JPH04217631A - 水酸化亜鉛カルシウム、レシチンおよびｐａｏの抗原溶液用アジュバントとしての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、抗原溶液に対する水酸化亜鉛カ
ルシウム、レシチンおよびＰＡＯの使用、およびこの種
類のアジュバントで処理した抗原溶液に関する。

【０００２】多くの抗原はわずかな免疫原性しか示さな
いので、動物への１回注射では、弱い免疫応答を引き起
こすにすぎないかまたは検出できるような応答は全く認
められない。したがって、抗原に対する生体の免疫応答
を増幅するため、抗原刺激性アジュバントが抗原に添加
される。大部分の不活性化ウイルスおよび細菌ワクチン
は、この理由で、アジュバントを含んでいる。これらの
ウイルスおよび細菌ワクチンには好んでＡｌ（ＯＨ）３
およびＡｌＰＯ４が単独でもしくは配合されて、また粗
製油分画から得られる植物油もしくは鉱油、たとえば組
成は明確に定義されていない、いわゆる医療用の薬用白
油が用いられる。ＢａｙｏｌＲ　Ｆ鉱油を含有し、結核
菌抽出物を添加したおよび添加しないフロインドの完全
および不完全アジュバントが実験的ワクチンには優先的
に用いられている。

【０００３】しかしながら、これらのアジュバントには
局所反応に加えて全身的な副作用もある。

【０００４】アジュバントには、その局所的および全身
的耐容性のほかに、以下の点が重要である。すなわち、
１．　　それらの作用の免疫学的機構すなわちそれらに
よって誘発される作用、２．　　それらの薬動力学的性
質（生物学的分解性）である。

【０００５】１に関しては、無機アジュバント〔Ａｌ（
ＯＨ）３，ＡｌＰＯ４〕は主として体液性免疫応答のみ
を誘発し、一方、多くのウイルス感染において有力な役
割を果たす細胞性免疫はわずかしかまたは全く刺激しな
いことが一般的に知られている。

【０００６】鉱油、とくにフロインドのアジュバントの
特性は異なり、よく知られているように、細胞性および
体液性の両免疫応答を刺激する。

【０００７】２に関しては、現在まで慣用されてきたア
ジュバントは、主として注射部位に残留するか、または
生体の他の臓器に輸送され、濃縮されて、そこでそれら
の免疫学的作用と場合によっては毒性作用を示す。すな
わち、分解および排泄は、きわめて長期の遅延後に生じ
るか、または全く起こらない。

【０００８】本発明のアジュバントの成分、すなわち水
酸化亜鉛／水酸化カルシウムゲルおよびレシチンは異な
る性質を有する。これらは生体内で代謝され、したがっ
て毒性が低い。

【０００９】ＥＰ−Ａ−０，１０８，３１６（ドイツ公
開公報３，２４１，１１３号）には、ワクチンの添加物
として他の物質に加えて、亜鉛化合物すなわち亜鉛塩の
使用が提案されている。

【００１０】ＥＰ−Ａ−０，３４３，５４８にはアジュ
バントとしてポリアルファオレフィン（ＰＡＯ）が開示
され、またＥＰ出願８９　１１８５６５４９４には水酸
化亜鉛ゲルおよびレシチンが開示されている。

【００１１】しかしながら驚くべきことに、水酸化亜鉛
／水酸化カルシウムゲル、レシチンおよびＰＡＯを組合
せると、以下の性質を有するアジュバントが得られるこ
とが見出された。すなわち、１．　　この配合アジュバ
ントは、アジュバントとして有効な４種の個々の成分そ
れぞれと比較して著しく改良された、免疫系に対する刺
激作用を有する。２．　　この配合アジュバントは、驚
くべきことに、水酸化亜鉛ゲルおよびレシチンまたはＰ
ＡＯに比較して、改良された全身的および局所的耐容性
を有する。

