KR0162074B1

KR0162074B1 - 항원용액중의 보조제로서 수산화아연 또는 수산화철의 용도, 및 이러한 보조제를 함유하는 항원용액

Info

Publication number: KR0162074B1
Application number: KR1019890014464A
Authority: KR
Inventors: 베른하르트 디터
Original assignee: 필리프 슈타인, 헤리베르트 부크; 베링베르 케 아크티엔게젤샤프트
Priority date: 1988-10-12
Filing date: 1989-10-10
Publication date: 1998-12-01
Also published as: DK504389D0; EP0363835A1; DE3834729A1; FI894804A; FI894804A0; PT91953B; IE893283L; US5252327A; ES2058432T3; ATE90568T1; AU4276689A; CA1333257C; FI100946B; EP0363835B1; AU626920B2; JPH02149530A; KR900005986A; DK504389A; DK170224B1; JP2756321B2

Abstract

내용없음

Description

보조제로서 수산화아연 또는 수산화철을 함유하는 항원용액 및 이의 제조방법

본 발명은 항원용액중의 보조제로서 수산화아연 또는 수산화철 겔, 경우에 따라서는, 레시틴의 용도 및 이러한 보조제를 함유하는 항원용액에 관한 것이다.

다수의 항원은 낮은 면역원성을 가지므로 동물 또는 사람에게 1회 주입한 후 유발되는 면역반응은 측정할 수 없거나 매우 낮다. 이 때문에, 항원성 자극에 대한 신체의 면역반응을 증진시키기 위하여 항원에 보조제를 첨가한다. 이것이 대부분의 불활성화 바이러스성 및 박테리아성 백신이 보조제를 함유하게 되는 이유이다. 주로 상기한 바이러스성 및 박테리아성 백신에 사용되는 보조제는 Al(O)H₃및 AlPO₄, 단독이거나 혼합한 식물성 오일 또는 정확하게정의되지 않은 조성물의 석유 분획으로부터 수득된 광유, 소위 의료용 약제학적 백색 오일이다. 마이코박테리아의 추출물이 존재 및 부재하는 광유 바욜 F(

Bayol F)로 구성된 프룬드(Freund)의 완전 및 불완전 조보제가 주로 실험실용 백신에 사용된다.

그러나, 이들 보조제는 국소적 반응 뿐만 아니라 전신적 부작용도 나타낼 수 있다.

보조제의 국소적 및 전체적인 허용성 이외에, 다음이 핵심사항이다 :

1. 보조제가 유발시키는 작용의 보조제의 면역학적 작용 기작; 및

2. 보조제의 약물역학(생분해도).

성질 1에 대하여 : 따라서, 통상적으로는 광물보조제(Al(OH₃), AlPO₄)는 주로 체액성 면역반응만을 유발시키는 반면, 다수의 바이러스 감염에서의 주된 역할을 나타내는 세포성 면역성은 약간만 자극받거나 전혀 자극받지 않는다.

광유, 특히 프룬드 보조제는 상이하게 작용하며 세포성과 체액성 면역반응 둘다를 자극하는 것으로 공지되어 있다.

성질 2에 대하여 : 현재까지 사용되어 오고 있는 보조제는 대부분이 주입부위에 잔류하거나 이송되며 이들이 면역학적 및 독성 효과를 나타내게되는 신체의 기타 기관에 축적된다. 즉, 분해 또는 배출은 발생한다해도 상당히 느리게 발생한다. 본 발명에 따른 보조제인 수산화아연 겔, 수산화철 겔 및 레시틴은 서로 달리 작용한다. 이들은 신체에서 대사화된다. 따라서, 이들은 덜 독성이다.

EP-A-O, 108,316(독일연방공화국 공개 공보 제 3,241,113호)에는 기타의 물질외에, 아연의 화합물, 특히 아연염을 백신 첨가제로서의 용도를 제안하고 있다.

그러나, 마우스 및 기니아 피그에 대한 예비시험에서 수용액중의 염화아연, 황산아연 및 아연 아세테이트와 같은 아연염 또는 염화제 2철(III)과 같은 철염은 오히려 열악한 국소 허용도를 가지며 어떠한 감지할만한 보조제 효과도 나타내지 않는다는 것이 밝혀졌다.

그러나, 현재 놀랍게도, 적절한 염용액으로부터 수득할 수 있는 수산화아연 및 수산화철 겔이 하기 특성을 가짐이 밝혀졌다.

1. 수산화아연 및 수산화철 겔은 상당히 양호한(바이러스 및 단백질) 흡착성을 갖는다.

2. 수산화아연 및 수산화철 겔은 상당히 양호한 보조제 특성을 갖는다.

3. 수산화철 겔은 주로 체액성 면역을 유발시킨다.

4. 수산화철 겔은 주로 체액성 면역을 유발시킨다.

