 것이 발견되었다. 또는, 다시 말하면, 본원에서 보고되는 샘플 제조 방법은 LAL 검정법에서 LER 효과를 극복하는데 적합하다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 맥락에서, 항체를 포함하는 샘플 (예를 들어 치료적 모노클로날 항체의 샘플) 에 관한 샘플 제조 방법이 발견되었다. 이러한 본 발명의 샘플 제조 방법은 그것이 놀랍게도 및 예상외로 LAL 검정법이 수행되는 경우에 LER 효과를 배제한다는 이점을 갖는다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 BET 을 위한 (바람직하게는 LAL 검정법을 위한) 항체를 포함하는 샘플의 제조 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 마그네슘 이온을, 바람직하게는 MgCl2 의 형태로, 샘플에 첨가하는 단계,
(b) 샘플을 희석하는 단계, 및
(c) 5.7-9.0, 바람직하게는 5.7-8.0 의 pH-값을 갖는 샘플을 내독소-비함유 (endotoxin-free) 수성 용액에 대해 투석하는 단계.
따라서, 본 발명에 따르면, 항체를 포함하는 샘플 (예를 들어 치료적 모노클로날 항체의 샘플) 은 본 발명의 샘플 제조 방법의 단계 (a) 내지 (c) 를 수행함으로써 가공된다. 이들 단계 및 그들의 조합은 놀랍게도 LAL 검정법이 수행되는 경우에 LER 효과를 겪지 않는 샘플의 제공을 초래한다. 또는, 다시 말하면, 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법의 단계 (a) 내지 (c) 를 수행한 후에, 항체를 포함하는 샘플은 LAL 효소 캐스케이드에서 인자 C 에 반응성이다. 따라서, 본 발명의 샘플 제조 방법은 유리하게는 LAL 검정법을 통해 박테리아 내독소를 확인하기 전에 수행된다. 따라서, 본 발명은 또한 샘플 중의 내독소를 측정 (즉 검출 및/또는 정량화) 하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법은 항체 (예를 들어 치료적 모노클로날 항체) 를 포함하는 샘플 중의 내독소의 측정 (즉 검출 및/또는 정량화) 을 허용한다. 특히, 본 발명은 항체를 포함하는 샘플 (바람직하게는 LER 효과를 나타내는) 중의 박테리아 내독소의 측정 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 마그네슘 이온을, 바람직하게는 MgCl2 의 형태로, 샘플에 (즉 항체를 포함하는 샘플에) 첨가하는 단계,
(b) 샘플을 희석하는 단계,
(c) 5.7-8.0 의 pH-값을 갖는 샘플을 내독소-비함유 수성 용액에 대해 투석하는 단계, 및
(d) 샘플 중의 박테리아 내독소를 LAL 검정법을 사용함으로써 측정하는 단계.
바람직하게는, 본 발명의 샘플 제조 방법 또는 내독소 측정 방법에서, 1.5-5 ㎖ 투명 유리, 크림프 넥 (crimp neck), 넓적 바닥 용기가 사용된다. 가장 바람직하게는, 용기는 Macherey-Nagel GmbH 의 스크루 넥 (screw neck) 유리 바이알 (1.5 ㎖ 또는 4 ㎖) 이다.
내독소 오염은 약제 예컨대 모노클로날 항체의 생산에서 높은 위험에 해당한다. 선행 기술에서, 특히 치료적 항체에 관한, 내독소 시험은 종래의 LAL 검정법을 사용함으로써 수행된다. 그러나, 첨부된 실시예에서 입증되는 바와 같이, LAL 검정법은 LER 효과를 나타내는 항체 제형 중의 내독소 오염을 검출실패/과소평가한다. 미검출/과소평가된 내독소는 임의의 약학적 샘플에서, 특히 근육내 또는 정맥내 투여되는 약제에서 극도의 안전 위험에 해당한다. 그러나, 그것의 엄청난 현실적 중요성에도 불구하고, LER 효과의 물리-화학적 메카니즘에 관해 알려진 것이 없다. 이런 이유로, 선행 기술은 LER 효과를 나타내는 치료적 제품 중의 내독소의 측정을 보정하기 위한 방법을 제공하는데 실패한다.
본 발명의 맥락에서 LER 효과를 배제하고 CSE-스파이킹된 샘플로부터 만족스러운 회수율을 초래하는 견고한 물리-화학적 설정이 발견되었다. 특히, 예시적 첨부된 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본원에서 보고되는 방법은 정의된 농도 (0.5 또는 5.0 EU/㎖) 로 주어진 샘플에 스파이킹된 CSE 의 회수를 허용한다. 중요하게도, 본원에서 제공되는 방법은 50% 내지 200% 범위의 회수율을 초래하며, 이러한 방식은 FDA 의 요건을 충족시킨다. 따라서, 본 발명은 유리하게는 내독소를 비차폐 (unmask) 할 수 있고 LER 효과를 극복할 수 있는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 맥락에서 놀랍게도 특정 조합 및 순서의 단계 (a) 내지 (c) (즉 (a) 마그네슘 이온을 시험될 샘플에 첨가하는 단계; (b) 시험될 샘플을 희석하는 단계; 및 (c) 시험될 샘플을 투석하는 단계 (여기에서 샘플은 5.7-8.0 의 pH-값을 갖는다) 가 내독소에 관해 시험될 샘플의 LER 효과를 배제한다는 것이 발견되었다. 또는, 다시 말하면, 단계 (a) 내지 (c) 의 수행은 샘플 중의 내독소를 비차폐하고, 따라서, 내독소를 LAL 검정법으로 탐지가능하게 만든다. 첨부된 실시예는 본원에서 제공되는 방법이 예를 들어 제형화된 리툭시맙에서 LER 효과를 극복한다는 것을 보여준다. 이와 대조적으로, 동일한 프로토콜은 NeoRecormon® (이는 항체를 포함하지 않으나 에포에틴-베타 (epoetin-beta) 를 포함함) 에 관해 만족스러운 결과를 나타낼 수 없었다. 이는 본원에서 제공되는 방법이 항체 제형에서, 바람직하게는 모노클로날 항체, 시트레이트 완충제 및 폴리소르베이트 80 함유 제형에서 LER 효과를 배제하는데 특히 유용하다는 것을 시사한다.
따라서, 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 및 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법은 유리하게는 LER 효과를 배제한다. 그러므로 이들 방법은 약제 중의 내독소의 검출을 개선한다. 이는 유해 효과가 더 적은 약학적 제품의 생산을 초래한다. 결과적으로, 본원에서 제공되는 방법은 소비자의 건강의 상태를 개선할 것이고 중환자의 생명을 구할 수 있다.
본원에서 제공되는 방법에서, 샘플에 포함되는 항체는 박테리아 또는 진핵생물 세포에서 또는 그로부터 생산 및/또는 정제되었을 수 있다. 예를 들어, 항체는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터 생산 및 정제되었을 수 있다. 본 발명의 하나의 양상에서, 샘플 (즉 항체를 포함하는 샘플) 은 용해된 고체 샘플이다. 본 발명의 또다른 양상에서, 샘플 (즉 항체를 포함하는 샘플) 은 액체 샘플이다. 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 및 내독소 측정 방법에서, 항체 (즉 샘플에 포함되는 항체) 는 치료적 항체일 것으로 구상된다. 바람직하게는, 항체 (즉 샘플에 포함되는 항체) 는 모노클로날 항체이다. 그러나, 본원에서 제공되는 방법에서 항체 (샘플에 포함되는) 는 또한 폴리클로날 항체일 수 있다. 본원에서, 또한 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 분절은 그들이 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 용어 "항체" 에 포함된다. 항체는 인간, 인간화, 또는 낙타화 (camelized) 된 것일 수 있다.
본원에서 제공되는 방법은 유리하게는 약학적 제형의 LER-경향이 있는 (prone) 샘플을 LAL 효소 캐스케이드에서 인자 C 에 반응성으로 만든다. LER 효과는 양친매성 화합물 예컨대 비-이온성 세제와 함께 제형화되는 생물제제 제품에서, 특히 그들이 완충제로서 시트레이트 또는 포스페이트와 조합되는 경우에 보고되어 왔다. 첨부된 실시예는 본원에서 제공되는 방법은 그러한 치료적 제형에서 LER 효과를 확실히 배제한다는 것을 입증한다. 그러므로, 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 및 내독소 측정 방법의 맥락에서 상기 치료적 항체 (즉 치료적 샘플에 포함되는 항체) 는 적어도 하나의 세제 (바람직하게는 폴리소르베이트) 와 함께 제형화될 것으로 구상된다.
그러나, 상기 치료적 항체는 LAL 캐스케이드의 C 반응성 단백질 내의 지질 A 공동 (cavity) 에 관한 구조적 모티프를 포함하지 않는 폴리소르베이트와 함께 제형화될 것으로 구상된다. 더욱 구체적으로, 직쇄 지방산 예컨대 라우르산은 LAL 캐스케이드의 지질 A 분자 내의 지방산을 모방할 수 있으며, 이러한 분자는 또한 12 개의 탄소 원자를 포함하고 이중 결합을 포함하지 않는 지방산을 함유한다 (즉 C:D 는 12:0 이다). 그러한 직쇄 지방산은 LAL 캐스케이드를 음성으로 간섭할 수 있다. 그러므로, 본원에서 제공되는 방법에서, 상기 치료적 항체는 직쇄 지방산 예컨대 라우르산을 포함하는 세제와 함께 제형화되지 않을 것으로 구상된다. 폴리소르베이트 20 은 라우르산을 포함한다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법에서 샘플 (특히 치료적 항체의 샘플) 은 폴리소르베이트 20 과 함께 제형화되지 않을 것으로 것으로 구상된다. 또한 포스페이트 완충제, 특히 소듐 포스페이트 완충제는 LAL 캐스케이드를 간섭할 수 있다. 그러므로, 이들 완충제는 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법에 덜 유용하다. 따라서, 본 발명은 샘플에 포함되는 (치료적) 항체가 포스페이트 완충제로 희석되지 않는, 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 또는 내독소 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 양상에서 샘플은 0.1 mM 초과의 포스페이트 완충제를 포함하지 않고, 그것의 임계 미셀 농도 (critical micellar concentration) (CMC) 의 100 분의 1 보다 높은 농도의 폴리소르베이트 20 을 포함하지 않는다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 샘플은 포스페이트 완충제 및 폴리소르베이트 20 중 어느 하나를 포함하지 않거나, 또는 표준 검출 방법을 사용할 때 검출 한계 미만인 양의 포스페이트 완충제 및/또는 폴리소르베이트 20 을 포함한다.
본 발명의 방법을 사용하여 첨부된 실시예에서 입증되는 바와 같이, LER 효과는 제형화된 리툭시맙 샘플에서 뿐만 아니라 리툭시맙 플라시보 샘플에서 극복될 수 있다. 리툭시맙 플라시보 샘플은 리툭시맙 샘플과 오직 항체가 부재한다는 점에서만 상이하다. 이러한 차이점 외에는, 리툭시맙 플라시보 샘플은 리툭시맙의 제형의 모든 기타 성분 예컨대 세제 및 완충제를 함유한다. 이는 본원에서 제공되는 방법이 특정 모노클로날 항체를 포함하는 제형에 의존하지 않고, 예를 들어, LER 효과를 나타내는 모든 제형에서 LER 효과를 배제하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 그러한 제형은 폴리소르베이트 80 및 킬레이트화 완충제 (예컨대 소듐 시트레이트) 를 포함하는 제형을 포함한다. 이러한 제형은 항체, 특히 모노클로날 항체에 전형적이다. 따라서, 위에 기재된 방법은 모든 모노클로날 항체 제형에서 LER 효과를 극복하는데 유용할 것으로 예상된다. 리툭시맙은 폴리소르베이트 80 및 소듐 시트레이트 완충제의 혼합물 (즉 25 mM 소듐 시트레이트 완충제, pH 6.5; 700 ㎎/ℓ 폴리소르베이트 80, 및 154 mM NaCl) 과 함께 제형화된다. 본 발명의 맥락에서, 항체를 포함하는 샘플은 이러한 제형을 가질 것으로 구상된다.
첨부된 실시예는 폴리소르베이트 80 및 시트레이트 완충제와 함께 제형화된 치료적 항체의 예시적 샘플에서, 본원에서 제공되는 방법을 사용하여 LER 효과가 극복될 수 있다는 것을 입증한다. 그러므로, 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 또는 내독소 측정 방법에서 샘플 (즉 항체를 포함하는 샘플) 이 폴리소르베이트 80 과 함께 제형화되는 것이 바람직하다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법에서, 샘플 (즉 항체를 포함하는 샘플) 이 폴리소르베이트 80 을 포함할 것으로 구상된다. 바람직하게는, 샘플은 500-1000 ㎎/ℓ 폴리소르베이트 80, 더욱 바람직하게는 약 700 ㎎/ℓ 폴리소르베이트 80 을 포함한다. 본원에서 제공되는 방법에서 샘플 (즉 항체를 포함하는 샘플) 이 킬레이트화 완충제 (예컨대 시트레이트 완충제) 와 함께 제형화될 것으로 추가로 구성된다. 상기 시트레이트 완충제는 5-50 mM 시트레이트 완충제, pH 6.0-7.0; 바람직하게는 25 mM 시트레이트 완충제, pH 6.5 일 수 있다. 바람직하게는, 시트레이트 완충제는 소듐 시트레이트 완충제이다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법에서, 샘플 (즉 항체를 포함하는 샘플) 은 5-50 mM Na-시트레이트, 바람직하게는 25 mM Na-시트레이트를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 샘플은 폴리소르베이트 80 및 소듐 시트레이트 완충제를 포함한다. 예를 들어, 샘플은 약 700 ㎎/ℓ 폴리소르베이트 80 및 5-50 mM, 바람직하게는 약 25 mM 소듐 시트레이트 완충제를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 본원에서 제공되는 방법에서 샘플은 약 25 mM Na-시트레이트 완충제 및 약 700 ㎎/ℓ 폴리소르베이트 80 과 함께 제형화되고 약 6.5 의 pH 값을 갖는 항체의 샘플이다.
본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 또는 내독소 측정 방법에서 상기 항체 (즉 샘플에 포함되는 항체) 가 항-CD20 항체인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 항체는 항-CD20 항체 리툭시맙이다. 리툭시맙의 중 및 경쇄의 아미노산 서열은 본원에서 각각 SEQ ID NOs: 1 및 2 로서 보여진다. 당업자는 주어진 아미노산 서열로부터 코딩 핵산 서열을 어떻게 얻는지에 대해 쉽게 안다. 따라서, SEQ ID NOs: 1 및 2 의 지식으로, 리툭시맙의 코딩 핵산 서열은 쉽게 얻어질 수 있다. 리툭시맙은, 예를 들어, Rituxan® 및 MabThera®, 또는 Zytux® 로서 상업적으로 입수가능하다.
본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 또는 내독소 측정 방법의 단계 (a) 에서, 마그네슘 이온 (Mg2 +) 은, 예를 들어 MgCl2 의 형태로, 샘플에 (즉 항체를 포함하는 샘플에) 첨가된다. 본원에서, 용어 "마그네슘 클로라이드" 또는 "MgCl2" 는 식 MgCl2 를 갖는 화학적 화합물 뿐만 아니라 그것의 다양한 하이드레이트 MgCl2 (H2O)x (즉 MgCl2ㆍx H2O) 를 나타낸다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법의 단계 (a) 에서 MgCl2 헥사하이드레이트 (즉 MgCl2ㆍ6H2O) 가 샘플에 첨가될 수 있다. 예시적 첨부된 실시예는 단계 (a) 에서 10-100 mM Mg2 + 의 최종 농도로의 마그네슘 이온의 첨가가 LER 효과를 현저히 감소시킨다는 것을 입증한다. 더욱이, 첨부된 실시예는 또한 샘플의 완충제의 농도의 2 배인 Mg2 + 의 농도가 최상의 내독소 회수율을 초래한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 리툭시맙이 샘플로서 사용될 때, 단계 (a) 에서 마그네슘 염 MgCl2 의 첨가가 소듐 시트레이트 농도의 2 배인 Mg2+ 의 최종 농도 (즉 50 mM Mg2+) 를 초래할 때 최상의 내독소 회수율이 얻어졌다. 그러므로, 본원에서 제공되는 방법의 단계 (a) 에서 염 (예를 들어 MgCl2) 형태의 마그네슘 이온이 첨가되어, 완충제 (예를 들어 소듐 시트레이트 완충제) 의 농도의 2 배인 최종 Mg2 + 농도를 초래할 것으로 구상된다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법에서, 바람직하게는 마그네슘 이온은 Mg2 + 의 최종 농도 [단계 (a) 에서] 가 10-100 mM Mg2 +, 더욱 바람직하게는 25-75 mM Mg2 +, 더 더욱 바람직하게는 40-75 mM Mg2 +, 가장 바람직하게는 약 50 mM Mg2+ (즉 45-55 mM Mg2+) 가 되도록 샘플에 첨가된다. 또는, 샘플이 이미 마그네슘 이온을 포함하는 경우에, 그 때 결과적인 Mg2 + 의 최종 농도 [단계 (a) 에서] 가 바람직하게는 10-100 mM, 더욱 바람직하게는 25-75 mM, 더 더욱 바람직하게는 40-75 mM, 가장 바람직하게는 약 50 mM Mg2 + (즉 45-55 mM Mg2+) 가 되도록 Mg2 + 의 첨가량이 조정된다. 단계 (a) 후에, 즉 단계 (b) 에서, 샘플은 희석된다. 그러나, 단계 (a) 에서, 용어 "마그네슘 이온을 ... 의 농도로 첨가한다" 또는 그의 문법적 변형 및 용어 "마그네슘 이온을 ... 의 최종 농도로 첨가한다" 또는 그의 문법적 변형은 단계 (a) 에서 Mg2 + 의 최종 농도를 나타낸다. 예를 들어, 단계 (a) 에서 MgCl2 를 45-55 mM MgCl2 의 (최종) 농도로 첨가한다는 것은 단계 (a) 에서 MgCl2 의 첨가 후에 MgCl2 의 농도가 45-55 mM 이라는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 단계 (b) 에서 샘플이 1:10 (샘플:완충제/물) 의 비로 희석되는 경우에, 마그네슘 이온의 농도 및 마찬가지로 MgCl2 의 농도는 4.5-5.5 mM 이다.
첨부된 실시예는 마그네슘 이온의 첨가 후의 인큐베이션 단계가 LAL 검정법에서의 회수율을 추가로 개선한다는 것을 입증한다. 그러므로, 본원에서 제공되는 방법에서, 마그네슘 이온의 첨가 후에 샘플은 바람직하게는 30 분 내지 6 시간 동안, 더욱 바람직하게는 1-4 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 1 시간 동안 인큐베이션된다. 본원에서 제공되는 방법의 단계 (a) 의 하나의 우선순위부여된 양상에서 마그네슘 이온의 첨가 후에 샘플은 약 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션된다. 상기 인큐베이션 단계 전에 및 후에, 샘플은 셰이킹 (shake) 될 수 있다 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서]. 예를 들어, 인큐베이션 단계 전에 및 후에 샘플은 30 초 내지 10 분 동안, 바람직하게는 1 분 동안 셰이킹될 수 있다.
본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 또는 내독소 측정 방법의 단계 (b) 에서, 샘플 (즉 항체를 포함하는 샘플) 은 희석된다. 샘플은 내독소-비함유 물로 희석될 수 있다. 첨부된 실시예는 투석 동안 샘플이 5.7-8.0 의 pH-값을 갖는 경우에 양호한 회수율이 얻어질 수 있다는 것을 입증한다. 투석 동안 샘플이 6.0-8.0 의 pH-값을 가졌던 경우에 더더욱 양호한 회수율이 얻어졌다. 투석 동안 샘플이 6.5-7.5 의 pH-값을 가졌던 경우에 최상의 회수율이 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상은 단계 (b) 에서 샘플은 내독소-비함유 물로 희석되고, 희석 후에 및 투석 전에 샘플의 pH-값은 5.7-8.0, 더욱 바람직하게는 6.0-8.0, 가장 바람직하게는 6.5-7.5 로 조정되는, 본원에서 제공되는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상에서, 본원에서 제공되는 방법의 단계 (b) 에서 샘플의 pH-값은 pH 5.7-8.0, 더욱 바람직하게는 pH 6.0-8.0 로 조정된다. 가장 바람직하게는, 본원에서 제공되는 방법의 단계 (b) 에서 샘플의 pH-값은 pH 6.5-7.5 로 조정된다. 예를 들어, 샘플의 pH-값은 pH 5.7, pH 5.8, pH 5.9, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, 또는 pH 7.0 로 조정될 수 있다. 그러나, 본원에서 바람직하게는 샘플의 pH-값은 단계 (b) 에서 샘플을 10-50 mM 완충제, 예를 들어 Tris/HCl-완충제, pH 6.0-9.0 으로, 더욱 바람직하게는 10-50 mM 완충제, 예를 들어 Tris/HCl 완충제, pH 6.0-8.0 으로 희석함으로써 조정된다. 그러므로, 본원에서 제공되는 방법의 바람직한 양상에서 샘플의 pH-값은 단계 (c) 에서 샘플을 10-50 mM Tris/HCl 완충제, pH 6.0-9.0 으로 희석함으로써 조정되는 것으로 구상된다. 더욱 바람직하게는, 샘플의 pH-값은 샘플을 10-50 mM Tris/HCl 완충제, pH 6.0-8.0 으로 희석함으로써 조정된다. 가장 바람직하게는, 샘플의 pH-값은 샘플을 (단계 (b) 에서) 50 mM Tris/HCl pH ~7.0 으로 희석함으로써 조정된다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법에서, 단계 (c) 에서 투석 동안 샘플은 5.7-8.0, 바람직하게는 6.0-8.0, 더욱 바람직하게는 6.5-7.5 의 pH-값을 갖는다.
위에서 나타낸 바와 같이, 샘플은 세제 예컨대 폴리소르베이트 80 을 포함할 수 있다. 첨부된 예시적 실시예는 특히 세제 (예를 들어 폴리소르베이트 80) 를 포함하는 샘플의 희석이 내독소 분자를 LAL 검정법에서 접근가능하게 (accessible) 만든다는 것을 입증한다. 이론에 구속되지 않으면서, 세제를 포함하는 샘플의 근사-CMC (near-CMC) 농도로의 희석이 샘플의 미셀 구획화 (compartmentalization) 를 감소시키고, 그러므로 LER 효과를 감소시킨다고 여겨진다.
첨부된 실시예는 1:5 내지 1:20 의 희석이 LAL 검정법에서의 회수율에 상당히 영향을 미친다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명은 단계 (b) 에서 샘플은 1:5 내지 1:20 (샘플:완충제/물), 바람직하게는 1:10 (샘플:완충제/물) 의 비로 희석되는, 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 및 내독소 측정 방법에 관한 것이다. 본원에서 제공되는 방법에서 항체는 바람직하게는 약 25 mM 소듐 시트레이트 완충제 및 약 700 ㎎/ℓ 폴리소르베이트 80 과 함께 제형화된다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법에서, 샘플은 단계 (b) 에서 희석되어, 완충제의 농도가 5-1.25 mM, 바람직하게는 2.5 mM 로 감소할 수 있다. 게다가, 샘플은 단계 (b) 에서 희석되어, 세제의 농도가 140-35 ㎎/ℓ, 바람직하게는 내지 70 ㎎/ℓ 로 감소할 수 있다. 첨부된 실시예에서, 샘플은 약 10 ㎎/㎖ 의 항체의 농도를 갖는 항체 제형이었다. 이들 샘플은 본 발명의 방법의 단계 (b) 에서 희석되어 2-0.5 ㎎/㎖ 의 항체 농도를 초래했다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법에서, 샘플은 단계 (b) 에서 희석되어, 항체의 농도가 2-0.5 ㎎/㎖, 바람직하게는 1 ㎎/㎖ 로 감소할 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에서 또한 미희석 대조군이 제조될 수 있다. 상기 미희석 대조군은 시험될 샘플과 동일한 방식으로 처리되며, 다른 점은 미희석 대조군은 희석되지 않는다 (단계 (b) 에서) 는 점이다. 본원에서, "완충제/물" 은 "완충제 또는 물" 을 의미한다.
본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 및 내독소 측정 방법의 단계 (c) 에서, 샘플은 내독소-비함유 수성 용액에 대해 투석된다. 내독소-비함유 수성 용액은 내독소-비함유 물일 수 있다. 그러나, 상기 내독소-비함유 수성 용액은 또한, 예를 들어 염 MgCl2 의 형태로 첨가된, 마그네슘 이온을 포함하는 내독소-비함유 수성 용액일 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상은 단계 (c) 에서 내독소-비함유 수성 용액이 마그네슘 이온, 예를 들어 2.5-10 mM MgCl2 를 함유하는, 본원에서 제공되는 방법에 관한 것이다.
투석을 시작하기 전에, 샘플은 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서], 예를 들어 30 초 내지 10 분 동안, 바람직하게는 1 분 동안 셰이킹될 수 있다. 바람직하게는, 단계 (c) 에서의 투석은 1-48 시간 동안, 더욱 바람직하게는 4-24 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 24 시간 동안 수행된다. 따라서, 단계 (c) 에서 투석은 약 24 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다. 투석은 15-30 ℃ 에서, 바람직하게는 실온 (즉 21 ± 2 ℃) 에서 수행될 수 있다. 투석 후에, 샘플은 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서], 예를 들어 20 분 동안 내지 1 시간, 바람직하게는 (적어도) 20 분 동안 셰이킹될 수 있다.
