CN110845636B

CN110845636B - 一种去除细菌多糖中的内毒素的方法

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Publication number: CN110845636B
Application number: CN201911212999.5A
Authority: CN
Inventors: 王玺; 张轶; 罗树权; 刘方蕾; 白贵杰
Original assignee: Lanzhou Institute Of Biological Products Co ltd
Current assignee: Lanzhou Institute Of Biological Products Co ltd
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2039-12-02
Also published as: CN110845636A

Abstract

本发明提供了一种去除细菌多糖中的内毒素的方法，包括以下步骤：1)提供细菌多糖与盐和脱氧胆酸钠的混合液，其中所述盐的终浓度为0.3mol/L‑3mol/L，所述脱氧胆酸钠的终浓度为基于所述混合液的总重量为0.5w％‑5w％；2)使所述细菌多糖、盐和脱氧胆酸钠反应至少1小时；3)将步骤2)所得混合液离心，收集上清液；4)采用截留分子量为3K‑300K的膜对所述上清液进行透析或超滤。本发明可有效地去除生物医药制剂中的内毒素，方法重复性良好，可用于大规模荚膜多糖的制备。

Description

一种去除细菌多糖中的内毒素的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及一种去除细菌多糖中的内毒素的方法，特别是去除生物医药制剂中内毒素的方法。

背景技术

细菌内毒素是革兰氏阴性杆菌生长释放或死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖类物质，是热原的一种。人体对内毒素极为敏感，极微量的内毒素进入动物或人体内都会引起强烈的炎症反应，导致发热、脓毒症、感染性休克、甚至死亡的严重后果。基于此，尽可能降低制剂中内毒素的含量是十分必要的，特别是对于注射类制剂而言，内毒素的含量要求应更为严格。对于目前已经上市的针对各类革兰式阴性细菌，诸如Hib、脑膜炎耐瑟氏菌、伤寒沙门氏菌等的多糖疫苗和多糖蛋白结合疫苗，各国药典和监管当局都有严格的细菌内毒素含量要求。

内毒素的化学性质非常稳定，100℃湿热灭菌处理不能将其破坏，250℃、30分钟以上或者180℃干热灭菌处理3小时以上才能将其破坏，或者浓度为0.1M以上强碱浸泡数小时才能将其破坏。内毒素分子量在4000-5000道尔顿之间，因其类脂A部分为疏水性基团，其可在疏水作用下形成十几万至上百万道尔顿的聚集体。

革兰式阴性细菌荚膜多糖中内毒素残留来源于细菌本身。因其结构与荚膜多糖相似，均带有负电荷，均有用于锚定细菌外膜的疏水结构，因此用于疫苗制备的荚膜多糖中常不可避免地残留有不同水平的内毒素。文献报道的内毒素去除方法有超速离心、乙醇分级沉淀、色谱层析、活性炭吸附、树脂吸附、TritonX-114萃取等。然而，这些内毒素去除方法多适用于蛋白类生物制品，在荚膜多糖制品中的效果并不稳定。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种去除细菌多糖中的内毒素的方法。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种去除细菌多糖中的内毒素的方法，包括以下步骤：

1)提供细菌多糖与盐和脱氧胆酸钠的混合液，其中所述盐的终浓度为0.3mol/L-3mol/L，所述脱氧胆酸钠的终浓度为基于所述混合液的总重量为0.5w％-5w％；

2)使所述细菌多糖、盐和脱氧胆酸钠反应至少1小时；

3)将步骤2)所得混合液离心，收集上清液；

4)采用截留分子量为3K-300K的膜对所述上清液进行透析或超滤。

(2)根据(1)所述的方法，其中在步骤1)中，所述细菌多糖的浓度为0.5mg/ml-15mg/ml。

(3)根据(1)所述的方法，其中步骤1)包括：

i)提供细菌多糖溶液；

ii)将所述细菌多糖溶液与所述盐混合，得到第一混合液；

ii)将所述第一混合液与所述脱氧胆酸钠混合。

(4)根据(1)所述的方法，其中所述盐选自盐酸盐、磷酸盐和硫酸盐。

(5)根据(4)所述的方法，其中所述盐酸盐包括NaCl、KCl、 MgCl₂和ZnCl₂；所述磷酸盐包括Na₃PO₄、K₃PO₄、Na₂HPO₄和K₂HPO₄；所述硫酸盐包括Na₂SO₄、K₂SO₄、MgSO₄和ZnSO₄。

