FI100946B - Menetelmä adjuvanttia sisältävän antigeeniliuoksen valmistamiseksi - Google Patents

Description

100946

Menetelmä adjuvanttia sisältävän antigeeniliuoksen valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää adjuvanttia sisältävän 5 antigeeniliuoksen valmistamiseksi, jolloin sinkki- ja rau-tahydroksidigeeliä ja mahdollisesti lesitiiniä käytetään antigeeniliuoksen adjuvantteina.

Useat antigeenit ovat niin heikosti immunogeenisia, että ne yhden eläimelle tai ihmiselle suoritetun injektion 10 jälkeen saavat aikaan tuskin mitattavaa tai vain vähäisen immuunivasteen. Niinpä organismin immuunivasteen vahvistamiseksi antigeeniärsytyksen suhteen antigeeniin lisätään adjuvantteja. Tästä syystä useimmat inaktivoidut virusja bakteerirokotteet sisältävät adjuvantteja. Mainituissa vi-15 rus- ja bakteerirokotteissa käytetään pääasiallisesti Al(OH)3:a ja AlP04:a, erillisinä tai yhdistelminä, ja kasviöljyjä tai maaöljyfraktioista saatuja mineraaliöljyjä, ns. lääkekäyttöön sopivia farmaseuttisia valkoöljyjä, joiden koostumus ei ole tarkasti määritelty. Koekäyttöön val-20 mistetuissa rokotteissa käytetään pääasiallisesti Freund1in täydellistä ja epätäydellistä adjuvanttia, jotka sisältävät mineraaliöljyä Bayol F ja edellinen lisäksi mykobakteeri- • · "... uutetta, jota jälkimmäisessä ei ole.

\v Nämä adjuvantit voivat kuitenkin paikallisten reak- 25 tioiden lisäksi aiheuttaa systeemisiä sivuvaikutuksia.

:*·*: Paikallisen ja yleisen siedettävyyden ohella adju- vanttien valinnassa tulisi erityisesti kiinnittää huomiota • · seuraaviin: j·. 1. immunologinen vaikutusmekanismi, jonka ne saavat aikaan; • »« 30 2. niiden farmakokinetiikka (biologinen hajoavuus) .

• · ·

Kohta 1: Yleisesti tiedetään, että mineraaliadjuvantit • · S/·· (Ai (OH) 3, A1P04) saavat aikaan vain nesteimmuunivasteen, kun sen sijaan soluimmuniteettia, joka useissa virusinfektioissa on vallitsevana, kehittyy vain vähäisessä määrin tai ei 35 lainkaan.

2 100946

Toisin vaikuttavat mineraaliöljyt ja varsinkin Freund'in adjuvantti, joka stimuloi tunnetusti sekä solu-että nesteimmuunivastetta.

Kohta 2: Tähän asti käytetyt adjuvantit jäävät suu-5 relta osaltaan injektiopaikkaan tai kulkeutuvat ja rikastuvat organismin muihin elimiin, joissa niiden immunologinen ja myrkkyvaikutus kehittyy, toisin sanoen hajoamista tai erittymistä ei tapahtu tai tapahtuu vain erittäin hi-dastetusti. Keksinnössä käytettävät adjuvantit, sinkkihyd-10 roksidigeeli, rautahydroksidigeeli ja lesitiini suhtautuvat toisin. Ne osallistuvat organismin aineenvaihduntaan. Ne ovat siten vähemmän myrkyllisiä.

EP-A-julkaisussa 108 316 (DE-hakemusjulkaisu 3 241 113) ehdotettiin muiden aineiden lisäksi sinkin käyttöä 15 sinkkisuoloina rokotteiden lisäaineina.

Hiirillä ja marsuilla tehdyissä esikokeissa on kuitenkin osoittautunut, että Zn-suolat kuten sinkkikloridi, sinkkisulfaatti ja sinkkiasetaatti tai rautasuolat kuten rauta-III-kloridi ovat vesiliuoksina paikallisesti käytet-20 tyinä sangen huonosti siedettyjä ja ettei niillä saada minkäänlaista mitattavissa olevaa adjuvanttivaikutusta.