투석은 회전 투석기 (예를 들어 Harvard SpinDIALYZER, 카탈로그 Nb. 74-0314) 또는 빠른 회전 투석기 (예를 들어 Harvard Fast Spin Dialyzer, 카탈로그 Nb. 74-0412) 를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 (특히 빠른 회전 투석기가 사용되는 경우에) 교반기의 회전 주파수는 높으며, 이는 교반기의 주파수가 50 내지 300 rpm, 바람직하게는 200 내지 300 rpm 인 것을 의미한다. 교반기는 바람직하게는 20-60 ㎜ 의 길이 및 5-25 ㎜ 의 직경 (즉 단면 치수) 을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 교반기는 약 40 ㎜ 의 길이 및 약 14 ㎜ 의 직경을 갖는다. 교반기는 가장 바람직하게는 약 40 ㎜ 의 길이 및 약 14 ㎜ 의 직경을 갖는 가열 살균된 (예를 들어 250℃ 에서 4 시간) 자기 교반기이다. 그러한 교반기는 OMNILAB 으로부터 입수가능하다. 실제로 투석은 통상적으로 교반기의 높은 주파수로 수행되며, 그 이유는 교반기의 높은 주파수가 투석 멤브레인을 통하는 확산을 촉진하기 때문이다. 따라서, 교반기의 높은 주파수에 의한 투석은 표준 투석 절차이다. 투석에 사용되는 용기는 바람직하게는 500-5000 ㎖, 더욱 바람직하게는 1000-3000 ㎖, 가장 바람직하게는 1500-2500 ㎖ 의 부피를 갖는다. 이러한 용기는 120 ㎜ 의 직경 및 240 ㎜ 의 높이를 가질 수 있다. 예를 들어, 투석에 사용되는 용기는 DURAN® 비이커, 키 큰 (tall) 형태, 2000 ㎖ (예를 들어 OMNILAB, Germany 으로부터 입수가능, P/N: 5013163) 일 수 있다. 빠른 회전 투석기를 사용하는 것이 바람직하며, 그 이유는 그것이 두배 면적의 투석 멤브레인을 갖고, 따라서 더욱 효율적인 및 더욱 신속한 투석에 적합한 것으로 여겨지기 때문이다.
단계 (c) 에서 투석 동안 100 Da 내지 16 kDa, 바람직하게는 500 Da 내지 10 kDa, 가장 바람직하게는 10kDa 의 분자량 컷-오프 (molecular-weight cut-off) 를 갖는 멤브레인이 사용될 것으로 구상된다. 단계 (c) 에서 투석 동안 셀룰로오스 에스테르 또는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 단계 (c) 에서 투석 동안 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 사용된다. 가장 바람직하게는, 투석 동안 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 사용된다.
따라서, 본원에서 제공되는 방법의 단계 (c) 에서, 투석은 바람직하게는 약 24 시간 동안 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인을 사용하여 수행된다. 투석 전에, 투석 멤브레인은, 바람직하게는 내독소-비함유 물에서 세척될 수 있다. 특히, 투석 멤브레인은 내독소-비함유 물에서 셰이킹될 수 있다 (예를 들어 Shaker SG 20. IDL GmbH, Germany 또는 등가물, 50 내지 300 rpm, 바람직하게는 100 rpm 으로). 예를 들어, 투석 멤브레인은 그것을 10 분 내지 3 시간 동안, 바람직하게는 1 시간 동안 내독소-비함유 물에서 셰이킹하여 세척될 수 있다. 이러한 세척 단계 후에, 투석 멤브레인은 바람직하게는 신선한 (fresh) 내독소-비함유 물에 옮겨지고, 그것을 10 분 내지 3 시간 동안, 바람직하게는 1 시간 동안 셰이킹하여 다시 세척된다.
투석은 1 ㎖ 체임버에서, 예를 들어 500 Da 내지 10 kDa 범위의 분자량 컷-오프 (예를 들어 10 kDa 의 분자량 컷-오프) 를 갖는 멤브레인 (예컨대 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인) 을 갖춘 1 ㎖ 회전 투석기 (Harvard) 체임버에서 수행될 수 있다. 투석 동안 물은 바람직하게는 교환되고, 더욱 바람직하게는 물은 2 회 교환된다. 예를 들어, 물은 2 및 20 시간의 투석 후에 또는 18 및 22 시간의 투석 후에 교환될 수 있다. 바람직하게는, 물은 2 및 4 시간의 투석 후에 교환된다.
본원에서 제공되는 방법의 맥락에서 단계 (c) 에서의 투석 후에 샘플이 셰이킹되는 것이 바람직하다 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서]. 바람직하게는, 샘플 (즉 항체를 포함하는 샘플) 은 투석 후에 10 분 내지 1 시간 동안, 더욱 바람직하게는 20 분 동안 셰이킹된다. 셰이킹에 더하여 또는 대안적으로, 샘플은 투석 후에 초음파로 처리될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상은 단계 (c) 에서 샘플이 투석 후에 초음파로 처리되는, 본원에서 제공되는 방법에 관한 것이다.
본원에서 제공되는 샘플 제조 방법이 LAL 검정법과 조합되는 경우에, 그 때 이러한 조합된 방법은 유리하게는 샘플에 스파이킹된 정의된 양의 CSE 의 정량적 및 재현가능한 검출에 관한 FDA 요건에 도달한다. 바람직하게는, 본원에서 제공되는 방법의 LAL 검정법은 아래 기재된 바와 같은 LAL 검정법이다.
첨부된 실시예는 Mg2 + (즉 마그네슘 이온) 의 첨가가 그것이 투석 체임버의 내부 구획에 내독소를 보유하는 추가의 이점을 갖는다는 것을 시사한다. 따라서, 단계 (c) 에서의 투석은 오직 완충제 (예를 들어 소듐 시트레이트 완충제) 의 제거를 초래하며, 내독소의 제거는 초래하지 않는다. 희석 단계는 세제 (예를 들어 폴리소르베이트 80) 의 농도를 감소시켜 세제에 의한 LAL 캐스케이드의 저해를 폐지하게 된다. 첨부된 실시예는 본 발명의 방법의 단계가 하기 순서로 수행되는 경우에 LER 효과가 특히 재현가능하게 극복될 수 있다는 것을 입증한다: (1) Mg2 + 의 첨가; (2) 희석; 및 (3) 투석. 따라서, 단계 (1), (2) 및 (3) 의 조합, 또는 청구되는 단계 (a), (b) 및 (c) 의 조합은 LER 효과를 재현가능하게 극복한다. Mg2 + 의 바람직한 첨가량, 바람직한 희석도 및 바람직한 투석 파라미터는 본원에서 위에 및 아래 상술된다.
바람직한 양상에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 LAL 검정법을 위한 항체를 포함하는 샘플의 제조 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 마그네슘 이온을, 예를 들어 MgCl2 의 형태로, 샘플에 10-100 mM, 바람직하게는 40-75 mM, 가장 바람직하게는 45-55 mM 의 최종 농도로 첨가하는 단계,
(b) 샘플을 10-50 mM Tris/HCl 완충제, pH 6.0-8.0 로, 바람직하게는 50 mM Tris/HCl-완충제, pH ~7.0 으로 1:5 (샘플:완충제) 내지 1:20 (샘플:완충제), 바람직하게는 1:10 (샘플:완충제) 의 비로 희석하는 단계,
(c) 5.7-8.0 (바람직하게는 6.5-7.5) 의 pH-값을 갖는 샘플을 내독소-비함유 물에 대해 1-48 시간 동안, 바람직하게는 4-24 시간 동안, 가장 바람직하게는 24 시간 동안 투석하는 단계. 바람직하게는 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 사용되고, 물은 2 및 4 시간 후에 교환된다. 가장 바람직하게는, 빠른 회전 투석기가 사용되고, 교반기의 주파수는 50 내지 300 rpm, 바람직하게는 200 rpm 이다.
위에서 언급된 바와 같이, 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 더욱 바람직하게는, 항체는 리툭시맙이다. 가장 바람직하게는, 본원에서 제공되는 방법에서 샘플은 약 25 mM 소듐 시트레이트 완충제 (7.35 ㎎/㎖) 및 약 700 ㎎/ℓ 폴리소르베이트 80 과 함께 제형화되고 약 6 의 pH 값을 갖는 항체의 샘플이다.
용어 "약" 및 기호 "~" 는 호환되게 본원에서 사용되고, 제공된 특정 값이 어느 정도 다를 수 있다는 것을 명시한다. 예를 들어, "약" 또는 "~" (예를 들어 약/~25 mM 소듐 시트레이트 완충제의 맥락에서) 는 ± 10 %, 바람직하게는 ± 5 %, 가장 바람직하게는 ± 2 % 범위의 변화가 주어진 값에 포함된다는 것을 의미한다.
명시된 바와 같이, 본 발명의 맥락에서 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법은 LAL 검정법과 조합된다고 구상된다. LAL 검정법은 그것이 낮은 농도의 내독소를 검출하는 이점을 갖는다.
CSE 표준 곡선에 의해 제시되는 바와 같이 내독소 검출의 검증된 하한은 동역학적 발색 LAL 기술에서 0.005 EU/mL 이다. 이들 기술의 LAL 시약은 리뮐루스 크랩 (crab) 으로부터 정제된 세린 프로테아제의 완전 효소 증폭 캐스케이드를 포함한다.
더욱 최근에 개발된 EndoLISA® 검정법 (Hyglos GmbH, Germany) 에서 내독소 (CSE) 검출의 하한은 제조사에 의해 0.05 EU/mL 라고 명시되었다 (Advertisment of Hyglos: Grallert et al. in: Nature Methods, Oct. 2011; p://www.hyglos.de/fileadmin/media/Application_note_EndoLISA_Nature_Methods_October_2011.pdf). 이러한 EndoLISA® 검정법은 오직 리뮐루스 캐스케이드의 초기 효소, 즉 인자 C 의 재조합 형태를 이용한다. 공인된 LAL 시험과 구별되게, EndoLISA® 검정법은 LAL 방법에 의해 검출될 것으로 잘 알려진 넓은 범위의 박테리아 내독소에 결합하는 것으로 아직 증명되지 않은 박테리오파지-인코딩되는 단백질에 의한 미세역가 플레이트의 예비-코팅에 의해 제공되는 초기 내독소 흡착 단계를 부가적으로 포함한다.
특히, 바람직한 양상에서 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 샘플 중의 박테리아 내독소의 측정 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 마그네슘 이온을, 바람직하게는 MgCl2 의 형태로, 샘플에 10-100 mM, 바람직하게는 40-75 mM, 가장 바람직하게는 45-55 mM 의 최종 농도로 첨가하는 단계,
(b) 샘플을 10-50 mM Tris/HCl 완충제, pH 6.0-8.0 로; 바람직하게는 50 mM Tris/HCl-완충제, pH ~7.0 으로 1:5 (샘플:완충제) 내지 1:20 (샘플:완충제), 바람직하게는 1:10 (샘플:완충제) 의 비로 희석하는 단계,
(c) 5.7-8.0 (바람직하게는 6.5-7.5) 의 pH-값을 갖는 샘플을 내독소-비함유 물에 대해 1-48 시간 동안, 바람직하게는 4-24 시간 동안, 가장 바람직하게는 24 시간 동안 투석하는 단계. 바람직하게는 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 사용되고, 물은 2 및 4 시간 후에 교환된다. 가장 바람직하게는, 빠른 회전 투석기가 사용되고, 교반기의 주파수는 50 내지 300 rpm 바람직하게는 200 rpm 이다.
(d) LAL 검정법을 사용함으로써 샘플 중의 박테리아 내독소를 측정하는 단계.
위에서 언급된 바와 같이, 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 더욱 바람직하게는, 항체는 리툭시맙이다. 가장 바람직하게는, 본원에서 제공되는 방법에서 샘플은 약 25 mM 소듐 시트레이트 완충제 및 약 700 ㎎/ℓ 폴리소르베이트 80 과 함께 제형화되고 약 6.5 의 pH 값을 갖는 항체의 샘플이다.
명시된 바와 같이 첨부된 실시예에서, "LER 양성 대조군" (또한 "양성 LER 대조군" 으로서 지칭됨) 은 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법의 단계 (d) 의 LAL 검정법에서 사용될 수 있다. 상기 "LER 양성 대조군" 은 본원에서 기재되는 방법의 단계 (a) 내지 (c) 가 수행되지 않은 경우에 시험될 샘플 (즉 항체를 포함하는 샘플) 이 LER 효과를 나타낼 것임을 입증하는 지표이다. 또는, 다시 말하면, "LER 양성 대조군" 은 LAL 검정법에서 알려진 스파이킹된 양의 내독소 (시험될 샘플 내의) 가 오직 LAL 검정법만을 사용함으로써 (즉 본원에서 제공되는 방법의 단계 (a) 내지 (c) 를 수행하지 않고) 회수될 수 없다는 것을 보여주는 양성 대조군으로서 사용된다. 본 발명의 맥락에서 놀랍게도 및 예상외로 오직, 샘플을 CSE 로 스파이킹한 후에, 샘플이 45 분 내지 2 시간 동안, 바람직하게는 약 60 분 내지 2 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 60 분 동안 셰이킹되는 경우에만 양성 LER 효과가 얻어질 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 "LER 양성 대조군" 은 알려진 양의 내독소를 내독소에 관해 시험될 샘플의 앨리쿼트 (aliquot) 내로 (예를 들어 항체를 포함하는 샘플의 앨리쿼트 내로) 스파이킹하고 스파이킹된 샘플을 45 분 내지 2 시간 동안, 바람직하게는 약 60 분 내지 2 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 60 분 동안 셰이킹함으로써 제조된다. 따라서, 본 발명은 알려진 양의 내독소를 샘플의 앨리쿼트 내로 스파이킹하고 내독소 스파이킹 샘플의 앨리쿼트를 ≥ 60 분 동안 (더욱 바람직하게는 60 분 내지 2 시간 동안) 셰이킹함으로써 LER 양성 대조군을 생성하는 것을 추가로 포함하는 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본원에서 제공되는 박테리아 내독소의 측정 방법에서 "LER 양성 대조군" 은 CSE 를 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로 시험될 샘플의 앨리쿼트에 스파이킹함으로써 제조된다. 이후, 스파이킹된 앨리쿼트는 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서] ≥ 60 분 동안, 가장 바람직하게는 60 분 동안 셰이킹된다. 셰이킹 후에, 내독소 스파이킹된 앨리쿼트는 바람직하게는 본원에서 제공되는 방법의 단계 (b) 에서 시험될 샘플과 동일한 정도로 희석된다. 바람직하게는, 스파이킹된 앨리쿼트는 내독소-비함유 물로 희석된다. 희석 후에, 스파이킹된 앨리쿼트는 바람직하게는 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서], 예를 들어 1 분 동안 셰이킹된다.
따라서, "LER 양성 대조군" 은 바람직하게는 하기 절차에 의해 하기 순서로 제조된다:
- CSE 를 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로 시험될 샘플의 앨리쿼트에 스파이킹한다. 바람직하게는, "LER 양성 대조군" 은 1.5-5 ㎖ 투명 유리, 크림프 넥, 넓적 바닥 용기에서, 더욱 바람직하게는 Macherey-Nagel GmbH 의 스크루 넥 유리 바이알 (1.5 ㎖ 또는 4 ㎖) 에서 제조된다
- 스파이킹된 앨리쿼트를 ≥ 60 분 동안 (더욱 바람직하게는 60 분 내지 2 시간 동안), 가장 바람직하게는 60 분 동안 셰이킹한다. 바람직하게는, 스파이킹된 앨리쿼트는 고속 (2,037 rpm) 으로 실온 (즉 21 ± 2℃) 에서 셰이킹된다. 가장 바람직하게는 스파이킹된 앨리쿼트는 고속 (2,037 rpm) 으로 Heidolph Multi Reax 셰이커에서 실온에서 셰이킹된다.
- 스파이킹된 앨리쿼트를 내독소-비함유 물로 희석한다. 스파이킹된 앨리쿼트는 본원에서 제공되는 방법의 단계 (b) 에서 시험될 샘플과 동일한 정도로 희석된다 (즉 시험될 샘플이 단계 (b) 에서 1:10 의 비로 희석되는 경우에, 그 때 또한 스파이킹된 앨리쿼트는 1:10 의 비로 희석된다).
- 스파이킹된 앨리쿼트를 셰이킹한다 (예를 들어 1 분 동안).
위에 기재된 바와 같이, "LER 양성 대조군" 의 제조 동안, 희석이 수행된다. 그러나, 본 발명의 맥락에서, 상기 희석 외에, "LER 양성 대조군" 은 본원에서 제공되는 방법의 단계 (a) 내지 (c) 에서 기재된 바와 같이 처리되지 않는 것으로 구상된다. 그러나, 상기 "LER 양성 대조군" 은 박테리아 내독소의 측정 방법의 단계 (d) 에서 사용되어, 본원에서 기재되는 방법의 단계 (a) 내지 (c) 가 수행되지 않을 경우에 시험될 샘플 (즉 항체를 포함하는 샘플) 이 LER 효과를 나타낼 것임을 보여준다. "LER 양성 대조군" 은 단계 (a) 내지 (c) 중 임의의 하나의 시간 동안 (예를 들어 투석-시간 동안) 제조되어, 그것은 LAL 검정법이 수행될 때 사용될 준비가 되어 있을 수 있다.
주어진 물질 (예를 들어 완충제 또는 치료적 항체의 샘플) 이 LER 효과를 나타내는지를 확인하기 위해서, 예를 들어 내독소 유지 시간 (hold time) 연구에서, 내독소 함량이 시간의 흐름에 따라 모니터링될 수 있다. 내독소 유지 시간 연구는 미희석 샘플의 내독소 스파이킹 및 시간의 흐름에 따른 내독소 스파이킹된 샘플의 저장을 요구한다. 예를 들어, 샘플은 수개월까지 저장될 수 있다. 바람직하게는, 유지 시간 연구에서 내독소 스파이킹된 샘플은 수 (예를 들어 7 ~ 28) 일 동안 저장되고, 정의된 시점에 LAL 검정법이 수행된다. 스파이킹된 내독소의 양의 50% 미만인 회수율은 샘플이 LER 효과를 나타낸다는 것을 시사한다.
위에서 언급된 바와 같이, LAL 검정법은 일상적으로 희석된 시험 샘플을 희석된 양성 대조군 (PPC) 과 함께 이용하여 수행되며, 상기 양성 대조군 (PPC) 은 알려진 양의 스파이킹된 CSE 의 샘플이다. 따라서, 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법의 단계 (d) 에서 수행되는, LAL 검정법에서, 모든 샘플은 매번 듀플리케이트로 스파이킹된 대조군 표준 내독소 (PPC) 와 함께 및 스파이킹된 내독소 없이 측정되는 것으로 구상된다. 결과적으로, 모든 주어진 샘플로, 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 또는 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법이 샘플에 존재하는 내독소 (또는 FDA 에 의해 요구되는 바와 같이 그의 적어도 50-200%) 는 LAL 검정법을 사용하여 검출될 수 있다는 유리한 효과를 갖는지 여부가 용이하게 시험될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법의 단계 (d) 에서의 LAL 검정법은 양성 대조군 (PPC) 이 시험될 샘플 (즉 시험될 항체를 포함하는 샘플) 과 함께 시험되는 것을 포함하는 것으로 구상된다. 상기 양성 대조군은 시험될 샘플과 동일하며, 다른 점은 PPC 이 알려진 양의 CSE 로 스파이킹된다는 점이다. 또는, 다시 말하면, 본원에서 제공되는 방법의 단계 (a) 내지 (c) 는 시험될 샘플과 동일한 방식으로 PPC 으로 수행되어야 한다. 따라서, PPC 은 본원에서 제공되는 방법의 단계 (a) 전에 제조된다.
본 발명의 맥락에서 놀랍게도 및 예상외로, 샘플을 CSE 로 스파이킹한 후에, 샘플이 45 분 내지 2 시간 동안, 바람직하게는 약 60 분 내지 2 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 60 분 동안 셰이킹되는 경우에만 양성 LER 효과가 얻어질 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 PPC 은 스파이킹 후에 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서] 45 분 내지 2 시간 동안, 바람직하게는 약 60 분 내지 2 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 60 분 동안 셰이킹된다. 더욱 바람직하게는, PPC 은 스파이킹 후에 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서] 약 60 분 동안 실온에서 셰이킹된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 양상은 본원에서 제공되는 항체를 포함하는 샘플 중의 박테리아 내독소의 측정 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a0)
- 알려진 양의 내독소를 항체를 포함하는 샘플의 제 1 앨리쿼트 내로 스파이킹하고,
- 내독소 스파이킹된 앨리쿼트를 60 분 내지 2 시간 동안 (바람직하게는 약 60 분 동안 실온에서) 셰이킹하여
PPC 을 제조하는 단계,
(a) 마그네슘 이온을 시험될 샘플의 제 2 앨리쿼트에 뿐만 아니라 PPC 에 첨가하는 단계,
(b) 시험될 샘플의 제 2 앨리쿼트 뿐만 아니라 PPC 을 희석하는 단계,
(c) 시험될 5.7-8.0 (바람직하게는 5.8-7.0) 의 pH-값을 갖는 샘플의 제 2 앨리쿼트 뿐만 아니라 PPC 을 내독소-비함유 수성 용액에 대해 투석하는 단계로서, 상기 시험될 샘플 뿐만 아니라 PPC 은 5.7-9.0 의 pH-값을 갖는 단계, 및
(d) 시험될 샘플의 제 2 앨리쿼트 중의 뿐만 아니라 PPC 중의 박테리아 내독소를 LAL 검정법을 사용함으로써 측정하는 단계.
본 발명의 하나의 양상에서, PPC 은 내독소로 스파이킹되어, 5.0 EU/㎖ 의 최종 내독소 농도가 얻어진다.
본원에서 제공되는 박테리아 내독소의 측정 방법과 관련하여 공개된 모든 양상 및 정의는 PPC 이 적용되는 경우에 상기 방법에, 필요한 부분만 약간 수정하여, 적용된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양상은 본원에서 제공되는 항체를 포함하는 샘플 중의 박테리아 내독소의 측정 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a0)
- 알려진 양의 내독소를 항체를 포함하는 샘플의 제 1 앨리쿼트 내로 스파이킹하고,
- 내독소 스파이킹된 앨리쿼트를 ≥ 60 분 동안 (바람직하게는 60 분 동안 실온에서) 셰이킹하여
PPC 을 제조하는 단계,
(a) 마그네슘 이온을, 바람직하게는 MgCl2 의 형태로, 샘플의 제 2 앨리쿼트에 10-100 mM, 바람직하게는 40-75 mM, 가장 바람직하게는 45-55 mM 의 최종 농도로 첨가하는 단계,
(b) 샘플의 제 2 앨리쿼트를 10-50 mM Tris/HCl-완충제, pH 6.0-8.0 으로, 바람직하게는 50 mM Tris/HCl-완충제, pH ~7.0 으로 1:5 (샘플:완충제) 내지 1:20 (샘플:완충제), 바람직하게는 1:10 (샘플:완충제) 의 비로 희석하는 단계,
(c) 5.7-8.0 (바람직하게는 6.5-7.5) 의 pH-값을 갖는 샘플을 내독소-비함유 물에 대해 1-48 시간 동안, 바람직하게는 4-24 시간, 가장 바람직하게는 24 시간 투석하는 단계. 바람직하게는 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 사용되고, 물은 2 및 4 시간 후에 교환된다. 더욱 바람직하게는, 빠른 회전 투석기가 사용되고, 교반기의 주파수는 높다.
(d) LAL 검정법을 사용함으로써 샘플 중의 박테리아 내독소를 측정하는 단계.
부가적으로 물 대조군이 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법에 적용될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 2 개의 물 대조군이 사용된다; 하나의 대조군은 내독소-비함유 물로 이루어지는 것이고, 다른 하나의 대조군은 내독소-비함유 물로 이루어지며, 알려진 양의 내독소로 스파이킹되는 것이다 (예를 들어 5.0 EU/㎖ CSE 의 최종 농도를 초래함). 물 대조군은 시험될 샘플과 동일한 방식으로 처리된다.
