KR970010544B1 - 한탄바이러스 항원과 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 함유하는 혼합항원 조성물 - Google Patents

Abstract

내용없음.

Description

한탄바이러스 항원과 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 함유하는 혼합항원 조성물

제1도는 알루미늄 겔의 농도에 따른 한탄바이러스에 대한 항체가의 변화를 나타내는 그래프이다.

제2도는 알루미늄 겔의 농도에 따른 리켓챠 쯔쯔가무시에 대한 항체가의 변화를 나타내는 그래프이다.

제3도는 최종 혼합백신으로 면역시킨 랫트에서의 항체형성을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 한탄바이러스 항원과 리케챠 쯔쯔가무시 항원을 함유하는 혼합항원 조성물에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 신증후출혈열 및 쯔쯔가무시병 등 두가지 질환에 대해 동시에 면역원성을 나타내도록 한탄바이러스 항원과 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 백신 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

우리나라에서는 매년 급성열성 출혈열 질환으로 한탄바이러스로 인한 신증후출혈열과 리켓챠 쯔쯔가무시로 인한 쯔쯔가무시병이 주류를 이루어 유행하고 있다. 이들 두가지 종류의 출혈성 질환은 입상증상이 유사할 뿐만 아니라 환자 발생시기도 비슷하며, 또 자연계 보균동물도 설치류라는 점에서 역학적으로 유사한 점이 많은 것으로 알려져 있다.

쯔쯔가무시병은 리켓챠 쯔쯔가무시가 체내에 침입하여 발생하는 급성발열 질환이며, 1989년에는 장우현증이 전극 20개 병원 내원환자 2,295명중 965명의 쯔쯔가무시병 환자를 확인하는 등 매년 증가하는 추세에 있다. [참조 : 장우현 등, 대한미생물학회지 ,25 : 227(1989)]. 한편, 한탄바이러스에 의해 발병하는 신증후출혈열도 1976도 최초로 확인된 이래로 매년 수백명의 환자가 발생하고 있다[참조 : Lee, H. W., Rev. Infect. Dis., 2 : 864(1989)].

신증후출혈열에 대해서는 1988년 예방백신이 개발되어 현재 시판중에 있으나(이호왕 등, 대한미생물학회지, 18 : 143(1988)). 아직 광범위하게 공급되지 않고 있으며, 쯔쯔가무시병 예방백신은 1991년 백신용 한원정제에 대한 보고서가 있는 이래로(김태연 등, 미생물학회지, 26 : 337(1991)), 예방백신은 개발단계에 있다.

쯔쯔가무시병과 신증후출혈열은 발병초기의 증상이 비슷하기 때문에 임상적으로 정확한 진단이 곤란할 때가 많고, 적절한 치료가 되지 않았을 때 치사율도 높다. 따라서, 이들을 예방하기 위해서는 신증후출혈열 백신과 쯔쯔가무시 백신을 중복해서 접종받아야 하는 번거로움과 경제적 손실이 예상되어, 이에 대한 대책으로 혼합백신의 필요성이 대두되었다. 한편, 이들 두가지 질환에 대해 동시에 방어할 수 있는 혼합백신을 만들기 위해서는 각각의 백신을 충분한 효과가 나타나도록 최적 혼합비율을 결정하여야 하며, 두가지 백신에 공통적으로 효과적인 보조제 및 첨가제를 결정하여야 한다는 문제점이 있었다.

이에 본 발명자는 마우스의 뇌에서 정제한 한탄바이러스 항원과 수정란의 난황막에서 정제한 쯔쯔가무시 항원을 혼합하여 제조된 혼합백신으로 두가지 질환에 대해 동시에 면역효과를 나타내는 백신제제를 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 리켓챠 쯔쯔가무시를 수정란의 난황막에서 배양하여 정제하고, 한탄바이러스를 마우스 뇌에서 배양하여 정제한 다음 각각의 항원을 면역효과를 그대로 유지하는 상태로 혼합제조하는 방법과 그 방법에 의해 제조되며 동시면역 효과를 나타내는 백신을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 백신 제조공정에 관하여 상술한다.

