ES2699526T3

ES2699526T3 - Prueba de endotoxinas bacterianas mejorada para la determinación de endotoxinas

Info

Publication number: ES2699526T3
Application number: ES15178683T
Authority: ES
Inventors: Sven Deutschmann; Pierre Lang; Wintzingerode Friedrich Von; Christian Alexander; Ulrich Zaehringer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Forschungszentrum Borstel Leibniz Lungenzentrum FZB
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Forschungszentrum Borstel Leibniz Lungenzentrum FZB
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2019-02-11
Anticipated expiration: 2035-07-28
Also published as: AU2016298598B2; CA2989960C; JP6800226B2; EP3124976A1; DK3124976T3; JP2018529978A; WO2017017135A1; EP3124976B1; JP7164790B2; US20180188249A1; RS58167B1; CN111638346A; SI3124976T1; PT3124976T; AU2016298598A1; MX2018000679A; JP2021051080A; LT3124976T; CN108027374A; KR102630300B1

Abstract

Metodo para la preparacion de una muestra para un ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), en el que la muestra comprende un anticuerpo, y en el que el metodo comprende las siguientes etapas en el siguiente orden: (a) anadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCl2, a la muestra, (b) diluir la muestra, y (c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 contra una disolucion acuosa libre de endotoxina.

Description

DESCRIPCIÓN

Prueba de endotoxinas bacterianas mejorada para la determinación de endotoxinas

Campo de la invención

En el presente documento se reporta un método de preparación de muestra de prueba de endotoxina bacteriana (BET) que supera el efecto de baja recuperación de endotoxina (LER) que se debe al enmascaramiento de la endotoxina.

Antecedentes de la invención

A menudo se generan productos terapéuticos de proteína (tales como anticuerpos monoclonales) usando células eucariotas y procariotas genéticamente transformadas, tales como, por ejemplo, bacterias. Se usan bacterias de crecimiento rápido para producciones bacterianas tales como Escherichia coli. Sin embargo, durante el crecimiento y cultivo de la proteína recombinante se segregan en el medio lipopolisacáridos (LPS) altamente tóxicos. Estos componentes se denotan como endotoxinas bacterianas (endotoxinas cortas). Las bacterias Gram negativas poseen LPS como un componente esencial de su pared celular. Una célula bacteriana Gram negativa contiene aproximadamente 3,5 x 105 moléculas de LPS, que ocupan un área total de aproximadamente 4,9 pm2 (Rietschel, 1994, FASEB J. 8:217-225). En el caso de E. coli, significa que los LPS representan aproximadamente tres cuartos de la superficie total de células bacterianas. Aproximadamente 10.000 UFC (unidades formadoras de colonias) de una especie de bacteria Gram negativa corresponden a una unidad de endotoxina (UE) (Rietschel, 1994, FASEB J.

8:217-225). UE se refiere a endotoxina/LPS; 1 UE = 100 pg de LPS, dependiendo del LPS usado. Sin embargo, aún si no se producen productos por medios recombinantes, la mayoría de los reactivos empleados están contaminados con endotoxina, puesto que su producción raramente se hace bajo condiciones asépticas o aún estériles. Por lo tanto, LPS son contaminantes potenciales ubicuos en el caso de que no puedan mantenerse condiciones estériles y/o asépticas, durante la producción de los productos farmacéuticos. Entre todos los compuestos bacterianos conocidos, la endotoxina es uno de los compuestos naturales más tóxicos para los mamíferos. Se sabe que LPS como se presentan en la pared celular de las bacterias Gram negativas, provocan inmunoactivación profunda que incluye la inducción de fiebre cuando entra a la corriente sanguínea humana. Provoca efectos perjudiciales a condiciones bajas extremas (intervalo de picogramos) cuando entra al sistema cardiovascular y linfático, respectivamente. Desdichadamente, las endotoxinas bacterianas son térmicamente estables y su toxicidad no está vinculada con la presencia de la célula bacteriana para nada. También se conoce en general que todos los productos terapéuticos de proteína, a pesar del método de su producción, debe esperarse o considerarse que estén contaminados con bajas trazas de endotoxinas bacterianas (denominadas “endotoxina que se produce de manera natural”, NOE). Por lo tanto, la contaminación de endotoxinas presenta un reto continuo a la producción de productos farmacéuticos tales como anticuerpos monoclonales terapéuticos. Esto se ha explicado resumidamente de manera clara en la “Guidance for Industry, pyrogen and endotoxin testing", emitida por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en junio de 2012.

Para asegurar que los productos terapéuticos inyectables de proteína (tales como anticuerpos monoclonales) sean seguros para uso humano, ha de realizarse la prueba de endotoxina. La prueba de endotoxina se realiza comúnmente usando los métodos de compendio de la Farmacopea de los Estados Unidos <85>, Farmacopea Europea 2.6.14 o Farmacopea Japonesa 4.01 con técnicas de coágulo en gel, cromogénicas o turbidimétricas de Usado de amebocitos de Limulus (LAL) (también designada como ensayo de LAL o prueba de LAL). El nombre de compendio para el ensayo de LAL es prueba de endotoxina(s) bacteriana(s) (BET). La BET se usa para detectar la presencia de niveles inseguros de endotoxina, en particular de endotoxina bacteriana Gram negativa, en una muestra o sustancia dada.

En Sun, Immunology 99, 2000, 352-360 se midió el contenido de endotoxina en preparaciones de anticuerpo y medios de cultivo usando el ensayo de LAL. En Tsuji, Applied and Environmental Microbiology, 1983, 1342-1350 se escribe el uso de magnesio para aumenta la sensibilidad de la detección de LAL de endotoxina. Se da a conocer una familia de catalizadores para proporcionar capacidad mejorada de disolución de Usado de Limulus para precipitar en presencia de concentraciones de endotoxina extremadamente bajas en el documento US 4.096.091 A. En Sourek, Infection and Immunity, 1978, 648-654 se han analizado los efectos de determinados cationes sobre las endotoxinas bacterianas.

El ensayo de LAL se realiza por rutina con una muestra de prueba diluida junto con un control positivo, que es una muestra con una cantidad conocida de endotoxina de patrón de control con adiciones conocidas (CSE). La CSE es una forma definida de endotoxina comercialmente disponible (suministrada por ejemplo por Lonza, Associates of Cape Cod, Inc. (ACC), o Charles River Laboratories International, Inc.). Según la calificación del método de ensayo de LAL de compendio, se añaden adiciones conocidas de la CSE a una muestra diluida a una concentración de no interferencia (NIC) para lograr una tasa aceptable de recuperación del 50-200%. Este enfoque falla en reconocer que los componentes de la matriz de muestra de las formulaciones farmacéuticas así como las condiciones de almacenamiento tienen impacto potencial en la reactividad de LAL de las endotoxinas presentes en muestras de producto no diluidas. Cuando a las muestras no diluidas de producto se le añaden cantidades conocidas de endotoxinas tales como CSE seguido por el ensayo de LAL, se observó baja recuperación de endotoxina (<50%) para determinados productos biológicos. Esta baja recuperación de endotoxina se observó particularmente si la formulación del producto contuvo compuestos anfifílicos tales como detergentes. Se añaden detergentes al producto con el fin de solubilizar la proteína terapéutica. Este enmascaramiento de la endotoxina da como resultado la detección significativamente reducida de la endotoxina, especialmente en el caso que sea baja la contaminación por LPS.

Este fenómeno se denomina “enmascaramiento de endotoxina” si no se puede aumentar la recuperación de endotoxina por dilución de muestra después de las adiciones conocidas.

Se conocen diferentes pretratamientos de muestra para el ensayo de LAL para superar la inhibición del ensayo y/o potenciamiento. Sin embargo, en la actualidad estos pretratamientos de muestra no conducen a resultados satisfactorios. Por lo tanto, existe aún el riesgo de que se presenten contaminaciones de endotoxina durante la fabricación de productos farmacéuticos que no se pueden detectar por el ensayo de LAL debido al enmascaramiento de endotoxina. En base al conocimiento actual hay dos diferentes tipos de enmascaramiento de endotoxina:

1) Enmascaramiento de endotoxina provocado por proteínas de unión a endotoxina presentes en la muestra (“protein masking”, Petsch, Anal. Biochem. 259, 1998, 42-47). Por ejemplo, la formación de agregados de proteínaendotoxina, por ejemplo, con lipoproteínas humanas Apo A1, lisozima, ribonucleasa A o IgG humana, se sabe bien que reduce la reactividad de LAL de las endotoxinas (Emancipator, 1992, Petsch, Anal. Biochem. 259, 1998, 42-47).

2) Enmascaramiento de endotoxina provocado por determinados ingredientes de formulación o componentes de tampón a menudo presentes en los productos farmacéuticos. Por ejemplo, el enmascaramiento de endotoxina provocado específicamente por una combinación de polisorbato más o bien citrato o bien fosfato se denomina “baja recuperación de endotoxina” o LER (Chen, J. and Williams, K. L., PDA Letter 10, 2013, 14-16, Williams, American Pharmaceutical Review, 28 de octubre de 2013: Endotoxin Test Concerns of Biologics). También puede provocarse enmascaramiento de endotoxina por cualquier otro componente de tampón y detergente no iónico o combinaciones de los mismos.

Debido al efecto de LER, las contaminaciones potenciales de endotoxina que se presentan durante la fabricación permanecen subestimadas o no detectadas cuando se usa un ensayo de LAL convencional. El efecto de LER representa un reto continuo para los productos farmacéuticos (Hughes, BioPharm. Asia marzo/abril de2015, 14-25). Por consiguiente, el problema técnico que fundamenta la presente invención es la provisión de medios y métodos para superar el efecto de LER.

El problema técnico se ha superado por los métodos de la presente invención como se detalla a continuación.

En el presente documento se reporta un ensayo de LAL mejorado para cuantificación de endotoxina. Este ensayo de LAL mejorado es particularmente útil cuando las matrices anfifílicas enmascaran la determinación de endotoxina (baja recuperación de endotoxina; LER).

En particular, en el contexto de la presente divulgación, se encontró de manera sorprendente que por la secuencia de la adición de iones magnesio, por ejemplo, en forma de MgCL, a una muestra; dilución de la muestra; y diálisis de la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0, puede superarse con éxito el efecto de LER. O, en otras palabras, el método de preparación de muestra como se reporta en el presente documento es adecuado para superar el efecto de LER en un ensayo de LAL.

Más específicamente, en el contexto de la presente divulgación, se ha encontrado un método de preparación de muestra para muestras que comprenden un anticuerpo (por ejemplo, una muestra de un anticuerpo monoclonal terapéutico). Este método de preparación de muestra tiene la ventaja que evita de manera sorprendente y de forma inesperada el efecto de LER si se realiza un ensayo de LAL.

La invención se refiere a las realizaciones como se definen en las reivindicaciones.

La presente invención se refiere a un método para la preparación de una muestra para un ensayo de LAL, en el que la muestra comprende un anticuerpo, y en el que el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden: (a) añadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCL, a la muestra,

(b) diluir la muestra, y

(c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0, contra una disolución acuosa libre de endotoxina.

Por tanto, una muestra que comprende un anticuerpo (por ejemplo una muestra de un anticuerpo monoclonal terapéutico) se procesa realizando las etapas (a) a (c) del método inventivo de preparación de muestra según las realizaciones de las reivindicaciones. Estas etapas y su combinación conducen de manera sorprendente a la provisión de una muestra, que no padece del efecto de LER si se realiza un ensayo de LAL. O, en otras palabras, después de realizar las etapas (a) a (c) del método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento, la muestra que comprende un anticuerpo es reactiva al factor C en la cascada enzimática de LAL. Por tanto, el método inventivo de preparación de muestra se realiza de manera ventajosa antes de determinar la endotoxina bacteriana mediante el ensayo de LAL. Por consiguiente, la presente divulgación también se refiere a un método para determinar (es decir para detectar y/o cuantificar) endotoxina en una muestra. En particular, el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento permite la determinación (es decir, la detección y/o cuantificación) de endotoxina en una muestra que comprende un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo monoclonal terapéutico). En particular, la presente invención se refiere a un método para determinar endotoxina bacteriana en una muestra (que muestra preferiblemente un efecto de LER) en el que la muestra comprende un anticuerpo, y en el que el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(a) añadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCL, a la muestra (es decir, a la muestra que comprende un anticuerpo),

(b) diluir la muestra,

(c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 contra una disolución acuosa libre de endotoxina, y (d) determinar la endotoxina bacteriana en la muestra usando un ensayo de LAL.

También está abarcado por la presente invención el uso de los métodos de la invención para hacer la muestra que comprende un anticuerpo reactiva al factor C en la cascada enzimática de LAL.

En el método de preparación de muestra o el método de determinación de endotoxina de la presente divulgación, se usan recipientes de fondo plano, de cuello frisado de vidrio transparente de 1,5-5 mi. Más preferiblemente, los recipientes son recipientes de vidrio de cuello roscado de Marcherey-Nagel GmbH (1,5 mi o 4 mi).

La contaminación de endotoxina representa un alto riesgo en la producción de productos farmacéuticos tales como anticuerpos monoclonales. En la técnica anterior, la prueba de endotoxina, en particular para anticuerpos terapéuticos, se realiza usando un ensayo de LAL convencional. Sin embargo, como se demuestra en los ejemplos adjuntos, el ensayo de LAL falla en detectar/subestima la contaminación de endotoxina en formulaciones de anticuerpo que muestran el efecto de LER. La endotoxina no detectada/subestimada representa un riesgo extremo de seguridad para cualquier muestra farmacéutica, particularmente para productos farmacéuticos que se administran por vía intramuscular o por vía intravenosa. Sin embargo, a pesar de su tremenda importancia práctica, no se conoce nada acerca de los mecanismos fisicoquímicos del efecto de LER. Por lo tanto, la técnica anterior falla en proporcionar métodos para la determinación correcta de endotoxina en productos terapéuticos que muestran el efecto de LER.

En el contexto de la presente divulgación, se ha encontrado una configuración físico-química robusta, que evita el efecto de LER y da como resultado tasas satisfactorias de recuperación de muestras con adiciones conocidas de CSE. En particular, como se demuestra en los ejemplos adjuntos ilustrativos, los métodos como se reporta en el presente documento permiten la recuperación de la CSE con adiciones conocidas a una muestra dada a una concentración definida (0,5 o 5,0 UE/ml). De manera importante, los métodos proporcionados en el presente documento conducen a tasas de recuperación que varían entre el 50% y el 200%, cumpliendo de esta manera con los requisitos de la FDA. Por tanto, la presente divulgación proporciona de manera ventajosa métodos, que son capaces de desenmascarar endotoxinas y de superar el efecto de LER. Más específicamente, en el contexto de la presente invención, se ha encontrado de manera sorprendente que la combinación específica y secuencia de las etapas (a) a (c) (es decir (a) añadir iones magnesio a la muestra que se va a someter a prueba; (b) diluir la muestra que se va a someter a prueba; y (c) dializar la muestra que se va a someter a prueba (en donde la muestra tiene un valor de pH de 5,7-8,0), evita el efecto de LER de la muestra que se va a someter a prueba para endotoxina. O, en otras palabras, la realización de las etapas (a) a (c) desenmascara la endotoxina en la muestra, y de esta manera, hace detectable a la endotoxina con el ensayo de LAL. Los ejemplos adjuntos muestran que los métodos proporcionados en el presente documento superan el efecto de LER, por ejemplo en rituximab formulado. En cambio, el mismo protocolo no pudo revelar resultados satisfactorios para NeoRecormon® (que no comprende un anticuerpo sino epoetina-beta). Esto indica que los métodos proporcionados en el presente documento son particularmente útiles para evitar el efecto de LER en formulaciones de anticuerpo, preferiblemente en formulaciones con un anticuerpo monoclonal, tampón citrato y polisorbato 80.

De esta manera, el método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento y el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento evitan de manera ventajosa el efecto de LER. Por lo tanto, estos métodos mejoran la detección de endotoxina en productos farmacéuticos. Esto conduce a la producción de productos farmacéuticos con menos efectos adversos. En consecuencia, los métodos proporcionados en el presente documento mejorarán el estado de salud del consumidor y pueden salvar las vidas de pacientes críticamente enfermos.

En los métodos proporcionados en el presente documento, el anticuerpo que está comprendido en la muestra puede haberse producido en y/o purificado de células bacterianas o eucariotas. Por ejemplo, el anticuerpo puede haberse producido y purificado de células de ovario de hámster chino (CHO). En un aspecto de la divulgación, la muestra (es decir la muestra que comprende un anticuerpo) es una muestra sólida disuelta. En otro aspecto de la divulgación, la muestra (es decir, la muestra que comprende un anticuerpo) es una muestra líquida. En el método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento y el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento, se contempla que el anticuerpo (es decir el anticuerpo que está comprendido en la muestra) sea un anticuerpo terapéutico. Preferiblemente, el anticuerpo (es decir el anticuerpo que está comprendido en la muestra) es un anticuerpo monoclonal. Sin embargo, en los métodos proporcionados en el presente documento, el anticuerpo (que está comprendido en la muestra) también puede ser un anticuerpo policlonal. En el presente documento, también están comprendidos anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), o fragmentos de anticuerpos por el término “anticuerpo”, siempre que muestren la actividad biológica deseada. El anticuerpo puede ser humano, humanizado, o camélidos.

Los métodos proporcionados en el presente documento vuelven ventajosamente a las muestras propensas a LER de una formulación farmacéutica reactivas al factor C en la cascada enzimática de LAL. El efecto de LER se ha reportado en productos biológicos, que se formulan con compuestos anfifílicos tales como detergentes no iónicos, en particular si se combinan con citrato o fosfato como tampón. Los ejemplos adjuntos demuestran que los métodos proporcionados en el presente documento evitan de manera fiable el efecto de LER en estas formulaciones terapéuticas. Por lo tanto, se contempla en el contexto del método de preparación de muestra y el método de determinación de endotoxina, proporcionados en el presente documento, que dicho anticuerpo terapéutico (es decir el anticuerpo terapéutico que está comprendido en la muestra) se formule con al menos un detergente (preferiblemente un polisorbato).

Sin embargo, se contempla que el anticuerpo terapéutico se formule con un polisorbato que no comprende un motivo estructural para la cavidad del lípido A en la proteína reactiva C de la cascada de LAL. Más específicamente, ácidos grasos de cadena recta tales como ácido láurico pueden imitar los ácidos grasos en la molécula del lípido A de la cascada de LAL, puesto que esta molécula también contiene ácidos grasos con 12 átomos de carbono y sin dobles enlaces (es decir C:D es 12:0). Estos ácidos grasos lineales pueden interferir de manera negativa con la cascada de LAL. Por lo tanto, en los métodos proporcionados en el presente documento, se contempla que el anticuerpo terapéutico no se formule con un detergente que comprende ácidos grasos lineales tales como ácido láurico. Polisorbato 20 comprende ácido láurico. De esta manera, se contempla en los métodos proporcionados en el presente documento que la muestra (en particular la muestra de un anticuerpo terapéutico) no se formule con polisorbato 20. También el tampón fosfato, particularmente tampón fosfato de sodio, puede interferir con la cascada de LAL. Por lo tanto, estos tampones son menos útiles para los métodos de preparación de muestra proporcionados en el presente documento. Por consiguiente, la divulgación se refiere al método de preparación de muestra o método de determinación de endotoxina, proporcionados en el presente documento, en donde el anticuerpo (terapéutico) que está comprendido en la muestra no se diluye con un tampón fosfato. En un aspecto de la presente divulgación, la muestra no comprende más de tampón fosfato 0,1 mM y no comprende una concentración de polisorbato 20 que sea mayor de 1/100 de su concentración micelar crítica (CMC). En un aspecto preferido de la presente divulgación, la muestra no comprende o bien tampón fosfato ni polisorbato 20, o bien comprende una cantidad de tampón fosfato y/o polisorbato 20 que está por abajo del límite de detección cuando se usan métodos convencionales de detección.

Como se demuestra en los ejemplos adjuntos usando los métodos de la divulgación, el efecto de LER puede superarse en muestras formuladas de rituximab así como en muestras de placebo de rituximab. Las muestras de placebo de rituximab sólo difieren de las muestras de rituximab en que el anticuerpo está ausente. Además de esta diferencia, las muestras de placebo de rituximab contienen todos los otros componentes de la formulación de rituximab tales como detergente y tampón. Esto indica que los métodos proporcionados en el presente documento no dependen de una formulación que comprende un anticuerpo monoclonal particular sino que pueden usarse por ejemplo, para evitar el efecto de LER en cada formulación que muestre este efecto. Estas formulaciones incluyen formulaciones que comprenden polisorbato 20 y un tampón quelante (tal como citrato de sodio). Esta formulación es típica para anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales. De esta manera, el método descrito anteriormente se espera que sea útil para superar el efecto de LER en cada formulación de anticuerpo monoclonal. Se formula rituximab con una mezcla de polisorbato 80 y tampón citrato de sodio (es decir tampón citrato de sodio 25 mM, pH 6,5; polisorbato 80700 mg/l, y NaCI 154 mM). Se contempla en el contexto de la presente invención, que la muestra que comprende un anticuerpo tenga esta formulación.

Los ejemplos adjuntos demuestran que en muestras a modo de ejemplo de los anticuerpos terapéuticos que se formulan con polisorbato 80 y tampón citrato, el efecto de LER puede superarse usando los métodos proporcionados en el presente documento. Por lo tanto, en el método de preparación de muestra o método de determinación de endotoxina proporcionados en el presente documento se prefiere que la muestra (es decir la muestra que comprende un anticuerpo) se formule con polisorbato 80. Por consiguiente, en los métodos proporcionados en el presente documento, se contempla que la muestra (es decir, la muestra que contiene un anticuerpo) comprenda polisorbato 80. Preferiblemente, la muestra comprende polisorbato 80 500-1000 mg/l, más preferiblemente polisorbato 80 de aproximadamente 700 mg/l. Además se contempla en los métodos proporcionados en el presente documento que la muestra (es decir, la muestra que comprende un anticuerpo) se formule con un tampón quelante (tal como tampón citrato). Este tampón citrato puede ser un tampón citrato 5-50 mM pH 6,0-7,0; preferiblemente un tampón citrato 25 mM, pH 6,5. Preferiblemente el tampón citrato es un tampón citrato de sodio. Por ejemplo, en los métodos proporcionados en el presente documento, la muestra (es decir la muestra que comprende un anticuerpo) puede comprender citrato de sodio 5-50 mM, preferiblemente citrato de sodio 25 mM. Más preferiblemente, la muestra comprende polisorbato 80 y tampón citrato de sodio. Por ejemplo, la muestra puede comprender polisorbato 80 de aproximadamente 700 mg/l y tampón citrato de sodio 5-50 mM, de manera preferible aproximadamente 25 mM. Más preferiblemente, en los métodos proporcionados en el presente documento, la muestra es la muestra de un anticuerpo, que se formula con un tampón citrato de sodio de aproximadamente 25 mM y polisorbato 80 de aproximadamente 700 mg/l y tiene un valor de pH de aproximadamente 6,5.