(6)根据(1)所述的方法，其中在步骤2)中，使所述细菌多糖、盐和脱氧胆酸钠反应至少2小时。

(7)根据(1)所述的方法，其中步骤3)所述离心的转速为 3000rpm-6000rpm，时间为5分钟-60分钟。

(8)根据(1)所述的方法，其中在步骤4)中，采用截留分子量为30K-100K的膜对所述上清液进行透析或超滤

(9)根据(1)所述的方法，其中所述方法在5℃-70℃下进行。

(10)根据(1)-(9)中任一项所述的方法，其中所述细菌多糖为细菌荚膜多糖。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1)本发明可有效地去除生物医药制剂中的内毒素，甚至可将样品中内毒素含量降至5EU/μg以下，方法重复性良好，可用于大规模荚膜多糖的制备。

2)本发明技术方案中所涉及的化学试剂均为国家所允许的低毒或无毒试剂，不具有对环境和人体构成伤害的潜在风险。

3)本发明实验条件温和，可在室温环境中进行操作，对生产设备要求低，对实验条件要求宽松，容易实施，并且本发明的工艺路线简单易行，不具有规模放大的障碍。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

细菌内毒素可通过疏水作用与细菌荚膜多糖相互聚集，并且自身也由于疏水作用而形成稳定的胶束，因此难以将其去除或破坏，由此影响生物医药制剂的安全性及其应用。本发明的发明人进行了充分的研究和实验，提出可以简单且巧妙地利用脱氧胆酸钠和高浓度盐将其去除。本发明不受理论的限制，但认为脱氧胆酸钠可破坏内毒素与荚膜多糖之间的疏水相互作用，并与内毒素相互作用；高浓度盐能够使脱氧胆酸钠形成聚沉从而吸附内毒素，进而可通过离心将其去除，此外高浓度盐还能够进一步破坏内毒素与荚膜多糖之间的离子相互作用，从而更好地使内毒素游离出来，进而再与脱氧胆酸钠结合。这样，高浓度盐和脱氧胆酸钠之间实现了协同作用，获得了显著的内毒素去除效果。本发明的发明人发现，当盐的浓度低于0.3mol/L时，其不足以起到上述作用，因此内毒素去除效果很不理想；当盐浓度高于3mol/L时，其容易从溶液中析出。

此外，本发明的发明人还对脱氧胆酸钠的浓度、反应时间和其他条件进行了摸索。在利用盐和脱氧胆酸钠处理细菌多糖之后，本发明进一步采用超滤或透析，这样进一步去除了未被脱氧胆酸钠吸附而去除的游离内毒素，进一步提高了内毒素去除效果。

基于上述发现和构思，本发明提供了一种去除细菌多糖中的内毒素的方法，包括以下步骤：

2)使所述细菌多糖、盐和脱氧胆酸钠反应至少1小时；

3)将步骤2)所得混合液离心，收集上清液；

在本发明中，术语“细菌多糖”是指来自细菌中的多糖，例如革兰阴性细菌的荚膜多糖。

本发明的方法适用于有效去除生物医药制剂中的内毒素，所述生物医药制剂可以是多糖疫苗和多糖蛋白结合疫苗等。本发明可使样品中的内毒素含量显著降低，该方法重复性良好，可用于大规模荚膜多糖的制备。

在本发明一个具体的实施方案中，步骤1)包括：i)提供细菌多糖溶液；ii)将所述细菌多糖溶液与所述盐混合，得到第一混合液； ii)将所述第一混合液与所述脱氧胆酸钠混合。

优选地，在步骤1)中，所述盐的终浓度为0.5mol/L-3.0mol/L，更优选范围为1.0mol/L-2.0mol/L，最优选为1.5mol/L。

优选地，在步骤1)中，基于所述混合液的总重量，所述脱氧胆酸钠的终浓度为0.5％-3.0％。

优选地，在步骤1)中，所述细菌多糖的浓度为0.5mg/ml-15mg/ml，更优选为2-5mg/ml。

在本发明的方法中，盐可以为常用的对本发明所用其他试剂没有干扰作用(例如形成沉淀)的盐。例如可以为常用的中性盐，例如可选自盐酸盐、磷酸盐和硫酸盐。其中盐酸盐可包括NaCl、KCl、MgCl₂、 ZnCl₂。磷酸盐可包括Na₃PO₄、K₃PO₄、Na₂HPO₄、K₂HPO₄。硫酸盐可包括Na₂SO₄、K₂SO₄、MgSO₄、ZnSO₄。其中，所述盐最优选为NaCl。

本发明的发明人发现，当使细菌多糖与盐和脱氧胆酸钠反应至少 2小时时，将得到更加明显的内毒素去除效果，内毒素含量可降至 5EU/μg以下。因此，最优选地，使所述细菌多糖、盐和脱氧胆酸钠反应至少2小时。