1. 한탄바이러스의 배양 및 백신 원액의 제조

한탄바이러스의 항원을 얻기 위해서는 신증후출혈열의 병원체인 한탄바이러스 ROK84-105주(ATCC VR-2250)를 젖빨이 마우스의 뇌내에 접종하여 증시되도록 적응시킨 것을 사용하였다. 접종후 약 10일 후 뇌염증세가 나타나기 시작하면, 마우스 뇌를 채취하여 0.01M 인산염 완충용액(pH 7.2)으로 20% 유제를 만들고 프로타민 설페이트(protamine sulfate)를 첨가한 후, 원심분리하여 상층액을 회수하고 여기에 에탄올을 처리한 뒤 원심분리하여 침전물을 모은다. 이 침전물을 인산염 완충액에 현탁시킨 다음 다시 프로타민 설페이트를 재차 처리하고 원심분리하여 상층액을 모아 이를 한탄바이러스 항원원액으로 한다. 기존의 방법과는 달리, 프로타민 설페이트를 반복처리하므로써 정제도를 높여, 리켓챠 쯔쯔가무시 항원과 혼합할 때 발생하는 단백함량의 부족문제를 높은 항원역가로 보충한다.

2. 한탄바이러스 항원원액의 불활화.

상기의 항원원액을 통상의 방법, 예를 들면, 포름알데히드를 처리하여 불활화시킨다. 이 경우 포름알데히드를 0.01 내지 0.05%(v/v)의 농도로 첨가한 후, 처리기간에 따른 치사율 변화와 감염율을 관찰하여 적절한 처리기간과 농도를 결정한다. 또한, 불활화 여부를 확인하기 위해 VeroE6세포(ATCC CRL-1586)에 불활화 처리를 한 항원을 접종하여 계대배양하면서 간접면역 형광항체법을 실시하여 항원양성세포가 없음을 확인한다. 또한, 정제 완료 후 항원원액중의 포름알데히드의 잔량을 공지의 방법인 아세틸아세톤을 이용하여 포름알데히드를 정량하고 제거여부를 확인한다.

3. 리켓챠 쯔쯔가무시의 배양, 정제 및 백신 원액의 제조

수정란의 난황막 순화주를 리켓챠 쯔쯔가무시 항원 제조용 균주로 사용한다. 위의 균주를 수정란의 난황막에 배양한 다음 이를 정제하기 위해서는 양이온 교환수지를 사용한 흡착법, 원심분리법 및 밀도구배 원심분리법 등을 조합시켜 사용한다. 즉, 앰버라이트(Amberlite, Sigma, U, S. A.)와 같은 양이온 교환수지를 이용하여 난황물질들을 여기에 흡착시킨 후 원심분리시켜 제거하고, 이를 다시 밀도구배 원심분리를 행하여 리켓챠 쯔쯔가무시 항원을 정제한다. 정제된 항원은 혼합백신에 사용될 수 있도록 한탄바이러스 정제에 쓰이는 인산염 완충액에 희석한 다음 원심분리하고 침전물을 회수하여 다시 인산염 완충액에 현탁한다.

이와 같이 얻어진 항원원액을 제균여과할 수 있도록 수용액화하기 위해서 균체를 파쇄한다. 이 경우 계면할성제를 이용하거나, 초음파 파쇄법 또는 이들의 적절한 조합을 사용한다. 이렇게 해서 파쇄된 리켓챠 쯔쯔가무시 항원 원액은 제균여과하고, 여과액을 희석하여 브래드포드(Bradford)법에 의해 단백함량의 측정치가 1 내지 50㎍/ml이 되도록 조제한다[참조 : Bradford, Anal. Biochem., 72 : 248(1976)]. 이와 같이 조제된 레켓챠 쯔쯔가무시 항원액은 길리암(Gilliam)주를 이용한 항원액과 카프(Karp)주를 이용한 항원액을 최대의 항체가(antibody titer)를 나타내는 비율로 혼합한다. 이 항원을 유행성 출혈열(쯔쯔가무시병, 신증후출혈열) 예방용 혼합백신의 유효성분으로 사용할 수 있다.