5. 수산화아연 및 수산화철 겔은 지금까지의 통상의 보조제와 비교하여, 오히려 양호한 국소적이고 전체적인 허용도를 갖는다.

6. 수산화아연 및 수산화철 겔에 레시틴의 첨가는 수산화물 겔의 보조효과를 증강시켜, 국소적 허용도를 증가시키며 백신의 제형특성을 추가로 증진시킨다.

자체가 공지된 방법에 의한, 수산화아연 겔, 수산화철 겔 및 레시킨 99 현탁액의 제법 설명: 수산화아연 겔 :

1. ZnCl₂, 아연 아세테이트×2H₂O, ZnSO₄×7H₂O로부터 출발-증류수중의 0.1M 용액을 제조.

2. 수산화탄산아연으로부터 출발-5N HCl을 첨가함으로써 증류수중의 0.1M 용액을 제조.

3. 아연염용액의 무균여과(0.2μ막 필터).

4. 무균조건하에서 교반하면서 6.0 내지 7.8의 pH가 달성될 때까지 10N NaOH 또는 10N KOH를 첨가.

5. 침전된 수산화아연 겔을 울트라터렉스(

Ultraturrax)처리로 더 균질화.

여기에서 사용한 출발 아연염은 단지 예일 뿐이다. 마찬가지로 다른 아연염(산화아연을 포함하여)으로부터 기술된 방법으로 수산화아연 겔을 용이하게 제조할 수 있다. 또한 항원 현탁액에서 pH를 직접 모니터링하면서 수산화아연 겔을 제조할 수도 있다. 비-무균조건을 이용하는 경우, 아연염용액을 살균 시키지 않고, 겔을 120℃에서 20분 동안 오토클레브시킬 수 있다.

수산화철 겔 : 수산화철 겔의 제조는 수산화아연 겔의 제조와 유사한 방법으로 수행한다.

출발물로서 사용한 염용액은 증류수중의 0.25 M FeCl₃이다.

20% 농도 레시틴 99 현탁액의 제조 :

1. 20g의 레시틴을 pH 7.2 100ml의 PBS에 현탁;

2. 현탁액을 120℃에서 20분 동안 오토클레이브처리;

3. 냉각 후, 현탁액을 균질화;

4. 현탁액의 pH를 10N NaOH 로 7.0 내지 7.8로 조정.

이들 겔 및, 경우에 따라서는, 레시틴 현탁액은 하기 양으로 항원용액에 첨가한다 :

수산화아연 겔 1 - 45%

수산화철 겔 1 - 45%

레시틴 현탁액 1 - 25%

적합한 항원은 바이러스성, 박테리아성, 세포성 펩티드 및 단백질 항원이다.

하기 실시예는 본 발명에 따르는 면역자극제/보조제의 장점을 설명한다.

[실시예]

[실시예 1]

아우제스키질환(Aujeszky disease) 바이러스(AV)를 우선 기니아 피그 신장세포 배양물에서 성장시킨다. 배양물이 100% 바이러스-특이적 분해를 겪은 후, 바이러스를 수거하고 원심분리 및 여과에 의하여 정제시킨다. 이것을 에틸렌이민 으로 AV 불활성화시킨다. 멸균 및 안정성을 시험한 후, 이 불활성화된 AV 항원으로부터 6개의 백신을 제조한다.

백신의 조성은 이후의 표 1(ml로 나타낸 데이터)에 기재되어 있다 :

*) 레시틴 99(독일연방공화국 6000 프랑크루르트 보르지갈레 6 소재의 Paesel GmbH Co.로부터)

이들 6개의 백신 각각을 0.2ml 사용하여 체중이 18 내지 20g인 20마리의 NMRI 마우스를 백신처리한다. 백신접종전 및 백신접종 4주후에 마우스로부터 혈액을 채취하여, 아우제스키 바이러스에 대한 중화 항체를 측정한다. 예방율을 측정하기 위하여, 마우스는 백신접종 4주 후에 200배 치사투여량의 아우제스키 바이러스를 투여받는다.

이 실험의 결과는 이후의 표 2에 기재되어 있다 :

이실험으로부터, 수산화아연 및 수산화철은, 백신 A의 표준 보조제 혼합물로 자극하는 것보다 항체역가 및 예방율을 촉진함이 명백해진다. 가장 높은 수치는 신규한 보조제 혼합물(백신F) 수산화아연 ＋ 수산화철 ＋ 레시틴 99로 달성된다.