En el método de preparación de muestra o método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento se prefiere que dicho anticuerpo (es decir el anticuerpo que está comprendido en la muestra) sea un anticuerpo anti-CD20. Más preferiblemente, el método es el anticuerpo anti-CD20 rituximab. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de rituximab se muestran en el presente documento como SEQ ID NO 1 y 2, respectivamente. La persona experta en la técnica conoce fácilmente cómo obtener una secuencia de ácido nucleico codificante a partir de una secuencia dada de aminoácidos. De esta manera, con el conocimiento de SEQ ID NO 1 y 2, se puede obtener fácilmente una secuencia de ácido nucleico codificante de rituximab. Rituximab está comercialmente disponible, por ejemplo como Rituxan® y MabThera®, o Zytux®.

En la etapa (a) del método de preparación de muestra o método de determinación de endotoxina, proporcionados en el presente documento, se añaden iones magnesio (Mg2+), por ejemplo en forma de MgCL a la muestra (es decir a la muestra que comprende un anticuerpo). En el presente documento, el término “cloruro de magnesio” o “MgCL” se refiere a los compuestos químicos con la fórmula MgCL así como sus varios hidratos MgCL • (hhOJx (es decir MgCL • H2O). Por ejemplo, en la etapa (a) de los métodos proporcionados en el presente documento, a la muestra se puede añadir hexahidrato de MgCh (es decir MgCh • 6 H2O). Los ejemplos adjuntos ilustrativos demuestran que en la etapa (a) la adición de iones magnesio a una concentración final de Mg2+ 10-100 mM reduce notablemente el efecto de LER. Además, los ejemplos adjuntos también muestran que una concentración de Mg2+ que es dos veces la concentración del tampón de la muestra da como resultado mejores tasas de recuperación de endotoxina. Por ejemplo, cuando se usó rituximab como muestra, se obtuvieron mejores tasas de recuperación de endotoxina cuando en la etapa (a) la adición de la sal de magnesio MgCL da como resultado una concentración final de Mg2+ que es dos veces la concentración de citrato de sodio (es decir Mg2+ 50 mM). Por lo tanto, en la etapa (a) de los métodos proporcionados en el presente documento se contempla que se añadan iones magnesio en forma de una sal (por ejemplo MgCL) para dar como resultado una concentración final de Mg2+ que es dos veces la concentración del tampón (por ejemplo el tampón citrato de sodio). Por ejemplo, en los métodos proporcionados en el presente documento, preferiblemente se añaden iones magnesio a la muestra de modo que la concentración final de Mg2+ [en la etapa (a)] sea Mg2+10-100 mM, más preferiblemente Mg2+25-75 mM, más preferiblemente Mg2+40-75 mM, y más preferiblemente de aproximadamente Mg2+ 50 mM (es decir Mg2+45-55 mM). O, si la muestra comprende ya iones magnesio, entonces la cantidad añadida de Mg2+ se ajusta de modo que la concentración final resultante de Mg2+ [en la etapa (a)] es preferiblemente 10-100 mM, más preferiblemente 25-75 mM, de manera aún más preferible 40-75 mM, y de manera mucho más preferible de aproximadamente Mg2+ 50 mM (es decir, Mg2+45-55 mM). Después de la etapa (a), es decir en la etapa (b), la muestra se diluye. Sin embargo, en la etapa (a), el término “añadir iones magnesio a una concentración de...” o variaciones gramaticales del mismo y el término “añadir iones magnesio a una concentración final de...” o variaciones gramaticales del mismo, se refiere a la concentración final de Mg2+ en la etapa (a). Por ejemplo, la adición en la etapa (a) de MgCh a una concentración (final) de MgCL 45-55 mM significa que después de la adición de MgCL en la etapa (a) la concentración de MgCL es 45-55 mM. Por consiguiente, si, por ejemplo, en la etapa (b) la muestra se diluye a una razón de 1:10 (muestra:tampón/agua), la concentración de los iones magnesio e igualmente la de MgCL es 4,5-5,5 mM.

Los ejemplos adjuntos demuestran que una etapa de incubación después de la adición de iones magnesio mejora adicionalmente las tasas de recuperación en el ensayo de LAL. Por lo tanto, en los métodos proporcionados en el presente documento, después de la adición de iones magnesio la muestra se incuba preferiblemente durante de 30 minutos a 6 horas, más preferiblemente durante 1-4 horas, más preferiblemente durante aproximadamente 1 hora. En un aspecto prioritario de la etapa (a) de los métodos proporcionados en el presente documento, la muestra se incuba durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente después de la adición de los iones magnesio. Antes y después de dicha etapa de incubación, la muestra puede agitarse [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax de alta velocidad (2.037 rpm)]. Por ejemplo, antes y después de la etapa de incubación, la muestra puede agitarse durante de 30 segundos a 10 minutos, preferiblemente durante 1 minuto.

En la etapa (b) del método de preparación de muestra o método de determinación de endotoxina, proporcionados en el presente documento, se diluye la muestra (es decir la muestra que comprende un anticuerpo). La muestra puede diluirse con agua libre de endotoxina. Los ejemplos adjuntos demuestran que pueden obtenerse buenas tasas de recuperación si durante la diálisis la muestra tiene un valor de pH de 5,7-8,0. Se obtuvieron aún mejores tasas de recuperación si durante la diálisis la muestra tuvo un valor de pH de 6,0-8,0. Se obtuvieron mejores tasas de recuperación si durante la diálisis la muestra tuvo un valor de pH de 6,5-7,5. De esta manera, un aspecto de la divulgación se refiere a los métodos proporcionados en el presente documento, en donde en la etapa (a) la muestra se diluye con agua libre de endotoxina, y en donde después de la dilución y antes de la diálisis el valor de pH de la muestra se ajusta 5,7-8,0, más preferiblemente a 6,0-8,0, de manera mucho más preferible a 6,5-7,5. De esta manera, en un aspecto de la invención, en la etapa (b) de los métodos proporcionados en el presente documento, el valor de pH de la muestra se ajusta a pH 5,7-8,0, más preferiblemente a pH 6,0-8,0. Más preferiblemente, en la etapa (b) de los métodos proporcionados en el presente documento, el valor de pH de la muestra se ajusta a pH 6,5-7,5. Por ejemplo, el valor de pH de la muestra puede ajustarse a pH 5,7, pH 5,8, pH 5,9, pH 6,0, pH 6,1, pH 6,2, pH 6,3, pH 6,4, pH 6,5, pH 6,6, pH 6,7, pH 6,8, pH 6,9, o pH 7,0. Sin embargo, se prefiere que el valor de pH de la muestra se ajuste en la etapa (b) diluyendo la muestra con tampón 10-50 mM, por ejemplo, tampón Tris/HCI, pH 6,0-9,0, más preferiblemente con tampón 10-50 mM, por ejemplo, tampón Tris/HCI, pH 6,0-8,0. Por lo tanto, se contempla en un aspecto preferido de los métodos proporcionados en el presente documento que en la etapa (c) el valor de pH de la muestra se ajuste diluyendo la muestra con tampón Tris/HCI 10-50 mM, pH 6,0-9,0. Más preferiblemente, el valor de pH de la muestra se ajusta diluyendo la muestra con un tampón Tris/HCI 10-50 mM, pH 6,0-8,0. Más preferiblemente, el valor de pH de la muestra se ajusta diluyendo la muestra (en la etapa (b)) con Tris/HCI 50 mM pH —7,0. De esta manera, en los métodos proporcionados en el presente documento, durante la diálisis en la etapa (c), la muestra tiene un valor de pH de 5,7-8,0, preferiblemente de 6,0-8,0, más preferiblemente 6,5-7,5.

Como se indica anteriormente, la muestra puede comprender un detergente tal como polisorbato 80. Los ejemplos ilustrativos adjuntos demuestran, entre otros, que la dilución de una muestra que comprende un detergente (por ejemplo, polisorbato 80) vuelve a las moléculas de endotoxina accesibles en el ensayo de LAL. Sin limitarse por la teoría se cree que la dilución de una muestra que comprende un detergente a concentraciones casi CMC reduce la compartimentalización micelar de la muestra, y por lo tanto reduce el efecto de LER.

Los ejemplos adjuntos muestran que una dilución de 1:5 a 1:20 tiene influencia considerable en la tasa de recuperación en un ensayo de LAL. De esta manera, la invención se refiere al método de preparación de muestra y método de determinación de endotoxina proporcionados en el presente documento, en donde en la etapa (b) la muestra se diluye a una razón de 1:5 a 1:20 (muestra:tampón/agua), preferiblemente de 1:10 (muestra:tampón/agua). En los métodos proporcionados en el presente documento, el anticuerpo se formula preferiblemente con un tampón citrato de sodio de aproximadamente 25 mM y polisorbato 80 de aproximadamente 700 mg/l. De esta manera, en los métodos proporcionados en el presente documento, la muestra puede diluirse en la etapa (b) tal que la concentración del tampón disminuya a 5-1,25 mM, preferiblemente a 2,5 mM. Además, la muestra puede diluirse en la etapa (b) tal que la concentración de detergente disminuya a 140-35 mg/l, preferiblemente a 70 mg/l. En los ejemplos adjuntos, las muestras fueron formulaciones de anticuerpo que tienen una concentración del anticuerpo de aproximadamente 10 mg/ml. Estas muestras se diluyeron en la etapa (b) de los métodos proporcionados en el presente documento para dar como resultado una concentración anticuerpo de 2-0,5 mg/ml. De esta manera, en los métodos de preparación proporcionados en el presente documento, la muestra puede diluirse en la etapa (b) tal que la concentración del anticuerpo disminuye a 2-0,5 mg/ml, preferiblemente a 1 mg/ml. En los métodos proporcionados en el presente documento también puede prepararse un control no diluido. Dicho control no diluido se trata de la misma manera que la muestra que va a someterse a prueba, con la excepción que el control no diluido no se diluye (en la etapa (b)). En el presente documento, “tampón/agua” significa “tampón o agua”.

En la etapa (c) del método de preparación de muestra y método de determinación de endotoxina, proporcionados en el presente documento, la muestra se dializa contra una disolución acuosa libre de endotoxina. La disolución acuosa libre de endotoxina puede ser agua libre de endotoxina. Sin embargo, la disolución acuosa libre de endotoxina también puede ser una disolución acuosa libre de endotoxina que comprende iones magnesio, por ejemplo, añadidos en forma de la sal MgCL. Por consiguiente, un aspecto de la divulgación se refiere a los métodos proporcionados en el presente documento, en donde en la etapa (c), la disolución acuosa libre de endotoxina contiene iones magnesio, por ejemplo, MgCL 2,5-10 mM.

Antes del inicio de la diálisis, las muestras pueden agitarse [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, de alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente], por ejemplo durante de 30 segundos a 10 minutos, preferiblemente durante 1 minuto. Preferiblemente, la diálisis en la etapa (c) es durante 1-48 horas, más preferiblemente durante 4-24 horas, más preferiblemente durante aproximadamente 24 horas. De esta manera, se prefiere que en la etapa (c) la diálisis sea durante aproximadamente 24 horas. La diálisis puede realizarse a 15-30°C, preferiblemente a temperatura ambiente (es decir 21 ± 2°C). Después de la diálisis, la muestra puede agitarse [por ejemplo en el agitador Heidolph Multi Reax, de alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente, por ejemplo durante de 20 minutos a 1 hora, preferiblemente durante (al menos) 20 minutos.

La diálisis puede realizarse usando un dializador de giro (por ejemplo el SpinDIALYZER de Harvard, n.° de catálogo 74-0314) o el SpinDIALYZER rápido (por ejemplo el SpinDIALYZER de Harvard, n.° de catálogo 74-0412). Se prefiere (especialmente si se usa un SpinDIALYZER) que la frecuencia de rotación del agitador sea alta, que quiere decir que la frecuencia del agitador es de 50 a 300 rpm, preferiblemente de 200 a 300 rpm. El agitador tiene preferiblemente una longitud de 20-60 mm y un diámetro (es decir, dimensión en sección transversal) de 5-25 mm. Más preferiblemente, el agitador tiene una longitud de aproximadamente 40 mm y un diámetro de aproximadamente 14 mm. El agitador es más preferiblemente un agitador magnético térmicamente esterilizado (por ejemplo 4 horas a 250°C) que tiene una longitud de aproximadamente 40 mm y un diámetro de aproximadamente 14 mm. Estos agitadores están disponibles de OMNILAB. En realidad, la diálisis se hace usualmente con una alta frecuencia del agitador, puesto que esto facilita la difusión a través de la membrana de diálisis. Por consiguiente, la dialización con una alta frecuencia del agitador es el procedimiento de diálisis convencional. El recipiente que se usa para diálisis tiene preferiblemente un volumen de 500-5000 mi, más preferiblemente 1000-3000 mi, más preferiblemente 1500-2500 mi. Este recipiente puede tener un diámetro de 120 mm y una altura de 240 mm. Por ejemplo, el recipiente que se usa para diálisis puede ser un vaso de precipitados DURAN®, forma alta, 2000 mi (por ejemplo disponible de OMNILAB, Alemania, P/N 5013163). El uso de un SpinDIALYZER rápido se prefiere puesto que tiene el doble del área de la membrana de diálisis, y de esta manera se cree que es adecuado para una diálisis más eficiente y más rápida.

Se contempla que para la diálisis en la etapa (c) se usa una membrana con un corte de peso molecular de 100 Da a 16 kDa, preferiblemente de 500 Da a 10 kDa, más preferiblemente de 10 kDa. Para la diálisis en la etapa (c) puede usarse una membrana de éster de celulosa o de acetato de celulosa. Preferiblemente, para la diálisis en la etapa (c) se usa una membrana de acetato de celulosa. Más preferiblemente, durante la diálisis se usa una membrana de acetato de celulosa con un corte de peso molecular de 10 kDa.

De esta manera, en la etapa (c) de los métodos proporcionados en el presente documento, la diálisis se realiza preferiblemente durante aproximadamente 24 horas usando una membrana de acetato de celulosa con un corte de peso molecular de 10 kDa. Antes de la diálisis, la membrana de diálisis puede lavarse, preferiblemente en agua libre de endotoxina. En particular, la membrana de diálisis puede agitarse (por ejemplo con el agitador SG 20. IDL GmbH, Alemania o equivalente, de 50 a 300 rpm, preferiblemente 100 rpm) en agua libre de endotoxina. Por ejemplo, la membrana de diálisis puede lavarse agitándola durante de 10 minutos a 3 horas, preferiblemente durante 1 hora en agua libre de endotoxina. Después de esta etapa de lavado, la membrana de diálisis se transfiere preferiblemente en agua fresca libre de endotoxina y se lava nuevamente agitándola durante de 10 minutos a 3 horas, preferiblemente durante 1 hora.

La diálisis puede realizarse en cámaras de 1 mi, por ejemplo en cámaras de SpinDIALYZER (Harvard) de 1 mi equipadas con una membrana (tal como membrana de acetato de celulosa) que tiene un corte de peso molecular que oscila entre 500 Da y 10 kDa (por ejemplo un corte de peso molecular de 10 kDa). Durante la diálisis, el agua se cambia preferiblemente, más preferiblemente se cambia dos veces el agua. Por ejemplo, el agua puede cambiarse después de 2 y 20 horas de diálisis o después de 18 y 22 horas de diálisis. Preferiblemente, el agua se cambia después de 2 y 4 horas de diálisis.

Se prefiere en el contexto de los métodos proporcionados en el presente documento que después de la diálisis en la etapa (c) se agite la muestra (por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, de alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente. Preferiblemente, la muestra (es decir, la muestra que comprende un anticuerpo) se agita después de la diálisis durante de 10 minutos a 1 hora, más preferiblemente durante 20 minutos. Además, o de manera alternativa a la agitación, la muestra puede tratarse con ultrasonidos después de la diálisis. De esta manera, un aspecto de la invención se refiere a los métodos proporcionados en el presente documento, en donde en la etapa (c) la muestra se trata con ultrasonidos después de la diálisis.

Si el método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento se combina con un ensayo de LAL, entonces este método combinado alcanza ventajosamente los requisitos de la FDA para la detección cuantitativa y reproductiva de una cantidad definida de CSE con adiciones conocidas a una muestra. Preferiblemente, el ensayo de LAL de los métodos proporcionados en el presente documento es un ensayo de LAL como se describe más adelante.

Los ejemplos adjuntos indican que la adición de Mg2+ (es decir iones magnesio) tiene la ventaja adicional que retiene la endotoxina en el compartimiento interior de la cámara de diálisis. De esta manera, en la diálisis en la etapa (c) conduce sólo a la retirada del tampón (por ejemplo el tampón citrato de sodio) y no de la endotoxina. La etapa de dilución puede reducir la concentración del detergente (por ejemplo, polisorbato 80) para anular la inhibición de la cascada de LAL por el detergente. Los ejemplos adjuntos demuestran que el efecto de LER puede ser en particular reproduciblemente superados y las etapas de los métodos inventivos se realizan en el orden: (1) adición de Mg2+; (2) dilución; y (3) diálisis. Por consiguiente, la combinación de los etapas (1), (2) y (3), o la combinación de los etapas (a), (b) y (c) reivindicadas supera de manera reproducible el efecto de LER. La cantidad preferida de Mg2+ que va a añadirse, el grado preferido de dilución y los parámetros preferidos para diálisis se detallan en el presente documento anteriormente y más adelante.

En un aspecto preferido, la divulgación se refiere al método proporcionado en el presente documento para la preparación de una muestra que comprende un anticuerpo para un ensayo de LAL, en donde el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(a) añadir iones magnesio, por ejemplo en forma de MgCb, a la muestra a una concentración final de 10-100 mm, preferiblemente 40-75 mm, más preferiblemente 45-55 mm,

(b) diluir la muestra a una razón de 1:5 (muestra:tampón) a 1:20 (muestra:tampón), preferiblemente 1:10 (muestra:tampón) con tampón Tris/HCI 10-50 mm, pH 6,0-8,0; preferiblemente con tampón Tris/HCI 50 mm, pH —7,0, (c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 (preferiblemente 6,5-7,5) contra agua libre de endotoxina durante 1-48 horas, preferiblemente durante 4-24 horas, más preferiblemente durante 24 horas. Preferiblemente, se usa una membrana de acetato de celulosa con un corte de peso molecular de 10 kDa y el agua se cambia después de 2 y 4 horas. Más preferiblemente, se usa un SpinDIALYZER rápido y la frecuencia del agitador es de 50 a 300 rpm, preferiblemente 200 rpm.

Como se menciona anteriormente, el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Más preferiblemente, el anticuerpo es rituximab. Más preferiblemente, en los métodos proporcionados en el presente documento, la muestra es una muestra de un anticuerpo, que se formula con un tampón citrato de sodio de aproximadamente 25 mM (7,35 mg/ml) y polisorbato 80 de aproximadamente 700 mg/l y tiene un valor de pH de aproximadamente 6. El término “aproximadamente” y el símbolo se usan de manera indistinta en el presente documento y especifican que el valor específico proporcionado puede variar hasta cierto punto. Por ejemplo, “aproximadamente” o (por ejemplo en el contexto de tampón citrato de sodio aproximadamente/- 25 mm) significa que la variación en el valor dado se incluyen variaciones en el intervalo de ± 10%, preferiblemente ± 5%, más preferiblemente ± 2%.

Como se indica, se contempla en el contexto de la presente divulgación que el método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento se combina con un ensayo de LAL. El ensayo de LAL tiene la ventaja que detecta endotoxina a baja concentración.

Como se da por la curva convencional de CSE, el límite inferior validado de detección de endotoxina es de 0,005 UE/ml en técnicas de LAL cromogénicas cinéticas. El reactivo LAL de estas técnicas comprende la cascada completa de amplificación enzimática de serina-proteasas purificadas a partir del cangrejo Limulus.

El límite inferior de detección de endotoxina (CSE) en el ensayo EndoLISA® más recientemente desarrollado (Hyglos GmbH, Alemania) se indica por el fabricante que es 0,05 UE/mL (publicidad de: Grallert et al. en: Nature Methods, oct. de 2011; http://www.hyglos.de/fileadmin/media/Application_note_EndoLISA_Nature_Methods_October_2011.pdf). Este ensayo EndoLISA® emplea una forma recombinante de solo la enzima inicial de la cascada de Limulus, es decir, factor C. Distinto de las pruebas LAL certificadas, el ensayo EndoLISA® incluye adicionalmente una etapa inicial de adsorción de endotoxina provisto por un pre-revestimiento de la placa de microtítulo por una proteína codificada por bacteriófago que aún no se ha probado que se una al amplio espectro de endotoxinas bacterianas bien conocidas por ser detectadas por el método LAL.

En particular, en un aspecto preferido, la presente divulgación se refiere a un método para determinar endotoxina bacteriana en una muestra que comprende un polipéptido, en donde el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(a) añadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCL, a la muestra a una concentración final de 10-100 mM, preferiblemente 40-75 mM, más preferiblemente 45-55 mM,

(b) diluir la muestra a una razón de 1:5 (muestra:tampón) a 1:20 (muestra:tampón), preferiblemente 1:10 (muestra:tampón) con tampón Tris/HCI 10-50 mM, pH 6,0-8,0; preferiblemente con tampón Tris/HCI 50 mM, pH -7,0, (c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 (preferiblemente 6,5-7,5) contra agua libre de endotoxina durante 1-48 horas, preferiblemente durante 4-24 horas, más preferiblemente durante 24 horas. Preferiblemente, se usa una membrana de acetato de celulosa con un corte de peso molecular de 10 kDa y el agua se cambia después de 2 y 4 horas. Más preferiblemente, se usa un SpinDIALYZER rápido y la frecuencia del agitador es de 50 a 300 rpm, preferiblemente 200 rpm.

(d) determinar la endotoxina bacteriana en la muestra usando un ensayo de LAL.

Como se menciona anteriormente, el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Más preferiblemente, el anticuerpo es rituximab. Más preferiblemente, en los métodos proporcionados en el presente documento, la muestra es una muestra de un anticuerpo, que se formula con un tampón citrato de sodio de aproximadamente 25 mM y polisorbato 80 de aproximadamente 700 mg/l y tiene un valor de pH de aproximadamente 6,5.

Como se indica en los ejemplos adjuntos, puede usarse un “control positivo de LER” (también designado como “control LER positivo”) en el ensayo de LAL de la etapa (d) del método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento. Este “control positivo de LER” es un indicador para demostrar que la muestra que va a someterse a prueba (es decir la muestra que comprende un anticuerpo) mostrará el efecto de LER si las etapas (a) a (c) de los métodos descritos en el presente documento no se hubieran realizado. O, en otras palabras, el “control positivo de LER” se usa en un ensayo de LAL como un control positivo para mostrar que una cantidad con adiciones conocidas de endotoxina (dentro de la muestra que va a someterse a prueba) no puede recuperarse usando un ensayo de LAL únicamente (es decir sin realizar las etapas (a) a (c) de los métodos proporcionados en el presente documento). En el contexto de la presente divulgación, se ha encontrado de manera sorprendente y de forma inesperada que un efecto de LER positivo sólo se puede obtener si, después de añadir adiciones conocidas a la muestra con CSE, la muestra se agita durante de 45 minutos a 2 horas, preferiblemente durante de aproximadamente 60 minutos a 2 horas, más preferiblemente durante aproximadamente 60 minutos. De esta manera, en el contexto de la presente invención, el “control positivo de LER” se prepara añadiendo una cantidad conocida de endotoxina en una alícuota de la muestra que va a someterse a prueba para endotoxina (por ejemplo en una alícuota de la muestra que comprende un anticuerpo) y agitando la muestra con adiciones conocidas durante de 45 minutos a 2 horas, preferiblemente durante de aproximadamente 60 minutos a 2 horas, más preferiblemente durante aproximadamente 60 minutos. De esta manera, la divulgación se refiere al método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento, que comprende además producir un control positivo de LER añadiendo una cantidad conocida de endotoxina en una alícuota de la muestra y agitando la alícuota con adiciones conocidas con la endotoxina de la muestra durante > 60 min (más preferiblemente durante de 60 minutos a 2 horas.