위에서 나타낸 바와 같이, 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법에서 뿐만 아니라 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법에서, 단계 (a) 에서, 샘플은 30 분 내지 6 시간 동안, 바람직하게는 1-4 시간 동안, 가장 바람직하게는 1 시간 동안 인큐베이션되는 것으로 구상된다. 더욱이, 또한 투석 후에 샘플은 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서], 예를 들어 10 분 내지 1 시간 동안, 바람직하게는 20 분 동안 셰이킹되는 것으로 구상된다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상은 본원에서 제공되는 LAL 검정법을 위한 항체를 포함하는 샘플의 제조 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 마그네슘 이온을, 바람직하게는 MgCl2 의 형태로, 샘플에 10-100 mM, 바람직하게는 40-75 mM, 가장 바람직하게는 45-55 mM 의 최종 농도로 첨가하고; 샘플을 30 분 내지 6 시간 동안, 바람직하게는 1-4 시간 동안, 가장 바람직하게는 1 시간 동안 인큐베이션하는 단계,
(b) 샘플을 10-50 mM Tris/HCl-완충제, pH 6.0-8.0 으로, 바람직하게는 50 mM Tris/HCl-완충제, pH ~7.0 으로 1:5 (샘플:완충제) 내지 1:20 (샘플:완충제), 바람직하게는 1:10 (샘플:완충제) 의 비로 희석하는 단계,
(c) 5.7-8.0 (바람직하게는 6.5-7.5) 의 pH-값을 갖는 샘플을 내독소-비함유 물에 대해 1-48 시간 동안, 바람직하게는 4-24 시간 동안, 가장 바람직하게는 24 시간 동안 투석하는 단계. (바람직하게는, 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 사용되고, 물은 2 및 4 시간 후에 교환된다. 가장 바람직하게는, 빠른 회전 투석기가 사용되고, 교반기의 주파수는 높다.) 투석 후에, 샘플은 10 분 내지 1 시간 동안, 바람직하게는 20 분 동안 셰이킹된다.
유사하게, 본 발명의 추가의 양상은 본원에서 제공되는 LER 효과를 나타내는 항체를 포함하는 샘플 중의 박테리아 내독소의 측정 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 마그네슘 이온을, 바람직하게는 MgCl2 의 형태로, 샘플에 10-100 mM, 바람직하게는 40-75 mM, 가장 바람직하게는 45-55 mM 의 최종 농도로 첨가하고; 샘플을 30 분 내지 6 시간 동안, 바람직하게는 1-4 시간 동안, 가장 바람직하게는 1 시간 동안 인큐베이션하는 단계 (여기에서 샘플은 인큐베이션 전에 및 후에 셰이킹될 수 있다),
(b) 샘플을 10-50 mM Tris/HCl-완충제, pH 6.0-8.0 으로, 바람직하게는 50 mM Tris/HCl-완충제, pH ~7.0 으로 1:5 (샘플:완충제) 내지 1:20 (샘플:완충제), 바람직하게는 1:10 (샘플:완충제) 의 비로 희석하는 단계,
(c) 5.7-8.0 (바람직하게는 6.5-7.5) 의 pH-값을 갖는 샘플을 내독소-비함유 물에 대해 1-48 시간 동안, 바람직하게는 4-24 시간 동안, 가장 바람직하게는 24 시간 동안 투석하는 단계. (바람직하게는, 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 사용되고, 물은 2 및 4 시간 후에 교환된다. 가장 바람직하게는, 빠른 회전 투석기가 사용되고, 교반기의 주파수는 높다.) 투석 후에, 샘플은 10 분 내지 1 시간 동안, 바람직하게는 20 분 동안 셰이킹된다.
(d) LAL 검정법을 사용함으로써 샘플 중의 박테리아 내독소를 측정하는 단계.
더욱이, 위에서 언급된 바와 같이, 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법에서 PPC 이 제조되고 PPC 이 스파이킹 후에 60 분 내지 2 시간 동안 셰이킹되는 것으로 구상된다. 따라서, 본 발명은 본원에서 제공되는 LER 효과를 나타내는 항체를 포함하는 샘플 중의 박테리아 내독소의 측정 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a0)
- 알려진 양의 내독소를 (예를 들어 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로) 항체를 포함하는 샘플의 제 1 앨리쿼트 내로 스파이킹하고,
- 내독소 스파이킹된 앨리쿼트를 60 분 내지 2 시간 동안 (바람직하게는 60 분 동안 실온에서) 셰이킹하여
PPC 을 제조하는 단계,
(a) 마그네슘 이온을, 바람직하게는 MgCl2 의 형태로, 샘플의 제 2 앨리쿼트에 뿐만 아니라 PPC 에 10-100 mM, 바람직하게는 40-75 mM, 가장 바람직하게는 45-55 MgCl2 의 최종 농도로 첨가하는 단계; (및 바람직하게는 샘플 및 PPC 을 30 분 내지 6 시간 동안, 더욱 바람직하게는 1-4 시간 동안, 가장 바람직하게는 1 시간 동안 인큐베이션, (여기에서 샘플은 인큐베이션 전에 및 후에 셰이킹될 수 있다)),
(b) 샘플 및 PPC 을 10-50 mM Tris/HCl-완충제, pH 6.0-8.0 으로, 바람직하게는 50 mM Tris/HCl-완충제, pH ~7.0 으로 1:5 (샘플/PPC:완충제) 내지 1:20 (샘플/PPC:완충제), 바람직하게는 1:10 (샘플/PPC:완충제) 의 비로 희석하는 단계,
(c) 5.7-8.0 (바람직하게는 6.5-7.5) 의 pH-값을 갖는 샘플 및 PPC 을 내독소-비함유 물에 대해 1-48 시간 동안, 바람직하게는 4-24 시간 동안, 가장 바람직하게는 24 시간 동안 투석하는 단계. (바람직하게는, 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 사용되고, 물은 2 및 4 시간 후에 교환된다. 가장 바람직하게는, 빠른 회전 투석기가 사용되고, 교반기의 주파수는 높다.) 투석 후에, 샘플 및 PPC 은 10 분 내지 1 시간 동안, 바람직하게는 20 분 동안 셰이킹된다.
(d) LAL 검정법을 사용함으로써 샘플 및 PPC 중의 박테리아 내독소를 측정하는 단계.
게다가, 위에서 나타낸 바와 같이, 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법에서 "LER 양성 대조군" 이 제조되고 단계 (d) 에서 사용되어 LER 효과를 보여줄 것으로 구상된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양상은 본원에서 제공되는 LER 효과를 나타내는 항체를 포함하는 샘플 중의 박테리아 내독소의 측정 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a0)
- 알려진 양의 내독소를 (예를 들어 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로) 항체를 포함하는 샘플의 제 1 앨리쿼트 내로 스파이킹하고,
- 내독소 스파이킹된 앨리쿼트를 60 분 내지 2 시간 동안 (바람직하게는 60 분 동안 실온에서) 셰이킹하여
PPC 을 제조하는 단계,
(a) 마그네슘 이온을, 바람직하게는 MgCl2 의 형태로, 샘플의 제 2 앨리쿼트에 뿐만 아니라 PPC 에 10-100 mM, 바람직하게는 40-75 mM, 가장 바람직하게는 45-55 mM 의 최종 농도로 첨가하는 단계; (및 바람직하게는 샘플 및 PPC 을 30 분 내지 6 시간 동안, 더욱 바람직하게는 1-4 시간 동안, 가장 바람직하게는 1 시간 동안 인큐베이션, (여기에서 샘플은 인큐베이션 전에 및 후에 셰이킹될 수 있다)),
(b) 샘플 및 PPC 을 10-50 mM Tris/HCl-완충제, pH 6.0-8.0 으로, 바람직하게는 50 mM Tris/HCl-완충제, pH ~7.0 으로 1:5 (샘플/PPC:완충제) 내지 1:20 (샘플/PPC:완충제), 바람직하게는 1:10 (샘플/PPC:완충제) 의 비로 희석하는 단계,
(c) 5.7-8.0 (바람직하게는 6.5-7.5) 의 pH-값을 갖는 샘플 및 PPC 을 내독소-비함유 물에 대해 1-48 시간 동안, 바람직하게는 4-24 시간 동안, 가장 바람직하게는 24 시간 동안 투석하는 단계. (바람직하게는, 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 사용되고, 물은 2 및 4 시간 후에 교환된다. 가장 바람직하게는, 빠른 회전 투석기가 사용되고, 교반기의 주파수는 높다.) 투석 후에, 샘플 및 PPC 은 10 분 내지 1 시간 동안, 바람직하게는 20 분 동안 셰이킹된다.
(d) LAL 검정법을 사용함으로써 샘플 및 PPC 중의 박테리아 내독소를 측정하는 단계로서, 상기 LAL 검정법에서 "LER 양성 대조군" 이 사용되며, LER 양성 대조군은 하기에 의해 제조되는 단계:
- CSE 를 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로 시험될 샘플의 제 3 앨리쿼트에 스파이킹하고;
- 스파이킹된 앨리쿼트를 ≥ 60 분 동안, 가장 바람직하게는 60 분 동안 셰이킹하고;
- 스파이킹된 앨리쿼트를 내독소-비함유 물로 희석하고 (스파이킹된 앨리쿼트는 본원에서 제공되는 방법의 단계 (b) 에서 시험될 샘플과 동일한 정도로 희석된다);
- 스파이킹된 앨리쿼트를 셰이킹 (예를 들어 1 분 동안).
따라서, 본 발명의 바람직한 양상은 본원에서 제공되는 LER 효과를 나타내는 항체를 포함하는 샘플 중의 박테리아 내독소의 측정 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a0)
- 알려진 양의 내독소를 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로 항체를 포함하는 샘플의 제 1 앨리쿼트 내로 스파이킹하고,
- 내독소 스파이킹된 앨리쿼트를 약 60 분 동안 실온에서 셰이킹하여
PPC 을 제조하는 단계,
(a) 마그네슘 이온을, 바람직하게는 MgCl2 의 형태로, 샘플의 제 2 앨리쿼트 및 PPC 에 45-55 mM 의 최종 농도로 첨가하고, 샘플 및 PPC 을 1 분 동안 셰이킹하고, 샘플 및 PPC 을 1 시간 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션 후에 다시 샘플 및 PPC 을 셰이킹하는 단계,
(b) 샘플 및 PPC 을 50 mM Tris/HCl-완충제, pH ~7.0 으로 1:10 (샘플/PPC:완충제) 의 비로 희석하는 단계,
(c) 5.7-8.0 (바람직하게는 6.5-7.5) 의 pH-값을 갖는 샘플 및 PPC 을 내독소-비함유 물에 대해 24 시간 동안 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인을 사용하여 투석하는 단계로서; 상기 물은 2 및 4 시간 후에 교환되고 (바람직하게는, 빠른 회전 투석기가 사용되고, 교반기의 주파수는 높다), 샘플 및 PPC 은 20 분 동안 셰이킹되는 단계, 및
(d) LAL 검정법을 사용함으로써 샘플 및 PPC 중의 박테리아 내독소를 측정하는 단계로서, 상기 LAL 검정법에서 "LER 양성 대조군" 이 사용되며, LER 양성 대조군은
- CSE 를 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로 시험될 샘플의 제 3 앨리쿼트에 스파이킹하고,
- 스파이킹된 앨리쿼트를 60 분 동안 셰이킹하고,
- 스파이킹된 앨리쿼트를 내독소-비함유 물로 1:10 의 비로 희석하고,
- 스파이킹된 앨리쿼트를 셰이킹 (예를 들어 1 분 동안) 하여
제조되는 단계.
게다가, 위에서 언급된 바와 같이, 물 대조군이 LAL 검정법에서 적용되는 것으로 구상된다. 예를 들어, 내독소-비함유 물로 이루어지는 물 대조군이 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법의 단계 (d) 의 LAL 검정법에서 적용될 수 있다. 또다른 물 대조군은 내독소 스파이킹된 내독소-비함유 물로 이루어질 수 있다. 내독소 스파이킹 후에, 물은 바람직하게는 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서] ≥ 60 분 동안 (예를 들어 60 분 동안 실온에서) 셰이킹된다. 게다가, LAL 검정법에서 표준은 통상적으로 사용되는 키트의 지침에 따라 제조된다.
단계 (a0), (a), (b), (c) 및 (d) 는 순서 (a0)→(a)→(b)→(c)→(d) 로 수행될 것이다. 그러나, 투석 멤브레인의 세척은 아무 때나 수행될 수 있으며, 다만 투석이 시작할 때 단계가 실행된다. 유사하게, LER 양성 대조군의 제조는 아무 때나 수행될 수 있으며, 다만 LAL 검정법이 시작할 때 단계가 실행된다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법은 하기 단계를 포함한다.
단계 (a00) : 샘플의 제조
ㆍ 시험될 샘플의 농도를 PPC 에 적응시킴 (예를 들어 항체 900 ㎕ + 100 ㎕ 내독소-비함유 물)
ㆍ PPC 의 생산을 위해 시험될 샘플의 앨리쿼트를 내독소로 스파이킹 (예를 들어 항체 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE 농도 50 EU/㎖ = 최종 농도 5.0 EU/㎖)
ㆍ 물 대조군을 제조 (예를 들어 내독소-비함유 물 1000 ㎕)
ㆍ 또다른 물 대조군을 제조 (예를 들어 내독소-비함유 물 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE 농도 50 EU/㎖ = 최종 농도 5.0 EU/㎖)
ㆍ 샘플을 약 60 분 실온에서 셰이킹 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서],
단계 (a01) : 투석 멤브레인의 세척
ㆍ 예를 들어, 10 kDa 셀룰로오스 아세테이트 (CA) 멤브레인을 사용하고 그들을 내독소-비함유 물 (예를 들어 300 ㎖ 의 제조사 B. Braun, Melsungen 의 증류수) 함유 크리스탈라이징 디쉬 내로 넣는다
ㆍ 그들을 조심스럽게 1 h 동안 셰이킹 (Shaker SG 20. IDL GmbH, Germany 또는 등가물, 50 내지 300 rpm, 바람직하게는 100 rpm)
ㆍ 멤브레인을 신선한 내독소-비함유 물 (예를 들어 300 ㎖ 의 제조사 B. Braun, Melsungen 의 증류수) 함유 새로운 크리스탈라이징 디쉬 내로 옮긴다
ㆍ 그들을 1 h 동안 셰이킹 (Shaker SG 20. IDL GmbH, Germany 또는 등가물, 50 내지 300 rpm, 바람직하게는 100 rpm)
단계 (a) : 25-100 mM, 바람직하게는 50-100 mM, 마그네슘 이온 (Mg2 +) 의 첨가
ㆍ Mg2 + 을, 예를 들어 MgCl2 의 형태로, 단계 (a0) 의 샘플에 25-100 mM, 바람직하게는 50-100 mM 의 최종 농도로 첨가 (예를 들어 50 ㎕ 의 1 M MgCl2 스톡 용액을 단계 (a0) 의 샘플에 첨가)
ㆍ 2-5 분 동안, 예를 들어 1 분 동안 셰이킹 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서]
ㆍ 샘플을 45 내지 75 분 동안, 바람직하게는 60 분 동안, 실온에서 인큐베이션
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서]
단계 (b) : 희석
ㆍ 단계 (a) 의 샘플 중 하나를 취하고 그것을 완충제 pH ~ 7.0 (예를 들어 50 mM Tris/HCl 완충제 pH ~ 7.0) 으로 1:10 의 비로 희석 (예를 들어 895 ㎕ 50 mM Tris-완충제 + 105 ㎕ 샘플)
ㆍ 바람직하게는 2 개의 희석된 샘플을 제조
ㆍ 예를 들어:
˚ 2 x Tris-완충제로 1:10 의 비로 희석된 항체 (샘플)
˚ 2 x Tris-완충제로 1:10 의 비로 희석된 5.0 EU/㎖ 로 스파이킹된 항체 (PPC)
˚ 2 x Tris-완충제로 1:10 의 비로 희석된 LAL 물 (배경)
˚ 2 x Tris-완충제로 1:10 의 비로 희석된 LAL 물 5.0 EU/㎖ (표준)
˚ LAL-물 = 첨가해 주세요
단계 (c) : 투석
ㆍ 모든 희석된 샘플을 1 분 동안 셰이킹 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서],
ㆍ 그들을 투석기 (바람직하게는 FastSpinDialyzer) 내로 옮긴다
ㆍ 교반기 위에 비이커 당 하나의 투석기를 놓는다
ㆍ 비이커를 내독소-비함유 물 (예를 들어 200 ㎖ 의 제조사 B. Braun, Melsungen 의 증류수) 로 채운다
ㆍ 실온에서 24 h 투석하고, 2 h 및 4 h 후에 내독소-비함유 물을 교환
ㆍ 교반기의 주파수는 바람직하게는 50 내지 300 rpm, 더욱 바람직하게는 200 rpm (특히 FastSpinDialyzer 가 사용되는 경우에) 이다. 교반기는 바람직하게는 20-60 ㎜ 의 길이 및 5-25 ㎜ 의 직경을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 교반기는 약 40 ㎜ 의 길이 및 약 14 ㎜ 의 직경을 갖는 자기 교반기이다.
단계 (d) : 셰이킹
ㆍ 투석 후에 샘플을 새로운 용기 내로 (예를 들어 1.5 ㎖ 스크류 바이알 내로) 옮기고, 20-60 min 동안 셰이킹 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서]
단계 (d00) : "LER 양성 대조군" 및 추가의 물 대조군의 제조
1. (단계 (d00) 는 필수적으로 단계 (d) 후에 수행되어야 하는 것은 아니다. 단계 (d00) 는 아무 때나 수행될 수 있으며, 다만 "LER 양성 대조군" 및 추가의 물 대조군은 LAL 검정법이 시작될 때 준비가 되어 있다.) "LER 양성 대조군" (즉 "양성 LER 대조군") 을 바람직하게는 투석이 끝나기 전 1 h 에 제조한다 [예를 들어 항체 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE 농도 50 EU/㎖ = 최종 농도 5.0 EU/㎖]
ㆍ 추가의 물 대조군, 예를 들어 하기를 제조:
1. 항체 900 ㎕ + 100 ㎕ LAL 물
2. LAL 물 1000 ㎕
ㆍ LAL 물 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE 농도 50 EU/㎖ = 최종 농도 5.0 EU/㎖
ㆍ 1 h 셰이킹 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서]
ㆍ 샘플을 내독소-비함유 물로 1:10 의 비로 희석
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [예를 들어 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서]
단계 (e) : LAL 검정법
표준 (즉 사용되는 LAL 검정법 키트에 포함되는 표준) 을 제조사의 지침에 따라 제조하고, 측정을 다음과 같이 시작한다;
(1) LAL 시약 (Kinetic-QCL™ 시약) 의 제조:
ㆍ 투구게, 리뮐루스 폴리페무스의 변형유주세포로부터 제조된 용해물, 및 발색 기질의 동시-동결건조된 혼합물을 사용 직전에 바이알 당 2.6 ㎖ 의 LAL 시약 물로 재구성 (reconstitute).
(2) CSE 스톡 용액 (50 EU/㎖, 즉 표준 S1 과 등가임) 의 제조:
ㆍ CSE 제제 (에스케리키아 콜라이 O55:B5-LPS, 각각의 바이알은 50-200 EU 동결건조된 내독소를 함유함) 를 분석의 증명서에서 언급되고 50 EU(또는 IU)/㎖ 를 함유하는 용액을 산출하도록 계산된 부피의 LAL 시약 물 중에 재구성.
ㆍ CSE 스톡 용액을 격렬히 적어도 15 분 동안 고속으로 셰이커에서 셰이킹.
ㆍ 사용 전에, 용액을 실온으로 데워지게 놔두고, 다시 격렬히 고속으로 셰이커에서 15 분 동안 셰이킹.
(3) CSE 표준 시리즈의 제조:
ㆍ CSE 스톡 용액 / 표준 S1 (단계 1) 을 실온의 LAL 시약 물로 1:10 계획으로 희석하여, 완전한 시리즈의 CSE 표준 (50, 5, 0.5, 0.05 및 0.005 EU/㎖) 을 산출함
(4) 96-웰 마이크로플레이트 ELISA 리더 포맷으로 LAL 분석:
ㆍ 100 ㎕ 의 LAL 시약 물 블랭크, 내독소 표준, 생성물 샘플, 양성 생성물 대조군을 마이크로플레이트의 적당한 웰 내로 조심스럽게 제공.
ㆍ 채워진 플레이트를 마이크로플레이트 리더에 배치하고, 뚜껑을 닫음.
ㆍ 플레이트를 ≥10 분 동안 37℃ ± 1℃ 에서 예비-인큐베이션.
ㆍ 8-채널 멀티피펫터를 사용하여 100 ㎕ 의 Kinetic-QCL™ 시약을 첫번째 칼럼 (A1-H1) 에서 시작하여 사용되는 마지막 칼럼으로 차례대로 진행하여 마이크로플레이트의 모든 웰 내로 제공. 시약을 가능한 신속히 첨가 (기포를 회피함).
ㆍ 컴퓨터 키보드 상의 OK 버튼을 즉시 클릭하여 시험을 시작.
(주의: Kinetic-QCL™ 검정법은 마이크로플레이트 커버를 제거하여 수행된다)
본원에서, "스파이킹한다 (spiking)" 는 "첨가한다" 또는 "제공한다" 를 의미한다. 예를 들어, "샘플을 알려진 양의 CSE 으로 스파이킹한다" 는 "알려진 양의 CSE 를 샘플에 첨가한다" 또는 "샘플에 알려진 양의 CSE 를 제공한다" 를 의미한다.
내독소는, 또한 지질다당류 (LPS) 로서 알려져 있으며, 그람-음성 박테리아의 외막에서 발견되는 큰 분자이고, 동물에서, 예를 들어 인간에서 강한 면역 반응을 유발한다. 언급된 바와 같이, 본 발명은 항체를 포함하는 샘플 중의 박테리아 내독소의 측정 (즉 검출 및 정량화) 방법으로서, 본원에서 기재되는 단계 (a) 내지 (d) 를 포함하는 방법을 제공한다 (바람직하게는 또한 단계 (a00), (a01) 및 (d00) 를 포함함).
하나의 실시양태에서 내독소는 에스케리키아 콜라이 내독소일 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법의 단계 (d) 에서 측정 (즉 검출 및/또는 정량화) 되는 내독소는 에스케리키아 콜라이 내독소일 수 있다. 예를 들어, LAL 검정법 동안 샘플에 스파이킹되는 내독소는 에스케리키아 콜라이 내독소 (즉 에스케리키아 콜라이로부터 정제된 내독소) 일 수 있다. 바람직하게는, 내독소는 상업적으로 입수가능한 에스케리키아 콜라이 내독소 (예를 들어 대조군 표준 내독소, CSE) 이다.
WHO 국제 표준 내독소 (International Standard Endotoxin) (I.S.) 는 박테리아 내독소 시험에 관한 궁극적 칼리브런트 (calibrant) 로서 국제적으로 인정되는 에스케리키아 콜라이 O113:H10:K- 로부터의 내독소 제제이다. 국제 표준의 현재의 로트 (lot) 는 "내독소에 관한 WHO 국제 표준, 3rd I.S." 로 명명된다.
참조 표준 내독소 (Reference Standard Endotoxin) (RSE) 는 WHO 국제 표준 내독소에 대해 보정된 내독소 제제이다. RSE 는 국가 기관 (예컨대 USP, EP, JP, ChP) 에 의해 확립되고, LAL 검정법에서 사용되는 CSE (아래 참고) 를 보정하기 위해 제공된다.
대조군 표준 내독소 (Control Standard Endotoxin) (CSE) 는 RSE 에 대해 보정된 RSE 이외의 내독소 제제이다. CSE 는 에스케리키아 콜라이 O113:H10:K- (예를 들어 Associates of Cape Cod, Inc.) 또는 기타 에스케리키아 콜라이 균주 예컨대 에스케리키아 콜라이 O55:B5 (예를 들어 Charles River, Lonza) 로부터 생산되는 내독소의 판매자 (vendor)-특이적, 고도-정제된 제제이다. 판매자는 안정화제 예컨대 인간 혈청 알부민, PEG, 또는 전분을 그들의 재량에 따라 첨가할 것이다. CSE 는 그들의 의도되는 용도에 따라 다양한 농도로 공급된다.
본원에서 제공되는 항체를 포함하는 샘플 중의 내독소의 측정 (즉 검출 및/또는 정량화) 방법; 또는 본원에서 제공되는 항체를 포함하는 샘플의 제조 방법은 그들이 LAL 검정법에서 LER 효과를 배제한다는 유리한 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상은 LAL 검정법에서 박테리아 내독소의 측정에서 LER 효과를 극복하기 위한 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 또는 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법의 용도에 관한 것이다.
더욱 구체적으로, 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 또는 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법은 이들 방법이 LER 효과를 나타내는 항체를 포함하는 샘플을 LAL 효소 캐스케이드에서 인자 C 에 반응성으로 만든다는 유리한 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상은 LER 효과를 나타내는 항체를 포함하는 샘플을 LAL 효소 캐스케이드에서 인자 C 에 반응성으로 만들기 위한 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 또는 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법의 용도에 관한 것이다.
특히 "박테리아 내독소를 측정한다" 의 맥락에서, 본원에서 용어 "측정한다" 또는 그의 문법적 변형은 내독소의 검출 및/또는 정량화, 바람직하게는 내독소의 검출 및 정량화에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 내독소 (예를 들어 에스케리키아 콜라이 내독소 예컨대 CSE) 는 바람직하게는 LAL 검정법에 의해 측정된다.