Nyt on kuitenkin yllättäen keksitty, että sinkkihyd-roksidi- ja rautahydroksidigeeleillä, joita voidaan saada ·.·.· vastaavista suolaliuoksista, on seuraavia ominaisuuksia: 25 1. Sinkkihydroksidi- ja rautahydroksidigeelit ovat erittäin :Y: hyvin adsorboivia (virus ja proteiini).

2. Sinkkihydroksidi- ja rautahydroksidigeeleillä on erit- • · täin hyvät adjuvanttiominaisuudet.

;·. 3. Sinkkihydroksidigeeli saa aikaan sekä neste- että solu- • · · 30 immuniteetin.

• · « • · · 4. Rautahydroksidigeeli saa aikaan pääasiassa nesteimmuni- • · teettia.

5. Sinkkihydroksidi- ja rautahydroksidigeelien siedettävyys sekä paikallisesti että yleisesti on sangen hyvä verrattuna ,35 tähän asti tavallisesti käytettyjen adjuvanttien siedettä-vyyteen.

3 100946 6. Lisäämällä sinkkihydroksidi- ja/tai rautahydroksidigee-liin lesitiiniä hydroksidigeelien adjuvanttivaikutus vahvistuu, paikallinen siedettävyys paranee ja rokotteiden galeenisuus edelleen paranee.

5 Keksinnön mukaiselle menetelmälle adjuvanttia sisäl tävän antigeeniliuoksen valmistamiseksi on tunnusomaista, että antigeeniliuokseen lisätään 1-45 tilavuus-/tilavuus-% sinkkihydroksidigeeliä ja/tai 1-45 tilavuus-/tilavuus-% rautahydroksidigeeliä ja mahdollisesti 1-25 tilavuus-/tila-10 vuus-% lesitiiniä.

Sinkkihydroksidigeelin, rautahydroksidigeelin ja lesitiini-99-suspension valmistuksen kuvaus sinänsä tunnetulla valmistusmenetelmällä:

Sinkkihydroksidigeeli: 15 1. Kun lähtöaineina on ZnCl2, Zn-asetaatti · 2H20 tai

ZnS04-7H20, valmistetaan Ο,Ι-m liuos tislattuun veteen.

2. Kun lähtöaineena on Zn-karbonaattihydroksidi, valmistetaan 0,1-m liuos tislattuun veteen lisäämällä 5-m HCl-liuosta.

20 3. Zn-suolaliuos steriilisuodatetaan (0,2μτη membraanisuoda- tin) · 4. Steriileissä olosuhteissa lisätään sekoittaen 10-m NaOH- • » '··' tai 10-m KOH-liuosta kunnes pH-arvo 6,0-7,8 saavutetaan.

• · · 5. Saostunut sinkkihydroksidigeeli voidaan edelleen homo- 25 genoida RUltraturrax-käsittelyllä.

• · · ί,ί · Tässä lähtöaineina käytetyt Zn-suolat ovat vain esi- merkkejä. Kuvatulla menetelmällä voidaan myös muista Zn-suoloista (myös Zn-oksidista) helposti valmistaa sink-kihydroksidigeelejä. On myös mahdollista valmistaa sinkki-3 0 hydroksidigeeli säädetyissä pH-olosuhteissa suoraan anti- • · · geenisuspensiossa. Jos Zn-suolaliuos ei ole steriili, vaan • · ·.*·· valmistus tapahtuu epästeriileissä olosuhteissa, voidaan geeli steriloida autoklaavissa 120 °C:ssa 20 minuuttia. Rautahydroksidigeeli: 35 Rautahydroksidigeelin valmistusmenetelmä on analo- 4 100946 ginen Zn-hydroksidigeelin valmistuksen kanssa. Lähtöaineena käytetään 0,25-m FeCl3-liuosta tislatussa vedessä.

20 %:isen lesitiini-99-suspension valmistus: 1. 20 g lesitiiniä suspendoidaan pH-arvossa 7,2 100 ml:aan 5 PBS:ää 2. Suspensio steriloidaan autoklaavissa 120 °C:ssa 20 minuuttia .