【００１２】水酸化亜鉛／水酸化カルシウムゲルおよび
レシチン９９懸濁液のそれ自体既知の方法による製造方
法の説明： 水酸化亜鉛／水酸化カルシウムゲル： １．　　ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏに出発
して、蒸留水中０．１Ｍ溶液の調製（それぞれについて
０．１ｍｏｌ／ｌ）。 ２．　　ＺｎＣａ塩溶液の濾過による滅菌（０．２μ膜
フィルター）。 ３．　　塩基、好ましくは１０Ｎ　ＮａＯＨまたは１０
Ｎ　ＫＯＨを、滅菌条件下、撹拌しながら、ｐＨが６．
８〜７．８に達するまで加える。 ４．　　沈殿した水酸化亜鉛／水酸化カルシウムゲルは
好ましくは、ＵｌｔｒａｔｕｒａｘＲ処理によってホモ
ジナイズできる。

【００１３】この場合出発原料として用いられるこれら
のＺｎＣａ塩は単に一例である。水酸化亜鉛／水酸化カ
ルシウムゲルは、直接、抗原懸濁液中でｐＨをモニタリ
ングしながら調製することもできる。用いられるＺｎＣ
ａ塩溶液が滅菌されていなくて、操作が非滅菌条件下に
行われる場合は、ゲルを１２０℃で２０分間、オートク
レーブ処理してもよい。

【００１４】 ２０％レシチン９９懸濁液の調製： １．　　レシチン２０ｇをＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏに
よるリン酸緩衝食塩溶液）、ｐＨ７．２、１００ｍｌ中
に懸濁する。 ２．　　この懸濁液を１２０℃で２０分間オートクレー
ブ処理。３．　　冷却後、懸濁液をホモジナイズする。 ４．　　１０Ｎ　ＮａＯＨを用いて、懸濁液のｐＨを７
．０〜７．８に調整する。

【００１５】 　　本発明のアジュバント配合物（ＢＷ８９）の調製例
：ＰＡＯ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２６．６７％をＴｗｅｅ
ｎＲ８１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　６．００％およびＴｗｅｅｎＲ８
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２．００％（いずれもポリオキシエチレンソルビ タンモノエステル）とホモジナイザー を用いて完全に混合する。 ＵｌｔｒａｔｕｒａｘＲを用いて混合しながら０．１Ｍ
水酸化亜鉛カルシウムゲル　　　　　　　　　　５０．
００％およびレシチン９９の２０％懸濁液　　　　　　
　　　１５．３３％を加える。　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．００％

【００１６】この方法で得られるアジュバント配合物は
所望の任意の百分率で抗原に添加することができる。

【００１７】レシチンは２０％懸濁液として添加するこ
とが好ましい。この種類の懸濁液１〜１０％、好ましく
は５％を添加できる。

【００１８】ポリアルファオレフィンは１〜４０％、好
ましくは１０％の濃度に添加される。

【００１９】このアジュバント配合物に考えられる別の
製法としては、１．　　抗原への、水酸化亜鉛カルシウ
ムゲルおよびレシチン９９懸濁液の添加、ついで２．　
　ＰＡＯ、Ｔｗｅｅｎ８１およびＴｗｅｅｎ８０、なら
びに１に記載した抗原／アジュバント混合物によるＷ／
Ｏ　エマルジョン（油中水型乳剤）の製造による方法が
ある。