용어 "박테리아 내독소들 시험" 또는 "박테리아 내독소 시험" 은 본원에서 호환되게 사용되고, 그람-음성 박테리아로부터 내독소를 검출 또는 정량화하는 시험의 군에 관한 것이다. BET 은 전서 (즉 표준으로서의 역할을 하는 전서, 예컨대 유럽 또는 미국 약전, 또는 기타 국가 또는 국제 약학적 표준과 관련됨) LAL 검정법 (리뮐루스 변형유주세포 용해물 검정법) 을 기술한다. 더욱이, 본 발명의 맥락에서 LAL 검정법 동안 시험될 샘플의 pH-값은 5.7-8.0, 바람직하게는 6.0-8.0, 더욱 바람직하게는 6.5-7.5 인 것이 바람직하다.
용어 "LAL 검정법" 은 당업계에서 흔하게 알려져 있고, 인간 및 동물 비경구 약물, 생물학적 제품, 및 의료 장비에 관한 시험관내 내독소 시험을 나타낸다. 특히, LAL 검정법은 투구게 (리뮐루스 폴리페무스 (Limulus polyphemus) 또는 타키플레우스 트리덴타투스 (Tachypleus tridentatus)) 로부터의 변형유주세포 용해물을 사용하여 그람-음성 박테리아로부터 내독소를 검출 및 정량화하는 시험이다. 예를 들어, 박테리아 세포 생식, 세포 분열, 초목 잎마름병 및 세포 용해 동안, LPS 분자는 박테리아 세포 표면으로부터 상당히 제어되지 않고 비특이적인 방식으로 방출된다. 방출된 LPS 는 강력한 박테리아 독소에 해당하고, 그람-음성 박테리아에 의한 중증 감염 및 해로운 효과 (예를 들어, 고열, 저혈압 및 비가역 쇼크) 의 독성 발현의 주 원인이다 (Rietschel, 1994, FASEB J. 8:217-225). 지질 A 성분은 이러한 LPS 의 생물학적 활성의 원인이다. 희석된 염 용액에서, LPS 는 거대분자 응집물 (미셀) 을 형성한다. 이들 미셀의 형성, 크기 및 역학은 LPS 농도, 다양한 물리-화학적 파라미터 (예컨대 온도, 완충제의 농도 (이온 강도), 및 pH) 뿐만 아니라 지질 A 의 코어-올리고당인 O-사슬의 구조와 상관관계가 있다 (Aurell, 1998, Biochem. Biophys. Res. Comm. 253:119-123). 모든 그람-음성 박테리아에서 고도로 보존되어 있는, LPS 의 지질 A 모이어티는 LAL 검정법에 의해 인지되는 LPS 분자의 부분이며, 이러한 시험을 그람-음성 박테리아 공급원의 넓은 독립체로부터 내독소 오염을 조사하는 골든 표준 및 적합한 절차로 만든다 (Takada (1988)Eur. J. Biochem; 175:573-80).
LAL 검정법의 원리는 다음과 같이 기재된다. LAL 검정법에서 LPS 의 검출은 LAL 의 겔화를 통해 일어난다. 이러한 LPS 의 LAL 활성화 활성은 여러 가지 인자에 의해 영향을 받는다:
- LPS-LPS 응집물의 형성 [Akama, 1984, In "Bacterial Endotoxin" (Eds. J. Y. Homma, S. Kanegasaki, O. Luederitz, T. Shiba and O. Westphal], Publisher Chemie)
- 예를 들어 인간 지질단백질 Apo A 1, 라이소자임, 리보뉴클레아제 A 또는 인간 lgG 와의, 단백질-LPS 응집물의 형성 (Emancipator, 1992, Infect Immun. 60:596-601; Petsch, 1998, Anal. Biochem. 259:42-47)
- 박테리아 세포로부터의 LPS 의 추출 방법 [Galanos, 1984, In "Bacterial Endotoxin" (Eds. J. Y. Homma, S. Kanegasaki, O. Luederitz, T. Shiba and O. Westphal), Publisher Chemie]
- 박테리아 종; 장내세균 내의 LAL 활성화 활성은 1000 배 만큼 달라진다 [Niwa, 1984, In "Bacterial Endotoxin" (Eds. J. Y. Homma, S. Kanegasaki, O. Luederitz, T. Shiba and O. Westphal), Publisher Chemie].
LAL 검정법은 미국 (US), 유럽 (EP) 및 일본 (JP) 의 약전에서 비슷하게 만들어진다. 비슷해진 약전 챕터 (USP <85>, Ph. Eur. 2.6.14., 및 JP 4.01) 에서, LAL 검정법에 관한 3 가지 기술이 기재되어 있다:
- 겔-응고 기술 (내독소-유도되는 겔화에 기초함)
- 비탁 기술 (겔화에 의해 유도되는 탁도에 기초함)
- 발색 기술 (합성 펩티드-색소원 복합체의 분할 후의 착색에 기초함).
이들 3 가지 기술은 결국 6 가지 상이한 방법에서 적용된다:
방법 A: 겔-응고 방법, 한계 시험
방법 B: 겔-응고 방법, 반-정량적 시험
방법 C: 동역학적 비탁 방법
방법 D: 동역학적 발색 방법
방법 E: 발색 종점 방법
방법 F: 비탁 종점 방법
Ph. Eur./USP/JP 에 따르면 이들 6 가지 방법은 등가로 보여질 것이다.
본 발명의 우선순위부여된 양상은 샘플 중의 박테리아 내독소의 측정에 동역학적 발색 방법 또는 동역학적 비탁 방법이 사용되는, 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 및 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법에 관한 것이다. 가장 바람직하게는, 본원에서 제공되는 샘플 제조 방법 및 내독소 측정 방법에서 동역학적 발색 방법이 사용된다. 이러한 기술을 사용함으로써 내독소는 광도측정으로 검출될 수 있다. 이러한 기술은 내독소와 LAL 의 반응에 의해 발색 기질 (즉 적합한 발색 펩티드) 로부터 방출되는 발색단을 측정하는 검정법이다. 동역학적 발색 검정법은 반응 혼합물의 예정된 흡광도에 도달하는데 필요한 시간 (개시 시간), 또는 발색 현상이 속도를 측정하는 방법이다. 이 시험은 용해물 제조사에 의해 권고되는 인큐베이션 온도 (이는 통상적으로 37 ± 1℃ 임) 에서 수행된다. 예를 들어, 동역학적 발색 LAL 검정법을 수행하기 위해서, 샘플은 LAL 및 발색 기질 (즉 적합한 발색 펩티드 예컨대 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA) 을 포함하는 시약과 혼합되고 인큐베이션 플레이트 리더에 배치될 수 있다. 그 후, 샘플은 색 (예를 들어 노란색) 의 출현에 관해 시간의 흐름에 따라 모니터링된다. 색의 출현 전에 요구되는 시간 (반응 시간) 은 존재하는 내독소의 양에 반비례한다. 즉, 다량의 내독소의 존재 하에 반응은 신속히 일어난다; 더 적은 양의 내독소의 존재 하에 반응 시간은 증가된다. 미지의 샘플 중의 내독소의 농도는 표준 곡선으로부터 계산될 수 있다. LAL 검정법 동안, 즉 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법의 단계 (d) 에서, 내독소의 정량화는 바람직하게는 적어도 두 자릿수의 범위 (본 발명의 하나의 양상에서 0.005, 0.05, 0.5, 5.0 및 50.0 EU/㎖) 를 커버하는 표준 보정 곡선을 통해 수행된다.
예를 들어, 동역학적 발색 LAL 기술 동안, 하기 반응이 일어날 수 있다. 그람 음성 박테리아 내독소는 LAL 에서 효소전구체의 활성화를 촉매작용한다. 활성화의 초기 속도는 존재하는 내독소의 농도에 의해 측정된다. 활성화된 효소는 무색 기질 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA 로부터 p-니트로아닐린 (pNA) 의 분할을 촉매작용한다. 방출되는 pNA 은 인큐베이션 기간 전체 동안 연속적으로 405 nm 에서 광도측정으로 측정된다. 샘플 중의 내독소의 농도는 그것의 반응 시간으로부터 알려진 양의 내독소 표준을 함유하는 용액의 반응 시간과 비교함으로써 계산된다. LAL 검정법을 위해, LONZA 로부터의 키트 "리뮐루스 변형유주세포 용해물 (LAL) Kinetic-QCL™" (카탈로그 번호: 50-650U, 50-650NV, 50-650H; K50-643L, K50-643U) 가 제조사의 지침에 따라 사용될 수 있다. LAL 검정법을 수행함으로써 사용되는 키트에 포함되는 내독소 (예를 들어 LONZA 로부터의 키트 "리뮐루스 변형유주세포 용해물 (LAL) Kinetic-QCL™", 카탈로그 번호: 50-650U, 50-650NV, 50-650H; K50-643L, K50-643U 에 포함되는 에스케리키아 콜라이 O55:B5 내독소) 를 사용하는 것으로 구상된다.
본 발명의 맥락에서 LAL 검정법 동안 시험될 샘플의 pH-값은 5.7-9.0 인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, LAL 검정법 동안 시험될 샘플의 pH-값은 5.8-8.0, 더 더욱 바람직하게는 pH 5.8-7.5, 더 더욱 바람직하게는 pH 5.8-7.0 이다. 가장 바람직하게는, LAL 검정법 동안 시험될 샘플의 pH-값은 5.8-7.0 이다. 예를 들어, LAL 검정법 동안 시험될 샘플의 pH-값은 pH 5.7, pH 5.8, pH 5.9, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, 또는 pH 7.0 일 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 LAL 검정법 전에 시험 용액 (즉 용해된 고체 샘플 또는 액체 샘플) 의 pH 값은 pH 5.7-8.0, 더욱 바람직하게는 pH 5.8 내지 pH 7.0 로 조정되는 것으로 구상된다. 필요한 경우에, pH 값은 예를 들어 희석, 완충제의 첨가 및/또는 중화에 의해 조정될 것이다.
여러 물질 (예컨대 β-글루칸) 이 LAL 시험을 어느 정도 간섭한다 (명백한 예외는 물 샘플이다). 간섭은 LAL 검정법의 저해 또는 증강일 수 있다. 특히, 간섭 인자는 LAL 시험으로부터 얻어지는 LPS 정량화, 및 그러므로 내독소의 정량화를 증강 또는 저하시킬 수 있다. 그러므로, 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법의 단계 (d) 에서 PPC 의 회수가 50-200% 의 수용가능한 범위에 있지 않은 경우에, 간섭 인자는 제거되어야 한다. 이는 본원에서 제공되는 방법의 단계 (b) 에서 샘플 희석에 의해 수행될 수 있다. 특히, 샘플은 내독소-비함유 물 또는 내독소-비함유 완충제로 (바람직하게는 Tris/HCl 완충제, pH ~ 7.0 로) 희석될 수 있다. 저해/증강을 결여하는 최저 샘플 희석 (최고 생성물 농도) 은 "비-간섭 농도 (NIC)" 로 호칭된다. 그러나, 샘플 희석 동안, MVD (최대 유효 희석 (Maximum Valid Dilution) = 내독소 한계가 측정될 수 있는 샘플의 최대 가능한 희석) 은 초과되지 않을 것이다. 특히, 상이한 뱃치의 시험 결과에 기초하여, 모든 뱃치를 커버하는 샘플 희석 (검증된 샘플 희석 또는 샘플 농도) 이 선택된다. 또는, 다시 말하면, PPC 에서 50-200% 의 회수를 초래하는 샘플 희석이 본원에서 제공되는 방법의 단계 (b) 에서 선택된다. 내독소의 손실 없이 (즉 LER 효과를 보이지 않으면서) 선택된 처리가 간섭을 효과적으로 제거한다는 것을 확립하기 위해서, 정의된 농도의 내독소로 스파이킹된 샘플 (즉 PPC) 을 사용하여 "간섭 인자에 관한 시험" 이 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 양상은 PPC 이 제조되고 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법의 단계 (d) 에서 내독소에 관해 시험되는, 본원에서 제공되는 내독소 측정 방법에 관한 것이다. 스파이킹된 내독소 대조군 표준의 회수가 합계 50-200% 에 이르는 경우에, 샘플에는 간섭 인자가 없다.
USP/Ph. Eur./JP 에 따른 BET 이 각각의 시험 결과의 평가를 개별적으로 허용하는 내부 대조군 (PPC) 을 포함한다는 사실로 인해, USP/Ph. Eur./JP 에 따른 BET 방법 검증은 올바른 내독소 결과의 전제조건이 아니다.
용어 "낮은 내독소 회수 (LER)" 또는 "LER 효과" 는 당업계에 알려져 있고, 폴리소르베이트 + 시트레이트 또는 포스페이트의 조합에 의해 야기되는 내독소 차폐를 구체적으로 기술한다 (Chen, J. and Williams, K. L., PDA Letter 10, 2013, 14-16). 내독소 차폐는 또한 임의의 기타 완충제 성분 또는 그들의 조합에 의해 야기될 수 있다. 주어진 물질 (예를 들어 완충제 또는 치료적 항체의 샘플) 이 LER 효과를 나타내는지를 확인하기 위해서, 예를 들어 내독소 유지 시간 연구에서, 내독소 함량이 시간의 흐름에 따라 모니터링될 수 있다. 내독소 유지 시간 연구는 미희석 샘플의 내독소 스파이킹 및 시간의 흐름에 따른 내독소 스파이킹된 샘플의 저장을 요구한다. 예를 들어, 샘플은 수개월까지 저장될 수 있다. 바람직하게는, 유지 시간 연구에서 내독소 스파이킹된 샘플은 수 (예를 들어 7 ~ 28) 일 동안 저장되고, 정의된 시점에 LAL 검정법이 수행된다. 스파이킹된 내독소의 양의 50% 미만인 회수율은 샘플이 LER 효과를 나타낸다는 것을 시사한다. 내독소 회수가 50% 미만이지만 임의의 중간 시점에서만 발생하고 종료 시점에서는 발생하지 않는 경우에, 시험 샘플은 차폐 효과를 나타내는 것으로 여겨질 수 없다.
지난 몇년 동안, FDA 는 LER 현상을 잘 인지했고, 가이던스를 발행했다 (참고, Hughes, P., et al., BioPharm. Asia March/April 2015, 14-25). 이들 가이던스는 전에 정의된 양의 CSE 가 미희석 샘플에 스파이킹되었을 때 (예를 들어 5.0 EU/㎖ = 100 %) 약학적 시료 중의 내독소 회수의 수용가능한 한계를 50 내지 200 % 범위로 정의한다. 시험될 샘플이 LER 효과를 나타내는 경우에, 스파이킹된 내독소의 회수율은 스파이킹된 내독소의 전체 양의 50% 미만이다.
본원에서 제공되는 본 발명의 방법에서, 샘플은 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 포함한다. 본원에서 용어 "샘플", "시험될 샘플", "항체를 포함하는 샘플" 및 "시험될 항체를 포함하는 샘플" 은 호환되게 사용되고, 내독소의 존재 및/또는 양에 관해 시험될 항체를 포함하는 특정 양의 액체를 언급한다. 또는, 다시 말하면, 용어 "샘플", "시험될 샘플", "항체를 포함하는 샘플" 및 "시험될 항체를 포함하는 샘플" 은 본원에서 호환되게 사용되고, 내독소의 존재 및/또는 양에 관해 (바람직하게는 존재 및 양에 관해) 시험될 액체와 관련되고, 여기에서 상기 액체는 항체를 포함한다. 상기 "시험될 항체를 포함하는 샘플" 은 바람직하게는 치료적 항체의 샘플이다. 용어 "치료적 항체" 는 인간에서 사용하는 것이 의도되는 임의의 항체 제제를 나타낸다. 항체 (예를 들어 치료적 항체) 는 바람직하게는 폴리소르베이트 80 또는 소듐 시트레이트 완충제와 함께, 더욱 바람직하게는 폴리소르베이트 80 및 소듐 시트레이트 완충제와 함께 제형화된다. 가장 바람직하게는, 항체는 약 25 mM 소듐 시트레이트 완충제 및 약 700 ㎎/L 폴리소르베이트 80 과 함께 제형화되고, 약 6.5 의 pH 값을 갖는다. 바람직하게는 본 발명의 맥락에서 상기 항체 (예를 들어 치료적 항체) 는 모노클로날 항체이다. 가장 바람직하게는, 상기 항체 (예를 들어 치료적 항체) 는 항-CD20 항체 리툭시맙이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 샘플은 MabThera®/Rituxan®/Zytux® 의 샘플일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 시험될 샘플 (즉 시험될 항체를 포함하는 샘플) 은 LER 효과를 보이는/나타내는 것으로 구상된다.
본원에서 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 온전한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2 개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 분절을 그들이 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 망라한다. 또한 인간, 인간화된, 낙타화된 또는 CDR-그래프팅된 항체가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 얻어진 항체에 관한 것이며, 즉 항체 집단의 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도 특이적이며, 단일 항원 자리를 향해 지향된다. 게다가, 상이한 결정인자 (에피토프) 를 향해 지향되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자를 향해 지향된다. 그들의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 그것이 기타 항체에 의해 오염되지 않게 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날" 은 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 얻어진 항체의 특질을 나타내고, 임의의 특별한 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 샘플에 포함되는 모노클로날 항체는 Kohler, G. et al., Nature 256 (1975) 495 에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567) 에 의해 제조될 수 있다.
본원에 기재된 모노클로날 항체는 바람직하게는 숙주 세포, 가장 바람직하게는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서의 발현에 의해 생산된다. 생산을 위해 항체의 VL 를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경 및/또는 중쇄) 을 인코딩하는 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 하나 이상의 벡터 내에 삽입된다 (예를 들어, 발현 벡터). 이들은 숙주 세포 내로 도입된다. 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들어, 하기로 형질전환되었다): (1) 항체의 VL 를 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터. 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포) 일 수 있다.
항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어, 위에 기재된 바와 같은, 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 그러한 핵산은 종래의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 항체는 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 분절 및 폴리펩티드의 발현에 관해, 예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523 을 참고한다. (또한 참고, 에스케리키아 콜라이에서의 항체 분절의 발현을 기술하는, Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), HumanaPress, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254.) 발현 후에, 항체는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵생물 미생물 예컨대 사상 진균 또는 효모가 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 이는 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산을 초래하는, 글리코실화 경로가 "인간화된" 진균 및 효모 균주를 포함한다. 참고, Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로 바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 참고, 예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978, 및 US 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서의 항체 생산을 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재함).
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응되는 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 기타 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어, Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 리뷰에 대해, 예를 들어, Yazaki, P. and Wu,A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), HumanaPress, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268 을 참고한다.
"항체 분절" 은 온전한 항체의 일부를 포함한다. 용어 "항체 분절" 은 항원-결합 부분, 즉, 항원 (예컨대 CD20) 에 결합하는 능력을 보유하는 "항원 결합 자리" (예를 들어, 분절, 부분서열, 상보성 결정 영역 (CDRs)) 를 포함하고, 예를 들어, 하기를 포함하거나 또는 대안적으로 그로 이루어진다: (i) Fab 분절, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 일가 분절; (ii) F(ab')2 분절, 힌지 영역에서 다이설파이드 가교에 의해 연결된 2 개의 Fab 분절을 포함하는 이가 분절; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 분절; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 분절, (v) VH 도메인으로 이루어지는, dAb 분절 (Ward; 1989; Nature 341; 544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR). 항체 분절 또는 유도체는 F(ab')2, Fv 또는 scFv 분절 또는 단일 사슬 항체를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 본원에서 제공되는 방법에서 항체 (즉 샘플에 포함되는 항체) 는 리툭시맙이다.
용어 "리툭시맙" (상표명 MabThera®, Rituxan®, Zytux®) 은 단백질 CD20 에 대항하는 키메라 모노클로날 항체에 관한 것이다. CD20 은 암 및 정상 B-세포의 표면에서 발견된다. 리툭시맙은 B 세포를 파괴하고, 그러므로, 예를 들어, 과도한 수의 B 세포, 과활성 B 세포, 또는 기능부전 B 세포에 의해 특징지어지는 질환을 치료하는데 사용된다. 이는 다수의 림프종, 백혈병, 이식 거부반응, 및 자가면역 장애를 포함한다. 예를 들어, 리툭시맙은 만성 림프모구 백혈병에서 피하 제형으로서 사용된다. 그러나, 리툭시맙은 통상적으로 정맥내 주입에 의해 투여된다. 골수의 줄기 세포는 리툭시맙 처리 후에 B-세포가 재증식하는 것을 허용하는 CD20 단백질을 갖지 않는다. 본원에서 사용되는, 용어 "리툭시맙" 은 또한 미국, 유럽 및 일본으로 이루어지는 나라들의 군으로부터 선택되는 나라 또는 지역에서 시판 허가를 얻는데 필수적인 요건을 만족시키는 모든 항-CD20 항체 또는 항-CD20 항체 분절을 망라한다. 가장 바람직하게는, 용어 "리툭시맙" 은 각각 SEQ ID NOs: 1 및 2 에서 보여지는 바와 같은 중 및 경쇄의 아미노산 서열을 갖는 항체를 나타낸다. 당업자는 주어진 아미노산 서열로부터 코딩 핵산 서열을 얻는 방법을 쉽게 안다. 따라서, SEQ ID NOs: 1 및 2 의 지식으로, 리툭시맙의 코딩 핵산 서열은 쉽게 얻어질 수 있다.
상표명 "NeoRecormon®" 은 활성 성분으로서 에포에틴 베타를 함유하는 약학적 제형에 관한 것이다. 에포에틴 베타는 자연-발생적 호르몬 에리트로포이에틴의 합성 버전이다. 에리트로포이에틴은 건강한 신장에 의해 생산되고, 골수를 자극하여 신체 여기저기에 산소를 운반하는 적혈구를 생산하게 한다. 에포에틴 베타는 또한 화학 요법을 받고 있는 특정 유형의 암을 갖는 사람에서 증상을 보이는 빈혈을 치료하는데 사용된다. 화학요법의 부작용 중 하나는 그것이 암 세포 뿐만 아니라 건강한 혈구를 죽인다는 것이다. 에포에틴의 주입은 적혈구 생산을 증가시키고, 빈혈의 증상을 완화시키는 것을 돕는다. 에포에틴이 혈구 생산을 증가시키므로, 더 큰 부피의 혈액이 에포에틴을 수령하는 사람으로부터 취해질 수 있고, 이러한 혈액은 수술 동안 또는 수술 후에 수혈 동안 저장될 수 있다.
본원에서 제공되는 샘플 제조 또는 내독소 측정 방법의 단계 (d) 에서, 샘플 (즉 항체를 포함하는 샘플) 은 내독소-비함유 수성 용액에 대해 투석되며, 여기에서 샘플은 pH 5.7 내지 pH 8.0 (바람직하게는 pH 6.0 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 7.5) 의 pH-값을 갖는다. 생화학에서, 투석은 반투과성 멤브레인, 예컨대 투석 관 (tubing) 을 통한 분자의 확산 속도의 차이에 의해 용액 중의 분자를 분리하는 흔히 사용되는 과정이다. 투석은 의료 투석과 동일한 원리로 작업하는 흔한 실험실 기술이다. 생명 과학 연구의 맥락에서, 투석의 가장 흔한 적용은 더 큰 거대분자 예컨대 항체로부터 원치 않는 작은 분자 예컨대 염, 환원제, 또는 염료의 제거이다. 투석은 또한 완충제 교환 및 약물 결합 연구에 흔히 사용된다.
확산은 평형에 도달할 때까지 더 높은 농도의 영역으로부터 더 낮은 농도의 영역으로의 분자의 순 이동을 초래하는 용액 중의 분자의 무작위, 열 이동 (브라운 운동) 이다. 투석에서, 샘플 및 완충제 용액 (투석물로 호칭됨) 은 차등 확산 패턴을 야기하여, 그에 의해 샘플 및 투석물 양쪽에서 분자의 분리를 허용하는 반-투과성 멤브레인에 의해 분리된다. 멤브레인의 공극 크기로 인해, 샘플 중의 큰 분자 (예를 들어 항체) 는 멤브레인을 통과할 수 없으며, 그에 의해 샘플 체임버로부터의 그들의 확산을 제한한다. 이와 대조적으로, 작은 분자 (예를 들어 Na-시트레이트 완충제의 성분) 는 멤브레인을 통하여 자유롭게 확산하고 전체 용액 부피에서 평형을 얻을 것이고, 그에 의해 샘플 및 투석물 중 이들 분자의 전체 농도를 변화시킨다. 평형에 도달하면, 분자의 최종 농도는 관여되는 용액의 부피에 의존적이고, 평형된 투석물이 신선한 투석물로 교환 (또는 교환) 되는 경우에 (하기 절차 참고), 확산은 샘플 중의 작은 분자의 농도를 추가로 감소시킬 것이다.
예를 들어, 샘플로부터 (즉 항체를 포함하는 샘플로부터) Na-시트레이트 완충제를 제거하기 위한 하기 투석 절차가 사용될 수 있다:
1. 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 멤브레인을 수득 및 세척
2. 샘플을 투석 관, 카세트 또는 디바이스 내로 로딩
3. 샘플을 투석물이 있는 외부 체임버 내로 배치 (완충제의 교반과 함께)
4. 24 시간 동안 실온에서 투석; 상기 24 시간 동안 물을 2 회 교환
적당한 부피의 투석물을 사용하고 완충제의 복수의 교환에 의해, 샘플 내의 소듐 시트레이트 완충제의 농도가 무시할 수 있는 수준 (즉 원래의 함량의 1-2%) 으로 감소될 수 있다.