Preferiblemente, en el método proporcionado en el presente documento para determinar endotoxina bacteriana, el “control positivo de LER” se prepara añadiendo CSE a una concentración final de 5,0 UE/ml a una alícuota de la muestra que va a someterse a prueba. Posteriormente, la alícuota con adiciones conocidas se agita [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] durante > 60 min, más preferiblemente durante 60 min. Después de la agitación, la alícuota con adiciones conocidas con endotoxina se diluye preferiblemente al mismo grado como la muestra que va a someterse a prueba en la etapa (b) de los métodos proporcionados en el presente documento. Preferiblemente, la alícuota con adiciones conocidas se diluye con agua libre de endotoxina. Después de la dilución, la alícuota con adiciones conocidas se agita preferiblemente “por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente], por ejemplo durante 1 minuto.

De esta manera, el “control positivo de LER” se prepara preferiblemente por el siguiente procedimiento en el siguiente orden:

- añadir adiciones conocidas de CSE a una concentración final de 5,0 UE/ml a una alícuota de la muestra que va a someterse a prueba. Preferiblemente, el “control positivo de LER” se prepara en un recipiente de fondo plano, de cuello rizado, de vidrio transparente de 1,5-5 mi, más preferiblemente en un vial de vidrio de cuello roscado de Macherey-Nagel GmbH (1,5 mi o 4 mi).

- Agitación de la alícuota con adiciones conocidas durante > 60 min (más preferiblemente durante de 60 min a 2 horas), más preferiblemente durante 60 min. Preferiblemente, la alícuota con adiciones conocidas se agita a una alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente (es decir 21 ± 2°C). Más preferiblemente, la alícuota con adiciones conocidas se agita a alta velocidad (2.037 rpm) en un agitador Heidolph Multi Reax a temperatura ambiente.

- Dilución de la alícuota con adiciones conocidas con agua libre de endotoxina. La alícuota con adiciones conocidas se diluye al mismo grado como la muestra que va a someterse a prueba en la etapa (b) de los métodos proporcionados en el presente documento (es decir, si la muestra que va a someterse a prueba se diluye en la etapa (b) a una razón de 1:10, entonces también la alícuota con adiciones conocidas se diluye a una razón de 1:10).

- Agitación de la alícuota con adiciones conocidas (por ejemplo durante 1 minuto).

Como se describe anteriormente, durante la preparación del “control positivo de LER”, se realiza una dilución. Sin embargo, se contempla en el contexto de la presente divulgación que, además de dicha dilución, el “control positivo de LER” no se trate como se describe en los etapas (a) a (c) de los métodos proporcionados en el presente documento. Sin embargo, el “control positivo de LER” se usa en la etapa (d) del método para determinar la endotoxina bacteriana para mostrar que la muestra que va a someterse a prueba (es decir la muestra que comprende un anticuerpo) mostraría el efecto de LER si no se realizaran los etapas (a) a (c) de los métodos descritos en el presente documento. El “control positivo de LER” puede prepararse durante el tiempo de una cualquiera de las etapas (a) a (c) (por ejemplo durante el tiempo de diálisis) de modo que está listo para el uso cuando se realice el ensayo de LAL.

Para identificar que un material dado (por ejemplo un tampón o una muestra de un anticuerpo terapéutico) muestra el efecto de LER, pueden monitorizarse los contenidos de endotoxina a lo largo del tiempo, por ejemplo en un estudio de tiempo de retención de endotoxina. Los estudios de tiempo de retención de endotoxina requieren adiciones conocidas de endotoxina de una muestra no diluida y almacenamiento de la muestra con adiciones conocidas con endotoxina a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la muestra puede almacenarse hasta varios meses. Preferiblemente, en un estudio de tiempo de retención, la muestra con adiciones conocidas con endotoxina se almacena durante varios (por ejemplo de 7 hasta 28) días y en puntos definidos de tiempo se realiza un ensayo de LAL. Las tasas de recuperación que son menores del 50% de la cantidad de la endotoxina con adiciones conocidas indican que la muestra presenta un efecto de LER.

Como se menciona anteriormente, el ensayo LER se realiza de manera rutinaria con una muestra de prueba diluida junto con un control positivo diluido (PPC) que es una muestra con una cantidad conocida de CSE con adiciones conocidas. De esta manera, en el ensayo de LAL, que se realiza en la etapa (d) del método de terminación de endotoxina proporcionado en el presente documento, se contempla que cada muestra se mida cada vez en duplicado con una endotoxina de patrón de control con adiciones conocidas (PPC) y libre de endotoxina con adiciones conocidas. En consecuencia, con cada muestra dada, puede someterse a prueba fácilmente si el método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento o el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento tienen el efecto favorable que la endotoxina presente en la muestra (o al menos el 50%-200% de la misma como se requiere por la FDA) puede detectarse usando el ensayo de LAL. De esta manera, se contempla que el ensayo de LAL en la etapa (d) del método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento comprenda que se pruebe un control positivo (PPC) junto con la muestra que va a someterse a prueba (es decir la muestra que comprende un anticuerpo que va a someterse a prueba). Dicho control positivo es idéntico a la muestra que va a someterse a prueba con la excepción que el PPC se añade con una cantidad conocida de CSE. O, en otras palabras, los etapas (a) a (c) de los métodos proporcionados en el presente documento tienen que realizarse con el PPC de la misma manera como con la muestra que va a someterse a prueba. Por consiguiente, el PPC se prepara antes de la etapa (a) de los métodos proporcionados en el presente documento.

En el contexto de la presente divulgación, se ha encontrado de manera sorprendente e inesperada que sólo se puede obtener un efecto de LER positivo si, después de la adición conocida de la muestra con CSE, la muestra se agita durante de 45 minutos a 2 horas, preferiblemente durante aproximadamente de 60 minutos a 2 horas, más preferiblemente durante aproximadamente 60 minutos. De esta manera, en el contexto de la presente invención el PPC se agita [por ejemplo, en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm)] después de la adición conocida durante de 45 minutos a 2 horas, preferiblemente durante aproximadamente de 60 minutos a 2 horas, más preferiblemente durante aproximadamente 60 minutos. Más preferiblemente, el PPC se agita [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm)] después de la adición conocida durante aproximadamente 60 minutos a temperatura ambiente.

De esta manera, un aspecto preferido de la divulgación se refiere al método proporcionado en el presente documento para determinar la endotoxina bacteriana en una muestra que comprende un anticuerpo, en donde el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(aO) preparar un PPC al

- añadir una cantidad conocida de endotoxina en una primera alícuota de la muestra que comprende un anticuerpo, y

- agitar la alícuota con adiciones conocidas con endotoxina durante de 60 minutos a 2 horas (preferiblemente durante aproximadamente 60 minutos a temperatura ambiente),

(a) añadir iones magnesio a una segunda alícuota de la muestra que va a someterse a prueba así como al PPC, (b) diluir la segunda alícuota de la muestra que va a someterse a prueba así como el PPC,

(c) dializar la segunda alícuota de la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 (preferiblemente 5,8-7,0) que va a someterse a prueba así como el PPC contra una disolución acuosa libre de endotoxina, en donde la muestra que va a someterse a prueba así como el PPC tienen un valor de pH de 5,7-9,0, y

(d) determinar la endotoxina bacteriana en la segunda alícuota de la muestra que va a someterse a prueba así como en el PPC usando un ensayo de LAL.

En un aspecto de la invención, el PPC se añade con endotoxina tal que se obtiene una concentración final de endotoxina de 5,0 UE/ml.

Todos los aspectos y definiciones dadas a conocer en relación con el método proporcionado en el presente documento para determinar endotoxina bacteriana se aplican, con los cambios necesarios, a dicho método si se aplica un PPC. De esta manera un aspecto preferido de la invención se refiere al método proporcionado en el presente documento para determinar endotoxina bacteriana en una muestra que comprende un anticuerpo, en donde el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(aO) preparar un PPC al

- agitar la alícuota con adiciones conocidas con endotoxina durante > 60 min (preferente durante 60 min a temperatura ambiente),

(a) añadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCL, a una segunda alícuota de la muestra a una concentración final de 10-100 mM, preferiblemente 40-75 mM, más preferiblemente 45-55 mM,

(b) diluir la segunda alícuota de la muestra a una razón de 1:5 (muestra:tampón) a 1:20 (muestra:tampón), preferiblemente 1:10 (muestra:tampón) con tampón Tris/HCI 10-50 mM, pH 6,0-8,0, preferiblemente con tampón Tris/HCI 50 mM, pH ~7,0,

(c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 (preferiblemente 6,5-7,5) contra agua libre de endotoxina durante 1-48 horas, preferiblemente 4-24 horas, de manera 24 horas. Preferiblemente, se usa una membrana de acetato de celulosa con un corte de peso molecular de 10 kDa y el agua se cambia después de 2 y 4 horas. Más preferiblemente, se usa un SpinDIALYZER rápido y la frecuencia del agitador es alta.

(d) determinar la endotoxina bacteriana en la muestra usando un ensayo de LAL.

Adicionalmente, pueden aplicarse controles de agua en el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento. Preferiblemente, se usan al menos dos controles de agua; en donde uno que consiste en agua libre de endotoxina y el otro en agua libre de endotoxina, que se añade con una cantidad conocida de endotoxina (por ejemplo que da como resultado una concentración final de 5,0 UE/ml CSE). Los controles de agua se tratan de la misma manera como la muestra que va a someterse a prueba.

Como se indica anteriormente, en el método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento así como en el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento, se contempla que en la etapa (a), la muestra se incube durante de 30 minutos a 6 horas, preferiblemente durante 1-4 horas, y más preferiblemente durante 1 hora. Además también se contempla que después de la diálisis la muestra se agite [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente], por ejemplo durante de 10 minutos a 1 hora, preferiblemente durante 20 minutos. De esta manera, un aspecto de la divulgación se refiere al método proporcionado en el presente documento para la preparación de una muestra que comprende un anticuerpo para un ensayo de LAL, en donde el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden: (a) añadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCL, a la muestra a una concentración final de 10-100 mM, preferiblemente 40-75 mM, más preferiblemente 45-55 mM; e incubar la muestra durante de 30 minutos a 6 horas, preferiblemente durante 1-4 horas, más preferiblemente durante 1 hora,

(b) diluir la muestra a una razón de 1:5 (muestra:tampón) a 1:20 (muestra:tampón), preferiblemente 1:10 (muestra:tampón) con tampón Tris/HCI 10-50 mM, pH 6,0-8,0, preferiblemente, en tampón Tris/HCI 50 mM, pH —7,0. (c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5:7-8,0 (preferiblemente 6,5-7,5) contra agua libre de endotoxina durante 1-48 horas, preferiblemente durante 4-24 horas, más preferiblemente durante 24 horas. (Preferiblemente, se usa una membrana de acetato de celulosa con un corte de peso molecular de 10 kDa y el agua se cambia después de 2 y 4 horas. Más preferiblemente, se usa un SpinDIALYZER rápido y la frecuencia del agitador es alta). Después de la diálisis, las muestras se agitan durante de 10 minutos a 1 hora, preferiblemente durante 20 minutos.

De manera análoga, un aspecto adicional de la divulgación se refiere al método proporcionado en el presente documento para determinar endotoxina bacteriana en una muestra que consiste en un anticuerpo que muestra un efecto de LER, en donde el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(a) añadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCL a la muestra a una concentración final de 10-100 mM, preferiblemente 40-75 mM, más preferiblemente 45-55 mM; e incubar la muestra durante de 30 minutos a 6 horas, preferiblemente durante 1-4 horas, más preferiblemente durante 1 hora (en donde la muestra puede agitarse antes y después de la incubación),

(b) diluir la muestra a una razón de 1:5 (muestra:tampón) a 1:20 (muestra:tampón), preferiblemente 1:10 (muestra:tampón) con tampón Tris/HCI 10-50 mM, pH 6,0-8,0, preferiblemente con tampón Tris/HCI 50 mM, pH —7,0, (c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 (preferiblemente 6,5-7,5) contra agua libre de endotoxina durante 1-48 horas, preferiblemente durante 4-24 horas, más preferiblemente durante 24 horas. (Preferiblemente, se usa una membrana de acetato de celulosa con un corte de peso molecular de 10 kDa y el agua se cambia después de 2 y 4 horas. Más preferiblemente, se usa un SpinDIALYZER rápido y la frecuencia del agitador es alta. Después de la diálisis, las muestras se agitan durante de 10 minutos a 1 hora, preferiblemente durante 20 minutos.

(d) determinar la endotoxina bacteriana en la muestra usando un ensayo de LAL.

Además, como se menciona anteriormente, en el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento se contempla que se prepara un PPC y que el PPC se agita durante de 60 minutos a 2 horas después de la adición conocida. De esta manera, la presente divulgación se refiere al método proporcionado en el presente documento para determinar endotoxina bacteriana en una muestra que comprende un anticuerpo que muestra un efecto de LER, en donde el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(aO) preparar un PPC al

- añadir una cantidad conocida de endotoxina (por ejemplo a una concentración final de 5,0 UE/ml) en una primera alícuota de la muestra que comprende un anticuerpo, y

- agitar la alícuota con adiciones conocidas con endotoxina durante de 60 minutos a 2 horas (preferiblemente durante 60 minutos a temperatura ambiente),

(a) añadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCL, a una segunda alícuota de la muestra así como al PPC a una concentración final de 10-100 mM, preferiblemente 40-75 mM, más preferiblemente 45-55 mM de MgCh; (y preferiblemente incubar la muestra y el PPC durante de 30 minutos a 6 horas, más preferiblemente durante 1-4 horas, más preferiblemente durante 1 hora, (en donde la muestra puede agitarse antes y después de la incubación)), (b) diluir la muestra y el PPC a una razón de 1:5 (muestra/PPC:tampón) a 1:20 (muestra/PPC:tampón), y preferiblemente 1:10 (muestra/PPC:tampón) con tampón Tris/HCI 10-50 mM, pH 6,0-8,0, preferiblemente con tampón Tris/HCI 50 mM, pH —7,0,

(c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 (preferiblemente 6,5-7,5) y el PPC contra agua libre de endotoxina durante 1-48 horas, preferiblemente durante 4-424 horas, de manera durante 24 horas. Preferiblemente, se usa una membrana de acetato de celulosa con un corte de peso molecular de 10 kDa y el agua se cambia después de 2 y 4 horas. (Más preferiblemente, se usa un SpinDIALYZER rápido y la frecuencia del agitador es alta). Después de la diálisis, las muestras y el PPC se agitan durante de 10 minutos a 1 hora, preferiblemente durante 20 minutos,

(d) determinar la endotoxina bacteriana en la muestra y el PPC usando un ensayo de LAL.

Además, como se indica anteriormente, se contempla en el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento que se prepara un “control positivo de LER” y se usa en la etapa (d) para mostrar el efecto de LER. De esta manera, un aspecto preferido de la divulgación se refiere al método proporcionado en el presente documento para determinar endotoxina bacteriana en una muestra que comprende un anticuerpo que muestra un efecto de LER, en donde el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(aO) preparar un PPC al

(a) añadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCh, a una segunda alícuota de la muestra así como al PPC a una concentración final de 10-100 mM, preferiblemente 40-75 mM, más preferiblemente 45-55 mM; (y preferiblemente incubar la muestra y el PPC durante de 30 minutos a 6 horas, más preferiblemente durante 1-4 horas, más preferiblemente durante 1 hora, (en donde la muestra puede agitarse antes y después de la incubación)), (b) diluir la muestra y el PPC a una razón de 1:5 (muestra/PPC:tampón) a 1:20 (muestra/PPC:tampón), preferiblemente 1:10 (muestra/PPC:tampón) con tampón Tris/HCI 10-50 mM, pH 6,0-8,0, preferiblemente con tampón Tris/HCI 50 mM, pH —7,0,

(c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 (preferiblemente 6,5-7,5) y el PPC contra agua libre de endotoxina durante 1-48 horas, preferiblemente 4-24 horas, más preferiblemente durante 24 horas. Preferiblemente durante 24 horas. (Preferiblemente, una membrana de acetato de celulosa con un corte de peso molecular de 10 kDa se usa y el agua se cambia después de 2 y 4 horas. Más preferiblemente, se usa un SpinDIALYZER rápido y la frecuencia del agitador es alta. Después de la diálisis, las muestras y el PPC se agitan durante de 10 minutos a 1 hora, preferiblemente durante 20 minutos.

(d) determinar la endotoxina bacteriana en la muestra y el PPC usando un ensayo de LAL, en donde en el ensayo de LAL se usa un “control positivo de LER”, que se prepara al:

- añadir CSE a una concentración final de 5,0 UE/ml a una tercera alícuota de la muestra que va a someterse a prueba;

- agitar la alícuota con adiciones conocidas durante > 60 min, más preferiblemente durante 60 min;

- diluir la alícuota con adiciones conocidas con agua libre de endotoxina (la alícuota con adiciones conocidas se diluye al mismo grado como la muestra que va a someterse a prueba en la etapa (b) de los métodos proporcionados en el presente documento);

- agitar la alícuota con adiciones conocidas (por ejemplo durante 1 minuto).

De esta manera, un aspecto preferido de la divulgación se refiere al método proporcionado en el presente documento para determinar endotoxina bacteriana en una muestra que comprende un anticuerpo que muestra un efecto de LER, en donde el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(aO) preparar un PPC al

- añadir una cantidad conocida de endotoxina a una concentración final de 5,0 UE/ml en una primera alícuota de la muestra que comprende un anticuerpo, y

- agitar la alícuota con adiciones conocidas con endotoxina durante aproximadamente 60 minutos a temperatura ambiente),

(a) añadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCh, a una segunda alícuota de la muestra y el PPC a una concentración final de 45-55 mM, agitar la muestra y el PPC durante 1 minuto, incubar la muestra y el PPC durante 1 hora, y agitar la muestra y el PPC nuevamente después de la incubación,

(b) diluir la muestra y el PPC 1:10 (muestra/PPC:tampón) con tampón Tris/HCI 50 mM, pH —7,0,

(c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 (preferiblemente 6,5-7,5) y el PPC contra agua libre de endotoxina durante 24 horas usando una membrana proporcionado en el presente documento con un corte de peso molecular de 10 kDa; en donde el agua se cambia después de 2 y 4 horas. (Más preferiblemente un SpinDIALYZER rápido se usa y la frecuencia del agitador es alta), y agitar la muestra y el PPC durante 20 min, y

(d) determinar la endotoxina bacteriana en la muestra y el PPC usando un ensayo de LAL, en donde en el ensayo de LAL se usa un “control positivo de LER”, que se prepara al

- añadir CSE a una concentración final de 5,0 UE/ml a una tercera alícuota de la muestra que va a someterse a prueba,

- agitar la alícuota con adiciones conocidas durante 60 min,

- diluir la alícuota con adiciones conocidas a una razón de 1:10 con agua libre de endotoxina,

- agitar la alícuota con adiciones conocidas (por ejemplo durante 1 minuto).

Además, como se menciona anteriormente, se contempla que se apliquen controles de agua en el ensayo de LAL. Por ejemplo, un control de agua que consiste en agua libre de endotoxina puede aplicarse en el ensayo de LAL de la etapa (d) del método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento. Otro control de agua puede consistir en agua libre de endotoxina con adiciones conocidas con endotoxina. Después de la adición conocida con endotoxina, el agua se agita preferiblemente [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm)] durante > 60 minutos (por ejemplo durante 60 minutos a temperatura ambiente). Además, en un ensayo de LAL normalmente se prepara un patrón según las instrucciones del kit usado.

Las etapas (aO), (a), (b), (c) y (d) se van a llevar a cabo en el orden (a0)->(a)->(b)->(c)->(d). Sin embargo, el lavado de la membrana de diálisis puede realizarse en cualquier momento, con la condición que la etapa se ejecute cuando se inicia la diálisis. De manera similar, la preparación del control positivo de LER puede realizarse en cualquier momento con la condición que la etapa se ejecute cuando se inicia el ensayo de LAL. En un aspecto preferido de la divulgación, el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento comprende las siguientes etapas:

Etapa íaOOL Preparación de las muestras

- Adaptar la concentración de la muestra que va a someterse a prueba al PPC (por ejemplo anticuerpo 900 pl 100 |il de agua libre de endotoxina).

- Añadir una alícuota de la muestra que va a someterse a prueba con endotoxina para la producción del PPC (por ejemplo, anticuerpo 900 pl 100 pl de CSE cono. 50 UE/ml = concentración final 5,0 UE/ml).

- Preparar un control de agua (por ejemplo agua libre de endotoxina 1000 pl).

- Preparar otro control de agua (por ejemplo agua libre de endotoxina 900 pl 100 pl de CSE cono. 50 UE/ml = concentración final cono. 5,0 UE/ml).

Agitar las muestras aproximadamente 60 minutos a temperatura ambiente [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm)]

Etapa Ía011: Lavado de la membrana de diálisis

- Por ejemplo, usar membranas de acetato de celulosa (CA) de 10 kDa y ponerlas en una caja de cristalización con agua libre de endotoxina (por ejemplo 300 mi de agua destilada del fabricante B. Braun, Melsungen).

- Agitarlas cuidadosamente durante 1 hora (agitador SG 20. IDL GmbH, Alemania o equivalente, de 50 a 300 rpm, preferiblemente 100 rpm).

- Transferir las membranas en una nueva caja de cristalización con agua fresca libre de endotoxina (por ejemplo 300 mi de agua destilada del fabricante B. Braun, Melsungen).

- Agitarlas (agitador SG 20. IDL GmbH, Alemania o equivalente, de 50 a 300 rpm, preferiblemente 100 rpm) durante 1 hora.

Etapa (al: Adición de iones magnesio (Mg2+) 25-100 mM, preferiblemente 50-100 mM,.

- Añadir Mg2+, por ejemplo en forma de MgCL, a las muestras de la etapa (aO) a una concentración final de 25-100 mM, preferiblemente 50-100 mM (por ejemplo añadir 50 pl de una disolución madre de MgCL 1 M a las muestras de la etapa (a0)).

- Agitar [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] durante 2-5 minutos, por ejemplo durante 1 minuto.

- Incubar las muestras durante de 45 a 75 minutos, preferiblemente durante 60 minutos, a temperatura ambiente. - Agitar (por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] durante 1 minuto.

Etapa ib): Dilución

- Tomar una de las muestras de la etapa (a) y diluirla 1:1 con tampón pH —7,0 (por ejemplo, tampón Tris/HCI 50 mM pH ~ 7,0) (por ejemplo 895 pl de tampón Tris/HCI 50 mM 105 pil de muestra).