【００２０】しかしながらまた、本発明のアジュバント
配合物は以下の方法で製造することもできる。この場合
、すべての操作工程は滅菌条件下に行われる。 １．　　ＰＡＯ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
６．６７％　　　　　　ＴｗｅｅｎＲ８０　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　６．００％　　　　　　Ｔｗｅｅｎ
Ｒ８１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．００％をＵ
ｌｔｒａｔｕｒａｘによって完全に混合する。 ２．　　滅菌ＺｎＣｌ２／ＣａＣｌ２　０．１Ｍ溶液　
　　　　　　　　　　　５０．００％を加え、Ｕｌｔｒ
ａｔｕｒａｘＲによって混合して油中水型（Ｗ／Ｏ）エ
マルジョンを調製する。 ３．　　ｐＨをモニタリングし（６．５〜７．５）、Ｕ
ｌｔｒａｔｕｒａｘを用いて混合しながら、１０Ｎ　Ｎ
ａＯＨを加えてＷ／Ｏエマルジョン中に水酸化亜鉛カル
シウムゲルを沈殿させる。 ４．　　次に、２０％レシチン９９　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１５．３３％を混合し
ながら加える。　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　計　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１００．００％

【００２１】アジュバント配合物
の製造に考えられる他の方法としては、 １．　　水酸化亜鉛カルシウムゲルとレシチン９９懸濁
液を抗原に加えて抗原を吸着させ、 ２．　　ＰＡＯ、ＴｗｅｅｎＲ８１および８０、ならび
に１に述べた抗原／アジュバント混合物によりＷ／Ｏエ
マルジョンを製造する方法がある。

【００２２】以下の実施例は、本発明のアジュバント配
合物の利点を例示するものである。

【００２３】実施例　　１ アウジェスツキー（Ａｕｊｅｓｚｋｙ）病ウイルス（Ａ
Ｖ）を初代ブタ腎臓細胞培養中で増殖させる。培養細胞
の１００％がウイルス特異的に破壊されたならば、すな
わち細胞が完全に破壊される（ＣＰＥ）まで待って、ウ
イルスを収穫し、遠心分離および濾過によって精製した
。次に、エチレンイミンを用いてＡＶを不活性化した。 不稔性および安全性をチェックしたのち、この不活性化
ＡＶ抗原から４種のワクチンを製造した。

【００２４】ワクチンの組成を以下の表１に掲げる（数
値はｍｌである）。

【表１】

【００２５】局所的耐容性を調べるため、体重４５０ｇ
のモルモット２匹に、それぞれのワクチンの各場合とも
０．１ｍｌを足蹠内に接種した。

【００２６】接種後４週間、毎日モルモットの足蹠の発
赤、腫張および他の肉眼的な病的解剖学的変化を検査し
て局所的耐容性を評価し、不耐性の値を点数で決定した
。肉眼的な病的解剖学的変化が重篤なほど、その値の点
数は高く、不耐性が大きいことを示す。

【００２７】測定した不耐性の点数を以下に表として掲
げる。

【表２】

【００２８】表に示した結果から明らかなように、ＢＷ
８９アジュバント配合物（ワクチンＤ）は、局所的耐容
性に関し、他のすべてのアジュバントよりはるかに優れ
ている。

【００２９】ワクチンの効力を評価するために、ワクチ
ン接種４週後にモルモットから採血し、ＡＶに対する血
清中の中和抗体を測定した。

【００３０】測定された中和力価を以下に表として示す
。

【表３】

【００３１】この表における結果から明らかなように、
アジュバント配合物（ワクチンＤ）の効力は他のアジュ
バントの場合よりも良好である。

【００３２】全身的耐容性の測定 　　各場合とも体重３０ｇのＮＭＲＩマウス１０匹を用
い、上述のようにして製造したワクチンの各場合とも０
．３ｍｌを皮下に接種した。

【００３３】全身的耐容性の測定には、ワクチン接種後
８日まで毎日、動物の体重をモニタリングした。

【００３４】 動物の体重の増加は ワクチンＡ　　　　１１ｇ ワクチンＢ　　　　　　６ｇ ワクチンＣ　　　　　　８ｇ ワクチンＤ　　　　１１ｇ 非処置対照　　　　１０ｇ であった。