3. Jäähtynyt suspensio homogenoidaan.

4. Suspension pH säädetään 10-m NaOH-liuoksella 7,0 10 7,8:ksi.

Näitä geelejä ja mahdollisesti lesitiinisuspensiota lisätään antigeeniliuokseen seuraavat määrät: sinkkihydroksidigeeliä 1-45 % rautahydroksidigeeliä 1-45 % 15 lesitiinisuspensiota 1-25 %

Antigeeneinä tulevat kysymykseen virus-, bakteeri-, solu-, peptidi- ja proteiiniantigeenit.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnössä käytettävien immuunistimuloivien adjuvanttien etuja.

20 Esimerkki 1

Auj eszky-tautivirusta (AV) viljeltiin primaarisissa sian- munuaissoluviljelmissä. Kun viljelmät oli 100-%:isesti vi- ' rus-spesifisesti tuhottu, virus otettiin talteen ja puhdis- :.V tettiin linkoamalla ja suodattamalla. Tämän jälkeen suori- 25 tettiin AV-inaktivointi etyleeni-imiinillä. Steriiliys- ja turvallisuuskokeilun jälkeen tästä inaktivoidusta AV-anti-geenistä valmistettiin 6 rokotetta.

• ·

Rokotteiden koostumukset on esitetty taulukossa 1 :·. (luvut ovat millilitroja) : • ·· • · « • « 1 • ♦ · · • · · • · · • · 100946 5

Taulukko 1

Adjuvantti/antigeeni Rokote

5 A B C D E F

Ai(OH)3, 2-%:inen 39,5

Saponiini, 10-%:inen 0,5

Zn-hydroksidi, 10 0,1-m geeli 40 20 17,5

Fe-hydroks idi, 0,25-m geeli 40 20 17,5

Lesitiini 99*, 20-%:inen 40 5,0 15 AV-antigeeni 60,0 60 60 60 60 60,0

Yhteensä 100,0 100 100 100 100 100,0 *) Lesitiini 99 (Fa. Paesel GmbH & CO. Borsigallee 6, 6000 20 Frankfurt) . Näillä 6:11a rokotteella rokotettiin käyttäen kul loinkin 0,2 ml rokotetta 20 NMRI-hiirtä (paino 18-20 g). '··* Ennen rokottamista ja 4 viikkoa rokottamisen jälkeen eläi- mistä otettiin verta, josta määritettiin Aujeszky-viruksen 25 vastaiset neutraloivat vasta-aineet. Suoja-asteen määrittä- • · * ί#ϊ : miseksi hiiriin tartutettiin 4 viikon kuluttua rokotuksesta 200 kuolettavalla annoksella Aujeszky-virusta. Tämän kokeen • · tulokset nähdään seuraavassa taulukossa 2.

• · • · • · · • •1 • · ·

I I I

Φ • · • · · • · · • · 6 100946

Taulukko 2

Ro- Neutral, vasta-aine- Neutral, vasta-aine- Suoja-aste ko- titteri ennen roko- titteri 4 viikkoa (pd50) te tusta rokotuksen jälkeen 5 A pienempi kuin 1:2 1:12 2,0 B " "1:2 1:86 25,0 C "1:2 1:60 4,0 D " "1:2 1:10 1,5 E " " 1:2 1:110 30,0 10 F " " 1:2 1:204 65,0 Tästä kokeesta ilmenee selvästi, että sinkkihydrok-sidi ja rautahydroksidi saavat aikaan korkeampia vastaa-inetittereitä ja suoja-asteita Aujeszky-virusta vastaan 15 kuin standardiadjuvanttiyhdistelmä rokotteessa A. Korkeimmat arvot saadaan uudella adjuvanttiyhdistelmällä (rokote F) sinkkihydroksidi + rautahydroksidi + lesitiini 99. Esimerkki 2

