DK170224B1

DK170224B1 - Adjuveret antigenopløsning, dens fremstilling samt zink- eller jernhydroxidgel til anvendelse derved

Info

Publication number: DK170224B1
Application number: DK504389A
Authority: DK
Inventors: Dieter Bernhardt
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1988-10-12
Filing date: 1989-10-11
Publication date: 1995-07-03
Also published as: DK504389D0; EP0363835A1; DE3834729A1; FI894804A; FI894804A0; PT91953B; IE893283L; US5252327A; KR0162074B1; ES2058432T3; ATE90568T1; AU4276689A; CA1333257C; FI100946B; EP0363835B1; AU626920B2; JPH02149530A; KR900005986A; DK504389A; JP2756321B2

Description

DK 170224 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af zink- eller jernhydroxidgel og eventuelt et lecithin til adjuvering af antigenopløsninger samt på denne måde adjuve-rede antigenopløsninger.

5 Mange antigener er så lidt immunogene, at de efter injektion én gang til et dyr eller menneske ikke udløser nogen påviselig eller en kun ringe immunreaktion. For at forstærke organismens immunreaktion på en antigenpåvirkning sætter man derfor til antigenet adjuvanser. De fleste inak-10 tiverede virus- og bakterievacciner indeholder derfor adjuvanser. I de nævnte virus- og bakteriepodestoffer anvender man overvejende Al(OH)3 og A1P04, alene eller i kombination, planteolier eller fra jordoliefraktioner udvundne mineralolier, såkaldte medicinsk-pharmaceutiske paraffiner af en 15 ikke nøjagtigt defineret sammensætning. Freund’s adjuvans og inkomplet adjuvans, bestående af mineralolien "Bayol F®H med og uden ekstrakt af mycobakterier, anvendes overvejende i forsøgsvacciner.

Disse adjuvanser kan imidlertid foruden lokalreak-20 tioner også udvikle systemiske bivirkninger.

Foruden den lokale og almene forenelighed af adjuvanser er følgende af vital interesse: 1. deres immunologiske virkemekanisme, som de fremkalder; 25 2. deres pharmakokinetik (bionedbrydelighed).

Ad 1: Det er således alment kendt, at de mineralske adjuvanser (Al(OH)3, A1P04) overvejende kun fremkalder en humoral immunreaktion, medens den cellulære immunitet, som 30 ved mange virusinfektioner spiller en dominerende rolle, kun i ringe grad eller slet ikke stimuleres.

Anderledes forholder det sig med mineralolier og især Freund's adjuvans, der som bekendt stimulerer både den cellulære og den humorale immunreaktion.

35 Ad 2: De hidtil anvendelige adjuvanser forbliver for størstedelens vedkommende på injektionsstedet eller transpor- 2 DK 170224 B1 teres væk derfra og føres til andre organer i organismen, hvor de udvikler deres immunologiske og toksiske virkning, dvs. der sker ikke nogen nedbrydning eller udskillelse eller kun meget forsinket.

5 Anderledes forholder det sig med de her omhandlede 4 adjuvanser zinkhydroxid-gel, jernhydroxid-gel og lecithin.

Disse adjuvanser er i organismen underkastet stofskiftet.

De er derfor mindre toksiske.

I EP-A nr. 108 316 foreslås det foruden andre stoffer 10 at anvende forbindelser af zink, dvs. zinksalte, som tilsætningsstoffer til vacciner.

I for-forsøg på mus og marsvin har man imidlertid konstateret, at Zn-salte, såsom zinkchlorid, zinksulfat og zinkacetat, eller jernsalte, såsom jern(III)-chlorid, i 15 vandig opløsning er ret uforenelige lokalt og på ingen måde udviser en målelig adjuvansvirkning.

Man har imidlertid nu overraskende fundet frem til, at zinkhydroxid- og jernhydroxidgeler, som kan udvindes fra de tilsvarende saltopløsninger, udviser følgende egenskaber: 20 1. Zinkhydroxid- og jernhydroxidgeler er i besiddelse af meget gode adsorberende egenskaber (virus og protein) .

2. Zinkhydroxid- og jernoxidgeler er i besiddelse af 25 meget gode adjuverende egenskaber.

3. Zinkhydroxidgel fremkalder både humoral og cellulær immunitet.

4. Jernhydroxidgel fremkalder overvejende humoral immunitet.

30 5. Zinkhydroxid- og jernhydroxidgeler er sammenlignet med de hidtil gængse adjuvanser i besiddelse af en ^ ret god lokal og almen forenelighed.