4. 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 불활성

리켓챠 쯔쯔가무시의 불활화 방법으로는 공지의 방법 즉, 포름알데히드, 글루타르디알데히드, 에틸렌옥사이드, 베타프로피오락톤, 카르보디이미도, 감마선 및 자외선 등에 의한 불활화 방법 등의 채용이 가능하다. 그러나, 이들중 병원성이 강한 리켓챠 쯔쯔가무시의 감염성을 안전히 실할시키고 항원성과 높은 면역원성을 함께 가지는 제품을 얻기 위해서는 포름알데히드를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 포름알데히드는 앞으로 혼합할 기존의 한탄바이러스 항원의 불활화에도 사용되고 있으므로, 이들 두가지 항원을 혼합하는 혼합백신을 제조할 때 불활화 실험과 불활화제의 잔류함량 검사 등이 간편하다는 잇점이 있다.

또한, 불활화제의 첨가시기는 정제공정의 중간과정에 처리하며 정제과정중에 제거될 수 있다. 이 경우 따로 불활하제를 제거하기 위한 과정이 추가되지 않으므로 항원성과 면역원성의 손실을 막을 수 있다. 예를 들면, 시판하는 포르말린(37%(w/v) 포름알데히드 수용액)을 사용하는 경우 난황막의 균질액에 0.05 내지 0.5%(w/v)가 되도록 첨가하여 혼합한다. 첨가 혼합 후 얻어지는 혼합물은 약 4 내지 37℃에서 약 5내지 50일간 보존한다. 또, 불활화 개시와 동시에 이와 병행해서 불활화의 진행상황을 추적하기 위해 불활화 보존중의 포르말린을 첨가 혼합한 난황막 균질액으로부터 그 일부를 1 내지 7일 마다 샘플링한 피검체의 각각에 대해서 공지의 생리적 식염수를 외액으로 하는 투석에 의해 포름알데히드를 제거한 후, 리켓챠 쯔쯔가무시 감염을 측정한다. 리켓챠 쯔쯔가무시 감염가는 공지의 방법인 플라크 형성방법으로 측정한다[참조 : Wike, Infect. Immun., 5 : 715(1972)].

한편, 피검체를 접종한 세포로 상술한 간접면역 형광항체법을 실시하여 항원양성 세포가 업음을 확인하고, 이를 계대배양하여 계대전 세포배양에서도 상기와 같이 항원 양성세포가 없음을 확인한다. 또한 정제완료 후, 항원원액중의 포름알데히드의 잔량은 공지의 방법인 아세틸아세톤을 이용하여 포름알데히드를 정량하고 제거여부를 확인한다.

5. 한탄바이러스 항원과 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 혼합백신 제조

전술한 두가지 항원액을 각각의 면역기능을 적절히 유지하며 혼합하는 조건을 결정하여야 한다. 한탄바이러스 항원액을 여러가지 역가(ELA antigen titer)로 희석하고 쯔쯔가무시 항원 또한 같은 방법으로 희석한 다음, 두가지 항원을 각기 다른 비율로 혼합하여 이를 랫트(rat)에 접종하여 최적 희석배수 및 혼합비율을 결정한다. 상기에서 결정된 혼합항원액에 면역보조제인 수산화 알루미늄겔을 여러가지 농도로 첨가하여 항체 생성률이 가장 양호한 첨가농도를 결정하였다. 이렇게 결정된 최적 항원원액을 혼합백신 원액으로 사용한다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

한탄바이러스 제조

1일령의 젖빨이 마우스에 한탄바이러스 ROK84-105주(Hantan virus ROK84-, ATCC VT-2250)를 접속하고 약 10일간 사육하여 완전히 마비를 일으킨 마우스의 두부를 절개하고, 그 뇌를 채취하여 여기에 뇌중량에 대하여 4배량의 0.01M인산염 완충용액(pH 7.2)을 첨가하여 유화시키고, 6,000rpm으로 40분간 원심분리하여 수득되는 상층액을 바이러스액으로 하였다. 이 바이러스의 항원의 역가는 공지의 ELA 방법으로 측정한 결과 8, 192를 나타내었다.

[실시예 2]

한탄바이러스 백신의 제조

상기의 바이러스액당 프로타민 설페이트를 0.1 내지 0.5mg/ml로 처리한 후, 18,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 모았다. 여기에 에탄올을 30%(w/v)의 농도로 처리하고 4℃에서 16 내지 20시간 방치한 후, 12,000rpm에서 30분간 원심분리하여 수득하고, 이를 전기 인산염 완충용액(pH 7.2)에 다시 현탁한 다음, 바이러스액당 프로타민 설페이트를 0.1 내지 0.5mg/ml로 처리하였다. 그런다음, 18,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하고, 4℃에서 10일간 포르말린으로 불활화시킨 후 이를 한탄바이러스 백신원액으로 하였다.