Esimerkin 1 rokotteilla käyttäen 0,2 ml rokotetta rokotet- . 20 tiin jalkapohjansisäisesti kullakin 3 marsua (paino 450- ;· 500 g). Rokotteiden siedettävyyden määrittämiseksi eläinten rokotetta saanutta jalkaa tarkkailtiin päivittäin aina 28 V.· päivään asti rokottamisesta mahdollisten turvotusten ja muiden patologis-anatomisten muutosten toteamiseksi. Pato- 25 logis-anatomisten muutosten vaikeusasteen ja keston mukaan ;V: laskettiin siedettävyydelle pistearvo, joka on sitä kor- • · keampi mitä huonommin siedettävä rokote on. Lisäksi eläi- ;·, mistä otettiin ennen rokottamista ja 4 viikkoa rokottamisen * · · jälkeen verinäytteitä, joista määritettiin neutraloivat • · · 30 vasta-aineet Aujeszky-virusta vastaan. Kokeen tulokset on • · V*j koottu taulukkoon 3 .

7 100946

Taulukko 3

Rokote Siedettä- Neutr.vasta-aine- Neutr. vasta-aine-vyyspiste- titteri ennen titteri 4 viikkoa arvo rokottamista rokottamisen jälkeen 5 A 685 pienempi kuin 1:2 1:8 B 212 " " 1:2 1:25 C 189 " " 1:2 1:14 D 98 " "1:2 1:4 E 192 " " 1:2 1:34 10 F 140 " " 1:2 1:42 Tämä koe osoittaa selvästi, että keksinnössä käytettävät adjuvantit ovat kaikki aivan huomattavasti paremmin siedettyjä kuin standardiadjuvantti Ai(OH)3 + saponiini. Sinkki-15 hydroksidi- ja rautahydroksidigeelin vaikutus, kun mittana käytetään neutraloivaa vasta-ainetitteriä, on samoin parempi kuin vertailuna olevalla standardiadjuvantilla. Paras vaikutusteho ja samalla hyvä siedettävyys saavutetaan yhdistelmällä sinkkihydroksidi + rautahydroksidi + lesitiini 20 99 (rokote F).

: Esimerkki 3 ' Esimerkin 1 rokotteilla A ja F rokotettiin kummal- V.; lakin 2 sikaa (30-35 kg) ihonalaisesti 2,0 ml:11a rokotet- /1' ta. Eläimet tutkittiin päivittäin 3 viikon ajan rokotukses- 25 ta injektiopaikan mahdollisten turvotusten ja patologis-- « ·*;*; anatomisten muutosten toteamiseksi ja kummankin rokotteen • · siedettävyyden pistearvon määrittämiseksi (katso esimerkki ·· 2) .

• · • · ·

Rokotuksen ajankohtana, 1, 2 ja 3 viikkoa rokotuksen • · · 30 jälkeen eläimistä otettiin verta neutraloivan vastaainetit- • · V*: terin määrittämiseksi Aujeszky-virusta vastaan. Kokeen tu lokset nähdään taulukossa 4: e 100946

Taulukko 4

Rokote Eläin Siedettävyys- Neutr. vasta-ainetitteri_ pistearvo ennen __1_2_3_ roko- viikkoa rokotuksesta 5 tusta A 1 87 *1:2 *1:2 *1:2 1:7 2 96 *1:2 *1:2 1:4 1:12 10 F 3 19 *1:2 1:5 1:17 1:32 4 28 *1:2 1:6 1:16 1:44 * tarkoittaa pienempi kuin Tämä koe osoittaa selvästi, että adjuvanttiyhdistel-15 mä sinkkihydroksidi + rautahydroksidi + lesitiini 99 (rokote F) on olennaisesti paremmin siedetty ja vaikuttava kuin standardiadjuvantti Al(OH)3 + saponiini (rokote A).