此外，还优选地，在震荡或搅拌的条件下进行步骤2)。

优选地，步骤3)所述离心的转速为3000rpm-6000rpm，时间为 5分钟-60分钟，更优选为10-30分钟。

优选地，在步骤4)中，采用截留分子量为30K-100K的膜对所述上清液进行透析或超滤。

本发明的方法可以在5℃-70℃下进行，例如可以在室温下进行。

在本发明的方法中，所述细菌多糖优选为细菌荚膜多糖。本发明对细菌的种类没有限制，可以为各种革兰式阴性细菌，例如Hib、脑膜炎耐瑟氏菌、伤寒沙门氏菌。

在本发明一个具体的实施方案中，所述方法包括以下步骤：

A)将细菌多糖用水溶解成多糖浓度在0.5-15mg/ml范围内，向溶液中加入NaCl至终浓度范围0.3-3mol/L，溶液充分混匀后，向溶液中加入脱氧胆酸钠(DOC)至终浓度为0.5-5w％；

B)将液体振荡或搅拌2小时以上；

C)将液体以3000-6000rpm离心5-60分钟，收集上清液；

D)采用透析或超滤的方法，并用截留分子量为3K-300K的膜对液体溶剂进行置换。

以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

实施例

以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用本领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。

实施例1

经细菌发酵、离心收集上清液、CTAB沉淀、氯化钙解离、乙醇沉淀和苯酚抽提制得奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis) 夹膜多糖，用水溶解成多糖浓度为2.5mg/ml，向溶液中加入NaCl至终浓度为1.5mol/L，溶液充分混匀后，向溶液中加入脱氧胆酸钠(DOC)至终浓度为0.5w％。

将液体搅拌1小时，然后4200rpm离心15分钟，收集上清液。

采用截留分子量为100K的膜(购自Millipore公司)对上清液进行透析，得到去除内毒素的荚膜多糖。

对该荚膜多糖进行细菌内毒素含量光度分析(所用仪器为 BET-72型，购自天津市天大天发科技有限公司；鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司)。结果显示，该荚膜多糖制品的内毒素含量为 12.484EU/μg。

实施例2

经细菌发酵、离心收集上清液、CTAB沉淀、氯化钙解离、乙醇沉淀和苯酚抽提制得奈瑟氏脑膜炎球菌夹膜多糖，用水溶解成多糖浓度为2.5mg/ml，向溶液中加入NaCl至终浓度为1.5mol/L，溶液充分混匀后，向溶液中加入脱氧胆酸钠(DOC)至终浓度为1.0w％。

将液体搅拌2小时，然后4200rpm离心15分钟，收集上清液。

对该荚膜多糖进行细菌内毒素含量光度分析(所用仪器为 BET-72型，购自天津市天大天发科技有限公司；鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司)。结果显示，该荚膜多糖制品的内毒素含量为 2.32EU/μg。

实施例3

经细菌发酵、离心收集上清液、CTAB沉淀、氯化钙解离、乙醇沉淀和苯酚抽提制得奈瑟氏脑膜炎球菌夹膜多糖，用水溶解成多糖浓度为2.5mg/ml，向溶液中加入KCl至终浓度为1.5mol/L，溶液充分混匀后，向溶液中加入脱氧胆酸钠(DOC)至终浓度为1.0w％。

将液体搅拌2小时，然后4200rpm离心15分钟，收集上清液。

对该荚膜多糖进行细菌内毒素含量光度分析(所用仪器为 BET-72型，购自天津市天大天发科技有限公司；鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司)。结果显示，该荚膜多糖制品的内毒素含量为小于3.06EU/μg。

实施例4

经细菌发酵、离心收集上清液、CTAB沉淀、氯化钙解离、乙醇沉淀和苯酚抽提制得奈瑟氏脑膜炎球菌夹膜多糖，用水溶解成多糖浓度为2.5mg/ml，向溶液中加入Na₃PO₄至终浓度为1.5mol/L，溶液充分混匀后，向溶液中加入脱氧胆酸钠(DOC)至终浓度为2.0w％。

将液体搅拌2小时，然后4200rpm离心15分钟，收集上清液。

对该荚膜多糖进行细菌内毒素含量光度分析(所用仪器为 BET-72型，购自天津市天大天发科技有限公司；鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司)。结果显示，该荚膜多糖制品的内毒素含量为 2.11EU/μg。

实施例5

经细菌发酵、离心收集上清液、CTAB沉淀、氯化钙解离、乙醇沉淀和苯酚抽提制得奈瑟氏脑膜炎球菌夹膜多糖，用水溶解成多糖浓度为2.5mg/ml，向溶液中加入Na₂SO₄至终浓度为2.0mol/L，溶液充分混匀后，向溶液中加入脱氧胆酸钠(DOC)至终浓度为5.0w％。

将液体搅拌2小时，然后4200rpm离心15分钟，收集上清液。

对该荚膜多糖进行细菌内毒素含量光度分析(所用仪器为 BET-72型，购自天津市天大天发科技有限公司；鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司)。结果显示，该荚膜多糖制品的内毒素含量为 2.05EU/μg。