- Preparar preferiblemente dos muestras diluidas

- Por ejemplo:

- 2x anticuerpo 1:10 con tampón Tris/HCI (muestra)

- 2x anticuerpo con adiciones conocidas con 5,0 UE/ml 1:10 con tampón Tris/HCI (PPC)

- 2x agua para LAL 1:10 con tampón Tris/HCI (fondo)

- 2x agua para LAL 5,0 UE/ml 1:10 con tampón Tris/HCI (patrón)

- agua para LAL = por favor añadir

Etapa íc): Diálisis

- Agitar [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente, todas las muestras diluidas durante 1 minuto

- Transferirlas en el dializador (preferiblemente un SpinDIALYZER rápido)

- Poner un dializador por vaso de precipitados en un agitador

- Rellenar el vaso de precipitados con agua libre de endotoxina (por ejemplo 200 mi de agua destilada del fabricante B. Braun, Melsungen)

- Dializar 24 horas a temperatura ambiente e intercambiar el agua libre de endotoxina después de 2 horas y 4 horas - La frecuencia del agitador es preferiblemente de 50 a 300 rpm, más preferiblemente 200 rpm (especialmente si se usa un SpinDIALYZER rápido). El agitador tiene preferiblemente una longitud de 20-60 mM y un diámetro de 5-25 mm. Más preferiblemente, el agitador es un agitador magnético que tiene una longitud de aproximadamente 40 mm y un diámetro de aproximadamente 14 mm.

Etapa id): Agitación

- Después de la diálisis transferir las muestras en nuevos recipientes (por ejemplo en viales de rosca de 1,5 mi) y agitar [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] durante 20-60 min.

Etapa ídOOL Preparación del “control positivo de LER” y de controles de agua adicionales

1. (Etapa (dOO) no se tiene que realizar necesariamente después de la etapa (d). la etapa (dOO) puede realizarse en cualquier momento con la condición de que el “control positivo de LER” y los controles de agua adicionales estén listos cuando se inicia el ensayo de LAL). Preparar el “control positivo de LER” (es decir, el “control LER positivo”) preferiblemente 1 hora antes de que termine la diálisis [por ejemplo anticuerpo 900 pl 100 pl de CSE cono.

5,0 UE/ml = concentración final 5,0 UE/ml

- Preparar controles adicionales de agua, por ejemplo:

1. Anticuerpo 900 pl 100 pl de agua para LAL

2. agua para LAL 1000 pl

- agua para LAL 900 pl 100 pl de CSE cono. 5,0 UE/ml = concentración final 5,0 UE/ml

- Agitar 1 hora [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] - Diluir muestras 1:10 con agua libre de endotoxina

- Agitar durante 1 minuto [por ejemplo en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

Etapa fe): Ensayo de LAL

Preparar el patrón (es decir el patrón que está comprendido en el kit de ensayo de LAL usado (según las instrucciones del fabricante e iniciar la medición como sigue:

(1) Preparación del reactivo LAL (reactivo Kinetic-ACL®):

- Reconstituir la mezcla coliofilizada del lisado preparado de los amebocitos del cangrejo de herradura Limulus polyphemus, y el sustrato cromogénico con 2,6 mi de agua reactivo LAL por vial inmediatamente antes del uso. (2) Preparación de disolución madre de CSE (5,0 UE/ml, es decir equivalente a patrón S1):

- Reconstituir la preparación de CSE (£. coli 055:B5-LPS, cada vial contiene 50-200 UE de endotoxina liofilizada) en el volumen del agua de reactivo LAL señalada en el Certificado de Análisis y calculada para producir una disolución que contiene 50 UE(o Ul)/ml.

- Agitar la disolución madre de CSE vigorosamente durante al menos 15 minutos a alta velocidad en un agitador. - Antes del uso, dejar que la disolución se caliente a temperatura ambiente y agitar nuevamente de forma vigorosa a alta velocidad en un agitador durante 15 minutos.

(3) Preparación de la serie de patrones de CSE:

- Diluir la disolución madre de CSE/patrón S1 (etapa 1) con agua de reactivo LAL a temperatura en un esquema 1:10 para producir la serie completa de patrones de CSE (50, 5, 0,5, 0,05 y 0,005 UE/ml).

(4) Análisis LAL en un formato de lector de ELISA de microplaca de 96 pocilios:

- Dispensar cuidadosamente 100 pl del agua de reactivo LAL en blanco, patrones de endotoxina, muestras de producto, controles positivos de producto, en los pocilios apropiados de la microplaca.

- Colocar la placa rellena en el lector de microplaca, cerrar la tapa.

- Preincubar la microplaca durante > 10 minutos a 37°C ± 1°C.

- Usar una multipipeta de 8 canales para dispensar 100 pl del reactivo Kinetic-QCL® en todos los pocilios de la microplaca empezando con la primera columna (A1-H1) y proseguir en secuencia a la última columna usada. Añadir el reactivo tan pronto como sea posible (evitar burbujas de aire).

- Hacer inmediatamente clic en el botón OK en el teclado del ordenador para iniciar la prueba. (Nota: El ensayo Kinetic-QCL® se realiza con la cubierta de microplaca retirada).

En el presente documento, “adición conocida” significa “adición o “proporcionar con”. Por ejemplo, “adición conocida de una muestra con una cantidad conocida de CSE” significa “adición de una cantidad conocida de CSE a una muestra” o “proporcionar una muestra con una cantidad conocida de CSE”.

Las endotoxinas, también conocidas como lipopolisacáridos (LPS), son moléculas grandes encontradas en la membrana exterior de bacterias Gram negativas, y producen fuertes respuestas inmunitarias en animales, por ejemplo, en seres humanos. Como se menciona, la divulgación proporciona un método para determinar (es decir, detectar y cuantificar) endotoxina bacteriana en una muestra que comprende un anticuerpo, en donde el método comprende los etapas (a) a (d) descritas en el presente documento (preferiblemente también incluye los etapas (aOO), (a01) y (d00)).

En una realización, la endotoxina puede ser endotoxina de Escherichia coli. Por consiguiente, la endotoxina que se determina (es decir se detecta y/o cuantifica) en la etapa (d) del método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento puede ser endotoxina de E. coli. Por ejemplo, la endotoxina que se añade en la muestra durante el ensayo de LAL puede ser endotoxina de E. coli (es decir endotoxina purificada a partir de E. coli). Preferiblemente, la endotoxina es una endotoxina de E. coli comercialmente disponible (por ejemplo, endotoxina de patrón de control, CSE).

La endotoxina de patrón internacional (I.S.) de la OMS es una preparación de endotoxina a partir de E. coli 0113-H10:K-, que se reconoce internacionalmente como el calibrante final para las pruebas de endotoxinas bacterianas. El lote actual del patrón internacional se denomina “patrón internacional de la OMS, 3a I.S. para endotoxina”.

Una endotoxina de patrón de referencia (RSE) es una preparación de endotoxina que se ha calibrado contra la endotoxina de patrón internacional de la OMS. Se establecen RSE por agencias nacionales tales como USP, EP, JP, ChP) y se proporcionan para calibrar CSE (véase más adelante) para el uso en los ensayos LAL.

Una endotoxina de patrón de control (CSE) es una preparación de endotoxina diferente de RSE que se ha calibrado contra una RSE. Las CSE son preparaciones altamente purificadas específicas del vendedor, de endotoxinas, que se producen de E. coli O113-H10:K-(por ejemplo Associates of Cape Cod, Inc.) u otras cepas de E. coli tales como E. coli 055:B5 (por ejemplo Charles River, Lonza). Los vendedores pueden añadir estabilizadores tales como albúmina de suero humano, PEG, o almidón bajo su propio juicio. Se proporcionan CSE a diversas concentraciones, dependiendo de su uso propuesto.

El método proporcionado en el presente documento para determinar (es decir detectar y/o cuantificar) endotoxina en una muestra que comprende un anticuerpo; o el método proporcionado en el presente documento para la preparación de una muestra que comprende un anticuerpo tiene el efecto ventajoso que evita el efecto de LER en el ensayo de LAL. De esta manera, un aspecto de la invención se refiere al uso del método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento o el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento para superar el efecto de LER en la determinación de endotoxina bacteriana en un ensayo de LAL. Más específicamente, el método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento o el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento tienen el efecto ventajoso que estos métodos vuelven a la muestra que comprende un anticuerpo que muestra un efecto de LER, reactiva al factor C en la cascada enzimática de LAL. De esta manera, un aspecto de la invención se refiere al uso del método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento o el método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento para volver a la muestra que comprende un anticuerpo que muestra un efecto de LER, reactiva al factor C en la cascada enzimática de LAL.

En el presente documento, el término “determinación”, en particular en el contexto de “determinación de endotoxina bacteriana” o variaciones gramaticales de lo mismo se refiere a la detección y/o cuantificación de endotoxina, preferiblemente a la detección y cuantificación de endotoxina. En el contexto de la presente invención, endotoxina (por ejemplo, endotoxina de E. coli tal como CSE) se determina preferiblemente por un ensayo de LAL.

El término “prueba de endotoxinas bacterianas” o “prueba de endotoxina bacteriana” se usan de manera indistinta en el presente documento y se refieren a un grupo de pruebas para detectar o cuantificar endotoxinas de bacterias Gram negativas. La BET describe el ensayo de LAL de compendio (es decir relacionado con un compendio que sirve como una norma, tal como la farmacopea europea o norteamericana, u otra norma farmacéutica nacional o internacional) (ensayo de Usado de amebocitos de Limulus). Además, en el contexto de la divulgación, se prefiere que el valor de pH de la muestra que se somete a prueba durante el ensayo de LAL sea de 5,07-8,0, preferiblemente 6,0-8,0, más preferiblemente 6,5-7,5.

El término “ensayo de LAL” se conoce comúnmente en la técnica y representa una prueba de endotoxina in vitro para fármacos parenterales de humano y animal, productos biológicos y dispositivos médicos. En particular, el ensayo de LAL es una prueba para detectar y cuantificar endotoxinas de bacterias Gram negativas usando el Usado de amebocitos del cangrejo de herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus). Por ejemplo, durante la reproducción de células bacterianas, división celular, muerte regresiva de vegetación y lisis celular, se liberan moléculas de LPS de la superficie de células bacterianas de una manera más bien descontrolada e inespecífica. El LPS liberado representa una toxina bacteriana potente y es principalmente responsable de la manifestación tóxica de infecciones graves con bacterias Gram negativas y efectos perjudiciales (por ejemplo, fiebre alta, hipotensión y choque irreversible) (Rietschel, 1994, FASEB J. 8:217-225). El componente del lípido A es responsable de esta actividad biológica de LPS. En disoluciones salinas diluidas, LPS forman agregados macromoleculares (micelas). La formación, tamaño y dinámica de estas micelas se correlaciona con la concentración de LPS, diversos parámetros fisicoquímicos (tales como temperatura, concentración del tampón (concentración iónica) y pH) así como la estructura de la cadena O, que es el oligosacárido núcleo del lí pido A (Aurell, 1998, Biochem. Biophys. Res. Comm.

253:119-123). El resto de lípido A de LPS, que está altamente conservado entre todas las bacterias Gram negativas, es aquella parte de la molécula de LPS que se reconoce por el ensayo de LAL, volviendo a esta prueba una norma de oro y un procedimiento adecuado para investigar la contaminación por endotoxina de una entidad amplia de fuentes bacterianas Gram negativas (Takada (1988) Eur. J. Biochem; 175:573-80).

Los principios del ensayo de LAL se describen como sigue. En el ensayo de LAL, la detección de LPS tiene lugar mediante gelificación del LAL. Esta actividad activadora de LAL de LPS se ve afecta por una variedad de factores: - formación de agregados de LPS-LPS [Akama, 1984, en “Bacterial Endotoxin” (Eds. J. Y. Homma, S. Kanegasaki, O. Lüderitz, T. Shiba y O. Westphal], Publisher Chemie)

- formación de agregados de proteína-LPS, por ejemplo con lipoproteínas humanas Apo A 1, lisozima, ribonucleasa A o IgG humana (Emancipator, 1992, Infect Immun. 60:596-601; Petsch, 1998, Anal. Biochem. 259:42-47)

- el método de extracción de LPS a partir de células bacterianas (Galanos, 1984, en “Bacterial Endotoxin” (Eds. J. Y. Homma, S. Kanegasaki, O. Lüderitz, T. Shiba y O. Westphal), Publisher Chemie]

- las especies bacterianas; la actividad activadora de LAL dentro de Enterobacteriaceae varía en un factor de 1000 [Niwa, 1984, en “Bacterial Endotoxin” (Eds. J. Y. Homma, S. Kanegasaki, O. Lüderitz, T. Shiba and O. Westphal), Publisher Chemie],

El ensayo de LAL se armoniza entre las farmacopeas en los Estados Unidos (US), Europa (EP) y Japón (JP). En los capítulos de las farmacopeas armonizadas (USP <85>, Farm. Eur. 2,6.14., y JP 4.01), se describen tres técnicas para el ensayo de LAL:

- técnica de coágulo en gel (con base en formación de gel inducida por endotoxina)

- técnica turbidimétrica (con base a la turbidez inducida por la formación de gel)

- técnica cromogénica (con base a la coloración después de la división de un complejo de péptido sintéticocromógeno).

Estas tres técnicas se aplican a su vez en 6 diferentes métodos:

Método A: método de coágulo en gel, prueba límite

Método B: método de coágulo en gel, prueba semicuantitativa

Método C: método turbidimétrico cinético

Método D: método cromogénico cinético

Método E: método cromogénico de punto final

Método F: método turbidimétrico de punto final

Según la Farm. Eur./USP/JP estos seis métodos se van a ver como equivalentes.

Un aspecto prioritario de la presente divulgación se refiere al método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento y al método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento, en donde el método cromogénico cinético o el método turbidimétrico cinético se usa para la determinación de endotoxina bacteriana en la muestra. Más preferiblemente, el método cromogénico cinético se usa en el método de preparación de muestra proporcionado en el presente documento y método de determinación de endotoxina proporcionado en la presente. Usando esta técnica, puede detectarse de manera fotométrica la endotoxina. Esta técnica es un ensayo para medir el cromóforo liberado de un sustrato cromogénico (es decir, un péptido cromogénico adecuado) por la reacción de endotoxinas con LAL. El ensayo cromogénico cinético es un método para medir o bien el tiempo (tiempo de comienzo) necesario para alcanzar una absorbancia predeterminada de la mezcla de reacción, o bien la velocidad de desarrollo de color. La prueba se lleva a cabo a la temperatura de incubación recomendada por el fabricante del Usado (que usualmente es de 37 ± 1°C. Por ejemplo, para realizar el ensayo de LAL cromogénico cinético, puede mezclarse una muestra con un reactivo que comprende LAL y un sustrato cromogénico (es decir, un péptido cromogénico adecuado tal como Ac-lle-Glu-Ala-Arg-pNA y se coloca en un lector de placa de incubación. Entonces, la muestra se monitoriza a lo largo del tiempo para determinar la aparición de un color (por ejemplo, un color amarillo). El tiempo requerido antes de la aparición de un color (tiempo de reacción) es inversamente proporcional a la cantidad de endotoxina presente. Es decir, en presencia de una gran cantidad de endotoxina la reacción se produce rápidamente; en presencia de una cantidad más pequeña de endotoxina, se aumenta el tiempo de reacción. La concentración de endotoxina en muestras desconocidas puede calcularse a partir de una curva patrón. Durante el ensayo de LAL, es decir, en la etapa (d) del método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento, la cuantificación de endotoxina se lleva a cabo preferiblemente mediante una curva de calibración patrón, que cubre un intervalo de al menos dos órdenes de magnitud (en un aspecto de la invención 0,005, 0,05, 0,5, 5,0 y 50,0 UE/ml).

Por ejemplo, durante la técnica LAL cromogénica cinética, pueden tener lugar las siguientes reacciones. La endotoxina bacteriana Gram negativa cataliza la activación de una proenzima en el LAL. La velocidad inicial de activación se determina por la concentración de endotoxina presente. La enzima activada cataliza la división de pnitroanilina (pNA) del sustrato incoloro Ac-lle-Glu-Ala-Arg-pNA. El pNA liberado se mide de manera fotométrica, a 405 nm continuamente en la totalidad del periodo de incubación. La concentración de endotoxina en una muestra se calcula a partir de su tiempo de reacción por comparación con el tiempo de reacción de disoluciones que contienen cantidades conocidas de patrón de endotoxina. Para el ensayo de LAL, puede usarse el kit “Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Kinetic-QCL™” de LONZA (número de catálogo: 50-650U, 50-650NV, 50-650H; K50-643L, K50-643U) según las instrucciones del fabricante. Realizando el ensayo de LAL se contempla usar la endotoxina, que está comprendida en el kit usado (por ejemplo endotoxina 055:B5 de E. coli, que está comprendida en el kit “Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Kinetic-QCL™” de LONZA, número de catálogo: 50-650U, 50-650NV, 50-650H; K50-643L, K50-643U).

En el contexto de la divulgación, se prefiere que el valor de pH de la muestra que va a someterse a prueba durante el ensayo de LAL sea de 5,7-9,0. Más preferiblemente, el valor de pH de la muestra que va a someterse a prueba durante el ensayo de LAL es de 5,8-8,0, más preferiblemente de pH 5,8-7,5, de manera aún más preferible de pH 5,8-7,0. Más preferiblemente, el valor de pH de la muestra que va a someterse a prueba durante el ensayo de LAL es de 5,8-7,0. Por ejemplo, el valor de pH de la muestra que va a someterse a prueba durante el ensayo de LAL puede ser pH 5,7, pH 5,8, pH 5,9, pH 6,0, pH 6,1, pH 6,2, pH 6,3, pH 6,4, pH 6,5, pH 6,6, pH 6,7, pH 6,8, pH 6,9, o pH 7,0. De esta manera, se contempla en el contexto de la divulgación que antes del ensayo de LAL, el valor de pH de la disolución de prueba (es decir una muestra líquida o muestra sólida disuelta) se ajuste para estar entre pH 5,7-8,0, más preferiblemente entre pH 5,8 y pH 7,0. Si es necesario, el valor de pH va a ajustarse por ejemplo por dilución, adición de tamponesy/o neutralización.

Varias sustancias (tales como |3-glucano) interfieren con la prueba de LAL en algún grado (siendo la excepción obvia muestras de agua). La interferencia puede ser inhibición o potenciamiento del ensayo de LAL. En particular, los factores de interferencia pueden o bien potenciar o bien disminuir la cuantificación de LPS obtenida de la prueba de LAL, y por lo tanto la cuantificación de la endotoxina. Por lo tanto, si en la etapa (d) del método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento, la recuperación del PPC no está en el intervalo aceptable del 50-200%, se debe retirarse el factor de interferencia. Esto puede hacerse por dilución de muestra en la etapa (b) del método proporcionado en el presente documento. En particular, la muestra puede diluirse con agua libre de endotoxina o tampón libre de endotoxina (preferiblemente con tampón Tris/HCI, pH —7,0). La dilución de muestra más baja (la concentración más alta de producto) que carece de inhibición/potenciamiento se denomina “concentración de no interferencia (NIC)”. Sin embargo, durante la dilución de la muestra, no puede excederse la MVD (dilución válida máxima = dilución máxima posible de una muestra en la cual puede determinarse un límite de endotoxina). En particular, basándose en los resultados de prueba de los diferentes lotes, se elige una dilución de muestra que cubra todos los lotes (dilución de muestra validada o concentración de muestra). O, en otras palabras, la dilución de muestra que da como resultado una recuperación del 50-200% en el PPC se elige en la etapa (b) de los métodos proporcionados en el presente documento. Para establecer que el tratamiento elegido elimine de manera efectiva la interferencia sin pérdida de endotoxinas (es decir sin que muestre el efecto de LER) la “prueba para factores de interferencia” puede realizarse usando una muestra que se añade con una concentración definida de endotoxina (es decir un PPC).

Por consiguiente, un aspecto de la divulgación se refiere al método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento, en donde se prepara un PPC y se somete a prueba para determinar endotoxina en la etapa (d) del método de determinación de endotoxina proporcionado en el presente documento. La muestra está libre de factores de interferencia si la recuperación del patrón de control de endotoxina con adiciones conocidas alcanza el 50-200%.

Debido al hecho que la BET según la USP/Farm. Eur./JP que incluye un control interno (PPC) que permite la valoración de cada resultado de prueba de forma individual, la validación del método BET según la USP/Farm. Eur./JP no es un prerrequisito para resultados correctos de endotoxinas.

El término “recuperación baja de endotoxina (LER)” o “efecto de LER” se conoce en la técnica y describe el enmascaramiento de endotoxina provocado específicamente por una combinación de polisorbato más o bien citrato o bien fosfato (Chen, J. y Williams, K. L., PDA Letter 10, 2013, 14-16). El enmascaramiento de endotoxina también puede provocarse por cualquier otro componente de tampón o combinaciones del mismo. Para identificar que un material dado (por ejemplo un tampón o una muestra de un anticuerpo terapéutico) muestre el efecto de LER, puede monitorizarse el contenido de endotoxina a lo largo del tiempo, por ejemplo, en un estudio de tiempo de retención de endotoxina. Los estudios de tiempo de retención de endotoxina requieren adición conocida con endotoxina de una muestra no diluida y almacenamiento de la muestra con adiciones conocidas con endotoxina a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la muestra puede almacenarse hasta varios. Preferiblemente, en un estudio de tiempo de retención, la muestra con adiciones conocidas con endotoxina se almacena durante varios días (por ejemplo de 7 hasta 28) y en puntos de tiempos definidos, se realiza un ensayo de LAL. Las tasas de recuperación que son menores del 50% de la cantidad de la endotoxina con adiciones conocidas indican que la muestra presenta un efecto de LER. Si la recuperación de endotoxina es menos del 50% pero sólo se produce en cualquiera de los puntos de tiempo intermedios pero no en los puntos de tiempo finales, la muestra no puede considerarse que muestre un efecto de enmascaramiento.

Durante los últimos años, la FDA ha reconocido bien el fenómeno de LER y ha emitido guía (véase Hughes, P., et al., BioPharm. Asia marzo/abril de 2015, 14-25). Esta guía define los límites aceptables de recuperación de endotoxina en muestras farmacéuticas para que oscilen entre el 50 y el 200% una vez que se añade una cantidad definida de CSE a la muestra no diluida antes (por Ejemplo 5.0 UE/ml = 100%). En el caso de que una muestra que va a someterse a prueba muestre el efecto de LER, la tasa de recuperación de la endotoxina con adiciones conocidas está por debajo del 50% de la cantidad total de la endotoxina con adiciones conocidas.

En los métodos proporcionados en el presente documento, la muestra comprende un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. En el presente documento, los términos “muestra”, “muestra que va a someterse a prueba”, “muestra que comprende un anticuerpo” y “muestra que comprende un anticuerpo que va a someterse a prueba” se usan de manera indistinta y se refieren a una determinada cantidad de líquido que comprende un anticuerpo que va a someterse a prueba para determinar la presencia y/o cantidad de endotoxina. O, en otras palabras, los términos “muestra”, “muestra que va a someterse a prueba”, “muestra que comprende un anticuerpo” y “muestra que comprende un anticuerpo que va a someterse a prueba” se usan de manera indistinta en el presente documento y se refieren a un líquido que va a someterse a prueba para la determinar la presencia y/o cantidad (preferiblemente para determinar la presencia y cantidad) de endotoxina, en donde dicho líquido comprende un anticuerpo. Dicha “muestra que comprende un anticuerpo que va a someterse a prueba” es preferiblemente una muestra de un anticuerpo terapéutico. El término “anticuerpo terapéutico” se refiere a cualquier preparación de anticuerpo que se pretende para el uso en un ser humano. El anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo terapéutico) se formula preferiblemente con polisorbato 80 o tampón citrato de sodio, más preferiblemente con polisorbato 80 y tampón citrato de sodio. Más preferiblemente, el anticuerpo se formula con un tampón citrato de sodio de aproximadamente 25 mM y polisorbato 80 de aproximadamente 700 mg/l y tiene un valor de pH de aproximadamente 6,5. Se prefiere en el contexto de la presente divulgación que el anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo terapéutico) sea un anticuerpo monoclonal. Más preferiblemente, el anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo terapéutico) es el anticuerpo anti-CD20 rituximab. De esta manera, en el contexto de la divulgación, la muestra puede ser una muestra de MabThera®/Rituxan®Zytux®. Se contempla en el contexto de la divulgación que la muestra que va a someterse a prueba (es decir la muestra que comprende un anticuerpo que va a someterse a prueba) muestre/presente el efecto de LER.