[실시예 3]

리켓챠 쯔쯔가무시의 제조

수정란의 난황막에서 100대 이상 계대되어 난황막 배양에 순환된 리켓챠 쯔쯔가무시 길리암주(Rickettsia tsutsugamushi Gillian strain, ATCC VR-312)와 카프주(Rickettsia tsutsugamushi Ka2p strain, ATTC- VT-150)를 스크로스 및 글루탐산을 함유한 0.01M인산완충 엄화나트륨 용액(pH 7.2, 이하 '균주희석액'이 라 함)을 사용하여 균주를 적정빙비율로 히석한 다음, 이들 0.1ml 수정란의 난항난에 접종하여 35℃에서 배양하면서 전페 주성라의 30% 정도가 사멸하였을 때 생존한 수정란의 난항막을 채취하여 경제에 사용하는 원료물질로 하였다.

[실시예 4]

리켓챠 쯔쯔가무시 백신의 제조

실시예 4에서 얻은 리켓챠 쯔쯔가무시가 대량 배양된 난황막을 평량하여 수크로스가 함유된 0.01M 인산완충용액(pH 7.2 이하, 'PS용액'이라 함)에 25%(w/v)가 되도록 넣고 분쇄하여 균질액을 만든다. 이를 400g에서 15분간 원심분리하여 중간층을 다시 고속원심분리하여 침전물을 회수하고 여기에 PS용액을 첨가하여 희석하였다. 이어서, 불활화제인 포르말린(37%(w/v)포름알데히드)을 0.2%(ww/v)가 되도록 첨가 혼합한 다음, 4℃에서 10일간 반응시켜 불활화시켰다. 그런 다음, 전처리된 앰버라이트(Amberlite, Sigma, #IRP-64, U.S.A.) 양이온 교환수지를 4.4%(w/v)로 첨가하여 반응시킨 후, 저속원심분리하여 상층액을 취하였다. 이 상층액을 다시 고속원심분리하여 침전물을 얻고, 수크로스가 함유된 0.03M 트리스 완충용액(pH 7.2, 이하, 'TS 완충용액'이라 함)에 재용해시키고, 여기에 퍼콜(Percoll, Pharmacia LKB, $17-0891-01, Swden)을 40%(w/v)가 되도록 첨가한 다음, 25,000g에서 1시간 동안 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후, 아래쪽에 형성되어 있는 리켓챠 쯔쯔가무시층(밀도 1.06 내지 1.07)을 분리한 다음, TS 완충용액으로 5회 세척하여 퍼콜을 제거하였다. 이를 다시 인산염 완충액에 희석하여 원심분리 방법으로 세척한 뒤 침전물을 인산염 완충용액에 현탁하였다.

이와 같은 방법으로 얻은 항원원액은 초음파 파쇄기로 수용액화하여 이를 백신제조용 항원원액으로 하였다.

[실시예 5]

한탄바이러스 항원과 리켓챠 쯔쯔가무시 항원의 혼합백신 제조

(1) 혼합방법의 결정

실시예 2에서 제조한 한탄바이러스 백신원액과 실시예 4에서 제조한 리켓챠 쯔쯔가무시 백신원액을 여러가지 비율로 혼합하여, 이를 실험용 랫트에 0.5ml 근육주사한 뒤 일주일 간격으로 채혈하여 혈청중의 한탄바이러스에 대한 항체가와 리켓챠 쯔쯔가무시에 대한 항체가를 공지의 간접면역 형광항체법으로 측정하였다. 그 결과, 항원가 4,000의 한탄바이러스 원액과 항원가 4,000의 리켓챠 쯔쯔가무시 원액을 부피비 2 : 1로 혼합한 용액이 단백함량 및 면역효과에서 가장 적절한 것으로 확인되었다[참조 : 표 1]

(2) 수산화 알루미늄 겔 농도의 결정

면역보조제인 수산화 알루미늄 겔의 최적 첨가농도를 결정하기 위해, 상기의 백신원액에 각각 100㎍/ml, 200㎍/ml, 300㎍/ml, 400㎍/ml, 500㎍/ml씩 첨가하고, 4℃에서 14일간 처리한 후 각 농도에 대해 5마리씩의 랫트에 0.5ml/마리를 근육주사하여, 일주일 간격으로 채혈하여 각각에 대한 항체가를 간접면역형광항체법으로 측정하였다[참조 : 제1도, 제2도]. 제1도 및 제2도에서 보듯이, 수산화 알루미늄 겔을 400 내지 500㎍/ml로 처리한 것이 가장 적절한 것으로 확인되었다.