对比例1

经细菌发酵、离心收集上清液、CTAB沉淀、氯化钙解离、乙醇沉淀和苯酚抽提制得奈瑟氏脑膜炎球菌夹膜多糖，用水溶解成多糖浓度为2.5mg/ml，向溶液中加入NaCl至终浓度为0.15mol/L，溶液充分混匀后，向溶液中加入脱氧胆酸钠(DOC)至终浓度为2.0w％。

将液体搅拌2小时，然后4200rpm离心15分钟，收集上清液。

对该荚膜多糖进行细菌内毒素含量光度分析(所用仪器为 BET-72型，购自天津市天大天发科技有限公司；鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司)。结果显示，该荚膜多糖制品的内毒素含量为 87.53EU/μg。

对比例2

经细菌发酵、离心收集上清液、CTAB沉淀、氯化钙解离、乙醇沉淀和苯酚抽提制得奈瑟氏脑膜炎球菌夹膜多糖，用水溶解成多糖浓度为2.5mg/ml，向溶液中加入脱氧胆酸钠(DOC)至终浓度为 2.0w％。

将液体搅拌2小时，然后4200rpm离心15分钟，收集上清液。

对该荚膜多糖进行细菌内毒素含量光度分析(所用仪器为 BET-72型，购自天津市天大天发科技有限公司；鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司)。结果显示，该荚膜多糖制品的内毒素含量为 103.82EU/μg。

对比例3

经细菌发酵、离心收集上清液、CTAB沉淀、氯化钙解离、乙醇沉淀和苯酚抽提制得奈瑟氏脑膜炎球菌夹膜多糖，用水溶解成多糖浓度为2.5mg/ml，向溶液中加入NaCl至终浓度为3.0mol/L。

将液体搅拌2小时，然后4200rpm离心15分钟，收集上清液。

对该荚膜多糖进行细菌内毒素含量光度分析(所用仪器为 BET-72型，购自天津市天大天发科技有限公司；鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司)。结果显示，该荚膜多糖制品的内毒素含量为 286.02EU/μg。

对比例4

经细菌发酵、离心收集上清液、CTAB沉淀、氯化钙解离、乙醇沉淀和苯酚抽提制得奈瑟氏脑膜炎球菌夹膜多糖，用水溶解成多糖浓度为2.5mg/ml，向溶液中加入NaCl至终浓度为1.5mol/L，溶液充分混匀后，向溶液中加入脱氧胆酸钠(DOC)至终浓度为0.1w％。

将液体搅拌2小时，然后4200rpm离心15分钟，收集上清液。

对该荚膜多糖进行细菌内毒素含量光度分析(所用仪器为 BET-72型，购自天津市天大天发科技有限公司；鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司)。结果显示，该荚膜多糖制品的内毒素含量为 96.44EU/μg。

对比例5

经细菌发酵、离心收集上清液、CTAB沉淀、氯化钙解离、乙醇沉淀和苯酚抽提制得奈瑟氏脑膜炎球菌夹膜多糖，用水溶解成多糖浓度为2.5mg/ml，向溶液中加入NaCl至终浓度为1.5mol/L，溶液充分混匀后，向溶液中加入脱氧胆酸钠(DOC)至终浓度为0.5w％。

将液体搅拌30分钟，然后4200rpm离心15分钟，收集上清液。

对该荚膜多糖进行细菌内毒素含量光度分析(所用仪器为 BET-72型，购自天津市天大天发科技有限公司；鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司)。结果显示，该荚膜多糖制品的内毒素含量为 159.62EU/μg。

Claims

1.一种去除细菌荚膜多糖中的内毒素的方法，包括以下步骤：

1）提供细菌荚膜多糖与盐和脱氧胆酸钠的混合液，其中所述盐的终浓度为1.5mol/L-3mol/L，所述脱氧胆酸钠的终浓度为基于所述混合液的总重量为1w%-5w%；

2）使所述细菌荚膜多糖、盐和脱氧胆酸钠反应至少2小时；

3）将步骤2）所得混合液离心，收集上清液；

4）采用截留分子量为3K-300K的膜对所述上清液进行透析或超滤；

其中所述盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、ZnCl₂、Na₃PO₄、K₃PO₄、Na₂HPO₄、K₂HPO₄、Na₂SO₄、K₂SO₄、MgSO₄和ZnSO₄；

其中在步骤1）中，所述细菌荚膜多糖的浓度为0.5mg/ml-5mg/ml。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1）包括：

i）提供细菌荚膜多糖溶液；

ii）将所述细菌荚膜多糖溶液与所述盐混合，得到第一混合液；

ii）将所述第一混合液与所述脱氧胆酸钠混合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3）所述离心的转速为3000rpm-6000rpm，时间为5分钟-60分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤4）中，采用截留分子量为30K-100K的膜对所述上清液进行透析或超滤。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在5℃-70℃下进行。