【００３５】体重の増加は、ＢＷ８９アジュバント配合
物が、良好な全身的耐容性を有することを示している。

【００３６】実施例　　２ ＰＩ３ウイルス（パラインフルエンザ３ウイルス）をＤ
ＢＫ細胞中で増殖させた。培養細胞ローンの８０〜１０
０％がウイルス特異的に破壊されたとき、ウイルスを収
穫し、遠心分離によって精製した。こののち、エチレン
イミンを用いてウイルス抗原を不活性化した。不稔性と
安全性をチェックし、不活性化抗原から２種のワクチン
を製造した。

【００３７】 ワクチンＡ（ワクチン組成の百分率は容量：容量である
）： ＰＩ３Ｖ抗原　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　８０．０％２％濃度Ａｌ（ＯＨ）３　　　　
　　　　　　　　　　　　１９．５％１０％濃度サポニ
ン（Ｍｅｒｃｋ）　　　　　０．５％ワクチンＢ： ＰＩ３Ｖ抗原　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　８０．０％ＢＷ８９　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０％

【００３
８】いずれの場合も２．０ｍｌのワクチンをそれぞれ３
匹のヒツジの皮下に接種し、接種４週後に同じ用量を再
接種した。ワクチンの局所的耐容性を調べるため、注射
部位の腫張、発赤、硬度および感受性を調べた。

【００３９】ワクチンＡでは接種の８週後にも接種後ラ
ンプが肉眼で認められ、その退行にはその硬度からみて
なお数週を要するものと思われた。本質的により良好な
局所的耐容性はワクチンＢに認められた。接種後１４〜
２１日で、注射部位の接種後ランプはも早肉眼ではみら
れないかまたは触知できなかった。ワクチンＡまたはＢ
を接種されたすべての動物で、全身的健康状態に障害は
認められなかった。

【００４０】実施例　　３ 耐容性の試験のために、２種のブランクワクチンを調製
した（ブランクワクチンは抗原を含まない。抗原の代わ
りにＥａｇｌｅｓ５９媒体を添加する。しかしながら、
アジュバントの含量はワクチンの場合と同様とする）。 組成は次の通りである。

【００４１】 　　ワクチンＡ： 　　　　ＥＢ（生理食塩水＋ビタミン＋アミノ酸）　　
　　９０．０％　　　　２％濃度のＡｌ（ＯＨ）３　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０％　
　ワクチンＢ： 　　　　ＥＢ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０．０％　
　　　ＢＷ８９　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０％。

【００４２】３頭のウマにワクチンＡを、６頭のウマに
ワクチンＢを、２．０ｍｌを用いて皮下に接種した。

【００４３】動物の局所反応の検査を８日間毎日実施し
た。結果を以下の表にまとめる。

【表４】

【００４４】この表から明らかなようにＢＷ８９はＡｌ
（ＯＨ）３よりもかなり良好な局所的耐容性を示す。注
目すべき全身反応を示す動物はみられなかった。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　アジュバントによる抗原溶液の処理過
   程における水酸化亜鉛カルシウムゲルの使用。
2. 【請求項２】　　さらにレシチンを使用する請求項１記
   載の使用。
3. 【請求項３】　　さらにポリアルファオレフィンを使用
   する請求項１記載の使用。
4. 【請求項４】　　抗原溶液に予め水酸化亜鉛カルシウム
   を添加した請求項１記載のアジュバント処理抗原溶液。
5. 【請求項５】　　抗原溶液に予めさらに、２０％レシチ
   ン懸濁液１〜１０％好ましくは５％を添加した請求項４
   記載の抗原溶液。
6. 【請求項６】　　抗原溶液に予めポリアルファオレフィ
   ン１〜４０％好ましくは１０％を添加した請求項４記載
   の抗原溶液。
7. 【請求項７】　　抗原溶液に水酸化亜鉛／水酸化カルシ
   ウムを添加するアジュバント処理抗原溶液の製造方法。
8. 【請求項８】　　抗原溶液にさらにレシチンを添加する
   請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】　　抗原溶液にさらにポリアルファオレフ
   ィンを添加する請求項７記載の方法。