En el presente documento, el término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo, siempre que muestren la actividad biológica deseada. También están comprendidos anticuerpos humanos, humanizados, camélidos o injertados con CDR.

El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales de la población de anticuerpos son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un sitio antigénico individual. Adicionalmente, en cambio con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopo), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante individual en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que pueden sintetizarse sin contaminar por otros anticuerpos. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no ha de interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que están comprendidos en la muestra de los métodos de la presente divulgación pueden producirse por el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler, G. et. al., Nature 256 (1975) 495, o pueden producirse por métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.816.567).

Los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento se producen preferiblemente por la expresión en una célula huésped, más preferiblemente en una célula de ovario de hámster chino (CHO). Para la producción de ácido nucleico aislado que codifique para un anticuerpo que codifique para una secuencia de aminoácidos que comprenda la secuencia VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprenda la VH del anticuerpo (por ejemplo las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo) se inserta en uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión). Éstos se introducen en la célula huésped. La célula huésped comprende (por ejemplo se ha transformado con: (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. La célula huésped puede ser eucariota, por ejemplo, célula de ovario de hámster chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo célula YO, NS0, Sp20).

Para la producción recombinante de anticuerpos, el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla y se inserta en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Este ácido nucleico puede aislarse fácilmente y secuenciarse usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótido que pueden unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para clonación o expresión de vectores que codifican para el anticuerpo incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos en bacterias, en particular cuando no se necesitan glicosilación y función efectora Fe. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo los documentos US 5.648.237, US 5.789.199, y US 5.840.523. (Véase también Charlton, K.A., en: Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), págs. 245-254, que describen la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. cotí). Después de la expresión, el anticuerpo puede aislarse de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente.

Además de las procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes adecuados de clonación o expresión para vectores que codifican para el anticuerpo, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas rutas de glicosilación se han “humanizado”, dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcialmente o completamente humano. Véase Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células invertebradas incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovirales que pueden usarse junto con células de insecto, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También pueden utilizarse cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse por ejemplo los documentos US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978, y US 6.417.429 (que describe tecnología Plantibodies® para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También pueden usarse células de vertebrados como huéspedes. Por ejemplo, las líneas de células de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por CV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 como se describe, por ejemplo, en Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células de riñón de hámster neonato (BHK); células Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5, y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células DHFR-CHO (Urlaub, G. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); y líneas de células de mieloma tales como YO, NS0 y SP2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase por ejemplo Yazaki, P. y Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), págs. 255-268.

Los “fragmentos de anticuerpo” comprenden una porción de un anticuerpo intacto. El término “fragmentos de anticuerpo” incluye porciones de unión a antígeno, es decir, “sitios de unión a antígeno” (por ejemplo, fragmentos, subsecuencias, regiones determinantes de complementariedad (CDR)) que retienen la capacidad de unirse a un antígeno (tal como CD20), que comprende o que consiste alternativamente en, por ejemplo, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (¡i) un fragmento F(ab')2, un fragmento divalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región de bisagra; (i¡¡) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward; 1989; Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Los fragmentos de anticuerpo o derivados comprenden además fragmentos F(ab’)2, Fv o svFv o anticuerpos de cadena individual.

Preferiblemente, en los métodos proporcionados en el presente documento, el anticuerpo (es decir, el anticuerpo que está comprendido en la muestra) es rituximab.

El término “rituximab” (nombres comerciales MabThera®, Rituxan®, Zytux®) se refiere a un anticuerpo monoclonal quimérico contra la proteína CD20. CD20 se encuentra en la superficie de células B normales y cancerosas. Rituximab destruye células B y por lo tanto se usa, por ejemplo, para tratar enfermedades que se caracterizan por números excesivos de células B, células B sobreactivas o células B disfuncionales. Esto incluye muchos linfomas, leucemias, rechazos de trasplante y trastornos autoinmunitarios. Por ejemplo, rituximab se usa en leucemia linfocítica crónica como una formulación subcutánea. Sin embargo, rituximab se administra usualmente por infusión intravenosa. Las células madre en la médula ósea no tienen la proteína CD20 que permite que las células B se repueblen después del tratamiento con rituximab. Como se usa en el presente documento, el término “rituximab” también abarca todos los anticuerpos anti-CD20 o fragmentos de anticuerpo anti-CD20 que cumplen con los requisitos necesarios para obtener una autorización de comercialización en un país o territorio seleccionado del grupo de países que consiste en los EE.UU, Europa y Japón. Preferiblemente, el término “rituximab” se refiere a un anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera como se muestra en SEQ ID NO 1 y 2, respectivamente. La persona experta en la técnica conoce fácilmente cómo obtener una secuencia de ácido nucleico codificante a partir de una secuencia dada de aminoácidos. De esta manera, con el conocimiento de SEQ ID NO 1 y 2, pueden obtenerse fácilmente secuencias codificantes de ácido nucleico de rituximab.

El nombre comercial “NeoRecormon®” se refiere a una formulación farmacéutica que contiene como principio activo epoetina beta. La epoetina beta es una versión sintética de la eritropoyetina, hormona que se produce de manera natural. Los riñones saludables producen eritropoyetina y ésta estimula la médula ósea para que produzca glóbulos rojos, que transportan oxígeno alrededor del cuerpo. También se usa epoetina beta para tratar anemia sintomática en personas con determinados tipos de cánceres que se están sometiendo a quimioterapia. Uno de los efectos secundarios de la quimioterapia es que destruye las células sanguíneas saludables así como las células cancerosas. Las inyecciones de epoetina aumentan la producción de glóbulos rojos y ayudan a aliviar los síntomas de la anemia. Puesto que la epoetina aumenta la producción de células sanguíneas, puede extraerse un volumen mayor de sangre de personas que reciben epoetina y esta sangre puede almacenarse para transfusión durante o después de la cirugía.

En la etapa (d) del método de preparación de muestra o del método de determinación de endotoxina, proporcionados en el presente documento, la muestra (es decir, la muestra que comprende un anticuerpo) se dializa contra una disolución acuosa libre de endotoxina, en donde la muestra tiene un valor de pH entre pH 5,7 y pH 8,0 (preferiblemente entre pH 6,0 y 8,0, más preferiblemente entre 6,5 y 7,5). En bioquímica, la diálisis es un proceso comúnmente usado de separación de moléculas en disolución por la diferencia en sus velocidades de difusión a través de una membrana semipermeable, tal como tubo de diálisis. La diálisis es una técnica común de laboratorio que opera por el mismo principio que la diálisis médica. En el contexto de la investigación de ciencias de vida, la aplicación más común de la diálisis es la retirada de moléculas pequeñas indeseadas tal como sales, agentes reductores o tintes de macromoléculas más grandes tales como anticuerpos. La diálisis también se usa comúnmente para intercambio de tampón y estudios de unión de fármacos.

La difusión es el movimiento térmico aleatorio de moléculas en disolución (movimiento browniano) que conduce al movimiento neto de moléculas de un área de mayor concentración a un área de menor concentración hasta que se alcanza el equilibrio. En la diálisis, una muestra y una disolución de tampón (llamada el dializado) se separan por una membrana semipermeable que provoca patrones de difusión diferencial, permitiendo de este modo la separación de moléculas tanto en la muestra como en el dializado. Debido al tamaño de poro de la membrana, las moléculas más grandes en la muestra (por ejemplo anticuerpos) no pueden pasar a través de la membrana, restringiendo de este modo su difusión de la cámara de muestra. En cambio, moléculas pequeñas (por ejemplo los componentes de un tampón citrato de sodio) se difundirán libremente a través de la membrana y obtendrán el equilibrio a través del volumen completo de disolución, cambiando de este modo la concentración global de estas moléculas en la muestra y dializado. Una vez que se alcanza el equilibrio, la concentración final de las moléculas es dependiente de los volúmenes de las disoluciones implicadas y si se reemplaza el dializado equilibrado (o se intercambia) con dializado nuevo (véase el procedimiento posterior), la difusión reducirá adicionalmente la concentración de las moléculas pequeñas en la muestra.

Por ejemplo, puede usarse el siguiente procedimiento de diálisis para retirar tampón citrato de sodio de la muestra (es decir, de la muestra que comprende el anticuerpo :

1. Obtener y lavar una membrana con un corte de peso molecular de 10 kDa

2. Cargar la muestra en el tubo, casete o dispositivo de diálisis

3. Colocar la muestra en una cámara externa con el dializado (con agitación del tampón)

4. Dializar durante 24 horas a temperatura ambiente; cambiar el agua dos veces durante las 24 horas.

Al usar el volumen apropiado de dializado y múltiples intercambios del tampón, la concentración del tampón citrato de sodio dentro de la muestra puede disminuirse a niveles insignificantes (es decir el 1-2% del contenido original). La presente divulgación se describe adicionalmente con referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitativos. En las figuras así como en los ejemplos, la mayoría de los ejemplos descritos se indican por números definidos. Por ejemplo, la designación [rituximab 117] significa que el experimento se realizó con rituximab formulado y/o con placebo de rituximab formulado y tiene el número de referencia “117”.

Descripción de las figuras

Figura 1: Dependencia en el tiempo de la diálisis de NeoRecormon® que contiene fosfato y polisorbato 20 usando un MWCO de 12-16 kDa. Se muestra el peso del dializado interior obtenido después del tiempo indicado de diálisis a temperatura ambiente, liofilización y pesado. Los datos en la parte superior de las barras grises muestran la cantidad promedio de 2 mediciones (%).

Figura 2: Diálisis de NeoRecormon® que contiene fosfato y polisorbato 20 usando una membrana MWCO de 12-16 kDa tratada con o sin albúmina de suero bovino (BSA) antes de la diálisis. Se muestra el contenido de fosfato (P) en el dializado interior obtenido después del tiempo indicado. Las barras a la izquierda muestran la cantidad de P cuando la membrana se trató con BSA al 0,2% antes de la diálisis. Las barras a la derecha corresponden a la cantidad de P sin tratamiento con BSA. La prueba fotométrica del fosfato recuperado del dializado interior se realizó según Strominger (1959, J. Biol. Chem. 234: 3263-3267).

Figura 3: Tasas (%) de recuperación de [Rituximab 115] y [Rituximab 117] obtenidas realizando el protocolo para superar el efecto de LER como se describe en el ejemplo 2.1 usando (A) rituximab y (B) placebo de rituximab como muestra. En las figuras “giro rápido” y “giro lento” significa la frecuencia del agitador (es decir, “giro rápido” significa que la frecuencia del agitador es alta). Este protocolo a modo de ejemplo también es útil para control de calidad de rutina de otras muestras, preferiblemente para espécimen que contiene tampón citrato de sodio y polisorbato 80 como detergente.

Figura 4: Representación esquemática de un protocolo modificado para superar el efecto de LER y tasas de recuperación obtenidas realizando el protocolo. (A) Representación esquemática de un protocolo según la invención para superar el efecto de LER (por ejemplo en rituximab y placebo de rituximab). El protocolo detallado se describe en el ejemplo 2.2. Este protocolo a modo de ejemplo también es útil para control de calidad de rutina de otras muestras, preferiblemente para espécimen que contiene tampón citrato de sodio y polisorbato 80 como detergente. (B) Tasa (%) de recuperación de [rituximab 046] rituximab y placebo de rituximab obtenidas por el ensayo LER después de realizar el protocolo según la figura 4(A). Para detalles adicionales, véase el protocolo descrito en el ejemplo 2.2.

Figura 5: Tasas (%) de recuperación de [rituximab 059] obtenidas realizando el protocolo como se describe en el ejemplo 2 de referencia usando rituximab como muestra.

Figura 6: Tasas (%) de recuperación obtenidas realizando el protocolo como se describe en el ejemplo 3 de referencia usando rituximab como muestra. Tasas de recuperación obtenidas realizando el protocolo como se describe en el ejemplo 2.2 de referencia [rituximab 061],

Figura 7: Tasas de recuperación (%) obtenidas realizando el protocolo como se describe en el ejemplo 4 de referencia usando rituximab como muestra. (A) Tasas de recuperación obtenidas realizando el protocolo como se describe en el ejemplo 3.1 de referencia [rituximab 062], (B) Tasas de recuperación obtenidas realizando el protocolo como se describe en el ejemplo 3.2 de referencia [rituximab 063],

Figura 8: Tasas (%) de recuperación obtenidas realizando el protocolo como se describe en el ejemplo 5 de referencia usando rituximab como muestra. (A) Tasas de recuperación obtenidas realizando el protocolo como se describe en el ejemplo 4.1 de referencia [rituximab 064], (B) Tasas de recuperación obtenidas realizando el protocolo como se describe en el ejemplo 4.2 de referencia [rituximab 065],

Figura 9: Tasas (%) de recuperación obtenidas realizando el protocolo como se describe en el ejemplo 6 de referencia usando rituximab y placebo de rituximab como muestra [rituximab 072],

Figura 10: Tasas (%) de recuperación obtenidas realizando el protocolo como se describe en el ejemplo 7 de referencia usando rituximab y placebo de rituximab como muestra. (A) [Rituximab 079] sin incubación; (B) [rituximab 080] 4 horas de incubación; (C) [rituximab 081] 1 día de incubación; (D) [rituximab 082] 3 días de incubación.

Figura 11: Tasas (%) de recuperación obtenidas realizando el ensayo de LAL como se describe en el ejemplo 8 de referencia usando rituximab como muestra. (A) [Rituximab 002] ensayo de LAL con diferentes disoluciones; (B) [rituximab 004] comparación de Lonza y adición conocida de CSE de ACC; (C) [rituximab 005] ensayo de LAL con diferentes disoluciones y ajuste de pH.

Figura 12: Tasas (%) de recuperación obtenidas realizando el ensayo de LAL como se describe en el ejemplo 8 de referencia usando rituximab como muestra. Diálisis y dilución solas no superan el efecto de LER [rituximab 011]. Figura 13: Dependencia en el tiempo del efecto de LER. La figura muestra las tasas (%) de recuperación obtenidas realizando la adición conocida y el ensayo de LAL como se describe en el ejemplo 1 de referencia usando rituximab como muestra [rituximab 027], Se indica el tiempo de agitación después de la adición conocida (es decir de 2 segundos a 60 minutos).

Figura 14: Importancia del sistema de tampón en el efecto de LER. Se muestran tasas (%) de recuperación obtenidas realizando el ensayo de LAL como se describe en el ejemplo 10 de referencia. (A) Ensayo de LAL cuando se usan rituximab o citrato de sodio como muestra y se diluyen a una razón de 1:1, 1:5, 1:10, o 1:20 [rituximab 006]; (B) ensayo de LAL cuando se usan citrato de sodio; polisorbato 80 o citrato de sodio y polisorbato 80 como muestra y se diluye a una razón de 1:2, 1:5 o 1:10 [rituximab 029],

Figura 15: Efecto de MgCL en el efecto de LER. Se muestran tasas (%) de recuperación obtenidas realizando el ensayo de LAL como se describe en el ejemplo 13 de referencia. (A) Adición de MgCL a una concentración de 10 mM [rituximab 030]; (B) adición de MgCL a una concentración de 50 mM [rituximab 031]; (C) adición de MgCL a una concentración de 25 mM [rituximab 032]; (D) adición de MgCL a una concentración de 75 mM [rituximab 033], Figura 16: Efecto de tratamientos mecánicos sobre el efecto de LER. Se muestran tasas (%) de recuperación obtenidas realizando el ensayo de LAL como se describe en el ejemplo 14 de referencia [rituximab 034], En la figura, “con agitación” significa agitado durante 60 minutos.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ayudar en el entendimiento de la presente invención, el verdadero alcance de la cual se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1: Equipo técnico y reactivos

1. Equipo técnico

1.1 Sistema de lector de microplaca (también denominado en el presente documento “lector”)

- Lector de microplaca multimodo Infinite® 200 PRO; Tecan, Suiza/Tecan Deutschland GmbH, Alemania, P/N: 30050303.

- Software Magellan V. 7.1.

- Placas de cultivo celular Costar™, 96 pocilios, Fisher Scientific, P/N: 07-200-89.

1.2 Sistema de agitador y viales de vidrio

- Multi Reax; Heidolph, Alemania, P/N: 545-10000-00.

- Viales de vidrio de cuello roscado de 1,5 mi (N8); Macherey-Nagel GmbH & Co. RU, Alemania, P/N: 702004 (cantidad de 100).

- Tapa roscada N 8 PP, negra, parte superior cerrada; Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Alemania, P/N: 70250 (cantidad de 100).

- Viales de vidrio de cuello roscado de 4 mi (N13); Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Alemania, P/N: 702962 (cantidad de 100).

- Tapa roscada N 13 PP, negra, parte superior cerrada; Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Alemania, P/N: 702051 (cantidad de 100).

1.3 Equipo de diálisis

- SpinDIALYZER®, volumen de cámara 1000 pl; Harvard Apparatus, EE.UU., P/N 740314 (cantidad de 1) y 740306 (cantidad de 5), distribuidor local: Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus, GmbH, Alemania, P/N SP1 74-0306 (cantidad de 5). Nota: uso de n.° de lote: 032613.

El dializador es un dispositivo simple de un solo lado para diálisis de muestras biológicas. Están disponibles una amplia variedad de tamaños de dializador para ajustar los volúmenes de muestra que oscilan entre 20 pl y 5 mi. El número de catálogo para 1 mi (como se usa en el presente documento) es 74-0314. El MWCO de la membrana oscila entre 100 y 300.000 Da. La unidad completa se construye de PTFE, un material prácticamente no reactivo. - SpinDIALYZER rápido, volumen de cámara 1000 pl, Harvard Apparatus, EE.UU., P/N 740510 (cantidad de 1) o 740504 (cantidad de 5), nota: sistema de membrana de dos lados, parte superior más membrana de fondo.

El dializador es una cámara de muestra reutilizable de PTFE para alta recuperación de muestra y se ha rediseñado para proporcionar mayores áreas de superficie de membrana para una velocidad aún más rápida de diálisis. Los dializadores ultra rápidos son de 50 pl a 1500 pl de volumen y se han usado en este caso con 1000 pl. El número de catálogo para 1 mi (como se usa en el presente documento) es 74-0412.

- Membranas de acetato de celulosa, MWCO de 500 Da, Harvard Apparatus, EE.UU., P/N SPI 7425-CA500, distribuidor local: Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH, Alemania, P/N: SP1 7425-CA500.

- Membranas de acetato de celulosa, MWCO de 10 kDa, Harvard Apparatus, EE.UU., P/N SPI 7425-CA10K, distribuidor local Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH, Alemania, P/N: SP17425-CA10K.

Nota: sometidas a prueba además de las membranas MWCO de 500 Da “convencionales” en investigaciones de LER en rituximab así como en los experimentos de LER en NeoRecormon®.

- Membranas de acetato de celulosa, MWCO de 25 kDa, Harvard Apparatus, EE.UU., P/N SPI 7425-CA25K, distribuidor local: Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH, Alemania, P/N: SP1 7425-CA25K.

Nota: sometidas a prueba además de las membranas de MWCO de 500 Da “convencionales” en investigaciones de LER rituximab así como en los experimentos de LER en NeoRecormon®.

- Agua libre de pirógenos, estéril Aqua B. Braun, 1 I, B. Braun Melsungen AG, Alemania, P/N: 14090586.

- Cajas de cristalización, 900 mi, OMNILAB, Alemania P/N: 5144008. (Nota: Uso para aclarado de membranas de diálisis).

- Vasos de precipitados DURAN®, forma alta, 2000 mi, OMNILAB, Alemania P/N: 5013163.

- Vasos de precipitados DURAN®, forma alta, 250 mi, OMNILAB, Alemania P/N: 5013136.

1.4 Experimentos de laboratorio de rutina

- Sistema de autoclave (nota: uso para esterilización de cámaras de diálisis).

- epT.l.P.S.® LoRetention-Reloads, PCR limpio, 0,5-10 pl, Eppendorf, Alemania, P/N: 0030072,057

- epT.l.P.S.® LoRetention-Reloads, PCR limpio, 2-200 pl, Eppendorf, Alemania, P/N: 0030072,022

- epT.l.P.S.® LoRetention-Reloads, PCR limpio, 50-1000 pl, Eppendorf, Alemania, P/N: 0030072,030

- Stripettes®, Individual, 5 mi, envoltura de papel/plástico, Fisher Scientific, P/N: 10420201.

2. Reactivos

2.1 Ensayos LAL cromogénicos cinéticos y reactivos asociados a LAL

- Kit Kinetic-QCL®; Lonza, Suiza, P/N: 50-650U o 50-650H (es decir kit “Lonza”).

- CHROMO- LAL von Associates of Cape Cod (AAC) Inc., EE.UU., P/N: C0031-5 (es decir kit “ACC”).

- Endotoxina E. coli 055:B5 para K-QCL; Lonza, Suiza, P/N: E50-643.

- Endotoxina E. coli 055:B5, 2,5 mg/vial; Lonza, Suiza, P/N: N185.

-Agua de reactivo LAL-100 mi; Lonza, Suiza, P/N: W50-100.

- MgCÍ2, disolución 10 mM para uso con LAL, vial 30 mi; Lonza, Suiza, P/N: S50-641.

- Cloruro de magnesio hexahidratado para análisis EMSURE® ACS, ISO, Reag. Farm. Eur., 250 g; Merck, Alemania, P/N: 1.05833.0250.

Tampón Tris, 50 mM, disolución 50 mM para uso con LAL, vial 30 mi; Lonza, Suiza, P/N: S50-642.

2.2 Reactivos de proteína

- Fracción V de albúmina bovina, muy baja endotoxina, libre de ácido graso, 25 g; Serva, Alemania, P/N: 47299.04. -Albúmina, suero humano, fracción V, alta pureza; 1 g; Merck, Alemania, P/N: 126658-1GM.

3. Productos farmacéuticos sometidos a prueba

Para los ejemplos descritos en el presente documento, se usaron rituximab (que comprende) y NeoRecormon® (que comprende epoetina-beta). Además, los placebos respectivos de rituximab y NeoRecormon® también se aplicaron en los métodos descritos en el presente documento.

El placebo de la muestra respectiva es idéntico a la muestra excepto por la ausencia del ingrediente terapéutico activo, es decir, placebo de rituximab no contiene rituximab sino todos los otros componentes de la formulación. Ejemplo 2: Métodos de la invención para superar el efecto de LER

Ejemplo 2.1: Protocolo para superar el efecto de LER

En este ejemplo, se usaron rituximab y placebo de rituximab como muestra. Sin embargo, como se analiza más adelante, el protocolo descrito en el presente documento es útil para superar el LER en todas las formulaciones típicas de anticuerpos farmacéuticos.