[실시예 2]

실시예 1로부터의 각 백신 0.2ml를 체중 450 내지 500g인 3마리의 기니아 피그의 태반내 백신처리를 위해 사용한다. 기니아 피그는, 백신의 허용성을 설정하기 위하여 백신 접종된 발에 대한 종창 및 기타의 육안-병리학적 변화에 대하여 백신접종 후 28일 까지 매일 시험한다. 백신의 허용성과 함께 증가하는 허용성 스코어는 육안-병리학적 변화의 심각성 및 지속시간으로부터 계산한다. 또한, 아우제스키 방이러스에 대한 중화항체를 측정하기위하여 백신접종전 및 백신접종 4주후 혈액샘플을 채취한다.

실험의 결과는 표 3에 요약되어 있다 :

이 실험은, 본 발명에 따르는 보조제가 모두 표준 보조제 Al(OH)＋ 사포닌보다 내성이 상당히 우수함을 명백히 나타내준다. 중화항체역가로서 측정한, 수산화아연 및 수산화철 겔의 활성은 또한, 역시 측정한 표준보조제의 활성보다 우수하다. 양호한 허용도와 함께 최상의 활성은 수산화아연 ＋ 수산화철 ＋ 레시틴 99 혼합불(백신 F)로 달성된다.

[실시예 3]

실시예 1로부터의 백신 A 내지 F를 각각 2.0ml 사용하여 체중이 30 내지 35kg인 2마리의 피그를 피하내 백신 처리시킨다. 피그는 2개의 백신에 대한 허용성 스코어를 측정하기 위하여 주사부위에서의 종창 및 육안-병리학적 변화에 대하여 백신 처리후 3주후까지 매일 시험한다(참조 : 실시예 2).

백신접종시 및 백신접종 1주후, 2주후 및 3주후 피그로부터 혈액을 채취하여 아우제스키 바이러스에 대한 중화항체 역가를 측정한다.

실험의 결과는 표4에 기재되어 있다 :

*는 미만을 나타낸다.

이 실험은, 수산화아연 ＋ 수산화철 ＋ 레시틴 99 보조 혼합물(백신F)이표준 보조제 Al(OH)＋ 사포닌(백신A)보다 내성이 상당히 우수하고 보다 효과적임을 명백하게 나타낸다.

[실시예 4]

파라인플루엔자 3(Pl) 및 IBR(감염성 소 리노트라카이티스 바이러스) 바이러스를 우선 송아지 신장 배양물에서 성장시킨다. 배양물이 100% 바이러스-특이적 분해를 겪은 후, 바이러스를 수거하고 원심분리 및 여과에 의하여 정제시킨다.

이후 에틸렌이민을 사용하여 두가지 타입의 바이러스를 불활성화시킨다. 멸균 치 안정성을 시험한 후, 이들 불활성화된 항원으로 2개의 백신을 제조한다.

백신 A는 PI항원 4.5ml, IBR 항원 4.5ml 및 2% Al(OH)1.0ml을 함유한다.

백신 B는 PI항원 4.5ml, IBR 항원 4.5ml, 0.1M 수산화아연 0.4ml, 0.25M 수산화철 4.0ml 및 20% 레시틴 99 0.2ml을 함유한다.

이들 백신 각각을 1.0ml 사용하여, 3마리의 개에피하백신 처리하고, 4주후에 동일한 투여량의 백신으로 이들을 다시 백신 처리한다. 모든 개는 주사부위에서의 종창 및 기타의 육안-병리학적 변화에 대하여 접종 28일 후까지 및 백신재접종 7일 후까지 매일 시험하고 허용성을 평가한다.

백신접종전, 접종 4주후 및 백신재접종 1주후에 개로부터 혈액심플을 채취하여 PI및 IBR 바이러스에 대한 중화항체를 측정한다.

결과는 표 5에 기재되어 있다 :

백신 허용성 스코여 PIIBR PIIBR PIIBR에 대한 중화항체역가

＋ 실험말기에도 국소반응은 여전히 존재한다.

*는 미만을 나타낸다.

이 실험은, 개에서 백신 B중의 보조제 혼합물, 수산화 아연 ＋ 수산화철 ＋ 레시틴 99 이 백신 A중의 표준 보조제 Al(OH)보다 내성이 상당히 우수하고 보다 효과적임을 명백하게 나타낸다.

백신 B로 백신접종한 3마리의 개 모두에게서 IBR 바이러스에 대한 우수한 항체역가가 검출된다. 백신 A로 백신접종된 개들중, 단지 개 3마리만이 낮은 항체역가를 갖는다.

Claims

1 내지 45% V/V의 수산화아연 겔, 수산화철 겔 또는 이 모두를 보조제로서 함유하는 항원용액.

항원용액에 1 내지 45% V/V의 수산화아연 겔, 수산화철 겔 또는 이 모두를 보조제로서 첨가함을 특징으로하여, 항원 용액을 제조하는 방법.

제1항에 있어서, 1 내지 25% V/V의 레시틴이 추가로 첨가된 항원용액.

제2항에 있어서, 1 내지 25% V/V의 레시틴이 추가로 첨가되는 방법.