[실시예 6]

혼합백신의 면역원성 및 중화항체 생성능의 확인

면역원성 실험은 랫트에서 항체 생성을 측정하여 수행하였으며, 중화항체 생성능은 플라크 감소법(plaque reduction method)으로 측정하여 후술하는 바와 같이 검증하였다.

(1) 랫트에서의 항체 생성실험

실시예 5에서 제조한 백신을 4주령의 랫트 20마리에 접종한 다음 1주일 간격으로 채혈하였다. 그 혈청을 간접면역 형광항체법으로 한탄바이러스에 대한 항체가와 리켓챠 쯔쯔가무시에 대한 항체가를 각각 측정하였다. 매번의 항체가를 플롯화하여 항체생성곡선을 작성하여 항체생성의 추이를 관찰하였다[참조 : 제3도]. 제3도에서 보는 바와 같이, 한탄바이러스에 대한 항체가는 접종 후 35일이 경과한 시점부터 감소하기 시작하였고, 리켓챠 쯔쯔가무시에 대한 항체가는 접종 후 49일이 경과한 시점부터 항체가가 더이상 증가하지 않고 유지되기 시작하였다. 이 시점에 2차 접종을 한 결과, 각각에 대한 항체가는 다시 현저히 증가하였다.

(2) 중화항체 실험

실시예 5(1)에서 채취한 혈청으로 한탄바이러스에 대한 중화항체가를 공지의 50% 플라크 감소방법으로 측정한 결과, 94.24 내지 114.28의 중화항체가를 얻을 수 있었는데, 이는 기존의 한탄바이러스의 백신의 결과와 유사한 값이었다. 마찬가지의 방법으로 리켓챠 쯔쯔가무시에 대한 중화항체가를 측정한 결과도 기존의 백신과 유사한 결과를 얻었다. 이들 결과들에서 알 수 있듯이 혼합백신은 기존의 백신과 동일한 면역효과를 나타냄을 알 수 있었다[참조 : 표 2].

상기에서 상세히 설명되고 입증되는 바와 같이, 본 발명에서는 유행성출혈열을일으키는 가장 대표적인 두가지 균주(한탄바이러스, 리켓챠 쯔쯔가무시)의 항원을 적절한 방법으로 혼합하여, 하나의 백신으로 두가지 질환에 대해 방어할 수 있는 면역원성이 높은 혼합백신을 제공한다.

Claims (5)

1. 한탄바이러스 항원원액과 리켓챠 쯔쯔가무시 항원원액을 부피비 2 : 1로 포함하고, 전기 혼합 항원원액에 대하여 400~500㎍/ml의 수산화 알루미늄 겔을 보조제로서함유하는 혼합원성 조성물.
2. 제1항에 있어서, 한탄바이러스 항원원액은 한탄바이러스에 프로타민 설페이트를 처리하고 원심분리하여 수득한 상층액을 불활화시켜 제조된 것을 특징으로 하는 혼합항원 조성물.
3. 제2항에 있어서, 한탄바이러스는 한탄바이러스 ROK84-105주(Hantaan virus ROK84-105, ATCC VR-2250)인 것을 특징으로 하는 혼합항원 조성물.
4. 제1항에 있어서, 리켓챠 쯔쯔가무시 항원원액은 리켓챠 쯔쯔가무시가 배양된 난황막을 균질화하고 원심분리하여 수득한 침전물을 불활화시켜 제조된 것을 특징으로 하는 혼합항원 조성물.
5. 제4항에 있어서, 리켓챠 쯔쯔가무시는 리켓챠 쯔쯔가무시 길리암주(Rickettsia tsutsugamushi Gilliam strain, ATCC VR-312) 및 리켓챠 쯔쯔가무시 카프주(Rickettsia tsutsugamushi Karp strain, ATCC VR-150)인 것을 특징으로 하는 혼합항원 조성물.