Materiales usados para este ejemplo

- Membranas:

- Membranas de acetato de celulosa (CA) de 10 kDa de Harvard Apparatus, EE.UU., P/N SPI 7425-CA10K.

- dializador:

- SpinDIALYZER rápido, volumen de cámara 1000 pl, Harvard Apparatus, EE.UU., P/N 740510 (cantidad de 1) o 740504 (cantidad de 5).

- Viales de muestra:

- Viales de vidrio de cuello roscado de 1,5 mi (N8); Macherey-Nagel GmbH & Co. KG. Alemania, P/N: 7020004. - Tapa roscada N8 PP, negra, parte superior cerrada; Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Alemania, P/N: 70250. - Cajas de cristalización:

- 900 mi, Duran, VWR Alemania P/N: 216-1817

- Disolución madre de MgCL:

- MgCh 1M disuelto en agua (cloruro de magnesio hexahidratado para análisis EMSURE® ACS, ISO, Reag, Farm. Eur., 250 g; Merck, Alemania, P/N: 1,05833,0250).

- Tampón Tris/HCI, disolución 50 mM para uso con LAL (es decir libre de endotoxina), vial 30 mi; Lonza, Suiza, P/N: S50-642.

- Muestras:

- Placebo de rituximab y agua para LAL

Protocolo etapa por etapa:

Etapa 1: Preparación de las muestras

- 1x placebo de rituximab 900 pl 100 pl de agua para LAL

- 1x placebo de rituximab 900 pl 100 pl de CSE cono. 5,0 UE/ml = concentración final 5,0 UE/ml

- 1x agua para LAL 1000 pl

- 1x agua para LAL 900 pl 100 pl de CSE cono. 5,0 UE/ml = concentración final 53

- Agitar las muestras 60 minutos a TA (temperatura ambiente) [es decir, en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm)].

Etapa 2: Lavado de membrana de diálisis

- Usar 10 membranas de acetato de celulosa (CA) de 10 kDa y ponerlas en la caja de cristalización con 300 mi de Aqua Braun (es decir agua destilada del fabricante B. Braun, Melsungen)

- Agitarlas durante 1 hora (agitador SG 20, IDL GmbH, Alemania o equivalente, de 50 a 300 rpm, preferiblemente 100 rpm)

- Transferir las membranas a una nueva caja de cristalización con Aqua Braun nueva (también 300 mi)

- Agitarlas durante 1 hora (Agitador SG 20, IDL GmbH Alemania o equivalente, de 50 a 300 rpm, preferiblemente 100 rpm)

Etapa 3: Adición de MgCh a una concentración final de MgCL de aproximadamente MgCL 50 mM

- Añadir 50 pl de la disolución madre de MgCL 1M a las muestras de la etapa 1

- Agitarlas 1 minuto [es decir en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] - Incubar las muestras durante 60 minutos a temperatura ambiente

- Agitarlas 1 minuto [es decir en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] Etapa 4: Dilución

- Tomar una de las muestras de la etapa 3 y diluirla a 1:10 con tampón, pH ~7 (es decir tampón Tris/HCI 50 mM pH ~7)

- 895 pl de tampón Tris/HCI 50 mM 105 pil de muestra

- Realizar dos veces para una determinación repetida (es decir determinación en duplicado):

- 2x placebo de rituximab 1:10 con tampón Tris/HCI

- 2x placebo de rituximab 5,0 UE/ml 1:10 con tampón Tris/HCI

- 2x agua para LAL 1:10 con tampón Tris/HCI

- 2x agua para LAL 5,0 UE/ml 1:10 con tampón Tris/HCI

Etapa 5: Diálisis

- Agitar todas las muestras diluidas durante 1 minuto [es decir en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente],

- Transferir en el SpinDIALYZER rápido

- Poner un dializador por vaso de precipitados (es decir vaso de precipitados DURAN®, forma alta, 2000 mi, OMNILAB, Alemania, P/N: 5013163) en una placa agitadora magnética. Ajustar la frecuencia del agitador para que esté alta (es decir “giro rápido”). Una alta frecuencia del agitador significa 50-300 rpm, preferiblemente 200-300 rpm. El agitador es un agitador magnético esterilizado térmicamente (4 horas a 250°C) que tiene una longitud de aproximadamente 40 mm y un diámetro de aproximadamente 14 mm.

- Rellenar el vaso de precipitados con 200 mi de Aqua Braun

- Dializar 24 horas e intercambiar el Aqua Braun después de 2 horas y 4 horas a temperatura ambiente (21 ± 2°C) - Después de la diálisis transferir la muestra en nuevos viales de rosca de 1,5 mi

Etapa 6: Agitación

- Agitar las muestras durante 20 minutos [es decir en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

Etapa 7: Preparación del control positivo de LER (es decir, el control LER positivo) y de controles adicionales de agua

- Preparar el control positivo de LER 1 hora antes de que termine la diálisis

1. placebo de rituximab 900 pl 100 pl de agua para LAL

2. placebo de rituximab 900 pl 100 pl de CSE cono. 5,0 UE/ml = concentración final 5,0 UE/ml

3. agua para LAL 1000 pl

4. agua para LAL 900 pl 100 pl de CSE cono. 5,0 UE/ml = concentración final 5,0 UE/ml

- Agitar 1 hora [es decir en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] - Diluir muestras 1:10 (muestra:agua para LAL) con agua para LAL

- Agitar [es decir en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] durante 1 minuto

Etapa 8: Ensayo de LAL

- Preparar la patrón e iniciar el ensayo de LAL según las instrucciones del fabricante (ensayo Kinetic-QCL™; Lonza) Resultados y discusión

Como puede observase en las figuras 3(A) (es decir [rituximab 117]) y 3(B) (es decir [rituximab 115]), el método descrito anteriormente es capaz de superar el efecto de LER. Además, usando este método, el efecto de LER puede superarse en rituximab así como en placebo de rituximab. Esto indica que el protocolo descrito anteriormente no es dependiente de una formulación que comprenda un anticuerpo monoclonal particular pero puede usarse para evitar el efecto de LER en cada formulación que comprende polisorbato 80 y un tampón quelante (tal como citrato de sodio). Esta formulación es típica para anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales. De esta manera, el método descrito anteriormente se espera que sea útil para superar el efecto de LER en cada formulación de anticuerpo.

Se ha encontrado que Mg2+ es el catión divalente de elección para restaurar la reactividad de LAL en formulaciones que contienen tampones quelantes (tales como citrato de sodio) y que muestran el efecto de LER.

Con el fin de mejorar el tampón quelante (por ejemplo, el tampón citrato de sodio), una segunda etapa (después de la adición de Mg2+) es realizar la diálisis. El spinDIALYZER™ de Harvard es el equipo preferido para la diálisis.

El detergente (por ejemplo, polisorbato 80) representa la segunda razón para el efecto de LER. En general, la presencia de detergentes (tales como polisorbato 80) en una muestra biológica conduce a la formación de micelas en el caso de que se alcance la concentración micelar crítica (CMC) del detergente (usualmente en el intervalo pM). Las micelas pueden mostrar la activación mediada por LPS del factor C, una serina proteasa que representa la primera enzima en la reacción de la cascada de LAL (Nakamura (1988a) J. Biochem. 103: 370-374). En preparaciones de anticuerpos monoclonales, la muestra no diluida usualmente está por encima de la CMC con el fin de obtener una solubilización funcional del anticuerpo. En los productos que se investigaron en este caso, la CMC de los detergentes superó efectivamente su CMC (polisorbato 80: 700 mg/l (exceso de 50 veces)) que conduce a la suposición que polisorbato 80 está presente en forma de micelas. En el protocolo descrito anteriormente, la concentración de detergente se reduce por dilución de modo que la concentración de detergente está cerca/cae por debajo del valor de CMC (polisorbato 80: 14 mg/l o 10,6 pM). La dilución del detergente a concentraciones casi CMC puede eliminar la compartimentalización micelar, y por lo tanto, volver a las moléculas CSE con adiciones conocidas accesibles para las enzimas de LAL.

Por consiguiente, el problema del efecto de LER (por ejemplo en el caso de que se usen citrato de sodio y polisorbato 80 para la formulación de un producto farmacéutico) ahora puede considerarse como que está resuelto. En conclusión, se proporciona en el presente documento un método de prueba seguro, robusto y reproducible para productos farmacéuticos.

En resumen, en rituximab y placebo de rituximab, el protocolo descrito anteriormente supera sorprendentemente el efecto de LER. En cambio, el mismo protocolo no puede revelar resultados satisfactorios para NeoRecormon® (que no comprende un anticuerpo sino epoetina-beta) que indica que los métodos proporcionados en el presente documento son particularmente útiles para formulaciones de anticuerpo, preferiblemente para formulaciones con anticuerpos monoclonales, tampón citrato y polisorbato 80.

Ejemplo 2.2: Protocolo modificado (1) para superar el efecto de LER

En este ejemplo, se ha usado un protocolo modificado que no obstante supera el efecto de LER. Los cambios más importantes en comparación con el ejemplo 2.1 son como sigue:

1. En el ejemplo 2.2, se ha usado el SpinDIALYZER. En cambio, en el ejemplo 2.1 se usa el SpinDIALYZER rápido que tiene cámaras de diálisis más eficientes y aumenta la eficiencia de la diálisis (las membranas están en ambos lados del cilindro).

2. En el ejemplo 2.2, el MWCO de la membrana de diálisis es de 500 Da. En cambio, en el ejemplo 2.1, el MWCO de la membrana de diálisis es de 10 kDa.

3. En el ejemplo 2.2, la dilución es 1:10 con agua libre de endotoxina. En cambio, en el ejemplo 2.1, la dilución 1:10 con tampón Tris pH ~7 (es decir tampón Tris/HCL pH ~7). Diluyendo la muestra con agua libre de endotoxina a una razón de 1:10, el valor de pH de la muestra se ajusta a aproximadamente pH 6,0.

4. En el ejemplo 2.2, el tiempo de diálisis es de 4 horas. En cambio, en el ejemplo 2.1, el tiempo de diálisis es de 24 horas.

En este ejemplo, se usaron rituximab y placebo de rituximab como muestra. Sin embargo, por las mismas razones que las comentadas con respecto al ejemplo 2.1, este protocolo se usa para superar el LER en todas las formulaciones típicas de anticuerpo.

En particular, el protocolo usado en el ejemplo 2.2 se detalla como sigue.

Vista general del protocolo

Etapa 1: “Ajuste del efecto de LER” (véase también más adelante “control positivo de LER”): Se añadieron adiciones conocidas a muestras de rituximab y placebo de rituximab con 5,0 UE/ml o 5,0 UE/ml (CSE; Lonza, E. coli O055:B5) y la mezcla se agitó durante 60 minutos a temperatura ambiente a velocidad máxima [agitador: Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm)] para obtener una muestra de “efecto de LER positivo”.

Etapa 2: Añadir MgCL: Antes de la diálisis, añadir disolución madre de MgCh 2 M de modo que la concentración final es de aproximadamente MgCL 50 mM, 1 minuto de agitación como en la etapa 1.

Etapa 3: Dilución 1:10 [una muestra sin dilución (no diluida) como referencia]; agitación durante 1 minuto como en la etapa 1.

Etapa 4: Diálisis durante 4 horas usando una membrana de 500 Da (preincubada 30 min con BSA al 0,2%; opcionalmente pero no obligatorio), intercambio de agua después de 2 horas una vez. Transferencia de la disolución desde la cámara de diálisis hasta un vial de vidrio y agitación como en la etapa 1 durante 20 minutos a TA (temperatura ambiente, es decir 21 ± 2°C).

Etapa 5: Medición de ensayo de LAL cinético.

Protocolo detallado

Etapa 1: Preparación de las muestras

- Preparación de disolución de anticuerpo (rituximab) para MgCh 50 mM; rellenar un tubo con 877,5 pl de rituximab 97,5 |il de CSE (disolución concentrada de 50 (5) UE CSE/ml —> 5(0,5) UE/ml concentración final).

- Control sin adiciones conocidas : 877,5 pl de placebo de rituximab 97,5 pl de agua.

- Control sin adiciones conocidas de agua: 975 pl de agua (para sustracción en blanco)

- Viales usados: apertura pequeña de fondo plano transparente 1,5 mi Macherey & Nagel, n.° de ref. 70213 - 1 hora de agitación en Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente.

Etapa 2: Adición de MgCL a una concentración final de MgCL 50 mM

- Disolución madre MgCL 1M • 6 H2O: añadir 50 pl de una disolución madre de MgCL 1M a la muestra con adiciones conocidas así como a la muestra sin adiciones conocidas (en blanco).

Etapa 3: Dilución

- Muestra de rituximab con MgCL 50 mM; preparar una dilución 1:10 añadiendo 900 pl de agua libre de endotoxina (es decir agua para LAL) 100 pl de muestra

- Control de agua se trata igual con agua libre de endotoxina (es decir agua para LAL) en lugar de rituximab; diluir 1^:10^.

Etapa 4: Diálisis

- Agitación de 1 minuto antes de la diálisis [es decir en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente],

- Poner las muestras en las cámaras de dializador de 1 mi (SpinDIALYZER de Harvard) al cual se fija una membrana con MWCO de 500 Da (opcionalmente, preincubada 30 min con BSA al 0,2%).

- Dializar 4 horas contra 1 litro de Aqua Braun (es decir, agua estéril libre de pirógenos; como se suministra por B. Braun, Melsungen) a 24°C; cambiar el agua después de 2 horas. El cambio de agua también se ha templado hasta 24°C.

- Los SpinDIALYZER se distribuyen (dependiendo del número de cámaras de diálisis) sobre múltiples vasos de precipitados de 2 litros rellenos con 1 litro de Aqua Braun con agitación (agitador de teflón magnético).

- Hay como mucho 5 dializadores en un vaso de precipitados de 2 litros.

Etapa 5: Preparación del control positivo de LER

También en este ejemplo, se usa un control positivo de LER en el ensayo de LAL. Este control positivo de LER puede prepararse en cualquier momento, con la condición que esté listo si se inicia el ensayo de LAL. De manera ventajosa, el control positivo de LER se prepara 1 hora antes del final de la diálisis de 4 horas, de modo que todas las muestras estén listas para la prueba al mismo tiempo. Para preparar el control positivo de LER, se usa el siguiente protocolo:

- rituximab 900 pl 100 pl de CSE —> concentración final CSE: 5,0 UE/ml.

- Agitación en un Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente durante 1 hora. Sólo bajo estas condiciones, se logrará el efecto de LER máximo (<1% de tasa de recuperación).

- Preparar en paralelo los siguientes blancos:

- Agua con 5,0 UE/ml de CSE

-Agua con 5,0 UE/ml de CSE; diluido 1:10 (5,0 UE/ml).

Etapa 6: Ensayo de LAL

- Iniciar la prueba después de que se preparan todas las muestras.

- De todas las muestras, se usan dos alícuotas de 100 pl para determinación de repetición (2x, es decir determinación en duplicado) en una placa que se incuba 10 minutos a 37°C en el lector Tecan.

- Añadir 100 pl de reactivo LAL (ensayo Kinetic-ACL®; Lonza) a cada muestra en una secuencia bien definida (de acuerdo a la lectura de la máquina).

Resultados y discusión:

El protocolo descrito en el ejemplo 2.1 dio como resultado las mejores tasas de recuperación reprodúceles (también con respecto a los controles de agua). Sin embargo, el protocolo descrito en el ejemplo 2.2 dio como resultado una buena tasa de recuperación de CSE que oscila entre el 50 y el 95% para ambas concentraciones de CSE con adiciones conocidas (véase la figura 4(B) [rituximab 046]). Por lo tanto, se puede concluir que el protocolo usado en el ejemplo 2.2 representa un equivalente funcional al protocolo descrito en el ejemplo 2.1.

Ejemplo 1 de referencia: Dependencia en el tiempo del efecto de LER

En la técnica anterior se asume que el efecto de LER aparece inmediatamente después de la adición conocida de la muestra con una cantidad conocida de CSE (C. Plateo, 2014, “Low lipopolysaccharide recovery versus low endotoxin recovery in common biological product matrices”. American Pharmaceutical Review, 1 de septiembre de 2014, págs.

1-6). Por lo tanto, en primer lugar las muestras se agitan después de la adición conocida con LPS durante un tiempo más bien corto de aproximadamente 2-10 min a temperatura ambiente. Sin embargo, esta clase de adición conocida resultó ser ineficaz y algunos experimentos indicaron que el efecto de enmascaramiento del material con adiciones conocidas aún no ha alcanzado su máximo durante este corto intervalo de tiempo (<10 min). Se encontró que el mecanismo de adición conocida es uno de los procesos fundamentales en el análisis del efecto de LER de una manera correcta (véase, por ejemplo, la figura 13 [rituximab 027]). Según estos datos, el efecto de LER es un fenómeno cinético, que requiere tiempo para enmascarar las moléculas CSE por ejemplo al penetrar en las micelas de la mezcla de la formulación. De esta manera, la agitación durante 2-10 minutos antes de la siguiente etapa para análisis del efecto de LER, como lo representa la práctica de rutina, es inapropiado y no puede considerarse que sea representativo para el efecto de LER, debido a que aún no se han alcanzado las condiciones para su formación. Por lo tanto, en los experimentos se incluyó un patrón interno para someter a prueba el “efecto de LER positivo” (definido por estar presente en el caso de que se haya alcanzado la tasa de recuperación del 0% por la prueba de LAL). Realizando un estudio cinético sobre el efecto de LER en rituximab, se demostró que el efecto de LER positivo necesita >60 min de tiempo de incubación.

En particular, se analizó por cuánto tiempo tiene que llevarse a cabo la agitación [frecuencia máxima (es decir, agitación con vórtex) en un agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente (21°C ± 2°C) un recipiente de fondo plano, de cuello rizado, de vidrio transparente de 1,5 mi], con el fin de lograr el efecto de LER máximo. Por lo tanto, se añadieron adiciones conocidas a las muestras de rituximab con CSE en un vial, para obtener 0,5 y 5,0 UE/ml (viales de Macherey-Nagel, 1,5 mi). Después de la adición conocida, las muestras se agitaron durante 60 minutos, 30 minutos, 10 minutos, 5 minutos, o 2 segundos, respectivamente. Posteriormente, se prepararon diluciones 1:10 mezclando 900 pl de agua libre de endotoxina (es decir agua para LAL) con muestra de 100 pl. Después de la dilución, las muestras se agitaron nuevamente durante 1 minuto. Posteriormente, las muestras se sometieron a prueba en el ensayo de LAL en duplicados. En particular, se aplicaron 100 pl de cada muestra sobre una placa y se incubaron en el lector durante 10 minutos a 37°C. Entonces, se añadieron 100 pl de cromógeno a cada muestra y la medición se llevó a cabo. En este experimento, todas las disoluciones tienen temperatura ambiente. Como puede observarse en la figura 13 [rituximab 027], el efecto de LER es menor (es decir es mayor la tasa de recuperación) si la muestra se diluye a una razón de 1:10 en comparación con la muestra no diluida correspondiente. Además, después de 2 segundos de agitación, los valores de recuperación para las muestras diluidas con 5,0 UE/ml de endotoxina aún estuvieron en aproximadamente el 50%. Sin embargo, el aumento del tiempo de agitación (es decir la agitación con vórtex) da como resultado una disminución constante de la tasa de recuperación (con la excepción del valor de 30 minutos), véase la figura 13 [rituximab 027], En cambio, las muestras no diluidas muestran el efecto de LER máximo ya después de 2 segundos. Sin embargo, también las muestras diluidas mostraron un efecto de LER significativo en las muestras que se han agitado (es decir, agitado con vórtex) durante 60 minutos.

De este resultado, se concluyó que la adición conocida necesita tiempo para enmascarar las moléculas de LPS en las micelas de detergente. El “efecto de LER positivo” está completo cuando se obtiene aproximadamente el 100% de enmascaramiento o tasas de recuperación <0,5% de CSE. Este proceso requiere un mínimo de 1 hora durante la agitación a temperatura ambiente [por ejemplo agitador: Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente en un vial de fondo plano de cuello rizado de vidrio transparente de 1,5 a 5 mi] o de manera alternativa almacenamiento a 4°C durante un periodo más prolongado de tiempo >24 horas. El “control positivo de LER” resultante se muestra en todas las gráficas como una barra en las representaciones gráficas en el lado derecho del diagrama.

Ejemplo 2 de Referencia: Influencia de albúmina sérica humana (HAS) y diferentes concentraciones de MgCL en la tasa de recuperación

Con el fin de determinar el efecto de HSA y diferentes concentraciones de MgCL en la tasa de recuperación de muestras de rituximab con adiciones conocidas con endotoxina, se ha realizado el siguiente experimento. Además, en este experimento, se ha analizado la influencia de la diálisis en la tasa de recuperación. Más específicamente, las muestras con adiciones conocidas de rituximab se agitaron durante 60 minutos con el fin de obtener el “efecto de LER positivo”. Antes de la diálisis, se añadieron MgCL 10-75 mM, posteriormente, se realizó una dilución. No se usó membrana bloqueada con BSA. Después de la diálisis, o bien se añade o bien no se añade HSA 0,01 pg/ml. Posteriormente, se realiza la agitación durante 20 minutos. Además, algunas muestras no se dializaron para nada. En particular, las diferentes muestras que se han sometido a prueba en el ensayo de LAL se muestran en la figura 5 (es decir [rituximab 059]). En este experimento, el efecto de LER puede superarse en algunas muestras sin diálisis. Sin embargo, experimentos adicionales demostraron que sin diálisis, el efecto de LER no puede superarse de manera reproducible. O, en otras palabras, sin diálisis, el efecto de LER algunas veces se supera y algunas veces no. De esta manera, la diálisis de las muestras da como resultado un método más fuerte para superar el efecto de LER.

Las muestras se han preparado en un vial de cuello roscado de 1,5 mi de Macherey-Nagel.

Etapa 1: Preparación de las muestras

- Preparación de rituximab con adiciones conocidas para MgCL 10 mM: 897 pl de rituximab 99,8 pl de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml.

- Preparación de rituximab con adiciones conocidas para MgCL 50 mM: 889 pl de rituximab 98,8 pl de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml.

- Preparación de rituximab con adiciones conocidas para MgCL 75 mM: 883 pl de rituximab 99,1 pl de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml.

- Preparación de agua con adiciones conocidas para MgCL 10 mM: 897 pl de rituximab 99,8 pl de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml.

- Preparación de agua con adiciones conocidas para MgCL 50 mM: 889 pl de rituximab 98,8 pl de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml.

- Preparación de agua con adiciones conocidas para MgCL 75 mM: 883 pl de rituximab 99,1 pl de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml.

Agitar durante 60 minutos [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

Etapa 2: Adición de MgCL

- Se usó una disolución madre de MgCL 4M (es decir 511,437 mg de MgCL • 6 H2O en 0,629 mi de agua)

- Para MgCL 10 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añaden 2,5 pl de la disolución 4M. - Para MgCL 50 mM, a la muestra con adiciones conocidas

se le añaden 12,5 pl de la disolución 4M. - Para MgCL 75 mM, a la muestra con adiciones conocidas

se le añaden 19 pl de la disolución 4M. - Agitar durante 1 minuto (agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

Etapa 3: Dilución

- Se prepararon diluciones a una razón de 1:10 como sigue:

- Preparación rituximab 1:10: siempre 900 pl de agua para LAL 100 pil de muestra

- El agua no se diluyó 1:10 puesto que no hubo suficientes dializadores disponibles.