본 발명은 추가로 하기 비-제한적 도면 및 실시예를 참조하여 기재된다. 도면에서 뿐만 아니라 실시예에서, 기재된 실험의 대부분은 정의된 번호에 의해 표시된다. 예를 들어, 명칭 [리툭시맙 117] 은 실험이 제형화된 제형화된 리툭시맙을 사용하여 및/또는 제형화된 리툭시맙 플라시보를 사용하여 수행되었고 참조 번호 "117" 을 갖는다는 것을 의미한다.
도 1: 12-16kDa 의 MWCO 을 사용하는 포스페이트 및 폴리소르베이트 20 을 함유하는 Neo Re cormon ® 의 투 석의 시간 의존성 . 실온에서의 명시된 투석 시간, 동결건조 및 칭량 후에 얻어진 내부 투석물의 중량이 보여진다. 회색 막대기의 상부의 데이타는 2 회 측정의 평균 양 (%) 을 보여준다.
도 2: 투석 전에 소 혈청 알부민 (BSA) 으로 처리된 또는 처리되지 않은 (w/o) 12-16 kDa 의 멤브레인 MWCO 을 사용하는 포스페이트 및 폴리소르베이트 20 을 함유하는 Neo Re cormon ® 의 투 석 . 명시된 시간 후에 얻어진 내부 투석물 중의 포스페이트 (P) 의 함량이 보여진다. 왼쪽 막대기는 투석 전에 멤브레인이 0.2% BSA 로 처리되었을 때 P 의 양을 보여준다. 오른쪽 막대기는 BSA-처리되지 않은 P 의 양에 해당한다. 내부 투석물로부터 회수된 포스페이트의 광도측정 시험이 Strominger (1959, J. Biol. Chem. 234: 3263-3267) 에 따라 수행되었다.
도 3: [ 리툭시맙 115] 및 [ 리툭시맙 117] (A) 리툭시맙 및 (B) 리툭시맙 플라시보를 샘플로서 사용하여 실시예 2.1 에 기재된 바와 같은 LER 효과를 극복하기 위한 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 ( % ) . 도면에서 "빠른 회전" 및 "느린 회전" 은 교반기의 주파수를 의미한다 (즉 "빠른 회전" 은 교반기의 주파수가 높다는 것을 의미한다). 이러한 예시적 프로토콜은 또한 기타 샘플의 일상적 품질 대조군에, 바람직하게는 소듐 시트레이트 완충제 및 폴리소르베이트 80 을 세제로서 함유하는 시료에 유용하다.
도 4: LER 효과를 극복하기 위한 수정된 프로토콜의 도해적 표현 및 상기 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 . (A) LER 효과를 극복하기 위한 본 발명에 따른 프로토콜의 도해적 표현 (예를 들어 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보에서). 상세한 프로토콜은 실시예 2.2 에 기재되어 있다. 이러한 예시적 프로토콜은 또한 기타 샘플의 일상적 품질 대조군에, 바람직하게는 소듐 시트레이트 완충제 및 폴리소르베이트 80 을 세제로서 함유하는 시료에 유용하다. (B) [리툭시맙 046] 도 4(A) 에 따른 프로토콜을 수행한 후에 LER 검정법에 의해 얻어진 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보의 회수율 (%). 추가 세부사항에 대해, 실시예 2.2 에 기재된 프로토콜을 참조한다.
도 5: [리툭시맙 059] 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 2 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%).
도 6: 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 3 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%). 참조예 2.2 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 [리툭시맙 061].
도 7: 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 4 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) . (A) 참조예 3.1 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 [리툭시맙 062]. (B) 참조예 3.2 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 [리툭시맙 063].
도 8: 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 5 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) . (A) 참조예 4.1 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 [리툭시맙 064]. (B) 참조예 4.2 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 [리툭시맙 065].
도 9: 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보를 샘플로서 사용하여 참조예 6 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%). [리툭시맙 072].
도 10: 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보를 샘플로서 사용하여 참조예 7 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%). (A) [리툭시맙 079] 인큐베이션하지 않음; (B) [리툭시맙 080] 4 h 인큐베이션; (C) [리툭시맙 081] 1 일 인큐베이션; (D) [리툭시맙 082] 3 일 인큐베이션.
도 11: 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 8 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) . (A) [리툭시맙 002] 상이한 희석율을 사용하는 LAL 검정법; (B) [리툭시맙 004] Lonza 및 ACC CSE 스파이킹의 비교; (C) [리툭시맙 005] 상이한 희석율 및 pH 조정을 사용하는 LAL 검정법.
도 12: 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 8 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) . 투석 및 희석 단독은 LER 효과를 극복하지 않는다 [리툭시맙 011].
도 13: LER 효과의 시간 의존성 . 도면은 스파이킹 및 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 1 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) 을 보여준다 [리툭시맙 027]. 스파이킹 후의 셰이킹 시간 (즉 2 초 내지 60 분) 이 명시되어 있다.
도 14: LER 효과에 대한 완충제 시스템의 중요성 . 참조예 10 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) 이 보여진다. (A) 리툭시맙 또는 소듐 시트레이트가 샘플로서 사용되고 1:2, 1:5, 1:10, 또는 1:20 의 비로 희석되었을 때 LAL 검정법 [리툭시맙 006]; (B) 소듐 시트레이트; 폴리소르베이트 80 또는 소듐 시트레이트 및 폴리소르베이트 80 가 샘플로서 사용되고 1:2, 1:5 또는 1:10 의 비로 희석되었을 때 LAL 검정법 [리툭시맙 029].
도 15: LER 효과에 대한 MgCl 2 의 효과 . 참조예 13 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) 이 보여진다. (A) 10 mM 의 농도로 MgCl2 의 첨가 [리툭시맙 030]; (B) 50 mM 의 농도로 MgCl2 의 첨가 [리툭시맙 031]; (C) 25 mM 의 농도로 MgCl2 의 첨가 [리툭시맙 032]; (D) 75 mM 의 농도로 MgCl2 의 첨가 [리툭시맙 033].
도 16: LER 효과에 대한 기계적 (mechanical) 처리의 효과 . 참조예 14 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) 이 보여진다 [리툭시맙 034]. 도면에서, "셰이킹" 은 60 분 동안 셰이킹되었음을 의미한다.
도 2: 투석 전에 소 혈청 알부민 (BSA) 으로 처리된 또는 처리되지 않은 (w/o) 12-16 kDa 의 멤브레인 MWCO 을 사용하는 포스페이트 및 폴리소르베이트 20 을 함유하는 Neo Re cormon ® 의 투 석 . 명시된 시간 후에 얻어진 내부 투석물 중의 포스페이트 (P) 의 함량이 보여진다. 왼쪽 막대기는 투석 전에 멤브레인이 0.2% BSA 로 처리되었을 때 P 의 양을 보여준다. 오른쪽 막대기는 BSA-처리되지 않은 P 의 양에 해당한다. 내부 투석물로부터 회수된 포스페이트의 광도측정 시험이 Strominger (1959, J. Biol. Chem. 234: 3263-3267) 에 따라 수행되었다.
도 3: [ 리툭시맙 115] 및 [ 리툭시맙 117] (A) 리툭시맙 및 (B) 리툭시맙 플라시보를 샘플로서 사용하여 실시예 2.1 에 기재된 바와 같은 LER 효과를 극복하기 위한 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 ( % ) . 도면에서 "빠른 회전" 및 "느린 회전" 은 교반기의 주파수를 의미한다 (즉 "빠른 회전" 은 교반기의 주파수가 높다는 것을 의미한다). 이러한 예시적 프로토콜은 또한 기타 샘플의 일상적 품질 대조군에, 바람직하게는 소듐 시트레이트 완충제 및 폴리소르베이트 80 을 세제로서 함유하는 시료에 유용하다.
도 4: LER 효과를 극복하기 위한 수정된 프로토콜의 도해적 표현 및 상기 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 . (A) LER 효과를 극복하기 위한 본 발명에 따른 프로토콜의 도해적 표현 (예를 들어 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보에서). 상세한 프로토콜은 실시예 2.2 에 기재되어 있다. 이러한 예시적 프로토콜은 또한 기타 샘플의 일상적 품질 대조군에, 바람직하게는 소듐 시트레이트 완충제 및 폴리소르베이트 80 을 세제로서 함유하는 시료에 유용하다. (B) [리툭시맙 046] 도 4(A) 에 따른 프로토콜을 수행한 후에 LER 검정법에 의해 얻어진 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보의 회수율 (%). 추가 세부사항에 대해, 실시예 2.2 에 기재된 프로토콜을 참조한다.
도 5: [리툭시맙 059] 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 2 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%).
도 6: 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 3 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%). 참조예 2.2 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 [리툭시맙 061].
도 7: 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 4 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) . (A) 참조예 3.1 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 [리툭시맙 062]. (B) 참조예 3.2 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 [리툭시맙 063].
도 8: 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 5 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) . (A) 참조예 4.1 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 [리툭시맙 064]. (B) 참조예 4.2 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 [리툭시맙 065].
도 9: 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보를 샘플로서 사용하여 참조예 6 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%). [리툭시맙 072].
도 10: 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보를 샘플로서 사용하여 참조예 7 에 기재된 바와 같은 프로토콜을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%). (A) [리툭시맙 079] 인큐베이션하지 않음; (B) [리툭시맙 080] 4 h 인큐베이션; (C) [리툭시맙 081] 1 일 인큐베이션; (D) [리툭시맙 082] 3 일 인큐베이션.
도 11: 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 8 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) . (A) [리툭시맙 002] 상이한 희석율을 사용하는 LAL 검정법; (B) [리툭시맙 004] Lonza 및 ACC CSE 스파이킹의 비교; (C) [리툭시맙 005] 상이한 희석율 및 pH 조정을 사용하는 LAL 검정법.
도 12: 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 8 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) . 투석 및 희석 단독은 LER 효과를 극복하지 않는다 [리툭시맙 011].
도 13: LER 효과의 시간 의존성 . 도면은 스파이킹 및 리툭시맙을 샘플로서 사용하여 참조예 1 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) 을 보여준다 [리툭시맙 027]. 스파이킹 후의 셰이킹 시간 (즉 2 초 내지 60 분) 이 명시되어 있다.
도 14: LER 효과에 대한 완충제 시스템의 중요성 . 참조예 10 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) 이 보여진다. (A) 리툭시맙 또는 소듐 시트레이트가 샘플로서 사용되고 1:2, 1:5, 1:10, 또는 1:20 의 비로 희석되었을 때 LAL 검정법 [리툭시맙 006]; (B) 소듐 시트레이트; 폴리소르베이트 80 또는 소듐 시트레이트 및 폴리소르베이트 80 가 샘플로서 사용되고 1:2, 1:5 또는 1:10 의 비로 희석되었을 때 LAL 검정법 [리툭시맙 029].
도 15: LER 효과에 대한 MgCl 2 의 효과 . 참조예 13 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) 이 보여진다. (A) 10 mM 의 농도로 MgCl2 의 첨가 [리툭시맙 030]; (B) 50 mM 의 농도로 MgCl2 의 첨가 [리툭시맙 031]; (C) 25 mM 의 농도로 MgCl2 의 첨가 [리툭시맙 032]; (D) 75 mM 의 농도로 MgCl2 의 첨가 [리툭시맙 033].
도 16: LER 효과에 대한 기계적 (mechanical) 처리의 효과 . 참조예 14 에 기재된 바와 같은 LAL 검정법을 수행함으로써 얻어진 회수율 (%) 이 보여진다 [리툭시맙 034]. 도면에서, "셰이킹" 은 60 분 동안 셰이킹되었음을 의미한다.
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에 제시되어 있다. 본 발명의 주제에서 벗어나지 않으면서 절차에 변경이 가해질 수 있다고 이해된다.
실시예 1: 기술 장비 및 시약
1. 기술 장비
1.1 마이크로플레이트 리더 (reader) 시스템 (본원에서 또한 "리더" 로서 지칭됨)
ㆍ Infinite® 200 PRO, 멀티모드 마이크로플레이트 리더; Tecan, Switzerland / Tecan Deutschland GmbH, Germany, P/N: 30050303.
ㆍ Magellan V. 7.1 소프트웨어
ㆍ Costar™ 세포 배양 플레이트, 96 웰, Fisher Scientific, P/N: 07-200-89.
1.2 셰이커 시스템 및 유리 바이알
ㆍ Multi Reax; Heidolph, Germany, P/N: 545-10000-00.
ㆍ 1.5 ㎖ 스크루 넥 유리 바이알 (N8); Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany, P/N: 702004 (수량: 100).
ㆍ N 8 PP 스크루 캡, 검은색, 막힌 윗면 (closed top); Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany, P/N: 70250 (수량: 100).
ㆍ 4 ㎖ 스크루 넥 유리 바이알 (N13); Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany, P/N: 702962 (수량: 100).
ㆍ N 13 PP 스크루 캡, 검은색, 막힌 윗면; Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany, P/N: 702051 (수량: 100).
1.3 투석 장비
ㆍ SpinDIALYZER™, 체임버 부피 1000 ㎕; Harvard Apparatus, U.S.A., P/N 740314 (수량: 1) 및 740306 (수량: 5), 지역 유통업자: Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus, GmbH, Germany, P/N SP1 74-0306 (수량: 5). 주목 (Remark): Lot No: 032613 을 사용.
투석기는 생물학적 샘플의 투석을 위한 단순한 단면 디바이스이다. 20 ㎕ 내지 5 ㎖ 범위의 샘플 부피를 수용하는 넓은 범위의 투석기 크기가 입수가능하다. 1 ㎖ 를 위한 카탈로그 Nb. (본원에서 사용되는) 는 74-0314 이다. 멤브레인의 MWCO 은 100 내지 300,000 Da 범위이다. 전체 유닛은 PTFE, 거의 비반응성 재료로 구성되어 있다.
ㆍ Fast SpinDIALYZER, 체임버 부피 1000 ㎕, Harvard Apparatus, U.S.A., P/N 740510 (수량: 1) 또는 740504 (수량: 5), 주목: 양면 멤브레인 시스템, 상부 + 바닥 멤브레인.
투석기는 높은 샘플 회수를 위해 PTFE 로 만들어진 재사용가능한 샘플 체임버이고, 훨씬 더 빠른 투석 속도를 위해 더 큰 멤브레인 표면적을 제공하도록 다시 디자인되었다. 매우-빠른 (Ultra-Fast) 투석기는 50 ㎕ 내지 1500 ㎕ 부피를 갖고, 여기에서 1000 ㎕ 로 사용되었다. 1 ㎖ 를 위한 카탈로그 Nb. (본원에서 사용되는) 는 74-0412 이다.
ㆍ 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인, 500 Da MWCO, Harvard Apparatus, U.S.A., P/N: SP1 7425-CA500, 지역 유통업자: Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH, Germany, P/N: SP1 7425-CA500.
ㆍ 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인, 10 kDa MWCO, Harvard Apparatus, U.S.A., P/N: SP1 7425-CA10K, 지역 유통업자: Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH, Germany, P/N: SP1 7425-CA10K.
주목: 리툭시맙에 대한 LER 조사에서 뿐만 아니라 NeoRecormon® 에 대한 LER 실험에서 '표준' 500 Da MWCO 멤브레인에 더하여 시험됨.
ㆍ 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인, 25 kDa MWCO, Harvard Apparatus, U.S.A., P/N:SP1 7425-CA25K, 지역 유통업자: Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH, Germany, P/N:SP1 7425-CA25K.
주목: 리툭시맙에 대한 LER 조사에서 뿐만 아니라 NeoRecormon® 에 대한 LER 실험에서 '표준' 500 Da MWCO 멤브레인에 더하여 시험됨.
ㆍ Aqua B. Braun, 멸균 발열원-비함유 물, 1 ℓ, B. Braun Melsungen AG, Germany, P/N: 14090586.
ㆍ 크리스탈라이징 디쉬, 900 ㎖, OMNILAB, Germany, P/N: 5144008.
(주목: 투석 멤브레인의 헹굼에 사용)
ㆍ DURAN® 비이커, 키 큰 형태, 2000 ㎖, OMNILAB, Germany, P/N: 5013163.
ㆍ DURAN® 비이커, 키 큰 형태, 250 ㎖, OMNILAB, Germany, P/N: 5013136.
1.4 일상적 실험실 장비
ㆍ 고압증기멸균 시스템 (주목: 투석 체임버의 멸균에 사용)
ㆍ epT.I.P.S.® LoRetention-Reloads, PCR 클린 (clean), 0.5-10 ㎕, Eppendorf, Germany, P/N: 0030072.057
ㆍ epT.I.P.S.® LoRetention-Reloads, PCR 클린, 2-200 ㎕, Eppendorf, Germany, P/N: 0030072.022
ㆍ epT.I.P.S.® LoRetention-Reloads, PCR 클린, 50-1000 ㎕, Eppendorf, Germany, P/N: 0030072.030
ㆍ Stripettes®, Individual, 5 ㎖, Paper/Plastic Wrap, Fisher Scientific, P/N: 10420201.
2. 시약
2.1 동역학적 발색
LAL
검정법 및
LAL
-관련 시약
ㆍ Kinetic-QCL™ Kit; Lonza, Switzerland, P/N: 50-650U 또는 50-650H (즉 "Lonza 키트").
ㆍ CHROMO- LAL von Associates of Cape Cod (AAC) Inc., USA, P/N: C0031-5 (즉 "ACC 키트").
ㆍ K-QCL 을 위한 내독소 에스케리키아 콜라이 O55:B5; Lonza, Switzerland, P/N: E50-643.
ㆍ 내독소 에스케리키아 콜라이 O55:B5, 2.5 ㎎/바이알; Lonza, Switzerland, P/N: N185.
ㆍ LAL 시약 물 - 100 ㎖; Lonza, Switzerland, P/N: W50-100.
ㆍ LAL 을 위한 MgCl2, 10 mM 용액, 30 ㎖ 바이알; Lonza, Switzerland, P/N: S50-641.
ㆍ 분석용 마그네슘 클로라이드 헥사하이드레이트 EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph. Eur., 250 g; Merck, Germany, P/N: 1.05833.0250.
ㆍ LAL 을 위한 Tris 완충제, 50 mM 용액, 30 ㎖ 바이알; Lonza, Switzerland, P/N: S50-642.
2.2 단백질 시약
ㆍ 알부민 소 분획 V, 매우 낮은 내독소, 지방산 비함유, 25 g; Serva, Germany, P/N: 47299.04.
ㆍ 알부민, 인간 혈청, 분획 V, 높은 순도; 1 g; Merck, Germany, P/N: 126658-1GM.
3. 시험된
약제
본원에서 기재되는 실시예에서, 리툭시맙 (이는 포함한다) 및 NeoRecormon® (이는 에포에틴-베타를 포함한다) 을 사용했다. 게다가, 리툭시맙 및 NeoRecormon® 의 각각의 플라시보를 또한 본원에서 기재되는 방법에서 적용했다.
각각의 샘플의 플라시보는 활성 치료적 성분의 부재를 제외하고는 샘플과 동일하며, 즉 리툭시맙 플라시보는 리툭시맙을 함유하지 않으나 제형의 모든 기타 성분을 함유한다.
실시예 2: LER 효과를 극복하기 위한 본 발명의 방법
실시예 2.1: LER 효과를 극복하기 위한 프로토콜
이 실시예에서 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보를 샘플로서 사용했다. 그러나, 아래서 논의되는 바와 같이, 본원에서 기재되는 프로토콜은 약학적 항체의 모든 전형적 제형에서 LER 를 극복하는데 유용하다.
이 실시예에서 사용되는 물질
- 멤브레인:
ㆍ 10 kDa 셀룰로오스 아세테이트 (CA) 멤브레인, Harvard Apparatus, U.S.A., P/N:SP1 7425-CA10K
- 투석기:
ㆍ Fast SpinDialyzer, 체임버 부피 1000 ㎕, Harvard Apparatus, U.S.A., P/N 740510 (수량: 1) 또는 740504 (수량: 5)
- 샘플 바이알:
ㆍ 1.5 ㎖ 스크루 넥 유리 바이알 (N8); Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany, P/N: 702004
ㆍ N 8 PP 스크루 캡, 검은색, 막힌 윗면; Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany, P/N: 70250
- 크리스탈라이징 디쉬:
ㆍ 900 ㎖, Duran, VWR Germany, P/N: 216-1817
- MgCl2 - 스톡 용액:
ㆍ 물에 용해된 1M MgCl2 (분석용 마그네슘 클로라이드 헥사하이드레이트 EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph. Eur., 250 g; Merck, Germany, P/N: 1.05833.0250)
- LAL 을 위한 Tris-완충제, 50mM 용액 (즉 내독소-비함유), 30 ㎖ 바이알; Lonza, Switzerland, P/N: S50-642
- 샘플:
ㆍ 리툭시맙 플라시보 및 LAL 물
단계적 프로토콜:
단계 1: 샘플의 제조
ㆍ 1 x 리툭시맙 플라시보 900 ㎕ + 100 ㎕ LAL 물
ㆍ 1 x 리툭시맙 플라시보 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE 농도 50 EU/㎖ = 최종 농도 5.0 EU/㎖
ㆍ 1 x LAL 물 1000 ㎕
ㆍ 1 x LAL 물 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE 농도 50 EU/㎖ = 최종 농도 5.0 EU/㎖
ㆍ 샘플을 RT (실온) 에서 60 분 셰이킹 [즉 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서],
단계 2: 투석 멤브레인의 세척
ㆍ 10 개의 10 kDa 셀룰로오스 아세테이트 (CA) 멤브레인을 사용하고, 그들을 300 ㎖ Aqua Braun (즉 제조사 B. Braun, Melsungen 의 증류수) 을 함유하는 크리스탈라이징 디쉬 내로 넣는다
ㆍ 그들을 1 h 동안 셰이킹 (Shaker SG 20. IDL GmbH, Germany 또는 등가물, 50 내지 300 rpm, 바람직하게는 100 rpm)
ㆍ 멤브레인을 신선한 Aqua Braun (또한 300 ㎖) 을 함유하는 새로운 크리스탈라이징 디쉬 내로 옮긴다
ㆍ 그들을 1 h 동안 셰이킹 (Shaker SG 20. IDL GmbH, Germany 또는 등가물, 50 내지 300 rpm, 바람직하게는 100 rpm)
단계 3: 약 50 mM MgCl2 의 최종 MgCl2 농도로 MgCl2 의 첨가
ㆍ 50 ㎕ 의 1M MgCl2 스톡 용액을 단계 1 의 샘플에 첨가
ㆍ 그들을 1 분 동안 셰이킹. [즉 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서]
ㆍ 샘플을 60 분 동안 실온에서 인큐베이션
ㆍ 그들을 1 분 동안 셰이킹. [즉 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서]
단계 4: 희석
ㆍ 단계 3 의 샘플 중 하나를 취하고, 그것을 완충제, pH ~ 7 (즉 50 mM Tris/HCl 완충제 pH ~ 7) 로 1:10 의 비로 희석
˚ 895 ㎕ 50 mM Tris-완충제 + 105 ㎕ 샘플
ㆍ 반복 측정을 위해 그것을 2 회 수행 (즉 듀플리케이트로 측정):
˚ 2 x Tris-완충제로 1:10 의 비로 희석된 리툭시맙 플라시보
˚ 2 x Tris-완충제로 1:10 의 비로 희석된 리툭시맙 플라시보 5.0 EU/㎖
˚ 2 x Tris-완충제로 1:10 의 비로 희석된 LAL 물
˚ 2 x Tris-완충제로 1:10 의 비로 희석된 LAL 물 5.0 EU/㎖
단계 5: 투석
ㆍ 모든 희석된 샘플을 1 분 동안 셰이킹 [즉 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서],
ㆍ FastSpinDialyzer 내로 옮긴다
ㆍ 자기 교반기 플레이트 위에 비이커 당 하나의 투석기를 놓음 (즉 DURAN® 비이커, 키 큰 형태, 2000 ㎖, OMNILAB, Germany, P/N: 5013163). 교반기의 주파수를 높게 (즉 "빠른 회전") 조정. 교반기의 높은 주파수는 50-300 rpm, 바람직하게는 200-300 rpm 을 의미한다. 교반기는 약 40 ㎜ 의 길이 및 약 14 ㎜ 의 직경을 갖는 가열 살균된 (250 ℃ 에서 4 시간) 자기 교반기이다.