6. Ved tilsætning af et lecithin til zinkhydroxid- og * jernhydroxidgel forstærkes den adjuverende virkning 35 af hydroxidgelerne yderligere, den lokale forenelighed forøges yderligere, og vaccinernes galenik forbedres.

3 DK 170224 B1

Fremgangsmådebeskrivelse af fremstillingen af zink-hydroxidgel, jernhydroxidgel og lecithin-99-suspension ifølge i og for sig kendte metoder.

Zinkhydroxidgel: 5 1. Gående ud fra ZnCl2, Zn-acetat x 2H20, ZnS04 x 7H20 - fremstilling af en 0,1 M opløsning i destilleret vand.

2. Gående ud fra Zn-carbonathydroxid - fremstilling af en 0,1 M opløsning i destilleret vand ved tilsætning 10 af 5 N HC1.

3. Sterilfiltrering af Zn-saltopløsningen (0,2 μιη mem-branfilter).

4. Under sterile betingelser og under omrøring sker tilsætningen af 10 N NaOH eller 10 N KOH, indtil en 15 pH-værdi på 6,0-7,8 er nået.

5. Den dannede zinkhydroxidgel kan yderligere homogeniseres ved hjælp af "Ultraturrax®"-behandling.

De her som udgangsforbindelser anvendte Zn-salte 20 tjener kun som eksempel. Også ud fra andre Zn-salte (også Zn-oxid) kan man ligeledes let fremstille zinkhydroxidgeler ifølge de beskrevne metoder. Det er ligeledes muligt direkte i en antigensuspension at fremstille en zinkhydroxidgel under pH-kontrol. Hvis man ikke arbejder med sterile Zn-25 -salt-opløsninger, men under usterile betingelser, kan gelen autoklaveres i 20 minutter ved 120°C.

J ernhydroxidgel:

Ved fremstilling af jernhydroxidgel arbejdes på samme måde som ved zinkhydroxidgelfremstillingen. Som udgangsfor-30 bindelse tjener en 0,25 M FeCl3-saltopløsning i destilleret i vand.

Fremstilling af en 20%'s lecithin-99-suspension: 1. 20 g lecithin suspenderes i 100 ml PBS, pH 7,2.

2. Autoklavering af suspensionen i 20 minutter ved 120eC.

35 3. Efter afkøling homogeniseres suspensionen.

4 DK 170224 B1 4. Indstilling af suspensionen med 10 N NaOH på pH 7,0 til 7,8.

Disse geler og eventuelt lecithinsuspensionen sættes til en antigenopløsning i følgende mængder: 5 Zinkhydroxidgel 1-45% *

Jernhydroxidgel 1 - 45%

Lecithinsuspension 1 - 25% På tale som antigener kommer virus-, bakterie-, celle-, peptid- og protein-antigener.

10 Følgende eksempler belyser fordelene ved de her om handlede immunstimulatorer/adj uvanser.

Eksempler Eksempel 1 15 Aujeszky’s sygdoms virus (AV) formeres i primære svi- nenyrecellekulturer. Efter at kulturerne er ødelagt 100% virusspecifikt, høstes viruset og renses ved centrifugering og filtrering. Herefter sker AV-inaktivering med ethylenimin.

Efter sterilitets- og sikkerhedsundersøgelse fremstilles 20 seks vacciner ud fra dette inaktiverede AV-antigen.

Sammensætningen af vaccinerne er anført nedenfor i tabel I (angivelser i ml):

Tabel I 25

Adj uvans/antigen VACCINE

A B C D E F

30

Al(OH)2 2%'S 39,5

Saponin 10%'s 0,5

Zn-hydr. 0,1 M-gel 40 20 17,5

Fe-hydr. 0,25 M-gel 40 20 17,5 35 Lecith. 99* 20%'S 40 5,0 AV-antigen 60,0 60 60 60 60 60,0 I alt 100,0 100 100 100 100 100,0 5 DK 170224 B1 *) Lecithin 99 (Fa. Paesel GmbH & Co., 6000 Frankfurt).

Med disse 6 vacciner vaccineres 20 NMRI-mus, der vejer 18-20 g, med 0,2 ml. Inden vaccinationen og 4 uger efter vaccination tappes dyrene for blod til bestemmelse af 5 de neutraliserende antistoffer over for Aujeszkyviruset.

Til bestemmelse af beskyttelsesgraden injiceres musene 4 uger efter vaccination med 200 letale doser Aujeszkyvirus.