- Agitar durante 1 minuto [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] Etapa 4: Diálisis

- Las muestras se pusieron en un dializador de 1 mi. Una membrana de 500 Da. Sin embargo, la membrana se lavó en agua para LAL.

- Se realizó la diálisis contra 1 I de Aqua Braun a 24°C durante 4 horas, y después de 4 horas, el agua se cambió. La nueva agua también tenía una temperatura de 24°C.

- Los dializadores estuvieron localizados en tres vasos de precipitados de 2 litros, y se giraron puesto que hubo un agitador más largo (es decir barra de agitación) en cada vaso de precipitados.

- Hubo siempre 4 dializadores en cada vaso de precipitados.

Etapa 5: Adición de HSA después de diálisis

- Después de la diálisis, las muestras se dividieron. Para la preparación de las muestras de HSA, se añadieron 396 |il de cada muestra a un vial separado. Para la preparación de muestra sin HSA, se añadieron 400 pl a un vial separado.

- Para obtener una concentración de HSA de 0,01 pg/ml, se añadieron 4 pl de una disolución 1 pg/ml a las muestras de 396 |_il

- La disolución madre de HSA se preparó recientemente

- Agitar durante 20 minutos [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] Etapa 6: Preparación del control positivo de LER

- El control positivo de LER se prepara 1 hora antes del final de la diálisis de 4 horas de modo que está listo al mismo tiempo que las otras muestras.

- rituximab 900 pl 100 pl de CSE de diferentes disoluciones madre de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml] - agitar a temperatura ambiente durante 1 hora [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm)] Etapa 7: Ensayo de LAL

- Se aplicaron 100 pl de cada una de las muestras sobre una placa en doble determinación

- Incubación en el lector a 37°C durante 10 minutos

- Se aplicaron 100 pl de cromógeno a cada muestra.

- Iniciar la medición en el lector.

Resultados y discusión:

Los resultados se muestran en la figura 5 [rituximab 059], Este experimento demuestra que el tratamiento con HSA reduce la tasa de recuperación y por lo tanto es menos útil en el contexto de los métodos proporcionados en el presente documento. Además, los resultados muestran que el tratamiento de BSA de la membrana de diálisis no es necesario para obtener tasas satisfactorias de recuperación. Además, este experimento también demuestra que MgCL 50 mM es el valor óptimo para la recuperación, MgCL de 10 y 75 mM dan como resultado menor recuperación. Sin embargo, también con MgCb 75 mM, se obtuvo una tasa satisfactoria de recuperación. Además, este experimento muestra que la adición de MgCb conduce a una recuperación dentro de un intervalo satisfactorio (70-100%) aún sin diálisis. Sin embargo, como se menciona anteriormente, sin diálisis, el efecto de LER no puede superarse de manera reproducible. De esta manera, la diálisis de las muestras da como resultado un método más fuerte para superar el efecto de LER. Se indica que en el experimento [rituximab 059], los valores de controles de agua fueron altos (parte de los valores >220%). El control positivo de LER es satisfactorio; es decir, 0% de recuperación.

Ejemplo 3 de referencia: Tiempo de incubación de 4 horas después de la adición de MgCL

En este experimento, muestras de rituximab se agitaron durante 60 minutos antes de lograr el “efecto de LER positivo”. Después de la adición de MgCh, las muestras no diluidas se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente). Después de esta incubación, las muestras se agitaron durante 2 minutos. Las diferentes muestras que se han sometido a prueba en el ensayo de LAL se muestran en la figura 5(B) [rituximab 061],

Etapa 1: Preparación de las muestras

- Preparación de rituximab con adiciones conocidas/agua para MgCh 10 mM: 897 pl de rituximab/agua 99,8 pl de CSE de modo que se obtiene 5,0 UE/ml

- Preparación de rituximab con adiciones conocidas/agua para MgCh 50 mM: 889 pl de rituximab/agua 98,8 pl de CSE de modo que se obtiene 5,0 UE/ml

- Preparación de rituximab con adiciones conocidas/agua para MgCb 75 mM: 883 pl de rituximab/agua 98,1 pl de CSE de modo que se obtiene 5,0 UE/ml

- Preparación de rituximab con adiciones conocidas/agua para MgCh 100 mM: 877 pl de rituximab/agua 97,5 pl de CSE de modo que se obtiene 5,0 UE/ml

- Preparación de rituximab con adiciones conocidas/agua para MgCh 150 mM: 866 pl de rituximab/agua 96,3 pl de CSE de modo que se obtiene 5,0 UE/ml

- Agitar durante 60 minutos [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] Etapa 2: Adición de MgCh

- Se usó una disolución madre de MgCh 4M (es decir 534,661 mg de MgCh • 6 H2O en 0,657 mi de agua)

- Para MgCh 10 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añaden 2,5 pl de la disolución 4M. - Para MgCh 50 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añaden 12,5 pl de la disolución 4M. - Para MgCh 75 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añaden 19 pl de la disolución 4M. - Para MgCh 100 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añaden 25 pl de la disolución 4M.

- Para MgCh 150 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añaden 37 pl de la disolución 4M.

- Agitar durante 1 minuto [alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

Etapa 3: Dilución

- Se prepararon diluciones a una razón de 1:10: 900 pl de agua para LAL 100 pl de muestra (es decir, muestra de rituximab o muestra de agua)

- Agitar durante 1 minuto [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] Etapa 4: Preparación del control positivo de LER

- rituximab 900 pl 100 pl de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml

- Se preparó otro control positivo de LER mezclando 900 pl de rituximab 100 pil de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml; y posteriormente diluir la muestra a 1:10 con agua libre de endotoxina

Etapa 5: Agitación

- Todas las muestras así como los controles positivos de LER se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm)]

Etapa 6: Ensayo de LAL

- Se aplicaron 100 pl de cada muestra sobre una placa en doble determinación

- Incubación en el lector a 37°C durante 10 minutos

- Se aplican 100 pl de cromógeno a cada muestra

- Iniciar la medición en el lector.

Resultados y discusión:

Los resultados de este experimento se muestran en la figura 6(B) [es decir rituximab 061]). Esta figura demuestra nuevamente que MgCh 50 mM es el valor óptimo reproducible para la recuperación de CSE; 10, 75 y 150 mM muestran resultados ligeramente inferiores. Cuando se realizó un tiempo de incubación después de la adición de MgCh, las muestras de rituximab no diluidas no condujeron para nada a una recuperación de CSE, véase la figura 6(B) (es decir [rituximab 061]). Sin embargo, las diluciones 1:10 dieron como resultado recuperaciones de aproximadamente el 50-60% (en particular cuando se añadió MgCL 10, 50, 75 o 100 mM). Los valores de control de agua así como el control positivo de LER fueron satisfactorios. En este experimento, no se realizó diálisis. Sin embargo, varios experimentos mostraron que la diálisis es necesaria para superar de manera reproducible el efecto de LER.

Ejemplo 4 de referencia: Comparación del tiempo de incubación de 2 y 4 horas después de la adición de MgCL Las muestras de rituximab se agitaron durante 60 minutos con el fin de lograr el “efecto de LER positivo”. Después de la adición de MgCL, las muestras no diluidas se incubaron durante 2 o 4 horas, luego se diluyeron 1:10 y se midieron en el ensayo de LAL. Las diferentes muestras que se han sometido a prueba en el ensayo de LAL se muestran en las figuras 7(A) y 7(B) (es decir [rituximab 062] y [rituximab 063], respectivamente).

Etapa 1: Preparación de las muestras

- Preparación de rituximab/agua para MgCL 10 mM: 897 pl de rituximab/agua 99,8 pl de diferentes disoluciones madre de CSE de modo que se obtienen 0,5 y 5,0 UE/ml.

- Preparación de rituximab/agua para MgCL 50 mM: 889 pl de rituximab/agua 98,8 pl de diferentes disoluciones madre de CSE de modo que se obtienen 0,5 y 5,0 UE/ml.

- Preparación de rituximab/agua para MgCL 75 mM: 883 pl de rituximab/agua 98,1 pl de diferentes disoluciones madre de CSE de modo que se obtienen 0,5 y 5,0 UE/ml.

Etapa 2: Preparación de los controles positivos de LER

- rituximab 900 pl 100 pl de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml.

- Dilución de uno de los controles positivos de LER a una razón de 1:10 con agua libre de endotoxina.

Etapa 3: Agitación

- Todas las muestras así como el control positivo de LER se agitan durante 1 hora: [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

Etapa 4: Adición de MgCL

- Se usó una disolución madre de MgCMM.

- Para MgCL 10 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añaden 2,5 pl de la disolución 4M

- Para MgCL 50 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añaden 12,5 pl de la disolución 4M - Para MgCL 75 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añaden 19 pl de la disolución 4M

- Agitar durante 1 minuto [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] Etapa 5: Tiempo de incubación

- Las muestras (no diluidas) (así como los controles positivos de LER) se dividen. Una mitad de cada muestra (aproximadamente 500 pl) se incubó durante 2 horas y la otra mitad se incubó durante 4 horas, respectivamente.

E tapa 6: D iluc ión

- Agitar durante 2 minutos [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] - Se prepararon diluciones a una razón de 1:10: 900 pl agua para LAL 100 pil de muestra (es decir muestra de rituximab o muestra de agua).

- Agitar durante 1 minuto [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] Etapa 7: Ensayo de LAL

- Incubación en el lector a 37°C durante 10 minutos.

- Se aplicaron 100 pl de cromógeno a cada muestra.

- Iniciar la medición en el lector.

Resultados y discusión:

Los resultados se muestran en las figuras 7(A) y 7(B) (es decir, [rituximab 062] y [rituximab 063], respectivamente). En este caso se midieron las tasas de recuperación de 0,5 y 5,0 UE/ml de endotoxina. Cuando se añadió MgCL 10-75 mM a las muestras, la recuperación fue la misma en las muestras que se incubaron durante 2 horas (figura 7(A), es decir [rituximab 062]) y las muestras que se incubaron durante 4 horas (figura 7(B), es decir [rituximab 063]). En ambos experimentos, las tasas de recuperación son muy similares. Además, en las muestras que se añadieron con 5,0 UE/ml de endotoxina se obtuvieron tasas satisfactorias de recuperación (80-90%) aún sin diálisis. En las muestras que se añadieron con 0,5 UE/ml de endotoxina, las tasas de recuperación fueron de aproximadamente el 35-45%. De manera importante, sin dilución (a una razón de 1:10), se observa LER completo, es decir el 0% de recuperación, también en presencia de MgCL 10-75 mM. Los controles de agua así como los controles positivos de LER fueron satisfactorios. En estos experimentos, no se ha realizado la diálisis. Además, experimentos adicionales demostraron que sin diálisis, el efecto de LER algunas veces se supera y algunas veces no. De esta manera, la diálisis de las muestras da como resultado un método más fuerte para superar el efecto LER.

Ejemplo 5 de referencia: Comparación de tiempo de incubación de 2 horas después de la adición de diferentes cantidades de MgCL sin tiempo de incubación de diferentes cantidades de MgCL

Las muestras de rituximab se agitaron durante 60 minutos con el fin de lograr el “efecto de LER positivo”. Después de la adición de MgCL, las muestras no diluidas o bien no se incubaron o bien se incubaron durante 2 horas. Entonces se diluyeron 1:10 y se midieron en el ensayo de LAL. Las diferentes muestras que se han sometido a prueba en el ensayo de LAL se muestran en las figuras 8(A) y 8(B) (es decir, rituximab 064] y [rituximab 065], respectivamente).

Ejemplo 5.1 de referencia: Ningún tiempo de incubación después de la adición de MgCb

En este experimento, no se realizó incubación después de la adición de MgCh a las muestras.

Etapa 1: Preparación de las muestras

- Preparación de rituximab/agua para MgCL 10 mM: 897 pl de rituximab/agua 99,8 pl de diferentes disoluciones madre de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml.

- Preparación de rituximab/agua para MgCL 25 mM: 895 pl de rituximab/agua 99,4 pl de diferentes disoluciones madre de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml.

- Preparación de rituximab/agua para MgCL 50 mM: 889 pl de rituximab/agua 98,8 pl de diferentes disoluciones madre de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml.

Etapa 2: Preparación de dos controles positivos de LER

- rituximab 900 pl 100 pl de CSE de modo que se obtienen 5,0 UE/ml.

- Dilución de uno de los controles positivos de LER a una razón de 1:10 con agua libre de endotoxina

E tapa 3: A g ita c ió n

- Todas las muestras así como el control positivo de LER se agitaron (es decir sometieron a vórtice) durante 60 minutos [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

Etapa 4: Adición de MgCh

- Se usó una disolución madre de MgCL 4M

- Para MgCh 10 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añadieron 2,5 pl de la disolución 4M

- Para MgCL 25 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añadieron 6,25 pl de la disolución 4M

- Para MgCL 50 mM, a la muestra con adiciones conocidas se le añadieron 12,5 pl de la disolución 4M

- Agitar durante 1 minuto [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] Etapa 5: Dilución

- Agitar durante 1 min [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

- Se prepararon diluciones a una razón de 1:10.

- Agitar durante 1 min [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] Etapa 6: Ensayo de LAL

- Se aplicaron 100 pl de cada una de las muestras sobre una placa en determinación doble

- Incubación en el lector a 37°C durante 10 min.

- Se aplicaron 100 pl de cromógeno a cada muestra.

- Iniciar la medición en el lector.

Resultados y discusión:

Los resultados se muestran en la figura 8(A) (es decir [rituximab 064]). Para el análisis de los resultados véase el ejemplo 4.2 de referencia.

Ejemplo 5.2 de referencia: Incubación de 2 horas después de la adición de MgCH

En este experimento, las muestras se incubaron durante 2 horas después de la adición de MgCL. Las etapas 1 a 4 se llevaron a cabo como se describe en lo anterior bajo el ejemplo 4.1 de referencia. Sin embargo, después de la adición de MgCL las muestras no diluidas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente (21°C)). Después de la incubación, se llevaron a cabo las siguientes etapas 5 y 6. Las diferentes muestras que se han sometido a prueba en el ensayo de LAL se muestran en la figura 8(B) (es decir [rituximab 065]).

Etapa 5: Dilución

- Agitar durante 2 min [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

- Se prepararon diluciones a una razón de 1:10: 900 pl de agua para LAL 100 pl de muestra (es decir muestra de rituximab o muestra de agua)

- Agitar durante 1 min [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente] Etapa 6: Preparación de dos controles positivos de LER

- 900 |il de rituximab 10Opil de CSE de modo que se obtienen 0,5 y 5,0 de UE/ml.

Etapa 7: Agitación

- Todas las muestras así como el control positivo de LER se agitaron durante 1 hora [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

Etapa 8: Ensayo de LAL

- Se aplicaron 100 pl de cada una de las muestras sobre una placa en determinación doble.

- Incubación en el lector a 37°C durante 10 min.

- Se aplicaron 100 pl de cromógeno a cada muestra.

- Iniciar la medición en el lector.

Resultados y discusión:

Los resultados del ejemplo 4.1 de referencia se muestran en la figura 8(A) (es decir [rituximab 064]); los resultados del ejemplo 4.2 de referencia se muestra en la figura 8(B) (es decir [rituximab 065]). En estos dos experimentos, la dilución y la medición de LAL se llevaron a cabo o bien inmediatamente después de la adición de MgCL (figura 8(A), [rituximab 064]) o bien después de dejar la muestra reposar durante 2 horas después de la adición de MgCL (figura 8(B), [rituximab 065]). Todos los valores de recuperación fueron muy similares y en las muestras que se añadieron con 5,0 UE/ml de CSE, se han obtenido tasas de recuperación satisfactorias (60-80%) aún sin la diálisis. De manera interesante, después de un tiempo de incubación de 2 horas, la concentración de MgCL 25 mM dio como resultado el 100% de recuperación. De esta manera, un tiempo de incubación después de la adición de MgCh parece que es una medida valiosa para disminuir el efecto de LER. Sin embargo, los valores de recuperación para las muestras que se añadieron con 0,5 UE/ml de CSE fueron bajos con aproximadamente el 20-35%. Esto indica que además de la adición de Mg2+ y la dilución, la diálisis representa una etapa necesaria para superar con fiabilidad el efecto de LER. En estos experimentos los valores de control de agua fueron satisfactorios. El control positivo de LER no diluido también fue satisfactorio, es decir, el 0%.

Ejemplo 6 de referencia: Comparación de diferentes diluciones con muestras de rituximab y de placebo de rituximab Después de las adiciones conocidas, las muestras de rituximab y de placebo de rituximab se agitaron durante 60 minutos con el fin de lograr el “efecto positivo de LER”. Después de la adición de MgCL las muestras no diluidas se agitaron durante 1 hora y se diluyeron a una razón de 1:2, 1:5, 1:10 o 1:20. Después se llevó a cabo el ensayo de LAL. Las diferentes muestras que se habían sometido a prueba en el ensayo de LAL se muestran en la figura 9 (es decir [rituximab 072]).

En particular, se había llevado a cabo el siguiente experimento:

Etapa 1: Preparación de las muestras

- Preparación de rituximab/placebo de rituximab/agua para MgCb 25 mM: 895 pl de rituximab/placebo de rituximab/agua 99,4 pl de diferentes disoluciones madre CSE de modo que se obtienen 0,5 y 5,0 UE/ml.

Etapa 2: Preparación de tres controles positivos de LER

- 450 pl de placebo de rituximab 50 pl de CSE de modo que se obtienen 0,5 y 5,0 UE/ml (primer control positivo de LER).

- 450 pl de rituximab 50 pl de CSE de modo que se obtienen 0,5 y 5,0 UE/ml (segundo control positivo de LER). - 450 pl de rituximab 50 pl de CSE de modo que se obtienen 0,5 y 5,0 UE/ml. Después, esta muestra se diluyó a una razón de 1:10 (tercer control positivo de LER).

Etapa 3: Agitación

- Todas las muestras así como los controles positivos de LER se agitaron (es decir, se agitaron con vórtex) durante 60 minutos [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

Etapa 4: Adición de MgCL

- Se usó una disolución madre de MgCL4 M.

^oPara MgCl225 mM se añadieron 6,25 pl de la disolución 4M a la muestra con adiciones conocidas.

- Las muestras se diluyeron como sigue:

^oDilución a una razón de

:5: 400 pl de agua 100 pl de muestra

^oDilución a una razón de 1:10: 450 pl de agua 50 pl de muestra

^oDilución a una razón de 1:20: 475 pl de agua 25 pl de muestra

- Uno de los tres controles positivos de LER se diluyó aúna razón de 1:10.

- El agua sin MgCb no se diluyó.

- Incubación en el lector a 37°C durante 10 min.

- Se aplicaron 100 pl cromógeno a cada muestra.

- Iniciar la medición en el lector.

Resultados y discusión:

Los resultados se muestran en la figura 9 (es decir [rituximab 072]). De manera importante, los resultados para rituximab y placebo de rituximab no mostraron diferencias significativas. Esto indica que el efecto de LER en el rituximab se basa principalmente en el sistema tampón (es decir tampón citrato con polisorbato 80) y que el anticuerpo (es decir rituximab) no tiene un impacto significativo en el efecto de LER. Sin embargo, en este experimento las tasas de recuperación no son satisfactorias tanto para el rituximab como el placebo de rituximab. En el experimento descrito en lo anterior, los valores de control de agua fueron satisfactorios. Los controles positivos de LER no diluidos fueron satisfactorios, también, con tasas de recuperación del 0%.

Ejemplo 7 de referencia: Influencia del tiempo de incubación antes de la adición de MgCL en la tasa de recuperación en las muestras de rituximab y placebo de rituximab

En el siguiente experimento se sometió a prueba si los tiempos de incubación antes de la adición de MgCh tienen una influencia en la tasa de recuperación de las muestras de rituximab y placebo de rituximab. En particular, las muestras de rituximab y placebo de rituximab se agitaron durante 60 minutos con el fin de lograr el “efecto de LER positivo”. Después las muestras se incubaron a 4°C durante de 0 horas a 3 días. Después, se añadió MgCL a una concentración de 50 mM y las muestras se diluyeron. Después, la diálisis se llevó a cabo con una membrana de diálisis que no se bloqueó con BSA. Las diferentes muestras que se habían sometido a prueba en el ensayo de LAL se muestran en la figura 10 (es decir [rituximab 079], y [rituximab 082]).

Las muestras se habían preparado en un vial de cuello roscado de 1,5 mi de Macherey-Nagel.

Etapa 1: Preparación de las muestras

- Preparación de rituximab/placebo de rituximab placebo/agua para MgCLóO mM: 5,346 pl de rituximab/placebo de rituximab/agua 596 pl de diferentes disoluciones madre CSE de modo que se obtuvieron 0,5 o 5,0 UE/ml.

- Agitar con vórtex durante 60 minutos [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]

- Para el procedimiento adicional se transfirió 1 mi de cada muestra en nuevos viales.

Etapa 2: Tiempo de incubación

- Las muestras se colocaron en el refrigerador a 4°C durante 0 h, 4 h, 1 día, 3 días, o 7 días.

- Después del tiempo de incubación de 1 día, 3 días o 7 días las muestras se agitaron durante 2 min [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]. Después de un tiempo de incubación de 0 horas y 4 horas las muestras no se agitaron.

E tapa 3: A d ic ió n de M gC h

- Se usó una disolución madre de MgChó M (es decir 0,9055 g de MgCh en 0,891 mi de agua).

o Para MgCÍ250 mM se añadieron 10 pl de la disolución 5 M a las muestras con adiciones conocidas. - Agitar durante 1 min [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente.

Etapa 4: Dilución

- Se prepararon diluciones a una razón de 1:10: 900 pl de agua para LAL 100 pl de muestra (es decir muestra de rituximab, muestra de placebo de rituximab o muestra de agua)

- El agua sin MgCh no se diluyó.

- Agitar durante 1 min [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente.

Etapa 5: Diálisis

- Las muestras se añadieron en un dializador de 1 mi. La diálisis se llevó a cabo contra Aqua Braun de 1 I a 24°C durante 4 horas, y después de 2 horas el agua se cambió. La nueva agua también tuvo una temperatura de 24°C. Se usó una membrana de 500 Da que no se había incubado con BSA antes.

- Los dializadores se cargaron en tres vasos de precipitados de 2 I y se hicieron girar puesto que hubo un agitador largo (es decir barra agitadora) en cada vaso de precipitados.

- Después de la diálisis las muestras se habían transferido en nuevos viales de 1,5 mi.

Etapa 6: Agitación

- Agitar durante 20 minutos [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente]. Etapa 7: Preparación del control positivo de LER

- El control de LER se preparó 1 hora antes al final de la diálisis de 4 horas de modo que está listo al mismo tiempo que las otras muestras.

- 900 pl de rituximab o placebo de rituximab 10Opil de CSE para obtener 5,0 UE/mL de CSE

- Agitar a temperatura ambiente durante 1 hora [agitador Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm)] Etapa 8: Ensayo de LAL

- Incubación en el lector a 37°C durante 10 min.

- Se aplicaron 100 pl de cromógeno a cada muestra.

- Iniciar la medición en el lector.