ㆍ 비이커를 200 ㎖ Aqua Braun 로 채움
ㆍ 실온 (21 ±2 ℃) 에서 24 h 투석하고 2 h 및 4 h 후에 Aqua Braun 을 교환
ㆍ 투석 후에 샘플을 새로운 1.5 ㎖ 스크루 바이알 내로 옮긴다
단계 6: 셰이킹
ㆍ 샘플을 20 분 동안 셰이킹. [즉 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서]
단계 7: LER 양성 대조군 (즉 양성 LER 대조군) 및 추가의 물 대조군의 제조
ㆍ LER 양성 대조군을 투석이 끝나기 전 1 h 에 제조
1. 리툭시맙 플라시보 900 ㎕ + 100 ㎕ LAL 물
2. 리툭시맙 플라시보 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE 농도 50 EU/㎖ = 최종 농도 5.0 EU/㎖
3. LAL 물 1000 ㎕
4. LAL 물 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE 농도 50 EU/㎖ = 최종 농도 5.0 EU/㎖
ㆍ 1 h 셰이킹 [즉 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서]
ㆍ 샘플을 LAL 물로 1:10 (샘플:LAL 물) 의 비로 희석
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [즉 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서]
단계 8: LAL 검정법
ㆍ 제조사의 지침에 따라 표준을 제조하고 LAL 검정법 (Kinetic-QCL™ 검정법; Lonza) 을 시작
결과 및 논의
:
도 3(A) (즉 [리툭시맙 117]) 및 3(B) (즉 [리툭시맙 115]) 에서 볼 수 있는 바와 같이 위에 기재된 방법은 LER 효과를 극복할 수 있다. 게다가, 이러한 방법을 사용함으로써, 리툭시맙에서 뿐만 아니라 리툭시맙 플라시보에서 LER 효과가 극복될 수 있다. 이는 위에 기재된 프로토콜이 특별한 모노클로날 항체를 포함하는 제형에 의존적이지 않고, 폴리소르베이트 80 및 킬레이트화 완충제 (예컨대 소듐 시트레이트) 를 포함하는 모든 제형에서 LER 효과를 배제하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 제형은 항체, 특히 모노클로날 항체에 전형적이다. 따라서, 위에 기재된 방법은 모든 항체 제형에서 LER 효과를 극복하는데 유용할 것으로 예상된다.
Mg2+ 은 킬레이트화 완충제 (예컨대 소듐 시트레이트) 를 함유하고 LER 효과를 보이는 제형에서 LAL 반응성을 회복시키기 위해 선택되는 2 가 양이온이라는 것이 발견되었다.
킬레이트화 완충제 (예를 들어 소듐 시트레이트 완충제) 를 제거하기 위해서, 제 2 단계 (Mg2 + 의 첨가 후에) 는 투석을 수행할 것이다. Harvard 의 spinDIALYZER™ 은 투석에 바람직한 장비이다.
세제 (예를 들어 폴리소르베이트 80) 는 LER 효과의 두번째 이유에 해당한다. 일반적으로, 생물학적 샘플 중의 세제 (예컨대 폴리소르베이트 80) 의 존재는 세제의 임계 미셀 농도 (CMC) (통상적으로 μM 범위에서) 에 도달되는 경우에 미셀 형성을 초래한다. 미셀은 인자 C (LAL-캐스케이드 반응에서 첫번째 효소에 해당하는 세린 프로테아제) 의 LPS-매개되는 활성화를 저해할 수 있다 (Nakamura (1988a) J. Biochem. 103: 370-374). 모노클로날 항체 제제에서, 항체의 기능적 가용화를 얻기 위해서 미희석 샘플은 통상적으로 CMC 초과이다. 여기에서 조사된 제품에서, 세제의 CMC 는 실제로 그들의 CMC 를 초과하므로 (폴리소르베이트 80: 700 ㎎/ℓ (50 배 과잉)) 폴리소르베이트 80 이 미셀 형태로 존재한다는 추정을 초래한다. 위에 기재된 프로토콜에서 세제의 농도는 희석에 의해 감소되어 세제의 농도는 CMC 값 근처이다/미만으로 하락한다 (폴리소르베이트 80: 14 ㎎/ℓ 또는 10.6 μM). 근사-CMC 농도로의 세제의 희석은 미셀 구획화를 제거할 수 있고, 그러므로, 스파이킹된 CSE 분자를 LAL 효소에 접근가능하게 만든다.
따라서, LER 효과의 문제 (예를 들어 소듐 시트레이트 및 폴리소르베이트 80 이 약학적 제품의 제형에 사용되는 경우에) 는 이제 해결되는 것으로 여겨질 수 있다. 결론적으로, 약학적 제품에 대한 안전한, 견고한 및 재현가능한 시험 방법이 본원에서 제공된다.
요약하면, 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보에서 위에 기재된 프로토콜은 놀랍게도 LER 효과를 극복한다. 이와 대조적으로, 동일한 프로토콜은 NeoRecormon® (이는 항체를 포함하지 않으나 에포에틴-베타를 포함함) 에 관해 만족스러운 결과를 드러내지 못했으며, 이는 본원에서 제공되는 방법이 항체 제형에, 바람직하게는 모노클로날 항체, 시트레이트 완충제 및 폴리소르베이트 80 을 함유하는 제형에 특히 유용하다는 것을 시사한다.
실시예 2.2: LER 효과를 극복하기 위한 수정된 프로토콜 (1)
이 실시예에서 그럼에도 불구하고 LER 효과를 극복한 수정된 프로토콜을 사용했다. 실시예 2.1 과 비교할 때 가장 중요한 변화는 다음과 같다:
1. 실시예 2.2 에서는 회전 투석기를 사용했다. 이와 대조적으로, 실시예 2.1 에서는 더욱 효율적 투석 체임버를 갖고 투석 효율을 증가시키는 Fast SpinDialyzer (멤브레인이 실린더의 양면에 있다) 를 사용했다.
2. 실시예 2.2 에서는 투석 멤브레인의 MWCO 는 500 Da 이다. 이와 대조적으로, 실시예 2.1 에서는 투석 멤브레인의 MWCO 는 10 kDa 이다.
3. 실시예 2.2 에서는 희석을 내독소-비함유 물로 1:10 의 비로 수행한다. 이와 대조적으로, 실시예 2.1 에서는 희석을 Tris-완충제 pH ~ 7 (즉 Tris/HCL 완충제 pH ~ 7) 로 1:10 의 비로 수행한다. 샘플을 내독소-비함유 물로 1:10 의 비로 희석시킴으로써 샘플의 pH 값을 약 pH 6.0 로 조정한다.
4. 실시예 2.2 에서는 투석 시간은 4 h 이다. 이와 대조적으로, 실시예 2.1 에서는 투석 시간은 24 h 이다.
이 실시예에서 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보를 샘플로서 사용했다. 그러나, 실시예 2.1 에 관해 논의된 바와 동일한 이유로, 이 프로토콜은 모든 전형적 항체 제형에서 LER 를 극복하는데 유용하다.
특히, 실시예 2.2 에서 사용되는 프로토콜은 다음과 같이 상세히 설명된다.
프로토콜 개요
단계 1: "LER 효과를 설정" (또한 아래의 "LER 양성 대조군" 을 참고):
리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보 샘플을 5 EU/㎖ 또는 0.5 EU/㎖ (CSE; Lonza, 에스케리키아 콜라이 O055:B5) 로 스파이킹하고, 혼합물을 60 분 동안 실온에서 최대 속도로 셰이킹하여 [셰이커: Heidolph Multi Reax, 고속 (2,037 rpm)] "양성 LER-효과" 샘플을 얻었다.
단계 2: MgCl2 를 첨가: 투석 전에, 2 M MgCl2 스톡 용액을 첨가하여 최종 농도가 약 50 mM MgCl2 가 되게 한다; 단계 1 에서와 같이 1 분 동안 셰이킹.
단계 3: 1:10 희석 [하나의 샘플은 참조로서 희석하지 않음 (미희석)]; 단계 1 에서와 같이 1 분 동안 셰이킹.
단계 4: 4 h 동안 500 Da 멤브레인 (0.2% BSA 와 함께 30 분 예비-인큐베이션; 임의적이며 의무적이 아님) 을 사용하여 투석, 2h 후에 한 번 물을 교환. 용액을 투석 체임버로부터 유리 바이알 내로 옮기고, 단계 1 에서와 같이 20 분 동안 RT (실온, 즉 21 ± 2 ℃) 에서 셰이킹.
단계 5: 동역학적 LAL-검정법 측정.
상세한 프로토콜
단계 1 : 샘플의 제조
ㆍ 50 mM MgCl2 를 위한 항체 용액 (리툭시맙) 을 제조: 1 개의 튜브에 877.5 ㎕ 리툭시맙 + 97.5 ㎕ CSE (50 (5) EU CSE/㎖ 의 스톡 용액 → 5 (0.5) EU/㎖ 최종 농도) 를 채움.
ㆍ 스파이킹되지 않은 대조군: 877.5 ㎕ 리툭시맙 플라시보 + 97.5 ㎕ 물
ㆍ 스파이킹되지 않은 물 대조군: 975 ㎕ 물 (블랭크 뺄셈을 위함)
ㆍ 사용된 바이알: 투명 넓적 바닥 작은 개구부 1.5 ㎖ Macherey & Nagel, Ref. Nr. 70213
ㆍ Heidolph Multi Reax, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서 1h 셰이킹.
단계 2 : 50 mM MgCl2 의 최종 농도로 MgCl2 의 첨가
ㆍ 스톡 용액 1M MgCl2ㆍ6H2O: 50 ㎕ 의 1M MgCl2-스톡 용액을 스파이킹된 샘플에 뿐만 아니라 스파이킹되지 않은 샘플 (블랭크) 에 첨가.
단계 3 : 희석
ㆍ 50 mM MgCl2 함유 리툭시맙 샘플: 900 ㎕ 내독소-비함유 물 (즉 LAL 물) + 100 ㎕ 샘플을 첨가하여 1:10 희석물을 준비
ㆍ 물 대조군은 리툭시맙 대신에 내독소-비함유 물 (즉 LAL 물) 로 동일하게 처리: 1:10 로 희석
단계 4 : 투석
ㆍ 투석 전에 1 분 동안 셰이킹 [즉 Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온에서].
ㆍ MWCO 500 Da 을 갖는 멤브레인 (임의로, 0.2% BSA 와 함께 30 분 예비-인큐베이션) 이 고정된 1 ㎖ 투석기 체임버 (Harvard 회전 투석기) 내로 샘플을 넣는다.
ㆍ 24℃ 에서 1 ℓ Aqua Braun (즉 멸균, 발열원 비함유 물; B. Braun, Melsungen 에 의해 공급됨) 에 대해 4 h 동안 투석; 2 h 후에 물을 교환. 교환하는 물도 24℃ 로 예열했다.
ㆍ 교반 (자기 테플론 교반기) 하에 1 ℓ Aqua Braun 을 채운 복수의 2 ℓ 비이커에 회전 투석기를 분배한다 (투석 체임버의 수에 따라).
ㆍ 하나의 2 ℓ 비이커에 최대 5 개의 투석기가 있다.
단계 5 : LER 양성 대조군의 제조
또한 이 실시예에서 LER 양성 대조군을 LAL 검정법에서 사용한다. 이러한 LER 양성 대조군은 아무 때나 제조할 수 있으며, 다만 그것은 LAL 검정법이 시작될 때 준비가 되어 있다. 유리하게는, LER 양성 대조군은 4 h 투석이 끝나기 전 1 h 에 제조하여, 모든 샘플은 동시에 시험을 위한 준비가 되어 있다. LER 양성 대조군을 제조하기 위해 하기 프로토콜을 사용한다:
ㆍ 리툭시맙 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE → 최종 농도 CSE: 5.0 EU/㎖.
ㆍ Heidolph Multi Reax, 고속 (2,037 rpm) 에서 RT 에서 1 h 동안 셰이킹. 오직 이들 조건 하에서만 최대 LER 효과 (<1 % 회수율) 가 얻어질 것이다.
ㆍ 병행하여 하기 블랭크를 제조한다:
˚ 물 + 5.0 EU/㎖ CSE
˚ 물 + 5.0 EU/㎖ CSE; 1:10 (0.5 EU/㎖) 로 희석됨.
단계 6 : LAL 검정법
ㆍ 모든 샘플을 제조한 후에 시험을 시작한다.
ㆍ 모든 샘플로부터 100 ㎕ 의 2 개의 앨리쿼트를 사용하여 Tecan 리더에서 37℃ 에서 10 분 인큐베이션되는 플레이트에서 반복 측정한다 (2x, 즉 듀플리케이트로 측정).
ㆍ 100 ㎕ LAL 시약 (Kinetic-QCL™ 검정법; Lonza) 을 각각의 샘플에 잘 정의된 순서로 (기계의 판독에 따라) 첨가한다.
결과 및 논의
:
실시예 2.1 에 기재된 프로토콜은 최상의 재현가능한 회수율을 초래했다 (또한 물 대조군에 관하여). 그러나, 실시예 2.2 에 기재된 프로토콜은 스파이킹된 CSE 농도 둘다에서 50 내지 95% 범위의 양호한 CSE 회수율을 초래했다 (참고, 도 4(B) [리툭시맙 046]). 그러므로, 실시예 2.2 에서 사용된 프로토콜은 실시예 2.1 에 기재된 프로토콜과 기능적 등가물에 해당한다는 결론을 내릴 수 있다.
참조예 1: LER 효과의 시간 의존성
선행 기술에서 정의된 양의 CSE 로 샘플을 스파이킹한 직후에 LER 효과가 나타나는 것으로 추정된다 (C. Platco, 2014, "Low lipopolysaccharide recovery versus low endotoxin recovery in common biological product matrices". American Pharmaceutical Review, September 01, 2014, pp. 1-6). 그러므로, 첫째로 샘플을 LPS 스파이킹 후에 약 2-10 분의 상당히 짧은 시간 동안 실온에서 셰이킹했다. 그러나, 이러한 종류의 스파이킹은 비효율적인 것으로 드러났고, 일부 실험은 스파이킹된 물질의 차폐 효과가 이러한 짧은 시간 간격 (<10 분) 동안 그것의 최대에 아직 도달하지 않았다는 것을 시사했다. 스파이킹의 메카니즘은 올바른 방식으로 LER 효과를 분석함에 있어서 기본적 과정 중 하나인 것으로 밝혀졌다 (참고, 예를 들어, 도 13 [리툭시맙 027]). 이들 데이타에 따르면, LER 효과는 예를 들어 제형 혼합물의 미셀 내로 침투함으로써 CSE 분자를 차폐할 시간을 요구하는 동역학적 현상이다. 따라서, LER 효과를 분석하기 위한 다음 단계 전에 2-10 분 동안 셰이킹은, 그것은 일상적 관행에 해당하지만, 부적당하고, 그것의 형성을 위한 조건에 아직 도달하지 않았기 때문에 LER 효과를 대표하는 것으로 여겨질 수 없다. 그러므로, "양성 LER 효과" (LAL 시험에 의한 0% 의 회수율에 도달한 경우에 존재하는 것으로 정의됨) 를 시험하기 위한 내부 표준이 실험에 포함되었다. 리툭시맙에서 LER 효과에 대한 동역학적 연구를 수행함으로써, 양성 LER 효과는 ≥60 분 인큐베이션 시간을 필요로 하는 것으로 입증되었다.
특히, 최대 LER 효과를 달성하기 위해서, 얼마나 오래 셰이킹이 수행되어야 하는지가 분석되었다 [최대 주파수 (즉 볼텍싱 (vortexing)) Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 에서 실온 (21 ℃ ± 2 ℃) 에서 1.5 ㎖ 투명 유리, 크림프 넥, 넓적 바닥 용기에서]. 그러므로, 리툭시맙 샘플을 바이알에서 CSE 로 스파이킹하여, 0.5 및 5.0 EU/㎖ (Macherey-Nagel 에 의한 바이알, 1.5 ㎖) 를 얻었다. 스파이킹 후에, 샘플을 각각 60 분, 30 분, 10 분, 5 분, 또는 2 초 동안 셰이킹했다. 이후, 900 ㎕ 내독소-비함유 물 (즉 LAL 물) 과 100 ㎕ 샘플을 혼합함으로써 1:10 희석물을 제조했다. 희석 후에, 샘플을 다시 1 분 동안 셰이킹했다. 후속적으로, 샘플을 LAL 검정법에서 듀플리케이트로 시험했다. 특히, 100 ㎕ 의 각각의 샘플을 플레이트 위로 적용하고, 리더에서 10 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 그 후, 100 ㎕ 색소원을 각각의 샘플에 첨가하고, 측정을 수행했다. 이 실험에서, 모든 용액은 실온을 가졌다. 도 13 [리툭시맙 027] 에서 볼 수 있는 바와 같이, LER 효과는 상응하는 미희석 샘플과 비교할 때 샘플이 1:10 의 비로 희석되는 경우에 더 낮다 (즉 회수율이 더 높다) . 게다가, 2 초 셰이킹 후에 5.0 EU/㎖ 내독소 함유 희석된 샘플에 관한 회수 값은 여전히 대략 50% 였다. 그러나, 셰이킹 (즉 볼텍싱) 시간의 증가는 회수율의 일정한 감소를 초래한다 (30-분 값은 예외이다), 도 13 [리툭시맙 027] 참고. 이와 대조적으로, 미희석 샘플은 2 초 후에 이미 최대 LER 효과를 보인다. 그러나, 또한 희석된 샘플은 60 분 동안 셰이킹된 (즉 볼텍싱된) 샘플에서 유의한 LER 효과를 보였다.
이 결과로부터 스파이킹은 LPS 분자를 세제 미셀 내로 차폐할 시간을 필요로 한다는 결론을 내릴 수 있다. CSE 의 약 100% 차폐 또는 <0.5 % 회수율이 얻어질 때 "양성 LER 효과" 는 완전하다. 이 과정은 실온에서 셰이킹 [예를 들어, 셰이커: Heidolph Multi Reax, 고속 (2,037 rpm) 1 h 동안 실온에서 1.5 내지 5 ㎖ 투명 유리, 크림프 넥, 넓적 바닥에서] 또는 대안적으로 4℃ 에서 더 긴 시간 기간 >24h 동안 저장 동안 최소 1 h 을 요구한다. 결과적인 "양성 LER 대조군" 은 모든 그래프 도표에서 하나의 막대기로서 그래프 표현에서 도표의 오른쪽에 보여진다.
참조예 2: 회수율에 대한 인간 혈청 알부민 (humanserum albumin) (HAS) 및 상이한
MgCl
2
농도
의 영향
내독소 스파이킹된 리툭시맙 샘플의 회수율에 대한 HSA 및 상이한 MgCl2 농도의 효과를 확인하기 위해서, 하기 실험을 수행했다. 게다가, 이 실험에서 회수율에 대한 투석의 영향을 분석했다. 더욱 구체적으로, "양성 LER 효과" 를 얻기 위해서 리툭시맙 스파이킹된 샘플을 60 분 동안 셰이킹했다. 투석 전에, 10-75 mM MgCl2 를 첨가하고, 후속적으로, 희석을 수행했다. BSA-차단된 멤브레인을 사용하지 않았다. 투석 후에, 0.01 μg/㎖ HSA 을 첨가하거나 또는 첨가하지 않는다. 후속적으로, 20 분 동안 셰이킹을 수행한다. 게다가, 일부 샘플을 전혀 희석하지 않았다. 특히, LAL 검정법에서 시험된 상이한 샘플이 도 5 (즉 [리툭시맙 059]) 에서 보여진다. 이 실험에서, 투석을 수행하지 않은 일부 샘플에서 LER 효과가 극복될 수 있었다. 그러나, 추가의 실험은 투석 없이는 LER 효과가 재현가능하게 극복될 수 없다는 것을 입증했다. 또는, 다시 말하면, 투석 없이는, LER 효과는 때때로 극복되고 때때로 극복되지 않는다. 따라서, 샘플 투석은 LER 효과를 극복하기 위한 더욱 견고한 방법을 초래한다.
샘플을 Macherey-Nagel 에 의한 1.5 ㎖ 스크루 넥 바이알에서 제조했다.
단계 1 : 샘플의 제조
ㆍ 10 mM MgCl 2 를 위한 스파이킹된 리툭시맙의 제조: 897 ㎕ 리툭시맙 + 99.8 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 50 mM MgCl 2 를 위한 스파이킹된 리툭시맙의 제조: 889 ㎕ 리툭시맙 + 98.8 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 75 mM MgCl 2 를 위한 스파이킹된 리툭시맙의 제조: 883 ㎕ 리툭시맙 + 98.1 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 10 mM MgCl 2 를 위한 스파이킹된 물 의 제조: 897 ㎕ 물 + 99.8 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 50mM MgCl 2 를 위한 스파이킹된 물 의 제조: 889 ㎕ 물 + 98.8 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 75 mM MgCl 2 를 위한 스파이킹된 물 의 제조: 883 ㎕ 물 + 98.1 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 60 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 2 : MgCl2 의 첨가
ㆍ 4 M MgCl2 스톡 용액 (즉 0.629 ㎖ 물 중 511.437 ㎎ MgCl2ㆍ6H2O) 을 사용했다.
˚ 10 mM MgCl2 를 위해 2.5 ㎕ 의 4 M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다.
˚ 50 mM MgCl2 를 위해 12.5 ㎕ 의 4 M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다.
˚ 75 mM MgCl2 를 위해 19 ㎕ 의 4 M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다.
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 3 : 희석
ㆍ 1:10 의 비로의 희석물을 다음과 같이 제조했다:
ㆍ 리툭시맙 1:10 을 제조: 항상 900 ㎕ LAL 물 + 100 ㎕ 샘플
ㆍ 이용가능한 투석기가 충분하지 않으므로 물을 1:10 로 희석하지 않았다.
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 4 : 투석
ㆍ 샘플을 1 mL 투석기 내에 넣었다. 500 Da 멤브레인. 그러나, 멤브레인을 LAL 물에서 세척했다.
ㆍ 투석을 1L Aqua Braun 에 대해 24℃ 에서 4h 동안 수행하고, 2h 후에 물을 교환했다. 새로운 물도 또한 24℃ 의 온도를 가졌다.
ㆍ 투석기를 세 개의 2L 비이커에 배치했고, 각각의 비이커에 긴 교반기 (즉 교반 막대) 가 있었으므로 회전시켰다.
ㆍ 각각의 비이커에 항상 4 개의 투석기가 있다.
단계 5 : 투석 후에 HSA 의 첨가
ㆍ 투석 후에, 샘플을 나누었다. HSA-샘플의 제조를 위해 396 ㎕ 의 각각의 샘플을 별개의 바이알에 첨가했다. HSA 없는 샘플의 제조를 위해 400 ㎕ 를 별개의 바이알에 첨가했다.
ㆍ 0.01 ㎍/㎖ 의 HSA 농도를 얻기 위해서, 4 ㎕ 의 1 μg/㎖ 용액을 396 ㎕ 샘플에 첨가했다
ㆍ HSA 스톡 용액을 새롭게 제조했다.
ㆍ 20 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 6 : LER 양성 대조군의 제조
ㆍ LER 양성 대조군을 4 h 투석이 끝나기 전 1 h 에 제조하여, 그것은 다른 샘플과 동시에 시험을 위한 준비가 되어 있다.
ㆍ 리툭시맙 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE 의 상이한 CSE 스톡 용액 → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 실온에서 1h 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm)]
단계 7 : LAL 검정법
ㆍ 100 ㎕ 의 각각의 샘플을 이중 측정에서 플레이트 위로 적용했다
ㆍ 리더에서 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션.
ㆍ 100 ㎕ 색소원을 각각의 샘플에 적용했다.
ㆍ 리더에서 측정을 시작.
결과 및 논의
:
결과가 도 5 [리툭시맙 059] 에서 보여진다. 이 실험은 HSA 처리가 회수율을 감소시키고, 그러므로 본원에서 제공되는 방법의 맥락에서 덜 유용하다는 것을 입증한다. 게다가, 결과는 투석 멤브레인의 BSA 처리가 만족스러운 회수율을 얻는데 필수적이 아니라는 것을 보여준다. 게다가, 이 실험은 또한 50 mM MgCl2 이 회수를 위한 최적 값이고, 10 및 75 mM MgCl2 는 더 낮은 회수를 초래한다는 것을 입증한다. 그러나, 또한 75 mM MgCl2 로 만족스러운 회수율이 얻어졌다. 더욱이, 이 실험은 MgCl2 의 첨가가 투석 없이도 만족스러운 범위 (70-100%) 내의 회수를 초래한다는 것을 보여준다. 그러나, 위에서 언급된 바와 같이, 투석 없이는 LER 효과가 재현가능하게 극복될 수 없다. 따라서, 샘플 투석은 LER 효과를 극복하기 위한 더욱 견고한 방법을 초래한다. 실험 [리툭시맙 059] 에서 물 대조군 값이 높았다 (값의 일부 >220 %) 는 것이 시사된다. LER 양성 대조군은 만족스럽다; 즉 0% 회수.
참조예
3:
MgCl
2
의 첨가 후에
4 시간
인큐베이션 시간
이 실험에서 "양성 LER 효과" 를 달성하기 위해서 리툭시맙 샘플을 60 분 동안 셰이킹했다. MgCl2 의 첨가 후에 미희석 샘플을 4 h 동안 실온에서 인큐베이션했다. 이러한 인큐베이션 후에, 샘플을 2 분 동안 셰이킹했다. LAL 검정법에서 시험된 상이한 샘플이 도 5(B) [리툭시맙 061] 에서 보여진다.
샘플을 Macherey-Nagel 에 의한 1.5 ㎖ 스크루 넥 바이알에서 제조했다.