Resultaterne af disse forsøg er anført nedenfor i tabel II.

10

Tabel II

Neutraliseret Neutraliseret antistoftiter antistoftiter Beskyttelsesgrad 15 Vaccine inden vacc. 4 uger efter vacc. (PD50) A mindre end 1:2 1:12 2,0 B " " 1:2 1:86 25,0 20 C " " 1:2 1:60 4,0 D " " 1:2 1:10 1,5 E " " 1:2 1:110 30,0 F " " 1:2 1:204 65,0 25 Også af dette forsøg fremgår det klart, at zinkhydro xid og jernhydroxid stimulerer højere antistoftiter og beskyttelsesgrad over for Aujeszkyviruset end standardadjuvans-kombinationen i vaccine A. De højeste værdier opnås med den hidtil ukendte adjuvanskombination (vaccine F) zinkhydroxid 30 + jernhydroxid + lecithin 99.

Eksempel 2

Med 0,2 ml vaccine fra eksempel 1 vaccineres 3 marsvin, der vejer 450-500 g, intraplantart. Dyrene undersøges 35 dagligt indtil 28. dagen efter vaccination for opsvulmninger og lignende patologisk anatomiske forandringer på den vaccinerede fod for at konstatere vaccinens uforenelighed. Efter alvorligheden og varigheden af de patologisk anatomiske 6 DK 170224 B1 forandringer udregnes en punktværdi for uforeneligheden, der er højere, jo mere uforenelig vaccinen er. Desuden udtages blodprøver fra dyrene før og 4 uger efter vaccinationen ‘ til bestemmelse af de neutraliserende antistoffer over for 5 Aujeszkyvirus. ti

Resultaterne af forsøget er sammenfattet i tabel III.

Tabel III

10 Neutraliseret Neutraliseret

Uforenelig- antistoftiter antistoftiter

Vaccine hedspunkter inden vacc. 4 uger efter vacc.

15 A 685 mindre end 1:2 1:8 B 212 * " 1:2 1:25 C 189 " 1:2 1:14 D 98 " 1:2 1:4 E 192 " " 1:2 1:34 20 F 140 - " 1:2 1:42

Dette forsøg viser tydeligt, at de her omhandlede adjuvanser alle er betydeligt mere forenelige end standard-adjuvansen Al(OH)3 + saponin. Virkningen af zinkhydroxid-25 og jernhydroxidgel, målt som neutraliserende antistoftiter, er ligeledes bedre end ved den medførte standardadjuvans.

Den bedste aktivitet ved god forenelighed opnås ved kombinationen zinkhydroxid + jernhydroxid + lecithin (vaccine F).

30

Eksempel 3

Med 2,0 ml vaccine A og F fra eksempel 1 vaccineres ^ subkutant 2 svin, der vejer 30-35 kg. Dyrene undersøges dagligt indtil 3. uge efter vaccination for opsvulmninger 35 og patologisk anatomiske forandringer på injektionsstedet til tilvejebringelse af punktværdierne for uforeneligheden for begge vacciner (se eksempel 2).

7 DK 170224 B1 På tidspunktet for vaccinationen, 1, 2 og 3 uger efter vaccinationen udtages en blodprøve fra dyrene til bestemmelse af den neutraliserende antistoftiter over for Aujeszkyviruset.

5 Resultaterne af forsøget er anført i tabel iv.

8 DK 170224 B1 • o o (0 h” μ 0) 0) 4-> OJ OO Tf * -P <w C" Η co Tf φ ·* ·· ·· «·

•Η Η Η Η H

U

4-> Φ i- tn <W 3 O co P · ϋ ω o (ΰ *H > +> μ a) β -μ o« vo

*H OO Tf Η H

0} ·· «· ti ·· Η Η Η H U * α> o) tn Ό β β og φ · o

κ. μ O

U «5 M φ >

m ω M

£ (1)

a *H +J OO OO 1Λ VD

C_J (io ·· ·· ·· ··

^ ιΗ 0) Η Η Η H

* * fd o) tn μ β -μ η μ · o α) ο (ΰ S > οο οο οο οο Μ Μ ·· ·· CJ Η Η Η Η Φ * * * * Ό

C

•Η ι μ tn φ

•Η 4J

ή Μ 'ϋ φ β β β μ ο- νο σι co Φ Φ ft co σ\ η οο μ φ Φ ο ό μ «Η φ >ο

Di β •Η μ s >i Η ΟΙ CO Tf ο μ φ * Φ Ό β >1 •Η +> U φ ο < fn Λ Φ > * DK 170224 B1 9

Dette forsøg viser klart, at adjuvanskombinationen zinkhydroxid + jernhydroxid + lecithin 99 (vaccine F) er væsentligt mere forenelig og virksom end standardadjuvansen Al(OH)3 + saponin (vaccine A).