Esimerkki 4

Parainfluessa 3-(PI3) - ja IBR- (infektoiva naudan rhinot- 20 racheitis-virus) virusta kasvatettiin primaarisissa vasi- . kanmunuaisviljelmissä. Kun viljelmät oli 100-%:isesti vi- j russpesifisesti tuhottu, virus otettiin talteen ja puhdis- • · '·* tettiin linkoamalla ja suodattamalla. Sen jälkeen molemmat V.· viruslajit inaktivoitiin etyleeni-imiinillä. Steriiliys- ja 25 turvallisuuskokelden jälkeen näistä inaktivoiduista anti- • · · 5^5 t geeneistä valmistettiin 2 rokotetta:

Rokote A sisälsi: • ·

Plj-antigeenia 4,5 ml ;·. IBR-antigeenia 4,5 ml • ·» 30 AI (OH) 3, 2-%: ista 1,0 ml • » ·

Rokote B sisälsi: • ♦ ·.*·· PI3-antigeeniä 4,5 ml 'IBR-antigeenia 4,5 ml

Zn-hydroksidia, 0,1-m 0,4 ml '1' 35 Fe-hydroksidia, 0,25-m 4,0 ml

Lesitiini 99, 20-%:ista 0,2 ml 100946 9 Näillä rokotteilla rokotettiin (1 ml se,) kummallakin 3 koiraa, jotka rokotettiin uudelleen vielä 4 viikon kuluttua samalla annoksella. Kaikki eläimet tutkittiin päivittäin aina 28. päivään asti rokotuksesta ja 7. päivään 5 asti uudelleenrokotuksesta mahdollisten infektiopaikan turvotusten ja muiden patologis-anatomisten muutosten toteamiseksi ja siedettävyyspistearvon määrittämiseksi.

Ennen rokottamista, 4 viikkoa rokottamisen jälkeen ja 1 viikko uudelleenrokottamisen jälkeen koirista otettiin 10 verta neutraloivien vasta-aineiden määrittämiseksi PI3- ja IBR-virusta vastaan. Tulokset on koottu taulukkoon 5: Taulukko 5

Rokote Siedettävyys- Neutr. vasta-ainetitteri_ oistearvo PI3:n IBR:n PI3:n IBP:n PI3:n IBP:n 15 l.rok. 2.rok. suhteen suhteen suhteen ennen rok. 4 viik. 1 viik.uud.

rok.jälkeen rok.jälkeen 20 1 24 8+ 11:2 11:2 64 11:2 3550 11:2 A 2 21 6+ 11:2 11:2 42 11:2 2344 11:2 ’ 3 19 7+ 11:2 11:2 18 11:2 1178 1:6 » · 4 8 5 11:2 11:2 86 1:12 3090 1:85 25 B 5 7 6 11:2 11:2 63 1:24 3090 1:97 6 4 4 11:2 11:2 74 1:8 3550 1:43 • t • · · • · · - • · + Kokeen päättyessä paikallinen reaktio vielä havaittavissa * Tarkoittaa pienempi kuin • · · 30 • · · • · · Tämä koe osoittaa selvästi, että koirat sietävät • · olennaisesti paremmin rokotteen B adjuvanttiyhdistelmää t Ί": sinkkihydroksidi + rautahydroksi + lesitiini 99 kuin rokot-

teen A standardiadjuvanttia Ai(OH)3 ja että rokote B lisäk-35 si on paremmin vaikuttava. Kaikissa 3:ssa rokotteella B

Claims (1)

100946 rokotetussa koirassa saatiin hyvä vasta-aine-titteri IBR-virusta vastaan. Rokotteella A rokotetuista koirista vain koiralla 3 saatiin vähäinen vasta-ainetitteri. 5 Patenttivaatimus: Menetelmä adjuvanttia sisältävän antigeeniliuoksen 10 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että antigeeni-liuokseen lisätään 1-45 tilavuus-/tilavuus-% sinkkihydrok-sidigeeliä ja/tai 1-45 tilavuus-/tilavuus-% rautahydroksi-digeeliä ja mahdollisesti 1-25 tilavuus-/tilavuus-% lesitiiniä . 15 20 Förfarande för framställning av en antigenlösning som innehäller adjuvans, kännetecknat därav, : att i en antigenlösning tillsätts 1-45 volym-/volym-% :Y: zinkhydroxidgel och/eller 1-45 volym-/volym-% järnhyd- <·· 25 roxidgel och eventuellt 1-25 volym-/volym-% lecitin. ··«· • · · « · · • · · • · • · · I I I t · • · • · I ·· • · · • · · • · · 1 4 « · • · · • · · f ·