단계 1 : 샘플의 제조
ㆍ 10 mM MgCl 2 를 위한 스파이킹된 리툭시맙/물의 제조: 897 ㎕ 리툭시맙/물 + 99.8 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 50mM MgCl 2 를 위한 스파이킹된 리툭시맙/물의 제조: 889 ㎕ 리툭시맙/물 + 98.8 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 75 mM MgCl 2 를 위한 스파이킹된 리툭시맙/물의 제조: 883 ㎕ 리툭시맙/물 + 98.1 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 100 mM MgCl 2 를 위한 스파이킹된 리툭시맙/물의 제조: 877 ㎕ 리툭시맙/물 + 97.5 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 150 mM MgCl 2 를 위한 스파이킹된 리툭시맙/물의 제조: 866 ㎕ 리툭시맙/물 + 96.3 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 60 분 동 안 셰 이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 2 : MgCl2 의 첨가
ㆍ 4 M MgCl2 스톡 용액 (즉 0.657 ㎖ 물 중 534.661 ㎎ MgCl2ㆍ6H2O) 을 사용했다.
ㆍ 10mM MgCl2 를 위해 2.5 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다.
ㆍ 50mM MgCl2 를 위해 12.5 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다.
ㆍ 75mM MgCl2 를 위해 19 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다.
ㆍ 100mM MgCl2 를 위해 25 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다.
ㆍ 150mM MgCl2 를 위해 37 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다.
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 3 : 희석
ㆍ 1:10 의 비로의 희석물을 제조했다: 900 ㎕ LAL 물 + 100 ㎕ 샘플 (즉 리툭시맙 샘플 또는 물 샘플)
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 4 : LER 양성 대조군의 제조
ㆍ 리툭시맙 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE → 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 또다른 LER 양성 대조군을 900 ㎕ 리툭시맙 + 100 ㎕ CSE 을 혼합하여 5.0 EU/㎖ 을 얻고; 후속적으로 샘플을 내독소-비함유 물로 1:10 의 비로 희석함으로써 제조했다
단계 5 : 셰이킹
ㆍ 모든 샘플 뿐만 아니라 LER 양성 대조군을 셰이킹했다 실온에서 1h 동안 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm)]
단계 6 : LAL 검정법
ㆍ 100 ㎕ 의 각각의 샘플을 이중 측정에서 플레이트 위로 적용했다
ㆍ 리더에서 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션.
ㆍ 100 ㎕ 색소원을 각각의 샘플에 적용했다.
ㆍ 리더에서 측정을 시작.
결과 및 논의
:
이 실험의 결과는 도 6(B) (즉 [리툭시맙 061]) 에서 보여진다. 이 도면은 다시 50 mM MgCl2 이 CSE 회수에 재현가능한 최적 값이라는 것을 입증한다; 10, 75 및 150 mM 은 약간 열등한 결과를 보여준다. MgCl2 의 첨가 후에 인큐베이션 시간을 수행했을 때, 미희석 리툭시맙 샘플은 CSE 회수를 전혀 초래하지 않았다, 도 6(B) (즉 [리툭시맙 061]) 참고. 그러나, 1:10 희석물은 대략 50-60% 회수를 초래했다 (특히 10, 50, 75 또는 100 mM MgCl2 를 첨가했을 때). 물 대조군 값 뿐만 아니라 LER 양성 대조군은 만족스러웠다. 이 실험에서 투석을 수행하지 않았다. 그러나, 여러 실험들은 LER 효과를 재현가능하게 극복하는데 투석이 필수적이라는 것을 보여줬다.
참조예 4: MgCl
2
의 첨가 후에 2 및
4 시간
인큐베이션
시간의 비교
"양성 LER 효과" 를 달성하기 위해서 리툭시맙 샘플을 60 분 동안 셰이킹했다. MgCl2 의 첨가 후에 미희석 샘플을 2 또는 4 h 동안 인큐베이션하고, 그 후 1:10 희석하고, LAL 검정법에서 측정했다. LAL 검정법에서 시험된 상이한 샘플이 도 7(A) 및 7(B) (즉 [리툭시맙 062] 및 [리툭시맙 063], 각각) 에서 보여진다.
샘플을 Macherey-Nagel 에 의한 1.5 ㎖ 스크루 넥 바이알에서 제조했다.
단계 1 : 샘플의 제조
ㆍ 10 mM MgCl 2 를 위한 리툭시맙/물의 제조: 897 ㎕ 리툭시맙/ 물 + 99.8 ㎕ 의 상이한 CSE 스톡 용액 → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐.
ㆍ 50mM MgCl 2 를 위한 리툭시맙/물의 제조: 889 ㎕ 리툭시맙/물 + 98.8 ㎕ 의 상이한 CSE 스톡 용액 → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐.
ㆍ 75 mM MgCl 2 를 위한 리툭시맙/물의 제조: 883 ㎕ 리툭시맙/물 + 98.1 ㎕ 의 상이한 CSE 스톡 용액 → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐.
단계 2 : 두 개의 LER 양성 대조군의 제조
ㆍ 리툭시맙 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐.
ㆍ LER 양성 대조군 중 하나를 내독소-비함유 물로 1:10 의 비로 희석.
단계 3 : 셰이킹
ㆍ 모든 샘플 뿐만 아니라 LER 양성 대조군을 1h 동안 셰이킹한다: [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 4 : MgCl2 의 첨가
ㆍ 4 M MgCl2 스톡 용액을 사용했다.
˚ 10 mM MgCl2 를 위해 2.5 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다
˚ 50 mM MgCl2 를 위해 12.5 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다
˚ 75 mM MgCl2 를 위해 19 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 5 : 인큐베이션 시간
ㆍ (미희석) 샘플 (뿐만 아니라 LER 양성 대조군) 을 나눈다. 각각의 샘플의 절반 (약 500 ㎕) 을 2 h 동안 인큐베이션하고, 나머지 절반을 4 h 동안 각각 인큐베이션했다.
단계 6 : 희석
ㆍ 2 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
ㆍ 1:10 의 비로의 희석물을 제조했다: 900 ㎕ LAL 물 + 100 ㎕ 샘플 (즉 리툭시맙 샘플 또는 물 샘플).
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 7 : LAL 검정법
ㆍ 100 ㎕ 의 각각의 샘플을 이중 측정에서 플레이트 위로 적용했다
ㆍ 리더에서 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션.
ㆍ 100 ㎕ 색소원을 각각의 샘플에 적용했다.
ㆍ 리더에서 측정을 시작
결과 및 논의
:
결과가 도 7(A) 및 7(B) (즉 [리툭시맙 062] 및 [리툭시맙 063], 각각) 에서 보여진다. 여기에서 0.5 및 5.0 EU/㎖ 내독소의 회수율을 측정했다. 10-75 mM MgCl2 를 샘플에 첨가했을 때, 2 h 동안 인큐베이션한 샘플 (도 7(A), 즉 [리툭시맙 062]) 에서 및 4 h 동안 인큐베이션한 샘플 (도 7(B), 즉 [리툭시맙 063]) 에서 회수율은 동일했다. 두 실험에서 회수율은 매우 유사하다. 게다가, 5.0 EU/㎖ 내독소로 스파이킹한 샘플에서 투석 없이도 만족스러운 회수율 (80-90%) 이 얻어졌다. 0.5 EU/㎖ 내독소로 스파이킹한 샘플에서 회수율은 대략 35-45% 였다. 중요하게도, 희석 (1:10 의 비로) 없이, 완전한 LER, 즉 0% 회수가 관찰되며, 또한 10-75 mM MgCl2 의 존재시에도 그러하다. 물 대조군 뿐만 아니라 LER 양성 대조군은 만족스러웠다. 이들 실험에서 투석을 수행하지 않았다. 그러나, 추가의 실험은 투석 없이, LER 효과는 때때로 극복되고 때때로 극복되지 않는다는 것을 입증했다. 따라서, 샘플 투석은 LER 효과를 극복하기 위한 더욱 견고한 방법을 초래한다.
참조예 5: 상이한 양의 MgCl
2
의 첨가 후에
2 시간
인큐베이션
시간과 상이한 양의 MgCl
2
의 첨가 후에 인큐베이션 시간 없음의 비교
"양성 LER 효과" 를 달성하기 위해서 리툭시맙 샘플을 60 분 동안 셰이킹했다. MgCl2 의 첨가 후에 미희석 샘플을 인큐베이션하지 않거나 또는 2 h 동안 인큐베이션했다. 그 후 1:10 의 비로 희석하고, LAL 검정법에서 측정했다. LAL 검정법에서 시험된 상이한 샘플이 도 8(A) 및 8(B) (즉 [리툭시맙 064] 및 [리툭시맙 065], 각각) 에서 보여진다.
참조예 5.1: MgCl
2
의 첨가 후에 인큐베이션 시간 없음
이 실험에서, 샘플에 MgCl2 의 첨가 후에 인큐베이션을 수행하지 않았다.
샘플을 Macherey-Nagel 에 의한 1.5 ㎖ 스크루 넥 바이알에서 제조했다.
단계 1 : 샘플의 제조
ㆍ 10 mM MgCl 2 를 위한 리툭시맙/물의 제조: 897 ㎕ 리툭시맙/ 물 + 99.8 ㎕ 의 상이한 CSE 스톡 용액 → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐
ㆍ 25 mM MgCl 2 를 위한 리툭시맙/물의 제조: 895 ㎕ 리툭시맙/물 + 99.4 ㎕ 의 상이한 CSE 스톡 용액 → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐.
ㆍ 50 mM MgCl 2 를 위한 리툭시맙/물의 제조: 889 ㎕ 리툭시맙/물 + 98.8 ㎕ 의 상이한 CSE 스톡 용액 → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐.
단계 2 : 두 개의 LER 양성 대조군의 제조
ㆍ 리툭시맙 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐.
ㆍ LER 양성 대조군 중 하나를 내독소-비함유 물로 1:10 의 비로 희석
단계 3 : 셰이킹
ㆍ 모든 샘플 뿐만 아니라 LER 양성 대조군을 60 분 동안 셰이킹했다 (즉 볼텍싱했다) [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 4 : MgCl2 의 첨가
ㆍ 4 M MgCl2 스톡 용액을 사용했다.
˚ 10 mM MgCl2 를 위해 2.5 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다
˚ 25 mM MgCl2 를 위해 6.25 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다
˚ 50 mM MgCl2 를 위해 12.5 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 5 : 희석
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
ㆍ 1:10 의 비로의 희석물을 제조했다.
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 6 : LAL 검정법
ㆍ 100 ㎕ 의 각각의 샘플을 이중 측정에서 플레이트 위로 적용했다
ㆍ 리더에서 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션.
ㆍ 100 ㎕ 색소원을 각각의 샘플에 적용했다.
ㆍ 리더에서 측정을 시작.
결과 및 논의
:
결과가 도 8(A) (즉 [리툭시맙 064]) 에서 보여진다. 결과의 논의에 대해 참조예 4.2 를 참고.
참조예 5.2: MgCl
2
의 첨가 후에 2 h 인큐베이션
이 실험에서, MgCl2 의 첨가 후에 샘플을 2 h 동안 인큐베이션했다. 단계 1 내지 4 를 위에 참조예 4.1 하에 기재된 바와 같이 수행했다. 그러나, MgCl2 의 첨가 후에 미희석 샘플을 2 h 동안 실온 (21 ℃) 에서 인큐베이션했다. 인큐베이션 후에, 하기 단계 5 및 6 을 수행했다. LAL 검정법에서 시험된 상이한 샘플이 도 8(B) (즉 [리툭시맙 065]) 에서 보여진다.
단계 5 : 희석
ㆍ 2 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
ㆍ 1:10 의 비로의 희석물을 제조했다: 900 ㎕ LAL 물 + 100 ㎕ 샘플 (즉 리툭시맙 샘플 또는 물 샘플)
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 6 : 두 개의 LER 양성 대조군의 제조
ㆍ 리툭시맙 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐.
ㆍ LER 양성 대조군 중 하나를 내독소-비함유 물로 1:10 의 비로 희석
단계 7 : 셰이킹
ㆍ 모든 샘플 뿐만 아니라 LER 양성 대조군을 1 h 동안 셰이킹했다 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 8 : LAL 검정법
ㆍ 100 ㎕ 의 각각의 샘플을 이중 측정에서 플레이트 위로 적용했다
ㆍ 리더에서 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션.
ㆍ 100 ㎕ 색소원을 각각의 샘플에 적용했다.
ㆍ 리더에서 측정을 시작.
결과 및 논의
:
참조예 4.1 의 결과가 도 8(A) (즉 [리툭시맙 064]) 에서 보여진다; 참조예 4.2 의 결과가 도 8(B) (즉 [리툭시맙 065]) 에서 보여진다. 이들 두 실험에서, 희석 및 LAL 측정을 MgCl2 의 첨가 직후에 (도 8(A), [리툭시맙 064]) 또는 MgCl2 의 첨가 후에 샘플을 2 h 동안 놔둔 후에 (도 8(B), [리툭시맙 065]) 수행했다. 모든 회수 값은 매우 유사했고, 5.0 EU/㎖ CSE 로 스파이킹한 샘플에서, 투석 없이도 만족스러운 (60-80%) 회수율이 얻어졌다. 흥미롭게도, 2 h 의 인큐베이션 시간 후에, 25 mM MgCl2 농도는 100% 회수를 초래했다. 따라서, MgCl2 의 첨가 후에 인큐베이션 시간은 LER 효과를 감소시키는 귀중한 조치인 것으로 보인다. 그러나, 0.5 EU/㎖ CSE 로 스파이킹한 샘플에 관한 회수 값은 대략 20-35% 로 낮았다. 이는 Mg2 + 의 첨가 및 희석 외에도, 투석이 LER 효과를 신뢰할 수 있게 극복하는데 필수적인 단계에 해당한다는 것을 시사한다. 이들 실험에서 물 대조군 값은 만족스러웠다. 미희석 LER 양성 대조군도 또한 만족스러웠으며, 즉 0% 였다.
참조예 6: 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보 샘플에서 상이한
희석
의 비교
스파이킹 후에, "양성 LER 효과" 를 달성하기 위해서 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보 샘플을 60 분 동안 셰이킹했다. MgCl2 의 첨가 후에 미희석 샘플을 1 h 동안 셰이킹하고, 1:2, 1:5, 1:10 또는 1:20 의 비로 희석했다. 이후 LAL 검정법을 수행했다. LAL 검정법에서 시험된 상이한 샘플이 도 9 (즉 [리툭시맙 072]) 에서 보여진다.
특히, 하기 실험을 수행했다:
단계 1 : 샘플의 제조
ㆍ 25 mM MgCl 2 를 위한 리툭시맙/리툭시맙 플라시보/물의 제조: 895 ㎕ 리툭시맙/리툭시맙 플라시보/물 + 99.4 ㎕ 의 상이한 CSE 스톡 용액 → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐.
단계 2 : 세 개의 LER 양성 대조군의 제조
ㆍ 리툭시맙 플라시보 450 ㎕ + 50 ㎕ CSE → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐 (첫째 LER 양성 대조군).
ㆍ 리툭시맙 450 ㎕ + 50 ㎕ CSE → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐 (둘째 LER 양성 대조군).
ㆍ 리툭시맙 450 ㎕ + 50 ㎕ CSE → 0.5 및 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐. 이후, 이러한 샘플을 1:10 의 비로 희석했다 (셋째 LER 양성 대조군).
단계 3 : 셰이킹
ㆍ 모든 샘플 뿐만 아니라 LER 양성 대조군을 60 분 동안 셰이킹했다 (즉 볼텍싱했다) [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 4 : MgCl2 의 첨가
ㆍ 4 M MgCl2 스톡 용액을 사용했다.
˚ 25 mM MgCl2 를 위해 6.25 ㎕ 의 4M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가한다
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 5 : 희석
ㆍ 샘플을 다음과 같이 희석했다:
˚ 1:5 의 비로 희석: 400 ㎕ 물 + 100 ㎕ 샘플
˚ 1:10 의 비로 희석: 450 ㎕ 물 + 50 ㎕ 샘플
˚ 1:20 의 비로 희석: 475 ㎕ 물 + 25 ㎕ 샘플
ㆍ 세 개의 LER 양성 대조군 중 하나를 1:10 의 비로 희석했다.
ㆍ MgCl2 없는 물은 희석하지 않았다.
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 6 : LAL 검정법
ㆍ 100 ㎕ 의 각각의 샘플을 이중 측정에서 플레이트 위로 적용했다
ㆍ 리더에서 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션.
ㆍ 100 ㎕ 색소원을 각각의 샘플에 적용했다.
ㆍ 리더에서 측정을 시작.
결과 및 논의
:
결과가 도 9 (즉 [리툭시맙 072]) 에서 보여진다. 중요하게도, 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보에 관한 결과는 유의한 차이를 보이지 않는다. 이는 리툭시맙에서의 LER 효과가 주로 완충제 시스템 (즉 시트레이트 완충제와 폴리소르베이트 80) 에 기초한다는 것 및 항체 (즉 리툭시맙) 가 LER 효과에 대해 유의한 영향을 갖지 않는다는 것을 시사한다. 그러나, 이 실험에서 회수율은 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보 둘다에서 만족스럽지 않다. 위에 기재된 실험에서, 물 대조군 값은 만족스러웠다. 미희석 LER 양성 대조군도, 역시, 회수율 0% 로 만족스러웠다.
참조예 7: 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보 샘플에서 회수율에 대한 MgCl
2
의 첨가 전 인큐베이션 시간의 영향
하기 실험에서 MgCl2 의 첨가 전의 인큐베이션 시간이 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보 샘플의 회수율에 대한 영향을 갖는지 여부를 시험했다. 특히, "양성 LER 효과" 를 달성하기 위해서 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보 샘플을 60 분 동안 셰이킹했다. 그 후 샘플을 4 ℃ 에서 0 h 내지 3 일 동안 인큐베이션했다. 이후, MgCl2 를 50 mM 의 농도로 첨가하고, 샘플을 희석했다. 그 후, BSA-차단되지 않은 투석 멤브레인으로 투석을 수행했다. LAL 검정법에서 시험된 상이한 샘플이 도 10 (즉 [리툭시맙 079], 및 [리툭시맙 082]) 에서 보여진다.
샘플을 Macherey-Nagel 에 의한 1.5 ㎖ 스크루 넥 바이알에서 제조했다.
단계 1 : 샘플의 제조
ㆍ 50 mM MgCl 2 를 위한 리툭시맙 / 리툭시맙 플라시보 /물의 제조: 5,346 ㎕ 리툭시맙/리툭시맙 플라시보/물 + 596 ㎕ 의 상이한 CSE 스톡 용액 → 0.5 또는 5.0 EU/㎖ 이 얻어짐.
ㆍ 60 분 동안 볼텍싱 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
ㆍ 추가 절차를 위해 1 ㎖ 의 각각의 샘플을 새로운 바이알 내로 옮겼다
단계 2 : 인큐베이션 시간
ㆍ 샘플을 냉장고 내에 4℃ 에서 0 h, 4 h, 1 일, 3 일, 또는 7 일 동안 놔두었다.
ㆍ 1 일, 3 일 또는 7 일의 인큐베이션 시간 후에 샘플을 2 분 동안 셰이킹했다 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]. 0 h 및 4 h 인큐베이션 시간 후에 샘플을 셰이킹하지 않았다.
단계 3 : MgCl2 의 첨가
ㆍ 5 M MgCl2 스톡 용액 (즉 0.891 ㎖ 물 중 0.9055 g MgCl2) 을 사용했다
˚ 50 mM MgCl2 를 위해 10 ㎕ 의 5 M 용액을 스파이킹된 샘플에 첨가했다
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 4 : 희석
ㆍ 1:10 의 비로의 희석물을 제조했다: 900 ㎕ LAL 물 + 100 ㎕ 샘플 (즉 리툭시맙 샘플, 리툭시맙 플라시보 샘플 또는 물 샘플)
ㆍ MgCl2 없는 물은 희석하지 않았다.
ㆍ 1 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 5 : 투석
ㆍ 샘플을 1 ㎖ 투석기 내로 첨가했다. 투석을 1 ℓ Aqua Braun 에 대해 24 ℃ 에서 4h 동안 수행하고, 2 h 후에 물을 교환했다. 새로운 물은 또한 24 ℃ 의 온도를 가졌다. 사전에 BSA 와 함께 인큐베이션하지 않은 500 Da 멤브레인을 사용했다.
ㆍ 투석기를 세 개의 2 ℓ 비이커에 배치했고, 각각의 비이커에 긴 교반기 (즉 교반 막대) 가 있었으므로 회전시켰다.
ㆍ 투석 후에 샘플을 새로운 1.5 ㎖ 바이알 내로 옮겼다.
단계 6 : 셰이킹
ㆍ 20 분 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm) 실온에서]
단계 7 : LER 양성 대조군의 제조
ㆍ LER 대조군을 4 h 투석이 끝나기 전 1 h 에 제조하여, 그것은 다른 샘플과 동시에 시험을 위한 준비가 되어 있다.
ㆍ 리툭시맙 또는 리툭시맙 플라시보 900 ㎕ + 100 ㎕ CSE → 5.0 EU/mL CSE 이 얻어짐
ㆍ 실온에서 1h 동안 셰이킹 [Heidolph Multi Reax 셰이커, 고속 (2,037 rpm)]
단계 8 : LAL 검정법
ㆍ 100 ㎕ 의 각각의 샘플을 이중 측정에서 플레이트 위로 적용했다
ㆍ 리더에서 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션.
ㆍ 100 ㎕ 색소원을 각각의 샘플에 적용했다.
ㆍ 리더에서 측정을 시작.
결과 및 논의
:
결과가 도 10(A) (즉 [리툭시맙 079], 인큐베이션하지 않음), 도 10(B) (즉 [리툭시맙 080], 4 h 인큐베이션), 도 10(C) (즉 [리툭시맙 081], 1 일 인큐베이션), 및 도 10(D) (즉 [리툭시맙 082], 3 일 인큐베이션) 에서 보여진다. 7 일 인큐베이션에 관한 결과는 보여지지 않는다. 결과는 다시 본원에서 기재되는 프로토콜을 사용함으로써 리툭시맙에서 뿐만 아니라 리툭시맙 플라시보 샘플에서 양호한 회수율이 얻어질 수 있다는 것을 입증한다. 게다가, 이 실험은 MgCl2 의 첨가 전의 인큐베이션 시간이 회수율을 개선하지 않는다는 것을 입증한다. 특히, 0-4 h 의 인큐베이션 시간은 요망되는 범위 (50-200%) 내의 회수율을 초래했지만, 1 일 및 3 일의 인큐베이션 시간은 더 낮은 회수율 (대략 20-30%) 을 초래했다. 인큐베이션을 수행하지 않은 경우에 (즉 0 h), 리툭시맙에서 매우 양호한 회수율이 얻어졌다 (70-80%). 또한 5.0 EU/㎖ CSE 로 스파이킹된 리툭시맙 플라시보에서, 회수율은 만족스러웠다. 블랭크가 매우 높았으므로, 0.5 EU/㎖ CSE 로 스파이킹된 리툭시맙 플라시보에 관한 회수율은 음성이었다. 이는 이러한 블랭크 샘플이 내독소로 오염되었다는 것을 시사할 수 있다. 이 실험에서 또한 물 대조군 (80-120%) 뿐만 아니라 LER 양성 대조군 (~ 0%) 회수율은 만족스러웠다.
참조예 8: 선행 기술 ("
LAL
검정법") 의 프로토콜 및 그의 수정은 리툭시맙 또는 리툭시맙 플라시보에서 LER 효과를 극복할 수 없다
이 실시예에서 흔히 알려진 LAL 검정법이 리툭시맙 및 리툭시맙 플라시보 제제에서 내독소를 검출할 수 있는지 여부를 확인했다. 그러므로, 하기 물질들을 사용했다:
[리툭시맙 002]: Lonza CSE + Lonza 시약 (즉 Lonza 키트)
[리툭시맙 004]: ACC CSE 또는 Lonza CSE, 각각 + ACC 시약 (즉 ACC 키트)
[리툭시맙 005]: Lonza CSE + ACC 시약 (즉 ACC 키트)
LAL 검정법을 제조사에 의해 기재된 바와 같이 정확히 수행했다.
도 11(A)-(C) (즉, 각각, [ 리툭시맙 002], [리툭시맙 004] 및 [리툭시맙 005]) 로부터 볼 수 있는 바와 같이, 여러 상이한 희석율을 시험하는 경우에도, 표준 LAL 검정법은 만족스러운 회수율을 초래하지 않았다. 특히, 하나의 실험 (즉 [리툭시맙 002]) 에서, 리툭시맙을 96-웰 플레이트 (즉 미세역가 플레이트) 내로 피펫팅하고, Lonza CSE 로 0.5 EU/㎖ 또는 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로 스파이킹했다. 후속적으로, 도 11(A) (즉 [리툭시맙 002]) 에서 보여지는 바와 같은 물에 의한 희석을 96-웰 플레이트에서 수행했다. 그 후 LAL 검정법을 수행했다. 그러나, 도 11(A) (즉 [리툭시맙 002]) 에서 볼 수 있는 바와 같이, 50% 회수율에 도달되지 않았다.
유사한 실험 (즉 [리툭시맙 004]) 에서 리툭시맙을 미세역가 플레이트의 웰 내로 피펫팅하고, Lonza CSE 및 ACC CSE 로 0.5 EU/㎖ 또는 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로 스파이킹했다. 후속적으로, 도 11(B) (즉 [리툭시맙 004]) 에서 보여지는 바와 같은 물에 의한 희석을 96-웰 플레이트에서 수행했다. 이후, 측정을 수행했다. 그러나, 도 11(B) 에서 볼 수 있는 바와 같이, ACC CSE 로 200% 초과의 회수율이 얻어졌고, 또한 Lonza CSE 스파이킹은 만족스러운 회수율을 초래하지 않았다.