Resultados y discusión:

Los resultados se muestran en la figura 10(A) (es decir [rituximab 079], sin incubación), figura 10(B) (es decir [rituximab 080], incubación de 4 horas), figura 10(C) (es decir [rituximab 081], incubación de 1 día), y figura 10(D) (es decir [rituximab 082], incubación de 3 días). Los resultados para los 7 días de incubación no se muestran. Los resultados nuevamente muestran que usando los protocolos descritos en el presente documento pueden obtenerse buenas tasas de recuperación para el rituximab así como para las muestras de placebo de rituximab. Además, este experimento demuestra que un tiempo de incubación antes de la adición de MgCL no mejora las tasas de recuperación. En particular, mientras que el tiempo de incubación de 0-4 horas condujo a tasas de recuperación que están dentro del intervalo deseado (50-200%), los tiempos de incubación de 1 día y 3 días condujeron a tasas de recuperación más bajas (aproximadamente el 20-30%). Si no se realizó incubación (es decir 0 horas) se obtuvieron tasas de recuperación muy buenas para el rituximab (70-80%). También para el placebo de rituximab que se añadió con 5,0 UE/ml de CSE, la tasa de recuperación fue satisfactoria. La tasa de recuperación para el placebo de rituximab que se añadió con 0,5 UE/ml de CSE fue negativa puesto que el blanco fue muy alto. Esto puede indicar que esta muestra en blanco se contaminó con endotoxina. En este experimento también las tasas de recuperación del control de agua (80-120%) así como del control positivo de LER (~ 0%) fueron satisfactorias.

Ejemplo 8 de referencia: El protocolo del estado de la técnica (“ensayo de LAL”) y modificaciones de los mismos no pueden superar el efecto de LER en el rituximab o placebo de rituximab

En este ejemplo se determinó si el ensayo de LAL comúnmente conocido puede detectar las endotoxinas en las preparaciones de rituximab y placebo de rituximab. Por lo tanto, se habían descrito los siguientes materiales:

[rituximab 002]: CSE de Lonza reactivo de Lonza (es decir kit de Lonza)

[rituximab 004]: CSE de ACC o CSE de Lonza, respectivamente reactivo de ACC (es decir kit de ACC) [rituximab 005]: CSE de Lonza reactivo de ACC (es decir kit de ACC)

Los ensayos de LAL se han llevado a cabo con precisión como se describe por el fabricante.

Como puede observarse a partir de las figuras 11 (A)-(C) (es decir [rituximab 002], [rituximab 004] y [rituximab 005], respectivamente), el ensayo de LAL convencional no condujo a tasas de recuperación satisfactorias, aún si se sometieron a prueba varias diluciones diferentes. En particular, en un experimento (es decir [rituximab 002]), rituximab se pipeteó en una placa de 96 pocilios (es decir una placa de microtítulo) y se añadió con CSE de Lonza a una concentración final de 0,5 UE/ml o 5,0 UE/ml. Posteriormente, se llevaron a cabo diluciones con agua como se muestra en la figura 11 (A) (es decir [rituximab 002]) en la placa de 96 pocilios. Después se llevó a cabo un ensayo de LAL. Sin embargo, como puede observarse en la figura 11 (A) (es decir [rituximab 002]), no se alcanzó el 50% de recuperación.

En un experimento similar (es decir [rituximab 004]) rituximab se pipeteó en los pocilios de una placa de microtítulo y se añadieron con CSE de Lonza y CSE de ACC a una concentración final de 0,5 UE/ml o 5,0 UE/ml. Posteriormente, se llevaron a cabo diluciones con agua como se muestra en la figura 11 (B) (es decir [rituximab 004]) en la placa de 96 pocilios. Después, la medición se llevó a cabo. Sin embargo, como puede observarse en la figura 11 (B), con CSE de ACC se obtuvo una recuperación que es más del 200% y también la adición conocida de CSE de Lonza no dio como resultado tasas de recuperación satisfactorias.

En experimentos adicionales, se analizó el efecto del ajuste de pH en el ensayo de LAL. En particular, en un experimento [rituximab 005] el rituximab se pipeteó en una placa de microtítulo y la adición conocida de CSE de Lonza se llevó a cabo en la placa. Posteriormente, se llevaron a cabo diluciones con agua o el ajuste de pH como se indica en la figura 11© [rituximab 005], Sin embargo, ni la dilución ni el ajuste de pH dieron como resultado una recuperación del 50% (véase la figura 11 (C) [rituximab 005]).

También la diálisis sola da como resultado una tasa de recuperación satisfactoria. Más específicamente, en un experimento adicional, el rituximab se añadió con CSE para dar como resultado una concentración final de 0,5 y 5,0 UE/ml (es decir se mezclaron 900 pl de disolución de rituximab con 100 pl de CSE). Posteriormente, las muestras se dializaron en un SpinDIALYZER de 1 mi (en cámaras de teflón de 1 mi) durante 4 horas a 4°C con un cambio de agua después de 2 horas. La membrana de diálisis tuvo una MWCO de 100 Da. Después, se llevaron a cabo diluciones como se muestra en la figura 12 (es decir [rituximab 011]) en la placa. Posteriormente, la recuperación de endotoxina se midió usando el ensayo de LAL. Sin embargo, las tasas de recuperación buenas solo pudieron obtenerse para los controles de agua. En el caso de rituximab la recuperación máxima fue <5 % (véase la figura 12, [rituximab 011]). De esta manera, solo la diálisis y la dilución no superan el efecto de LER.

Ejemplo 9 de referencia: Estudios de tiempo de retención

Para identificar y monitorizar el efecto de LER, se había monitorizado el contenido de endotoxina a lo largo del tiempo en un estudio de tiempo de retención de endotoxina. Por lo tanto, una muestra no diluida de diversos tampones se ha añadido con adiciones conocidas con endotoxina y se ha almacenado a lo largo del tiempo (hasta 28 días). Los valores de endotoxina aceptables recuperados en el PPC después de la adición conocida con la mezcla de muestras apropiadas se definen por estar en el intervalo del 50 - 200% del valor de adición conocida teórico (100%). El efecto de LER se indica por una pérdida significativa de endotoxinas a lo largo del tiempo. En particular, una tendencia adversa de valores de endotoxina <50% del valor de adición conocida teórico es indicativa para el efecto de LER.

Se estudiaron varios componentes de tampones de formulación en un estudio de tiempo de retención de endotoxina (para resultados véase la siguiente tabla).

Tabla 1: Estudios de tiempo de retención

Como puede observarse a partir de la tabla anterior, los tampones que comprenden polisorbato 20 y Na2HP04; polisorbato 20 y NaH2P04; polisorbato 20, Na2HP04+ y NaH2P04; citrato de sodio, polisorbato 80 y NaCI; citrato de sodio y polisorbato 80; así como polisorbato 80 y NaCI muestran un efecto de LER.

Ejemplo 10 de referencia: Influencia del tampón y detergente en el efecto de LER

En varios experimentos, se analizó el efecto de citrato y/o polisorbato 80 en el efecto de LER. En particular, en un experimento se usaron rituximab y tampón citrato de sodio 25 mM como muestras. Antes de la adición conocida, el pH se ajustó a pH 7. Posteriormente, la adición conocida de CSE se llevó a cabo en la placa, y las muestras se diluyeron con agua. Como puede observarse a partir de la figura 14(A) (es decir [rituximab 006]), pudo obtenerse una tasa de recuperación satisfactoria para el citrato de sodio usando una dilución de 1:10. Sin embargo, en el caso de rituximab no pudo alcanzarse una recuperación del 50%.

En otro experimento, se usaron tampón citrato de sodio 25 mM, polisorbato 80 y una combinación de ambos como muestras. En particular, se usaron las concentraciones como están presentes en rituximab (es decir polisorbato 80: 0,7 mg/ml; citrato de sodio: 9 mg/ml). Estos sistemas tampones se añadieron con 0,5 y 5,0 UE/ml de CSE de Lonza o con CSE de Cape cod (excepto citrato de sodio, que se añadió con Lonza solamente, ya que la adición conocida de ACC de tampón citrato de sodio ya se llevó a cabo en el experimento descrito anteriormente y se mostró en la figura 14(A) (es decir [rituximab 006]). Después de la adición conocida, se llevó a cabo una dilución 1:2 o 1:5 con agua en la placa. En el caso del polisorbato 80, varias muestras condujeron a una tasa de recuperación satisfactoria entre el 50% y el 200%. En cambio, en el caso del tampón citrato de sodio, solo la dilución 1:10 condujo a una tasa de recuperación entre el 50% y el 200%. Esto indica que el tampón citrato tiene un impacto más significativo en el efecto de LER en comparación con polisorbato 80. Por otra parte, el efecto de LER no pudo superarse en este experimento si se usó una combinación de citrato de sodio y polisorbato 80 como muestra. Este experimento indica que en las formulaciones de anticuerpos monoclonales el efecto de LER está provocado por la formulación de tampón (es decir por la combinación de tampón citrato de sodio y polisorbato 80).

Estos resultados se han verificado por otro experimento en donde varias diluciones diferentes se sometieron a prueba. En particular, se prepararon muestras que comprenden o bien tampón citrato de sodio 25 mM (pH 6,5), polisorbato 80 700 mg/l o bien ambos (es decir la formulación de rituximab). Estas preparaciones así como los controles de agua se añadieron con CSE de Lonza a una concentración final de 0,5 o 5,0 UE/ml.

Todas las muestras se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la máquina con vórtex [agitador: Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) en un recipiente de fondo plano, de cuello rizado, de vidrio transparente de 1,5. Posteriormente, las diluciones como se indican en la figura 14(B) (es decir [rituximab 029]) se llevaron a cabo con agua libre de endotoxina en viales de 1,5 mi y se agitaron (como en lo anterior) durante 1 min. Después de la agitación, se llevó a cabo el ensayo de LAL. En particular, se añadieron 100 pl de cada una de las muestras a una placa de 96 pocilios y se incubaron en el lector durante 10 minutos a 37°C. Después, se añadieron 100 pl de cromógeno a cada una de las muestras y la medición se llevó a cabo. Como puede observarse en la figura 14(B) (es decir [rituximab 029]) el efecto de LER del tampón (es decir el tampón citrato de sodio) es más fuerte que en comparación con el efecto de LER del detergente (es decir polisorbato 80). Aunque el polisorbato 80 muestra una tasa de recuperación relativamente constante (-40-90%, véase la figura 14B, [rituximab 029], las columnas 2-5 de la derecha), en el tampón citrato el efecto de LER es dependiente de la dilución. De manera más importante, un efecto de LER potente y reproducible se expresa si el polisorbato 80 se combina con el tampón citrato (como es el caso en las formulaciones de anticuerpo monoclonal), véase la figura 14(B) (es decir [rituximab 029]). En estas muestras, también con alta dilución, la tasa de recuperación es solo -5-10%. Por consiguiente, este experimento demuestra cómo puede obtenerse un efecto de LER positivo. Este resultado es novedoso en el campo de la determinación de endotoxinas, ya que permite la prueba de varios medios y métodos para determinar su capacidad para superar el efecto de LER.

Cuando se analiza el efecto del tampón y el detergente por separado, el efecto del tampón sobre el efecto de LER fue más pronunciado tanto en NeoRecormon® como rituximab (véase, por ejemplo, la figura 14(B), es decir [rituximab 029]). Estos datos indican sorprendentemente que la retirada del tampón es más crítica que la retirada del detergente. Tomando en cuenta que las concentraciones de tampones en ambas formulaciones es comparable (rituximab: citrato de sodio 25 mM y NeoRecormon: 27,8 mM para fosfato de sodio), la razón para este efecto tiene que encontrarse en la estructura del tampón y/o en sus propiedades fisicoquímicas. El citrato de sodio es un anión quelante bien conocido, mientras que en el fosfato este efecto es menos pronunciado. Por lo tanto, estas observaciones también pueden explicar por qué la adición de Mg2+ es importante para la superación del efecto de LER, puesto que Mg2+ se forma en complejo por el tampón quelante reduciendo su concentración en la prueba de LAL.

Ejemplo de 11 referencia: Los métodos físicos y bioquímicos convencionales no recuperan endotoxinas enmascaradas mediante el efecto de LER

Con el fin de superar el efecto de LER (en los tampones identificados por tener el efecto de LER en el ejemplo 9 de referencia), se sometieron a prueba diferentes métodos físicos y bioquímicos:

Congelación de las muestras con adiciones conocidas con endotoxina a -30°C. Este estudio se basa en el descubrimiento inicial que el LER es más pronunciado a temperatura ambiente en comparación con 2-8°C. Resultado: la congelación de las muestras con adiciones conocidas con endotoxina no supera LER.

Calentar las muestras con adiciones conocidas con endotoxina durante 30 minutos a 70°C. Este estudio se llevó a cabo debido a que el calentamiento había mostrado que supera los efectos de enmascaramiento de endotoxina, para algunos productos (Dawson, 2005, LAL update. 22:1-6). Resultado: el tratamiento térmico de muestras con adiciones conocidas con endotoxina que no supera el LER.

Dilución de muestras con adiciones conocidas con endotoxina a dilución válida máxima (MVD). Este estudio se llevó a cabo puesto que la dilución de la muestra es el método convencional para superar la inhibición de LAL. Resultado: como puede observarse a partir de la figura 11 (es decir [rituximab 002], [rituximab 004], [rituximab 005]), la dilución no supera el efecto de LER.

Uso de columnas Endo Trap para muestras con adiciones conocidas con endotoxina. Estas columnas sirven para retirar las endotoxinas de las disoluciones a través de cromatografía de afinidad. Se llevó a cabo una prueba con una disolución de endotoxina acuosa. Resultado: las endotoxinas no pudieron recuperarse de la columna.

Ejemplo 12 de referencia: Retirada de detergentes por diálisis

Varias cámaras y membranas de diálisis (incluyendo diferentes tamaños de corte de peso molecular, MWCO) disponibles en el mercado se han sometido a prueba como se detalla a continuación.

Las membranas adecuadas para las cámaras de diálisis comercialmente disponibles son, por ejemplo, acetato de celulosa (MWCO de 100 a 300.000 Da), celulosa regenerada (MWCO de 1.000 a 50.000 Da), o éster de celulosa (MWCO de 100 a 500 Da). En el presente documento se prefieren el acetato de celulosa y el éster de celulosa, y es mucho más preferido el acetato de celulosa.

Las muestras de prueba (es decir rituximab) se diluyeron antes de la diálisis, aproximándose de este modo a la CMC y creando niveles crecientes de monómeros del detergente que se esperaron que se difundan a través de la membrana de diálisis. Las investigaciones sobre la tasa de recuperación del CSE con adiciones conocidas revelaron que, en el caso de rituximab, la celulosa regenerada no fue tan eficaz en comparación con el acetato de celulosa. En una serie de experimentos con rituximab se identificó que el MWCO es preferiblemente -10 kDa. Este tamaño se prefiere debido a que este tamaño se cree que i) acelera el proceso de diálisis y ii) permite también agregados oligoméricos más altos (pero no micelas) del detergente pasen a través de la membrana, en el caso de que el carácter hidrófobo del acetato de celulosa (ásteres de acetilo en los polímeros de glucosa) no inhibirá esta clase de proceso de transporte.

El experimento para determinar el óptima para la diálisis se ha llevado a cabo para imitar la situación en NeoRecormon®. Como se describe en lo anterior, el tampón y el detergente fueron aquellos compuestos en la formulación de la muestra que influyeron en gran medida el efecto de LER. Con el fin de imitar la formulación de NeoRecormon® se preparó una cantidad definida de tampón fosfato en un volumen total de 0,5 mi (2,7 mg) en presencia de polisorbato 200,1 mg/ml y se sometió a diálisis (en un SpinDIALYZER). En la figura 1 se muestra un ejemplo muy simple de este experimento usando una membrana de diálisis de acetato de celulosa con un MWCO de 12-16 kDa. En este caso, se muestra el material restante en el dializado interior después de un tiempo dado, demostrando de esta manera la eficacia de la diálisis. En particular, se analizó el peso del material restante en la cámara de diálisis interior durante un período de 72 horas (3d). El resultado es más bien sorprendente ya que muestra que la diálisis completa y eficaz de NeoRecormon® se logra solamente después de un período de diálisis más prolongado a temperatura ambiente (> 24 - 48h). Basándose en este experimento, el tiempo de diálisis preferido es de 20 horas durante la noche (por ejemplo 24 h). Además, este resultado indica que el dializador rápido de Harvard se prefiere sobre el SpinDIALYZER de Harvard, teniendo el primero el doble de área de membrana de diálisis, y de esta manera conduce a una diálisis más rápida.

En la figura 2, se muestra la eficacia de la diálisis en caso de que el fosfato se coloque en el compartimiento de dializado interior de la diálisis. En este experimento, la membrana de diálisis (MWCO 12-16 kDa) se lavó con BSA al 0,2% (30 min) antes de su uso, con el fin de evitar la absorbancia no específica del CSE con adiciones conocidas a la muestra. Sin embargo, en los métodos proporcionados en el presente documento una dilución (por ejemplo una dilución a una razón de 1:10) de las muestras reduce la concentración del detergente.

Ejemplo 13 de referencia: Influencia de MgCL en el efecto de LER

Se ha encontrado que el efecto de LER podría reducirse mediante la adición de MgCL a la muestra (véase, por ejemplo, la figura 15 (es decir [rituximab 031]). En particular, se observaron mejores resultados cuando la concentración de Mg2+ fue dos veces la concentración del citrato de sodio (es decir Mg2+50 mM).

En particular, se prepararon las muestras que comprendían o bien tampón citrato de sodio 25 mM, pH 6,5 (es decir tampón citrato de sodio, pH 6,5), polisorbato 80 0,7 mg/ml, o bien ambos (con pH 6,5, es decir la formulación de rituximab). Estas preparaciones así como los controles de agua se añadieron con CSE de Lonza a una concentración final de 0,5 o 5,0 UE/ml. Todas las muestras se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente [agitador: Heidolph Multi Reax, alta velocidad (2.037 rpm) en un recipiente de fondo plano de cuello rizado, de vidrio transparente de 1,5]. Entonces, se añadió MgCb para alcanzar una concentración de 10 mM, 25mM, 50 mM o 75 mM a las muestras. Posteriormente, las diluciones como se indica en las figuras 15(A), 18(B), 18(C), y 18(D) (es decir [rituximab 030 - rituximab 033]) se llevaron a cabo con agua libre de endotoxina en un vial de 1,5 mi y se agitaron (es decir, se agitaron con vórtex como en lo anterior) durante 1 min. Después de la agitación, el ensayo de LAL se llevó a cabo. En particular, se añadieron 100 pl de cada una de las muestras en una placa de 96 pocilios y se incubaron en el lector durante 10 min a 37°C. Después, se añadieron 100 pl de cromógeno a cada una de las muestras y la medición se llevó a cabo. Como puede observarse en la figura 15(A) (es decir [rituximab 030]), en todas las muestras diluidas, MgCL (10 mM) puede neutralizar el efecto formador de complejo de citrato. Los iones magnesio reducen el efecto de LER en las muestras que comprenden polisorbato 80 así como tampón citrato. En este caso, se logró una recuperación de aproximadamente el 50% con 5,0 UE/ml y el 25% con 0,5 UE/ml. Los valores de control del intervalo de agua alrededor del valor teóricamente esperado (es decir el 70-130%). Por otra parte, una comparación de las figuras 15(A), 15(B), y 1(5D) (es decir [rituximab 030], [rituximab 031], [rituximab 032] y [rituximab 033]) muestra que una concentración de MgCb que es dos veces la concentración del tampón citrato (es decir MgCl2 50 mM) conduce a mejores tasas de recuperación. Aunque el MgCL 25 mM y 75 mM no son la concentración óptima de MgCb, estas concentraciones no obstante superan el LER del tampón citrato (recuperación: el 75-190%). En un experimento similar en el que se usó rituximab como una muestra, se demostró que solo la adición de MgCL a una concentración de MgCb 10 mM, 50 mM, o 75 mM y una dilución posterior a una razón de 1:10 (sin diálisis) pudo conducir a una recuperación satisfactoria de endotoxina que se añadió una concentración final de 5,0 UE/ml (véase la figura 5, es decir [rituximab 059]).

Ejemplo 14 de referencia: Efecto de los tratamientos mecánicos sobre el efecto de LER

Se sometió a prueba si los tratamientos mecánicos (tales como agitación y ultrasonicación) son útiles para dispersar las micelas, y de esta manera para reducir el efecto de LER.

En particular, el agua libre de endotoxina (es decir agua para LAL) y rituximab se añadieron con CSE de Lonza para lograr una concentración final de 0,5 y 5,0 UE/ml. Después, las muestras o bien se sonicaron durante 1 hora o bien se agitaron durante 1 hora [es decir se agitaron con vórtex en el agitador Heidolph Multi Reax a alta velocidad (2.037 rpm) a temperatura ambiente en recipientes de fondo plano, de cuello rizado, de vidrio transparente de 1,5 mi]. Después se prepararon diluciones 1:10 (muestra:agua) con agua libre de endotoxina. Posteriormente, las

Claims

REIVINDICACIONES

i Método para la preparación de una muestra para un ensayo de Usado de amebocitos de Limulus (LAL), en el que la muestra comprende un anticuerpo, y en el que el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(a) añadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCh, a la muestra,

(b) diluir la muestra, y

(c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 contra una disolución acuosa libre de endotoxina.
2. Método para determinar la endotoxina bacteriana en una muestra que comprende un anticuerpo que muestra el efecto de LER, en el que el método comprende las siguientes etapas en el siguiente orden: (a) añadir iones magnesio, preferiblemente en forma de MgCL, a la muestra,

(b) diluir la muestra,

(c) dializar la muestra que tiene un valor de pH de 5,7-8,0 contra una disolución acuosa libre de endotoxina, y

(d) determinar la endotoxina bacteriana en la muestra usando un ensayo de LAL.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo terapéutico.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo se formula con polisorbato 80.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo se formula con un tampón citrato.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el anticuerpo se formula con un tampón citrato de sodio de aproximadamente 25 mM y polisorbato 80 de aproximadamente 700 mg/l y tiene un valor de pH de aproximadamente 6,5.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el anticuerpo es el anticuerpo anti-CD20 rituximab.
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que en la etapa (a) se añaden iones magnesio a una concentración final de aproximadamente 25 a 75 mM.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que en la etapa (b) el valor de pH de la muestra se ajusta diluyendo la muestra con tampón Tris/HCI 10-50 mM pH 6,0-9,0, preferiblemente 6,0-8,0.
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que en la etapa (b) la muestra se diluye a una razón de 1:10.
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que durante la diálisis en la etapa (c) la muestra tiene un valor de pH de 6,0-8,0.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que en la etapa (c) la diálisis tarda aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente.
13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que para la diálisis en la etapa (c) se usa una membrana con un corte de peso molecular de 10 kDa.
14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que para la diálisis en la etapa (c) se usa una membrana de acetato de celulosa.
15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que para la diálisis en la etapa (c) el agua se cambia dos veces.
16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, que comprende además producir un control positivo de recuperación de endotoxina baja (LER) añadiendo una cantidad conocida de endotoxina en una alícuota de la muestra y agitando la alícuota con adiciones conocidas de endotoxina de la muestra durante de 60 minutos a 2 horas.
17. Uso del método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para hacer que la muestra comprenda un anticuerpo sea reactiva al factor C en la cascada enzimática de LAL.