5

Eksempel 4

Parainfluenzavirus 3-(PI3) og IBR-virus (infektiøs kvæg-Rhinotracheitis-virus) formeres i primære kalvenyrekul-turer. Efter at kulturerne er ødelagt 100% virusspecifikt, 10 høstes viruset og renses ved centrifugering og filtrering. Derefter følger inaktivering af begge virusarter med ethy-lenimin. Efter sterilitets- og sikkerhedsundersøgelse fremstilles med disse inaktiverede antigener 2 vacciner: 15 Vaccine A indeholder: PI3-antigen 4,5 ml IBR-antigen 4,5 ml A1(0H3), 2%'s 1,0 ml

Vaccine B indeholder: Pl3-antigen 4,5 ml 20 IBR-antigen 4,5 mg

Zinkhydroxid, 0,1 M 0,4 ml

Fe-hydroxid, 0,25 M 4,0 ml

Lecithin 99, 20%'s 0,2 ml 25 Med 1,0 ml af disse vacciner vaccineres subkutant 3 hunde, som revaccineres 4 uger efter med samme podedosis.

Alle dyrene undersøges dagligt indtil 28. dagen efter vaccination og indtil 7. dagen efter revaccination for opsvulmninger og lignende patologisk anatomiske forandringer på 30 injektionsstedet til bedømmelse af uforeneligheden.

Inden vaccination, 4 uger derefter og 1 uge efter revaccination udtages blodprøver på hundene til bestemmelse af de neutraliserende antistoffer over for PI3- og IBR-virus. Resultaterne er anført i tabel V.

35 DK 170224 B1 c 10 o

•H

lo c 'r! in r- « X 03 oe <o ω o\ ^ Cή S ...... ......

tt i? HHH HHH

Hg * * P *

P

<D

ij O 'i CO o o o P n iu in ί h σ»σιΐη

OHfljinnr^ooin S

4-i tt n 03 h nnn P Cn 0 3

g H

p c fl) o

-P -H

•H +J

-P G

<w C

0 "H

•P o 03 0 CJ "5j*

-Η (0 N CM N H 03 CO

•P tt > ............

G tt HHH HHH -P

(0 Η P * * * Φ

<D

(1)+) ®

Tj 4-4 03

G <D P

<D n O

P Η P 4-1 > <11 P-t CD -i cm co von^f 03 Φ <0 <? H CO tø 4-1 Η -H G (0

<U H

Λ G ^ O'

G P G

l·* +> G -H

GO G

0) -Η -P

S -P G

G H

G OM CM 03 030303 03 & *H ...... 4-1

O U HHH HHH G

HO * * * * * * G Ό

> <D

n G ^ HQ) 030303 030303 0) (¾ Tf .... .. .. .. .. Ό G HHH HHH 0) •H * * * * * * 4-> 01

ϋ H

0 -H

G + + + -P

> co vo o* in cø ___________^ 11 DK 170224 B1

Dette forsøg viser klart, at adjuvanskombinationen af vaccine B, zinkhydroxid + jernhydroxid + lecithin 99, hos hunde er væsentligt bedre forenelig og mere aktiv end stan-dardadjuvansen . Al (OH) 3 i vaccine A. Over for IBR-viruset 5 påvises ved alle 3 hunde, som er podet med vaccine B, gode antistoftitre. Af dyrene, som er podet med vaccine A, udviser kun dyr nr. 3 en ringe antistoftiter.

Claims

1. Anvendelse af zinkhydroxidgel eller jemhydroxidgel og eventuelt lecithin til adjuvering af en antigenopløsning. 0

2. Antigenopløsning adjuveret ifølge krav 1, k e n-5 detegnet ved, at der til antigenopløsningen er sat Ψ 1-45 % volumen/volumen zinkhydroxidgel eller 1-45 % volumen/volumen jernhydroxidgel og eventuelt 1-25 % volumen/volumen lecithin.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af en adjuveret 10 antigenopløsning, kendetegnet ved, at man til en antigenopløsning sætter 1-45% volumen/volumen zinkhydroxidgel elelr 1-45 % volumen/volumen jernhydroxidgel og eventuelt 1-25% volumen/volumen lecithin. 15 \