추가의 실험에서, LAL 검정법에 대한 pH 조정의 효과를 분석했다. 특히, 하나의 실험 [리툭시맙 005] 에서 리툭시맙을 미세역가 플레이트 내로 피펫팅하고, Lonza CSE 스파이킹을 플레이트에서 수행했다. 후속적으로, 도 11(C) [리툭시맙 005] 에서 명시된 바와 같은 물에 의한 희석 또는 pH 조정을 수행했다. 그러나, 희석도 pH 조정도 50% 의 회수율을 초래하지 않았다 (참고, 도 11(C) [리툭시맙 005]).
또한 투석 단독은 만족스러운 회수율을 초래하지 않는다. 더욱 구체적으로, 추가의 실험에서, 리툭시맙을 CSE 로 스파이킹하여 0.5 및 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도를 초래했다 (즉 900 ㎕ 리툭시맙 용액을 100 ㎕ CSE 와 혼합했다). 후속적으로, 샘플을 1 ㎖ 회전 투석기에서 (1 ㎖ 테플론 체임버에서) 4 시간 동안 4℃ 에서 투석하고, 2h 후에 물을 한 번 교환했다. 투석 멤브레인은 100 Da 의 MWCO 를 가졌다. 그 후, 도 12 (즉 [리툭시맙 011]) 에서 보여지는 바와 같은 희석을 플레이트에서 수행했다. 후속적으로, LAL 검정법을 사용함으로써 내독소 회수를 측정했다. 그러나, 양호한 회수율은 오직 물 대조군에서만 얻어질 수 있었다. 리툭시맙의 경우에 최대 회수율은 <5 % 였다 (참고, 도 12, [리툭시맙 011]). 따라서, 오직 투석 및 희석만은 LER 효과를 극복하지 않는다.
참조예 9: 유지 시간 연구
LER 효과를 식별 및 모니터링하기 위해서, 내독소 유지 시간 연구에서 내독소 함량을 시간의 흐름에 따라 모니터링했다. 그러므로, 다양한 완충제의 미희석 샘플을 내독소로 스파이킹하고, 시간의 흐름에 따라 (~ 28 일) 저장했다. 적당한 샘플 혼합물로 스파이킹 후에 PPC 에서 회수된 수용가능한 내독소 값은 이론적 스파이크 값 (100%) 의 50 - 200% 범위에 있는 것으로 정의된다. LER 효과는 시간의 흐름에 따른 내독소의 유의한 손실에 의해 나타난다. 특히, 이론적 스파이크 값의 50% 미만인 내독소 값의 불리한 경향은 LER 효과의 지표이다.
여러 제형 완충제 성분을 내독소 유지 시간 연구에서 연구했다 (결과에 관해 하기 표를 참고).
표 1: 유지 시간 연구
위에 표로부터 볼 수 있는 바와 같이, 폴리소르베이트 20 및 Na2HPO4; 폴리소르베이트 20 및 NaH2PO4; 폴리소르베이트 20, Na2HPO4 + 및 NaH2PO4; Na 시트레이트, 폴리소르베이트 80 및 NaCl; Na 시트레이트 및 폴리소르베이트 80; 뿐만 아니라 폴리소르베이트 80 및 NaCl 을 포함하는 완충제는 LER 효과를 나타낸다.
참조예 10: LER 효과
에 대한
완충제 및 세제의 영향
여러 실험에서 LER 효과에 대한 시트레이트 및/또는 폴리소르베이트 80 의 효과를 분석했다. 특히, 하나의 실험에서 리툭시맙 및 25 mM 소듐 시트레이트 완충제를 샘플로서 사용했다. 스파이킹 전에, pH 를 pH 7 로 조정했다. 후속적으로, CSE 스파이킹을 플레이트에서 수행하고, 샘플을 물로 희석했다. 도 14(A) (즉 [리툭시맙 006]) 로부터 볼 수 있는 바와 같이, 소듐 시트레이트에서 1:10 의 희석율을 사용함으로써 만족스러운 회수율이 얻어질 수 있었다. 그러나, 리툭시맙의 경우에 50% 의 회수율에 도달될 수 없었다.
또다른 실험에서 25 mM 소듐 시트레이트 완충제, 폴리소르베이트 80 및 그 둘의 조합을 샘플로서 사용했다. 특히, 리툭시맙에 존재하는 농도를 사용했다 (즉 폴리소르베이트 80: 0.7 ㎎/㎖; 소듐 시트레이트: 9 ㎎/㎖). 이들 완충제 시스템을 0.5 및 5.0 EU/㎖ 의 Lonza CSE 로 또는 Cape cod CSE 로 스파이킹했다 (예외적으로 소듐 시트레이트는 오직 Lonza 만으로 스파이킹했으며, 이는 소듐 시트레이트 완충제의 ACC 스파이킹은 위에 기재된 실험에서 이미 수행했고 도 14(A) (즉 [리툭시맙 006]) 에서 보여졌기 때문이다). 스파이킹 후에, 물에 의한 1:2 또는 1:5 희석을 플레이트에서 수행했다. 폴리소르베이트 80 의 경우에, 여러 샘플이 50% 내지 200% 의 만족스러운 회수율을 초래했다. 이와 대조적으로, 소듐 시트레이트 완충제의 경우에, 오직 1:10 희석이 50% 내지 200% 의 회수율을 초래했다. 이는 폴리소르베이트 80 과 비교할 때 시트레이트 완충제가 LER 효과에 대해 더욱 유의한 영향을 갖는다는 것을 시사한다. 더욱이, 이 실험에서 소듐 시트레이트와 폴리소르베이트 80 의 조합을 샘플로서 사용한 경우에 LER 효과는 극복될 수 없었다. 이 실험은 모노클로날 항체 제형에서 LER 효과는 완충제 제형에 의해 (즉 소듐 시트레이트 완충제와 폴리소르베이트 80 의 조합에 의해) 야기된다는 것을 시사한다.
이들 결과는 여러 상이한 희석율을 시험한 또다른 실험에 의해 확인되었다. 특히, 25 mM 소듐 시트레이트 완충제 (pH 6.5), 700 ㎎/L 폴리소르베이트 80 또는 그 둘을 포함하는 샘플 (즉 리툭시맙의 제형) 을 제조했다. 이들 제제 뿐만 아니라 물 대조군을 Lonza CSE 로 0.5 또는 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로 스파이킹했다. 모든 샘플을 1 시간 동안 실온에서 볼텍싱 기계 [셰이커: Heidolph Multi Reax, 고속 (2,037 rpm)] 에서 1.5 투명 유리, 크림프 넥, 넓적 바닥 용기에서 셰이킹했다. 후속적으로, 도 14(B) (즉 [리툭시맙 029]) 명시된 바와 같은 희석을 1.5 ㎖ 바이알에서 내독소-비함유 물로 수행하고, (이전과 같이) 1 분 동안 셰이킹했다. 셰이킹 후에, LAL 검정법을 수행했다. 특히, 100 ㎕ 의 각각의 샘플을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 리더에서 10 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 그 후, 100 ㎕ 색소원을 각각의 샘플에 첨가하고, 측정을 수행했다. 도 14(B) (즉 [리툭시맙 029]) 에서 볼 수 있는 바와 같이 완충제 (즉 소듐 시트레이트 완충제) 의 LER 효과는 세제 (즉 폴리소르베이트 80) 의 LER 효과와 비교할 때 더 강하다. 폴리소르베이트 80 은 상대적으로 일정한 회수율을 보이지만 (~40-90%, 도 14(B), [리툭시맙 029], 오른쪽으로부터 칼럼 2-5 를 참고), 시트레이트-완충제에서 LER 효과는 희석에 의존적이다. 가장 중요하게도, 강한 및 재현가능한 LER 효과는 폴리소르베이트 80 이 시트레이트 완충제와 조합되는 경우에 발현된다 (모노클로날 항체 제형에서와 같이), 도 14(B) (즉 [리툭시맙 029]) 참고. 이들 샘플에서, 또한 높은 희석율에서도, 회수율은 오직 ~5-10% 이다. 따라서, 이 실험은 어떻게 양성 LER 효과가 얻어질 수 있는지를 입증한다. 이 결과는 내독소 측정의 분야에서 선구적이며, 이는 그것이 여러 수단 및 방법을 LER 효과를 극복하는 그들의 능력에 관해 시험하는 것을 허용하기 때문이다.
완충제 및 세제의 효과를 별도로 분석할 때, LER 효과에 대한 완충제의 효과는 NeoRecormon® 및 리툭시맙 둘다에서 더욱 현저했다 (참고, 예를 들어 도 14(B), 즉 [리툭시맙 029]). 이들 데이타는 놀랍게도 완충제의 제거가 세제의 제거보다 더욱 결정적이라는 것을 시사한다. 두 가지 제형 중의 완충제의 농도가 비슷하다는 것을 고려할 때 (리툭시맙: 25 mM 소듐 시트레이트 및 NeoRecormon: 27.8 mM 소듐 포스페이트), 이러한 효과의 이유는 완충제의 구조 및/또는 그것의 물리-화학적 특성에서 찾아야 한다. 소듐 시트레이트는 잘 알려진 킬레이트화 음이온이지만, 포스페이트에서 이러한 효과는 덜 현저하다. 그러므로, Mg2+ 는 킬레이트화 완충제에 의해 착화되어 LAL 시험에서 그것의 농도를 감소시키므로, 이들 관찰은 또한 Mg2 + 의 첨가가 LER 효과를 극복하는데 왜 중요한지를 설명할 수 있다.
참조예 11: 표준 물리적 및 생
화학적
방법은 LER 효과에 의해 차폐된 내독소를 회복하지 않는다
LER 효과를 극복하기 위해서 (참조예 9 에서 LER 효과를 갖는 것으로 확인된 완충제에서), 상이한 물리적 및 생화학적 방법을 시험했다:
-30℃ 에서 내독소 스파이킹된 샘플의 동결. 이 연구는 LER 가 2-8℃ 와 비교할 때 실온에서 더욱 현저하다는 초기 발견에 기초한다. 결과: 내독소 스파이킹된 샘플의 동결은 LER 를 극복하지 않는다.
30 분 동안 70℃ 에서 내독소 스파이킹된 샘플의 가열. 가열이 일부 제품에서 내독소 차폐 효과를 극복하는 것으로 밝혀졌기 때문에 이 연구를 수행했다 (Dawson, 2005, LAL update. 22:1-6). 결과: 내독소 스파이킹된 샘플의 가열 처리는 LER 를 극복하지 않는다.
최대 유효 희석율 (MVD) 로 내독소 스파이킹된 샘플의 희석. 샘플 희석은 LAL 저해를 극복하는 표준 방법이므로 이 연구를 수행했다. 결과: 도 11 (즉 [리툭시맙 002], [리툭시맙 004], [리툭시맙 005]) 로부터 볼 수 있는 바와 같이, 희석 단독은 LER 효과를 극복하지 않는다.
내독소 스파이킹된 샘플을 위해 엔도 트랩 ( Endo Trap) 칼럼의 사용. 이들 칼럼은 친화도 크로마토그래피를 통해 용액으로부터 내독소를 제거하는 역할을 한다. 시험을 수성 내독소 용액으로 수행했다. 결과: 내독소는 칼럼으로부터 회수될 수 없었다.
참조예 12: 투석에 의한 세제의 제거
시장에서 입수가능한 여러 투석 체임버 및 멤브레인 (상이한 크기의 분자량 컷-오프, MWCO 를 포함함) 을 아래 상세히 설명된 바와 같이 시험했다.
투석 체임버에 적합한 멤브레인은 상업적으로 입수가능하고, 예를 들어, 셀룰로오스 아세테이트 (MWCO 100 내지 300,000 Da), 재생 셀룰로오스 (MWCO 1,000 내지 50,000 Da), 또는 셀룰로오스 에스테르 (MWCO 100 내지 500 Da) 이다. 본원에서 셀룰로오스 아세테이트 및 셀룰로오스 에스테르가 바람직하고, 셀룰로오스 아세테이트가 가장 바람직하다.
시험 샘플 (즉 리툭시맙) 을 투석 전에 희석했으며, 이러한 방식은 CMC 에 접근하고 투석 멤브레인을 통해 확산할 것으로 예상된 세제의 단량체의 증가하는 수준을 초래한다. 스파이킹된 CSE 의 회수율에 대한 조사는 리툭시맙의 경우에 셀룰로오스 아세테이트와 비교할 때 재생 셀룰로오스가 그렇게 효율적이지 않다는 것을 밝혔다. 리툭시맙을 사용하는 일련의 실험에서 MWCO 는 바람직하게는 ~10 kDa 이라는 것이 확인되었다. 이 크기가 바람직한 이유는, 이 크기는 i) 투석 과정의 속도를 높이고 ii) 또한 셀룰로오스 아세테이트 (글루코스 중합체 상의 아세틸 에스테르) 의 소수성 특질이 그러한 종류의 수송 과정을 저해하지 않을 경우에, 세제의 더 높은 올리고머성 응집물 (그러나 미셀은 아님) 이 멤브레인을 통과하는 것을 허용하는 것으로 생각되기 때문이다.
NeoRecormon® 에서의 상황을 모방하는 투석에 관한 최적을 확인하는 실험을 수행했다. 이미 개요서술한 바와 같이, 완충제 및 세제는 LER 효과에 대부분 영향을 미친 샘플 제형 중의 화합물이었다. NeoRecormon® 의 제형을 모방하기 위해서 0.1 ㎎/㎖ 폴리소르베이트 20 의 존재 하에 총 부피 0.5 ㎖ (2.7 ㎎) 로 정의된 양의 포스페이트 완충제를 제조하고, 투석 (회전 투석기에서) 에 적용했다. 도 1 에서 12-16 kDa 의 MWCO 를 갖는 셀룰로오스 아세테이트의 투석 멤브레인을 사용하는 그러한 실험의 매우 단순한 실시예가 보여진다. 여기에서 주어진 시간 후에 내부 투석물에 남아 있는 물질이 보여지며, 이러한 방식은 투석 효율을 입증한다. 특히, 72 h (3d) 의 기간에 걸쳐 내부 투석 체임버에 남아 있는 물질의 중량을 분석했다. 이 결과는 그것이 NeoRecormon® 의 완전한 및 효과적인 투석이 오직 실온에서 더 긴 투석 기간 (> 24 - 48h) 후에만 얻어진다는 것을 보여주므로 상당히 놀랍다. 이 실험에 기초하여 바람직한 투석 시간은 20 h 내지 하룻밤 (예를 들어 24 h) 이다. 게다가, 이 결과는 Harvard 빠른 투석기가 Harvard 회전 투석기보다 바람직하다는 것을 시사하며, 전자가 투석 멤브레인의 면적이 두 배이고, 따라서 더 빠른 투석을 초래한다.
도 2 에서, 포스페이트가 투석의 내부 투석물 구획 내로 배치되는 경우의 투석 효율이 보여진다. 이 실험에서, 샘플에 스파이킹된 CSE 의 비특이적 흡광을 회피하기 위해서, 투석 멤브레인 (MWCO 12-16 kDa) 을 그것의 사용 전에 0.2% BSA 로 세척했다 (30 분). 그러나, 본원에서 제공되는 본 발명의 방법에서 샘플의 희석 (예를 들어 1:10 의 비로 희석) 은 세제의 농도를 감소시킨다.
참조예 13: LER 효과에 대한
MgCl
2
의 영향
샘플에 대한 MgCl2 의 첨가에 의해 LER 효과가 감소될 수 있었다는 것이 발견되었다 (참고, 예를 들어, 도 15 (즉 [리툭시맙 031])). 특히, Mg2 + 의 농도가 소듐 시트레이트의 농도의 2 배였을 때 (즉 50 mM Mg2 +) 최상의 결과가 관찰되었다.
특히, 25 mM 소듐 시트레이트 완충제, pH 6.5 (즉 소듐 시트레이트 완충제, pH 6.5), 0.7 ㎎/㎖ 폴리소르베이트 80, 또는 그 둘을 포함하는 샘플 (pH 6.5, 즉 리툭시맙의 제형) 을 제조했다. 이들 제제 뿐만 아니라 물 대조군을 Lonza CSE 로 0.5 또는 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로 스파이킹했다. 모든 샘플을 1 시간 동안 실온에서 셰이킹했다 [셰이커: Heidolph Multi Reax, 고속 (2,037 rpm), 1.5 투명 유리, 크림프 넥, 넓적 바닥 용기에서]. 그 후, 10 mM, 25mM, 50 mM 또는 75 mM 의 농도에 도달하는 MgCl2 를 샘플에 첨가했다. 후속적으로, 도 15(A), 18(B), 18(C), 및 18(D) (즉 [리툭시맙 030 - 리툭시맙 033]) 명시된 바와 같은 희석을 1.5 ㎖ 바이알에서 내독소-비함유 물로 수행하고, 1 분 동안 셰이킹했다 (즉 이전과 같이 볼텍싱했다). 셰이킹 후에, LAL 검정법을 수행했다. 특히, 100 ㎕ 의 각각의 샘플을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 리더에서 10 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 이후, 100 ㎕ 색소원을 각각의 샘플에 첨가하고, 측정을 수행했다. 도 15(A) (즉 [리툭시맙 030]) 에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 희석된 샘플에서, MgCl2 (10 mM) 는 시트레이트의 착화 효과를 중화시킬 수 있다. 마그네슘 이온은 폴리소르베이트 80 뿐만 아니라 시트레이트 완충제를 포함하는 샘플에서 LER 효과를 감소시킨다. 이러한 경우에, 5.0 EU/㎖ 에서 대략 50% 의 회수율 및 0.5 EU/㎖ 에서 대략 25% 의 회수율이 달성되었다. 물의 대조군 값은 이론적으로 예상되는 값 근처의 범위이다 (즉 70-130%). 더욱이, 도 15(A), 15(B), 15(C), 및 15(D) (즉 [리툭시맙 030], [리툭시맙 031], [리툭시맙 032] 및 [리툭시맙 033]) 의 비교는 시트레이트 완충제의 농도의 2 배인 MgCl2 농도 (즉 50 mM MgCl2) 가 최상의 회수율을 초래한다는 것을 보여준다. 25 mM 및 75 mM MgCl2 은 MgCl2 의 최적 농도가 아니지만, 이들 농도는 그럼에도 불구하고 시트레이트 완충제의 LER 를 극복한다 (회수: 75-190%). 리툭시맙을 샘플로서 사용한 유사한 실험에서, 오직 10 mM, 50 mM, 또는 75 mM MgCl2 의 농도로 MgCl2 의 첨가 및 후속적인 1:10 의 비로의 희석 (투석 없이) 이 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도로 스파이킹된 내독소의 만족스러운 회수를 초래할 수 있었다는 것이 입증되었다 (참고, 도 5, 즉 [리툭시맙 059]).
참조예 14: LER 효과에 대한 기계적 처리의 효과
기계적 처리 (예컨대 셰이킹 및 초음파처리) 가 미셀을 분산시키고 따라서 LER 효과를 감소시키는데 유용한지 여부를 시험했다.
특히, 내독소-비함유 물 (즉 LAL 물) 및 리툭시맙을 Lonza CSE 로 스파이킹하여 0.5 및 5.0 EU/㎖ 의 최종 농도를 달성했다. 그 후, 샘플을 1 시간 동안 초음파처리하거나 또는 1 시간 동안 셰이킹했다 [즉 볼텍싱했다 Heidolph Multi Reax 셰이커에서 고속 (2,037 rpm) 으로 실온에서 1.5 ㎖ 투명 유리, 크림프 넥, 넓적 바닥 용기에서]. 그 후 내독소-비함유 물로 1:10 (샘플:물) 희석물을 제조했다. 후속적으로, 희석된 샘플을 12-16 kD 멤브레인 (이는, 투석 전에, 0.2% BSA 에서 30 분 동안 인큐베이션했다) 을 사용함으로써 투석했다. 투석을 두 개의 2 ℓ 비이커에서 4 시간 동안 수행했다. 외부 투석물은 1 ℓ Aqua Braun 이었고, 2 시간의 투석 후에 물을 교환했다. 투석 후에 일부 샘플에 MgCl2 를 첨가하여 (도 16, 즉 [리툭시맙 034] 에 명시된 바와 같이) 50 mM 의 MgCl2 의 최종 농도를 초래했다. MgCl2 의 첨가 후에, 모든 샘플 (또한 MgCl2 이 없는 샘플) 을 20 분 동안 셰이킹했다 (예를 들어 이전과 같이 볼텍싱했다). 후속적으로, LAL 검정법을 수행했다. 특히, 100 ㎕ 의 각각의 샘플을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 리더에서 10 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 그 후, 100 ㎕ 색소원을 각각의 샘플에 첨가하고 측정을 수행했다. 도 16 (즉 [리툭시맙 034] 에서 볼 수 있는 바와 같이, 회수율은 셰이킹에 의해서도 초음파에 의해서도 개선되지 않는다. 그러므로, 셰이킹 또는 초음파처리에 의한 LER 야기 미셀의 기계적 분산이 비교적 비효율적이라는 결론을 내릴 수 있다. 그러나, MgCl2 (50 mM) 의 첨가는 LER 효과를 감소시켰으며, ~ 5-20% 의 개선된 회수 값을 초래했다. 게다가, 이 실험은 또한 상이한 수행되는 단계의 순서가 LER 효과를 극복하는데 중요하다는 것을 입증한다. 특히, 위에 기재된 (및 도 16, 즉 [리툭시맙 034] 에서 보여지는) 실험에서, 단계의 순서는 (a) 희석, (b) 투석, 및 (c) MgCl2 의 첨가였다. 이러한 순서는 만족스러운 회수율을 초래하지 않았다 (참고, 도 16, 즉 [리툭시맙 034]). 그러나, 도 3 및 4 (즉 [리툭시맙 046], [리툭시맙 115] 및 [리툭시맙 117]) 에서 입증되는 바와 같이, 순서 (a) MgCl2 의 첨가, (b) 희석, 및 (c) 투석은 FDA 의 요건을 충족시키는 회수율 (즉 50%-200%) 을 초래한다.
본 발명은 하기 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 관한 것이다:
SEQ ID NO: 1: 리툭시맙 중쇄, 아미노산 서열
SEQ ID NO: 2: 리툭시맙 경쇄, 아미노산 서열
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
Forschungszentrum Borstel Leibniz-Zentrum fur Medizin und
Biowissenschaften
Hoffmann-La Roche, Inc.
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endotoxins
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<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rituximab heavy chain
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
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<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Rituximab Light Chain
<400> 2
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
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20 25 30
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35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
Claims (17)
- 리뮐루스 변형유주세포 용해물 (LAL) 검정법을 위한 샘플의 제조 방법으로서, 상기 샘플은 항체를 포함하며, 상기 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함하는, 방법:
(a) 마그네슘 이온을, 바람직하게는 MgCl2 의 형태로, 샘플에 첨가하는 단계,
(b) 샘플을 희석하는 단계, 및
(c) 5.7-8.0 의 pH-값을 갖는 샘플을 내독소-비함유 수성 용액에 대해 투석하는 단계. - LER 효과를 나타내는 항체를 포함하는 샘플 중의 박테리아 내독소의 측정 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함하는, 방법:
(a) 마그네슘 이온을, 바람직하게는 MgCl2 의 형태로, 샘플에 첨가하는 단계,
(b) 샘플을 희석하는 단계,
(c) 5.7-8.0 의 pH-값을 갖는 샘플을 내독소-비함유 수성 용액에 대해 투석하는 단계, 및
(d) 샘플 중의 박테리아 내독소를 LAL 검정법을 사용함으로써 측정하는 단계. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체가 치료적 항체인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 폴리소르베이트 80 과 함께 제형화되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 시트레이트 완충제와 함께 제형화되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 약 25 mM 소듐 시트레이트 완충제 및 약 700 ㎎/ℓ 폴리소르베이트 80 과 함께 제형화되고, 약 6.5 의 pH 값을 갖는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항-CD20 항체 리툭시맙인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 에서 마그네슘 이온이 약 25 내지 75 mM 의 최종 농도로 첨가되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 에서 샘플을 10-50 mM Tris/HCl 완충제 pH 6.0-9.0, 바람직하게는 6.0-8.0 으로 희석함으로써 샘플의 pH-값이 조정되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 에서 샘플이 1:10 의 비로 희석되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 에서 투석 동안 샘플이 6.0-8.0 의 pH-값을 갖는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 에서 투석이 실온에서 약 24 시간 수행되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 에서 투석 동안 10 kDa 의 분자량 컷-오프를 갖는 멤브레인이 사용되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 에서 투석 동안 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인이 사용되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 에서 투석 동안 물이 2 회 교환되는, 방법.
- 제 2 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 알려진 양의 내독소를 샘플의 앨리쿼트 내로 스파이킹하고 내독소 스파이킹된 샘플의 앨리쿼트를 60 분 내지 2 시간 동안 셰이킹함으로써 낮은 내독소 회수 (LER) 양성 대조군을 생성하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 항체를 포함하는 샘플을 LAL 효소 캐스케이드에서 인자 C 에 반응성으로 만들기 위한, 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
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